CN117624349A - 鼠源ha标签抗体的人源化设计及表达验证 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗HA标签的人源化抗体及其表达验证，包括重链FR1、重链FR2、重链FR3、重链FR4或其变体的重链，以及轻链FR1、轻链FR2、轻链FR3、轻链FR4或其变体的轻链；所述重链FR1氨基酸序列包括SEQ ID NO:1或由其组成；所述重链FR2氨基酸序列包括SEQ ID NO:2或由其组成；所述重链FR3氨基酸序列包括SEQ ID NO:3或由其组成；所述重链FR4氨基酸序列包括SEQ ID NO:4或由其组成；所述轻链FR1氨基酸序列包括SEQ ID NO:5或由其组成；本发明人源化的过程通过基因重新组合和优化，使鼠源HA标签抗体的结构更接近人类抗体，拓展了抗HA标签的单克隆抗体的应用范围，不仅在融合蛋白质的表达检测、定位、免疫吸附及分离纯化中具有广阔的应用前景，还在分子诊断和药物研发等领域具有潜在的应用。
Description
技术领域
本发明属于抗体人源化技术领域，具体涉及鼠源HA标签抗体的人源化设计及表达验证。
背景技术
HA标签是来自流感病毒的血凝素(Hemagglutinin)多肽序列，通常由八个氨基酸组成(YPYDVPDY)。它已经成为生物学和生物技术领域中最常用的蛋白质标签之一。HA标签的主要优势在于其小尺寸和高度特异性，使其成为蛋白质定位、纯化和研究的理想工具。通过分子生物学手段将HA标签融合到目的蛋白的C端或N端后，再利用HA标签抗体特异识别C末端或N末端带有HA标签的融合蛋白，可用于检测和HA标记的蛋白的表达、分离和纯化而无需蛋白特异性抗体或探针。鼠源性的HA标签抗体是目前常用的抗体，尽管鼠源HA标签抗体在实验室研究中非常有用，但在蛋白表达和细胞生物学研究中仍然存在一些限制。
鼠源性抗体的可变区(Variable region，V区)的骨架区(Framework region，FR)会残留有免疫源性。为了减少这种免疫源性反应，人们常常会将鼠源抗体除3个互补决定区(CDR)以外的全部FR全部替换成人抗体的FR。将鼠源的HA标签抗体人源化拓展了抗HA标签的单克隆抗体的应用范围，不仅在融合蛋白质的表达检测、定位、免疫吸附及分离纯化中具有广阔的应用前景，还在分子诊断和药物研发等领域具有潜在的应用。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种抗HA标签的人源化抗体及其表达验证，其目的在于通过基因重新组合和优化，使抗体的结构更接近人类抗体，从而降低了免疫原性反应的风险。
为实现上述目的，本发明提供了一种抗HA标签的人源化抗体，包括重链FR1、重链FR2、重链FR3、重链FR4或其变体的重链，以及轻链FR1、轻链FR2、轻链FR3、轻链FR4或其变体的轻链；
所述重链FR1氨基酸序列包括SEQ ID NO:1E-V-Q-L-V-E-S-G-G-G-L-V-K-P-G-G-S-L-R-L-S-C-A-A-S；所述重链FR2氨基酸序列包括SEQ ID NO:2M-N-W-V-R-Q-A-P-G-K-G-L-E-W-V-S-S；所述重链FR3氨基酸序列包括SEQ ID NO:3S-Y-A-D-S-V-K-G-R-F-T-I-S-R-D-N-A-K-N-S-L-Y-L-Q-M-N-S-L-R-A-E-D-T-A-V-Y-Y-C；所述重链FR4氨基酸序列包括SEQID NO:4W-G-Q-G-T-L-V-T-V-S-S；
所述轻链FR1氨基酸序列包括SEQ ID NO:5D-I-V-M-T-Q-S-P-D-S-L-A-V-S-L-G-E-R-A-T-I-N-C-K-S-S；所述轻链FR2氨基酸序列包括SEQ ID NO:6L-A-W-Y-Q-Q-K-P-G-Q-P-P-K-L-L-I-Y；所述轻链FR3氨基酸序列包括SEQ ID NO:7T-R-E-S-G-V-P-D-R-F-S-G-S-G-S-G-T-D-F-T-L-T-I-S-S-V-Q-A-E-D-V-A-V-Y-Y-C；所述轻链FR4氨基酸序列包括SEQ IDNO:8F-G-Q-G-T-K-L-E-I-K；
优选地，所述抗HA标签的人源化抗体，其所述变体重链，其重链可变区包括SEQ IDNO:1,2,3,4所示的氨基酸序列、任意一个与SEQ ID NO:1,2,3,4所示的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:1，2，3，4所示的氨基酸序列相比具有一个或多个氨基酸突变。
优选地，所述抗HA标签的人源化抗体，其所述变体重链，其重链可变区包括如SEQID NO:1,2,3,4所示的氨基酸序列、任意一个与SEQ ID NO:1，2，3，4所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列、或者与SEQ ID NO:1，2，3，4所示的氨基酸序列具有十个以内氨基酸突变；所述氨基酸突变，为保守突变，包括置换，插入或缺失。
优选地，所述抗HA标签的人源化抗体，其所述变体轻链，其轻链可变区包括SEQ IDNO:5,6,7,8所示的氨基酸序列、任意一个与SEQ ID NO:5,6,7,8所示的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:5,6,7,8所示的氨基酸序列相比具有一个或多个氨基酸突变。
优选地，所述抗HA标签的人源化抗体，其所述变体轻链，其轻链可变区包括如SEQID NO:5,6,7,8所示的氨基酸序列、任意一个与SEQ ID NO:5,6,7,8所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列、或者与SEQ ID NO:5,6,7,8所示的氨基酸序列具有十个以内氨基酸突变；所述氨基酸突变，为保守突变，包括置换，插入或缺失。
优选地，所述抗HA标签的人源化抗体，其所述重链，其氨基酸序列如序列表中SEQID No.9所示；所述轻链，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.10所示。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明人源化的过程通过基因重新组合和优化，使抗体的结构更接近人类抗体，从而降低了免疫原性反应的风险，将鼠源HA标签抗体转化为人源化抗体，以降低免疫原性交叉反应问题；本发明人源HA标签抗体不仅具有更好的生物相容性，还可以更安全地用于分子诊断和药物研发等应用领域。
附图说明
图1为本发明的鼠源HA标签抗体VH与VL结构模拟图；
图2为本发明的鼠源HA标签抗体与人源HA标签抗体VH-VL区域结构比对图
图3为本发明的人源化HA标签抗体重链表达载体图谱；
图4为本发明的人源化HA标签抗体轻链表达载体图谱；
图5为本发明的人源化HA标签抗体重链和轻链氨基酸序列；
图6为本发明的聚丙烯酰胺凝胶电泳验证HA标签抗体的表达图；
图7为本发明的流式细胞术检验HA标签抗体的结合能力图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
抗体由恒定区(C区)和可变区(V区)两部分组成，V区的氨基酸组成和排列影响到抗体的特异性。其中VH和VL各有3个区域的氨基酸组成和排列顺序特别易变化，称为抗体分子的互补决定区(complementarity-determining region，CDR)。鼠源抗体的V区的骨架区(Framework region，FR)会残留有免疫源性。为了减少这种免疫源性反应，人们常常会将鼠源抗体除3个互补决定区(CDR)以外的全部FR全部替换成人抗体的FR。
因此，本发明根据鼠源HA标签抗体的原始氨基酸序列(鼠源抗体的原始序列来自文献Arimori T,Kitago Y,Umitsu M,et al.Fv-clasp:An Artificially Designed SmallAntibody Fragment with Improved Production Compatibility,Stability,andCrystallizability[J].Structure,2017,25(10):1611-1622.)，利用IMGT数据库确定抗体可变区(VH和VL)中互补决定区与骨架区范围。在Rosetta Online Server中模拟出抗体结构。在IMGT数据库中比对并选择出与鼠源FR序列同源性最高的人Germline抗体序列作为人源化骨架。基于模拟出的抗体结构，在PyMOL软件中突变鼠源FR序列为人源FR，利用Swiss-PDBViewer软件计算人源化抗体各位置氨基酸能量，对高能量位点的氨基酸进行突变降低能量，得到最终序列。
本发明提供了一种抗HA标签的人源化抗体，包括重链FR1、重链FR2、重链FR3、重链FR4或其变体的重链，以及轻链FR1、轻链FR2、轻链FR3、轻链FR4或其变体的轻链；
所述重链FR1氨基酸序列包括SEQ ID NO:1E-V-Q-L-V-E-S-G-G-G-L-V-K-P-G-G-S-L-R-L-S-C-A-A-S；所述重链FR2氨基酸序列包括SEQ ID NO:2M-N-W-V-R-Q-A-P-G-K-G-L-E-W-V-S-S；所述重链FR3氨基酸序列包括SEQ ID NO:3S-Y-A-D-S-V-K-G-R-F-T-I-S-R-D-N-A-K-N-S-L-Y-L-Q-M-N-S-L-R-A-E-D-T-A-V-Y-Y-C；所述重链FR4氨基酸序列包括SEQID NO:4W-G-Q-G-T-L-V-T-V-S-S；
所述轻链FR1氨基酸序列包括SEQ ID NO:5D-I-V-M-T-Q-S-P-D-S-L-A-V-S-L-G-E-R-A-T-I-N-C-K-S-S；所述轻链FR2氨基酸序列包括SEQ ID NO:6L-A-W-Y-Q-Q-K-P-G-Q-P-P-K-L-L-I-Y；所述轻链FR3氨基酸序列包括SEQ ID NO:7T-R-E-S-G-V-P-D-R-F-S-G-S-G-S-G-T-D-F-T-L-T-I-S-S-V-Q-A-E-D-V-A-V-Y-Y-C；所述轻链FR4氨基酸序列包括SEQ IDNO:8F-G-Q-G-T-K-L-E-I-K；
优选地，所述抗HA标签的人源化抗体，其所述变体重链，其重链可变区包括SEQ IDNO:1,2,3,4所示的氨基酸序列、任意一个与SEQ ID NO:1,2,3,4所示的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:1，2，3，4所示的氨基酸序列相比具有一个或多个氨基酸突变。
优选地，所述抗HA标签的人源化抗体，其所述变体重链，其重链可变区包括如SEQID NO:1,2,3,4所示的氨基酸序列、任意一个与SEQ ID NO:1，2，3，4所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列、或者与SEQ ID NO:1，2，3，4所示的氨基酸序列具有十个以内氨基酸突变；所述氨基酸突变，为保守突变，包括置换，插入或缺失。
优选地，所述抗HA标签的人源化抗体，其所述变体轻链，其轻链可变区包括SEQ IDNO:5,6,7,8所示的氨基酸序列、任意一个与SEQ ID NO:5,6,7,8所示的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:5,6,7,8所示的氨基酸序列相比具有一个或多个氨基酸突变。
优选地，所述抗HA标签的人源化抗体，其所述变体轻链，其轻链可变区包括如SEQID NO:5,6,7,8所示的氨基酸序列、任意一个与SEQ ID NO:5,6,7,8所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列、或者与SEQ ID NO:5,6,7,8所示的氨基酸序列具有十个以内氨基酸突变；所述氨基酸突变，为保守突变，包括置换，插入或缺失。
优选地，所述抗HA标签的人源化抗体，其所述重链，其氨基酸序列如序列表中SEQID No.9所示；所述轻链，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.10所示。
实施例1标签抗体表达质粒的构建
(1)重链表达载体质粒的构建
重链载体构建包括将编码人源HA标签抗体VH区段的DNA连接到编码人抗体CH1-Fc段的DNA上，其DNA序列如序列表中SEQ ID No.11所示。再将连接片段插入到表达载体NAC-HSP，其DNA序列如序列表中SEQ ID No.12所示。其中，该哺乳动物细胞表达载体包含CMV启动子，可以在哺乳动物细胞中启动下游基因表达。
在第一步中得到的人源化HA标签抗体VH氨基酸序列经密码子优化工具优化后得到DNA序列并合成；编码人抗体CH1-Fc段的DNA根据蛋白质数据库UniProt(P01857·IGHG1_HUMAN)经密码子优化工具优化后得到DNA序列并合成。
用BsaI限制性内切酶(NEB,Cat#R3733L)处理表达载体NAC-HSP使其线性化。用重叠延伸聚合酶链式反应将两个片段连接在一起。所用引物如下表所示。
按照下述比例将各成分加入1.5mL Ep管中：
将上述成分混匀后在冰上静置5分钟。加入1μl Exonuclease III(Takara,Cat#2170A)，用移液枪轻吹混匀后在冰上静置60分钟。加入1μl 0.5M EDTA(Invitrogen，Cat#11568896)，混匀后65℃加热5分钟，在冰上静置5分钟。离心后将混合物全部加入到100μlDH5α中，在冰上孵育20分钟，42℃热激45秒，在冰上孵育2分钟，加入无抗LB培养基预摇60分钟后，涂布到带有氨苄抗生素的平板。16小时后挑取单克隆扩增培养，测序正确后提取质粒。
(2)轻链表达载体质粒的构建
轻链载体构建包括将编码人源HA标签抗体VL区段的DNA连接到编码人抗体CL段的DNA上，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.13所示。再将连接片段插入到表达载体NAC-LSP，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.14所示。其中，该哺乳动物细胞表达载体包含CMV启动子，可以在哺乳动物细胞中启动下游基因表达。
在第一步中得到的人源化HA标签抗体VL氨基酸序列经密码子优化工具优化后得到DNA序列并合成；编码人抗体CL段的DNA根据蛋白质数据库UniProt(P01834·IGKC_HUMAN)经密码子优化工具优化后得到DNA序列并合成。
用BsaI限制性内切酶(NEB,Cat#R3733L)处理表达载体NAC-LSP使其线性化。用重叠延伸聚合酶链式反应将两个片段连接在一起。所用引物如下表所示：
按照下述比例将各成分加入1.5mL Ep管中：
将上述成分混匀后在冰上静置5分钟。加入1μl Exonuclease III(Takara,Cat#2170A)，用移液枪轻吹混匀后在冰上静置60分钟。加入1μl 0.5M EDTA(Invitrogen，Cat#11568896)，混匀后65℃加热5分钟，在冰上静置5分钟。离心后将混合物全部加入到100μlDH5α中，在冰上孵育20分钟，42℃热激45秒，在冰上孵育2分钟，加入无抗LB培养基预摇60分钟后，涂布到带有氨苄抗生素的平板。16小时后挑取单克隆扩增培养，测序正确后提取质粒。
实施例2标签抗体的表达
(1)第-2天：Expi-293F细胞在Union293细胞培养基中悬浮培养(额外添加1％GlutaMax)培养，含5％CO2的37℃培养箱，转速设置为180rpm。确保刚复苏的细胞已培养三代或更多代且活力≥90％。培养并扩增Epi293F细胞，直到转染前一天(第-1天)细胞密度应达到大约3-5×106/mL。
(2)第-1天：按照最终密度2.5-3×106/mL接种细胞，让细胞过夜生长。
(3)第0天：测定活细胞密度和活率。活细胞密度和活率应分别达到4.5-5.5×106/mL和≥95％，才可进行转染。用提前预热的Union293细胞培养基(添加1％GlutaMax)将细胞稀释至3×106活细胞/mL，轻晃培养瓶以混匀细胞。在无菌的15mL离心管中配制用于转染的混合液(以30mL表达体系为例)：
Opti-MEM减血清培养基 3mL
总表达质粒(轻链：重链＝2.5：1) 24μg
polyethylenimine(PEI)转染试剂 96μg
用移液枪将混合物轻柔地吹匀，在室温静置10分钟。在一次性无菌通气摇瓶中加入27mL浓度为3×106/mL的Expi-293F细胞，后将混合物逐滴添加到培养皿的细胞中，轻轻摇晃混匀，将细胞放置在含5％CO2的37℃培养箱中培养24小时。
(4)第1天：在细胞中加入300μL 300mM丙戊酸(VPA，Sigma cat#P4543；用水配制，0.22μM过滤器过滤)和270μL 45％葡萄糖(Sigma cat#G8769)，轻轻摇晃混匀，将细胞放置在含5％CO2的37℃培养箱中培养。
(5)第5天：收蛋白。将细胞转移到50mL离心管中，在4℃以4000rpm离心10分钟，将上清转移到新的50mL离心管。
(6)将Protein G纯化介质(Genscript cat#L00664)混匀后取400μL，加1mL 1×PBS，在4℃以600g离心3分钟，弃上清。重复清洗的操作三遍以去除存储液中的乙醇。将清洗后的Protein G纯化介质加入步骤(5)得到的上清中，在4℃旋转孵育2-4小时。
(7)准备用于纯化的重力柱，将大小合适的亲水性筛板垫入3mL亲和层析柱空柱管中，并用平衡/洗杂液(25mM Tris,150mM NaCl；pH7.2)提前润湿筛板。将孵育过后的上清液转移到柱管中，利用重力使未结合的蛋白与杂质随培养基上清流出，结合有目的蛋白的Protein G纯化介质在筛板的作用下堆积在柱管中。向柱管中缓慢加入10倍柱体积的平衡/洗杂液清洗Protein G纯化介质。缓慢加入1mL洗脱液(0.1M glycine,pH 2-3)，在流出口收集洗脱液(提前加入1/10体积的中和液(1M Tris，pH 7.5-9))，测量蛋白浓度，可重复洗脱步骤直至流出液的蛋白浓度无法检测到为止。
(8)用50KD的超滤管将蛋白溶剂从洗脱液替换为1×PBS，并浓缩至0.5mg/mL，用0.22μM过滤器过滤，分装后放4℃冰箱短期保存，或-20℃以延长保存时间。
实施例3标签抗体的验证
(1)SDS-PAGE
吸取3μg抗体，加入2xSDS上样缓冲液，98℃加热20分钟。根据抗体蛋白的分子量大小，选用10％浓度的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳(PAGE)，浓缩电压80伏，当marker分开后电压可升到120伏，根据不同蛋白大小需求，跑胶时间不定，一般情况下，溴酚蓝到胶的底部即可。取下PAGE胶，用超纯水洗胶10分钟后，加入考马斯亮蓝染色液染色。
试剂配置：
将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95％乙醇，加入100ml85％的磷酸，然后，用蒸馏水补充至1000ml。
(2)流式分析
收集表达HA标签的Ramos细胞(该细胞系为实验室先前构建用于其他实验的稳定细胞系，HA标签所在的氨基酸序列如附录所示)。300xg离心弃去上清。将鼠源或人源化的HA标签抗体按照浓度梯度稀释在FACS溶液中(1xPBS+2％FBS)。用100μL的稀释液重悬细胞，4℃静置20分钟染色。用2mL FACS溶液稀释染色抗体，300xg离心弃去上清。将带有AF488荧光的抗人源或鼠源Fc的荧光二抗稀释在FACS溶液中，用100μL的稀释液重悬细胞，4℃静置20分钟染色，用2mL FACS溶液稀释染色抗体，300xg离心弃去上清。用300μL的FACS溶液重悬细胞，上机检测。
根据图6可以看出，将鼠源抗体的框架区替换为人源的序列之后，并不会影响抗体的表达。根据图7可以看出，在Ramos B细胞中表达HA标签，使其表达在细胞表面，用不同浓度的鼠源或者人源化HA标签抗体进行孵育，并用带AF488荧光的抗鼠源Fc或者人源Fc指示抗体的结合。人源化的HA标签抗体保留结合HA标签的能力。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上所述，仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其它修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (6)
1.一种抗HA标签的人源化抗体，包括重链FR1、重链FR2、重链FR3、重链FR4或其变体的重链，以及轻链FR1、轻链FR2、轻链FR3、轻链FR4或其变体的轻链；
所述重链FR1氨基酸序列包括SEQ ID NO:1 E-V-Q-L-V-E-S-G-G-G-L-V-K-P-G-G-S-L-R-L-S-C-A-A-S；所述重链FR2氨基酸序列包括SEQ ID NO:2 M-N-W-V-R-Q-A-P-G-K-G-L-E-W-V-S-S；所述重链FR3氨基酸序列包括SEQ ID NO:3 S-Y-A-D-S-V-K-G-R-F-T-I-S-R-D-N-A-K-N-S-L-Y-L-Q-M-N-S-L-R-A-E-D-T-A-V-Y-Y-C；所述重链FR4氨基酸序列包括SEQ IDNO:4 W-G-Q-G-T-L-V-T-V-S-S；
所述轻链FR1氨基酸序列包括SEQ ID NO:5 D-I-V-M-T-Q-S-P-D-S-L-A-V-S-L-G-E-R-A-T-I-N-C-K-S-S；所述轻链FR2氨基酸序列包括SEQ ID NO:6 L-A-W-Y-Q-Q-K-P-G-Q-P-P-K-L-L-I-Y；所述轻链FR3氨基酸序列包括SEQ ID NO:7 T-R-E-S-G-V-P-D-R-F-S-G-S-G-S-G-T-D-F-T-L-T-I-S-S-V-Q-A-E-D-V-A-V-Y-Y-C；所述轻链FR4氨基酸序列包括SEQ ID NO:8 F-G-Q-G-T-K-L-E-I-K。
2.如权利要求1所述的抗HA标签的人源化抗体，其特征在于，所述变体重链，其重链可变区包括任意一个与SEQ ID NO:1,2,3,4所示的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:1，2，3，4所示的氨基酸序列相比具有一个或多个氨基酸突变。
3.如权利要求1或2至所述的抗HA标签的人源化抗体，包括如SEQ ID NO:1,2,3,4所示的氨基酸序列、与SEQ ID NO:1，2，3，4所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列、或者与SEQ ID NO:1，2，3，4所示的氨基酸序列具有十个以内氨基酸突变；所述氨基酸突变，为保守突变，包括置换，插入或缺失。
4.如权利要求1至3所述的抗HA标签的人源化抗体，其特征在于，所述变体的轻链，其轻链可变区包括任意一个与SEQ ID NO:5,6,7,8所示的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:5,6,7,8所示的氨基酸序列相比具有一个或多个氨基酸突变。
5.如权利要求4至所述的抗HA标签的人源化抗体，包括如SEQ ID NO:5,6,7,8所示的氨基酸序列、与SEQ ID NO:5,6,7,8所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的序列、或者与SEQ ID NO:5,6,7,8所示的氨基酸序列具有十个以内氨基酸突变；所述氨基酸突变，为保守突变，包括置换，插入或缺失。
6.一种含有编码如权利要求1所述抗HA标签的人源化抗体或其片段的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列，其重链的核酸序列，包括SEQ ID NO:9，轻链的核酸序列，包括SEQID NO:10，或者其保守置换的变体和互补序列。
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