CN113549650A

CN113549650A - 一种CRISPR-SaCas9基因编辑系统及其应用

Info

Publication number: CN113549650A
Application number: CN202110756753.5A
Authority: CN
Inventors: 张孝兵; 程涛; 张健萍; 杨智学; 傅雅文
Original assignee: Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital of CAMS and PUMC
Current assignee: Tianjin Xiehe Biotechnology Development Co ltd
Priority date: 2021-07-05
Filing date: 2021-07-05
Publication date: 2021-10-26
Anticipated expiration: 2041-07-05
Also published as: CN113549650B

Abstract

本发明提供了一种CRISPR‑SaCas9基因编辑系统及其应用。所述基因编辑系统包括SaCas9载体、sgRNA载体和同源重组模板pDonor载体。本发明通过选择合适的SaCas9载体的核定位信号、sgRNA载体的骨架结构以及sgRNA载体的靶序列长度等多种手段，提高了mNeonGreen在人诱导多能干细胞中EEF1A1位点和GAPDH位点的基因敲入效率。同时，本发明还系统比较了不同sgRNA长度的SpCas9和SaCas9针对同一位点的打靶效率和脱靶效率，最终得知本发明提供的CRISPR‑SaCas9基因编辑系统是一种打靶效率高、脱靶效率低的新型基因编辑载体系统。

Description

一种CRISPR-SaCas9基因编辑系统及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种基因编辑系统及其应用，尤其涉及一种CRISPR-SaCas9基因编辑系统及其应用。

背景技术

CRISPR-Cas9是目前应用最为广泛的基因编辑工具。目前常用的CRISPR-Cas9基因编辑工具主要由两部分组成，即负责切割双链DNA的Cas9蛋白和负责通过碱基互补配对的方式识别目标DNA区域sgRNA。

CRISPR-Cas9基因编辑系统的工作原理如下：

Cas9蛋白首先和sgRNA形成RNP复合物，Cas9-sgRNA复合物寻找基因组上的PAM序列(Protospacer Adjacent Motif，原间隔区相邻基序)，并在PAM序列处识别和短暂停留。一旦sgRNA上的靶序列能够与基因组上的序列完全互补配对，Cas9蛋白会对PAM序列前第3和第4个碱基间进行切割造成DNA双链断裂(DSB)。当细胞内无外源同源重组模板的情况下，细胞通过非同源末端链接(NHEJ)的方式对DSB进行修复，这种修复是不精确的，容易造成单个或多个碱基的插入或者缺失形成Indel。如果有同源重组模板，细胞将通过同源重组(HDR)精确修复DSB，进而可以将外源基因导入目标区域，或者实现单碱基的替换等。

目前，常用的SpCas9蛋白来自化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)，由1368个氨基酸组成(约4.1kb)，因其体积较大限制了其在基因治疗领域中的应用。SaCas9来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的Cas9，由1053个氨基酸组成(约3.3kb)，因其较小的体量和更低的脱靶效率，被广泛应用于体内基因编辑实验。编码SaCas9的基因比SpCas9小约1kb，这使得SaCas9能够更有效的组装进入容量较小的AAV等病毒载体中并且高效表达，同时为其他调节元件和sgRNA等留下更多的空间，为将SaCas9和sgRNA包装在同一AAV载体中提供可能。SaCas9的PAM识别序列为NNGRRT(R代表A或G碱基)，而SpCas9的PAM识别序列为NGG。SaCas9的PAM识别序列(NNGRRT)较长，大大增加了识别的特异性，降低了脱靶率。

综上所述，SaCas9具有较小的体积和较低的脱靶效率，在基因治疗领域具有广阔的应用前景。然而和常用的SpCas9相比，SaCas9的基因编辑效率较低。因此，进一步优化SaCas9基因编辑工具，提高其体内外基因编辑效率具有重要意义。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种CRISPR-SaCas9基因编辑系统及其应用。所述CRISPR-SaCas9基因编辑系统选用的核定位信号、sgRNA骨架以及sgRNA的长度，能够显著提高基因敲入效率。为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种CRISPR-SaCas9基因编辑系统，所述CRISPR-SaCas9基因编辑系统包括：SaCas9载体、sgRNA载体和同源重组模板pDonor载体；

其中，所述SaCas9载体包括启动子、SaCas9编码基因、核定位信号、Wpre和PolyA，所述核定位信号包含编码如SEQ ID NO.1～7中任意一项或至少两项所示的氨基酸序列的核苷酸。

本发明中，利用高通量测序发现SaCas9和SpCas9造成DSB后，DSB修复的模式不同，SaCas9独特的修复模式更有利于HDR的发生，因此CRISPR-SaCas9基因编辑系统是一种基因编辑效率较高的基因编辑系统。

本发明能够显著提高人诱导多能干细胞中SaCas9的基因编辑效率。首先，建立了在EEF1A1和GAPDH位点进行mNeonGreen基因敲入的报告系统，当mNeonGreen报告基因成功敲入，可通过流式细胞术检测到绿色荧光的表达。通过选择合适的核定位信号，能够促进SaCas9的HDR效率，尤其是BPNLS和HMGA2，能够显著提高基因编辑效率；同时，对sgRNA骨架进行改造，其基因敲入效率提高20～30％，本发明中还发现，sgRNA长度也能显著影响编辑效率，即使只有1nt的差别，其基因编辑效率的改变也是较为显著的。

HMGA1基因(包含核定位和核转运信号)，如SEQ ID NO.1所示；HMGA2基因编码序列(包含核定位和核转运信号)，如SEQ ID NO.2所示；HMGB1基因编码序列(包含核定位和核转运信号)，如SEQ ID NO.3所示；HMGB2基因编码序列(包含核定位和核转运信号)，如SEQ IDNO.4所示；HMGB3基因编码序列(包含核定位和核转运信号)，如SEQ ID NO.5所示；BPNLS(核定位信号)，如SEQ ID NO.6所示；NPM-NLS(核定位信号)，如SEQ ID NO.7所示。本发明中，所述核定位信号的氨基酸序列包括HMGA1、HMGA2、HMGB1、HMGB2、HMGB3、BPNLS和NPM-NLS；其序列如SEQ ID NO.1～7所示，除BPNLS和NPM-NLS基因编码序列仅包含核定位信号外，其余均包含核定位和核转运信号。

本发明中所述核定位信号可以连接于SaCas9编码基因的N端和/或C端，可以单独使用一种核定位信号或两种核定位信号组合使用，例如可以仅在SaCas9编码基因的N端连接HMGA2基因，也可在SaCas9编码基因的N端和C端同时连接HMGA2基因，也可以在SaCas9编码基因的N端连接HMGA2基因，C端连接BPNLS基因。

本发明中，所述核定位信号中，BPNLS和HMGA2的组合使用，能够显著提高基因编辑效率，其效果明显优于不使用核定位信号、使用NPM-NLS核定位信号、单独使用或者重复使用BPNLS核定位信号。在单独使用HMGA2、HMGB1、HMGA1、HMGB2和HMGB3时，其基因编辑效果依次降低，即HMGA2>HMGB1>HMGA1>HMGB2>HMGB3。

编码SEQ ID NO.1～7所示的氨基酸序列的核苷酸可根据宿主细胞的密码子偏好性进行设计。例如，本发明中，所述SEQ ID NO.1～7所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.8～14所示。

作为本发明优选的技术方案，所述SaCas9载体的启动子包括EF1启动子、CAG启动子或CMV启动子中的任意一种。优选地，所述SaCas9编码基因编码的蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO.15所示。

优选地，SaCas9和核定位信号的连接序列1、连接序列2、连接序列3分别由SEQ IDNO.16～18所示。上述3种连接序列的一种或两种均可用于SaCas9的N端或C端。

作为本发明优选的技术方案，所述sgRNA载体包括启动子(例如可以是U6启动子)、靶向序列和骨架结构。优选地，所述sgRNA载体的骨架结构包括SEQ ID NO.19～24之一所示的核苷酸序列。此外，SgRNA原始骨架结构如SEQ ID NO.25所示。

作为本发明优选的技术方案，所述同源重组模板pDonor载体包含供体序列的供体DNA(Donor)，Donor可通过同源定向修复在插入位点将所述供体序列插入基因组中。优选地，所述供体DNA采用单链DNA模板供体(Single-stranded donor oligonucleotides，ssODN)、AAV腺相关病毒模板供体或质粒模板供体插入基因组中。优选地，所述AAV腺相关病毒模板供体的AAV为单链或者双链AAV，其血清型为AAV6。

本发明中，所述SaCas9载体为质粒、腺病毒载体或慢病毒载体的任意一种。优选地，所述sgRNA载体为质粒、腺病毒载体或慢病毒载体的任意一种。优选地，所述同源重组模板pDonor载体为质粒、腺病毒载体或慢病毒载体的任意一种。

第二方面，本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如第一方面所述的CRISPR-SaCas9基因编辑系统。优选地，所述宿主细胞包括人原代细胞。优选地，所述人原代细胞包括人诱导多能干细胞、人原代T细胞或人造血干细胞中的任意一种。

第三方面，本发明还提供一种如第一方面所述的CRISPR-SaCas9基因编辑系统在制备基因编辑的细胞和/或药物中的应用。所述CRISPR-SaCas9基因编辑系统可以提高在制备人原代细胞(人诱导多能干细胞、人原代T细胞、人造血干细胞)过程中基因的敲入效率。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供一种CRISPR-SaCas9基因编辑系统，包括：SaCas9载体、sgRNA载体和同源重组模板pDonor载体，其中，SaCas9载体中的核定位信号编码SEQ ID NO.1～7任意一项或至少两项所示氨基酸序列的核苷酸，在选择上所核定位信号时，SaCas9的HDR效率能够明显提高，尤其是同时选择BPNLS和HMGA2时，其促进效果十分明显；

(2)本发明提供的基因编辑系统，选择的sgRNA骨架能明显提高基因敲入效率，以SgRNA骨架序列1为例，在EEF1A1处敲入效率由20％上升为40％，在GAPDH处敲入效率由38％上升为50％；本发明中还发现，sgRNA长度对基因敲入效率有明显的影响，且发现和SpCas9的sgRNA需要20个碱基不同，SaCas9的sgRNA(sa)在21～22个碱基序列时基因敲入效率最高，如果减少到20个碱基，基因编辑效率显著降低；

(3)本发明提供的CRISPR-SaCas9基因编辑系统脱靶效率较低，利用该基因编辑系统，最高体外HDR效率可到40％以上，因此，该技术在临床基因治疗中具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明中基因编辑组件的组成结构示意图。

图2为基因编辑系统在人的EEF1A1位点和GAPDH位点基因编辑的原理示意图，其中I图为EEF1A1位点，II图为GAPDH位点。

图3为具有不同核定位信号的SaCas9基因编辑载体示意图。

图4为在人的EEF1A1进行基因编辑的流式代表图。

图5为在人的EEF1A1进行基因编辑的流式统计图。

图6为sgRNA骨架结构优化示意图，I图为sgRNA(Sa)，II图为sgRNA(Sa-V2)。

图7为sgRNA骨架结构优化后，在人的EEF1A1位点和GAPDH位点进行基因编辑的流式结果统计图，其中，I图为EEF1A1位点，II图为GAPDH位点。

图8为sgRNA长度优化后，在人的EEF1A1位点和GAPDH位点进行基因编辑的流式结果统计图，其中，I图为EEF1A1位点，II图为GAPDH位点。

图9为靶向AAVS1c位点不同靶序列长度的sgRNA在iPSC细胞中的切割效率统计图，其中，I图为不同sgRNA(Sp)长度，II图为不同sgRNA(Sa)长度。

图10(a)为不同靶序列长度的sgRNA(Sp)在iPSC细胞中的脱靶情况；图10(b)为不同靶序列长度的sgRNA(Sa)在iPSC细胞中的脱靶情况。

图11(a)为使用SpCas9蛋白切割DNA后修复模式代表图，其中，I图为sgAAVS1c-gN20(Sp)切割后+A，II图为sgAAVS1d-GN17(Sp)切割后+T；图11(b)为使用SaCas9蛋白切割DNA后的修复模式代表图，其中，I图为sgAAVS1c-gN21(Sa)切割后+A，II图为sgAAVS1d-GN21(Sa)切割后+T。

图12(a)为SpCas9和SaCas9蛋白切割后不同的修复模式代表图，其中，I图为sgAAVS1d-gN21(Sp)切割后+T，II图为sgAAVS1d-gN20(Sa)切割后+T；图12(b)为SpCas9和SaCas9在DSB处+T的相对比例和HDR效率统计图，其中I图为在DSB处+T的相对比例统计图，II图为HDR效率统计图。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

以下实施例中，若无特殊说明，所用试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。

实施例1载体构建

本实施例用于构建本发明中所述基因编辑系统的各个载体。

(1)不同核定位信号SaCas9载体的构建

利用PCR扩增得到不同核定位信号序列，再使用NEBuilder HiFi DNA组装试剂盒(New England Biolabs)将EF1启动子、不同核定位信号序列(SEQ ID NO.8～14)、SaCas9(编码SEQ ID NO.15的核苷酸序列)、Wpre和PolyA拼接并克隆至pEF1-SaCas9质粒中；其中，SaCas9与核定位信号采用连接序列1(SEQ ID NO.16)进行连接；经核酸内切酶消化和Sanger测序鉴定获得不同核定位信号SaCas9载体。

(2)不同骨架结构及不同靶序列长度的sgRNA载体构建

利用CHOPCHOP网站(https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/)设计针对EEF1A1基因和GAPDH基因终止密码子附近的sgRNA；利用NEBuilder HiFi DNA组装试剂盒(NewEngland Biolabs)将靶向EEF1A1基因和GAPDH基因终止密码子附近的sgRNA克隆至带有U6启动子的sgRNA载体中，经Sanger测序鉴定获得pU6-sgRNA载体。

(3)双切供体(pD-mNeonGreen-sg)载体构建

利用PCR扩增得到EEF1A1基因和GAPDH基因打靶位点的左右同源臂(HA)，连接左右同源臂(SEQ ID NO.26～29)、mNeonGreen、Wpre和PolyA；经核酸内切酶消化和Sanger测序鉴定获得pD-mNeonGreen-sg供体载体。其中，GAPDH左臂如SEQ ID NO.26所示，GAPDH右臂如SEQ ID NO.27所示，EEF1A1基因左臂如SEQ ID NO.28所示，EEF1A1基因右臂如SEQ IDNO.29所示。具体步骤如下：

使用KAPA HiFi聚合酶(KAPA Biosystems)PCR扩增左右同源臂和插入片段，引物设计时左右同源臂和期望的敲入片段应重叠约20bp用于连接；使用DNA凝胶回收试剂盒(ZYMO)对PCR产物进行纯化；然后，使用NEBuilder HiFi DNA组装克隆试剂盒将片段与质粒主链组装，生成pDonor-sg载体；从人类基因组DNA中扩增左右同源臂(～600bp)，在左同源臂上游和右同源臂下游添加sgDocut(donor cut)识别序列；所有载体均通过Sanger测序验证。

通过上述方法制备得到的SaCas9载体、sgRNA载体和pD-mNeonGreen-sg载体的结构如图1所示。

实施例2人诱导多能干细胞在不同位点的基因编辑方法

本实施例提供人诱导多能干细胞在不同位点的基因编辑方法。

(1)人诱导多能干细胞的电转

人诱导多能干细胞使用mTeSR^TM1培养基进行培养。复苏和传代时培养板先用Matrigel进行包被处理。具体步骤如下：在电转之前，用Accutase消化iPSC细胞，以获得单细胞悬浮液；取0.8～1.5×10⁶细胞进行电转，基因编辑质粒用量如下：Cas9 1μg，sgRNA(切割基因组)0.5μg，sgDocut(切割pDonor)0.5μg，pDonor 1μg以及BCL-XL质粒0.5μg；使用人干细胞专用电转试剂盒Human Stem Cell

Kit 2(Lonza)进行电转，电转程序为B-016。

(2)人诱导多能干细胞在EEF1A1位点的基因编辑

本步骤介绍在EEF1A1位点进行基因编辑的过程，用于后续测试SaCas9核定位信号和sgRNA骨架优化等。混合pEF1-Cas9(1μg)、pU6-sgEEF1A1(0.5μg)、pD-EEF1A1-E2A-mNeonGreen-sg(1μg)、pU6-sgDocut(0.5μg)、pEF1-BCL-XL(0.5μg)的CRISPR编辑组件；其中pEF1-BCL-XL可减少电转时细胞的死亡，可提高基因编辑效率。通过电转将质粒导入iPSC，细胞成功实现基因编辑后，通过HDR途径将E2A-mNeonGreen精确整合在EEF1A1处。

(3)人诱导多能干细胞在GAPDH位点的基因编辑

本步骤具体介绍在GAPDH位点进行基因编辑的过程，用于后续测试SaCas9核定位信号和sgRNA骨架优化等。混合pEF1-Cas9(1μg)、pU6-sgGAPDH(0.5μg)、pD-GAPDH-E2A-mNeonGreen-sg(1μg)、pU6-sgDocut(0.5μg)、pEF1-BCL-XL(0.5μg)的CRISPR编辑组件。通过电转将质粒导入iPSC，细胞成功实现基因编辑后，通过HDR途径将E2A-mNeonGreen精确整合在GAPDH处。

EEF1A1位点基因编辑：

由于EEF1A1在包括iPSC和K562细胞在内的所有哺乳动物细胞中高表达，其内源性转录机制驱动mNeonGreen的表达(如图2中I图所示)，可在电转后的第3天通过FACS分析来量化。电转后3天，用FACS确定由mNeonGreen-阳性细胞的百分比反映的基因敲入效率。

GAPDH位点基因编辑：

由于GAPDH在包括iPSC和K562细胞在内的所有哺乳动物细胞中高表达，其内源性转录机制驱动mNeonGreen的表达(如图2中II图所示)，可在电转后的第3天通过FACS分析来量化。电转后3天，用FACS确定由mNeonGreen-阳性细胞的百分比反映的基因敲入效率。

实施例3携带核定位信号的SaCas9提高基因编辑效率

本实施例用于比较不同核定位信号对SaCas9基因编辑效率的影响。将带有不同核定位信号的SaCas9质粒，包括：组1：SaCas9(No NLS)(1μg)、组2：SaCas9-NPM-NLS(1μg)、组3：SaCas9-BPNLS(1μg)、组4：BPNLS-SaCas9-BPNLS(1μg)和组5：HMGA2-SaCas9-BPNLS(1μg)(如图3所示)，分别与pU6-sgEEF1A1(0.5μg)、pD-EEF1A1-E2A-mNeonGreen-sg(1μg)、pU6-sgDocut(0.5μg)和pEF1-BCL-XL(0.5μg)等CRISPR组件共电转iPSC，在电转后的第3天通过FACS分析基因敲入效率。

如图4和图5所示，EEF1A1处的HDR效率从对照组SaCas9(No NLS)的17％增加至30.2％(SaCas9-NPM-NLS)、29.9％(SaCas9-BPNLS)、25.8％(BPNLS-SaCas9-BPNLS)和41％(HMGA2-SaCas9-BPNLS)。这些结果表明，核定位信号的使用能够促进iPSC中报告基因的HDR精确敲入，尤其是包含HMGA2序列的新型SaCas9融合蛋白显著提高基因编辑效率。

实施例4 sgRNA骨架结构的优化促进基因敲入

本实施例改造sgRNA的骨架结构，通过提高sgRNA的转录效率提高sgRNA的表达进一步促进基因编辑效率的提升。

如图6所示，将具有不同sgRNA骨架结构的质粒sgRNA(Sa)(0.5μg)(I图)或者sgRNA(Sa-V2)(0.5μg)(II图)分别与pD-E2A-mNeonGreen-sg(0.5μg)、pU6-sgDocut(0.5μg)和pEF1-BCL-XL(0.5μg)等CRISPR质粒共电转iPSC，在电转后的第3天通过FACS分析基因敲入效率。其中，sgRNA(Sa-V2)即为SgRNA骨架序列1(SEQ ID NO.19)，未优化的骨架序列sgRNA(Sa)为SEQ ID NO.25。

如图7所示，EEF1A1处的HDR效率从对照组的20％增加至40％(sgRNA-V2)(I图)；GAPDH处的HDR效率从对照组的38％增加至50％(sgRNA-V2)(II图)。这些结果表明，sgRNA骨架结构的改变能够促进iPSC中报告基因的HDR精确敲入。

本实施例中，同时还采用其他的SgRNA骨架序列2～6进行同样操作，结构证明，SgRNA骨架序列1～6均能够实现报告基因的HDR精确敲入。

实施例5最佳sgRNA靶序列长度的优化促进基因敲入

本实施例通过测试不同长度的sgRNA靶序列对基因编辑效率的影响确定sgRNA最优化的靶序列长度。将具有不同sgRNA靶序列长度的质粒(0.5μg)(如表1所示)分别与pD-E2A-mNeonGreen-sg(0.5μg)、pU6-sgDocut(0.5μg)和pEF1-BCL-XL(0.5μg)的CRISPR质粒共电转iPSC，在电转后的第3天通过FACS分析基因敲入效率。

表1

质粒名称	序列	SEQ ID NO.
			pU6-sgEEF1A1-gN19(Sa)	gAATACAACTGAACAGTACT	30
pU6-sgEEF1A1-gN20(Sa)	gAAATACAACTGAACAGTACT	31
			pU6-sgEEF1A1-gN21(Sa)	gAAAATACAACTGAACAGTACT	32
pU6-sgEEF1A1-GN22(Sa)	GAAAAATACAACTGAACAGTACT	33
			pU6sgGAPDH1-gN19(Sa)	gGACTGGCTCTTAAAAAGTG	34
pU6-sgGAPDH1-GN20(Sa)	GAGACTGGCTCTTAAAAAGTG	35
			pU6-sgGAPDH1-gN21(Sa)	gGAGACTGGCTCTTAAAAAGTG	36
pU6-sgGAPDH1-gN22(Sa)	gAGAGACTGGCTCTTAAAAAGTG	37
			pU6-sgGAPDH1-GN20(Sa)	GAGACTGGCTCTTAAAAAGTG	38
pU6-sgGAPDH1-gN21(Sa)	gGAGACTGGCTCTTAAAAAGTG	39

表中，以gN20为例，gN20指sgRNA靶序列长度为21nt。如图8所示，sgRNA靶序列长度为21nt时EEF1A1处和的HDR效率最高。在GAPDH位点，sgRNA靶序列长度为21nt或22nt时，HDR效率都显著高于20nt，但21nt或22nt sgRNA的编辑效率没有明显区别。

本实施例中还测试了第3个位点-AAVS1c，通过检测Indel(删除突变)比例来反映编辑效率。

结果(图9)显示，长度为22nt时，编辑效率大大高于长度为19、20和21nt的sgAAVS1c。在所有3个位点，23nt sgRNA的编辑效率都有所下降。综合统计所有数据，sgRNA靶序列最佳长度为21～22nt。

实施例6靶向AAVS1c和AAVS1d位点不同长度的sgRNA的切割数据、脱靶切割结果、DSB修复模式和敲入效率比较

为了进一步比较SaCas9和SpCas9编辑系统，本实施例中设计了不同长度的靶向AAVS1c位点的sgRNA，如下表2所示：

表2

为实现SaCas9和SpCas9能够同时识别同一位点，在设计sgRNA时选用PAM序列为NGGRRT，实现SaCas9和SpCas9可以识别同一PAM区域；设计不同sgRNA靶序列长度，利用前述优化的最优sgRNA骨架及核定位信号构建sgRNA质粒。

将具有不同sgRNA靶序列长度的sgRNA质粒分别与包含瞬时过表达BCL-XL的保护质粒在内的CRISPR质粒(SpCas9或者SaCas9)共电转iPSC，在电转后的第3天，收集基因组DNA，扩增靶序列附近序列，然后利用Illumina高通量测序和CRISPResso2分析编辑效率。结果表明，SaCas9的编辑效率与sgRNA识别序列的长度关系密切，而当SpCas9与长度为19、20、21nt的导向RNA结合时，其切割效率差别不大。

本实施例中还利用GUIDE-seq检测了不同长度sgRNA的脱靶切割效应。

结果如图10(a)和图10(b)显示，当SpCas9与长度为18、19、20、21nt导向RNA形成RNP时，其脱靶效应没有明显区别，都检测到40-50个位点。相反的，SaCas9只产生了3-5个脱靶切割位点，尤其是当导向RNA识别序列为22nt时，脱靶率最低，比SpCas9低10～100倍。

结果表明在AAVS1c位点，经优化后的SaCas9具有较高的打靶效率及较低的脱靶效率。

实施例7 SaCas9和SpCas9在切割后的DSB修复模式以及对敲入效率的影响

本实施例通过研究SaCas9和SpCas9在切割后靶位点的高通量测序结果，系统分析SaCas9和SpCas9在切割后的DSB修复模式。

图11(a)展示了SpCas9不同的切割模式代表结果。由图可知，AAVS1c位点SpCas9切割DNA后，在DSB处+A的比例为9.32％(I图)，AAVS1d位点SpCas9切割DNA后，在DSB处+T的比例为34.83％(II图)。图11(b)展示了SaCas9不同的切割模式代表结果。由图可知，AAVS1c位点SaCas9切割DNA后，在DSB处+A的比例为1.16％(I图)，AAVS1d位点SaCas9切割DNA后，SaCas9在DSB处+T的比例为9.59％(II图)。

图12(a)和图12(b)展示SaCas9和SpCas9不同的切割模式和KI的结果。图12(a)为AAVS1d位点SpCas9和SaCas9切割DNA后不同的修复模式代表图，图12(b)中I图为SpCas9和SaCas9切割DNA后不同的修复模式的+T比例统计图，SpCas9在DSB处+T的相对比例为60％，SaCas9在DSB处+A的相对比例为20％。图12(b)中II图显示在DSB处+A的相对比例低的SaCas9 HDR效率高。

因此，SaCas9和SpCas9切割DNA造成DSB后具有不同的修复模式。在AAVS1c位点和AAVS1d位点切割造成DSB时，细胞主要以NHEJ修复方式为主。其中，+T的比例显示的比例SpCas9比SaCas9高，这种差异导致在有外源同源重组模板时，SaCas9进行切割时发生同源重组修复的比例更高。这一结果表明，相比SpCas9基因编辑系统，使用SaCas9核酸内切酶能够提高HDR编辑效率。

综上所述，本发明提供一种CRISPR-SaCas9基因编辑系统及其应用，所述基因编辑系统的脱靶率较低，基因敲入效率提高20～30％，最高体外HDR效率可到40％以上。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国医学科学院血液病医院（中国医学科学院血液学研究所）

<120> 一种CRISPR-SaCas9基因编辑系统及其应用

<130> 20210628

<160> 49

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ser Glu Ser Ser Ser Lys Ser Ser Gln Pro Leu Ala Ser Lys Gln

1 5 10 15

Glu Lys Asp Gly Thr Glu Lys Arg Gly Arg Gly Arg Pro Arg Lys Gln

20 25 30

Pro Pro Val Ser Pro Gly Thr Ala Leu Val Gly Ser Gln Lys Glu Pro

35 40 45

Ser Glu Val Pro Thr Pro Lys Arg Pro Arg Gly Arg Pro Lys Gly Ser

50 55 60

Lys Asn Lys Gly Ala Ala Lys Thr Arg Lys Thr Thr Thr Thr Pro Gly

65 70 75 80

Arg Lys Pro Arg Gly Arg Pro Lys Lys Leu Glu Lys Glu Glu Glu Glu

85 90 95

Gly Ile Ser Gln Glu Ser Ser Glu Glu Glu Gln

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<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ser Ala Arg Gly Glu Gly Ala Gly Gln Pro Ser Thr Ser Ala Gln

1 5 10 15

Gly Gln Pro Ala Ala Pro Ala Pro Gln Lys Arg Gly Arg Gly Arg Pro

20 25 30

Arg Lys Gln Gln Gln Glu Pro Thr Gly Glu Pro Ser Pro Lys Arg Pro

35 40 45

Arg Gly Arg Pro Lys Gly Ser Lys Asn Lys Ser Pro Ser Lys Ala Ala

50 55 60

Gln Lys Lys Ala Glu Ala Thr Gly Glu Lys Arg Pro Arg Gly Arg Pro

65 70 75 80

Arg Lys Trp Pro Gln Gln Val Val Gln Lys Lys Pro Ala Gln Glu Glu

85 90 95

Thr Glu Glu Thr Ser Ser Gln Glu Ser Ala Glu Glu Asp

100 105

<210> 3

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr

1 5 10 15

Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro

20 25 30

Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg

35 40 45

Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala

50 55 60

Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro

65 70 75 80

Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys

85 90 95

Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys

100 105 110

Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys

115 120 125

Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr

130 135 140

Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala

145 150 155 160

Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val

165 170 175

Lys Ala Glu Lys Ser Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu

180 185 190

Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Asp Glu Asp Glu

195 200 205

Glu Glu Asp Asp Asp Asp Glu

210 215

<210> 4

<211> 209

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Gly Lys Gly Asp Pro Asn Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr

1 5 10 15

Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro

20 25 30

Asp Ser Ser Val Asn Phe Ala Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg

35 40 45

Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Ser Lys Phe Glu Asp Met Ala

50 55 60

Lys Ser Asp Lys Ala Arg Tyr Asp Arg Glu Met Lys Asn Tyr Val Pro

65 70 75 80

Pro Lys Gly Asp Lys Lys Gly Lys Lys Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys

85 90 95

Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu His Arg Pro Lys

100 105 110

Ile Lys Ser Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Thr Ala Lys Lys

115 120 125

Leu Gly Glu Met Trp Ser Glu Gln Ser Ala Lys Asp Lys Gln Pro Tyr

130 135 140

Glu Gln Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala

145 150 155 160

Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Ser Glu Ala Gly Lys Lys Gly Pro Gly

165 170 175

Arg Pro Thr Gly Ser Lys Lys Lys Asn Glu Pro Glu Asp Glu Glu Glu

180 185 190

Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu

195 200 205

Glu

<210> 5

<211> 200

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Met Ala Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Lys Gly Lys Met Ser Ala Tyr

1 5 10 15

Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys Asn Pro

20 25 30

Glu Val Pro Val Asn Phe Ala Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg

35 40 45

Trp Lys Thr Met Ser Gly Lys Glu Lys Ser Lys Phe Asp Glu Met Ala

50 55 60

Lys Ala Asp Lys Val Arg Tyr Asp Arg Glu Met Lys Asp Tyr Gly Pro

65 70 75 80

Ala Lys Gly Gly Lys Lys Lys Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro

85 90 95

Pro Ser Gly Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Phe Arg Pro Lys Ile Lys

100 105 110

Ser Thr Asn Pro Gly Ile Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys Leu Gly

115 120 125

Glu Met Trp Asn Asn Leu Asn Asp Ser Glu Lys Gln Pro Tyr Ile Thr

130 135 140

Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Val Ala Asp Tyr

145 150 155 160

Lys Ser Lys Gly Lys Phe Asp Gly Ala Lys Gly Pro Ala Lys Val Ala

165 170 175

Arg Lys Lys Val Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu

180 185 190

Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu

195 200

<210> 6

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Lys Arg Thr Ala Asp Gly Ser Glu Phe Glu Ser Pro Lys Lys Lys Arg

1 5 10 15

Lys Val Glu

<210> 7

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys

1 5 10 15

<210> 8

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atgagtgagt cgagctcgaa gtccagccag cccttggcct ccaagcagga aaaggacggc 60

actgagaagc ggggccgggg caggccgcgc aagcagcctc cggtgagtcc cgggacagcg 120

ctggtaggga gtcagaagga gcccagcgaa gtgccaacac ctaagagacc tcggggccga 180

ccaaagggaa gcaaaaacaa gggtgctgcc aagacccgga aaaccaccac aactccagga 240

aggaaaccaa ggggcagacc caaaaaactg gagaaggagg aagaggaggg catctcgcag 300

gagtcctcgg aggaggagca g 321

<210> 9

<211> 327

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atgagcgcac gcggtgaggg cgcggggcag ccgtccactt cagcccaggg acaacctgcc 60

gccccagcgc ctcagaagag aggacgcggc cgccccagga agcagcagca agaaccaacc 120

ggtgagccct ctcctaagag acccagggga agacccaaag gcagcaaaaa caagagtccc 180

tctaaagcag ctcaaaagaa agcagaagcc actggagaaa aacggccaag aggcagacct 240

aggaaatggc cacaacaagt tgttcagaag aagcctgctc aggaggaaac tgaagagaca 300

tcctcacaag agtctgccga agaggac 327

<210> 10

<211> 645

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

atgggcaaag gagatcctaa gaagccgaga ggcaaaatgt catcatatgc attttttgtg 60

caaacttgtc gggaggagca taagaagaag cacccagatg cttcagtcaa cttctcagag 120

ttttctaaga agtgctcaga gaggtggaag accatgtctg ctaaagagaa aggaaaattt 180

gaagatatgg caaaggcgga caaggcccgt tatgaaagag aaatgaaaac ctatatccct 240

cccaaagggg agacaaaaaa gaagttcaag gatcccaatg cacccaagag gcctccttcg 300

gccttcttcc tcttctgctc tgagtatcgc ccaaaaatca aaggagaaca tcctggcctg 360

tccattggtg atgttgcgaa gaaactggga gagatgtgga ataacactgc tgcagatgac 420

aagcagcctt atgaaaagaa ggctgcgaag ctgaaggaaa aatacgaaaa ggatattgct 480

gcatatcgag ctaaaggaaa gcctgatgca gcaaaaaagg gagttgtcaa ggctgaaaaa 540

agcaagaaaa agaaggaaga ggaggaagat gaggaagatg aagaggatga ggaggaggag 600

gaagatgaag aagatgaaga tgaagaagaa gatgatgatg atgaa 645

<210> 11

<211> 627

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atgggtaaag gagaccccaa caagccgcgg ggcaaaatgt cctcgtacgc cttcttcgtg 60

cagacctgcc gggaagagca caagaagaaa cacccggact cttccgtcaa tttcgcggaa 120

ttctccaaga agtgttcgga gagatggaag accatgtctg caaaggagaa gtcgaagttt 180

gaagatatgg caaaaagtga caaagctcgc tatgacaggg agatgaaaaa ttacgttcct 240

cccaaaggtg ataagaaggg gaagaaaaag gaccccaatg ctcctaaaag gccaccatct 300

gccttcttcc tgttttgctc tgaacatcgc ccaaagatca aaagtgaaca ccctggccta 360

tccattgggg atactgcaaa gaaattgggt gaaatgtggt ctgagcagtc agccaaagat 420

aaacaaccat atgaacagaa agcagctaag ctaaaggaga aatatgaaaa ggatattgct 480

gcatatcgtg ccaagggcaa aagtgaagca ggaaagaagg gccctggcag gccaacaggc 540

tcaaagaaga agaacgaacc agaagatgag gaggaggagg aggaagaaga agatgaagat 600

gaggaggaag aggatgaaga tgaagaa 627

<210> 12

<211> 600

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

atggctaaag gtgaccccaa gaaaccaaag ggcaagatgt ccgcttatgc cttctttgtg 60

cagacatgca gagaagaaca taagaagaaa aacccagagg tccctgtcaa ttttgcggaa 120

ttttccaaga agtgctctga gaggtggaag acgatgtccg ggaaagagaa atctaaattt 180

gatgaaatgg caaaggcaga taaagtgcgc tatgatcggg aaatgaagga ttatggacca 240

gctaagggag gcaagaagaa gaaggatcct aatgctccca aaaggccacc gtctggattc 300

ttcctgttct gttcagaatt ccgccccaag atcaaatcca caaaccccgg catctctatt 360

ggagacgtgg caaaaaagct gggtgagatg tggaataatt taaatgacag tgaaaagcag 420

ccttacatca ctaaggcggc aaagctgaag gagaagtatg agaaggatgt tgctgactat 480

aagtcgaaag gaaagtttga tggtgcaaag ggtcctgcta aagttgcccg gaaaaaggtg 540

gaagaggaag atgaagaaga ggaggaggaa gaagaggagg aggaggagga ggaggatgaa 600

<210> 13

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

aagcggactg ctgatggcag tgaatttgag tccccaaaga agaagagaaa ggtggaa 57

<210> 14

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

aagaggcccg ccgccaccaa gaaggccggc caggccaaga agaagaag 48

<210> 15

<211> 1102

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 15

Met Lys Arg Thr Ala Asp Gly Ser Glu Phe Glu Ser Pro Lys Lys Lys

1 5 10 15

Arg Lys Val Glu Gly Gly Ser Thr Arg Met Lys Arg Asn Tyr Ile Leu

20 25 30

Gly Leu Asp Ile Gly Ile Thr Ser Val Gly Tyr Gly Ile Ile Asp Tyr

35 40 45

Glu Thr Arg Asp Val Ile Asp Ala Gly Val Arg Leu Phe Lys Glu Ala

50 55 60

Asn Val Glu Asn Asn Glu Gly Arg Arg Ser Lys Arg Gly Ala Arg Arg

65 70 75 80

Leu Lys Arg Arg Arg Arg His Arg Ile Gln Arg Val Lys Lys Leu Leu

85 90 95

Phe Asp Tyr Asn Leu Leu Thr Asp His Ser Glu Leu Ser Gly Ile Asn

100 105 110

Pro Tyr Glu Ala Arg Val Lys Gly Leu Ser Gln Lys Leu Ser Glu Glu

115 120 125

Glu Phe Ser Ala Ala Leu Leu His Leu Ala Lys Arg Arg Gly Val His

130 135 140

Asn Val Asn Glu Val Glu Glu Asp Thr Gly Asn Glu Leu Ser Thr Lys

145 150 155 160

Glu Gln Ile Ser Arg Asn Ser Lys Ala Leu Glu Glu Lys Tyr Val Ala

165 170 175

Glu Leu Gln Leu Glu Arg Leu Lys Lys Asp Gly Glu Val Arg Gly Ser

180 185 190

Ile Asn Arg Phe Lys Thr Ser Asp Tyr Val Lys Glu Ala Lys Gln Leu

195 200 205

Leu Lys Val Gln Lys Ala Tyr His Gln Leu Asp Gln Ser Phe Ile Asp

210 215 220

Thr Tyr Ile Asp Leu Leu Glu Thr Arg Arg Thr Tyr Tyr Glu Gly Pro

225 230 235 240

Gly Glu Gly Ser Pro Phe Gly Trp Lys Asp Ile Lys Glu Trp Tyr Glu

245 250 255

Met Leu Met Gly His Cys Thr Tyr Phe Pro Glu Glu Leu Arg Ser Val

260 265 270

Lys Tyr Ala Tyr Asn Ala Asp Leu Tyr Asn Ala Leu Asn Asp Leu Asn

275 280 285

Asn Leu Val Ile Thr Arg Asp Glu Asn Glu Lys Leu Glu Tyr Tyr Glu

290 295 300

Lys Phe Gln Ile Ile Glu Asn Val Phe Lys Gln Lys Lys Lys Pro Thr

305 310 315 320

Leu Lys Gln Ile Ala Lys Glu Ile Leu Val Asn Glu Glu Asp Ile Lys

325 330 335

Gly Tyr Arg Val Thr Ser Thr Gly Lys Pro Glu Phe Thr Asn Leu Lys

340 345 350

Val Tyr His Asp Ile Lys Asp Ile Thr Ala Arg Lys Glu Ile Ile Glu

355 360 365

Asn Ala Glu Leu Leu Asp Gln Ile Ala Lys Ile Leu Thr Ile Tyr Gln

370 375 380

Ser Ser Glu Asp Ile Gln Glu Glu Leu Thr Asn Leu Asn Ser Glu Leu

385 390 395 400

Thr Gln Glu Glu Ile Glu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Gly Tyr Thr Gly

405 410 415

Thr His Asn Leu Ser Leu Lys Ala Ile Asn Leu Ile Leu Asp Glu Leu

420 425 430

Trp His Thr Asn Asp Asn Gln Ile Ala Ile Phe Asn Arg Leu Lys Leu

435 440 445

Val Pro Lys Lys Val Asp Leu Ser Gln Gln Lys Glu Ile Pro Thr Thr

450 455 460

Leu Val Asp Asp Phe Ile Leu Ser Pro Val Val Lys Arg Ser Phe Ile

465 470 475 480

Gln Ser Ile Lys Val Ile Asn Ala Ile Ile Lys Lys Tyr Gly Leu Pro

485 490 495

Asn Asp Ile Ile Ile Glu Leu Ala Arg Glu Lys Asn Ser Lys Asp Ala

500 505 510

Gln Lys Met Ile Asn Glu Met Gln Lys Arg Asn Arg Gln Thr Asn Glu

515 520 525

Arg Ile Glu Glu Ile Ile Arg Thr Thr Gly Lys Glu Asn Ala Lys Tyr

530 535 540

Leu Ile Glu Lys Ile Lys Leu His Asp Met Gln Glu Gly Lys Cys Leu

545 550 555 560

Tyr Ser Leu Glu Ala Ile Pro Leu Glu Asp Leu Leu Asn Asn Pro Phe

565 570 575

Asn Tyr Glu Val Asp His Ile Ile Pro Arg Ser Val Ser Phe Asp Asn

580 585 590

Ser Phe Asn Asn Lys Val Leu Val Lys Gln Glu Glu Asn Ser Lys Lys

595 600 605

Gly Asn Arg Thr Pro Phe Gln Tyr Leu Ser Ser Ser Asp Ser Lys Ile

610 615 620

Ser Tyr Glu Thr Phe Lys Lys His Ile Leu Asn Leu Ala Lys Gly Lys

625 630 635 640

Gly Arg Ile Ser Lys Thr Lys Lys Glu Tyr Leu Leu Glu Glu Arg Asp

645 650 655

Ile Asn Arg Phe Ser Val Gln Lys Asp Phe Ile Asn Arg Asn Leu Val

660 665 670

Asp Thr Arg Tyr Ala Thr Arg Gly Leu Met Asn Leu Leu Arg Ser Tyr

675 680 685

Phe Arg Val Asn Asn Leu Asp Val Lys Val Lys Ser Ile Asn Gly Gly

690 695 700

Phe Thr Ser Phe Leu Arg Arg Lys Trp Lys Phe Lys Lys Glu Arg Asn

705 710 715 720

Lys Gly Tyr Lys His His Ala Glu Asp Ala Leu Ile Ile Ala Asn Ala

725 730 735

Asp Phe Ile Phe Lys Glu Trp Lys Lys Leu Asp Lys Ala Lys Lys Val

740 745 750

Met Glu Asn Gln Met Phe Glu Glu Lys Gln Ala Glu Ser Met Pro Glu

755 760 765

Ile Glu Thr Glu Gln Glu Tyr Lys Glu Ile Phe Ile Thr Pro His Gln

770 775 780

Ile Lys His Ile Lys Asp Phe Lys Asp Tyr Lys Tyr Ser His Arg Val

785 790 795 800

Asp Lys Lys Pro Asn Arg Glu Leu Ile Asn Asp Thr Leu Tyr Ser Thr

805 810 815

Arg Lys Asp Asp Lys Gly Asn Thr Leu Ile Val Asn Asn Leu Asn Gly

820 825 830

Leu Tyr Asp Lys Asp Asn Asp Lys Leu Lys Lys Leu Ile Asn Lys Ser

835 840 845

Pro Glu Lys Leu Leu Met Tyr His His Asp Pro Gln Thr Tyr Gln Lys

850 855 860

Leu Lys Leu Ile Met Glu Gln Tyr Gly Asp Glu Lys Asn Pro Leu Tyr

865 870 875 880

Lys Tyr Tyr Glu Glu Thr Gly Asn Tyr Leu Thr Lys Tyr Ser Lys Lys

885 890 895

Asp Asn Gly Pro Val Ile Lys Lys Ile Lys Tyr Tyr Gly Asn Lys Leu

900 905 910

Asn Ala His Leu Asp Ile Thr Asp Asp Tyr Pro Asn Ser Arg Asn Lys

915 920 925

Val Val Lys Leu Ser Leu Lys Pro Tyr Arg Phe Asp Val Tyr Leu Asp

930 935 940

Asn Gly Val Tyr Lys Phe Val Thr Val Lys Asn Leu Asp Val Ile Lys

945 950 955 960

Lys Glu Asn Tyr Tyr Glu Val Asn Ser Lys Cys Tyr Glu Glu Ala Lys

965 970 975

Lys Leu Lys Lys Ile Ser Asn Gln Ala Glu Phe Ile Ala Ser Phe Tyr

980 985 990

Asn Asn Asp Leu Ile Lys Ile Asn Gly Glu Leu Tyr Arg Val Ile Gly

995 1000 1005

Val Asn Asn Asp Leu Leu Asn Arg Ile Glu Val Asn Met Ile Asp

1010 1015 1020

Ile Thr Tyr Arg Glu Tyr Leu Glu Asn Met Asn Asp Lys Arg Pro

1025 1030 1035

Pro Arg Ile Ile Lys Thr Ile Ala Ser Lys Thr Gln Ser Ile Lys

1040 1045 1050

Lys Tyr Ser Thr Asp Ile Leu Gly Asn Leu Tyr Glu Val Lys Ser

1055 1060 1065

Lys Lys His Pro Gln Ile Ile Lys Lys Gly Gly Gly Gly Gly Ser

1070 1075 1080

Lys Arg Thr Ala Asp Gly Ser Glu Phe Glu Ser Pro Lys Lys Lys

1085 1090 1095

Arg Lys Val Glu

1100

<210> 16

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

agcggcagcg agactcccgg gacctcagag tccgctacac ccgaaagtac gcgt 54

<210> 17

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ggtggtggtg gttctggtgg tggtggttcc ggcggcggcg gctctggtgg tggtggatcc 60

<210> 18

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ggtggtggtg gttctggtgg tggtggttcc ggcggcggcg gctct 45

<210> 19

<211> 93

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gtttaagtac tctgtgctgg aaacagcaca gaatctactt aaacaaggca aaatgccgtg 60

tttatctcgt caacttgttg gcgagatttt ttt 93

<210> 20

<211> 93

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gttatagtac tctgtgctgg aaacagcaca gaatctacta taacaaggca aaatgccgtg 60

tttatctcgt caacttgttg gcgagatttt ttt 93

<210> 21

<211> 93

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

gtattagtac tctgtgctgg aaacagcaca gaatctacta atacaaggca aaatgccgtg 60

tttatctcgt caacttgttg gcgagatttt ttt 93

<210> 22

<211> 93

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gtttcagtac tctgtgctgg aaacagcaca gaatctactg aaacaaggca aaatgccgtg 60

tttatctcgt caacttgttg gcgagatttt ttt 93

<210> 23

<211> 93

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

gttctagtac tctgtgctgg aaacagcaca gaatctacta gaacaaggca aaatgccgtg 60

tttatctcgt caacttgttg gcgagatttt ttt 93

<210> 24

<211> 93

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

gtcttagtac tctgtgctgg aaacagcaca gaatctacta agacaaggca aaatgccgtg 60

tttatctcgt caacttgttg gcgagatttt ttt 93

<210> 25

<211> 83

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

gttttagtac tctggaaaca gaatctacta aaacaaggca aaatgccgtg tttatctcgt 60

caacttgttg gcgagatttt ttt 83

<210> 26

<211> 643

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

cccacctttc tcatccaaga ctggctcctc cctgccgggg ctgcgtgcaa ccctggggtt 60

gggggttctg gggactggct ttcccataat ttcctttcaa ggtggggagg gaggtagagg 120

ggtgatgtgg ggagtacgct gcagggcctc actccttttg cagaccacag tccatgccat 180

cactgccacc cagaagactg tggatggccc ctccgggaaa ctgtggcgtg atggccgcgg 240

ggctctccag aacatcatcc ctgcctctac tggcgctgcc aaggctgtgg gcaaggtcat 300

ccctgagctg aacgggaagc tcactggcat ggccttccgt gtccccactg ccaacgtgtc 360

agtggtggac ctgacctgcc gtctagaaaa acctgccaaa tatgatgaca tcaagaaggt 420

ggtgaagcag gcgtcggagg gccccctcaa gggcatcctg ggctacactg agcaccaggt 480

ggtctcctct gacttcaaca gcgacaccca ctcctccacc tttgacgctg gggctggcat 540

tgccctcaac gaccactttg tcaagctcat ttcctggtat gacaacgaat ttggctacag 600

caacagggtg gtggacctca tggcccacat ggcctccaag gag 643

<210> 27

<211> 491

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

gacccctgga ccaccagccc cagcaagagc acaagaggaa gagagagacc ctcactgctg 60

gggagtccct gccacactca gtcccccacc acactgaatc tcccctcctc acagttgcca 120

tgtagacccc ttgaagaggg gaggggccta gggagccgca ccttgtcatg taccatcaat 180

aaagtaccct gtgctcaacc agttacttgt cctgtcttat tctagggtct ggggcagagg 240

ggagggaagc tgggcttgtg tcaaggtgag acattcttgc tggggaggga cctggtatgt 300

tctcctcaga ctgagggtag ggcctccaaa cagccttgct tgcttcgaga accatttgct 360

tcccgctcag acgtcttgag tgctacagga agctggcacc actacttcag agaacaaggc 420

cttttcctct cctcgctcca gtcctaggct atctgctgtt ggccaaacat ggaagaagct 480

attctgtggg c 491

<210> 28

<211> 782

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

ggggtaaaca aagttgaatt tgagttgata gagtactgtc tgccttcata ggtatttagt 60

atgctgtaaa tatttttagg tattggtact gttcctgttg gccgagtgga gactggtgtt 120

ctcaaacccg gtatggtggt cacctttgct ccagtcaacg ttacaacgga agtaaaatct 180

gtcgaaatgc accatgaagc tttgagtgaa gctcttcctg gggacaatgt gggcttcaat 240

gtcaagaatg tgtctgtcaa ggatgttcgt cgtggcaacg ttgctggtga cagcaaaaat 300

gacccaccaa tggaagcagc tggcttcact gctcaggtaa caatttaaag taacattaac 360

ttattgcaga ggctaaagtc atttgagact ttggatttgc actgaatgca aatctttttt 420

ccaaggtgat tatcctgaac catccaggcc aaataagcgc cggctatgcc cctgtattgg 480

attgccacac ggctcacatt gcatgcaagt ttgctgagct gaaggaaaag attgatcgcc 540

gttctggtaa aaagctggaa gatggcccta aattcttgaa gtctggtgat gctgccattg 600

ttgatatggt tcctggcaag cccatgtgtg ttgagagctt ctcagactat ccacctttgg 660

gtcgctttgc tgttcgtgat atgagacaga cagttgcggt gggtgtcatc aaagcagtgg 720

acaagaaggc tgctggagct ggcaaggtca ccaagtctgc ccagaaagct cagaaggcta 780

aa 782

<210> 29

<211> 527

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

tgaatattat ccctaatacc tgccacccca ctcttaatca gtggtggaag aacggtctca 60

gaactgtttg tttcaattgg ccatttaagt ttagtagtaa aagactggtt aatgataaca 120

atgcatcgta aaaccttcag aaggaaagga gaatgttttg tggaccactt tggttttctt 180

ttttgcgtgt ggcagtttta agttattagt ttttaaaatc agtacttttt aatggaaaca 240

acttgaccaa aaatttgtca cagaattttg agacccatta aaaaagttaa atgagaaacc 300

tgtgtgttcc tttggtcaac accgagacat ttaggtgaaa gacatctaat tctggtttta 360

cgaatctgga aacttcttga aaatgtaatt cttgagttaa cacttctggg tggagaatag 420

ggttgttttc cccccacata attggaaggg gaaggaatat catttaaagc tatgggaggg 480

ttgctttgat tacaacactg gagagaaatg cagcatgttg ctgattg 527

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

gaatacaact gaacagtact 20

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

gaaatacaac tgaacagtac t 21

<210> 32

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

gaaaatacaa ctgaacagta ct 22

<210> 33

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

gaaaaataca actgaacagt act 23

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

ggactggctc ttaaaaagtg 20

<210> 35

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

gagactggct cttaaaaagt g 21

<210> 36

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

ggagactggc tcttaaaaag tg 22

<210> 37

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

gagagactgg ctcttaaaaa gtg 23

<210> 38

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

gagactggct cttaaaaagt g 21

<210> 39

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

ggagactggc tcttaaaaag tg 22

<210> 40

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

gacagcagag agcaagggga aga 23

<210> 41

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

gcagcagaga gcaaggggaa ga 22

<210> 42

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

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gagcagagag caaggggaag a 21

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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ggcagagagc aaggggaaga 20

<210> 44

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

gcagagagca aggggaaga 19

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

gagcagagag caaggggaag a 21

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

ggcagagagc aaggggaaga 20

<210> 47

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

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gcagagagca aggggaaga 19

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gagagagcaa ggggaaga 18

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<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

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gacagcagag agcaagggga aga 23

Claims

1.一种CRISPR-SaCas9基因编辑系统，其特征在于，所述CRISPR-SaCas9基因编辑系统包括：SaCas9载体、sgRNA载体和同源重组模板pDonor载体；

2.根据权利要求1所述的CRISPR-SaCas9基因编辑系统，其特征在于，所述SaCas9编码基因与核定位信号的连接序列包括SEQ ID NO.16～18所述的核苷酸序列中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述连接序列连接于SaCas9编码基因的N端和/或C端。

3.根据权利要求1或2所述的CRISPR-SaCas9基因编辑系统，其特征在于，所述SaCas9载体的启动子包括EF1启动子、CAG启动子或CMV启动子中的任意一种。

4.根据权利要求1～3任一项所述的CRISPR-SaCas9基因编辑系统，其特征在于，所述SaCas9编码基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。

5.根据权利要求1～4任一项所述的CRISPR-SaCas9基因编辑系统，其特征在于，所述sgRNA载体包括启动子、靶向序列和骨架结构；

优选地，所述靶向序列的长度为21～23nt，优选为21nt或22nt。

6.根据权利要求5所述的CRISPR-SaCas9基因编辑系统，其特征在于，所述sgRNA载体的启动子包括U6启动子；

优选地，所述sgRNA载体的骨架结构包括SEQ ID NO.19～24任一项所示的核苷酸序列。

7.根据权利要求1～6任一项所述的CRISPR-SaCas9基因编辑系统，其特征在于，所述同源重组模板pDonor载体包含供体序列的供体DNA；

优选地，所述供体DNA采用单链DNA模板供体、AAV腺相关病毒模板供体或质粒模板供体中的任意一种方式插入基因组中；

优选地，所述AAV腺相关病毒模板供体的AAV为单链或者双链AAV，其血清型为AAV6。

8.根据权利要求1～7任一项所述的CRISPR-SaCas9基因编辑系统，其特征在于，所述SaCas9载体为质粒、腺病毒载体或慢病毒载体的任意一种；

优选地，所述sgRNA载体为质粒、腺病毒载体或慢病毒载体的任意一种；

优选地，所述同源重组模板pDonor载体为质粒、腺病毒载体或慢病毒载体的任意一种。

9.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含如权利要求1～8任一项所述的CRISPR-SaCas9基因编辑系统；

优选地，所述宿主细胞包括人原代细胞；

优选地，所述人原代细胞包括人诱导多能干细胞、人原代T细胞或人造血干细胞中的任意一种。

10.如权利要求1～8任一项所述的CRISPR-SaCas9基因编辑系统在制备基因编辑的细胞和/或药物中的应用。