RU2693553C1 - Генетическая конструкция pA21/Fab, для получения одноцепочечного антитела, слитого с константным фрагментом иммуноглобулина человека, стереоселективно взаимодействующего с фосфорорганическими соединениями. - Google Patents
Генетическая конструкция pA21/Fab, для получения одноцепочечного антитела, слитого с константным фрагментом иммуноглобулина человека, стереоселективно взаимодействующего с фосфорорганическими соединениями. Download PDFInfo
- Publication number
- RU2693553C1 RU2693553C1 RU2017146638A RU2017146638A RU2693553C1 RU 2693553 C1 RU2693553 C1 RU 2693553C1 RU 2017146638 A RU2017146638 A RU 2017146638A RU 2017146638 A RU2017146638 A RU 2017146638A RU 2693553 C1 RU2693553 C1 RU 2693553C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- fab
- stereoselectively
- genetic construct
- organophosphorus compounds
- antibody
- Prior art date
Links
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 title claims abstract description 12
- 150000002903 organophosphorus compounds Chemical class 0.000 title claims abstract description 9
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 title 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 title 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 3
- 241000598436 Human T-cell lymphotropic virus Species 0.000 claims description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 claims 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 claims 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 6
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 208000005374 Poisoning Diseases 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N cocaine Chemical compound O([C@H]1C[C@@H]2CC[C@@H](N2C)[C@H]1C(=O)OC)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- WYMSBXTXOHUIGT-UHFFFAOYSA-N paraoxon Chemical compound CCOP(=O)(OCC)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WYMSBXTXOHUIGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004623 paraoxon Drugs 0.000 description 2
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 2
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001007681 Candida albicans (strain WO-1) Kexin Proteins 0.000 description 1
- 206010008428 Chemical poisoning Diseases 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010015078 Pregnancy-Associated alpha 2-Macroglobulins Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000012574 advanced DMEM Substances 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000729 antidote Substances 0.000 description 1
- 229940075522 antidotes Drugs 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 229960003920 cocaine Drugs 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000000324 molecular mechanic Methods 0.000 description 1
- 230000003533 narcotic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- -1 p-nitrophenyl-8-methyl-8-azabicyclo [3.2.1] octane-phenylphosphonate Chemical compound 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 1
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M phosphonate Chemical compound [O-]P(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000005610 quantum mechanics Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000000707 stereoselective effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической конструкции pA21/Fab. Изобретение решает задачу получения рекомбинантного одноцепочечного антитела человека, стереоселктивно взаимодействующего с фосфорорганическими соединениями. 3 ил., 3 пр.
Description
Изобретение относится к биотехнологии, а именно: к технологии получения рекомбинантных антител человека (рчАт) и может быть использовано в медицине в терапии отравлений фосфорорганическими токсинами, для терапии отравлений наркотическими веществами типа кокаин.
В настоящее время антитела имеют широкое применение в медицине и биотехнологии благодаря их способности специфически узнавать и связывать антигены. Возможность искусственно создавать антитела к самым различным соединениям, не имеющим природного аналога, является одной из причин, по которой данная область науки приковывает к себе большое внимание. Однако только на связывании функции антител не ограничиваются. В конце двадцатого столетия была обнаружена способность антител к биокатализу, позволяющая им не только связывать, но и разрушать антиген. На сегодняшний день получено значительное число каталитических антител (абзимов), катализирующих разнообразные химические реакции, для которых не известно природных ферментов. В связи с этим, использование каталитических антител для нейтрализации синтетических ядов открывает широкие перспективы в борьбе с химическими отравлениями, в частности с фосфорорганическими токсинами.
Ранее в результате скрининга полусинтетической библиотеки вариабельных фрагментов генов иммуноглобулинов человека с использованием п-нитрофенил-8-метил-8-азабицикло[3.2.1]октанфенилфосфоната (фосфонат X) была отобрана панель рекомбинантных одноцепочечных антител, способных к ковалентному взаимодействию с фосфорорганическими соединениями. Наибольшей активностью из отобранных антител обладали А5 и А17, для которых было установлено, что ковалентной модификации подвергаются остатки L-Tyr33 и L-Tyr37 соответственно. Отличие в положении ключевого аминокислотного остатка в реакционном центре свидетельствует о возможной реализации разных механизмов взаимодействия абзимов с субстратом. Для антитела А17 было показано, что оно способно гидролизовать пестицид параоксон, взаимодействие с фосфорорганическими субстратами осуществляется по механизму индуцированного соответствия, а изотип константного домена легкой цепи (каппа/лямбда) оказывает влияние на структурную организацию. На основе накопленного широкого спектра структурных и функциональных данных антитело А17 было использовано в качестве модели длянаправленного улучшения его каталитических свойств: методом квантовой механики и молекулярной механики (КМ/ММ) успешно предсказаны и экспериментально охарактеризованы мутанты с улучшенной специфичностью к параоксону.
Большинство фосфорорганических соединений, обладающих токсическим действием, являются хиральными молекулами. Таким образом, создание биологических антидотов стереспецифично взаимодействующих с такими ФОТ целесообразно.
Данное изобретение описывает генетическую конструкцию, предназначенную для получения одноцепочечного антитела слитного с константным доменом антитела человека.
Известен способ получения одноцепочечных антител в клетках линии P. pastoris в составе слитного белка с константным доменом иммуноглобулина мыши (Wang DD, Su MM, Sun Y, Huang SL, Wang J, Yan WQ. Protein Expr Purif. 2012 Nov; 86(l):75-81). В данной работе использовалась одноцистронная система векторов. Авторам удалось получить выход продукта 60 мг/л при использовании 80 литрового ферментера. Недостатком этой системы является получение антитела в виде одноцепочечного фрагмента, так как существуют данные о различии в уровнях специфической активности между Fab-фрагментами и одноцепочечными антителами в пользу первых (Захаров А.В., Смирнов И.В., Серебрякова М.В. и др. // Молекуляр. биология. 2011. Т. 45, №1, С. 86-95).
Известна система получения Fab-фрагмента антитела в составе моноцистронного вектора содержащего сайт гидролиза протеазой KEX2 (Burtet RT1, Santos-Silva MA, Buss GA, Moraes LM, Maranhao AQ, Brigido MM. J Biochem. 2007 Dec; 142(6):665-9). В результате авторам удалось получить функционально активный Fab-фрагмент, однако уровень экспрессии не превышал 10 мг/л культуральной среды.
Описана система получения Fab-фрагмента антитела, состоящая из двух моноцистронных векторов, кодирующих легкие и тяжелые цепи антител, соответственно (Захаров А.В., Смирнов И.В., Серебрякова М.В. и др. // Молекуляр. биология. 2011. Т. 45, №1, С. 86-95). Система позволяла получать до 15 мг/л активного Fab-фрагмента, однако впоследствии была обнаружена невысокая стабильность получаемых препаратов белка, предположительно по причине совыделения и расщепления Fab-фрагментов протеиназами хозяйской клетки.
Для всех представленных антител не описана их стереоспецифичность действия.
Таким образом, не описаны аналоги предлагаемой системы для экспрессии одноцепочечного антитела, стереоспецифично взаимодействующего с фосфорорганическими соединениями.
Изобретение решает задачу получения рекомбинантного одноцепочечного антитела человека, стереоселективно взаимодействующего с фосфорорганическими соединениями.
Поставленная задача решается за счет создания генетической конструкции pA21/Fab, кодирующей ген рекомбинантного антитела, и состоящей из плазмиды pFUSE, которая содержит:
высокоэффективный синтетический промотор hEF/HTLV,
нуклеотидную последовательность гена вариабельных доменов легкой и тяжелой цепи антитела
нуклеотидную последовательность, кодирующую линкер (Ser-Gly3)3,
нуклеотидную последовательность гена константного фрагмента иммуноглобулина человека Fc, содержащую в своем составе СН2 и CH3 константные домены тяжелой цепи IgG1 (Fc2-3) и находящуюся в единой рамке считывания с геном вариабельных доменов антитела.
Техническим результатом использования генетической конструкции pA21/Fab является получение одноцепочечного антитела, слитого с константным фрагментом антитела человека и стереоселективно взаимодействующего с фосфорорганическими соединениями.
Изобретение иллюстрируют следующими графическими материалами:
Рис. 1. Схема генетической конструкции pA21/Fab.
Рис. 2. Электрофоретический анализ экспрессии рекомбинантного антитела, полученного после трансфекции клеток линии НЕК-293.
Рис. 3. Анализ стереопецифичности взаимодействия рекомбинантного антитела.
Изобретение иллюстрируют следующими примерами.
ПРИМЕР 1
Создание генетической конструкции pA21/Fab.
Последовательность гена рекомбинантного антитела получают из генетической конструкции scFv_pHEN2 Reshetnyak et al., JACS 2007 с использованием ПЦР с перекрывающихся праймеров и набора олигонуклеотидов atctcgaggatagcaaagtcacaatcatatgcat, gtcccctatgggcacaccatccacggt, cacaccatccacggtaactttggtccgac, aagcggccgctcagagacccacacaactttctttct и последующим клонированием в вектор pFUSE с использованием эндонуклеаз рестрикции NotI и XhoI, с получением генетической конструкции pA21/Fab (Рис. 1).
ПРИМЕР 2
Трансфекция и аналитическая экспрессия генетической конструкции pA21/Fab.
Полученную генетическую конструкцию pA21/Fab линеаризуют и используют для серии трансфекций клеток линии НЕК-293. Селекцию проводят с использованием антибиотика зеоцина в концентрации 100 мкг/мл. Для отбора клонов штамма-продуцента клетки выращивают в среде Advanced DMEM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки. При достижении конфлюентности более 90%, проводят замену среды на безбелковую среду ProCHO-4, ProCHO-5 или аналогичные. Через 72 часа среду центрифугируют и анализируют электрофоретически (Рис. 2).
Было установлено, что уровень экспрессии рекомбинантного антитела человека, стереоселективно взаимодействующего с фосфорорганическими соединениями, составил около 20 мкг/мл.
ПРИМЕР 3
Анализ стереопецифичности взаимодействия рекомбинантного антитела.
Среду после экспрессии инкубируют с 10 мМ раствором субстрата: (R)-изомера или (S)-изомера арил-фосфоната, конъюгированного с биотином.
Электрофоретическое разделение белков в ПААГ в денатурирующих условиях проводят по стандартной методике. Пробы, контрольный образец и образец рекомбинантного антитела, наносят в буфере: 4% ДСН, 0.25 М Трис-HCl рН6.8, 4 мМ ЭДТА-Na рН 8.0, 10% глицерина, 0.25 мг/мл бромфенолового синего. Электрофорез в концентрирующем геле проводят при силе тока 8-10 мА на 1 пластину геля, а вразделяющем геле при 15-20 мА. По окончании электрофоретического разделения белков в денатурирующем ПААГ пластину с гелем используют для переноса на нитроцеллюлозную бумагу. Перенос проводят в течение 40 минут. После чего мембрану последовательно инкубируют в растворе фосфатно-солевого буфера, содержащего 5% бычьего сывороточного альбумина и стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой хрена. Визуализацию результатов иммуноблоттинга осуществляют с использованием прибора Bio-Rad Imager. Результаты, подтверждающие стереоселективность взаимодействия рекомбинантного антитела с арил-фосфонатом, представлены на рисунке 3.Приложение 1
Нуклеотидная последовательность рекомбинантной плазмидная ДНК pA21/Fab.
Claims (1)
- Генетическая конструкция pA21/Fab для получения одноцепочечного антитела, слитого с константным фрагментом антитела человека и стереоселективно взаимодействующего с фосфорорганическими соединениями, состоящая из плазмиды pFUSE, которая содержит высокоэффективный синтетический промотор hEF/HTLV, нуклеотидную последовательность гена вариабельных доменов легкой и тяжелой цепи антитела, соединенных нуклеотидной последовательностью, кодирующей линкер (Ser-Gly3)3, нуклеотидную последовательность гена константного фрагмента иммуноглобулина человека Fc (СН2 и CH3 константные домены тяжелой цепи IgG1), где Fc-фрагмент находится в единой рамке считывания с генами вариабельных доменов антитела.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017146638A RU2693553C1 (ru) | 2017-12-28 | 2017-12-28 | Генетическая конструкция pA21/Fab, для получения одноцепочечного антитела, слитого с константным фрагментом иммуноглобулина человека, стереоселективно взаимодействующего с фосфорорганическими соединениями. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017146638A RU2693553C1 (ru) | 2017-12-28 | 2017-12-28 | Генетическая конструкция pA21/Fab, для получения одноцепочечного антитела, слитого с константным фрагментом иммуноглобулина человека, стереоселективно взаимодействующего с фосфорорганическими соединениями. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2693553C1 true RU2693553C1 (ru) | 2019-07-04 |
Family
ID=67252087
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017146638A RU2693553C1 (ru) | 2017-12-28 | 2017-12-28 | Генетическая конструкция pA21/Fab, для получения одноцепочечного антитела, слитого с константным фрагментом иммуноглобулина человека, стереоселективно взаимодействующего с фосфорорганическими соединениями. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2693553C1 (ru) |
-
2017
- 2017-12-28 RU RU2017146638A patent/RU2693553C1/ru active
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| BURTET R.T. et al. Production of a recombinant Fab in Pichia pastoris from a Monocistronic expression vector, J Biochem., 2007, Vol.142, N6. * |
| BURTET R.T. et al. Production of a recombinant Fab in Pichia pastoris from a Monocistronic expression vector, J Biochem., 2007, Vol.142, N6. ЗАХАРОВ А.В. и др. Экспрессия каталитических антител в эукариотических системах, Молекулярная биология, 2011, т.45, н.1. WANG D.D. et al. Expression, purification and characterization of a human single-chain Fv antibody fragment fused with the Fc of an IgG1 targeting a rabies antigen in Pichia pastoris, Protein Expr Purif, 2012, Vol. 86, N1. DHARSHANAN S. et al. Stable expression of H1C2 monoclonal antibody in NS0 and CHO cells using pFUSE and UCOE expression system, Cytotechnology, 2014, Vol.66, N4. TEREKHOVA S. et al. A novel expression cassette delivers efficient production of exclusively tetrameric human butyrylcholinesterase with improved pharmacokinetics for protection against organophosphate poisoning, Biochimie, 2015, Vol.118. * |
| DHARSHANAN S. et al. Stable expression of H1C2 monoclonal antibody in NS0 and CHO cells using pFUSE and UCOE expression system, Cytotechnology, 2014, Vol.66, N4. * |
| TEREKHOVA S. et al. A novel expression cassette delivers efficient production of exclusively tetrameric human butyrylcholinesterase with improved pharmacokinetics for protection against organophosphate poisoning, Biochimie, 2015, Vol.118. * |
| WANG D.D. et al. Expression, purification and characterization of a human single-chain Fv antibody fragment fused with the Fc of an IgG1 targeting a rabies antigen in Pichia pastoris, Protein Expr Purif, 2012, Vol. 86, N1. * |
| ЗАХАРОВ А.В. и др. Экспрессия каталитических антител в эукариотических системах, Молекулярная биология, 2011, т.45, н.1. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10954498B2 (en) | Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof | |
| US8187884B2 (en) | Method of enhancing homologous recombination of somatic cells and method of constructing specific antibody | |
| JP7027334B2 (ja) | アルファ溶血素バリアントおよびその使用 | |
| EP0349578B1 (en) | Organism carrying a Single Chain Antibody Domain at its surface. | |
| US8883692B2 (en) | Method for cell surface displaying of target proteins using Bacillus anthracis exosporium | |
| CA3044101A1 (en) | Crispr/cpf1 systems and methods | |
| CN104804093A (zh) | 一种针对cd47的单域抗体 | |
| JP2015213511A (ja) | 免疫グロブリン溶液を精製するための方法 | |
| JP6178846B2 (ja) | 組み換え抗体組成物およびその使用方法 | |
| EP2957633A1 (en) | Method for refolding antibody, process for producing refolded antibody, refolded antibody, and uses thereof | |
| WO2013074371A2 (en) | Hybrid organic-inorganic system for producing biofuels | |
| JP2021514634A (ja) | アルファ溶血素バリアントおよびその使用 | |
| CN104066745A (zh) | 溶菌酶作为标签的用途 | |
| RU2693553C1 (ru) | Генетическая конструкция pA21/Fab, для получения одноцепочечного антитела, слитого с константным фрагментом иммуноглобулина человека, стереоселективно взаимодействующего с фосфорорганическими соединениями. | |
| US8158387B2 (en) | Method for cell surface display of target proteins using FadL of E. coli | |
| JP4448138B2 (ja) | 大腸菌シグナル配列を用いて抗体断片を分泌する発現ベクター及び抗体断片の大量生産方法 | |
| CN109593133B (zh) | 一种抗人神经生长因子抗体的电荷异构体分离方法 | |
| CN113832127A (zh) | 一种限制性内切酶BamHⅠ的突变体及其应用 | |
| Banerjee et al. | Expression of functional scorpion neurotoxin Lqq-V in E. coli | |
| EP1147419A2 (de) | Nachweis von zellen mittels spezifischer zellwand-bindender domänen (cbd) von zellwand-bindenden proteinen | |
| Pan et al. | Rapid process for purification of an extracellular β-xylosidase by aqueous two-phase extraction | |
| Lee et al. | Engineering IgG1 Fc Domains That Activate the Complement System | |
| JPS62262994A (ja) | Ｄ−アミノ酸オキシダ−ゼ遺伝子 | |
| US20230313121A1 (en) | Modified filamentous fungi for production of exogenous proteins | |
| CN117624349A (zh) | 鼠源ha标签抗体的人源化设计及表达验证 |