CN114163504A - SARS-CoV-2 S蛋白RBD区中和表位肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本公开在SARS‑CoV‑2S蛋白RBD区中和抗体的基础上，重组表达制备了中和抗体Fab段，使其与SARS‑CoV‑2S蛋白RBD反应形成抗原‑抗体复合物，纯化、结晶、X‑晶体衍射分析。利用PDB数据库中的同源复合物三维结构作为模型对所述抗原‑抗体复合物结构进行解析，获得SARS‑CoV‑2S蛋白RBD上与中和抗体相互作用的氨基酸残基，对关键的氨基酸残基进行定点突变，检测SARS‑CoV‑2S蛋白RBD突变体与中和抗体Fab的亲和力。根据RBD点突变对亲和力的影响程度，确定表位肽段。还提供了表位肽段制备融合抗原检测SARS‑CoV‑2的用途、表位肽段制备免疫原制备疫苗或抗体的用途。

Description

SARS-CoV-2 S蛋白RBD区中和表位肽及其应用
本专利申请要求于2020年9月10日提交的申请号为CN 202010945544.0的中国发明专利申请的优先权权益，在此将其全部内容引入作为参考。
技术领域
本发明属于蛋白质工程领域，具体涉及一种SARS-CoV-2 S蛋白RBD区中和表位肽及其应用，特别是涉及SARS-CoV-2 S蛋白RBD区上与抗SARS-CoV-2中和抗体相互作用的抗原表位、其制备方法及应用。
背景技术
2019新型冠状病毒(2019-nCoV)，因2019年病毒性肺炎病例而被发现，2020年1月12日被世界卫生组织命名。冠状病毒是一个大型病毒家族，已知可引起感冒以及中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸综合征(SARS)等较严重疾病。新型冠状病毒是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。新型冠状病毒是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。冠状病毒是一个大型病毒家族，在系统分类上属冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)。冠状病毒属的病毒是具外套膜(envelope)的正链单股RNA病毒，直径约80～120nm，其遗传物质是所有RNA病毒中最大的，只感染人、鼠、猪、猫、犬、禽类脊椎动物。冠状病毒粒子呈不规则形状，病毒粒子外包着脂肪膜，膜表面有三种糖蛋白：刺突糖蛋白(S，Spike Protein，是受体结合位点、溶细胞作用和主要抗原位点)；小包膜糖蛋白(E，Envelope Protein，较小，与包膜结合的蛋白)；膜糖蛋白(M，Membrane Protein)，负责营养物质的跨膜运输、新生病毒出芽释放与病毒外包膜的形成)。其中刺突蛋白(spikeprotein)是冠状病毒最重要的表面蛋白，与病毒的传染能力相关。刺突蛋白含有两个亚基：S1和S2，其中S1主要包含受体结合区域(RBD)，负责识别细胞受体，S2含有膜融合过程所需的基本元件。
人感染了冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。目前对于新型冠状病毒所致疾病没有特异治疗方法，需根据患者临床情况进行治疗。《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第五版)》公布，在重型、危重型病人治疗的其他治疗措施中，可采用恢复期血浆治疗。2月8日，首期在江夏区第一人民医院开展了3名危重患者的新冠特免血浆治疗，目前连同后续医院治疗的危重病人超过了10人。经临床反映，患者接受治疗12至24小时后，实验室检测主要炎症指标明显下降，淋巴细胞比例上升，血氧饱和度、病毒载量等重点指标全面向好，临床体征和症状明显好转。3月4日国家卫生健康委办公厅、中央军委后勤保障部卫生局联合发布《新冠肺炎康复者恢复期血浆临床治疗方案(试行第二版)》。围绕康复者血浆中和病毒的治疗目的，细化了临床使用的适应证、禁忌症和不宜使用的情况。康复者血浆主要用于病情进展较快、重症、危重症新冠肺炎患者。原则上病程不超过3周；新冠病毒核酸检测阳性或临床专家判定患者存在病毒血症，在病情急性进展期应当尽早使用。尽管康复患者血浆疗法在临床上取得了一定的成效，然而由于抗原患者血浆来源有限、纯化抗体安全隐患高、特异性抗体效价不稳定。效价高、性能稳定、安全性好的单克隆抗体对于控制新冠状病毒疫情具有良好的应用前景。目前现有文献已经公开或教导了针对新冠病毒RBD制备保护性中和单抗的报道。利用新冠病毒刺突蛋白RBD产生抗新冠病毒的保护性中和抗体(如：bioRxiv，“SARS-CoV-2 and SARS-CoV Spike-RBD Structure and ReceptorBinding Comparison and Potential Implications on Neutralizing Antibody andVaccine Development”，20200220)。SARS刺突蛋白RBD和新冠病毒刺突蛋白RBD存在交叉中和表位肽，抗SARS的单克隆抗体CR3022能够结合新冠病毒刺突蛋白RBD(EmergingMicrobes&Infections,9(1):382-385,20200217)。采用同源建模的方法明确了新冠病毒病毒CTD1/人ACE2复合物的蛋白-蛋白相互作用界面的热点和关键残基，筛选靶向CTD1区域与ACE2结合表面的候选抑制剂，阻断病毒与人体ACE2蛋白的识别与结合。
截至目前，全球范围内大约有250种新冠疫苗正在开发中，包括mRNA疫苗、复制型或非复制型病毒载体疫苗、重组蛋白疫苗、灭活病毒疫苗等类型，至少有17个新冠疫苗正在进行临床试验评估。我国5条技术路线推进的新冠疫苗分别是：灭活疫苗、腺病毒载体疫苗、重组亚单位疫苗、核酸疫苗(mRNA疫苗和DNA疫苗)和减毒流感病毒载体疫苗。
表位疫苗是近年发展起来的一种新型疫苗，它是利用基因工程的手段，体外表达或人工合成病原微生物的抗原表位，将其作为一种疫苗使用。表位又称抗原决定簇，是抗原分子中决定抗原特异性的化学基团，是能够与T细胞抗原受体或B细胞抗原受体特异性结合的基本单位，最终激起机体的免疫反应，形成对病原微生物的免疫能力，因此，表位疫苗符合未来疫苗的发展方向。在机体限制病毒进入和传播的适应性免疫防御中，中和抗体发挥着十分关键的保护作用。研究显示，冠状病毒的S蛋白不仅是其亲嗜性的主要决定因素，同时也是诱导机体产生中和抗体的主要抗原靶标，因此冠状病毒疫苗的研发通常以S蛋白作为主要免疫原。然而到目前为止，尚缺乏对于新发SARS-CoV-2病毒S蛋白的免疫原性以及中和抗原表位的详细资料。
目前，由于短肽表达的低效性和低免疫原性，所有报道的SARS-Cov-2疫苗还没有有效诱导机体针对病毒免疫应答的基于抗原表位的基因疫苗。基于载体蛋白的多肽疫苗也尚在尝试寻找靶位点阶段，本发明运用软件和数据库预测的方法，结合已有的病毒与其感染靶细胞结合相关位点报道，选取了与病毒宿主特异性或发病相关的有较好免疫特性的靶表位，为传统疫苗研究做了有益的补充，因此有较好的应用前景。
发明内容
为解决上述问题，本发明在前期筛选制备的SARS-CoV-2 S蛋白RBD区中和抗体的基础上，重组表达制备了中和抗体Fab段，使其与SARS-CoV-2 S蛋白RBD反应形成抗原-抗体复合物，纯化、结晶、X-晶体衍射分析。利用PDB数据库中的同源复合物三维结构作为模型对所述抗原-抗体复合物结构进行解析，获得SARS-CoV-2 S蛋白RBD上与中和抗体相互作用的氨基酸残基，对关键的氨基酸残基进行定点突变，检测SARS-CoV-2 S蛋白RBD突变体与中和抗体Fab的亲和力。根据RBD点突变对亲和力的影响程度，确定表位肽段。还提供了表位肽段制备抗原检测SARS-CoV-2的用途、表位肽段制备免疫原制备疫苗或抗体的用途。具体而言：
第一方面，本发明提供一种获得SARS-CoV-2 B细胞表位的方法，包括以下步骤：
(1)获得抗SARS-CoV-2抗体；
(2)制备抗SARS-CoV-2抗体Fab段；
(3)将步骤(2)制备的抗SARS-CoV-2抗体Fab段与重组SARS-CoV-2抗原在适合二者形成抗原-抗体复合物的条件下反应；
(4)对步骤(3)形成的抗原-抗体复合物进行纯化、结晶、X-射线晶体衍射分析；
(5)利用数据库中抗原、抗体的X-射线晶体三维结构图为模型，解析步骤(4)中的抗原-抗体复合物结构；
(6)根据步骤(5)中抗原-抗体复合物结构的解析结果，确定SARS-CoV-2抗原上与中和抗体相互作用的氨基酸残基；
(7)根据步骤(6)中SARS-CoV-2抗原上与中和抗体相互作用的氨基酸残基确定表位肽的序列。
进一步，本发明所述获得SARS-CoV-2 B细胞表位的方法，其特征在于：步骤(1)以SARS-CoV-2或其抗原蛋白制备免疫原，制备抗SARS-CoV-2单克隆抗体。
进一步，本发明所述获得SARS-CoV-2 B细胞表位的方法，其特征在于：所述的抗原蛋白为SARS-CoV-2的S蛋白或其片段，所述抗SARS-CoV-2单克隆抗体为中和性抗体。
进一步，本发明所述获得SARS-CoV-2 B细胞表位的方法，其特征在于：抗SARS-CoV-2抗体具有选自SEQ ID NO:1、3、5、7任一或其变体的重链可变区；和/或具有选自SEQID NO:2、4、6、8任一或其变体的轻链可变区。
进一步，本发明所述获得SARS-CoV-2 B细胞表位的方法，其特征在于：步骤(2)中的抗SARS-CoV-2抗体Fab段通过重组表达制备或通过酶切纯化制备。
进一步，本发明所述获得SARS-CoV-2 B细胞表位的方法，其特征在于：步骤(3)中抗SARS-CoV-2抗体Fab段与重组SARS-CoV-2抗原的摩尔比为0.8-1:1-2.5。
进一步，本发明所述获得SARS-CoV-2 B细胞表位的方法，其特征在于：步骤(4)中采用坐滴法，在柠檬酸钠、PEG、尿素的条件下结晶。
进一步，本发明所述获得SARS-CoV-2 B细胞表位的方法，其特征在于：步骤(5)中作为模型的抗体X-射线晶体三维结构图为PBD数据库PDB ID:6JJP中所示的抗体Fab结构、作为模型的抗原X-射线晶体三维结构图为PBD数据库PDB ID:6LZG中所示的SARS-CoV-2 S蛋白RBD结构。
进一步，本发明所述获得SARS-CoV-2 B细胞表位的方法，其特征在于：步骤(6)还包括对SARS-CoV-2 S蛋白RBD上与中和抗体相互作用的氨基酸残基进行定点突变验证，检测SARS-CoV-2 S蛋白RBD突变体与中和抗体Fab的亲和力。
第二方面，本发明还提供一种通过本发明第一方面任一所述方法获得的SARS-CoV-2 B细胞表位。
第三方面，本发明提供一种SARS-CoV-2 S蛋白RBD区的B细胞表位，其选自SARS-CoV-2 S蛋白RBD区的第446-456aa、481-494aa、444-456aa、483-494aa、369-385aa、404-408aa、437-440aa、499-508aa、403-421aa、449-460aa、473-477aa、484-489aa、493-505aa所示的多肽或其可自然获得的同源变体。
进一步，本发明所述的B细胞表位，其具有选自SEQ ID NO:9-21任一所示的多肽或其可自然获得的同源变体。
第四方面，本发明提供一种多肽片段组合，其具有一个或多个选自SARS-CoV-2 S蛋白RBD区的第446-456aa、481-494aa、444-456aa、483-494aa、369-385aa、404-408aa、437-440aa、499-508aa、403-421aa、449-460aa、473-477aa、484-489aa、493-505aa所示多肽片段或其可自然获得的同源变体。
进一步，本发明所述多肽片段组合，其具有2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、或13个选自SARS-CoV-2 S蛋白RBD区的多肽片段或其可自然获得的同源变体。
第五方面，本发明提供一种融合蛋白，其包括本发明第三方面任一所述SARS-CoV-2 S蛋白RBD区的B细胞表位、载体蛋白。
进一步，本发明所述的融合蛋白，其特征在于所述载体蛋白包括麦芽糖结合蛋白(MBP)；牛血清白蛋白(BSA)；钥孔血蓝蛋白(KLH)；卵清蛋白(OVA)；鞭毛蛋白；甲状腺球蛋白；任何物种的血清白蛋白；任何物种的γ球蛋白；D氨基酸和/或L氨基酸的聚合物；破伤风类毒素；解毒的白喉毒素；二氧四氢喋啶合酶；L7/L12核糖体蛋白；热休克蛋白GroEL；热休克蛋白GroES；铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)；外膜蛋白31(Omp31)；周质结合蛋白p39；外膜蛋白28(Omp28)；未脂质化的Omp16(U-Omp16)；未脂质化的Omp19(U-Omp19)。
进一步，本发明任一所述融合蛋白，其特征在于所述B细胞表位与载体蛋白通过键、双功能接头、肽接头连接。
进一步，本发明所述的融合蛋白，其特征在于所述的键包括共价键，优选肽键、酰胺键、酯键、二硫键。
进一步，本发明所述的融合蛋白，其特征在于所述的双功能接头包括戊二醛、双磺琥珀酰亚胺辛二酸酯、二甲基己二酸、N,N'-二异丙基碳二亚胺。
进一步，本发明所述的融合蛋白，其特征在于所述的肽接头包括(GnS)m所示的序列，其中n为1到10之间的整数，和m为1-6之间的整数。
第六方面，本发明提供一种多表位融合蛋白，其具有一个或多个选自SARS-CoV-2S蛋白RBD区的第446-456aa、481-494aa、444-456aa、483-494aa、369-385aa、404-408aa、437-440aa、499-508aa、403-421aa、449-460aa、473-477aa、484-489aa、493-505aa所示多肽或其可自然获得的同源变体。
进一步，本发明所述的多表位融合蛋白，其特征在于具有2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、或13个选自SARS-CoV-2 S蛋白RBD区的多肽片段或其可自然获得的同源变体。
进一步，本发明所述的多表位融合蛋白，其特征在于SARS-CoV-2 S蛋白RBD区多肽片段或其可自然获得的同源变体之间通过键、双功能接头、肽接头连接。
进一步，本发明所述的多表位融合蛋白，其特征在于所述的键包括共价键，优选肽键、酰胺键、酯键、二硫键。
进一步，本发明所述的多表位融合蛋白，其特征在于所述的双功能接头包括戊二醛、双磺琥珀酰亚胺辛二酸酯、二甲基己二酸、N,N'-二异丙基碳二亚胺。
进一步，本发明所述的多表位融合蛋白，其特征在于所述的肽接头包括(GnS)m所示的序列，其中n为1到10之间的整数，和m为1-6之间的整数。
进一步，本发明任一所述的多表位融合蛋白，其特征在于还包括至少一种载体蛋白。
进一步，本发明所述的多表位融合蛋白，其特征在于所述载体蛋白包括包括麦芽糖结合蛋白(MBP)；牛血清白蛋白(BSA)；钥孔血蓝蛋白(KLH)；卵清蛋白(OVA)；鞭毛蛋白；甲状腺球蛋白；任何物种的血清白蛋白；任何物种的γ球蛋白；D氨基酸和/或L氨基酸的聚合物；破伤风类毒素；解毒的白喉毒素；二氧四氢喋啶合酶；L7/L12核糖体蛋白；热休克蛋白GroEL；热休克蛋白GroES；铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)；外膜蛋白31(Omp31)；周质结合蛋白p39；外膜蛋白28(Omp28)；未脂质化的Omp16(U-Omp16)；未脂质化的Omp19(U-Omp19)。
第七方面，本发明提供如本发明第三方面所述多肽表位、如本发明第四方面所述多肽片段组合、如本发明第五方面所述融合蛋白、或如本发明第六方面所述多表位融合蛋白在制备抗体中的用途。
第八方面，本发明提供如本发明第三方面所述多肽表位、如本发明第四方面所述多肽片段组合、如本发明第五方面所述融合蛋白、或如本发明第六方面所述多表位融合蛋白在提高抗体亲和力和/或改善抗体特异性方面的用途。
第九方面，本发明提供一种制备抗SARS-CoV-2抗体与SARS-CoV-2抗原的抗原-抗体复合物晶体的方法，其特征在于将抗SARS-CoV-2抗体Fab段与重组SARS-CoV-2抗原在适合二者形成抗原-抗体复合物的条件下反应，对形成的抗原-抗体复合物进行纯化、结晶。
进一步，本发明所述制备抗SARS-CoV-2抗体与SARS-CoV-2抗原的抗原-抗体复合物晶体的方法，其特征在于：采用坐滴法结晶，在柠檬酸钠、PEG、尿素的条件下结晶。
进一步，本发明所述制备抗SARS-CoV-2抗体与SARS-CoV-2抗原的抗原-抗体复合物晶体的方法，其特征在于采用坐滴法，在0.2M柠檬酸钠、21％PEG3350、0.02M尿素的条件下结晶3天。
第十方面，本发明提供第九方面任一方法制备的抗SARS-CoV-2抗体与SARS-CoV-2抗原的抗原-抗体复合物晶体。
第十一方面，本发明提供一种多核苷酸，其编码如本发明第三方面所述多肽表位、如本发明第五方面所述融合蛋白、或如本发明第六方面所述多表位融合蛋白。
第十二方面，本发明提供一种载体，其包含本发明第十一方面所述的多核苷酸。
第十三方面，本发明提供一种宿主细胞，其包含本发明第十一方面所述的多核苷酸和/或本发明第十方面所述的载体。
第十四方面，本发明提供一种制备SARS-CoV-2 S蛋白多肽表位、表位-载体融合蛋白、或多表位融合蛋白的方法，其包括以下步骤：
(1)在适合表达重组外源蛋白的条件下培养本发明第十三方面所述宿主细胞；
(2)从细胞培养物中分离纯化SARS-CoV-2 S蛋白多肽表位、融合蛋白、或多表位融合蛋白。
第十五方面，本发明提供一种制备SARS-CoV-2 S蛋白多肽表位、表位-载体融合蛋白、或多表位融合蛋白的方法，其特征在于通过化学合成法制备，其中其中所述多肽表位如本发明第三方面任一所述，所述表位-载体融合蛋白如本发明第五方面任一所述，所述多表位融合蛋白如本发明第六方面所述。
进一步，本发明所述制备SARS-CoV-2 S蛋白多肽表位、表位-载体融合蛋白、或多表位融合蛋白的方法，其特征在于所述化学合成法包括固相合成、液相合成、以及固相-液相联合合成。
进一步，本发明所述制备SARS-CoV-2 S蛋白多肽表位、表位-载体融合蛋白、或多表位融合蛋白的方法，其特征在于所述化学合成法的合成策略包括由N端至C端依次合成、由C端至N端依次合成、分段合成等。
为更好理解本发明，首先定义一些术语。其他定义则贯穿具体实施方式部分而列出。
术语“冠状病毒”是指套式病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)的成员。本发明所述冠状病毒主要涉及感染人的冠状病毒，包括HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2(2019-nCov)，本发明所述冠状病毒特别涉及SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2(2019-nCov)。
术语“特异性”是指在蛋白和/或其他生物异质群体中确定是否存在所述蛋白，例如本发明所述单抗与SARS-CoV-2 RBD蛋白的结合反应。因此，在所指定的条件下，特定的配体/抗原与特定的受体/抗体结合，并且并不以显著的量与样本中存在的其它蛋白结合。
本文中的术语“抗体”意在包括全长抗体及其任何抗原结合片段(即，抗原结合部分)或单链。全长抗体是包含至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，重链和轻链由二硫键连接。各重链由重链可变区(简称VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域构成，即CH1、CH2和CH3。各轻链由轻链可变区(简称VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区还可以划分为称作互补决定区(CDR)的高变区，其由较为保守的框架区(FR)区分隔开。各VH和VL由三个CDR以及四个FR构成，从氨基端到羧基端以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的顺序排布。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括多种免疫系统细胞(例如，效应细胞)和传统补体系统的第一组分(C1q)。
术语“单克隆抗体”或“单抗”或“单克隆抗体组成”是指单一分子组成的抗体分子制品。单克隆抗体组成呈现出对于特定表位的单一结合特异性和亲和力。
本文中的术语，抗体的“抗原结合片段”(或简称为抗体部分)，是指抗体的保持有特异结合抗原能力的一个或多个片段。已证实，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实施。包含在抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的例子包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1构成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包含铰链区二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1构成的Fd片段；(iv)由抗体单臂VL和VH构成的Fv片段；(v)由VH构成的dAb片段(Ward et al.，(1989)Nature 341：544-546)；(vi)分离的互补决定区(CDR)；以及(vii)纳米抗体，一种包含单可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，它们可以通过重组法经由使两者成为单蛋白链的合成接头而连接，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fc(scFv)；参见例如Bird et al.，(1988)Science 242：423-426；and Huston et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。这些单链抗体也意在包括在术语涵义中。这些抗体片段可以通过本领域技术人员已知的常用技术而得到，且片段可以通过与完整抗体相同的方式进行功能筛选。
本发明的抗原结合片段包括能够特异性结合冠状病毒RBD的那些。抗体结合片段的实例包括例如但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、单链Fv(scFv)片段和单结构域片段。
Fab片段含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基末端处的少数残基的添加，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。通过切割在F(ab')2胃蛋白酶消化产物的铰链半胱氨酸处的二硫键产生Fab'片段。抗体片段的另外化学偶联是本领域普通技术人员已知的。Fab和F(ab')2片段缺乏完整抗体的片段可结晶(Fc)区，从动物的循环中更快速地清除，并且可能具有比完整抗体更少的非特异性组织结合(参见例如，Wahl等人，1983，J.Nucl.Med.24:316)。
如本领域通常理解的，“Fc”区是不包含抗原特异性结合区的抗体的片段可结晶恒定区。在IgG、IgA和IgD抗体同种型中，Fc区由两个相同的蛋白质片段组成，衍生自抗体的两条重链的第二和第三恒定结构域(分别为CH2和CH3结构域)。IgM和IgE Fc区在每条多肽链中含有三个重链恒定结构域(CH2、CH3和CH4结构域)。
“Fv”片段是含有完整靶识别和结合位点的抗体的最小片段。该区域由以紧密的非共价结合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体(VH-VL二聚体)组成。在该构型中，每个可变结构域的三个CDR相互作用，以限定在VH-VL二聚体的表面上的靶结合位点。通常，六个CDR对抗体赋予靶结合特异性。然而，在一些情况下，甚至单个可变结构域(或仅包含对于靶特异性的三个CDR的Fv的一半)可以具有识别且结合靶的能力，尽管其亲和力低于整个结合位点。
“单链Fv”或“scFv”抗体结合片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单条多肽链中。一般地，Fv多肽进一步包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，其致使scFv能够形成有利于靶结合的结构。
“单结构域片段”由对冠状病毒RBD显示出足够亲和力的单个VH或VL结构域组成。在一个具体实施方案中，单结构域片段是骆驼化的(参见例如，Riechmann，1999，JournalofImmunological Methods 231:25–38)。
本发明的抗冠状病毒RBD的抗体包括衍生化抗体。例如，衍生化抗体通常通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/封闭基团的衍生化、蛋白酶解切割、与细胞配体或其它蛋白质的连接来修饰。可以通过已知技术进行众多化学修饰中的任一种，所述技术包括但不限于特定的化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。另外，衍生物可以含有一种或多种非天然氨基酸，例如，使用ambrx技术(参见例如，Wolfson，2006，Chem.Biol.13(10):1011-2)。
“人源抗体”包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并且包括从人免疫球蛋白文库或动物中分离的抗体，所述动物对于一种或多种人免疫球蛋白是转基因的，并且不表达内源免疫球蛋白。人抗体可以通过本领域已知的各种方法制备，所述方法包括使用衍生自人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示方法。参见美国专利号4,444,887和4,716,111；以及PCT公开WO 98/46645；WO 98/50433；WO 98/24893；WO 98/16654；WO 96/34096；WO96/33735；和WO 91/10741。还可以使用不能表达功能性内源免疫球蛋白，但可以表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠来产生人抗体。参见例如，PCT公开WO 98/24893；WO92/01047；WO 96/34096；WO 96/33735；美国专利号5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771；和5,939,598。另外，使用与上述类似的技术，公司例如LakePharma，Inc.(Belmont，CA)或Creative BioLabs(Shirley，NY)可以从事于提供针对所选抗原的人抗体。可以使用被称为“引导选择”的技术生成识别所选表位的全人抗体。在该方法中，选择的非人单克隆抗体，例如小鼠抗体，用于引导识别相同表位的完全人抗体的选择(参见，Jespers等人，1988，Biotechnology 12:899-903)。
术语“识别抗原的抗体”以及“对抗原特异的抗体”在本文中与术语“特异结合抗原的抗体”交替使用。
术语“高亲和性”对于IgG抗体而言，是指对于抗原的KD为1.0x10-6M以下，优选5.0x10-8M以下，更优选1.0x10-8M以下、5.0x10-9M以下，更优选1.0x10-9M以下。对于其他抗体亚型，“高亲和性”结合可能会变化。例如，IgM亚型的“高亲和性”结合是指KD为10-6M以下，优选10-7M以下，更优选10-8M以下。
术语“Kassoc”或“Ka”是指特定抗体-抗原相互作用的结合速率，而术语“Kdis”或“Kd”是指特定抗体-抗原相互作用的离解速率。术语“KD”是指解离常数，由Kd与Ka比(Kd/Ka)得到，并以摩尔浓度(M)表示。抗体的KD值可以通过领域内已知的方法确定。优选的确定抗体KD的方式是使用表面等离子共振仪(SPR)测得的，优选使用生物传感系统例如BiacoreTM系统测得。
术语“EC50”，又叫半最大效应浓度，是指引起50％最大效应的抗体浓度。
术语“表位”包括能够与免疫球蛋白或T细胞受体特异性结合的任何多肽决定簇。术语“抗原决定簇”和“表位”可互换使用。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子例如氨基酸、糖侧链、磷酰基、或磺酰基的化学活性表面定组(grouping)，且在某些实施方案中，可以具有具体三维结构特征、和/或具体电荷特征。表位是由抗体结合的抗原区域。在某些实施方案中，当抗体在蛋白和/或大分子复杂混合物中优先识别其靶抗原时，它被说成特异性结合抗原。表位包括构象表位和线性表位。
“构象表位”是包括抗原的氨基酸序列的不连续部分的表位。抗体基于抗原的3维表面特征、形状或三级结构结合构象表位。
“线性表位”是由来自抗原的氨基酸的连续序列形成的表位。线性表位通常包括约5至约10个连续氨基酸残基。抗体基于抗原的一级序列结合线性表位。
术语“功能变体”是指包含与亲代结合分子的核苷酸和/或氨基酸序列相比改变了一或多个核苷酸和/或氨基酸的核苷酸序列和/或氨基酸序列但仍能竞争性结合亲代结合分子的结合配偶体例如SARS-CoV-2的结合分子。换句话说，亲代结合分子的氨基酸和/或核苷酸序列中的修饰不显著影响或改变由所述核苷酸序列编码的或含有所述氨基酸序列的结合分子的结合特性，即所述结合分子仍能识别并结合其靶位。所述功能变体可具有保守的序列修饰，包括核苷酸和氨基酸取代、添加和缺失。这些修饰可以通过本领域已知的标准技术导入，例如定点诱变和随机PCR介导的诱变，并且可以包含天然以及非天然核苷酸和氨基酸。
保守的氨基酸取代包括氨基酸残基由具有相似结构或化学性质的氨基酸残基置换。本领域已经明确了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支的侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。本领域技术人员清楚也可以应用除了上述之外的其它氨基酸残基家族分类。另外，变体可具有非保守的氨基酸取代，例如将氨基酸残基用具有不同结构或化学性质的氨基酸残基置换。相似的小变化也可以包括氨基酸缺失或插入或者这两者。确定氨基酸残基可以被取代、插入、或缺失而不消除其免疫学活性的指导可以使用本领域熟知的计算机程序发现。
核苷酸序列中的突变可以是在基因座产生的单一改变(点突变)，如转换或颠换突变，或者可以在一个单基因座插入、缺失或改变多个核苷酸。另外，可以在核苷酸序列内的任意数目的基因座中产生一或多个改变。突变可以通过本领域已知的合适方法进行。
术语“同源性”，也称为“同一性”，如果两条待相互比较的序列在长度上有区别，序列同一性优选的指与较长序列核苷酸残基相同的较短序列的核苷酸残基百分数。序列同一性可以通过使用诸如Bestfit程序(Wisconsin序列分析包，版本8，Unix，GeneticsComputer Group，University Research Park，575 Science Drive Madison，WI 53711)的计算机程序照惯例测定。Bestfit利用Smith和Waterman，Advances in AppliedMathematics 2(1981)，482-489的局部同源算法，目的是找出两个序列之间具有最高序列同一性的部分。当使用Bestfit或其它的序列比对程序以确定特定的序列是否与本发明的参考序列具有例如95％的序列同一性时，优选的如此设置参数以使得序列同一性百分比是对于参考序列的全长计算并且允许高达参考序列中核苷酸总数的5％的同源性缺口。当使用Bestfit时，所谓的任选的参数优选地设在它们的预定(“缺省”)值。出现在给定序列和以上所描述的本发明的序列之间的比较中的偏差可能由例如添加、缺失、替换、插入或重组所导致。这类序列比较也可以优选的用程序“fasta20u66”(2.0u66版本，1998年9月，WilliamR.Pearson和the University of Virginia；也参见W.R.Pearson(1990)，Methods inEnzymology 183，63-98，所附的实例和http://workbench.sdsc.edu/)。为此目的，可以使用“缺省”参数设置。
术语“载体”是指抗原肽或表位构建体能够掺入到其中或与之相结合的结构，由此向人或动物的免疫系统呈递或暴露抗原肽或肽的部分。术语“载体”还包括递药方法，其中含有抗原肽或表位的抗原构建体可以通过递药机制运输到期望位点。这样的递药系统的一个实例利用胶态金属如胶体金。
此外，术语“载体”还包括本领域技术人员公知的递药机制，包括但不限于钥孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)和其它佐剂。还应当理解本发明含有表位的抗原构建体组合物能进一步包含佐剂、防腐剂、稀释剂、乳化剂、稳定剂和现有技术已知的用于疫苗中的其它组分。本领域已知的任何佐剂系统能用于本发明的组合物。弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂、多分散β-(1，4)连接的乙酰化甘露聚糖(“Acemannan”)、TITERMAX(CytRx公司的聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物佐剂)、Chiron公司的修饰脂质佐剂，Cambridge Biotech的皂角苷衍生物佐剂、杀死的百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、革兰氏阴性细菌的脂多糖(LPS)、大分子多聚阴离子如右旋糖苷硫酸盐以及无机凝胶如明矾、氢氧化铝或磷酸铝。
能用于本发明含有表位的抗原构建体组合物的载体蛋白包括但不限于：麦芽糖结合蛋白“MBP”；牛血清白蛋白(BSA)；钥孔血蓝蛋白(KLH)；卵清蛋白；鞭毛蛋白；甲状腺球蛋白；任何物种的血清白蛋白；任何物种的γ球蛋白；同系细胞；携带Ia抗原的同系细胞；以及D氨基酸和/或L氨基酸的聚合物。
载体可以是蛋白质，例如破伤风类毒素或解毒的白喉毒素，或蛋白质，例如牛血清白蛋白(BSA)。载体可以是荧光分子、惰性两亲聚合物、或固体材料实体，例如表面或珠子。载体可以是布鲁氏菌蛋白质，即天然存在于布鲁氏菌生物体中并且通过天然或重组方式产生的蛋白质。合适的蛋白质包括，例如：二氧四氢喋啶合酶、L7/L12核糖体蛋白、GroEL(热休克蛋白)、GroES(热休克蛋白)，MBP(麦芽糖结合蛋白)、Cu-Zn SOD(铜-锌超氧化物歧化酶)Omp31(外膜蛋白31)、p39(周质结合蛋白)、bp26(也称为Omp28)，、U-Omp16(未脂质化的Omp16)、U-Omp19(未脂质化的Omp19)。载体可以是如下所述的疫苗载体实体。
术语“接头”指能够形成连接两个或更多个分子或者同一分子的两个或更多个位点的共价化学键或桥的化合物。理想的接头包括，例如戊二醛或通式OHC-R-CHO的其他二醛，其中R是1-12个碳原子的线性或分支的二价亚烷基，1-12个原子的线性或分支的二价杂烷基，2-12个碳原子的线性或分支的二价亚烯基(alkenylene)，2-12个碳原子的线性或分支的二价亚炔基(alkynylene)，5-10个碳原子的二价芳基基团，3-10个原子的环体系，-(CH2CH2O)qCH2CH2-，其中q是1-4，或者连接两个醛基团的直接的化学键。连接可以是直接的而不使用连接(桥接)分子。例如，可使用碳二亚胺化学物或使用酶促催化游离氨基酸与甲酰胺基团(例如Gln的甲酰胺基团)交联的转谷氨酰胺酶，使羧基(例如在载体蛋白的Asp或Glu残基的侧链上的羧基)，直接与游离氨基酸(例如在Lys残基的侧链上的游离氨基酸)相连。
术语“双功能接头”意指具有两个功能性基团的化合物，各功能性基团单独地能够与想要被连在一起的两个分开的分子、原子或分子集上的反应性基团形成共价键。示例性的双功能接头描述于，例如G.T.Hermanson,Bioconjugate Techniques(Academic Press,1996)以及Dick and Beurret,"Glycoconj ugates of Bacterial CarbohydrateAntigens,"在Conjugate Vaccines(Cruse and Lewis编著),Contrib.Microbiol.Immunol.Basel,Karger,1989,vol.10,pp.48-114)。理想地，双功能接头是戊二醛、双磺琥珀酰亚胺辛二酸酯或二甲基己二酸(dimethyl adipimidate)。
术语“肽接头”，在本发明所公开中可互换地使用并且是指一种肽具有天然或合成的氨基酸残基用于连接两个多肽(polypeptides)。例如，该肽接头可以用于连接表位与载体蛋白；或将多个表位连接，以形成本发明的一种免疫原。较佳地，该连接是一具有至少5个氨基酸残基长度的肽，例如5至100个氨基酸残基的长度，更佳地，10至30个氨基酸残基的长度。本发明的肽接头是一至少5个氨基酸残基长度的肽，较佳地为15至20个氨基酸残基的长度的肽。在一个实施例中，所述肽接头包含(GnS)m的序列，其中G＝甘氨酸(glycine)，S＝丝氨酸(serine)，n为1到4之间的数字，和m为1，2或3。较佳地，该接头包含(G4S)3的序列；或(G3S)及(G3S2)的序列。在一个实施方式中，所述柔性多肽接头为甘氨酸/丝氨酸接头，并且包括氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)n或(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中n是等于或大于1的正整数。例如n＝1、n＝2、n＝3、n＝4、n＝5、n＝6、n＝7、n＝8、n＝9和n＝10。在一个实施方式中，柔性多肽接头包括但不限于(Gly4Ser)4或(Gly4Ser)3。在另一个实施方式中，接头包括(GlyxSer)n的多个重复，其中x＝1、2、3、4或5并且n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，例如(GlySer)、(Gly2Ser)或(Gly5Ser)的多个重复。也包括在本发明的范围内的是WO2012/138475中描述的接头，其通过引用结合于此。
术语“宿主”是指其中已经导入载体如克隆载体或表达载体的生物体或细胞。所述生物体或细胞可以是原核或真核生物体或细胞。应理解这个术语不仅是指特定对象生物体或细胞，也是指这种生物体或细胞的后代。由于突变或环境影响导致在后续的世代中可以发生某些修饰，因此这种后代实际上与亲代生物体或细胞不相同，但仍包括在本文所用术语“宿主”范围内。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优点：
本研究通过抗原-抗体复合物结晶的方法，对靶向新型冠状病毒SARS-CoV-2棘突蛋白S1亚基受体结合区域(S1RBD)的全人源重组抗体MW01(8B4；制备方法和筛选过程如申请号CN202010178099.X，该申请全文以引用的方式纳入)、MW05(制备方法和筛选过程如申请号CN202010298015.6，该申请全文以引用的方式纳入)、MW06(制备方法和筛选过程如申请号CN202010298015.6，该申请全文以引用的方式纳入)和MW07(制备方法和筛选过程如申请号CN202010302415.X，该申请全文以引用的方式纳入)与SARS-CoV-2 S1RBD抗原结合的表位进行了深入分析。通过晶体复合物结构的X射线衍射及数据分析，分别获得了MW01、MW06、MW05和MW07的Fab形式重组蛋白MW01-Fab、MW05-Fab、MW06-Fab和MW07-Fab与SARS-CoV-2 S1RBD结合的相互作用信息，确认了抗体与SARS-CoV-2 S1RBD结合的主要区域、关键抗原结合位点以及抗体参与结合的关键氨基酸残基信息。
MW01-Fab参与SARS-CoV-2 S1RBD结合的主要是LCDR3和HCDR1、HCDR2和HCDR3。相互作用的氨基酸情况如下表1所示。与ACE2的表位对比分析发现，MW01与SpikeRBD的结合表面与hACE2结合表位(表5)有重叠，MW01的结合应可阻断Spike与hACE2的结合。其集中表位区段包括：446-456aa和481-494aa两个线性表位肽区域。
MW05-Fab重链的3个CDR区和轻链的LCDR2、LCDR3都参与了结合。相互作用的氨基酸情况如下表4所示。其集中表位区段包括：表位肽444-456aa和483-494aa两个区域。表位对比分析发现，MW05的识别表位与hACE2结合区域明显重合，提示MW05可阻断Spike蛋白与hACE2的结合(表5)。
MW06-Fab参与SARS-CoV-2 S1RBD结合的主要包括LCDR1、LCDR2和LCDR3以及HCDR3。相互作用的氨基酸情况如下表3所示。其集中表位区段包括：表位肽369-385aa、404-408aa、437-440aa以及499-508aa几个区域。表位对比分析发现，其大部分区域与ACE2的结合表位不重叠，仅499-508aa区域与ACE2的结合区域重合(表5)，提示该区域是其发挥阻断作用的主要区域。
MW07-Fab参与SARS-CoV-2 S1RBD结合的主要包括LCDR1、LCDR2和LCDR3；HCDR1、HCDR2和HCDR3。相互作用的氨基酸情况如下表2所示。其集中表位区段包括：表位肽403-421aa、449-460aa、473-477aa、484-489aa和493-505aa几个线性区域。表位对比发现，其中涵盖大量与ACE2结合重叠的区域(表5)。证明MW07的结合应可阻断Spike与hACE2的结合。
本研究还发现，MW01和MW05两者结合表位极为相似，均既可结合处于close状态的Spike蛋白三聚体，也可结合处于open状态的Spike蛋白三聚体；一个处于close状态的Spike蛋白三聚体可同时结合3个MW01-FAB或MW05-Fab分子；一个处于open状态的Spike蛋白三聚体可同时结合2个MW01-FAB或MW05-FAB。提示两个抗体的表位具有独特性，在结合Spike蛋白时能够实现多价结合。推测为MW01和MW05强中和活性的表位基础。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：
图1：纯化重组SARS-CoV-2 S1蛋白RBD的SDS-PAGE(12％)分析。
图2：纯化重组SARS-CoV-2 S1蛋白RBD的HPLC分析。
其中，保留时间19.204min的峰峰高为2462，面积为95534、面积百分比为2.37％；保留时间20.549min的峰峰高为2462，面积为3930023、面积百分比为97.63％。
图3：重组MW01-Fab的SDS-PAGE(12％)分析。
图4：重组MW01-Fab的HPLC分析。
其中，保留时间18.567min的峰峰高为465，面积为18609、面积百分比为0.51％；保留时间21.154min的峰峰高为111617，面积为3617036、面积百分比为99.49％。
图5：重组MW05-Fab的SDS-PAGE(12％)分析。
图6：重组MW05-Fab的HPLC分析。
其中，保留时间18.429min的峰峰高为57，面积为4316、面积百分比为0.11％；保留时间22.442min的峰峰高为70750，面积为4084861、面积百分比为99.89％。
图7：重组MW06-Fab的SDS-PAGE(12％)分析。
图8：重组MW06-Fab的HPLC分析。
其中，保留时间20.114min的峰峰高为-176，面积为7130、面积百分比为0.16％；保留时间21.398min的峰峰高为163937，面积为4484046、面积百分比为99.84％。
图9：重组MW07-Fab的SDS-PAGE(12％)分析。
图10：重组MW07-Fab的HPLC分析。
其中，保留时间19.923min的峰峰高为-42，面积为831、面积百分比为0.02％；保留时间21.275min的峰峰高为170553，面积为4674235、面积百分比为98.45％；保留时间22.161min的峰峰高为2320，面积为72763、面积百分比为22.161％。
图11：SARS-CoV-2 S1RBD，MW01-Fab及其复合物的SDS-PAGE分析。
图12：SARS-CoV-2 S1RBD，MW01-Fab及其复合物的HPLC分析。
图13：SARS-CoV-2 S1RBD，MW05-Fab及其复合物的SDS-PAGE分析。
图14：SARS-CoV-2 S1RBD，MW05-Fab及其复合物的HPLC分析。
图15：SARS-CoV-2 S1RBD，MW06-Fab及其复合物的SDS-PAGE分析。
图16：SARS-CoV-2 S1RBD，MW06-Fab及其复合物的HPLC分析。
图17：SARS-CoV-2 S1RBD，MW07-Fab及其复合物的SDS-PAGE分析。
图18：SARS-CoV-2 S1RBD，MW07-Fab及其复合物的HPLC分析。
图19：MW05抗原抗体复合物晶体照片。
图20：MW05 FAB-SpikeRBD复合物整体结构。
图21：MW05与SpikeRBD相互作用的位点。
(A)MW05 H链N端和CDR1与SpikeRBD的相互作用；(B)H链CDR2与SpikeRBD的相互作用；(C)H链CDR3与SpikeRBD的相互作用；(D)L链CDR2与SpikeRBD的相互作用；(E)L链CDR3与SpikeRBD的相互作用。图中墨绿色和浅绿色分别代表MW05的H链和L链，灰色代表SpikeRBD，参与相互作用的残基以棍棒模型显示，氢键和盐桥用蓝色虚线标出。
图22：一个close状态的Spike三聚体可同时结合3个MW05 FAB。
通过将MW05 FAB-SpikeRBD复合物中的SpikeRBD与close状态的Spike三聚体(PDBcode：6VXX)中的三个SpikeRBD叠合获得。图中墨绿色和淡绿色分别为MW05 FAB的H链和L链，Spike三聚体的三个亚基分别用淡粉色、淡黄色和淡蓝灰色表示。可以看出Spike三聚体同时结合三个MW05 FAB时，三个MW05 FAB之间以及其与Spike三聚体之间不产生碰撞。
图23：MW05 FAB可以结合open状态Spike三聚体中处于open构象的RBD。
通过将open状态的Spike三聚体(PDB code：6VYB)中的处于open状态SpikeRBD与MW05-SpikeRBD复合物中的SpikeRBD叠合获得。图中墨绿色和淡绿色分别为MW05 FAB的H链和L链，Spike三聚体的三个亚基分别用淡粉色、淡黄色和淡蓝灰色表示，用来建立MW05 FAB结合模型的SpikeRBD用红色表示。可以看出MW05 FAB结合Spike三聚体中处于open状态的RBD后，不与Spike三聚体产生碰撞。
图24：MW05 FAB可以结合open状态Spike三聚体中一个处于close构象的RBD。
通过将MW05 FAB-SpikeRBD复合物中的SpikeRBD与open状态的Spike三聚体(PDBcode：6VYB)中的两个处于close状态SpikeRBD叠合获得。图中墨绿色和淡绿色分别为MW05FAB的H链和L链，Spike三聚体的三个亚基分别用淡粉色、淡黄色和淡蓝灰色表示。可以看出MW05 FAB结合Spike三聚体中一个处于close构象的RBD后，不与Spike三聚体产生碰撞；而结合另一个处于close构象的RBD后会与处于open构象的RBD产生碰撞，碰撞之处用红色虚线圈出。
图25：一个open状态的Spike三聚体可同时结合2个MW05 FAB。
通过将MW05 FAB-SpikeRBD复合物中的SpikeRBD与open状态的Spike三聚体(PDBcode：6VYB)中处于open构象的SpikeRBD和一个处于close构象的SpikeRBD叠合获得。图中墨绿色和淡绿色分别为MW05 FAB的H链和L链，Spike三聚体的三个亚基分别用淡粉色、淡黄色和淡蓝灰色表示。可以看出2个MW05 FAB分别结合处于open构象的RBD和一个处于close构象的RBD时不产生碰撞。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
实施例1重组抗原和抗体制备
1.S1RBD的制备
将SARS-CoV-2 S1RBD(QHD43416.1，319-533aa)基因克隆至N端带有His tag的真核表达载体中，构建好N端带有His标签的S1RBD真核表达质粒(重组RBD-His的序列如SEQID NO:23所示)。将质粒通过转染试剂293fectin(Life Technologies，12347-019，1977248)，转入HEK293细胞中，进行瞬时表达，4天后收集上清，采用HisTrap HP亲和层析柱(GE,17-5248-01)对表达上清进行纯化，随后通过超滤浓缩管超滤，将缓冲液置换为PBS，获得SARS-CoV-2 S1RBD抗原的重组蛋白纯品，并经SDS-PAGE及HPLC分析纯度，结果如图1所示。
2.MW01、MW06和MW07-Fab的制备
MW01-Fab，MW06-Fab，MW07-Fab为HEK293细胞瞬时表达样品，经Protein G亲和层析纯化所得，为北京科诺信诚科技有限公司生产。具体为，将MW01-VH、MW06-VH、MW07-VH通过酶切连接克隆入真核表达载体pKN045的人IgG1-CH1的重链恒定区编码基因的上游，将MW01-VL、MW06-VL、MW07-VL通过酶切连接克隆入真核表达载体pKN019的人轻链Cκ的编码基因的上游，构建MW01-Fab，MW06-Fab，MW07-Fab表达载体，并通过转染试剂293fectin(Cat:12347019，Life Technologies)，共转入HEK293细胞中，进行瞬时表达，4天后收集上清，采用Protein G亲和层析柱(Cat:17-0404,GE Healthcare)，对表达上清纯化，随后通过超滤浓缩管(Cat:VS0122,Sartorius Stedim)超滤，将缓冲液置换为PBS，获得MW01-Fab，MW06-Fab，MW07-Fab抗体的重组蛋白纯品，并经SDS-PAGE及HPLC分析纯度。结果如图2、图4和图5所示。
3.MW05-Fab的制备
将MW05-VH通过酶切连接克隆入真核表达载体pKN045的人IgG1-CH1的重链恒定区编码基因的上游，将MW05-VL通过酶切连接克隆入真核表达载体pKN035的人轻链Cλ的编码基因的上游，构建MW05-Fab表达载体，并通过转染试剂293fectin，共转入HEK293细胞中，进行瞬时表达，4天后收集上清，采用AF-rProtein L 650F亲和层析柱(TOSOH,0023486)对表达上清纯化，随后通过超滤浓缩管超滤，将缓冲液置换为PBS，获得MW05-Fab抗体的重组蛋白纯品，并经SDS-PAGE及HPLC分析纯度，结果如图3所示。
实施例2抗原-抗体复合物制备及分析
1.MW01-Fab抗原抗体复合物制备
将N端His标签SARS-CoV-2 S1RBD及MW01-Fab在20mM Tris 150mM NaCl溶液中，按SARS-CoV-2 S1RBD：MW01-Fab为0.9:1比例混合，室温放置2h，使得MW01-Fab充分结合，通过超滤浓缩管(Cat:VS2002,Sartorius Stedim)超滤，浓缩至20mg/ml，0.3ml，并进行SEC-HPLC及SDS-PAGE检测；根据结果显示，该抗原-抗体复合物保留时间低于SARS-CoV-2 S1RBD和MW01-Fab，主峰为单一峰，提示该复合物样品符合结晶实验的要求(图6)。
2.MW05-Fab抗原抗体复合物制备
将SARS-CoV-2 S1RBD及MW05-Fab在20mM Tris 150mM NaCl溶液中，按照摩尔比SARS-CoV-2 S1RBD：MW05-Fab＝1:2.5比例进行混合，室温放置2h后，采用HisTrap HP亲和层析柱进行纯化，得到SARS-CoV-2 S1RBD/MW05-Fab复合物，随后通过超滤浓缩管超滤浓缩后，SEC-HPLC及SDS-PAGE检测抗原-抗体复合物质量后，纯化获得的抗原-抗体复合物的超滤浓缩至23mg/ml，用于晶体制备。结果显示，该抗原-抗体复合物组成成份SARS-CoV-2S1RBD和MW05-Fab(图7左)，SDS-PAGE上复合物的保留时间低于SARS-CoV-2 S1RBDh和MW05-Fab，主峰为单一峰(图7右)。
3.MW06-Fab抗原抗体复合物制备
将SARS-CoV-2 S1RBD及MW06-Fab在20mM Tris 150mM NaCl溶液中，根据二者的摩尔比，选择SARS-CoV-2 S1RBD：MW06-Fab为1.15:1比例混合，室温放置2h，使得MW06-Fab充分结合，通过超滤浓缩管(Cat:VS2002,Sartorius Stedim)超滤，浓缩至22mg/ml，0.3ml，并进行SEC-HPLC及SDS-PAGE检测；根据结果显示，该抗原-抗体复合物保留时间低于SARS-CoV-2 S1RBD和MW06-Fab，主峰为单一峰，提示该复合物样品符合结晶实验的要求。(图8)
4.MW07-Fab抗原抗体复合物制备
将SARS-CoV-2 S1RBD及MW07-Fab在20mM Tris 150mM NaCl溶液中，根据二者的摩尔比，选择SARS-CoV-2 S1RBD：MW07-Fab为1.1:1比例混合，室温放置2h，使得MW07-Fab充分结合，通过超滤浓缩管(Cat:VS2002,Sartorius Stedim)超滤，浓缩至20mg/ml，0.35ml，并进行SEC-HPLC及SDS-PAGE检测；根据结果显示，该抗原-抗体复合物保留时间低于SARS-CoV-2 S1RBD和MW07-Fab，主峰为单一峰，提示该复合物样品符合结晶实验的要求。(图9)
实施例3 MW05抗原抗体晶体制备与衍射数据收集和结构解析
1.晶体指标与衍射
MW05抗原抗体复合物晶体生长采用HAMPTON公司Crystal Screen1、CrystalScreen2、Index、PEGRx1、PEGRx2、和Emerald Biosystems公司WIZARDⅠ/Ⅱ试剂盒。采用坐滴法，在0.2M柠檬酸钠,21％PEG3350,0.02M尿素的条件下，结晶3天，最终获得了衍射较好的晶体，如图10所示。对该晶体在上海同步辐射光源收集了分辨率
Figure BDA0003251362350000221
的衍射数据，使用PHASER软件，以MW317-PD1复合物结构(PDB ID：6JJP)中的MW317 FAB以及covid-19SpikeRBD-hACE2复合物结构(PDB ID：6LZG)中的spike蛋白RBD为分子置换模型，采用分子置换法解析了MW05的复合物结构。
2.MW05参与S1RBD结合的关键氨基酸分析
解析的晶体结构中包含一个SpikeRBD分子和一个MW05 FAB，MW05 FAB可变区与SpikeRBD相互作用，见图11。SpikeRBD与抗体FAB结合的包埋面积(为相互作用面积的两倍)约为
Figure BDA0003251362350000222
其中重链贡献
Figure BDA0003251362350000223
轻链贡献
Figure BDA0003251362350000224
分析结果发现，MW05 FAB通过重链的3个CDR区和轻链的CDR2，CDR3结合在SpikeRBD上和ACE2结合密切相关的两个Loop区，具体相互作用的氨基酸残基见图12、表1。分析结果发现，MW05 FAB通过重链的3个CDR区和轻链的CDR2，CDR3结合在SpikeRBD上和ACE2结合密切相关的两个Loop区。而关键氨基酸包括H-32Y、H-55F、H-106G、H-107Y等，尤其是CDR3区多个氨基酸均为直接结合氨基酸；轻链L49Y、L56T、L94W和L97W为直接结合氨基酸。上述氨基酸决定了MW05与S1RBD结合的亲和力和阻断活性，在此基础上优化的抗体突变体也应在本专利保护范围内。
表1.MW05 FAB-SpikeRBD相互作用的残基
Figure BDA0003251362350000231
Figure BDA0003251362350000241
注：HB：氢键；SB：盐桥；VDW：范德华力(含疏水相互作用)。
3.MW05与ACE2结合表位比较
根据王齐辉[Wang QH，et al.Structural and functional basis of SARS-CoV-2 entry by using human ACE2,Cell,2020 May 14；181(4):894-904.e9.]等人发表SARS-CoV-2和ACE2结构的文章提供的复合物信息，通过对比分析，发现MW05的结合表位与hACE2结合区域大范围重合(表5)，提示MW05可阻断Spike蛋白与hACE2的结合。从结合表位看，MW05的结合表位集中在表位肽444-456aa和483-494aa两个区域。
4.MW05与close状态和open状态全长Spike蛋白三聚体结构对比分析
进一步通过将MW05 FAB-SpikeRBD复合物中的SpikeRBD与close状态的Spike三聚体(PDB code：6VXX)中的三个SpikeRBD叠合发现(图13)，发现close状态的Spike蛋白三聚体可同时结合3个MW05Fab，而不发生碰撞；通过与open状态全长Spike蛋白三聚体的结构比较，发现MW05 FAB可结合Spike蛋白三聚体处于open构象的RBD(见图14)，MW05 FAB也可结合open状态Spike三聚体中一个处于close构象的RBD，而结合另一个时存在位阻(见图15)。一个处于open状态的Spike三聚体可同时结合2个MW05 FAB，其中一个结合open构象RBD，一个结合close构象RBD(见图16)。而这种多价，多结构的结合模式，在靶点RBD的抗体中首次被发现。提示其可能是MW05的强中和活性的结构基础。
实施例4 MW01、MW06和MW07抗原抗体晶体复合物结构解析
采用实施例3类似方法制备了MW01、MW06和MW07的晶体复合物，分别收集到2.4、3.3、
Figure BDA0003251362350000251
的X-ray衍射数据，并采用分子置换法解析了复合物结构。
MW01与SpikeRBD的相互作用情况见表2，可以看出，MW01-Fab参与SARS-CoV-2S1RBD结合的主要是LCDR3和HCDR1、HCDR2和HCDR3。相互作用的氨基酸情况如下表1所示。与ACE2的表位对比分析发现，MW01与SpikeRBD的结合表面与hACE2结合表位(表5)有重叠，MW01的结合应可阻断Spike与hACE2的结合。其集中表位区段包括：446-456aa和481-494aa两个线性表位肽区域。
MW06与SpikeRBD的相互作用情况见表3，MW06-Fab参与SARS-CoV-2 S1RBD结合的主要包括LCDR1、LCDR2和LCDR3以及HCDR3。相互作用的氨基酸情况如下表3所示。其集中表位区段包括：表位肽369-385aa、404-408aa、437-440aa以及499-508aa几个区域。表位对比分析发现，其大部分区域与ACE2的结合表位不重叠，仅499-508aa区域与ACE2的结合区域重合(表5)，提示该区域是其发挥阻断作用的主要区域。
MW07与SpikeRBD的相互作用情况见表4。MW07-Fab参与SARS-CoV-2 S1RBD结合的主要包括LCDR1、LCDR2和LCDR3；HCDR1、HCDR2和HCDR3。相互作用的氨基酸情况如下表2所示。其集中表位区段包括：表位肽403-421aa、449-460aa、473-477aa、484-489aa和493-505aa几个线性区域。表位对比发现，其中涵盖大量与ACE2结合重叠的区域(表5)。证明MW07的结合应可阻断Spike与hACE2的结合。
表2.MW01与SpikeRBD的相互作用
Figure BDA0003251362350000252
Figure BDA0003251362350000261
HB：氢键；SB：盐桥；VDW：范德华力(包括疏水相互作用)
表3.MW06与SpikeRBD的相互作用
Figure BDA0003251362350000262
Figure BDA0003251362350000271
HB：氢键；SB：盐桥；VDW：范德华力(包括疏水相互作用)
表4.MW07与SpikeRBD的相互作用
Figure BDA0003251362350000281
Figure BDA0003251362350000291
HB：氢键；SB：盐桥；VDW：范德华力(包括疏水相互作用)
表5.MW01、MW05、MW06、MW07和ACE2结合SpikeRBD的关键作用位点
Figure BDA0003251362350000292
Figure BDA0003251362350000301
实施例5 MW05、MW01与不同S1RBD突变体的结合活性分析
对上述S1RBD中与MW05相互作用的部分关键氨基酸位点进行突变，并进一步分析MW05的结合活性。具体地，在SARS-CoV-2 Spike RBD：S1RBD(319-533)-His的基础上对8个位点进行突变，Y449A、L452A、V483A、E484A、F486A、Y489A、F490A和Q493A的突变，并在HEK293中重组表达，经纯化后，检测其与9MW3311-MW05的结合。结果如下表所示，与野生型相比，MW05与突变后氨基酸结合活性均不同程度降低，其中Y449A、L452A、Y489A降低10-50倍，而E484A和F490A降低达到100倍以上。分析发现亲和力下降明显突变体位点与MW05的CDR区多个氨基酸存在相互作用。表位相似抗体MW01亲和力变化较大的位点Y449A和E484A与MW05趋势相似，而其他位点则亲和力变化不大，另一对照抗体MW06的亲和力整体变化不大，提示上述关键氨基酸位点为MW05结合的关键氨基酸残基。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 迈威（上海）生物科技股份有限公司
<120> SARS-CoV-2 S蛋白RBD区中和表位肽及其应用
<150> CN 202010945544.0
<151> 2020-09-10
<160> 23
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Phe
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Ser Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Arg Ile Ile Pro Val Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Glu Val
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
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Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
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Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Trp Leu Thr
85 90 95
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Gly Arg Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ser Ser Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> PRT
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His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785 790 795 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
805 810 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820 825 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
900 905 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
915 920 925
Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
930 935 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945 950 955 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
980 985 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
995 1000 1005
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu
1010 1015 1020
Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val
1025 1030 1035 1040
Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala
1045 1050 1055
Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu
1060 1065 1070
Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His
1075 1080 1085
Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val
1090 1095 1100
Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr
1105 1110 1115 1120
Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr
1125 1130 1135
Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu
1140 1145 1150
Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp
1155 1160 1165
Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp
1170 1175 1180
Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu
1185 1190 1195 1200
Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile
1205 1210 1215
Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile
1220 1225 1230
Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys
1235 1240 1245
Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val
1250 1255 1260
Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
1265 1270
<210> 23
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
His His His His His His Ala Ser Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile
1 5 10 15
Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe
20 25 30
Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile
35 40 45
Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe
50 55 60
Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu
65 70 75 80
Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu
85 90 95
Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn
100 105 110
Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser
115 120 125
Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg
130 135 140
Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr
145 150 155 160
Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe
165 170 175
Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly
180 185 190
Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu
195 200 205
His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu
210 215 220

Claims (41)

1.一种获得SARS-CoV-2B细胞表位的方法，包括以下步骤：
(1)获得抗SARS-CoV-2抗体；
(2)制备抗SARS-CoV-2抗体Fab段；
(3)将步骤(2)制备的抗SARS-CoV-2抗体Fab段与重组SARS-CoV-2抗原在适合二者形成抗原-抗体复合物的条件下反应；
(4)对步骤(3)形成的抗原-抗体复合物进行纯化、结晶、X-射线晶体衍射分析；
(5)利用数据库中抗原、抗体的X-射线晶体三维结构图为模型，解析步骤(4)中的抗原-抗体复合物结构；
(6)根据步骤(5)中抗原-抗体复合物结构的解析结果，确定SARS-CoV-2抗原上与中和抗体相互作用的氨基酸残基；
(7)根据步骤(6)中SARS-CoV-2抗原上与中和抗体相互作用的氨基酸残基确定表位肽的序列。
2.如权利要求1所述获得SARS-CoV-2B细胞表位的方法，其特征在于：步骤(1)以SARS-CoV-2或其抗原蛋白制备免疫原，制备抗SARS-CoV-2单克隆抗体。
3.如权利要求1或2所述获得SARS-CoV-2B细胞表位的方法，其特征在于：所述的抗原蛋白为SARS-CoV-2的S蛋白或其片段，所述抗SARS-CoV-2单克隆抗体为中和性抗体。
4.如权利要求1或2所述获得SARS-CoV-2B细胞表位的方法，其特征在于：抗SARS-CoV-2抗体具有选自SEQ ID NO:1、3、5、7任一或其变体的重链可变区；和/或具有选自SEQ ID NO:2、4、6、8任一或其变体的轻链可变区。
5.如权利要求1所述获得SARS-CoV-2B细胞表位的方法，其特征在于：步骤(2)中的抗SARS-CoV-2抗体Fab段通过重组表达制备或通过酶切纯化制备。
6.如权利要求1所述获得SARS-CoV-2B细胞表位的方法，其特征在于：步骤(3)中抗SARS-CoV-2抗体Fab段与重组SARS-CoV-2抗原的摩尔比为0.8-1:1-2.5。
7.如权利要求1所述获得SARS-CoV-2B细胞表位的方法，其特征在于：步骤(4)中采用坐滴法，在柠檬酸钠、PEG、尿素的条件下结晶。
8.如权利要求1所述获得SARS-CoV-2B细胞表位的方法，其特征在于：步骤(5)中作为模型的抗体X-射线晶体三维结构图为PBD数据库PDB ID:6JJP中所示的抗体Fab结构、作为模型的抗原X-射线晶体三维结构图为PBD数据库PDB ID:6LZG中所示的SARS-CoV-2S蛋白RBD结构。
9.如权利要求1所述获得SARS-CoV-2B细胞表位的方法，其特征在于：步骤(6)还包括对SARS-CoV-2S蛋白RBD上与中和抗体相互作用的氨基酸残基进行定点突变验证，检测SARS-CoV-2S蛋白RBD突变体与中和抗体Fab的亲和力。
10.一种通过权利要求1-9任一所述方法获得的SARS-CoV-2B细胞表位。
11.SARS-CoV-2S蛋白RBD区的B细胞表位，其选自SARS-CoV-2S蛋白RBD区的第446-456aa、481-494aa、444-456aa、483-494aa、369-385aa、404-408aa、437-440aa、499-508aa、403-421aa、449-460aa、473-477aa、484-489aa、493-505aa所示的多肽或其可自然获得的同源变体，所述SARS-CoV-2S蛋白RBD区氨基酸的序号以QHD43416.1编号。
12.如权利要求11所述的B细胞表位，其具有选自SEQ ID NO:9-21任一所示的多肽或其可自然获得的同源变体。
13.一种多肽片段组合，其具有一个或多个选自SARS-CoV-2S蛋白RBD区的第446-456aa、481-494aa、444-456aa、483-494aa、369-385aa、404-408aa、437-440aa、499-508aa、403-421aa、449-460aa、473-477aa、484-489aa、493-505aa所示多肽片段或其可自然获得的同源变体，所述SARS-CoV-2S蛋白RBD区氨基酸的序号以QHD43416.1编号。
14.如权利要求13所述多肽片段组合，其具有2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、或13个选自SARS-CoV-2S蛋白RBD区的多肽片段或其可自然获得的同源变体。
15.一种融合蛋白，其包括权利要求11-12任一所述SARS-CoV-2S蛋白RBD区的B细胞表位、载体蛋白。
16.如权利要求15所述的融合蛋白，其特征在于所述载体蛋白包括麦芽糖结合蛋白(MBP)；牛血清白蛋白(BSA)；钥孔血蓝蛋白(KLH)；卵清蛋白(OVA)；鞭毛蛋白；甲状腺球蛋白；任何物种的血清白蛋白；任何物种的γ球蛋白；D氨基酸和/或L氨基酸的聚合物；破伤风类毒素；解毒的白喉毒素；二氧四氢喋啶合酶；L7/L12核糖体蛋白；热休克蛋白GroEL；热休克蛋白GroES；铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)；外膜蛋白31(Omp31)；周质结合蛋白p39；外膜蛋白28(Omp28)；未脂质化的Omp16(U-Omp16)；未脂质化的Omp19(U-Omp19)。
17.如权利要求15-16任一所述融合蛋白，其特征在于所述B细胞表位与载体蛋白通过键、双功能接头、肽接头连接。
18.如权利要求17所述的融合蛋白，其特征在于所述的键包括共价键，优选肽键、酰胺键、酯键、二硫键。
19.如权利要求17所述的融合蛋白，其特征在于所述的双功能接头包括戊二醛、双磺琥珀酰亚胺辛二酸酯、二甲基己二酸、N,N'-二异丙基碳二亚胺。
20.如权利要求17所述的融合蛋白，其特征在于所述的肽接头包括(GnS)m所示的序列，其中n为1到10之间的整数，和m为1-6之间的整数。
21.一种多表位融合蛋白，其具有一个或多个选自SARS-CoV-2S蛋白RBD区的第446-456aa、481-494aa、444-456aa、483-494aa、369-385aa、404-408aa、437-440aa、499-508aa、403-421aa、449-460aa、473-477aa、484-489aa、493-505aa所示多肽或其可自然获得的同源变体，所述SARS-CoV-2S蛋白RBD区氨基酸的序号以QHD43416.1编号。
22.如权利要求21所述的多表位融合蛋白，其特征在于具有2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、或13个选自SARS-CoV-2S蛋白RBD区的多肽片段或其可自然获得的同源变体。
23.如权利要求21所述的多表位融合蛋白，其特征在于SARS-CoV-2S蛋白RBD区多肽片段或其可自然获得的同源变体之间通过键、双功能接头、肽接头连接。
24.如权利要求23所述的多表位融合蛋白，其特征在于所述的键包括共价键，优选肽键、酰胺键、酯键、二硫键。
25.如权利要求23所述的多表位融合蛋白，其特征在于所述的双功能接头包括戊二醛、双磺琥珀酰亚胺辛二酸酯、二甲基己二酸、N,N'-二异丙基碳二亚胺。
26.如权利要求23所述的多表位融合蛋白，其特征在于所述的肽接头包括(GnS)m所示的序列，其中n为1到10之间的整数，和m为1-6之间的整数。
27.如权利要求21-26任一所述的多表位融合蛋白，其特征在于还包括至少一种载体蛋白。
28.如权利要求27所述的多表位融合蛋白，其特征在于所述载体蛋白包括包括麦芽糖结合蛋白(MBP)；牛血清白蛋白(BSA)；钥孔血蓝蛋白(KLH)；卵清蛋白(OVA)；鞭毛蛋白；甲状腺球蛋白；任何物种的血清白蛋白；任何物种的γ球蛋白；D氨基酸和/或L氨基酸的聚合物；破伤风类毒素；解毒的白喉毒素；二氧四氢喋啶合酶；L7/L12核糖体蛋白；热休克蛋白GroEL；热休克蛋白GroES；铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)；外膜蛋白31(Omp31)；周质结合蛋白p39；外膜蛋白28(Omp28)；未脂质化的Omp16(U-Omp16)；未脂质化的Omp19(U-Omp19)。
29.如权利要求11-12所述多肽表位、权利要求13-14所述多肽片段组合、权利要求15-19所述融合蛋白、或权利要求20-28所述多表位融合蛋白在制备抗体中的用途。
30.如权利要求11-12所述多肽表位、权利要求13-14所述多肽片段组合、权利要求15-19所述融合蛋白、或权利要求20-28所述多表位融合蛋白在提高抗体亲和力和/或改善抗体特异性方面的用途。
31.一种制备抗SARS-CoV-2抗体与SARS-CoV-2抗原的抗原-抗体复合物晶体的方法，其特征在于将抗SARS-CoV-2抗体Fab段与重组SARS-CoV-2抗原在适合二者形成抗原-抗体复合物的条件下反应，对形成的抗原-抗体复合物进行纯化、结晶。
32.如权利要求31所述制备抗SARS-CoV-2抗体与SARS-CoV-2抗原的抗原-抗体复合物晶体的方法，其特征在于：采用坐滴法结晶，在柠檬酸钠、PEG、尿素的条件下结晶。
33.如权利要求32所述制备抗SARS-CoV-2抗体与SARS-CoV-2抗原的抗原-抗体复合物晶体的方法，其特征在于采用坐滴法，在0.2M柠檬酸钠、21％PEG3350、0.02M尿素的条件下结晶3天。
34.如权利要求31-33任一方法制备的抗SARS-CoV-2抗体与SARS-CoV-2抗原的抗原-抗体复合物晶体。
35.一种多核苷酸，其编码权利要求11-12任一所述多肽表位、权利要求15-19任一所述融合蛋白、或权利要求20-28任一所述多表位融合蛋白。
36.载体，其包含权利要求35所述的多核苷酸。
37.宿主细胞，其包含权利要求35所述的多核苷酸或权利要求36所述的载体。
38.一种制备SARS-CoV-2S蛋白多肽表位、表位-载体融合蛋白、或多表位融合蛋白的方法，其包括以下步骤：
(1)在适合表达重组外源蛋白的条件下培养权利要求37所述宿主细胞；
(2)从细胞培养物中分离纯化SARS-CoV-2S蛋白多肽表位、融合蛋白、或多表位融合蛋白。
39.一种制备SARS-CoV-2S蛋白多肽表位、表位-载体融合蛋白、或多表位融合蛋白的方法，其特征在于通过化学合成法制备，其中所述多肽表位如权利要求11-12任一所述，所述表位-载体融合蛋白权利要求15-19任一所述，所述多表位融合蛋白如权利要求20-28所述。
40.如权利要求39所述制备SARS-CoV-2S蛋白多肽表位、表位-载体融合蛋白、或多表位融合蛋白的方法，其特征在于所述化学合成法包括固相合成、液相合成、以及固相-液相联合合成。
41.如权利要求39所述制备SARS-CoV-2S蛋白多肽表位、表位-载体融合蛋白、或多表位融合蛋白的方法，其特征在于所述化学合成法的合成策略包括由N端至C端依次合成、由C端至N端依次合成、分段合成等。
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