CN113025659A - 一种治疗a型血友病的基因编辑系统及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种治疗A型血友病的基因编辑系统及其应用，所述基因编辑系统包括CRISPR‑SaCas9基因编辑载体和F8供体载体；所述CRISPR‑SaCas9基因编辑载体包括串联的SaCas9编码基因和sgRNA，所述sgRNA的靶基因为Alb基因内含子；所述F8供体载体包括截短型F8基因。本发明利用腺相关病毒将SaCas9、sgRNA和BDDF8导入肝细胞，BDDF8通过NHEJ途径定点插入到Alb内含子位点，剪接形成Alb和BDDF8的融合转录本，自断裂多肽促使形成Alb和BDDF8蛋白两种蛋白，F8在小鼠中稳定表达一年，所述基因编辑系统无毒副作用，是潜在的A型血友病治疗药物。

Description

一种治疗A型血友病的基因编辑系统及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种治疗A型血友病的基因编辑系统及其应用。

背景技术

A型血友病(Hemophilia A，HA)是凝血因子F8基因突变或缺失导致的一类出血性疾病，属于X染色体连锁单基因隐性遗传病。在男性人群中，A型血友病的发病率约为1/5000。根据患者血浆中的F8活性，A型血友病分为轻型(F8活性为正常水平的5％～40％)、中间型(F8活性为正常水平的1％～5％)和重型(F8活性低于正常水平的1％)。轻型和中间型HA患者症状较轻，重型HA患者在关节、软组织等处容易出现自发性或诱发性出血，导致疼痛性、致残性关节炎，同时增加颅内出血和早期死亡的风险。A型血友病的临床表现主要包括关节、肌肉和深部组织出血，以及胃肠道、泌尿道和中枢神经系统出血。若反复出血，不及时治疗可能导致关节畸形和/或假肿瘤形成，严重者可危及生命。

目前，A型血友病的主要治疗方法为替代治疗，即直接向患者输注新鲜全血、血浆或F8浓缩制剂，例如一些发达国家根据医疗标准向HA患者静脉注射外源F8从而预防出血。然而，替代治疗费用昂贵，为患者家庭和国家医保系统带来沉重负担。对于A型血友病等单基因遗传病，基因治疗是实现治愈的唯一途径。

基因治疗是一种以改变基因表达为手段的治疗与预防遗传性疾病和多因素疾病的方法，它通过基因工程的手段，将正常基因(包括调控序列)导入基因突变的患者体内，使导入的基因发挥作用或使突变基因在原位进行校正和修复，从而纠正因基因缺陷导致的各项异常表现。

腺相关病毒(Adeno-associated Virus，AAV)是一种具有单链DNA基因组的小型、非致病性、复制缺陷的细小病毒，具有安全性好、宿主细胞范围广、免疫源性低等优点，在临床基因治疗研究中得到广泛应用。目前靶向肝脏组织的血清型AAV载体主要包括AAV2、AAV5和AAV8。

现有技术鲜有基于腺相关病毒的基因治疗方法应用于A型血友病治疗的方案。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种治疗A型血友病的基因编辑系统及其应用，利用腺相关病毒载体将CRISPR-SaCas9基因编辑系统和F8基因供体递送至F8基因突变或缺失的肝细胞内，实现了F8稳定表达于肝细胞中的效果。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种基因编辑系统，所述基因编辑系统包括CRISPR-SaCas9基因编辑载体和F8供体载体；

所述CRISPR-SaCas9基因编辑载体包括串联的SaCas9编码基因和sgRNA，所述sgRNA的靶基因为Alb基因内含子；

所述F8供体载体包括截短型F8基因。

本发明中，利用腺相关病毒载体介导SaCas9、靶向Alb基因内含子的sgRNA和F8基因供体导入肝细胞，进行基因编辑，在Alb位点插入无启动子F8表达盒；内源性Alb启动子/增强子在BDDF8处整合和转录后，通过E2A介导的核糖体跳读产生Alb和BDDF8两种蛋白，实现对A型血友病的治疗，原理示意图如图1所示。

优选地，所述sgRNA的靶基因包括Alb基因第11号内含子和/或Alb基因第13号内含子。

优选地，所述SaCas9编码基因的启动子和所述sgRNA的启动子不同。

优选地，所述SaCas9编码基因的启动子包括肝细胞特异性启动子，显著提高了SaCas9在肝细胞中的特异性表达。

优选地，所述sgRNA的启动子包括U6启动子。

优选地，所述SaCas9编码基因和所述sgRNA之间还包括Wpre，有助于提高SaCas9的表达量。

优选地，所述Wpre和sgRNA的启动子之间还包括PolyA或miR-142-3p靶序列，其中，miR-142-3p是造血细胞特异性表达的miRNA，在CRISPR-SaCas9基因编辑载体上增加miR-142-3p靶序列miR-142-T，可以有效降低SaCas9在免疫细胞中的表达，并降低SaCas9引起的免疫反应。

优选地，所述截短型F8基因为缺失了B结构域的F8基因BDDF8。

优选地，所述F8供体载体包括截短型F8基因和天门冬酰胺糖基化位点N6的融合基因，6个天门冬酰胺(N)糖基化位点进一步提高了BDDF8的活性。

优选地，所述F8供体载体在截短型F8基因上游还包括剪接受体序列，以促进F8基因与Alb基因转录后的拼接。

优选地，所述剪接受体序列和截短型F8基因之间还包括自断裂多肽基因。

优选地，所述F8供体载体在截短型F8基因下游还包括PolyA序列。

本发明中，CRISPR-SaCas9基因编辑载体在基因组特定位点引入DNA双链断裂，SaCas9蛋白在sgRNA的引导下识别基因组特异位点，并发挥分子剪刀的作用，切割DNA造成双链断裂；DNA双链断裂后，细胞利用非同源末端连接(NHEJ)将F8供体模板插入到断裂位点，并在5’端携带一段长度为40～100bp的Alb第13号内含子剪接序列和第14号外显子序列，3’端为BDDF8编码序列，Alb终止密码子被E2A自断裂多肽替换。

优选地，所述sgRNA的靶基因包括SEQ ID NO:1～15之一所示的核酸序列，其中，SEQ ID NO:1～6靶向Alb基因第11号内含子，SEQ ID NO:7～15靶向Alb基因第13号内含子；

SEQ ID NO:1(sgAlb-In11a-gN20)：gATCTAACTTTCAGGAGCAAG；

SEQ ID NO:2(sgAlb-In11a-gN21)：gAATCTAACTTTCAGGAGCAAG；

SEQ ID NO:3(sgAlb-In11a-gN22)：gAAATCTAACTTTCAGGAGCAAG；

SEQ ID NO:4(sgAlb-In11b-gN20)：gAATTGCCATGCCAATCAAGG；

SEQ ID NO:5(sgAlb-In11b-gN21)：gAAATTGCCATGCCAATCAAGG；

SEQ ID NO:6(sgAlb-In11b-gN22)：gTAAATTGCCATGCCAATCAAGG；

SEQ ID NO:7(sgAlb-In13a-gN20)：gTTGGTGGAGTTATTCAGTGT；

SEQ ID NO:8(sgAlb-In13a-gN21)：gATTGGTGGAGTTATTCAGTGT；

SEQ ID NO:9(sgAlb-In13a-gN22)：gGATTGGTGGAGTTATTCAGTGT；

SEQ ID NO:10(sgAlb-In13b-gN20)：gCATTTCAGGGCAAGGTTTAA；

SEQ ID NO:11(sgAlb-In13b-gN21)：gACATTTCAGGGCAAGGTTTAA；

SEQ ID NO:12(sgAlb-In13b-gN22)：gAACATTTCAGGGCAAGGTTTAA；

SEQ ID NO:13(sgAlb-In13c-gN20)：gAAAAGTATTAGCAGGACTGT；

SEQ ID NO:14(sgAlb-In13c-gN21)：gGAAAAGTATTAGCAGGACTGT；

SEQ ID NO:15(sgAlb-In13c-gN22)：gAGAAAAGTATTAGCAGGACTGT。

优选地，所述sgRNA包括SEQ ID NO:16～30之一所示的核酸序列；

SEQ ID NO:16：

gatctaactttcaggagcaaggtttaagtactctgtgctggaaacagcacagaatctacttaaacaaggcaaaatgccgtgtttatctcgtcaacttgttggcgagattttttt；

SEQ ID NO:17：

gaatctaactttcaggagcaaggtttaagtactctgtgctggaaacagcacagaatctacttaaacaaggcaaaatgccgtgtttatctcgtcaacttgttggcgagattttttt；

SEQ ID NO:18：

gaaatctaactttcaggagcaaggtttaagtactctgtgctggaaacagcacagaatctacttaaacaaggcaaaatgccgtgtttatctcgtcaacttgttggcgagattttttt；

SEQ ID NO:19：

gaattgccatgccaatcaagggtttaagtactctgtgctggaaacagcacagaatctacttaaacaaggcaaaatgccgtgtttatctcgtcaacttgttggcgagattttttt；

SEQ ID NO:20：

gaaattgccatgccaatcaagggtttaagtactctgtgctggaaacagcacagaatctacttaaacaaggcaaaatgccgtgtttatctcgtcaacttgttggcgagattttttt；

SEQ ID NO:21：

gtaaattgccatgccaatcaagggtttaagtactctgtgctggaaacagcacagaatctacttaaacaaggcaaaatgccgtgtttatctcgtcaacttgttggcgagattttttt；

SEQ ID NO:22：

gttggtggagttattcagtgtgtttaagtactctgtgctggaaacagcacagaatctacttaaacaaggcaaaatgccgtgtttatctcgtcaacttgttggcgagattttttt；

SEQ ID NO:23：

gattggtggagttattcagtgtgtttaagtactctgtgctggaaacagcacagaatctacttaaacaaggcaaaatgccgtgtttatctcgtcaacttgttggcgagattttttt；

SEQ ID NO:24：

ggattggtggagttattcagtgtgtttaagtactctgtgctggaaacagcacagaatctacttaaacaaggcaaaatgccgtgtttatctcgtcaacttgttggcgagattttttt；

SEQ ID NO:25：

gcatttcagggcaaggtttaagtttaagtactctgtgctggaaacagcacagaatctacttaaacaaggcaaaatgccgtgtttatctcgtcaacttgttggcgagattttttt；

SEQ ID NO:26：

gacatttcagggcaaggtttaagtttaagtactctgtgctggaaacagcacagaatctacttaaacaaggcaaaatgccgtgtttatctcgtcaacttgttggcgagattttttt；

SEQ ID NO:27：

gaacatttcagggcaaggtttaagtttaagtactctgtgctggaaacagcacagaatctacttaaacaaggcaaaatgccgtgtttatctcgtcaacttgttggcgagattttttt；

SEQ ID NO:28：

gaaaagtattagcaggactgtgtttaagtactctgtgctggaaacagcacagaatctacttaaacaaggcaaaatgccgtgtttatctcgtcaacttgttggcgagattttttt；

SEQ ID NO:29：

ggaaaagtattagcaggactgtgtttaagtactctgtgctggaaacagcacagaatctacttaaacaaggcaaaatgccgtgtttatctcgtcaacttgttggcgagattttttt；

SEQ ID NO:30：

gagaaaagtattagcaggactgtgtttaagtactctgtgctggaaacagcacagaatctacttaaacaaggcaaaatgccgtgtttatctcgtcaacttgttggcgagattttttt。

优选地，所述肝细胞特异性启动子包括SEQ ID NO:31～33之一所示的核酸序列；

SEQ ID NO:31(HSP1)：

gggggaggctgctggtgaatattaaccaaggtcaccccagttatcggaggagcaaacaggggctaagtccactgttccgatactctaatctccctaggcaaggttcatatttgtgtaggttacttattctccttttgttgactaagtcaataatcagaatcagcaggtttggagtcagcttggcagggatcagcagcctgggttggaaggagggggtataaaagccccttcaccaggagaagccgtcacacagatccacaagctcct；

SEQ ID NO:32(HSP2)：

gggggaggctgctggtgaatattaaccaaggtcacccctgttccgatactctaatctccctaggcaaggttcatatttgtgtaggttacttattctccttttgttgactaagtcaataatcagaatcagcaggtttggagtcagcttggcagggatcagcagcctgggttggaaggagggggtataaaagccccttcaccaggagaagccgtcacacagatccacaagctcct；

SEQ ID NO:33(HSP3)：

agttatcggaggagcaaacaggggctaagtccactgttccgatactctaatctccctaggcaaggttcatatttgtgtaggttacttattctccttttgttgactaagtcaataatcagaatcagcaggtttggagtcagcttggcagggatcagcagcctgggttggaaggagggggtataaaagccccttcaccaggagaagccgtcacacagatccacaagctcct。

优选地，所述U6启动子包括SEQ ID NO:34所示的核酸序列；

SEQ ID NO:34：

atctttttccctctgccaaaaattatggggacatcatgaagccccttgagcatctgacttctggctaataaaggaaatttattttcattgcaatagtgtgttggaattttttgtgtctctcactcggtaccccagtggaaagacgcgcaggcaaaacgcaccacgtgacggagcgtgaccgcgcgccgagcgcgcgccaaggtcgggcaggaagagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttgggtttatatatcttgtggaaaggacgaaacacc。

优选地，所述Wpre包括SEQ ID NO:35所示的核酸序列；

SEQ ID NO:35：

aatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttagttcttgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgt。

优选地，所述PolyA包括SEQ ID NO:36所示的核酸序列；

SEQ ID NO:36：

atctttttccctctgccaaaaattatggggacatcatgaagccccttgagcatctgacttctggctaataaaggaaatttattttcattgcaatagtgtgttggaattttttgtgtctctcactcg。

优选地，所述miR-142靶序列包括SEQ ID NO:37～39之一所示的核酸序列；

SEQ ID NO:37(miR-142-3p-T2，包括2拷贝miR-142靶序列)：

atatgcgactccataaagtaggaaacactacacgattccataaagtaggaaacactacaaccg；

SEQ ID NO:38(miR-142-3p-T3，包括3拷贝miR-142靶序列)：

atatgcgactccataaagtaggaaacactacacgattccataaagtaggaaacactacaaccgactccataaagtaggaaacactacacgat；

SEQ ID NO:39(miR-142-3p-T4，包括4拷贝miR-142靶序列)：

atatgcgactccataaagtaggaaacactacacgattccataaagtaggaaacactacaaccgactccataaagtaggaaacactacacgattccataaagtaggaaacactacaacc。

优选地，所述天门冬酰胺糖基化位点包括SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:40：NATNVSNNSNTSNDSNVS。

优选地，所述截短型F8基因和天门冬酰胺糖基化位点N6的融合基因包括SEQ IDNO:41所示的核酸序列；

SEQ ID NO:41：

atgcaaatagagctctccacctgcttctttctgtgccttttgcgattctgctttagtgccaccagaagatactacctgggtgcagtggaactgtcatgggactatatgcaaagtgatctcggtgagctgcctgtggacgcaagatttcctcctagagtgccaaaatcttttccattcaacacctcagtcgtgtacaaaaagactctgtttgtagaattcacggatcaccttttcaacatcgctaagccaaggccaccctggatgggtctgctaggtcctaccatccaggctgaggtttatgatacagtggtcattacacttaagaacatggcttcccatcctgtcagtcttcatgctgttggtgtatcctactggaaagcttctgagggagctgaatatgatgatcagaccagtcaaagggagaaagaagatgataaagtcttccctggtggaagccatacatatgtctggcaggtcctgaaagagaatggtccaatggcctctgacccactgtgccttacctactcatatctttctcatgtggacctggtaaaagacttgaattcaggcctcattggagccctactagtatgtagagaagggagtctggccaaggaaaagacacagaccttgcacaaatttatactactttttgctgtatttgatgaagggaaaagttggcactcagaaacaaagaactccttgatgcaggatagggatgctgcatctgctcgggcctggcctaaaatgcacacagtcaatggttatgtaaacaggtctctgccaggtctgattggatgccacaggaaatcagtctattggcatgtgattggaatgggcaccactcctgaagtgcactcaatattcctcgaaggtcacacatttcttgtgaggaaccatcgccaggcgtccttggaaatctcgccaataactttccttactgctcaaacactcttgatggaccttggacagtttctactgttttgtcatatctcttcccaccaacatgatggcatggaagcttatgtcaaagtagacagctgtccagaggaaccccaactacgaatgaaaaataatgaagaagcggaagactatgatgatgatcttactgattctgaaatggatgtggtcaggtttgatgatgacaactctccttcctttatccaaattcgctcagttgccaagaagcatcctaaaacttgggtacattacattgctgctgaagaggaggactgggactatgctcccttagtcctcgcccccgatgacagaagttataaaagtcaatatttgaacaatggccctcagcggattggtaggaagtacaaaaaagtccgatttatggcatacacagatgaaacctttaagactcgtgaagctattcagcatgaatcaggaatcttgggacctttactttatggggaagttggagacacactgttgattatatttaagaatcaagcaagcagaccatataacatctaccctcacggaatcactgatgtccgtcctttgtattcaaggagattaccaaaaggtgtaaaacatttgaaggattttccaattctgccaggagaaatattcaaatataaatggacagtgactgtagaagatgggccaactaaatcagatcctcggtgcctgacccgctattactctagtttcgttaatatggagagagatctagcttcaggactcattggccctctcctcatctgctacaaagaatctgtagatcaaagaggaaaccagataatgtcagacaagaggaatgtcatcctgttttctgtatttgatgagaaccgaagctggtacctcacagagaatatacaacgctttctccccaatccagctggagtgcagcttgaggatccagagttccaagcctccaacatcatgcacagcatcaatggctatgtttttgatagtttgcagttgtcagtttgtttgcatgaggtggcatactggtacattctaagcattggagcacagactgacttcctttctgtcttcttctctggatataccttcaaacacaaaatggtctatgaagacacactcaccctattcccattctcaggagaaactgtcttcatgtcgatggaaaacccaggtctatggattctggggtgccacaactcagactttcggaacagaggcatgaccgccttactgaaggtttctagttgtgacaagaacactggtgattattacgaggacagttatgaagatatttcagcatacttgctgagtaaaaacaatgccattgaaccaagaagcttctctcaaaacgcgacgaacgtgagtaacaactcaaacactagtaatgattcgaacgtttcgccaccagtcttgaaacgccatcaacgggaaataactcgtactactcttcagtcagatcaagaggaaattgactatgatgataccatatcagttgaaatgaagaaggaagattttgacatttatgatgaggatgaaaatcagagcccccgcagctttcaaaagaaaacacgacactattttattgctgcagtggagaggctctgggattatgggatgagtagctccccacatgttctaagaaacagggctcagagtggcagtgtccctcagttcaagaaagttgttttccaggaatttactgatggctcctttactcagcccttataccgtggagaactaaatgaacatttgggactcctggggccatatataagagcagaagttgaagataatatcatggtaactttcagaaatcaggcctctcgtccctattccttctattctagccttatttcttatgaggaagatcagaggcaaggagcagaacctagaaaaaactttgtcaagcctaatgaaaccaaaacttacttttggaaagtgcaacatcatatggcacccactaaagatgagtttgactgcaaagcctgggcttatttctctgatgttgacctggaaaaagatgtgcactcaggcctgattggaccccttctggtctgccacactaacacactgaaccctgctcatgggagacaagtgacagtacaggaatttgctctgtttttcaccatctttgatgagaccaaaagctggtacttcactgaaaatatggaaagaaactgcagggctccctgcaatatccagatggaagatcccacttttaaagagaattatcgcttccatgcaatcaatggctacataatggatacactacctggcttagtaatggctcaggatcaaaggattcgatggtatctgctcagcatgggcagcaatgaaaacatccattctattcatttcagtggacatgtgttcactgtacgaaaaaaagaggagtataaaatggcactgtacaatctctatccaggtgtttttgagacagtggaaatgttaccatccaaagctggaatttggcgggtggaatgccttattggcgagcatctacatgctgggatgagcacactttttctggtgtacagcaataagtgtcagactcccctgggaatggcttctggacacattagagattttcagattacagcttcaggacaatatggacagtgggccccaaagctggccagacttcattattccggatcaatcaatgcctggagcaccaaggagcccttttcttggatcaaggtggatctgttggcaccaatgattattcacggcatcaagacccagggtgcccgtcagaagttctccagcctctacatctctcagtttatcatcatgtatagtcttgatgggaagaagtggcagacttatcgaggaaattccactggaaccttaatggtcttctttggcaatgtggattcatctgggataaaacacaatatttttaaccctccaattattgctcgatacatccgtttgcacccaactcattatagcattcgcagcactcttcgcatggagttgatgggctgtgatttaaatagttgcagcatgccattgggaatggagagtaaagcaatatcagatgcacagattactgcttcatcctactttaccaatatgtttgccacctggtctccttcaaaagctcgacttcacctccaagggaggagtaatgcctggagacctcaggtgaataatccaaaagagtggctgcaagtggacttccagaagacaatgaaagtcacaggagtaactactcagggagtaaaatctctgcttaccagcatgtatgtgaaggagttcctcatctccagcagtcaagatggccatcagtggactctcttttttcagaatggcaaagtaaaggtttttcagggaaatcaagactccttcacacctgtggtgaactctctagacccaccgttactgactcgctaccttcgaattcacccccagagttgggtgcaccagattgccctgaggatggaggttctgggctgcgaggcacaggacctctactga。

优选地，所述剪接受体序列包括Alb第13号内含子的部分序列和第14号外显子的部分序列。

优选地，所述剪接受体序列的长度为65～135bp，例如可以是65bp、75bp、85bp、95bp、105bp、115bp、125bp或135bp。

优选地，所述剪接受体序列包括SEQ ID NO:42～49之一所示的核酸序列；

SEQ ID NO:42(SA65包括26bpAlb-In13和39bp Alb-E14)：

aacatccatcatttctttgttttcagggtccaaaccttgtcactagatgcaaagacgccttagcc；

SEQ ID NO:43(SA75包括36bp Alb-In13和39bp Alb-E14)：

atacttttctaacatccatcatttctttgttttcagggtccaaaccttgtcactagatgcaaagacgccttagcc；

SEQ ID NO:44(SA85包括46bp Alb-In13和39bp Alb-E14)：

agtcctgctaatacttttctaacatccatcatttctttgttttcagggtccaaaccttgtcactagatgcaaagacgccttagcc；

SEQ ID NO:45(SA95包括56bp Alb-In13和39bp Alb-E14)：

aaatcctaacagtcctgctaatacttttctaacatccatcatttctttgttttcagggtccaaaccttgtcactagatgcaaagacgccttagcc；

SEQ ID NO:46(SA105包括66bp Alb-In13和39bp Alb-E14)：

tatgaagtgcaaatcctaacagtcctgctaatacttttctaacatccatcatttctttgttttcagggtccaaaccttgtcactagatgcaaagacgccttagcc；

SEQ ID NO:47(SA115包括76bp Alb-In13和39bp Alb-E14)：

tgcctatggctatgaagtgcaaatcctaacagtcctgctaatacttttctaacatccatcatttctttgttttcagggtccaaaccttgtcactagatgcaaagacgccttagcc；

SEQ ID NO:48(SA125包括86bp Alb-In13和39bp Alb-E14)：

actatgtcattgcctatggctatgaagtgcaaatcctaacagtcctgctaatacttttctaacatccatcatttctttgttttcagggtccaaaccttgtcactagatgcaaagacgccttagcc；

SEQ ID NO:49(SA135包括96bp Alb-In13和39bp Alb-E14)：

acgtacgtttactatgtcattgcctatggctatgaagtgcaaatcctaacagtcctgctaatacttttctaacatccatcatttctttgttttcagggtccaaaccttgtcactagatgcaaagacgccttagcc。

优选地，所述自断裂多肽基因包括SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:50：QCTNYALLKLAGDVESNPGP。

优选地，所述SaCas9编码基因包括SEQ ID NO:51所示的核酸序列；

SEQ ID NO:51：

atgaagcggactgctgatggcagtgaatttgagtccccaaagaagaagagaaaggtggaaggtggatccacgcgtatgaagcggaactacatcctgggcctggacatcggcatcaccagcgtgggctacggcatcatcgactacgagacacgggacgtgatcgatgccggcgtgcggctgttcaaagaggccaacgtggaaaacaacgagggcaggcggagcaagagaggcgccagaaggctgaagcggcggaggcggcatagaatccagagagtgaagaagctgctgttcgactacaacctgctgaccgaccacagcgagctgagcggcatcaacccctacgaggccagagtgaagggcctgagccagaagctgagcgaggaagagttctctgccgccctgctgcacctggccaagagaagaggcgtgcacaacgtgaacgaggtggaagaggacaccggcaacgagctgtccaccaaagagcagatcagccggaacagcaaggccctggaagagaaatacgtggccgaactgcagctggaacggctgaagaaagacggcgaagtgcggggcagcatcaacagattcaagaccagcgactacgtgaaagaagccaaacagctgctgaaggtgcagaaggcctaccaccagctggaccagagcttcatcgacacctacatcgacctgctggaaacccggcggacctactatgagggacctggcgagggcagccccttcggctggaaggacatcaaagaatggtacgagatgctgatgggccactgcacctacttccccgaggaactgcggagcgtgaagtacgcctacaacgccgacctgtacaacgccctgaacgacctgaacaatctcgtgatcaccagggacgagaacgagaagctggaatattacgagaagttccagatcatcgagaacgtgttcaagcagaagaagaagcccaccctgaagcagatcgccaaagaaatcctcgtgaacgaagaggatattaagggctacagagtgaccagcaccggcaagcccgagttcaccaacctgaaggtgtaccacgacatcaaggacattaccgcccggaaagagattattgagaacgccgagctgctggatcagattgccaagatcctgaccatctaccagagcagcgaggacatccaggaagaactgaccaatctgaactccgagctgacccaggaagagatcgagcagatctctaatctgaagggctataccggcacccacaacctgagcctgaaggccatcaacctgatcctggacgagctgtggcacaccaacgacaaccagatcgctatcttcaaccggctgaagctggtgcccaagaaggtggacctgtcccagcagaaagagatccccaccaccctggtggacgacttcatcctgagccccgtcgtgaagagaagcttcatccagagcatcaaagtgatcaacgccatcatcaagaagtacggcctgcccaacgacatcattatcgagctggcccgcgagaagaactccaaggacgcccagaaaatgatcaacgagatgcagaagcggaaccggcagaccaacgagcggatcgaggaaatcatccggaccaccggcaaagagaacgccaagtacctgatcgagaagatcaagctgcacgacatgcaggaaggcaagtgcctgtacagcctggaagccatccctctggaagatctgctgaacaaccccttcaactatgaggtggaccacatcatccccagaagcgtgtccttcgacaacagcttcaacaacaaggtgctcgtgaagcaggaagaaaacagcaagaagggcaaccggaccccattccagtacctgagcagcagcgacagcaagatcagctacgaaaccttcaagaagcacatcctgaatctggccaagggcaagggcagaatcagcaagaccaagaaagagtatctgctggaagaacgggacatcaacaggttctccgtgcagaaagacttcatcaaccggaacctggtggataccagatacgccaccagaggcctgatgaacctgctgcggagctacttcagagtgaacaacctggacgtgaaagtgaagtccatcaatggcggcttcaccagctttctgcggcggaagtggaagtttaagaaagagcggaacaaggggtacaagcaccacgccgaggacgccctgatcattgccaacgccgatttcatcttcaaagagtggaagaaactggacaaggccaaaaaagtgatggaaaaccagatgttcgaggaaaagcaggccgagagcatgcccgagatcgaaaccgagcaggagtacaaagagatcttcatcaccccccaccagatcaagcacattaaggacttcaaggactacaagtacagccaccgggtggacaagaagcctaatagagagctgattaacgacaccctgtactccacccggaaggacgacaagggcaacaccctgatcgtgaacaatctgaacggcctgtacgacaaggacaatgacaagctgaaaaagctgatcaacaagagccccgaaaagctgctgatgtaccaccacgacccccagacctaccagaaactgaagctgattatggaacagtacggcgacgagaagaatcccctgtacaagtactacgaggaaaccgggaactacctgaccaagtactccaaaaaggacaacggccccgtgatcaagaagattaagtattacggcaacaaactgaacgcccatctggacatcaccgacgactaccccaacagcagaaacaaggtcgtgaagctgtccctgaagccctacagattcgacgtgtacctggacaatggcgtgtacaagttcgtgaccgtgaagaatctggatgtgatcaaaaaagaaaactactacgaagtgaatagcaagtgctatgaggaagctaagaagctgaagaagatcagcaaccaggccgagtttatcgcctccttctacaacaacgatctgatcaagatcaacggcgagctgtatagagtgatcggcgtgaacaacgacctgctgaaccggatcgaagtgaacatgatcgacatcacctaccgcgagtacctggaaaacatgaacgacaagaggccccccaggatcattaagacaatcgcctccaagacccagagcattaagaagtacagcacagacattctgggcaacctgtatgaagtgaaatctaagaagcaccctcagatcatcaaaaagggcggtggtggtggatccaagcggactgctgatggcagtgaatttgagtccccaaagaagaagagaaaggtggaatag。

优选地，所述CRISPR-SaCas9基因编辑载体和F8供体载体的空载体为腺相关病毒载体，优选为AAV2载体、AAV5载体、AAV6载体、AAV8载体或AAV9载体中的任意一种或至少两种的组合，优选为AAV8载体。

第二方面，本发明提供了一种腺相关病毒组合物，所述腺相关病毒组合物包括CRISPR-SaCas9基因编辑腺相关病毒和F8供体腺相关病毒；

所述CRISPR-SaCas9基因编辑腺相关病毒由转染有第一方面所述的基因编辑系统中的CRISPR-SaCas9基因编辑载体和辅助质粒的哺乳动物细胞制备得到；

所述F8供体腺相关病毒由转染有第一方面所述的基因编辑系统中的F8供体载体和辅助质粒的哺乳动物细胞制备得到。

优选地，所述腺相关病毒组合物中CRISPR-SaCas9基因编辑腺相关病毒和F8供体腺相关病毒的剂量比为1:(2.5～10)，例如可以是1:2.5、1:5或1:10。

第三方面，本发明提供了一种重组细胞，所述重组细胞含有第一方面所述的基因编辑系统和/或第二方面所述的腺相关病毒组合物。

优选地，所述重组细胞的宿主细胞包括F8基因突变型肝细胞。

第四方面，本发明提供了一种治疗A型血友病的药物组合物，所述药物组合物包括第二方面所述的腺相关病毒组合物。

优选地，所述腺相关病毒组合物的剂量为1×10¹²～4×10¹³vg/kg，优选为2×10¹²～1×10¹³vg/kg。

优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂中的任意一种或至少两种的组合。

第五方面，本发明提供了一种治疗A型血友病的方法，所述方法包括：

将第一方面所述的基因编辑系统和/或第二方面所述的腺相关病毒组合物导入A型血友病患者体内，AAV介导基因编辑系统进入患者肝细胞，进行SaCas9和靶向Alb内含子的sgRNA的表达，定点切割白蛋白Alb基因的第11或13内含子；

同时进入肝细胞的BDDF8整合在双链DNA断裂位点，当AAV-BDDF8反向插入后，无治疗效果，且对肝细胞功能没有显著影响；当AAV-BDDF8正向插入后，与E13进行正确剪接，形成预期的Alb-E2A-BDDF8融合转录本，转录本翻译后，E2A多肽引起核糖体跳读(或自断裂)，形成完整的Alb功能蛋白和BDDF8蛋白，BDDF8蛋白随后分泌出肝细胞，进入血液循环，发挥正常的凝血功能。

第六方面，本发明提供了第一方面所述的基因编辑系统、第二方面所述的腺相关病毒组合物、第三方面所述的重组细胞或第四方面所述的药物组合物在制备A型血友病治疗药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明利用腺相关病毒介导SaCas9、sgAlb和BDDF8进入小鼠肝脏细胞，将BDDF8定向整合于肝细胞高度表达的基因白蛋白(Alb)内含子位点，利用Alb内源性转录机器驱动BDDF8的高水平表达，显著提高了F8的体内水平，在80％以上的A型血友病小鼠中F8持续表达一年，血友病A得到了彻底治愈；

(2)本发明利用纳米孔测序技术分析发现，基于AAV导入的BDDF8基因整合在了Alb切割位点，在整合过程中，部分ITR序列丢失，但大部分剪接序列保持完整；Sanger测序结果表明，Alb与插入的携带SA序列的BDDF8进行正确拼接，形成了预期的融合转录本；

(3)本发明的BDDF8采用F8-N6变体，与F8-SQ相比，F8活性提高了5倍，且F8活性可以保持一年之久，对肝功能没有任何不良影响，说明基因编辑系统的长期安全性。

附图说明

图1为基因编辑系统在小鼠肝细胞中进行Alb内含子基因编辑的原理示意图；

图2为具有不同HSP的pAAV-HSP-SaCas9-U6-sgRNA基因编辑载体示意图，其中，小写字母代表HSP，大写字母代表小鼠Ttr(Transthyretin)基因启动子；

图3为具有2～4个拷贝miR-142-3p靶序列的pAAV-HSP-SaCas9-U6-sgRNA基因编辑载体示意图，其中，小写字母为靶序列之间的连接序列；

图4为具有不同长度SA的pAAV-Donor-BDDF8供体载体示意图，其中，小写字母代表内含子，长度分别为26bp、36bp、46bp、56bp、66bp、76bp、86bp、96bp，大写字母代表Alb第14号外显子至终止密码子的序列；

图5A为含有不同sgRNA的pAAV-HSP-SaCas9-U6-sgRNA基因编辑载体S1008、S1009、S1010的切割效率，图5B为含有不同sgRNA的pAAV-HSP-SaCas9-U6-sgRNA基因编辑载体S1146、S1147的切割效率；

图6A为小鼠的Alb-F8融合转录本的电泳结果，其中，泳道1为DNA分子量，泳道2为野生型小鼠的Alb-F8融合转录本的电泳结果，泳道3-5分别为3只治疗小鼠的Alb-F8融合转录本的电泳结果，图6B为治疗小鼠的Sanger测序结果；

图7为纳米孔测序技术分析AAV-F8插入序列的完整性；

图8A为pAAV-BDDF8-SQ和pAAV-BDDF8-N6的载体结构示意图，图8B为F8-N6变体大幅提高F8活性；

图9为A型血友病小鼠接受AAV-F8注射后的一年时间内，体内F8的活性；

图10A为A型血友病小鼠的肝脏切片HE染色结果，图10B为A型血友病小鼠接受基因治疗后的肝脏切片HE染色结果；

图11为A型血友病小鼠接受基因治疗后的肝脏组织中的AAV拷贝数残余。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1 pAAV-SaCas9-sgRNA基因编辑载体的构建

本实施例利用CHOPCHOP网站(https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/)设计针对Alb第11号和第13号内含子的sgRNA(SEQ ID NO:16～30)，利用NEBuilder HiFi DNA组装试剂盒(New England Biolabs)将靶向Alb内含子的sgRNA克隆至含有SaCas9基因的载体中，经Sanger测序(MCLAB)鉴定获得pAAV-HSP-SaCas9-U6-sgRNA基因编辑载体。

具有不同肝细胞特异性启动子(HSP，SEQ ID NO:31～33)的pAAV-HSP-SaCas9-U6-sgRNA基因编辑载体如图2所示，通过调节HSP的长度，可以控制启动子的强度，图2中的3种HSP在人和小鼠肝细胞中均具有较高的活性。

miR-142-3p为造血细胞特异性小RNA，在免疫细胞中高表达。如图3所示，在SaCas9载体下游设置miR-142-3p靶序列(SEQ ID NO:37～39)，可以有效控制SaCas9在免疫细胞中的表达，从而控制靶向SaCas9的免疫应答，2个拷贝的miR-142-3p靶序列约降低转基因效率5倍，3个拷贝约降低转基因效率10倍，4个拷贝约降低转基因效率20倍。

实施例2 pAAV-Donor-BDDF8供体载体的构建

本实施例利用PCR扩增得到BDDF8基因，随后利用NEBuilder HiFi DNA组装试剂盒(New England Biolabs)将SA(SEQ ID NO:42～49)、E2A(SEQ ID NO:50)、BDDF8-N6(SEQ IDNO:41)和PolyA(SEQ ID NO:36)拼接并克隆至pITR质粒中，经核酸内切酶消化和Sanger测序鉴定获得pAAV-Donor-BDDF8供体载体。

具有不同长度剪接受体(splice acceptor，SA)的pAAV-Donor-BDDF8供体载体如图4所示，不同长度的内含子均可促进有效拼接，SA的最佳长度为36～56bp。

实施例3腺相关病毒包装、生产、浓缩和纯化

本实施例利用AAV三质粒包装系统转染293T细胞包装腺相关病毒，AAV三质粒包装系统包括目的基因质粒(pITR)、AAV相关基因质粒(pAAV-R2C8)和AAV辅助基因Rep2和Cap8质粒(pHelper)；随后使用切向流过滤系统(tangential flow filtration，TFF)浓缩病毒，将大体积含病毒的培养基浓缩10～50倍左右，并利用碘克沙醇密度梯度离心，进行AAV的纯化；最后利用ddPCR测定AAV滴度，滴度可达到1×10¹³vg/mL。

实施例4不同切割位点的活性检测

本实施例利用Illumina高通量测序检测靶向Alb第11和第13号内含子的sgRNA的切割效率，步骤如下：

构建含有不同sgRNA的pAAV-HSP-SaCas9-U6-sgRNA基因编辑载体S1008(SEQ IDNO:22)、S1009(SEQ ID NO:25)、S1010(SEQ ID NO:28)、S1146(SEQ ID NO:16)、S1147(SEQID NO:19)，尾静脉注射C57小鼠，每组三只；注射一周后获取小鼠肝脏组织，提取DNA，对切割位点进行PCR扩增和Illumina高通量测序，利用Crispresso2进行数据分析。

结果如图5A和图5B所示，靶向Alb第13号内含子的S1008、S1009和S1010的切割效率分别为70％、40％和20％，靶向Alb第11号内含子的S1146和S1147的切割效率分别为60％和45％；以上结果表明pAAV-HSP-SaCas9-U6-sgRNA基因编辑载体可以有效切割基因组靶序列，其中S1008、S1009、S1146和S1147可以用于后续的HA小鼠体内实验。

实施例5 A型血友病小鼠尾静脉注射腺相关病毒

A型血友病小鼠的F8基因第16号外显子被敲除，导致凝血因子F8不能正常表达，进而产生凝血障碍。

将AAV-SaCas9-sgRNA病毒和AAV-Donor-BDDF8病毒按1:5的比例混合入生理盐水，37℃孵育10min，将总体积为200μL(总剂量为2.5×10¹²vg/kg)的混合液匀速注射入6～8周龄的HA小鼠尾静脉中。

4周后，以治疗后小鼠肝脏RNA为模板、利用靶向Alb第10号内含子和F8的引物进行RT-PCR，结果如图6A和图6B所示，在3只治疗小鼠中，均检测到Alb-F8融合转录本；Sanger测序结果表明，Alb的第13号外显子E13正确拼接插入到AAV-F8载体上的第14号外显子E14以及下游的E2A和F8序列中。

本实施例进一步利用纳米孔测序技术分析AAV-F8插入序列的完整性，以基因编辑后的小鼠肝脏gDNA作为模板进行PCR，获得的长片段扩增产物作为测序样本进行纳米孔测序，原始测序数据Fastq文件利用BWA软件与标准序列进行比对后，利用IGV软件对生成的BAM文件进行可视化分析。

图7为Nanopore测序数据进行IGV可视化后的初步分析结果，HA小鼠肝细胞中大部分AAV-ITR序列丢失，但大部分剪接序列和F8序列保留完整。

实施例6 F8凝血活性检测

本实施例在AAV尾静脉注射后的不同时间点(2周、4周、8周、12周)从小鼠尾静脉取血，利用Sysmex CA1500系统(Sysmex，Kobe，Japan)检测待测样本纠正缺乏F8因子血浆所致的凝固时间的延长，分析小鼠血浆中F8的凝血活性，步骤如下：

准备1.5mL EP管，提前加入10μL 3.2％柠檬酸钠溶液作为抗凝剂；用刀片轻轻划破小鼠尾静脉，用移液枪吸取约100μL血量置于抗凝管中，用止血粉(Miracle Corp)对小鼠伤口进行止血处理；

将收集的血液样品在2000×g、25℃下离心20min，得到的上清液即为血浆，将血浆转移至新的离心中，立即置于干冰上，并保存在-80℃中；

将保存的血浆样品在37℃快速解冻，用Dade Owren’s Veronal缓冲液(Siemens，B4234-25)稀释4倍；将5μL稀释的待测样品、45μL Dade Owren’s Veronal缓冲液、50μL乏F8血浆(Siemens，OTXW17)和50μL aPTT激活试剂(Siemens，B4218-1)混合，37℃孵育2min；

加入50μL 25mM氯化钙后开始凝固，用Sysmex CA1500系统检测凝块形成时间；

利用稀释的人标准血浆(Siemens)制备标准曲线，以正常小鼠血浆作为阳性对照。

结果如图8A和图8B所示，F8-N6变体大幅提高了F8活性，较F8-SQ变体，F8-N6变体将F8活性提高了5倍。

本实施例进一步对7只治疗后的小鼠进行为期一年的随访，结果如图9所示，HA小鼠的基因治疗具有长期疗效，在一年时间内F8可以在HA小鼠体内稳定存在。

实施例7肝组织HE染色

对A型血友病小鼠进行基因治疗3个月后，处死小鼠，获取肝组织切片进行HE染色，观察是否有病理学变化。

如图10A和图10B所示，基因治疗对肝功能未产生任何不良影响。

实施例8残留腺相关病毒拷贝数分析

本实施例利用qPCR分析A型血友病小鼠接受基因治疗后的不同时间点肝脏组织中的AAV拷贝数，步骤如下：

AAV注射2天、1周、3周、2个月、6个月和12个月后，获取肝脏组织并提取gDNA，进行实时荧光定量PCR，未注射AAV的A型血友病小鼠肝脏gDNA作为阴性对照，注射AAV 1～2周后的A型血友病小鼠肝脏gDNA作为阳性对照；

在1μg小鼠gDNA中加入1.6pg pEV质粒(～10kb)，作为每个细胞具有一拷贝质粒的标准品，构建标准曲线，基于此标准曲线定量计算小鼠肝脏组织中的AAV拷贝数。

结果如图11所示，治疗6个月后，AAV拷贝数下降到很低的水平，不影响肝细胞功能。

综上所述，本发明利用基因编辑系统将F8基因整合在Alb切割位点，在整合过程中，部分ITR序列丢失，但大部分剪接序列保持完整，剪接完成后，Alb-F8形成了预期的融合转录本，F8在大部分小鼠中功能正常，本发明通过对BDDF8和SaCas9载体的优化，实现了BDDF8在A型血友病小鼠肝细胞Alb位点的高效插入，在A型血友病治疗领域具有广阔的应用前景。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 中国医学科学院血液病医院（中国医学科学院血液学研究所）

<120> 一种治疗A型血友病的基因编辑系统及其应用

<130> 20210305

<160> 51

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

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<213> 人工序列()

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<212> DNA

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<400> 28

gaaaagtatt agcaggactg tgtttaagta ctctgtgctg gaaacagcac agaatctact 60

taaacaaggc aaaatgccgt gtttatctcg tcaacttgtt ggcgagattt tttt 114

<210> 29

<211> 115

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 29

ggaaaagtat tagcaggact gtgtttaagt actctgtgct ggaaacagca cagaatctac 60

ttaaacaagg caaaatgccg tgtttatctc gtcaacttgt tggcgagatt ttttt 115

<210> 30

<211> 116

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 30

gagaaaagta ttagcaggac tgtgtttaag tactctgtgc tggaaacagc acagaatcta 60

cttaaacaag gcaaaatgcc gtgtttatct cgtcaacttg ttggcgagat tttttt 116

<210> 31

<211> 267

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 31

gggggaggct gctggtgaat attaaccaag gtcaccccag ttatcggagg agcaaacagg 60

ggctaagtcc actgttccga tactctaatc tccctaggca aggttcatat ttgtgtaggt 120

tacttattct ccttttgttg actaagtcaa taatcagaat cagcaggttt ggagtcagct 180

tggcagggat cagcagcctg ggttggaagg agggggtata aaagcccctt caccaggaga 240

agccgtcaca cagatccaca agctcct 267

<210> 32

<211> 233

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 32

gggggaggct gctggtgaat attaaccaag gtcacccctg ttccgatact ctaatctccc 60

taggcaaggt tcatatttgt gtaggttact tattctcctt ttgttgacta agtcaataat 120

cagaatcagc aggtttggag tcagcttggc agggatcagc agcctgggtt ggaaggaggg 180

ggtataaaag ccccttcacc aggagaagcc gtcacacaga tccacaagct cct 233

<210> 33

<211> 229

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 33

agttatcgga ggagcaaaca ggggctaagt ccactgttcc gatactctaa tctccctagg 60

caaggttcat atttgtgtag gttacttatt ctccttttgt tgactaagtc aataatcaga 120

atcagcaggt ttggagtcag cttggcaggg atcagcagcc tgggttggaa ggagggggta 180

taaaagcccc ttcaccagga gaagccgtca cacagatcca caagctcct 229

<210> 34

<211> 462

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 34

atctttttcc ctctgccaaa aattatgggg acatcatgaa gccccttgag catctgactt 60

ctggctaata aaggaaattt attttcattg caatagtgtg ttggaatttt ttgtgtctct 120

cactcggtac cccagtggaa agacgcgcag gcaaaacgca ccacgtgacg gagcgtgacc 180

gcgcgccgag cgcgcgccaa ggtcgggcag gaagagggcc tatttcccat gattccttca 240

tatttgcata tacgatacaa ggctgttaga gagataatta gaattaattt gactgtaaac 300

acaaagatat tagtacaaaa tacgtgacgt agaaagtaat aatttcttgg gtagtttgca 360

gttttaaaat tatgttttaa aatggactat catatgctta ccgtaacttg aaagtatttc 420

gatttcttgg gtttatatat cttgtggaaa ggacgaaaca cc 462

<210> 35

<211> 247

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 35

aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60

ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120

atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttag ttcttgccac ggcggaactc 180

atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca ggggctcggc tgttgggcac tgacaattcc 240

gtggtgt 247

<210> 36

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 36

atctttttcc ctctgccaaa aattatgggg acatcatgaa gccccttgag catctgactt 60

ctggctaata aaggaaattt attttcattg caatagtgtg ttggaatttt ttgtgtctct 120

cactcg 126

<210> 37

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 37

atatgcgact ccataaagta ggaaacacta cacgattcca taaagtagga aacactacaa 60

ccg 63

<210> 38

<211> 92

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 38

atatgcgact ccataaagta ggaaacacta cacgattcca taaagtagga aacactacaa 60

ccgactccat aaagtaggaa acactacacg at 92

<210> 39

<211> 118

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 39

atatgcgact ccataaagta ggaaacacta cacgattcca taaagtagga aacactacaa 60

ccgactccat aaagtaggaa acactacacg attccataaa gtaggaaaca ctacaacc 118

<210> 40

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 40

Asn Ala Thr Asn Val Ser Asn Asn Ser Asn Thr Ser Asn Asp Ser Asn

1 5 10 15

Val Ser

<210> 41

<211> 4425

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 41

atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgcc 60

accagaagat actacctggg tgcagtggaa ctgtcatggg actatatgca aagtgatctc 120

ggtgagctgc ctgtggacgc aagatttcct cctagagtgc caaaatcttt tccattcaac 180

acctcagtcg tgtacaaaaa gactctgttt gtagaattca cggatcacct tttcaacatc 240

gctaagccaa ggccaccctg gatgggtctg ctaggtccta ccatccaggc tgaggtttat 300

gatacagtgg tcattacact taagaacatg gcttcccatc ctgtcagtct tcatgctgtt 360

ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga gctgaatatg atgatcagac cagtcaaagg 420

gagaaagaag atgataaagt cttccctggt ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg 480

aaagagaatg gtccaatggc ctctgaccca ctgtgcctta cctactcata tctttctcat 540

gtggacctgg taaaagactt gaattcaggc ctcattggag ccctactagt atgtagagaa 600

gggagtctgg ccaaggaaaa gacacagacc ttgcacaaat ttatactact ttttgctgta 660

tttgatgaag ggaaaagttg gcactcagaa acaaagaact ccttgatgca ggatagggat 720

gctgcatctg ctcgggcctg gcctaaaatg cacacagtca atggttatgt aaacaggtct 780

ctgccaggtc tgattggatg ccacaggaaa tcagtctatt ggcatgtgat tggaatgggc 840

accactcctg aagtgcactc aatattcctc gaaggtcaca catttcttgt gaggaaccat 900

cgccaggcgt ccttggaaat ctcgccaata actttcctta ctgctcaaac actcttgatg 960

gaccttggac agtttctact gttttgtcat atctcttccc accaacatga tggcatggaa 1020

gcttatgtca aagtagacag ctgtccagag gaaccccaac tacgaatgaa aaataatgaa 1080

gaagcggaag actatgatga tgatcttact gattctgaaa tggatgtggt caggtttgat 1140

gatgacaact ctccttcctt tatccaaatt cgctcagttg ccaagaagca tcctaaaact 1200

tgggtacatt acattgctgc tgaagaggag gactgggact atgctccctt agtcctcgcc 1260

cccgatgaca gaagttataa aagtcaatat ttgaacaatg gccctcagcg gattggtagg 1320

aagtacaaaa aagtccgatt tatggcatac acagatgaaa cctttaagac tcgtgaagct 1380

attcagcatg aatcaggaat cttgggacct ttactttatg gggaagttgg agacacactg 1440

ttgattatat ttaagaatca agcaagcaga ccatataaca tctaccctca cggaatcact 1500

gatgtccgtc ctttgtattc aaggagatta ccaaaaggtg taaaacattt gaaggatttt 1560

ccaattctgc caggagaaat attcaaatat aaatggacag tgactgtaga agatgggcca 1620

actaaatcag atcctcggtg cctgacccgc tattactcta gtttcgttaa tatggagaga 1680

gatctagctt caggactcat tggccctctc ctcatctgct acaaagaatc tgtagatcaa 1740

agaggaaacc agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag 1800

aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc agctggagtg 1860

cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt 1920

tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg catgaggtgg catactggta cattctaagc 1980

attggagcac agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa 2040

atggtctatg aagacacact caccctattc ccattctcag gagaaactgt cttcatgtcg 2100

atggaaaacc caggtctatg gattctgggg tgccacaact cagactttcg gaacagaggc 2160

atgaccgcct tactgaaggt ttctagttgt gacaagaaca ctggtgatta ttacgaggac 2220

agttatgaag atatttcagc atacttgctg agtaaaaaca atgccattga accaagaagc 2280

ttctctcaaa acgcgacgaa cgtgagtaac aactcaaaca ctagtaatga ttcgaacgtt 2340

tcgccaccag tcttgaaacg ccatcaacgg gaaataactc gtactactct tcagtcagat 2400

caagaggaaa ttgactatga tgataccata tcagttgaaa tgaagaagga agattttgac 2460

atttatgatg aggatgaaaa tcagagcccc cgcagctttc aaaagaaaac acgacactat 2520

tttattgctg cagtggagag gctctgggat tatgggatga gtagctcccc acatgttcta 2580

agaaacaggg ctcagagtgg cagtgtccct cagttcaaga aagttgtttt ccaggaattt 2640

actgatggct cctttactca gcccttatac cgtggagaac taaatgaaca tttgggactc 2700

ctggggccat atataagagc agaagttgaa gataatatca tggtaacttt cagaaatcag 2760

gcctctcgtc cctattcctt ctattctagc cttatttctt atgaggaaga tcagaggcaa 2820

ggagcagaac ctagaaaaaa ctttgtcaag cctaatgaaa ccaaaactta cttttggaaa 2880

gtgcaacatc atatggcacc cactaaagat gagtttgact gcaaagcctg ggcttatttc 2940

tctgatgttg acctggaaaa agatgtgcac tcaggcctga ttggacccct tctggtctgc 3000

cacactaaca cactgaaccc tgctcatggg agacaagtga cagtacagga atttgctctg 3060

tttttcacca tctttgatga gaccaaaagc tggtacttca ctgaaaatat ggaaagaaac 3120

tgcagggctc cctgcaatat ccagatggaa gatcccactt ttaaagagaa ttatcgcttc 3180

catgcaatca atggctacat aatggataca ctacctggct tagtaatggc tcaggatcaa 3240

aggattcgat ggtatctgct cagcatgggc agcaatgaaa acatccattc tattcatttc 3300

agtggacatg tgttcactgt acgaaaaaaa gaggagtata aaatggcact gtacaatctc 3360

tatccaggtg tttttgagac agtggaaatg ttaccatcca aagctggaat ttggcgggtg 3420

gaatgcctta ttggcgagca tctacatgct gggatgagca cactttttct ggtgtacagc 3480

aataagtgtc agactcccct gggaatggct tctggacaca ttagagattt tcagattaca 3540

gcttcaggac aatatggaca gtgggcccca aagctggcca gacttcatta ttccggatca 3600

atcaatgcct ggagcaccaa ggagcccttt tcttggatca aggtggatct gttggcacca 3660

atgattattc acggcatcaa gacccagggt gcccgtcaga agttctccag cctctacatc 3720

tctcagttta tcatcatgta tagtcttgat gggaagaagt ggcagactta tcgaggaaat 3780

tccactggaa ccttaatggt cttctttggc aatgtggatt catctgggat aaaacacaat 3840

atttttaacc ctccaattat tgctcgatac atccgtttgc acccaactca ttatagcatt 3900

cgcagcactc ttcgcatgga gttgatgggc tgtgatttaa atagttgcag catgccattg 3960

ggaatggaga gtaaagcaat atcagatgca cagattactg cttcatccta ctttaccaat 4020

atgtttgcca cctggtctcc ttcaaaagct cgacttcacc tccaagggag gagtaatgcc 4080

tggagacctc aggtgaataa tccaaaagag tggctgcaag tggacttcca gaagacaatg 4140

aaagtcacag gagtaactac tcagggagta aaatctctgc ttaccagcat gtatgtgaag 4200

gagttcctca tctccagcag tcaagatggc catcagtgga ctctcttttt tcagaatggc 4260

aaagtaaagg tttttcaggg aaatcaagac tccttcacac ctgtggtgaa ctctctagac 4320

ccaccgttac tgactcgcta ccttcgaatt cacccccaga gttgggtgca ccagattgcc 4380

ctgaggatgg aggttctggg ctgcgaggca caggacctct actga 4425

<210> 42

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 42

aacatccatc atttctttgt tttcagggtc caaaccttgt cactagatgc aaagacgcct 60

tagcc 65

<210> 43

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 43

atacttttct aacatccatc atttctttgt tttcagggtc caaaccttgt cactagatgc 60

aaagacgcct tagcc 75

<210> 44

<211> 85

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 44

agtcctgcta atacttttct aacatccatc atttctttgt tttcagggtc caaaccttgt 60

cactagatgc aaagacgcct tagcc 85

<210> 45

<211> 95

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 45

aaatcctaac agtcctgcta atacttttct aacatccatc atttctttgt tttcagggtc 60

caaaccttgt cactagatgc aaagacgcct tagcc 95

<210> 46

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 46

tatgaagtgc aaatcctaac agtcctgcta atacttttct aacatccatc atttctttgt 60

tttcagggtc caaaccttgt cactagatgc aaagacgcct tagcc 105

<210> 47

<211> 115

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 47

tgcctatggc tatgaagtgc aaatcctaac agtcctgcta atacttttct aacatccatc 60

atttctttgt tttcagggtc caaaccttgt cactagatgc aaagacgcct tagcc 115

<210> 48

<211> 125

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 48

actatgtcat tgcctatggc tatgaagtgc aaatcctaac agtcctgcta atacttttct 60

aacatccatc atttctttgt tttcagggtc caaaccttgt cactagatgc aaagacgcct 120

tagcc 125

<210> 49

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 49

acgtacgttt actatgtcat tgcctatggc tatgaagtgc aaatcctaac agtcctgcta 60

atacttttct aacatccatc atttctttgt tttcagggtc caaaccttgt cactagatgc 120

aaagacgcct tagcc 135

<210> 50

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 50

Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 51

<211> 3309

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 51

atgaagcgga ctgctgatgg cagtgaattt gagtccccaa agaagaagag aaaggtggaa 60

ggtggatcca cgcgtatgaa gcggaactac atcctgggcc tggacatcgg catcaccagc 120

gtgggctacg gcatcatcga ctacgagaca cgggacgtga tcgatgccgg cgtgcggctg 180

ttcaaagagg ccaacgtgga aaacaacgag ggcaggcgga gcaagagagg cgccagaagg 240

ctgaagcggc ggaggcggca tagaatccag agagtgaaga agctgctgtt cgactacaac 300

ctgctgaccg accacagcga gctgagcggc atcaacccct acgaggccag agtgaagggc 360

ctgagccaga agctgagcga ggaagagttc tctgccgccc tgctgcacct ggccaagaga 420

agaggcgtgc acaacgtgaa cgaggtggaa gaggacaccg gcaacgagct gtccaccaaa 480

gagcagatca gccggaacag caaggccctg gaagagaaat acgtggccga actgcagctg 540

gaacggctga agaaagacgg cgaagtgcgg ggcagcatca acagattcaa gaccagcgac 600

tacgtgaaag aagccaaaca gctgctgaag gtgcagaagg cctaccacca gctggaccag 660

agcttcatcg acacctacat cgacctgctg gaaacccggc ggacctacta tgagggacct 720

ggcgagggca gccccttcgg ctggaaggac atcaaagaat ggtacgagat gctgatgggc 780

cactgcacct acttccccga ggaactgcgg agcgtgaagt acgcctacaa cgccgacctg 840

tacaacgccc tgaacgacct gaacaatctc gtgatcacca gggacgagaa cgagaagctg 900

gaatattacg agaagttcca gatcatcgag aacgtgttca agcagaagaa gaagcccacc 960

ctgaagcaga tcgccaaaga aatcctcgtg aacgaagagg atattaaggg ctacagagtg 1020

accagcaccg gcaagcccga gttcaccaac ctgaaggtgt accacgacat caaggacatt 1080

accgcccgga aagagattat tgagaacgcc gagctgctgg atcagattgc caagatcctg 1140

accatctacc agagcagcga ggacatccag gaagaactga ccaatctgaa ctccgagctg 1200

acccaggaag agatcgagca gatctctaat ctgaagggct ataccggcac ccacaacctg 1260

agcctgaagg ccatcaacct gatcctggac gagctgtggc acaccaacga caaccagatc 1320

gctatcttca accggctgaa gctggtgccc aagaaggtgg acctgtccca gcagaaagag 1380

atccccacca ccctggtgga cgacttcatc ctgagccccg tcgtgaagag aagcttcatc 1440

cagagcatca aagtgatcaa cgccatcatc aagaagtacg gcctgcccaa cgacatcatt 1500

atcgagctgg cccgcgagaa gaactccaag gacgcccaga aaatgatcaa cgagatgcag 1560

aagcggaacc ggcagaccaa cgagcggatc gaggaaatca tccggaccac cggcaaagag 1620

aacgccaagt acctgatcga gaagatcaag ctgcacgaca tgcaggaagg caagtgcctg 1680

tacagcctgg aagccatccc tctggaagat ctgctgaaca accccttcaa ctatgaggtg 1740

gaccacatca tccccagaag cgtgtccttc gacaacagct tcaacaacaa ggtgctcgtg 1800

aagcaggaag aaaacagcaa gaagggcaac cggaccccat tccagtacct gagcagcagc 1860

gacagcaaga tcagctacga aaccttcaag aagcacatcc tgaatctggc caagggcaag 1920

ggcagaatca gcaagaccaa gaaagagtat ctgctggaag aacgggacat caacaggttc 1980

tccgtgcaga aagacttcat caaccggaac ctggtggata ccagatacgc caccagaggc 2040

ctgatgaacc tgctgcggag ctacttcaga gtgaacaacc tggacgtgaa agtgaagtcc 2100

atcaatggcg gcttcaccag ctttctgcgg cggaagtgga agtttaagaa agagcggaac 2160

aaggggtaca agcaccacgc cgaggacgcc ctgatcattg ccaacgccga tttcatcttc 2220

aaagagtgga agaaactgga caaggccaaa aaagtgatgg aaaaccagat gttcgaggaa 2280

aagcaggccg agagcatgcc cgagatcgaa accgagcagg agtacaaaga gatcttcatc 2340

accccccacc agatcaagca cattaaggac ttcaaggact acaagtacag ccaccgggtg 2400

gacaagaagc ctaatagaga gctgattaac gacaccctgt actccacccg gaaggacgac 2460

aagggcaaca ccctgatcgt gaacaatctg aacggcctgt acgacaagga caatgacaag 2520

ctgaaaaagc tgatcaacaa gagccccgaa aagctgctga tgtaccacca cgacccccag 2580

acctaccaga aactgaagct gattatggaa cagtacggcg acgagaagaa tcccctgtac 2640

aagtactacg aggaaaccgg gaactacctg accaagtact ccaaaaagga caacggcccc 2700

gtgatcaaga agattaagta ttacggcaac aaactgaacg cccatctgga catcaccgac 2760

gactacccca acagcagaaa caaggtcgtg aagctgtccc tgaagcccta cagattcgac 2820

gtgtacctgg acaatggcgt gtacaagttc gtgaccgtga agaatctgga tgtgatcaaa 2880

aaagaaaact actacgaagt gaatagcaag tgctatgagg aagctaagaa gctgaagaag 2940

atcagcaacc aggccgagtt tatcgcctcc ttctacaaca acgatctgat caagatcaac 3000

ggcgagctgt atagagtgat cggcgtgaac aacgacctgc tgaaccggat cgaagtgaac 3060

atgatcgaca tcacctaccg cgagtacctg gaaaacatga acgacaagag gccccccagg 3120

atcattaaga caatcgcctc caagacccag agcattaaga agtacagcac agacattctg 3180

ggcaacctgt atgaagtgaa atctaagaag caccctcaga tcatcaaaaa gggcggtggt 3240

ggtggatcca agcggactgc tgatggcagt gaatttgagt ccccaaagaa gaagagaaag 3300

gtggaatag 3309

Claims (10)

1.一种基因编辑系统，其特征在于，所述基因编辑系统包括CRISPR-SaCas9基因编辑载体和F8供体载体；

所述CRISPR-SaCas9基因编辑载体包括串联的SaCas9编码基因和sgRNA，所述sgRNA的靶基因为Alb基因内含子；

所述F8供体载体包括截短型F8基因。

2.根据权利要求1所述的基因编辑系统，其特征在于，所述sgRNA的靶基因包括Alb基因第11号内含子和/或Alb基因第13号内含子；

优选地，所述SaCas9编码基因的启动子和所述sgRNA的启动子不同；

优选地，所述SaCas9编码基因的启动子包括肝细胞特异性启动子；

优选地，所述sgRNA的启动子包括U6启动子；

优选地，所述SaCas9编码基因和所述sgRNA之间还包括Wpre；

优选地，所述Wpre和sgRNA的启动子之间还包括PolyA或miR-142-3p靶序列。

3.根据权利要求1或2所述的基因编辑系统，其特征在于，所述截短型F8基因为缺失了B结构域的F8基因；

优选地，所述F8供体载体包括截短型F8基因和天门冬酰胺糖基化位点的融合基因；

优选地，所述F8供体载体在截短型F8基因上游还包括剪接受体序列；

优选地，所述剪接受体序列和截短型F8基因之间还包括自断裂多肽基因；

优选地，所述F8供体载体在截短型F8基因下游还包括PolyA序列。

4.根据权利要求2所述的基因编辑系统，其特征在于，所述sgRNA的靶基因包括SEQ IDNO:1～15之一所示的核酸序列；

优选地，所述sgRNA包括SEQ ID NO:16～30之一所示的核酸序列；

优选地，所述肝细胞特异性启动子包括SEQ ID NO:31～33之一所示的核酸序列；

优选地，所述U6启动子包括SEQ ID NO:34所示的核酸序列；

优选地，所述Wpre包括SEQ ID NO:35所示的核酸序列；

优选地，所述PolyA包括SEQ ID NO:36所示的核酸序列；

优选地，所述miR-142靶序列包括SEQ ID NO:37～39之一所示的核酸序列。

5.根据权利要求3所述的基因编辑系统，其特征在于，所述天门冬酰胺糖基化位点包括SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列；

优选地，所述截短型F8基因和天门冬酰胺糖基化位点的融合基因包括SEQ ID NO:41所示的核酸序列；

优选地，所述剪接受体序列包括Alb第13号内含子的部分序列和第14号外显子的部分序列；

优选地，所述剪接受体序列的长度为65～135bp；

优选地，所述剪接受体序列包括SEQ ID NO:42～49之一所示的核酸序列；

优选地，所述自断裂多肽基因包括SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列。

6.根据权利要求1-5任一项所述的基因编辑系统，其特征在于，所述CRISPR-SaCas9基因编辑载体和F8供体载体的空载体为腺相关病毒载体，优选为AAV2载体、AAV5载体、AAV6载体、AAV8载体或AAV9载体中的任意一种或至少两种的组合，优选为AAV8载体。

7.一种腺相关病毒组合物，其特征在于，所述腺相关病毒组合物包括CRISPR-SaCas9基因编辑腺相关病毒和F8供体腺相关病毒；

所述CRISPR-SaCas9基因编辑腺相关病毒由转染有权利要求1-6任一项所述的基因编辑系统中的CRISPR-SaCas9基因编辑载体和辅助质粒的哺乳动物细胞制备得到；

所述F8供体腺相关病毒由转染有权利要求1-6任一项所述的基因编辑系统中的F8供体载体和辅助质粒的哺乳动物细胞制备得到；

优选地，所述腺相关病毒组合物中CRISPR-SaCas9基因编辑腺相关病毒和F8供体腺相关病毒的剂量比为1:(2.5～10)。

8.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有权利要求1-6任一项所述的基因编辑系统和/或权利要求7所述的腺相关病毒组合物；

优选地，所述重组细胞的宿主细胞包括F8基因突变型肝细胞。

9.一种治疗A型血友病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求7所述的腺相关病毒组合物；

优选地，所述腺相关病毒组合物的剂量为1×10¹²～4×10¹³vg/kg，优选为2×10¹²～1×10¹³vg/kg；

优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂中的任意一种或至少两种的组合。

10.权利要求1-6任一项所述的基因编辑系统、权利要求7所述的腺相关病毒组合物、权利要求8所述的重组细胞或权利要求9所述的药物组合物在制备A型血友病治疗药物中的应用。

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