CN104066745A - 溶菌酶作为标签的用途 - Google Patents
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Abstract
本公开提供表达和纯化多肽和蛋白的方法。在本公开中,公开了溶菌酶作为融合伴侣的用途。此外,描述了经由溶菌酶特异性的抗体来分离溶菌酶标记的多肽和蛋白的纯化方法。更具体地,本公开提供通过使用溶菌酶作为标签来表达和纯化单体多肽和蛋白的方法。
Description
背景技术
重组多肽和蛋白的表达和纯化是生物技术研究内的常规工序。通常,纯化工序包括期望的多肽在原核细胞或真核细胞内的表达,之后是与宿主细胞的其他非蛋白类(non-proteinacious)颗粒和蛋白类颗粒的分离。由此使用多种类型的层析法例如通过大小、电荷或疏水性来纯化期望的分子。
一个进一步的具体策略是使用与目标多肽融合的标签。特定的标签可用于支持目标多肽的折叠、可溶性、稳定性和表达,而其他标签主要用于纯化。因此,期望的多肽在原核细胞或真核细胞中作为融合构建体被表达,且可以通过经由特异性抗原结合部分检测的融合标签来进行纯化。这种类型的纯化策略被称为亲和层析。
例如,用于科学界的一个纯化标签是His标签。因此,可以通过使用例如具有固定化的对His标签具有强亲和性的镍或钴离子的纯化柱来分离与His标签融合的多肽。然后,在包括咪唑的洗脱工序中从柱子中释放蛋白,其中咪唑与His标签竞争与镍或钴的结合。进一步的实例是Flag标签和Strep标签,它们都融合到目标多肽上并分别对于各自的标签特异性的抗原结合部分例如抗体或Streptactin充当抗原。例如,用于纯化(例如,分别经由Flag标签、Strep标签或His标签)的这些结合部分(例如,抗体、streptactin或金属离子)可以例如固定在固体基质上(例如,膜、珠)上。与用于特定标签的特异性结合部分连接的那些固体基质可以用于容易地从作为裂解物或条件培养基的复杂样品中捕获带标签的多肽。然而,作为短肽,Flag标签、Strep标签和His标签有时不易进入特定的多肽或蛋白的3维结构内,因而不适合用于纯化。另外,经由Strep标签从哺乳动物细胞培养物上清液进行的纯化由于大多数介质的高生物素浓度而受损。
某些较大的球状标签可以支持难于表达的多肽作为蛋白的折叠、可溶性和表达。开发的大多数可得的基因融合技术是在大肠杆菌中表达并从粗裂解物中纯化。这些融合蛋白的实例是MBP(麦芽糖结合蛋白)、GST(谷胱甘肽-S-转移酶)和SUMO(小的泛素修饰蛋白;参见例如,WO03/057174)。
SUMO-标签最初被设计用于原核表达(例如,SUMOproTM表达试剂盒,http://www.lifesensors.com),然后被进一步研发用于哺乳动物表达(SUMOstarTM表达试剂盒,http://www.lifesensors.com)。SUMO起伴侣(chaperon)和蛋白折叠引发剂的作用,以改进目标蛋白的可溶性和表达水平。通过使用去SUOM酶(desumoylase),可以去除融合到目标蛋白的N端上的SUMO标签,导致蛋白的天然N端的产生。将SUMO标签融合到目标蛋白的C端不能实现融合标签的去除。纯化与SUMO标签融合的目标蛋白并不利用SUMO标签,但是需要应用纯化标签,如His标签。
用于哺乳动物表达的可选途径是使用Fc标签,其包括人类IgG1的铰链区、CH2和CH3结构域。Fc标签用于支持特定多肽的表达、折叠和分泌,同时也被用作其纯化的标签。His标签和Flag标签是具有低分子量的短肽,且较好地适用于可溶性多肽和蛋白的表达,而Fc标签是超过200个氨基酸的多肽,其支持特定的较不溶性的疏水性蛋白的表达。然而,相对较大的Fc部分形成二硫键桥接的聚集体,引起分离的和纯化的目标蛋白的二聚体或多聚体形式。
其他常见替代者是GST(谷胱甘肽S-转移酶)和MBP(麦芽糖结合蛋白),其分别结合谷胱甘肽和麦芽糖。两种标签都具有高分子量(>25kDa)且显著地提高目标多肽或蛋白的可溶性和稳定性。然而,两种基因融合系统都不能用于进行分泌蛋白从条件哺乳动物细胞培养上清液中的蛋白纯化,因为培养基的成分阻止融合标签与其结合伴侣(即谷胱甘肽或麦芽糖)的结合。另外,两种融合标签都具有在哺乳类表达系统中聚集的倾向和也易于形成内含体。
因此,例如Fc标签不适合用于单体多肽和蛋白的表达和纯化,所有其它可用的标签也具有特定的优点和缺点且不适合用于某些特定多肽或蛋白的表达和/或纯化。汇总言之,表达和纯化的质量不仅取决于目标多肽或蛋白的性质,而且取决于所使用的各个标签。因而,特定标签与特定的目标多肽或蛋白的组合对于最佳结果而言是重要的,但却难以预测。因此,对于能够实现特定的挑战性的重组多肽和蛋白的表达和纯化或改善其质量的新型便利标签有着无尽的需求。本申请中公开的方法提供了通过利用溶菌酶作为标签来表达和纯化多肽或蛋白的有效途径。
发明内容
本公开提供表达和纯化单体多肽和蛋白的方法。本公开能够对使用本领域已知的其他标签不能表达和纯化的多肽和蛋白进行纯化。在本公开中,公开了溶菌酶作为融合伴侣(fusion partner)的用途。此外,描述了经由溶菌酶-特异性抗体而分离溶菌酶标记的多肽和蛋白的纯化方法。与现有技术的其他标签相比,使用溶菌酶作为标签结果可以实现特定单体多肽和蛋白的表达或提高的多肽和蛋白表达率。通过使用溶菌酶作为融合伴侣,可以避免不恰当的折叠、低溶解度和表达、活性损失以及分离多肽的聚集,它们会导致不想要的和不期望的多聚体蛋白的形成。此外,使用溶菌酶的另一个优势在于其抗菌活性,这使得可以减少或免除抗生素,这对于无菌条件下的细胞培养和蛋白表达过程通常是需要的。
溶菌酶(EC 3.2.1.17)也被称为胞壁酸酶(muramidase)或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶,其具有大约14.6kDa的分子量,并催化肽聚糖中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰-D-葡糖胺残基之间的以及壳糊精中N-乙酰-D-葡糖胺残基之间的1,4-β-键的水解。
溶菌酶一般由许多生物体如病毒、植物、昆虫、鸟类、爬行动物和哺乳动物产生作为针对细菌的防御机制。该酶通过切割肽聚糖的糖苷键而引起细菌细胞壁的水解,所述肽聚糖是细菌中的重要结构分子。在其细胞壁已由溶菌酶作用削弱后,细菌细胞因渗透压引起裂解。
溶菌酶已分类成五个不同的糖苷水解酶(GH)家族(Cazy,http://www.cazy.org):鸡蛋清溶菌酶(GH22)、鹅蛋清溶菌酶(GH23)、细菌噬菌体T4溶菌酶(GH24)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)鞭毛蛋白(GH73)和拟鞘孢属(Chalaropsis)溶菌酶(GH25)。已发现溶菌酶家族GH25与其他溶菌酶家族在结构上无关。
溶菌酶的用途已在动物饲料(参见例如WO 00/21381和WO04/026334)、干酪生产(参见例如WO 05/080559)、食品保存(Hugheyand Johnson(1987)Appl Environ Microbiol53:2165)、去污剂(参见例如US序列号07/428,273和EP0425016)、口腔护理(参见例如US序列号06/279,536、WO04/017988和WO08/124764)、美容学和皮肤病学、避孕、泌尿学和妇科学(参见例如WO 08/124764)中提出。鸡蛋清溶菌酶是市售的溶菌酶产品。也已知从微生物分离但也有从哺乳动物来源分离的溶菌酶。然而还没有关于在哺乳动物细胞培养中的重组溶菌酶表达或在细胞培养中与溶菌酶融合的肽或蛋白的表达的公开报道。
美国序列号10/024,597和WO 01/00855公开了与溶菌酶融合的小肽在转基因动物乳液中的表达。因为溶菌酶是天然表达的乳蛋白,与溶菌酶融合的肽得以表达,并且可以从乳液中主要呈酸性的蛋白中纯化基本的溶菌酶融合肽。然而,来自乳腺的细胞据记载不能在细胞培养中产生乳蛋白,如溶菌酶(Streuli and Bissell(1990)The Journal of CellBiology,Volume 110,April 1990 1405-1415)。此外,乳蛋白在转基因动物中的蛋白表达对于细胞培养表达是不可预测的,且各自的发现不能被转移到细胞培养体系(参见例如,Furth等人,(1991),19NucleicAcids Res.6205和Whitelaw等人,(1991);1Transgenic Res.3)。
在另一个申请中,Kobilka等人利用溶菌酶作为用于G-蛋白偶联受体(GPCR)的稳定剂,以实现GPCR的结晶化。由此,将T4溶菌酶插入至在昆虫细胞内表达的各个GPCR中的一个胞内环中(参见,WO09/051769)。
本公开提供用于宿主细胞内的分离的蛋白、肽和/或氨基酸的产生和纯化的方法,其中所述蛋白、肽和/或氨基酸融合至溶菌酶,所述方法包括,
(a)在允许编码目标蛋白的基因的表达的条件下,培养所述宿主细胞,和
(b)分离所述蛋白、肽或氨基酸。
本公开也提供用于本文公开的方法中的宿主细胞和载体。本公开也提供用于本公开的方法中的反应容器,如发酵罐。本公开也提供试剂盒,包括,
(a)根据本发明的载体,
(b)溶菌酶特异性抗体,和
(c)任选地,根据本文描述的方法使用所述载体和抗体的说明书。
附图说明
图1:用于溶菌酶融合蛋白的表达的载体。将编码鸡溶菌酶的序列亚克隆到pMax载体骨架中。
图2A-C:编码包括鸡溶菌酶(下划线示出)的整个pMax表达构建体(SEQ ID NO:15)的核苷酸序列。
具体实施方式
在一个方面,本公开涉及用于增强目标多肽或蛋白的表达的方法,其通过将所述目标多肽或蛋白表达为包含溶菌酶的融合蛋白。
在本公开的一个实施方式中,目标多肽或蛋白是单体的目标多肽或蛋白。在进一步的实施方式中,目标多肽或蛋白具有生理学的单体组成。在另一个实施方式中,目标多肽或蛋白具有生理学的单体组成且充当单体。在另一个实施方式中,目标蛋白是生理学上作为单体表达的细胞表面受体。在进一步的实施方式中,目标蛋白是生理学上作为单体表达的可溶性蛋白。
在本公开的一个实施方式中,融合蛋白包括目标多肽或蛋白和溶菌酶,其中将溶菌酶融合到目标多肽或蛋白的N端。在本公开的一个实施方式中,融合蛋白包括目标多肽或蛋白和溶菌酶,其中将溶菌酶融合到目标多肽或蛋白的C端。
在一个实施方式中,本公开涉及用于增强目标多肽或蛋白的表达的方法,其通过将所述目标多肽或蛋白表达为包含溶菌酶的融合蛋白,其中所述融合蛋白的产量至少2倍地高于不包含溶菌酶的目标多肽或蛋白的产量。
在一个实施方式中,本公开涉及用于增强目标多肽或蛋白的表达的方法,其通过将所述目标多肽或蛋白表达为包含溶菌酶的融合蛋白,其中包括目标多肽或蛋白和溶菌酶的融合蛋白不形成任何聚集体或内含体。在本公开的进一步的实施方式中,少于50%、40%、30%、25%、20%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%的包括目标多肽或蛋白和溶菌酶的融合蛋白形成聚集体。
在本公开的一个实施方式中,所述融合蛋白在宿主细胞内表达。在本公开的进一步的实施方式中,所述宿主细胞是原核细胞或真核细胞。在优选的实施方式中,宿主细胞是真核细胞。在本公开的更优选的实施方式中,所述真核细胞选自CHO细胞、PER.C6细胞、HKB11细胞和HEK293细胞。
在本公开的一个实施方式中,用编码所述包括目标多肽或蛋白和溶菌酶的融合蛋白的表达载体转染所述宿主细胞。
在本公开的一个实施方式中,所述融合蛋白在宿主细胞中表达,其中与用于培养没有与溶菌酶融合的所述目标蛋白或多肽的培养基相比,所述宿主细胞的培养需要少至少50%的抗生素作为用于培养基的补充物。在本公开的优选的实施方式中,所述融合蛋白在宿主细胞中表达,其中与用于培养没有与溶菌酶融合的所述目标蛋白或多肽的培养基相比,所述宿主细胞的培养需要少至少50%、60%、70%、80%、90%、或95%的抗生素作为用于培养基的补充物。在本公开的更优选的实施方式中,所述融合蛋白在宿主细胞中表达,其中用于培养所述宿主细胞的培养基没有抗生素。
在本公开的一个实施方式中,在表达之后分离所述包括目标多肽或蛋白和溶菌酶的融合蛋白。在本公开的进一步的实施方式中,从宿主细胞、培养基或两者分离所述融合蛋白。
在本公开的一个实施方式中,利用溶菌酶特异性的抗体来分离所述融合蛋白。在本公开的进一步的实施方式中,溶菌酶特异性抗体是分离的抗体。在本公开的优选的实施方式中,溶菌酶特异性抗体是单克隆抗体。在本公开的优选的实施方式中,溶菌酶特异性抗体包括序列NSAAWS(SEQ ID NO:9)的HCDR1区、序列RIYYRSKWYNDYAVSVKS(SEQ ID NO:10)的HCDR2区、序列LDHRYHEDTVYPGMDV(SEQ ID NO:11)的HCDR3区、序列SGDNLPAYTVT(SEQ ID NO:12)的LCDR1区、序列DDSDRPS(SEQID NO:13)的LCDR2区和序列ASWDPSSGV(SEQ ID NO:14)的LCDR3区。在本公开的优选的实施方式中,溶菌酶特异性抗体是MOR03207。在本公开的另一个实施方式中,溶菌酶特异性抗体结合至与MOR03207相同的表位。在本公开的进一步的实施方式中,溶菌酶特异性抗体与MOR03207竞争。
在本公开的一个实施方式中,溶菌酶特异性抗体连接在支撑基质上。在本公开的进一步的实施方式中,溶菌酶特异性抗体连接在选自琼脂糖、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺、琼脂糖/聚丙烯酰胺共聚物、葡聚糖、纤维素、聚丙烯、聚碳酸脂、硝化纤维、玻璃、纸和磁性粒子的支撑基质上。在进一步的实施方式中,将支撑基质引入纯化柱中。在进一步的实施方式中,将支撑基质引入至可分离的珠上。
在本公开的一个方面,将目标多肽或蛋白融合至哺乳动物溶菌酶。在一个实施方式中,哺乳动物溶菌酶选自人类、小鼠、大鼠、鸡、兔、山羊和灵长动物溶菌酶。在优选的实施方式中,哺乳动物溶菌酶是鸡溶菌酶。
在本公开的一个方面,将目标多肽或蛋白融合至溶菌酶或它的片段、类似物、同源物、变体或衍生物。在一个实施方式中,溶菌酶或它的片段、类似物、同源物、变体或衍生物来源于哺乳动物溶菌酶。在进一步的实施方式中,哺乳动物溶菌酶选自人类、小鼠、大鼠、鸡、兔、山羊和灵长动物溶菌酶。在优选的实施方式中,哺乳动物溶菌酶是鸡溶菌酶。
在一个实施方式中,融合蛋白包括目标多肽或蛋白,溶菌酶或它的片段、类似物、同源物、变体或衍生物,以及蛋白酶切割位点。在优选的实施方式中,切割位点是FactorXa、肠激酶(肠肽酶)、TEV-蛋白酶或HRV3C-蛋白酶(PreScission蛋白酶)。在优选的实施方式中,蛋白酶切割位点可用于溶菌酶多肽结构域的去除。
在一个方面,本公开涉及包括编码融合蛋白的表达载体以及溶菌酶特异性抗体的试剂盒,其中所述融合蛋白包括目标多肽或蛋白和溶菌酶。在一个实施方式中,将所述溶菌酶特异性抗体连接在支撑基质上。在优选的实施方式中,所述支撑基质是固体支撑基质。在进一步的实施方式中,所述固体支撑基质选自琼脂糖、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺、琼脂糖/聚丙烯酰胺共聚物、葡聚糖、纤维素、聚丙烯、聚碳酸脂、硝化纤维、玻璃、纸和磁性粒子。
在一个方面,本公开涉及包括目标多肽或蛋白和溶菌酶的融合蛋白,其中目标多肽或蛋白的长度为至少5个氨基酸、至少10个氨基酸、至少20个氨基酸、至少50个氨基酸、至少80个氨基酸、至少90个氨基酸、至少100个氨基酸、至少110个氨基酸、至少120个氨基酸、至少125个氨基酸、至少150个氨基酸、至少200个氨基酸、至少250个氨基酸、至少300个氨基酸、至少400个氨基酸或至少500个氨基酸。
在一个方面,本公开涉及用溶菌酶标记的多肽或蛋白。在一个实施方式中,用溶菌酶标记的多肽或蛋白长为至少5个氨基酸、至少10个氨基酸、至少20个氨基酸、至少50个氨基酸、至少80个氨基酸、至少90个氨基酸、至少100个氨基酸、至少110个氨基酸、至少120个氨基酸、至少125个氨基酸、至少150个氨基酸、至少200个氨基酸、至少250个氨基酸、至少300个氨基酸、至少400个氨基酸、或至少500个氨基酸。
在一个方面,本公开涉及用于增强单体的目标多肽或蛋白的表达的方法,其通过将所述单体的目标多肽或蛋白表达为包含溶菌酶的融合蛋白。
在一个实施方式中,本公开涉及用于增强单体的目标多肽或蛋白的表达的方法,其通过将所述单体的目标多肽或蛋白表达为包含溶菌酶的融合蛋白,其中所述融合蛋白的产量至少2倍高于、至少3倍高于、至少4倍高于、至少5倍高于、至少6倍高于、至少7倍高于、至少7倍高于、至少8倍高于、至少10倍高于、至少15倍高于、至少20倍高于、至少25倍高于、至少50倍高于或至少100倍高于不包括溶菌酶的单体目标多肽或蛋白的产量。
在一个实施方式中,本公开涉及用于增强单体的目标多肽或蛋白的表达的方法,其通过将所述单体的目标多肽或蛋白表达为包含溶菌酶的融合蛋白,其中包括单体的目标多肽或蛋白和溶菌酶的融合蛋白不形成任何聚集体或内含体。在本公开的进一步的实施方式中,少于50%、40%、30%、25%、20%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%的包括单体的目标多肽或蛋白和溶菌酶的融合蛋白形成聚合物。
在本公开的一个实施方式中,用编码所述包括单体的目标多肽或蛋白和溶菌酶的融合蛋白的表达载体转染所述宿主细胞。
在本公开的一个实施方式中,融合蛋白包括单体的目标多肽或蛋白和溶菌酶,其中将溶菌酶融合到单体的目标多肽或蛋白的N端。在本公开的一个实施方式中,融合蛋白包括单体的目标多肽或蛋白和溶菌酶,其中将溶菌酶融合到单体的目标多肽或蛋白的C端。
在本公开的一个实施方式中,在表达之后分离所述包括单体的目标多肽或蛋白和溶菌酶的融合蛋白。在本公开的进一步的实施方式中,从宿主细胞、培养基或两者分离所述融合蛋白。
在一个方面,本公开涉及用于融合蛋白的产生的方法,所述方法包括以下步骤,
(a)在宿主细胞中表达所述融合蛋白,和
(b)分离所述融合蛋白,
其中所述融合蛋白的一个多肽结构域是溶菌酶。
在本公开的一个实施方式中,从宿主细胞分离融合蛋白。在进一步的实施方式中,从培养基分离融合蛋白。在优选的实施方式中,从宿主细胞和培养基分离融合蛋白。
在一个方面,本公开涉及用于融合蛋白的产生的方法,所述方法包括以下步骤,
(a)在宿主细胞中表达所述融合蛋白,和
(b)从宿主细胞和培养基分离所述融合蛋白,
其中所述融合蛋白的一个多肽结构域是溶菌酶,其中在步骤(a)中所述融合蛋白的产量至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍高于不包括溶菌酶多肽结构域的蛋白的产量。
在一个方面,本公开涉及用于融合蛋白的产生的方法,所述方法包括以下步骤,
(a)在宿主细胞中表达所述融合蛋白,和
(b)从宿主细胞和培养基分离所述融合蛋白,
其中所述融合蛋白的一个多肽结构域是溶菌酶,其中在步骤(a)中表达的融合蛋白不形成任何聚集体或内含体。
在本公开的一个实施方式中,少于50%、40%、30%、25%、20%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%的分离的融合蛋白形成聚集体。
在一个方面,本公开涉及用于分离的目标多肽或蛋白的产生的方法,所述方法包括以下步骤,
(a)在宿主细胞中表达融合蛋白,其中所述融合蛋白包括所述目标多肽或蛋白和溶菌酶,和
(b)分离所述融合蛋白。
在本公开的一个实施方式中,从宿主细胞分离融合蛋白。在进一步的实施方式中,从培养基分离融合蛋白。在优选的实施方式中,从宿主细胞和培养基分离融合蛋白。
在一个方面,本公开涉及用于分离的单体多肽或蛋白的产生的方法。在一个方面,本公开涉及用于分离的单体的目标多肽或蛋白的产生的方法。在优选的实施方式中,多肽或蛋白具有生理学上的单体组成。在优选的实施方式中,目标蛋白具有生理学上的单体组成。在优选的实施方式中,目标蛋白是生理学上作为单体表达的细胞表面受体。在优选的实施方式中,目标蛋白是生理学上作为单体表达的可溶性蛋白。
在一个方面,本公开涉及用于分离的单体的目标多肽或蛋白的产生的方法,所述方法包括以下步骤,
(a)在宿主细胞中表达融合蛋白,其中所述融合蛋白包括所述单体的目标多肽或蛋白和溶菌酶,和
(b)从宿主细胞和培养基分离所述融合蛋白。
在本公开的一个实施方式中,在步骤(a)中所述融合蛋白的产量至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍高于不包括溶菌酶的单体的目标多肽或蛋白的产量。
在本公开的一个实施方式中,在步骤(a)中表达的融合蛋白不形成任何聚集体或内含体。在本公开的优选的实施方式中,少于50%、40%、30%、25%、20%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%的分离的融合蛋白形成聚集体。
在本公开的一个实施方式中,溶菌酶是标签。在进一步的实施方式中,溶菌酶是表达或纯化标签。在优选的实施方式中,溶菌酶是表达和纯化标签。
在一个方面,本公开涉及溶菌酶作为标签用于目标多肽或蛋白的产生的用途,其特征在于,表达与溶菌酶融合的目标多肽或蛋白以及分离所述与溶菌酶融合的目标多肽或蛋白。
在一个方面,本公开涉及溶菌酶作为标签用于目标多肽或蛋白的产生的用途,其特征在于,在宿主细胞中表达与溶菌酶融合的目标多肽或蛋白以及从宿主细胞和培养基分离所述与溶菌酶融合的目标多肽或蛋白。
在一个方面,本公开涉及溶菌酶作为标签用于目标多肽或蛋白的产生的用途,其特征在于,在宿主细胞中表达与溶菌酶融合的目标多肽或蛋白以及从宿主细胞和培养基分离所述与溶菌酶融合的目标多肽或蛋白,其中使用溶菌酶特异性抗体来分离所述与溶菌酶融合的目标多肽或蛋白。
在本公开的一个实施方式中,所述与溶菌酶融合的目标多肽或蛋白的产量至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍高于不包括溶菌酶多肽结构域的目标多肽或蛋白的产量。
定义
术语“多肽”在本文中以本领域技术人员所理解的最广泛的含义使用。多肽包括至少两个由肽键连接的氨基酸。通常,多肽包括超过30个的氨基酸。
术语“蛋白”在本文中也以本领域技术人员所理解的最广泛的含义使用。蛋白包括一个或多个多肽,其中至少部分多肽具有或能够通过在它的多肽链内和/或在其之间形成二级、三级或四级结构而获得明确的三维结构排列。蛋白可以是单体的(由一个多肽链组成)或多聚体的(由两个或更多个多肽链组成)。
本文使用的术语“宿主细胞”可以是在外源多肽或蛋白的产生中通常使用的许多细胞中的任一种,包括真核和原核宿主细胞。本发明的优选的宿主细胞是真核宿主细胞,如真菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。最优选的是哺乳动物宿主细胞。在更进一步优选的实施方式中,所述哺乳动物宿主细胞选自CHO细胞(细胞培养物保藏中心(European Collection of Cell Culture);ECACC#85050302)、PER.C6细胞(Crucell,Leiden,The Netherlands)、HKB11细胞(Bayer HealthCare,Berkley/CA,USA)和HEK293细胞(美国模式培养物收藏所;订单号.CRL-1573)。
本文使用的术语“允许[多肽]的表达的条件”是指引起给定多肽的表达的条件。对宿主细胞条件的有目的的选择能够实现本发明多肽表达的打开(或关闭)。通常,通过向宿主细胞的生长培养基中添加化学化合物或自然出现的化合物——“诱导物”,带来这样的条件改变。诱导物的性质取决于所使用的具体启动子而改变。可引起多肽表达的其他条件变化是增加温度或增加对光线或UV的暴露程度。
本文使用的术语“溶菌酶”包含所有天然出现的溶菌酶,如鸡蛋清溶菌酶、合成的溶菌酶和重组溶菌酶例如人类重组溶菌酶、以及溶菌酶盐。在优选的实施方式中,溶菌酶是鸡溶菌酶(SEQ ID NO:1)。在一个实施方式中,术语“溶菌酶”是指来自微生物如藻类、古细菌、细菌、酵母、丝状真菌或原生动物的溶菌酶。在一个实施方式中,术语“溶菌酶”是指来自哺乳动物、鸟、爬行动物和两栖动物的溶菌酶。在一个实施方式中,术语“溶菌酶”是指小鼠(SEQ ID NO:2)、兔(SEQID NO:3)、山羊(SEQ ID NO:4)、人类(SEQ ID NO:5)、牛(SEQID NO:6)、大鼠(SEQ ID NO:7)或猕猴(SEQ ID NO:8)溶菌酶。在优选的实施方式中,本公开中所使用的溶菌酶与天然出现的生物体所表达的溶菌酶的氨基酸序列共享至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的同一性。
本文将术语“变体”定义为在一个或多个(数个)特定位置包括一个或多个(数个)氨基酸残基的改变(如取代、插入和/或缺失)的多肽。可以通过人为干预通过修饰编码亲本溶菌酶的多核苷酸序列而获得改变的多肽(变体)。亲本溶菌酶可以由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8或与这些序列中的一个具有至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%同一性的序列编码。变体多肽序列优选是在自然中未发现的序列。本发明涉及包括改变的溶菌酶变体,改变优选是以在一个或多个(数个)位置上的取代和/或插入和/或缺失的形式。
本文使用的术语“分离的”是指从来源例如表达它的宿主细胞分离的多肽或蛋白或其变体。优选地,如通过SDS-PAGE确定的,多肽为至少40%纯,如至少60%纯、至少80%纯、至少90%纯或至少95%纯。
术语“融合蛋白”是指具有至少两个通常不存在于单个天然多肽中的多肽结构域的单个多肽链。因而,如本文使用的,天然出现的蛋白不是“融合蛋白”。优选地,目标多肽通过肽键与至少一个多肽结构域融合,融合蛋白也可以在来自不同蛋白的氨基酸部分之间包含氨基酸连接区。融合到目标多肽的多肽结构域可以增强目标多肽的可溶性和/或表达,并且还可以提供纯化标签,以允许从宿主细胞或培养上清或两者中纯化重组融合蛋白。融合到目标多肽的多肽结构域可以融合到目标多肽的N端或C端。
术语“重组”是指例如通过化学合成或通过基因工程技术对氨基酸或核酸的分离片段的操作而得到的两个另外分开的序列片段的人工组合。
本文使用的术语“表达”是指功能性末端产物例如mRNA或蛋白(前体或成熟的)的产生。
术语“载体”意在指代能够运载与之连接的另一个多核苷酸的多核苷酸分子。一种类型的载体是“质粒”,其是指其中可以插入有另外的DNA片段的环状双链DNA环。此外,目标基因的编码序列可通过细胞转录机制从某些载体转录并进一步被翻译成目标蛋白。此处将这样的载体称为“表达载体”。通常,重组DNA技术中利用的表达载体经常采取质粒的形式。在本说明书中,“质粒”和“载体”可互换地使用,因为质粒是最常使用的载体形式。然而,本公开意在包括其他形式的这样的表达载体,如病毒载体(例如,复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺病毒相关的病毒),它们起到等同的功能。
本文使用的术语“单体的”及其语法上的等同物是指由单个多肽链组成的多肽或蛋白。本发明的单体多肽或蛋白与另一个多肽或蛋白既不共价地相连或结合或也不非共价地相连或结合。
本文使用术语“标签”,其是指可以连接到第二多肽上的肽或多肽序列。优选地,标签是纯化标签或表达标签,或两者。
本文使用的术语“纯化标签”是指适于多肽的纯化或鉴定的任何肽序列。纯化标签特异性地结合到对纯化标签具有亲和性的另一个部分上。这些特异性地与纯化标签结合的部分通常连接到基质或树脂如琼脂糖小球上。特异性地与纯化标签结合的部分包括抗体、其他蛋白(例如,蛋白A或链霉亲和素)、镍或钴离子或者树脂、生物素、直链淀粉、麦芽糖和环糊精。示例性的纯化标签包含组氨酸(HIS)标签(如六聚组氨酸肽),其将结合到金属离子如镍或钴离子上。其他示例性的纯化标签是myc标签(EQKLISEEDL)、Strep标签(WSHPQFEK)、Flag标签(DYKDDDDK)和V5标签(GKPIPNPLLGLDST)。术语“纯化标签”还包括“表位标签”,即,由抗体特异性识别的肽序列。示例性的表位标签包括FLAG标签,其由单克隆抗-FLAG抗体特异性地识别。由抗-FLAG抗体识别的肽序列由序列DYKDDDDK或其大体相同的变体组成。术语“纯化标签”还包括纯化标签的大体上相同的变体。本文使用的“大体上相同的变体”是指与原始的纯化标签相比有改变(例如,通过氨基酸替换、缺失或插入)、但是其保留了纯化标签的与特异性识别纯化标签的部分特异性地结合的特性的纯化标签的衍生物或片段。
本文使用的术语“表达标签”是指可连接到第二多肽上并且认为其能支持重组目标多肽的可溶性、稳定性和/或表达的任何肽或多肽。示例性的表达标签包含Fc标签和SUMO标签。原则上,可将任何肽、多肽或蛋白用作表达标签。
本文使用的术语“抗体”包含完整的抗体以及它的任何片段或单链。天然出现的“抗体”是包括通过二硫键相互连接的至少两个重(H)链和两个轻(L)链的蛋白。在优选的实施方式中,本申请中公开的抗体是“单克隆抗体”。本文使用的术语“单克隆抗体”是指具有单一分子组成的抗体分子制剂。单克隆抗体组合物表现出独特的结合位点,其对特定的表位具有独特的结合特异性和亲和性。
本文使用的术语“转染”是指通常用于将外源DNA导入到原核或真核宿主细胞内的多种技术,例如电穿孔、磷酸钙沉淀法、DEAE-葡聚糖转染等等。可以通过本领域技术人员知晓的任何常规方式对宿主细胞“转染”本发明的载体。例如,转染可以是瞬时转染。因此,在本发明的某些实施方式中,经由瞬时转染将编码包括目标多肽或蛋白和溶菌酶的所述融合蛋白的所述基因导入所述真核宿主细胞。
如下计算整个说明书和所附的权利要求中使用的术语“%同一性”。利用CLUSTAL W算法(Thompson,J.D.,Higgins,D.G.and Gibson,T.J.,Nucleic Acids Research,22:4673-4680(1994)),将查询序列与目标序列比对。在对应于最短的比对序列的窗口上进行比较。比较各个位置上的氨基酸残基,将查询序列中与目标序列具有相同对应关系的位置的百分比报道为%同一性。
实施例
所有的试剂都是市售可得的,且购自例如Sigma-Aldrich、Sartorius、TTP、GE Healthcare,它们是分子生物学实验室使用的标准试剂。
除非指出,否则使用标准的方案进行分子克隆,基本上如在Sambrook等人:Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3Vol.;ColdSpring Harbor Laboratory(December2000)描述的。根据如在ProteinScience(Wiley Interscience)中Current Protocols中所记载的标准方法进行表达和纯化。
实施例1:产生适用于本发明方法的载体
真核表达载体,例如标准的pcDNA3.1载体(Invitrogen)或以pcDNA3.1为基础改进的表达载体——pMAX表达载体(图1,图2)用于进行本发明。例如pMAX表达载体包括用于有效转录和翻译的复制起点、抗生素抗性以及调控序列(例如启动子、增强子、聚腺苷酸化位点)。通过标准亚克隆在多克隆位点(MCS)的3’-端插入各个融合伴侣或标签(例如,溶菌酶、GST、His、Fc)(图1)。在图2中,例示包括鸡溶菌酶的pMAX表达构建体的核苷酸序列。
可将任何目标蛋白的编码序列插入至表达载体的MCS中,得到目标基因和例如溶菌酶的融合构建体。在使包含目标蛋白的融合蛋白表达的条件下,将获得的载体转染到哺乳动物宿主细胞内,例如,HKB11或HEK293细胞。
实施例2:将载体转染到合适的宿主细胞中
产生根据实施例1的不同的表达载体变体,其编码与特定标签(例如溶菌酶、GST、His、Fc)融合的特定目标蛋白,将它们转染到哺乳动物宿主细胞内。
例如,以0.5×106vc/ml的密度接种HKB11悬浮细胞,且在37℃和6%CO2下于加湿的CO2培养箱中孵育。根据厂商的说明书,使用Lipofectamin2000和OptiMEM(Invitrogen)以质粒-DNA转染第二天的细胞。三天后,收获条件细胞培养物的上清液。然后,通过标准纯化方法(用于Fc-标签的蛋白A亲和层析或用于His标签的IMAC)或使用用于溶菌酶标记蛋白的溶菌酶特异性抗体(MOR03207)从收获的上清液纯化表达的蛋白。在这种情况下,根据厂商的说明书,将溶菌酶特异性抗体连接至Sepharose4FF(GE Healthcare)。将表达的目标融合蛋白结合到柱上,并使用100mM甘氨酸(pH4.0)洗脱样品。
使用在280nm下的UV吸光度测量用于蛋白浓度确定。通过大小-排除-层析法(用于%聚集体的确定)和动态光散射(用于颗粒大小的确定)来分析纯化蛋白的自然状态。
实施例3:利用溶菌酶作为标签进行目标蛋白的表达和纯化
3.1分析的八个蛋白
选择八个目标蛋白,用于作为溶菌酶融合蛋白进行表达和纯化。所有蛋白由哺乳动物细胞系(例如,HKB11)表达和分泌,并从细胞培养上清液中纯化出。所选择的蛋白作为Fc-、GST-融合或作为His-标记的蛋白显示出非常低的表达率和/或大量聚集。相比之下,遍及所有实施例,与溶菌酶融合引起增加的表达率和/或高度改进的蛋白品质。
在表1-8中,试验和比较八种不同蛋白的表达和纯化。所分析的所有目标蛋白是在生理学上作为单体表达且长于110个氨基酸的蛋白。在示例蛋白1中,例示的蛋白具有116个氨基酸的最小大小,其中蛋白2是517个氨基酸长,蛋白3是257个氨基酸长,蛋白4是237个氨基酸长,蛋白5是217个氨基酸长,蛋白6和蛋白7都是193个氨基酸长,蛋白8是209个氨基酸长。
当与Fc-标签融合时,一些例示蛋白最后不能表达。因此,测试His标签、溶菌酶或其组合,以表达所述单体的目标蛋白。经由His标签或经由溶菌酶进行随后的纯化。Avi-标签被用作随后对各个蛋白进行生物素化的进一步的标签。Avi-标签长为15个氨基酸,包括BirA酶的识别位点,该位点介导位点特异性的生物素化。Avi-标签对重组表达的多肽或蛋白的表达水平不具有影响,并且并不削弱其聚集倾向。
3.2溶菌酶-标签实现或增强蛋白表达
蛋白1在哺乳动物表达载体上编码,并与两个不同标签的特定组合融合。因此,使用His标签或溶菌酶标签,经由His标签(利用固定化金属亲和层析,IMAC)或经由溶菌酶(利用MOR3207作为连接至Sepharose4FF的溶菌酶特异性抗体)进行纯化。虽然利用His标签时没有可检测的蛋白1的表达,但与溶菌酶融合实现了蛋白1的表达(表1)。另外,与经由IMAC的纯化相比,经由溶菌酶特异性抗体的融合蛋白纯化的产量显著更高。此外,没有检测到纯化蛋白的聚集。
表1:与His-标签或溶菌酶-标签融合的蛋白1的表达和纯化。蛋白1具有116aa的大小。
在表2和表3中,例示了使用Fc-或His标签的组合不能表达的其它蛋白。然而,与溶菌酶的融合实现了两种蛋白——蛋白2和蛋白3的表达和纯化。对于蛋白2,通过将溶菌酶融合到蛋白2,实现纯化后产量从0.3mg/L至4.0mg/L的增加。此外,聚集体的水平低于纯化融合蛋白的7%。
表2:与Fc-、His-或溶菌酶-标签融合的蛋白2的表达和纯化。蛋白2具有517aa的大小。
表3:与Fc-、His-或溶菌酶-标签融合的蛋白3的表达和纯化。蛋白3具有257aa的大小。
3.2溶菌酶融合蛋白显示较少的聚集
如果作为溶菌酶-融合蛋白表达,分析的蛋白4、5和6不仅显示提高的表达率而且显示较少的聚集。如果使用溶菌酶代替His来标记蛋白(表4),则蛋白4的表达增加超过3倍,其聚集减少超过3倍。
表4:与His标签或溶菌酶标签融合的特定蛋白的表达和纯化。蛋白4具有237aa的大小。
当将溶菌酶标签与GST标签相比较时,对于蛋白5(表5)和6(表6)观察到相似的结果。
表5:与GST标签或溶菌酶标签融合的特定蛋白的表达和纯化。蛋白5具有217aa的大小。
表6:与GST标签或溶菌酶标签融合的特定蛋白的表达和纯化。蛋白6具有193aa的大小。
相应地,与融合至GST-His标签或His标签的蛋白相比,在用溶菌酶作标签时,表7和表8中所分析的蛋白也可以以显著较低的聚集被纯化出来。因此,与GST-His标签或His标签相比,通过溶菌酶融合使得蛋白8的表达水平增加,而蛋白7的表达水平仅相对于His标签有增加,但相对于GST-His标签并不如此。
表7:与GST标签、His标签或溶菌酶标签融合的特定蛋白的表达和纯化。蛋白7具有193aa的大小。
表8:与GST标签、His标签或溶菌酶标签融合的特定蛋白的表达和纯化。蛋白8具有209aa的大小。
3.3总结
总的说来,与可选的标签(例如,His、GST_His、Fc_His、His)相比,溶菌酶融合对于所分析的所有蛋白而言是有利的。
对于蛋白1、2和3,当将蛋白与溶菌酶融合时,表达水平显著地增加。对于蛋白7,表达水平没有增加,但从减少的聚集体方面而言,溶菌酶融合显著地改善纯化蛋白的质量。然而,对于蛋白4、5、6和8,当将蛋白与溶菌酶融合时,我们观察到显著降低的聚集趋势,伴随增加的表达率。
Claims (13)
1.一种用于产生分离的单体多肽或蛋白的方法,所述方法包括以下步骤,
(a)在宿主细胞中将所述单体多肽或蛋白作为融合蛋白表达,其中所述融合蛋白包括所述单体多肽或蛋白和溶菌酶,以及
(b)分离所述融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述融合蛋白的产量与不包括溶菌酶的单体多肽或蛋白相比至少2倍高于其产量。
3.根据权利要求1所述的方法,其中少于15%的所述包括单体多肽或蛋白和溶菌酶的融合蛋白形成聚集体。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述宿主细胞是原核细胞或真核细胞。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中用编码所述包括单体多肽或蛋白和溶菌酶的融合蛋白的表达载体转染所述宿主细胞。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述单体多肽或蛋白的长度为至少100个氨基酸。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述融合蛋白分离自所述宿主细胞、培养基或两者。
8.根据权利要求7所述的方法,其中使用溶菌酶特异性抗体分离所述融合蛋白。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述溶菌酶是哺乳动物溶菌酶。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述溶菌酶是溶菌酶的片段、类似物、同源物、变体或衍生物。
11.一种试剂盒,其包括编码融合蛋白的表达载体和溶菌酶特异性抗体,所述融合蛋白包括多肽或蛋白和溶菌酶。
12.根据权利要求11所述的试剂盒,其中所述溶菌酶特异性抗体连接在支撑基质上。
13.根据权利要求12所述的试剂盒,其中所述支撑基质选自琼脂糖、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺、琼脂糖/聚丙烯酰胺共聚物、葡聚糖、纤维素、聚丙烯、聚碳酸脂、硝化纤维、玻璃、纸和磁性粒子。
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