CN108977464A - 用于提高B型血友病患者的凝血活性的组合物、药物和sgRNA - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于提高B型血友病患者的凝血活性的组合物、药物和sgRNA，涉及血友病基因治疗领域。该组合物包括第一AAV载体和表达sgRNA的第二AAV载体，所述sgRNA的核心序列选自SEQ ID NO.6‑9；该组合物可用于治疗B型血友病，恢复其凝血活性。

Description

用于提高B型血友病患者的凝血活性的组合物、药物和sgRNA

技术领域

本发明涉及血友病基因治疗领域，具体而言，涉及一种用于提高B型血友病患者的凝血活性的组合物、药物和sgRNA。

背景技术

B型血友病是单基因X染色体连锁隐性遗传性凝血系统疾病，血友病患者常自幼年发病、由于儿童活泼好动，关节出血几率高，长期发作可以影响骨关节的生长发育，导致关节畸形及肌肉萎缩。B型血友病病人体内凝血IX因子缺乏，凝血IX因子编码的蛋白是参与凝血系统的丝氨酸蛋白酶之一，研究发现恢复凝血IX因子功能至≥1％正常活性就会大幅改善重型患者的临床表型。输注凝血IX因子制剂(通常为体外重组表达的IX蛋白)预防或按需替代疗法是目前高收入国家血友病的标准疗法，但是需要频繁输注，价格昂贵。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于提高B型血友病患者的凝血活性的组合物，该组合物可提高B型血友病患者的凝血活性。

本发明的另一目的在于提供一种预防或治疗B型血友病的药物，该药物可提高B型血友病患者的凝血活性。

本发明的另一目的在于提供用于CRISPR/Cas9基因编辑系统中的sgRNA，该sgRNA可靶向Albumin基因内含子1的区域，具有较高的基因编辑效率。

本发明是这样实现的：

一方面，本发明提供了一种用于提高B型血友病患者的凝血活性的组合物，其包括：第一AAV载体和第二AAV载体；

上述第一AAV载体含有表达Cas9核酸酶的核酸酶编码序列；

上述第二AAV载体含有表达sgRNA的sgRNA核酸序列；

上述sgRNA的核心序列选自SEQ ID NO.6-9；

上述第二AAV载体上还含有同源重组模板DNA序列；

上述同源重组模板DNA序列具有编码功能性凝血因子IX的凝血因子编码序列，上述功能性凝血因子IX的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。

基因治疗是目前正在临床试验的治疗方法，通过病毒载体将正常或高活性的因子IX导入患者细胞中，使其长期表达，从而达到预防出血目的，在B型血友病的治疗中显示出巨大潜力。由于非整合型载体(如AAV)在细胞分裂的过程中会丢失，从而大大降低了目的基因的表达效率，这给B型血友病的基因治疗带来了巨大的挑战。在临床前数据的鼓舞下，血友病B或粘多糖贮积症患者I的临床试验(NCT02695160；NCT02702115)已经开始。然而使用ZFN基因编辑技术仅有0.5％的靶向效率，效率太低从而极大的限制了其使用范围。

因此，仍然需要编辑效率更高的基因组编辑治疗B型血友病的其他方法，以达到有效表达足够量的凝血因子IX进而降低所需病毒载体剂量，进而降低潜在的毒副作用的目的。

本发明的提供的组合物基于CRISPR/Cas9基因编辑技术，利用具有较高基因编辑效率核心序列如SEQ ID NO.6-9所示的sgRNA靶向目的基因组区域Albumin基因(白蛋白基因)的内含子1区域，定向整合SEQ ID NO.10所示的功能性凝血因子IX即高活性的Padua突变体，可使B型血友病患者的凝血活性提高并恢复至正常水平。

本发明采用腺相关病毒(AAV)载体递送CRISPR/Cas9定向整合功能性凝血因子IX基因，一方面可以降低病毒载体剂量，降低潜在的毒副作用，提高其完全性和稳定性，另一方面可使基因靶向整合效率高达6％。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述凝血因子编码序列如SEQ ID NO.11所示。

经过密码子优化的SEQ ID NO.11所示的凝血因子编码序列，在体内可具有较高的表达水平可达正常水平的40％，有效地提高功能性凝血因子IX蛋白的表达水平。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述同源重组模板DNA序列还具有位于上述凝血IX因子编码序列上游的5’端同源臂和位于上述凝血IX因子编码序列下游的3’端同源臂。

优选地，在本发明的一些实施方案中，上述5’端同源臂的序列如SEQ ID NO.12所示。

优选地，在本发明的一些实施方案中，上述3’端同源臂的序列如SEQ ID NO.13所示。

同源臂的长短是影响基因重组效率的因素，具有合适长度的同源臂可以有效地提高基因重组的效率。

使用经优化后的SEQ ID NO.12作为5’端同源臂和SEQ ID NO.13作为3’端同源臂，可以提高基因重组效率。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述sgRNA的核心序列如SEQ ID NO.9所示。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述第一AAV载体还含有用于驱动上述核酸酶编码序列在肝脏中特异表达的肝脏特异性启动子，上述肝脏特异性启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。肝脏特异性启动子连接在核酸酶编码序列的上游。

通过引入SEQ ID NO.1所示肝脏特异性启动子，可使Cas9核酸酶在肝脏中特异性表达，使基因重组发生在肝脏中，在肝脏中特异性表达出功能性凝血因子IX，提高凝血活性。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，第一AAV载体含有转录终止信号序列，上述转录终止信号序列连接在核酸酶编码序列的下游，上述转录终止信号序列如SEQ IDNO.3所示。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述核酸酶编码序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，第一AAV载体和第二AAV载体均为AAV8载体。

当然，在其他的实施例中，第一AAV载体和第二AAV载体的类型也可以是AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV9、AAVrh10，AAVrh64或AAVrh74等类型。具体的AAV载体类别，可以根据感染组织的类型选择。

另一方面，本发明提供了一种预防或治疗B型血友病的药物，其包括如上上述的组合物和药学上可接受的辅料。

再一方面，本发明提供了一种用于CRISPR/Cas9基因编辑系统中的sgRNA，该sgRNA的核心序列选自SEQ ID NO.6-9。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，该sgRNA的核心序列如SEQ ID NO.9所示。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，该sgRNA的序列如SEQ ID NO.14所示。

本文前述以及后文提及的核心序列，可以理解为gRNA的引导序列，可结合至靶序列上，引导CRISPR复合物结合至靶序列上，在靶位点形成双链DNA断裂(DSB)，在同源模板的存在下发生基因重组。

针对不同靶位点的核心序列具有不同的编辑效率，本发明的研究表明，使用序列SEQ ID NO.6-9的核心序列具有较高的基因编辑效率，尤其是SEQ ID NO.9所示的核心序列的基因编辑效率高达50％。

再一方面，本发明提供了一种治疗B型血友病的方法，其包括：往患有B型血友病患者体内施用如上上述的组合物或如上上述的药物。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，通过静脉递送的方式施用如上上述的组合物或如上上述的药物。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑系统在Albumin基因内含子1区域定向整合功能性凝血因子IX的策略图。

图2为本发明实施例中的通过SURVEYOR实验检测sgRNA1-4的基因编辑效率的结果。

图3为本发明实施例中的第一AAV载体(AAV8.SpCas9)和第二AAV载体(AAV8.sgRNA.donor)的结构示意图。

图4为本发明实验例中的通过AAV8.CRISPR-SpCas9处理的血友病B小鼠有效恢复F9表达水平和功能的检测结果；图中，(a)：通过尾静脉注射具有AAV8.SpCas9(1×10¹²基因组拷贝/小鼠)和AAV8.sgRNA.donor(3×10¹²基因组拷贝/小鼠)的8周龄雌性血友病B小鼠，通过ELISA测量血浆中F9的含量；未靶向的血友病B小鼠接受AAV8.SpCas9(1×10¹²基因组拷贝/小鼠)和AAV8.control.donor(3×10¹²基因组拷贝/小鼠)；以未治疗的血友病B小鼠(n＝5)作为对照；(b)：在治疗前和治疗后16周通过活化的部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)测量凝血因子功能的结果，数据以平均值±SEM表示，****p<0.0001，Dunnett检验，N.S.＝非显著。

图5为本发明实验例中的在血友病B小鼠的治疗后F9基因靶向整合效率检测结果；图中：(a)：在注射后16周(n＝5)收集的肝切片上用抗F9(红色)和4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)核染色(蓝色)的抗体进行免疫荧光染色；染色细胞通常显示为单个校正肝细胞，a4为a3中的局部放大图；(b)：基于a中通过免疫染色表达F9的肝切片的面积百分比来量化F9基因定点整合效率；(c)：通过RT-qPCR使用跨越白蛋白外显子1和F9外显子2的引物定量肝中的F9mRNA表达水平；(d)：靶向DNA水平的Albumin基因座的比率；数据以平均值±SEM表示，***P<0.001，****P<0.0001，Dunnett检验。

图6为本发明实验例中的评估Albumin位点的基因编辑效率和脱靶效率；图中：(a)用通过AAV8.CRISPR-SpCas9处理的血友病B小鼠，治疗后第16周，取肝脏组织提取基因组DNA，SURVEYOR实验检测基因编辑效率；(b)：通过Benchling在线分析潜在脱靶点进行评分，并通过SURVEYOR实验进行验证。

图7为本发明实验例中的用AAV8.CRISPR-SpCas9治疗后肝毒性检查结果；图中：(a)：对治疗后16周收获的肝脏的组织学分析；(b)：未治疗的血友病B小鼠(n＝3)或靶向治疗后16周的肝转氨酶水平(n＝5)，非靶向对照的小鼠接受1×10¹²GC AAV8.SpCas9和3×10¹²GC的AAV8.control.donor载体，而靶向治疗的小鼠接受1×10¹²GC AAV8.SpCas9和3×10¹²GC的AAV8.sgRNA.donor，数据以平均值±SEM表示，Dunnett检验；(c)：Western印迹分析结果；用治疗后16周收获的肝脏制备肝脏蛋白裂解液以检测白蛋白的表达情况；(d)：通过qPCR定量肝脏中的SpCas9载体DNA的表达情况。

图8为本发明实施例中pX330载体的结构示意图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

构建靶向Albumin基因内含子1区域并能够定向整合功能性凝血因子IX(以下简称F9)的载体

1.利用CRISPR/Cas9基因编辑系统在Albumin基因内含子1区域定向整合功能性凝血因子IX的策略图1所示。

2.sgRNA基因编辑效率验证

2.1根据Albumin基因内含子1区域的序列，设计出靶向Albumin基因内含子1区域不同位点的sgRNA，各sgRNA所针对的靶位点序列见表1。

表1

2.2根据表1靶位点序列，合成各sgRNA寡核苷酸单链(见表2)，合成时在正反义链的5’端添加4个碱基，使其与pX330载体(载体示意图如图8所示)用限制性内切酶BbsI酶切后产生的黏性末端互补配对，序列如表2所示。

表2

2.3合成的sgRNA寡核苷酸单链进行磷酸化退火形成双链，pX330载体经限制性内切酶BbsI酶切后切胶回收的产物与磷酸化退火的寡核苷酸产物使用T4连接酶进行连接，随后进行转化感受态细菌接种培养，抽提得到的质粒进行酶切鉴定和测序，测序结果正确后提取去内毒素质粒。

2.4将退火形成的双链sgRNA1-4核苷酸序列(其可分别转录出SEQ ID NO.6-9的RNA序列)分部克隆至pX330载体上，分别得到sgRNA1载体、sgRNA2载体、sgRNA3载体、sgRNA4载体。用构建好的sgRNA1-4载体转染H2.35细胞，48小时收集细胞基因组DNA，通过SURVEYOR实验检测sgRNA1-4的基因编辑效率，结果见图2。

如图2所示，sgRNA1-4均能实现基因编辑效果，其中，出乎发明人的预料的是，sgRNA4的基因编辑效率高达为50.3％，而sgRNA1-sgRNA3的基因编辑效率分别是18.8％、20.5％、14.1％，预示sgRNA4具有更好的应用前景。

3.构建CRISPR/Cas9基因编辑系统

3.1使用含有5’ITR和3’ITR序列的AAV顺式包装质粒载体作为质粒骨架，分别构建出用于包装表达Cas9核酸酶的AAV顺式包装质粒载体一(命名pAAV.LSP.SpCas9.PA75)，和用于表达sgRNA4和携带同源重组模板DNA序列的AAV顺式包装质粒载体二(命名为pAAV.sgRNA.donor)。

其中，在AAV顺式包装质粒载体一5’ITR和3’ITR序列之间，通过Infusion无缝克隆的方式，在Cas9核酸酶编码序列(图3A中SpCas9)上游插入有SEQ ID NO.1所示的肝脏特异性启动子(图3A中LSP)，在Cas9核酸酶编码序列下游插入有SEQ ID NO.3所示的转录终止信号序列(图3A中PA75)，Cas9核酸酶编码序列如SEQ ID NO.2所示。

3.2AAV顺式包装质粒载体二上的sgRNA由碱基序列如SEQ ID NO.4所示U6启动子驱动。表达出的完整sgRNA的序列如下(SEQ NO ID.14)：

guaaauaucuacuaagacaaguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuuuu；

下划线处为针对Albumin基因内含子1区域90461429位点的核心序列(同SEQ NOID.9)。

AAV顺式包装质粒载体二上的同源重组模板DNA序列的碱基序列如SEQ ID NO.5所示。

3.3使用三质粒共转染法制备第一AAV病毒载体，在HEK 293细胞汇合度至80％，使用PEI转染试剂，转染AAV包装质粒pAAV.LSP.SpCas9.PA75，pAAV2/8和pAdΔF6质粒，转染72小时后收集AAV病毒颗粒，作为第一AAV病毒载体(命名为AAV8.SpCas9，其含有的核酸序列结构示意图见图3A)。使用碘克沙醇密度梯度离心进行纯化，病毒滴度使用荧光定量PCR(qPCR)进行检测，所用引物序列为：

hSpCas9_qPCR_Fwd:GCAAGGACACCTACGACGAC；

hSpCas9_qPCR_Rev:CGTACTGGTCGCCGATCT。

3.4使用三质粒共转染法制备第二AAV病毒载体，在HEK 293细胞汇合度至80％，使用PEI转染试剂，转染AAV包装质粒pAAV.sgRNA.donor，pAAV2/8和pAdΔF6质粒，转染72小时后收集AAV病毒颗粒，作为第二AAV病毒载体(命名为pAAV.sgRNA.donor，其含有的核酸序列结构示意图见图3B)。使用碘克沙醇密度梯度离心进行纯化，病毒滴度使用荧光定量PCR(qPCR)进行检测，所用引物序列为：

BGH_qPCR_Fwd:TCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGG；

BGH_qPCR_Rev:TGCTATTGTCTTCCCAATCCTC。

将第一AAV载体和第二AAV载体组合，命名为AAV8.CRISPR-SpCas9载体系统。该载体系统即可用于预防或治疗B型血友病，提高患者的凝血活性。

实验例1

检测经上述AAV8.CRISPR-SpCas9载体系统处理的F9表达水平

实验分组：

靶向治疗组：通过尾静脉注射实施例2中的第一AAV病毒载体AAV8.SpCas9(1×10¹²基因组拷贝/小鼠)和第二AAV病毒载体AAV8.sgRNA.donor(3×10¹²基因组拷贝/小鼠)的8周龄雌性血友病B小鼠(n＝5)；

非靶向对照组：通过尾静脉注射实施例2中的AAV8.SpCas9(1×10¹²基因组拷贝/小鼠)和AAV8.control.donor(空载体，不表达sgRNA，3×10¹²基因组拷贝/小鼠)的8周龄雌性血友病B小鼠(n＝5)；

未处理组：未作任何处理的8周龄雌性血友病B小鼠(n＝5)；

在治疗后的不同时间点采取血样，检测其F9的表达水平和功能。

检测方法：使用眼眶取血与3.2％柠檬酸钠抗凝剂10:1稀释，然后离心取上清血浆，分装为两份分别检测F9表达水平和凝血因子活性。使用人F9ELISA试剂盒测定血浆F9表达水平，正常人血浆和乏F9因子血浆分别作为标准品和阴性对照，使用显色测定法测定吸光光度值，绘制标准曲线，计算样品F9因子表达。使用活化部分凝血活酶(aPTT)检测治疗后小鼠凝血活性，将待测血浆与50μL EMO aPTT试剂混匀孵育5分钟，然后加入EMO Calcium记录凝血时间。

结果见图4，可以看出，靶向治疗组的F9表达水平明显高于其他实验组(图4-a)，且靶向治疗组的F9促凝血酶原激酶时间(aPTT)短于其他实验组，与正常野生型小鼠的F9促凝血酶原激酶时间接近(图4-b)，表明经实施例2的AAV8.CRISPR-SpCas9载体系统治疗后的血友病B小鼠的F9表达水平和其功能得到了恢复，且能够恢复至正常水平。

实验例2

检测在血友病B小鼠的治疗后F9基因靶向整合效率。

实验分组同实验例1。

治疗结束后，取肝叶用预冷PBS清洗，吸去水分，置于OCT包埋剂，液氮中冰冻，使用冰冻切片机切片(切片厚度8μm)，固定组织，使用山羊抗人F9抗体进行免疫荧光染色，使用ImageJ软件拍照并分析实验结果。收集肝脏匀浆，提取组织RNA，反转录合成cDNA，设计靶向特异的qPCR引物，Sybr Green qPCR试剂盒进行荧光定量PCR检测，使用Albumin特异qPCR作为对照。

实验结束后，收获肝组织，匀浆提取全基因组DNA，使用XhoI限制性内切酶处理基因组DNA，然后使用XhoI兼容性Linker进行连接，巢式PCR扩增目的片段，然后以此为模板进行qPCR定量分析野生型和基因靶向片段拷贝数，进行定量分析，所用引物如表3所示。

表3

结果如图5所示，在注射后16周(n＝5)收集的肝切片上用抗F9(红色)的抗体和4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)核染色(蓝色)进行免疫荧光染色，在靶向治疗组可见基因编辑后表达F9蛋白细胞，且显示为单个校正肝细胞(图5-a)。基于通过免疫染色表达F9的肝切片的面积百分比来量化F9基因定点整合效率，如a中所示，约5％的肝细胞表达F9蛋白(图5-b)。

通过RT-qPCR使用跨越白蛋白外显子1和F9外显子2的引物定量肝中的F9mRNA水平，F9mRNA总量约占Albumin mRNA总量的3.2％(图5-c)。靶向DNA水平的Albumin基因座的比率，F9基因定点整合效率为6.02％(图5-d)。

实验例3

评估Albumin位点的基因编辑效率和脱靶效率，结果如图6所示。通过AAV8.CRISPR-SpCas9处理的血友病B小鼠，治疗后第16周，取肝脏组织提取基因组DNA，SURVEYOR实验检测基因编辑效率，实验结果显示在Albumin位点的基因编辑效率为11％-23.9％(图6-a)。通过Benchling在线分析潜在脱靶点进行评分，对排名前10的脱靶位点(OT1-10)，通过PCR扩增目的区域，SURVEYOR实验进行验证，未发现基因编辑脱靶效应(图6-b)，所用PCR引物如表4所示。

表4

实验例4

用AAV8.CRISPR-SpCas9治疗后肝毒性检查，结果如图7所示。对治疗后16周收获的肝脏的组织学分析，与对照组相比，治疗组中肝脏的组织形态无差异(图7-a)；与非靶向对照组、对照组相比，靶向治疗组的肝转氨酶水平无差异(图7-b)。采用Western印迹分析，用治疗后16周收获的肝脏制备肝脏蛋白裂解液，通过SDS-PAGE分离蛋白，Western blotting使用Albumin抗体检测肝脏总蛋白中Albumin蛋白的表达情况。实验结果显示治疗组中Albumin蛋白表达与对照组无差异(图7-c)；治疗结束后，取肝脏组织，提取全基因组DNA，通过qPCR定量肝脏中的SpCas9载体DNA的拷贝数，所用引物序列：hSpCas9_qPCR_Fwd：GCAAGGACACCTACGACGAC；hSpCas9_qPCR_Rev：CGTACTGGTCGCCGATCT。

结果显示，非靶向治疗组中AAV8.SpCas9病毒拷贝数为9.98拷贝/细胞，靶向治疗组中AAV8.SpCas9病毒拷贝数10.73拷贝/细胞(图7-d)。

综上，本发明创造性地使用AAV双载体CRISPR/Cas9系统：AAV载体一包含肝脏特异启动子，SpCas9基因编码序列，转录终止信号序列polyA，用于肝脏特异表达Cas9核酸酶；AAV载体二携带U6-sgRNA元件，以及同源重组模板，用于定点编辑基因位点和外源基因的定点整合。在体内实验中，该系统能够整合至少6％的目的基因至基因组安全港位点(如Albumin基因内含子1区域)，恢复凝血IX因子表达至正常水平的40％，恢复其凝血因子活性，达到治疗B型血友病的效果。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 成都金唯科生物科技有限公司

<120> 用于提高B型血友病患者的凝血活性的组合物、药物和sgRNA

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 264

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gttaattttt aaactgtttg ctctggttaa taatctcagg aggttaattt ttaaactgtt 60

tgctctggtt aataatctca ggcgcgccac tcaaagttca aaccttatca ttttttgctt 120

tgttcctctt ggccttggtt ttgtacatca gctttgaaaa taccatccca gggttaatgc 180

tggggttaat ttataactaa gagtgctcta gttttgcaat acaggacatg ctataaaaat 240

ggaaagatgt tgctttctga gaga 264

<210> 2

<211> 4269

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggactata aggaccacga cggagactac aaggatcatg atattgatta caaagacgat 60

gacgataaga tggccccaaa gaagaagcgg aaggtcggta tccacggagt cccagcagcc 120

gacaagaagt acagcatcgg cctggacatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc 180

accgacgagt acaaggtgcc cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac 240

agcatcaaga agaacctgat cggagccctg ctgttcgaca gcggcgaaac agccgaggcc 300

acccggctga agagaaccgc cagaagaaga tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat 360

ctgcaagaga tcttcagcaa cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg 420

gaagagtcct tcctggtgga agaggataag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac 480

atcgtggacg aggtggccta ccacgagaag taccccacca tctaccacct gagaaagaaa 540

ctggtggaca gcaccgacaa ggccgacctg cggctgatct atctggccct ggcccacatg 600

atcaagttcc ggggccactt cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg 660

gacaagctgt tcatccagct ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc 720

aacgccagcg gcgtggacgc caaggccatc ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg 780

ctggaaaatc tgatcgccca gctgcccggc gagaagaaga atggcctgtt cggaaacctg 840

attgccctga gcctgggcct gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggat 900

gccaaactgc agctgagcaa ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag 960

atcggcgacc agtacgccga cctgtttctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg 1020

ctgagcgaca tcctgagagt gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgcctctatg 1080

atcaagagat acgacgagca ccaccaggac ctgaccctgc tgaaagctct cgtgcggcag 1140

cagctgcctg agaagtacaa agagattttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc 1200

tacattgacg gcggagccag ccaggaagag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggaa 1260

aagatggacg gcaccgagga actgctcgtg aagctgaaca gagaggacct gctgcggaag 1320

cagcggacct tcgacaacgg cagcatcccc caccagatcc acctgggaga gctgcacgcc 1380

attctgcggc ggcaggaaga tttttaccca ttcctgaagg acaaccggga aaagatcgag 1440

aagatcctga ccttccgcat cccctactac gtgggccctc tggccagggg aaacagcaga 1500

ttcgcctgga tgaccagaaa gagcgaggaa accatcaccc cctggaactt cgaggaagtg 1560

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ctgcccaacg agaaggtgct gcccaagcac agcctgctgt acgagtactt caccgtgtat 1680

aacgagctga ccaaagtgaa atacgtgacc gagggaatga gaaagcccgc cttcctgagc 1740

ggcgagcaga aaaaggccat cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg 1800

aagcagctga aagaggacta cttcaagaaa atcgagtgct tcgactccgt ggaaatctcc 1860

ggcgtggaag atcggttcaa cgcctccctg ggcacatacc acgatctgct gaaaattatc 1920

aaggacaagg acttcctgga caatgaggaa aacgaggaca ttctggaaga tatcgtgctg 1980

accctgacac tgtttgagga cagagagatg atcgaggaac ggctgaaaac ctatgcccac 2040

ctgttcgacg acaaagtgat gaagcagctg aagcggcgga gatacaccgg ctggggcagg 2100

ctgagccgga agctgatcaa cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat 2160

ttcctgaagt ccgacggctt cgccaacaga aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc 2220

ctgaccttta aagaggacat ccagaaagcc caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac 2280

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gaaatggcca gagagaacca gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaatg 2460

aagcggatcg aagagggcat caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg 2520

gaaaacaccc agctgcagaa cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat 2580

atgtacgtgg accaggaact ggacatcaac cggctgtccg actacgatgt ggaccatatc 2640

gtgcctcaga gctttctgaa ggacgactcc atcgacaaca aggtgctgac cagaagcgac 2700

aagaaccggg gcaagagcga caacgtgccc tccgaagagg tcgtgaagaa gatgaagaac 2760

tactggcggc agctgctgaa cgccaagctg attacccaga gaaagttcga caatctgacc 2820

aaggccgaga gaggcggcct gagcgaactg gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg 2880

gtggaaaccc ggcagatcac aaagcacgtg gcacagatcc tggactcccg gatgaacact 2940

aagtacgacg agaatgacaa gctgatccgg gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag 3000

ctggtgtccg atttccggaa ggatttccag ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac 3060

caccacgccc acgacgccta cctgaacgcc gtcgtgggaa ccgccctgat caaaaagtac 3120

cctaagctgg aaagcgagtt cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg 3180

atcgccaaga gcgagcagga aatcggcaag gctaccgcca agtacttctt ctacagcaac 3240

atcatgaact ttttcaagac cgagattacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggcct 3300

ctgatcgaga caaacggcga aaccggggag atcgtgtggg ataagggccg ggattttgcc 3360

accgtgcgga aagtgctgag catgccccaa gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag 3420

acaggcggct tcagcaaaga gtctatcctg cccaagagga acagcgataa gctgatcgcc 3480

agaaagaagg actgggaccc taagaagtac ggcggcttcg acagccccac cgtggcctat 3540

tctgtgctgg tggtggccaa agtggaaaag ggcaagtcca agaaactgaa gagtgtgaaa 3600

gagctgctgg ggatcaccat catggaaaga agcagcttcg agaagaatcc catcgacttt 3660

ctggaagcca agggctacaa agaagtgaaa aaggacctga tcatcaagct gcctaagtac 3720

tccctgttcg agctggaaaa cggccggaag agaatgctgg cctctgccgg cgaactgcag 3780

aagggaaacg aactggccct gccctccaaa tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac 3840

tatgagaagc tgaagggctc ccccgaggat aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag 3900

cacaagcact acctggacga gatcatcgag cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc 3960

ctggccgacg ctaatctgga caaagtgctg tccgcctaca acaagcaccg ggataagccc 4020

atcagagagc aggccgagaa tatcatccac ctgtttaccc tgaccaatct gggagcccct 4080

gccgccttca agtactttga caccaccatc gaccggaaga ggtacaccag caccaaagag 4140

gtgctggacg ccaccctgat ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac 4200

ctgtctcagc tgggaggcga caaaaggccg gcggccacga aaaaggccgg ccaggcaaaa 4260

aagaaaaag 4269

<210> 3

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aataaagtct gagtgggcgg cagcctgtgt gtgcctgggt tctctctgtc ccggaatgtg 60

caaacaatgg aggtg 75

<210> 4

<211> 249

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

cgaaacacc 249

<210> 5

<211> 3048

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tcctatcaac cccactagcc tctggcaaaa tgaagtgggt aacctttctc ctcctcctct 60

tcgtctccgg ctctgctttt tccaggggtg tgtttcgccg agaagcacgt aagagtttta 120

tgttttttca tctctgcttg tatttttcta gtaatggaag cctggtattt taaaatagtt 180

aaattttcct ttagtgctga tttctagatt attattactg ttgttgttgt tattattgtc 240

attatttgca tctgagaacc cttaggtggt tatattattg atatattttt ggtatctttg 300

atgacaataa tgggggattt tgaaagctta gctttaaatt tcttttaatt aaaaaaaaat 360

gctaggcaga atgactcaaa ttacgttgga tacagttgaa tttattacgg tctcataggg 420

cctgcctgct cgaccatgct atactaaaaa ttaaaagtgt gtgttactaa ttttataaat 480

ggagtttcca tttatattta cctttatttc ttatttagga tccctgacct ccaaatatga 540

ttagaaatct gaccttttat tactggaatt ctcttgacta aaagtaaaat tgaattttaa 600

ttcctaaatc tccatgtgta tacagtactg tgggaacatc acagattttg gctccatgcc 660

ctaaagagaa attggctttc agattatttg gattaaaaac aaagactttc ttaagagatg 720

taaaattttc atgatgtttt cttttttgct aaaactaaag aattattctt ttacatttca 780

gtgtttctgg accacgagaa cgccaacaag atcctgaacc ggcccaagcg gtacaacagc 840

ggcaagctgg aagagttcgt gcagggcaac ctggaacgcg agtgcatgga agagaagtgc 900

agcttcgaag aggccagaga ggtgttcgag aacaccgagc ggaccaccga gttctggaag 960

cagtacgtgg acggcgacca gtgcgagagc aacccctgtc tgaacggcgg cagctgcaag 1020

gacgacatca acagctacga gtgctggtgc cccttcggct tcgagggcaa gaactgcgag 1080

ctggacgtga cctgcaacat caagaacggc aggtgcgagc agttctgcaa gaacagcgcc 1140

gacaacaagg tcgtgtgctc ctgcaccgag ggctacagac tggccgagaa ccagaagtcc 1200

tgcgagcccg ccgtgccttt cccttgtgga agagtgtccg tgtcccagac cagcaagctg 1260

accagagccg agacagtgtt ccccgacgtg gactacgtga acagcaccga ggccgagaca 1320

atcctggaca acatcaccca gagcacccag tccttcaacg acttcaccag agtcgtgggc 1380

ggcgaggacg ccaagcctgg acagttcccc tggcaggtgg tgctgaacgg aaaggtggac 1440

gccttttgcg gcggcagcat cgtgaacgag aagtggatcg tgacagccgc ccactgcgtg 1500

gaaaccggcg tgaagattac agtggtggcc ggcgagcaca acatcgagga aaccgagcac 1560

acagagcaga aacggaacgt gatcagaatc atcccccacc acaactacaa cgccgccatc 1620

aacaagtaca accacgatat cgccctgctg gaactggacg agcccctggt gctgaatagc 1680

tacgtgaccc ccatctgtat cgccgacaaa gagtacacca acatctttct gaagttcggc 1740

agcggctacg tgtccggctg gggcagagtg tttcacaagg gcagatccgc tctggtgctg 1800

cagtacctga gagtgcctct ggtggaccgg gccacctgtc tgctgagcac caagttcacc 1860

atctacaaca acatgttctg cgccggcttt cacgagggcg gcagagatag ctgtcagggc 1920

gattctggcg gccctcacgt gacagaggtg gaaggcacca gctttctgac cggcatcatc 1980

agctggggcg aggagtgcgc catgaagggg aagtacggca tctacaccaa ggtgtccaga 2040

tacgtgaact ggatcaaaga aaagaccaag ctgacatgat aatctagagc ggccaaaccc 2100

gctgatcagc ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg 2160

tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa 2220

ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca 2280

gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg ggatgcggtg ggctctatgg 2340

cttctgaggc ggaaagaacc aggccatgca tggtcttagt agatatttac aaacatgaca 2400

gaaacactaa atcttgagtt tgaatgcaca gatataaaca cttaacgggt tttaaaaata 2460

ataatgttgg tgaaaaaata taactttgag tgtagcagag aggaaccatt gccaccttca 2520

gattttcctg taacgatcgg gaactggcat cttcagggag tagcttaggt cagtgaagag 2580

aagaacaaaa agcagcatat tacagttagt tgtcttcatc aatctttaaa tatgttgtgt 2640

ggtttttctc tccctgtttc cacagacaag agtgagatcg cccatcggta taatgatttg 2700

ggagaacaac atttcaaagg cctgtaagtt ataatgctga aagcccactt aatatttctg 2760

gtagtattag ttaaagtttt aaaacacctt tttccacctt gagtgtgaga attgtagagc 2820

agtgctgtcc agtagaaatg tgtgcattga cagaaagact gtggatctgt gctgagcaat 2880

gtggcagcca gagatcacaa ggctatcaag cactttgcac atggcaagtg taactgagaa 2940

gcacacattc aaataatagt taattttaat tgaatgtatc tagccatgtg tggctagtag 3000

ctcctttcct ggagagagaa tctggagccc acatctaact tgttaagt 3048

<210> 6

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 6

gcaucuucag ggaguagcuu 20

<210> 7

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 7

gcacagauau aaacacuuaa 20

<210> 8

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 8

ggaaaaucug aagguggcaa 20

<210> 9

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 9

guaaauaucu acuaagacaa 20

<210> 10

<211> 431

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Phe Leu Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile Leu Asn Arg Pro Lys Arg

1 5 10 15

Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg

20 25 30

Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe

35 40 45

Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly

50 55 60

Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp

65 70 75 80

Asp Ile Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys

85 90 95

Asn Cys Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu

100 105 110

Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr

115 120 125

Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val

130 135 140

Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr

145 150 155 160

Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu

165 170 175

Ala Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn

180 185 190

Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe

195 200 205

Pro Trp Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly

210 215 220

Ser Ile Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu

225 230 235 240

Thr Gly Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu

245 250 255

Thr Glu His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His

260 265 270

His Asn Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu

275 280 285

Leu Glu Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile

290 295 300

Cys Ile Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser

305 310 315 320

Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala

325 330 335

Leu Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys

340 345 350

Leu Leu Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly

355 360 365

Phe His Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro

370 375 380

His Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser

385 390 395 400

Trp Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys

405 410 415

Val Ser Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr

420 425 430

<210> 11

<211> 1298

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tgtttctgga ccacgagaac gccaacaaga tcctgaaccg gcccaagcgg tacaacagcg 60

gcaagctgga agagttcgtg cagggcaacc tggaacgcga gtgcatggaa gagaagtgca 120

gcttcgaaga ggccagagag gtgttcgaga acaccgagcg gaccaccgag ttctggaagc 180

agtacgtgga cggcgaccag tgcgagagca acccctgtct gaacggcggc agctgcaagg 240

acgacatcaa cagctacgag tgctggtgcc ccttcggctt cgagggcaag aactgcgagc 300

tggacgtgac ctgcaacatc aagaacggca ggtgcgagca gttctgcaag aacagcgccg 360

acaacaaggt cgtgtgctcc tgcaccgagg gctacagact ggccgagaac cagaagtcct 420

gcgagcccgc cgtgcctttc ccttgtggaa gagtgtccgt gtcccagacc agcaagctga 480

ccagagccga gacagtgttc cccgacgtgg actacgtgaa cagcaccgag gccgagacaa 540

tcctggacaa catcacccag agcacccagt ccttcaacga cttcaccaga gtcgtgggcg 600

gcgaggacgc caagcctgga cagttcccct ggcaggtggt gctgaacgga aaggtggacg 660

ccttttgcgg cggcagcatc gtgaacgaga agtggatcgt gacagccgcc cactgcgtgg 720

aaaccggcgt gaagattaca gtggtggccg gcgagcacaa catcgaggaa accgagcaca 780

cagagcagaa acggaacgtg atcagaatca tcccccacca caactacaac gccgccatca 840

acaagtacaa ccacgatatc gccctgctgg aactggacga gcccctggtg ctgaatagct 900

acgtgacccc catctgtatc gccgacaaag agtacaccaa catctttctg aagttcggca 960

gcggctacgt gtccggctgg ggcagagtgt ttcacaaggg cagatccgct ctggtgctgc 1020

agtacctgag agtgcctctg gtggaccggg ccacctgtct gctgagcacc aagttcacca 1080

tctacaacaa catgttctgc gccggctttc acgagggcgg cagagatagc tgtcagggcg 1140

attctggcgg ccctcacgtg acagaggtgg aaggcaccag ctttctgacc ggcatcatca 1200

gctggggcga ggagtgcgcc atgaagggga agtacggcat ctacaccaag gtgtccagat 1260

acgtgaactg gatcaaagaa aagaccaagc tgacatga 1298

<210> 12

<211> 517

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tcctatcaac cccactagcc tctggcaaaa tgaagtgggt aacctttctc ctcctcctct 60

tcgtctccgg ctctgctttt tccaggggtg tgtttcgccg agaagcacgt aagagtttta 120

tgttttttca tctctgcttg tatttttcta gtaatggaag cctggtattt taaaatagtt 180

aaattttcct ttagtgctga tttctagatt attattactg ttgttgttgt tattattgtc 240

attatttgca tctgagaacc cttaggtggt tatattattg atatattttt ggtatctttg 300

atgacaataa tgggggattt tgaaagctta gctttaaatt tcttttaatt aaaaaaaaat 360

gctaggcaga atgactcaaa ttacgttgga tacagttgaa tttattacgg tctcataggg 420

cctgcctgct cgaccatgct atactaaaaa ttaaaagtgt gtgttactaa ttttataaat 480

ggagtttcca tttatattta cctttatttc ttattta 517

<210> 13

<211> 685

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ccatgcatgg tcttagtaga tatttacaaa catgacagaa acactaaatc ttgagtttga 60

atgcacagat ataaacactt aacgggtttt aaaaataata atgttggtga aaaaatataa 120

ctttgagtgt agcagagagg aaccattgcc accttcagat tttcctgtaa cgatcgggaa 180

ctggcatctt cagggagtag cttaggtcag tgaagagaag aacaaaaagc agcatattac 240

agttagttgt cttcatcaat ctttaaatat gttgtgtggt ttttctctcc ctgtttccac 300

agacaagagt gagatcgccc atcggtataa tgatttggga gaacaacatt tcaaaggcct 360

gtaagttata atgctgaaag cccacttaat atttctggta gtattagtta aagttttaaa 420

acaccttttt ccaccttgag tgtgagaatt gtagagcagt gctgtccagt agaaatgtgt 480

gcattgacag aaagactgtg gatctgtgct gagcaatgtg gcagccagag atcacaaggc 540

tatcaagcac tttgcacatg gcaagtgtaa ctgagaagca cacattcaaa taatagttaa 600

ttttaattga atgtatctag ccatgtgtgg ctagtagctc ctttcctgga gagagaatct 660

ggagcccaca tctaacttgt taagt 685

<210> 14

<211> 102

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 14

guaaauaucu acuaagacaa guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102

Claims (10)

1.用于提高B型血友病患者的凝血活性的组合物，其特征在于，其包括：第一AAV载体和第二AAV载体；

所述第一AAV载体含有表达Cas9核酸酶的核酸酶编码序列；

所述第二AAV载体含有表达sgRNA的sgRNA核酸序列；

所述sgRNA的核心序列选自SEQ ID NO.6-9；

所述第二AAV载体上还含有同源重组模板DNA序列；

所述同源重组模板DNA序列具有编码功能性凝血因子IX的凝血因子编码序列，所述功能性凝血因子IX的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。

2.根据权利要求1所述的用于提高B型血友病患者的凝血活性的组合物，其特征在于，所述凝血因子编码序列如SEQ ID NO.11所示。

3.根据权利要求2所述的用于提高B型血友病患者的凝血活性的组合物，其特征在于，所述同源重组模板DNA序列具有位于所述凝血IX因子编码序列上游的5’端同源臂和位于所述凝血IX因子编码序列下游的3’端同源臂。

4.根据权利要求3所述的用于提高B型血友病患者的凝血活性的组合物，其特征在于，所述5’端同源臂的序列如SEQ ID NO.12所示。

5.根据权利要求3所述的用于提高B型血友病患者的凝血活性的组合物，其特征在于，所述3’端同源臂的序列如SEQ ID NO.13所示。

6.根据权利要求1-5任一项所述的用于提高B型血友病患者的凝血活性的组合物，其特征在于，所述第一AAV载体还含有用于驱动所述核酸酶编码序列在肝脏中特异表达的肝脏特异性启动子，所述肝脏特异性启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

7.根据权利要求1-5任一项所述的用于提高B型血友病患者的凝血活性的组合物，其特征在于，所述第一AAV载体含有转录终止信号序列，所述转录终止信号序列连接在所述核酸酶编码序列的下游，所述转录终止信号序列如SEQ ID NO.3所示。

8.根据权利要求1-5任一项所述的用于提高B型血友病患者的凝血活性的组合物，其特征在于，所述核酸酶编码序列如SEQ ID NO.2所示。

9.一种预防或治疗B型血友病的药物，其特征在于，其包括权利要求1-8任一项所述的组合物和药学上可接受的辅料。

10.一种用于CRISPR/Cas9基因编辑系统中的sgRNA，其特征在于，该sgRNA的核心序列选自SEQ ID NO.6-9。