CN113336841B

CN113336841B - F8蛋白变体及利用其制备的基因治疗载体

Info

Publication number: CN113336841B
Application number: CN202110613444.2A
Authority: CN
Inventors: 程涛; 张健萍; 赵梅; 殷梦迪; 李斯昂; 杨智学; 张凤; 李国华; 张孝兵
Original assignee: Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital of CAMS and PUMC
Current assignee: Tianjin Xiehe Biotechnology Development Co ltd
Priority date: 2021-06-02
Filing date: 2021-06-02
Publication date: 2022-09-23
Anticipated expiration: 2041-06-02
Also published as: CN113336841A

Abstract

本发明提供了F8蛋白变体及利用其制备的基因治疗载体。所述F8蛋白变体为BDDF8‑N6变体删除至少4个氨基酸后得到的氨基酸序列中的任意一种；其中，删除的氨基酸中包含弗林蛋白识别位点RHQR。本发明提供的F8蛋白变体，以BDDF8‑N6变体为基础，对B结构域进行优化，删除了F8蛋白弗林蛋白识别位点及其附近的氨基酸，得到了新的高效变体，所得变体载体滴度增加，体内测试中F8的活性较高，具有较高的临床转化价值。

Description

F8蛋白变体及利用其制备的基因治疗载体

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种F8蛋白变体及利用其制备的基因治疗载体，尤其涉及一种通过B结构域优化后得到的F8蛋白变体及其构建的基因治疗载体的开发与利用。

背景技术

血友病A(HA)是凝血因子F8基因功能缺失引起的单基因遗传性出血病性疾病，重症有生命危险。输注F8蛋白是目前的主要治疗方法，需要每周静脉注射2-3次，生活质量差，而且治疗费用昂贵。基因治疗是根治血友病的唯一方法。

血友病A基因治疗首选载体是AAV载体。AAV载体递送F8的血友病A基因治疗，经过20多年的研究，已经陆续进入临床试验。其中，BioMarin(拜玛林)公司开发的valoctocogene roxaparvovec(BMN270，NCT02576795)基因疗法处于领先地位，据报道接受了高剂量组(6×10¹³vg/kg)患者，F8活性维持在较高水平，病人的生活质量明显提高；然而，超高的给药剂量所带来的安全性问题限制了相关药物的使用。

目前，F8载体的优化策略主要是对B结构域的改造，从而促进F8蛋白的表达和分泌，以及凝血功能。不断优化的变体包括：BDDF8-SQ变体、F8-N222变体、F8-N6变体、F8-RH变体和弗林蛋白识别位点不同程度删除变体。其中，BDDF8(B domain-deleted F VIII)是指B结构域删除的F8。

(1)BDDF8-SQ变体：是将B结构域中Ser743与Gln1638直接融合，形成了一段14aa(SFSQNPPVLKRHQR)序列，替代了B结构域。这种变体的表达水平可以增加17倍，但是蛋白水平只提高了30％。

(2)BDDF8-N222变体：Pipe研究团队保留了B结构域中6个天冬酰胺-连接的糖基化位点，形成了222aa序列替代B结构域，可以明显提高F8的表达。糖基化位点的保留可能通过促进天冬酰胺链寡糖和LMAN1之间的结合，从而促进蛋白的加工和装运，也可能减低了细胞内不规则蛋白折叠反应；这种变体在HA基因治疗中应用也比较广泛。

(3)BDDF8-N6变体：由于AAV包装容量的限制，继续改造F8-N6蛋白，用包含6个天冬酰胺-连接的糖基化位点的18aa(SFSQNATNVSNNSNTSNDSNVSPPVLKRHQR)替代222aa，减少了AAV载体的包装压力。

(4)BDDF8-RH变体：研究发现犬BDDF8(Canine BDDF8，cBDDF8)的分泌形式主要是单体形式，而且激活状态下比人BDDF8(human BDDF8,hBDDF8)更稳定，通过比较两者的氨基酸序列发现只有一个氨基酸序列不同，弗林蛋白识别位点：cF8是1645-HHQR-1648，hF8是1645-RHQR-1648。将hF8中R替换成H：hF8-RH变体的蛋白表达水平2.5倍。

(5)弗林蛋白识别位点不同程度删除变体：包括hF8-Δ1645、hF8-1645-46(Δ2)、hF8-1645-47(Δ3)、hF8-1645-48(Δ4)和hF8-Δ1648。这些变体，表达水平能提高2～4倍，并且提高F8蛋白的促凝功能。

除上述变体之外，开发其他的能够高水平表达的F8变体，得到高表达、高活性AAV-F8载体对于减少载体用量、提高AAV治疗的安全性具有重要意义。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供F8蛋白变体及利用其制备的基因治疗载体。为实现高水平F8的表达，减少载体用量，提高AAV治疗的安全性，本发明在BDDF8-N6变体的基础上，对F8蛋白的B结构进行改造，得到了十三种F8蛋白变体，所得F8蛋白变体的载体生产滴度得到了明显提高。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供F8蛋白变体，所述F8蛋白变体为BDDF8-N6变体删除至少4个氨基酸后得到的氨基酸序列中的任意一种；

其中，删除的氨基酸中包含弗林蛋白识别位点RHQR。

如图1所示，在生理情况下，成熟F8是由2332个氨基酸组成的单链糖蛋白，约250kD，包含A1-a1-A2-a2-B-a3-A3-C1-C2结构域，由血管内皮细胞分泌进入外周血循环。F8蛋白在弗林蛋白的作用下，以异二聚体形式在血液中循环，包括重链(A1-a1-A2-a2-B)和轻链(a3-A3-C1-C2)。血管损伤处激活的血小板进一步切割作用，形成膜结合蛋白酶复合物(A1-a1，A2-a2，A3-C1-C2)。

在BDDF8-RH变体和弗林蛋白识别位点不同程度删除变体中，弗林蛋白的识别位点被破坏，但是F8蛋白水平增加，凝血功能增强，这说明弗林蛋白切割对F8活性并不是必须的。但是若继续删除弗林蛋白识别位点附近的氨基酸，F8活性是否会有影响尚未可知。本发明提供的F8蛋白变体，以BDDF8-N6变体为基础，对B结构域进行优化，删除了F8蛋白弗林蛋白识别位点及其附近的氨基酸，探索新的高效变体，提高临床转化价值。作为本发明优选的技术方案，所述BDDF8-N6变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，所述F8蛋白变体为所述BDDF8-N6变体删除4～30个(例如可以是4个、5个、6个、8个、10个、15个、20个、23个、25个或28个等)氨基酸后得到的氨基酸序列中的任意一种。

优选地，所述删除的氨基酸还包括弗林蛋白识别位点RHQR前端相邻的氨基酸和/或弗林蛋白识别位点RHQR后端相邻的氨基酸。

作为本发明优选的技术方案，所述F8蛋白变体包括如(I)、(II)、(III)或(IV)中的任意一种：

(I)删除弗林蛋白识别位点RHQR的BDDF8-N6变体；(II)删除弗林蛋白识别位点RHQR以及所述弗林蛋白识别位点RHQR前端至少一个相邻氨基酸的BDDF8-N6变体；(III)删除弗林蛋白识别位点RHQR以及所述弗林蛋白识别位点RHQR后端至少一个相邻氨基酸的BDDF8-N6变体；(IV)删除弗林蛋白识别位点RHQR、所述弗林蛋白识别位点RHQR前端至少一个相邻氨基酸以及所述弗林蛋白识别位点RHQR后端至少一个相邻氨基酸的BDDF8-N6变体。

作为本发明优选的技术方案，所述F8蛋白变体包括如(I)、(II')、(III')或(IV')中的任意一种：

(I)删除弗林蛋白识别位点RHQR的BDDF8-N6变体；(II')删除弗林蛋白识别位点RHQR以及所述弗林蛋白识别位点RHQR前端2～5个氨基酸的BDDF8-N6变体；(III')删除弗林蛋白识别位点RHQR以及所述弗林蛋白识别位点RHQR后端2～23个氨基酸的BDDF8-N6变体；(IV')删除弗林蛋白识别位点RHQR、所述弗林蛋白识别位点RHQR前端2～5个氨基酸以及所述弗林蛋白识别位点RHQR后端2～23个氨基酸的BDDF8-N6变体。

所述F8蛋白变体包括变体一～变体十三，所述变体一～变体十三删除的氨基酸序列如下：

所述变体一(BDDF8-N6-dRHQR)删除的氨基酸为弗林蛋白识别位点RHQR(SEQ IDNO.2)；

所述变体二(BDDF8-N6-dRHQR2)删除的氨基酸为RHQR-EI(SEQ ID NO.3)，其中，EI为弗林蛋白识别位点RHQR后端相邻的2个氨基酸；

所述变体三(BDDF8-N6-d2RHQR2)删除的氨基酸为LK-RHQR-EI(SEQ ID NO.4)，其中，LK为弗林蛋白识别位点RHQR前端相邻的2个氨基酸，EI为弗林蛋白识别位点RHQR后端相邻的2个氨基酸；

所述变体四(BDDF8-N6-d5RHQR)删除的氨基酸为PPVLK-RHQR(SEQ ID NO.5)，其中，PPVLK为弗林蛋白识别位点RHQR前端相邻的5个氨基酸；

所述变体五(BDDF8-N6-dRHQR5)删除的氨基酸为RHQR-EITRT(SEQ ID NO.6)，其中，EITRT为弗林蛋白识别位点RHQR后端相邻的5个氨基酸；

所述变体六(BDDF8-N6-d3RHQR5)删除的氨基酸为VLK-RHQR-EITRT(SEQ IDNO.7)，其中，VLK为弗林蛋白识别位点RHQR前端相邻的3个氨基酸，EITRT为弗林蛋白识别位点RHQR后端相邻的5个氨基酸；

所述变体七(BDDF8-N6-d5RHQR5)删除的氨基酸为PPVLK-RHQR-EITRT(SEQ IDNO.8)，其中，PPVLK为弗林蛋白识别位点RHQR前端相邻的5个氨基酸，EITRT为弗林蛋白识别位点RHQR后端相邻的5个氨基酸；

所述变体八(BDDF8-N6-dRHQR10)删除的氨基酸为RHQR-EITRTTLSQD(SEQ IDNO.9)，其中，EITRTTLSQD为弗林蛋白识别位点RHQR后端相邻的10个氨基酸；

所述变体九(BDDF8-N6-d5RHQR10)删除的氨基酸为PPVLK-RHQR-EITRTTLSQD(SEQID NO.10)，其中，PPVLK为弗林蛋白识别位点RHQR前端相邻的5个氨基酸，EITRTTLSQD为弗林蛋白识别位点RHQR后端相邻的10个氨基酸；

所述变体十(BDDF8-N6-dRHQR15)删除的氨基酸为RHQR-EITRTTLSQDGEEID(SEQ IDNO.11)，其中，EITRTTLSQDGEEID为弗林蛋白识别位点RHQR后端相邻的15个氨基酸；

所述变体十一(BDDF8-N6-d5RHQR15)删除的氨基酸为PPVLK-RHQR-EITRTTLSQDGEEID(SEQ ID NO.12)，其中，LK为弗林蛋白识别位点RHQR前端相邻的5个氨基酸，EI为弗林蛋白识别位点RHQR后端相邻的15个氨基酸；

所述变体十二(BDDF8-N6-dRHQR23)删除的氨基酸为RHQR-EITRTTLSQDGEEIDYDDTSSVE(SEQ ID NO.13)，其中，EITRTTLSQDGEEIDYDDTSSVE为弗林蛋白识别位点RHQR后端相邻的23个氨基酸；

所述变体十三(BDDF8-N6-d5RHQR23)删除的氨基酸为PPVLK-RHQR-EITRTTLSQDGEEIDYDDTSSVE(SEQ ID NO.14)，其中，PPVLK为弗林蛋白识别位点RHQR前端相邻的5个氨基酸，EITRTTLSQDGEEIDYDDTSSVE为弗林蛋白识别位点RHQR后端相邻的23个氨基酸。

本发明中，还可以按照删除氨基酸个数的多少对变体进行分类，所述变体可分为如下三类：

(a)删除4～9个氨基酸的变体，即变体一～变体五；其中，变体一和变体二的载体滴度增加2倍，变体三、变体四和变体五的载体滴度增加了5倍，除了变体五，其它四个变体F8活性提高2～3倍；

(b)删除10～24个氨基酸的变体，即变体六～变体十一；载体滴度增加6倍，除了变体九，其它五种变体F8活性提高2～4倍；

(c)删除＞24个氨基酸的变体，即变体十二和变体十三；载体包装的滴度增加，由于删除较多氨基酸，载体长度由～5.1kb降低到～5kb，生产滴度从3.6E+11GC/mL提高到2E+12GC/mL，提高了5倍；但是血友病A小鼠的体内测试F8活性只有45％和32％。

所述变体一～变体十三中敲除的序列如下表1和图2(图中删除线表示删除的具体氨基酸序列)所示：

表1

变体一的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示：

MQIELSTCFFLCLLRFCFSATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNATNVSNNSNTSNDSNVSPPVLK*EITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY(*表示删除的氨基酸原本存在的位置，其余变体的氨基酸序列以此类推，序列中斜体加粗下划线处表示变体中涉及到的删除的氨基酸)。

第二方面，本发明还提供一种编码如第一方面所述的F8蛋白变体的核苷酸序列。

第三方面，本发明还提供一种基因治疗载体，所述基因治疗载体含有编码如第一方面所述的F8蛋白变体的核苷酸序列。

优选地，所述基因治疗载体携带肝特异表达启动子HSP。

在本发明中，采用的是肝特异性表达调控元件HSP来调控载体在肝脏特异高效表达，HSP在血友病B的治疗效果中体现了明显的优势。

特异表达启动子HSP的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示：

GGGGGAGGCTGCTGGTGAATATTAACCAAGGTCACCCCAGTTATCGGAGGAGCAAACAGGGGCTAAGTCCACTGTTCCGATACTCTAATCTCCCTAGGCAAGGTTCATATTTGTGTAGGTTACTTATTCTCCTTTTGTTGACTAAGTCAATAATCAGAATCAGCAGGTTTGGAGTCAGCTTGGCAGGGATCAGCAGCCTGGGTTGGAAGGAGGGGGTATAAAAGCCCCTTCACCAGGAGAAGCCGTCACACAGATCCACAAGCTCCT

优选地，所述基因治疗载体为腺相关病毒载体。

第四方面，本发明还提供一种药物，所述药物包含如第一方面所述的F8蛋白变体、如第二方面所述的核苷酸序列或如第三方面所述的基因治疗载体。

第五方面，本发明还包括如权利要求第一方面所述的F8蛋白变体、如第二方面所述的核苷酸序列、如第三方面所述的基因治疗载体或如第四方面所述的药物在制备诊断或治疗血友病的药物或试剂中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明中所述的十三种变体，分别对BDDF8-N6变体B结构域中弗林蛋白识别位点及其附近的氨基酸序列进行了不同程度的删除，其中五种删除了4～9个氨基酸，六种删除了10～20个氨基酸，两种删除了＞20个氨基酸，其中：

删除4～9个氨基酸的变体中，变体一、二滴度增加2倍，变体三、四、五滴度增加了5倍，且血友病A小鼠体内测试结果显示：除了变体五，其它四个变体F8活性提高2～3倍，说明蛋白中氨基酸序列的删除，不仅提高了AAV-F8的包装能力，提高了载体滴度，也能提高F8的活性；

删除了10～24个氨基酸的变体中，载体滴度会增加6倍，且血友病A小鼠体内测试结果显示：除了变体九，其它五种变体F8活性提高2～4倍，说明这六种变体构建的AAV载体也可行；

删除了＞24个氨基酸的变体中，载体包装的滴度增加，由于删除较多氨基酸，载体长度由～5.1kb降低到～5kb，生产滴度从3.6E+11GC/mL提高到2E+12GC/mL，提高了5倍；但是血友病A小鼠的体内测试F8活性只有45％和32％，说明大片段氨基酸的删除可能会影响F8的功能；

(2)本发明针对F8蛋白B结构域中弗林蛋白识别位点及其附近序列的进行不同程度的删除，开发出十三种F8蛋白的优势变体；所述优势变体制备得到的AAV-F8载体能大幅度减少载体用量，提高提高AAV治疗的安全性；通过上述变体治疗血友病A小鼠，通过尾静脉注射，注射2周后检测F8活性，结果显示：对照组F8活性为55％，实验组F8活性最高可达235％；本发明中还展示其中四种变体治疗血友病A小鼠的长期效果：变体二、变体三、变体七、变体十注射血友病A小鼠后2周、6周、10周、20周检测F8活性，结果显示F8活性比较稳定；在注射6周时检测F8抗体，没有产生针对F8蛋白的抗体；因此，本发明对B结构域进行优化，使AAV-F8载体生产滴度不仅提高2～5倍，而且治疗血友病A小鼠的效果较好，不仅大大降低血友病A基因治疗的成本，还可以提高疗效和安全性。

附图说明

图1为生理情况下F8蛋白的结构域和激活过程示意图。

图2为本发明提供的F8蛋白变体中氨基酸序列删除部分的示意图。

图3为实施例2中B结构域中氨基酸删除数目对生产AAV-F8载体滴度的影响统计图。

图4为实施例3中AAV8-BDDF8-N6变体注射血友病A小鼠示意图。

图5为实施例3中B结构域中氨基酸删除数目小于10的优化型AAV-F8载体(即变体一～变体五)的F8活性统计结果图。

图6为实施例3中B结构域中氨基酸删除数目10～24的优化型AAV-F8载体会(即变体六～变体十一)的F8活性统计结果图。

图7为实施例3中B结构域中氨基酸删除数目>24的优化型AAV-F8载体会(即变体十二～变体十三)的F8活性统计结果图。

图8为实施例3中四种变体(变体二、变体三、变体七和变体十)治疗血友病A小鼠的长期效果统计图，其中I图为变体二，II图为变体三，III图为变体七，IV图为变体十。

图9为实施例4中使用和未使用AAV8-F8变体治疗的血友病A小鼠体内未F8蛋白抗体含量对比图。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

实施例1载体构建

首先，利用KAPAHiFi PCR扩增试剂盒扩增出BDDF8序列；其中，BDDF8-N6核酸序列(SEQ ID NO.17)所示；将预期删除氨基酸的序列直接在IDT公司合成gBlocks；质粒骨架通过酶切和PCR获得，然后使用NEBuilder HiFi DNA Assembly kit试剂盒将各个片段进行组装。

所有载体序列都利用核酸内切酶和桑格测序进行验证，得到表达变体一～变体十三的质粒。

实施例2 AAV病毒包装、生产、浓缩、纯化和滴度测定

利用AAV三质粒包装系统进行包装，所述三质粒包装系统包括：1)目的载体pAAV-BDDF8-N6-variant；2)反式质粒pAAV2/8，包含rep和cap基因；3)腺病毒辅助质粒pHelper(Cell Biolabs)，各质粒之间用量的比例为2:1:1；

使用PEI“Max”转染293T细胞生产AAV，293T细胞汇合度约为80～90％时进行病毒包装；切向流过滤系统(Tangential flow filtration，TFF)浓缩病毒，可将大体积含病毒的培养基浓缩50倍左右，然后利用碘克沙醇密度梯度离心，进行AAV载体的纯化。

利用qPCR测定AAV滴度，碘克沙醇纯化过的病毒使用0.1×TE+20ng/μL SalmonDNA稀释液稀释3倍，98℃5min加热完成后。使用稀释液0.1×TE+2ng/μL Salmon DNA稀释加热后的AAV病毒，连续5次3倍(5μL+10μL)稀释。

使用已知滴度的AAV载体做相同的病毒处理，作为病毒滴度检测的正对照。每个样本5个梯度，使用相应目的基因引物检测病毒滴度。

10μL qPCR体系：2μL AAV样本+0.5μL引物+5μL KAPA SYBR Fast Enzyme+2.5μLUV H₂O，进行qPCR测定载体滴度，具体PCR程序为98℃2min；98℃5s，60℃10s，72℃10s；35cycles。

AAV病毒样本qPCR病毒滴度计算：

平均CT目的引物：＝LOG(AAV样本体积,2)+CT目的引物；

AAV滴度＝正对照样本滴度/POWER(2,待测样本平均CT目的引物-正对照样本平均CT_目的引物)。

优化的13种变体，根据氨基酸删除的数目，可以分为三类：删除氨基酸数目<10；删除氨基酸数目在10～24；删除氨基酸数目>24。

如图3所示，这三组载体进行AAV载体包装，利用qPCR定量检测载体滴度，图中横坐标为AAV滴度(AAVtiterper 15cmplate)，进行统计分析，载体的滴度分别提高2倍、4倍、5倍。

实施例3 F8活性检测

本实施例中使用AAV8-BDDF8-N6变体对血友病A小鼠进行治疗并跟踪观察，检测F8活性。血友病A小鼠的F8基因第16号外显子被敲除，导致凝血因子F8不能正常表达，F8活性检测结果通常在6％～8％，进而产生凝血障碍。

AAV8-BDDF8-N6变体注射血友病A小鼠如图4所示，6～8周的血友病A小鼠，注射生产本发明所述的优势AAV-F8变体，通过尾静脉匀速注射，注射剂量是2E+12vg/kg，注射后每周观察小鼠身体状况，并于注射后4、6、10、20周分别对小鼠进行采血，检测F8的活性。

(1)血友病A小鼠取血和血浆分离

AAV尾静脉注射后，在不同时间点(2周、4周、8周、12周)取血。血友病A小鼠血浆分离采用尾静脉取血法。

准备1.5mL EP管，提前加入10μL 3.2％柠檬酸钠溶液(即1:9)作为抗凝剂，用刀片轻轻划破尾静脉，用移液枪吸取至所需血量(100μL)。血样收集完成后用止血粉末(MiracleCorp)对小鼠伤口处进行止血。

血液样品于2000×g，25℃离心20min，取出上清即为血浆，转移到新的试管中，立即冷冻在干冰上，并保存在-80℃。

在测定F8生物活性之前，将血浆样品在37℃快速解冻。

(2)F8活性检测

使用Sysmex CA1500系统(Sysmex，Kobe，Japan)测定F8的凝血活性。西门子试剂(Siemens；Marburg，Germany)包括Dade Actin activated cephaloplastin reagent(Siemens；B4218-1)和乏F8血浆(Siemens；OTXW17)。

小鼠血浆样品用Dade Owren’sVeronal缓冲液(Siemens；B4234-25)稀释4倍。F8活性测定是由5μL待测样品+45μL OV Buffer+50μL乏F8血浆+50μL aPTT试剂，37℃孵育2min；加入50μL 25mM氯化钙后开始凝固；用Sysmex CA1500系统测定凝块形成时间；稀释人标准血浆(Siemens)制备标准曲线，正常小鼠血浆作为阳性对照。

由图5可知，设计的前五种AAV-F8变体和对照载体，分别注射6-8周的血友病A小鼠，2周后检测F8活性。除了优化变体五检测到F8活性只有57％，其余四种载体F8的活性提高2-3倍。B结构域中弗林蛋白识别位点附近氨基酸的删除，能够提高F8的活性。B结构域中氨基酸删除数目小于10的优化型AAV-F8载体会提高F8活性。

由图6可知，变体六到变体十一和对照载体，分别注射6-8周的血友病A小鼠，2周后检测F8活性。除了变体九检测到F8活性只增加1.4倍，其余五种载体F8的活性提高2-4倍。B结构域中氨基酸删除数目10-24的优化型AAV-F8载体会提高F8活性。

由图7可知，变体十二和变体十三，注射血友病A小鼠，分别注射6～8周的血友病A小鼠，2周后检测F8活性。F8的活性降低，说明删除的氨基酸序列过长影响F8的活性。B结构域中氨基酸删除数目>24的优化型AAV-F8载体会降低F8活性。

本实施例中还检测了四种变体治疗血友病A小鼠的长期效果，

由图8可知，变体二(I图)、变体三(II图)、变体七(III图)、变体十(IV图)治疗血友病A小鼠观察半年后可知，F8活性较为稳定。

实施例4 F8抗体检测

F8抑制性抗体采用改进的Bethesda assay检测。一个Bethesda单位(BU)被定义为导致残余F8凝血活性下降50％的抑制剂的数量。

实验组：取F8活性长期＜20％的鼠、未注射血友病A小鼠及正常C57鼠，摘眼球取血浆，取其中50μL 56℃、30min灭活内源性F8及凝血酶，而不破坏抗体活性，冷却后再加50μL正常血浆。对照组：取咪唑缓冲液(PH＝7.3)50μL+正常血浆50μL混合。将对照组与实验组分别在37℃孵育2h，检测对照组与实验组中F8活性，计算样品中因子Ⅷ抑制物(F8inhibitor)含量。

由图9可知，注射不同载体的小鼠血清和未治疗血友病A小鼠组无差异，说明F8载体的优化并未引起体内的针对F8的体液免疫反应，从而达到长期的稳定治疗效果。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国医学科学院血液病医院（中国医学科学院血液学研究所）

<120> F8蛋白变体及利用其制备的基因治疗载体

<130> 20210517

<160> 17

<170> PatentIn version 3.3

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gatacagtgg tcattacact taagaacatg gcttcccatc ctgtcagtct tcatgctgtt 360

ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga gctgaatatg atgatcagac cagtcaaagg 420

gagaaagaag atgataaagt cttccctggt ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg 480

aaagagaatg gtccaatggc ctctgaccca ctgtgcctta cctactcata tctttctcat 540

gtggacctgg taaaagactt gaattcaggc ctcattggag ccctactagt atgtagagaa 600

gggagtctgg ccaaggaaaa gacacagacc ttgcacaaat ttatactact ttttgctgta 660

tttgatgaag ggaaaagttg gcactcagaa acaaagaact ccttgatgca ggatagggat 720

gctgcatctg ctcgggcctg gcctaaaatg cacacagtca atggttatgt aaacaggtct 780

ctgccaggtc tgattggatg ccacaggaaa tcagtctatt ggcatgtgat tggaatgggc 840

accactcctg aagtgcactc aatattcctc gaaggtcaca catttcttgt gaggaaccat 900

cgccaggcgt ccttggaaat ctcgccaata actttcctta ctgctcaaac actcttgatg 960

gaccttggac agtttctact gttttgtcat atctcttccc accaacatga tggcatggaa 1020

gcttatgtca aagtagacag ctgtccagag gaaccccaac tacgaatgaa aaataatgaa 1080

gaagcggaag actatgatga tgatcttact gattctgaaa tggatgtggt caggtttgat 1140

gatgacaact ctccttcctt tatccaaatt cgctcagttg ccaagaagca tcctaaaact 1200

tgggtacatt acattgctgc tgaagaggag gactgggact atgctccctt agtcctcgcc 1260

cccgatgaca gaagttataa aagtcaatat ttgaacaatg gccctcagcg gattggtagg 1320

aagtacaaaa aagtccgatt tatggcatac acagatgaaa cctttaagac tcgtgaagct 1380

attcagcatg aatcaggaat cttgggacct ttactttatg gggaagttgg agacacactg 1440

ttgattatat ttaagaatca agcaagcaga ccatataaca tctaccctca cggaatcact 1500

gatgtccgtc ctttgtattc aaggagatta ccaaaaggtg taaaacattt gaaggatttt 1560

ccaattctgc caggagaaat attcaaatat aaatggacag tgactgtaga agatgggcca 1620

actaaatcag atcctcggtg cctgacccgc tattactcta gtttcgttaa tatggagaga 1680

gatctagctt caggactcat tggccctctc ctcatctgct acaaagaatc tgtagatcaa 1740

agaggaaacc agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag 1800

aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc agctggagtg 1860

cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt 1920

tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg catgaggtgg catactggta cattctaagc 1980

attggagcac agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa 2040

atggtctatg aagacacact caccctattc ccattctcag gagaaactgt cttcatgtcg 2100

atggaaaacc caggtctatg gattctgggg tgccacaact cagactttcg gaacagaggc 2160

atgaccgcct tactgaaggt ttctagttgt gacaagaaca ctggtgatta ttacgaggac 2220

agttatgaag atatttcagc atacttgctg agtaaaaaca atgccattga accaagaagc 2280

ttctctcaaa acgcgacgaa cgtgagtaac aactcaaaca ctagtaatga ttcgaacgtt 2340

tcgccaccag tcttgaaacg ccatcaacgg gaaataactc gtactactct tcagtcagat 2400

caagaggaaa ttgactatga tgataccata tcagttgaaa tgaagaagga agattttgac 2460

atttatgatg aggatgaaaa tcagagcccc cgcagctttc aaaagaaaac acgacactat 2520

tttattgctg cagtggagag gctctgggat tatgggatga gtagctcccc acatgttcta 2580

agaaacaggg ctcagagtgg cagtgtccct cagttcaaga aagttgtttt ccaggaattt 2640

actgatggct cctttactca gcccttatac cgtggagaac taaatgaaca tttgggactc 2700

ctggggccat atataagagc agaagttgaa gataatatca tggtaacttt cagaaatcag 2760

gcctctcgtc cctattcctt ctattctagc cttatttctt atgaggaaga tcagaggcaa 2820

ggagcagaac ctagaaaaaa ctttgtcaag cctaatgaaa ccaaaactta cttttggaaa 2880

gtgcaacatc atatggcacc cactaaagat gagtttgact gcaaagcctg ggcttatttc 2940

tctgatgttg acctggaaaa agatgtgcac tcaggcctga ttggacccct tctggtctgc 3000

cacactaaca cactgaaccc tgctcatggg agacaagtga cagtacagga atttgctctg 3060

tttttcacca tctttgatga gaccaaaagc tggtacttca ctgaaaatat ggaaagaaac 3120

tgcagggctc cctgcaatat ccagatggaa gatcccactt ttaaagagaa ttatcgcttc 3180

catgcaatca atggctacat aatggataca ctacctggct tagtaatggc tcaggatcaa 3240

aggattcgat ggtatctgct cagcatgggc agcaatgaaa acatccattc tattcatttc 3300

agtggacatg tgttcactgt acgaaaaaaa gaggagtata aaatggcact gtacaatctc 3360

tatccaggtg tttttgagac agtggaaatg ttaccatcca aagctggaat ttggcgggtg 3420

gaatgcctta ttggcgagca tctacatgct gggatgagca cactttttct ggtgtacagc 3480

aataagtgtc agactcccct gggaatggct tctggacaca ttagagattt tcagattaca 3540

gcttcaggac aatatggaca gtgggcccca aagctggcca gacttcatta ttccggatca 3600

atcaatgcct ggagcaccaa ggagcccttt tcttggatca aggtggatct gttggcacca 3660

atgattattc acggcatcaa gacccagggt gcccgtcaga agttctccag cctctacatc 3720

tctcagttta tcatcatgta tagtcttgat gggaagaagt ggcagactta tcgaggaaat 3780

tccactggaa ccttaatggt cttctttggc aatgtggatt catctgggat aaaacacaat 3840

atttttaacc ctccaattat tgctcgatac atccgtttgc acccaactca ttatagcatt 3900

cgcagcactc ttcgcatgga gttgatgggc tgtgatttaa atagttgcag catgccattg 3960

ggaatggaga gtaaagcaat atcagatgca cagattactg cttcatccta ctttaccaat 4020

atgtttgcca cctggtctcc ttcaaaagct cgacttcacc tccaagggag gagtaatgcc 4080

tggagacctc aggtgaataa tccaaaagag tggctgcaag tggacttcca gaagacaatg 4140

aaagtcacag gagtaactac tcagggagta aaatctctgc ttaccagcat gtatgtgaag 4200

gagttcctca tctccagcag tcaagatggc catcagtgga ctctcttttt tcagaatggc 4260

aaagtaaagg tttttcaggg aaatcaagac tccttcacac ctgtggtgaa ctctctagac 4320

ccaccgttac tgactcgcta ccttcgaatt cacccccaga gttgggtgca ccagattgcc 4380

ctgaggatgg aggttctggg ctgcgaggca caggacctct actga 4425

Claims

1.F8蛋白变体，其特征在于，所述F8蛋白变体的氨基酸序列为BDDF8-N6变体删除至少4个氨基酸后得到的氨基酸序列中的任意一种；

所述BDDF8-N6变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述F8蛋白变体包括变体一、变体二、变体三、变体四、变体六、变体七、变体八、变体十和变体十一，所述变体一、变体二、变体三、变体四、变体六、变体七、变体八、变体十和变体十一删除的氨基酸序列如下：

所述变体一删除的氨基酸为弗林蛋白识别位点RHQR；

所述变体二删除的氨基酸为RHQR-EI，其中，EI为弗林蛋白识别位点RHQR后端相邻的2个氨基酸；

所述变体三删除的氨基酸为LK-RHQR-EI，其中，LK为弗林蛋白识别位点RHQR前端相邻的2个氨基酸，EI为弗林蛋白识别位点RHQR后端相邻的2个氨基酸；

所述变体四删除的氨基酸为PPVLK-RHQR，其中，PPVLK为弗林蛋白识别位点RHQR前端相邻的5个氨基酸；

所述变体六删除的氨基酸为VLK-RHQR-EITRT，其中，VLK为弗林蛋白识别位点RHQR前端相邻的3个氨基酸，EITRT为弗林蛋白识别位点RHQR后端相邻的5个氨基酸；

所述变体七删除的氨基酸为PPVLK-RHQR-EITRT，其中，PPVLK为弗林蛋白识别位点RHQR前端相邻的5个氨基酸，EITRT为弗林蛋白识别位点RHQR后端相邻的5个氨基酸；

所述变体八删除的氨基酸为RHQR-EITRTTLSQD，其中，EITRTTLSQD为弗林蛋白识别位点RHQR后端相邻的10个氨基酸；

所述变体十删除的氨基酸为RHQR-EITRTTLSQDGEEID，其中，EITRTTLSQDGEEID为弗林蛋白识别位点RHQR后端相邻的15个氨基酸；

所述变体十一删除的氨基酸为PPVLK-RHQR-EITRTTLSQDGEEID，其中，PPVLK为弗林蛋白识别位点RHQR前端相邻的5个氨基酸，EITRTTLSQDGEEID为弗林蛋白识别位点RHQR后端相邻的15个氨基酸。

2.编码如权利要求1所述的F8蛋白变体的多核苷酸。

3.一种基因治疗载体，其特征在于，所述基因治疗载体含有编码如权利要求1所述的F8蛋白变体的多核苷酸。

4.根据权利要求3所述的基因治疗载体，其特征在于，所述基因治疗载体携带肝特异表达启动子HSP。

5.根据权利要求4所述的基因治疗载体，其特征在于，所述基因治疗载体为腺相关病毒载体AAV。

6.一种药物，其特征在于，所述药物包含如权利要求1所述的F8蛋白变体、如权利要求2所述的多核苷酸或如权利要求3-5任一项所述的基因治疗载体。

7.如权利要求1所述的F8蛋白变体、如权利要求2所述的多核苷酸、如权利要求3-5任一项所述的基因治疗载体在制备治疗血友病的药物中的应用。