CN116789815A - 一种检测布鲁氏菌Bp26的特异性纳米抗体及其应用 - Google Patents

一种检测布鲁氏菌Bp26的特异性纳米抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于检测布鲁氏菌Bp26的特异性纳米抗体的制备方法，该方法利用Bp26重组蛋白在布鲁氏菌噬菌体展示文库中进行筛选，得到五种Bp26特异性纳米抗体的核苷酸和氨基酸序列，所述五种Bp26特异性纳米抗体包括纳米抗体Nb1、纳米抗体Nb2、纳米抗体Nb3、纳米抗体Nb4、纳米抗体Nb5。本发明还提供了一种所述Bp26特异性纳米抗体的表达载体的构建方法，及利用该构建方法构建的表达载体的应用，所述表达载体表达的融合蛋白可用于建立一种操作简便、快速的竞争ELISA方法，来检测血清中布鲁氏菌Bp26抗体。本发明的纳米抗体亲和力高，能特异性识别布鲁氏菌外膜蛋白Bp26，有效阻断布鲁氏菌阳性血清与Bp26的结合。

Description

一种检测布鲁氏菌Bp26的特异性纳米抗体及其应用
技术领域
本发明属于免疫检测技术领域，具体涉及一种检测布鲁氏菌Bp26的特异性纳米抗体及其应用。
背景技术
布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的人畜共患传染病，简称布病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的动物传染病，我国将其列为二类动物疫病。近年来，布病在国内呈明显上升趋势，给养殖业造成巨大的经济损失，严重威胁人类食品安全和公共卫生安全。
检测布鲁氏菌病原和特异性抗体是防控布鲁氏菌病的关键。布鲁氏菌病的诊断方法包括病原学诊断和血清学诊断。病原学诊断方法主要包括病原菌分离和分子诊断方法(常规PCR、实时定量PCR、LAMP、AMOS-PCR等)，但病原学诊断方法都需要在生物安全实验室完成，且操作人员必须经过专业培训，检测时间较长。目前的血清学检测方法主要以布鲁氏菌脂多糖链为基础，但一些革兰氏阴性菌(大肠杆菌O157：H7、小肠结肠炎耶尔森菌O：9等)与布鲁氏菌脂多糖存在相同的抗原表位，由此导致的交叉反应会在一定程度上影响血清学检测的特异性。因此，鉴定布鲁氏菌特异性免疫原性蛋白，并基于此开发取代LPS的诊断方法十分必要。
Bp26蛋白又称Omp28，存在于所有的布鲁氏菌菌株中，布鲁氏菌经典的6个种间均表现出高度保守性。在布鲁氏菌感染牛、绵羊、山羊和人中均为优势免疫原。许多报道显示其可以作为血清学检测的靶蛋白，并有较高的准确率。因此选取Bp26作为抗原，筛选其特异性纳米抗体建立一种操作简便、快速的竞争ELISA方法，进一步提高检测的特异性和准确性，对于提高布病防控技术十分必要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种检测布鲁氏菌Bp26的特异性纳米抗体及其应用，该特异性纳米抗体包括纳米抗体Nb1、纳米抗体Nb2、纳米抗体Nb3、纳米抗体Nb4、纳米抗体Nb5，能够特异性识别布鲁氏菌外膜蛋白Bp26，有效阻断布鲁氏菌阳性血清与Bp26的结合。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种用于检测布鲁氏菌Bp26的特异性纳米抗体的制备方法，该方法为：
步骤一、Bp26重组蛋白的诱导表达
将pET32a-Bp26菌液按千分之一的比例接入LB-Amp培养基，在37℃、200r/min的条件下培养至对数生长期，再将活化后的菌液接入200mL新的LB-Amp培养基中，37℃、200r/min培养至OD600为0.6，加入200μL1mM的IPTG诱导，转入16℃、200r/min培养24h；在4℃、8000r/min的条件下离心15min，弃掉上清，菌体用1/20体积的bufferA重悬，然后以超声3s，间歇3s，功率30％，时间20min超声破碎菌液；在4℃、12000r/min的条件下离心10min，分离上清和沉淀；
步骤二、Bp26蛋白的纯化
HIS标签纯化重力柱流干保护液，加入10倍柱体积的bufferA平衡重力柱；将步骤一得到的上清用0.45μM滤器过滤，加入重力柱，接触30min，调整流速为0.5mL/min，收集流穿液；加入5～10倍体积的bufferA洗涤柱子，至A280吸光度达到基线水平；加入5～10倍体积的bufferB洗涤柱子，去除非特异性吸附的杂蛋白并收集流出液，至A280吸光度达到基线水平；使用0.1～0.5倍体积的Elutionbuffer进行洗脱，分段收集洗脱液，至A280吸光度达到基线水平，进行SDS-PAGE检测；将洗脱的蛋白透析36h，每12h更换一次透析液，透析结束后使用PEG8000进行浓缩，并测定蛋白浓度，分装后于-80℃冻存；
步骤三、Bp26特异性噬菌体的淘选
将步骤二纯化的Bp26蛋白按10μg/孔包被在96孔酶标板上，重复3个孔，并设置PBS对照孔，4℃条件下包被过夜；弃去包被液，PBST洗涤三次，每次5min，用2.5％脱脂奶粉封闭，37℃封闭1h；弃去封闭液，PBST洗涤三次，每次10min，加入5×1010PFU/孔噬菌体，放置37℃孵育2h；弃去液体，PBST洗涤五次，每次5min；加入100μL0.1M三乙胺，室温静置10min后吸出液体并用100μL1MTris-HCl中和；取0.2mL淘选产物接入200mL2×YT/AMP-GLU培养基，37℃培养至对数生长期，加入20MOI辅助噬菌体M13K07混合均匀，37℃孵育30min，3000g室温离心15min，弃去上清，用200mL2×YT/AMP-KAN培养基重悬沉淀，37℃培养12h，3000g离心30min，收集上清，加入1/5体积的预冷至4℃的PEG/NaCl溶液，冰上孵育6～8h；3500g，4℃离心30min，弃去上清，用1mLPBS溶液重悬沉淀；4℃摇床孵育过夜，4℃高速离心15min，收集上清，使用TG1测定重组噬菌体的滴度；后续包被10、5μg/孔的Bp26蛋白，分别进行第二轮、三轮的淘选；所述PEG/NaCl溶液的制备方法为：将200gPEG6000和146gNaCl加水溶解，定容至1L，然后高压灭菌；
步骤四、纳米抗体粗提物的制备
在步骤三淘选的最后一轮，挑取96个噬菌体单克隆加入100μLLB/AMP-GLU培养基在96孔细胞培养板中培养，37℃、200r/min培养8h；吸取10μL转接至24孔细胞培养板，每孔1mLTB培养基，37℃培养到OD600为0.6，加入终浓度为1mM的IPTG继续培养12h；12000r/min离心5min，收集菌体，-80℃和37℃反复冻融三次裂解菌体，加入500μLPBS重悬菌体，4℃孵育2h，12000r/min离心5min，收集上清即为纳米抗体粗提物；
步骤五、ELISA检测纳米抗体粗提物
将2μg/mL纯化的Bp26重组蛋白和PBS包被在96孔酶标板上，4℃过夜；PBST洗涤三次，每次5min，加入2.5％脱脂奶粉封闭1h，PBST洗涤三次，每次5min；加入100μL步骤四得到的纳米抗体粗提物，37℃孵育1h，PBST洗涤五次，每次5min；加入1:3000稀释后的小鼠抗HA抗体，37℃孵育1h，PBST洗涤三次，每次5min；使用HRP标记的山羊抗小鼠IgG，1:5000稀释后加入孔中，37℃孵育1h，PBST洗涤三次，每次5min；洗涤完毕后加入TMB显色液孵育15min，3MH2SO4终止反应；酶标仪设定吸光度值为OD450，读值并分析结果；挑选阳性克隆测序，得到五种Bp26特异性纳米抗体，分别命名为纳米抗体Nb1、纳米抗体Nb2、纳米抗体Nb3、纳米抗体Nb4、纳米抗体Nb5；
所述纳米抗体Nb1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述纳米抗体Nb2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述纳米抗体Nb3的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述纳米抗体Nb4的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；
所述纳米抗体Nb5的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
优选地，所述纳米抗体Nb1、纳米抗体Nb2、纳米抗体Nb3、纳米抗体Nb4和纳米抗体Nb5均包括4个框架区FR1、FR2、FR3、FR4和3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，所述4个框架区和3个互补决定区的排列顺序为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4；
对于所述纳米抗体Nb1：所述FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示，所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示，所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示；
对于所述纳米抗体Nb2：所述FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示，所述FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示，所述FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示，所述FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示，所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示，所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示，所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示；
对于所述纳米抗体Nb3：所述FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示，所述FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示，所述FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示，所述FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.28所示，所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示，所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.30所示，所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.31所示；
对于所述纳米抗体Nb4：所述FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.32所示，所述FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.33所示，所述FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.34所示，所述FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.35所示，所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.36所示，所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.37所示，所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.38所示；
对于所述纳米抗体Nb5：所述FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.39所示，所述FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.40所示，所述FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.41所示，所述FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.42所示，所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.43所示，所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.44所示，所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.45所示。
本发明还提供了一种利用上述方法制备的用于检测布鲁氏菌Bp26的特异性纳米抗体的表达载体的构建方法，该方法为：
将所述Bp26特异性纳米抗体的基因序列通过PstI和NotI两个酶切位点插入到pCMV-HRP载体中，分别构建重组质粒，PCR和测序验证重组质粒的正确性，分别提取无内毒素的pCMV-Nb1-HRP、pCMV-Nb2-HRP、pCMV-Nb3-HRP、pCMV-Nb4-HRP、pCMV-Nb5-HRP重组质粒，将HEK-293T细胞铺设12孔板，待细胞长满70％～80％，使用Thermo TurboFect转染试剂混合重组质粒转染至HEK-293T细胞，72h后收取上清，分别得到Nb1-HRP、Nb2-HRP、Nb3-HRP、Nb4-HRP、Nb5-HRP融合蛋白；所述Bp26特异性纳米抗体包括纳米抗体Nb1、纳米抗体Nb2、纳米抗体Nb3、纳米抗体Nb4和纳米抗体Nb5；
本发明还提供了一种利用所述构建方法构建的表达载体的应用，所述表达载体表达的融合蛋白可用于构建竞争ELISA方法，检测布鲁氏菌Bp26抗体；
优选地，所述竞争ELISA方法通过以下步骤构建：
S1、棋盘法确定最佳抗原抗体工作浓度
S101、包被抗原：将Bp26蛋白浓度稀释到1、2、4μg/mL包被到ELISA板上，4℃条件包被过夜；
S102、封闭：PBST溶液洗涤三次，每次5min，加入100μL2.5％的脱脂奶粉，37℃封闭1h，PBST洗涤三次；
S103、孵育抗体：以2、4、8、16、32、64、128倍稀释纳米抗体表达载体表达的融合蛋白，加入酶标板中，37℃孵育1h，PBST洗涤三次；
S104、显色和终止：加入100μLTMB显色液室温孵育15min，50μL3M硫酸终止反应，450nm读取吸光值，分析结果，确定竞争ELISA的最佳抗原、抗体稀释浓度；
其中，S103所述纳米抗体表达载体表达的融合蛋白为Nb1-HRP、Nb2-HRP、Nb3-HRP、Nb4-HRP、Nb5-HRP中与Bp26蛋白亲和力最高的融合蛋白；
S2、确定竞争ELISA方法的血清稀释度
S201、包被抗原：将S1得到最佳抗原稀释浓度的Bp26蛋白包被到96孔酶标板上，4℃过夜；
S202、封闭：PBST溶液洗涤三次，加入100μL2.5％的脱脂奶粉，37℃封闭1h，PBST洗涤三次；
S203、稀释血清：选取阳性血清和阴性血清各四份，按照1:5、1:10、1:15、1:20倍稀释，并与S1得到最佳抗体稀释度稀释的纳米抗体表达载体表达的融合蛋白进行混合，每孔加入100μL混合液，37℃孵育1h，PBST洗涤三次；
S204、显色和终止：TMB显色液室温孵育15min，3M硫酸终止反应；450nm读取吸光值，分析结果，确定竞争ELISA方法的最佳血清稀释度；
S3、基于纳米抗体表达载体表达的融合蛋白建立竞争ELISA方法
S301、包被抗原：将S1得到最佳抗原稀释浓度的Bp26蛋白包被到96孔酶标板上，4℃孵育过夜；
S302、封闭：PBST溶液洗涤三次，每次5min，加入100μL2.5％的脱脂奶粉，37℃封闭1h；
S303、制备血清和纳米抗体混合液：血清按照S2得到的最佳血清稀释度稀释，纳米抗体表达载体表达的融合蛋白按照S1得到的最佳抗体稀释度稀释，制备混合液并加入酶标板中，每孔100μL，37℃孵育1h，PBST洗涤三次；
S304、显色和终止：加入TMB显色液孵育15min后用3M硫酸终止反应，OD450检测吸光度，分析结果。
本发明与现有技术相比具有以下显著的技术效果：
1、本发明基于布鲁氏菌A19疫苗株噬菌体展示文库，用Bp26重组蛋白筛选得到的五种检测布鲁氏菌Bp26的特异性纳米抗体，该特异性纳米抗体包括纳米抗体Nb1、纳米抗体Nb2、纳米抗体Nb3、纳米抗体Nb4、纳米抗体Nb5，能够特异性识别布鲁氏菌外膜蛋白Bp26，能够有效阻断布鲁氏菌阳性血清与Bp26的结合。
2、本发明还提供了一种Bp26特异性纳米抗体的表达载体的构建方法，通过该构建方法构建的表达载体可用于建立一种操作简便、快速的竞争ELISA方法，来检测血清中布鲁氏菌Bp26抗体，检测方法操作简便、耗时短、成本低，具有良好的市场前景。
3、本发明制备的检测布鲁氏菌Bp26的特异性纳米抗体还可用于建立夹心ELISA、胶体金等检测方法对布鲁氏菌病进行检测。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
附图说明
图1是本发明实施例1的Bp26蛋白纯化结果图。
图2是本发明实施例1的间接ELISA检测骆驼血清中Bp26抗体滴度结果。
图3是本发明实施例2的间接ELISA方法检测Bp26特异性纳米抗体粗提物的结果图。
图4是本发明实施例2的纳米抗体Nb1、Nb2、Nb3、Nb4、Nb5的序列分析图。
图5是本发明实施例3的纳米抗体识别Bp26蛋白westernblot鉴定图。
图6是本发明实施例4的纳米抗体粗提物与Bp26蛋白亲和力的测定结果。
图7是本发明实施例6的纳米抗体和辣根过氧化物酶(HRP)融合蛋白与Bp26蛋白的亲和力测定结果。
图8是本发明实施例7的竞争ELISA法检测血清中Bp26抗体。
具体实施方式
实施例1
本实施例为布鲁氏菌Bp26重组蛋白的表达、纯化及骆驼血清中抗体滴度测定，具体步骤如下：
1、Bp26重组蛋白的诱导表达
将实验室保存的pET32a-Bp26菌液按千分之一的比例接入LB-Amp培养基，在37℃、200r/min的条件下培养至对数生长期(OD600至0.6～0.8之间)，再将活化后的菌液接入200mL新的LB-Amp培养基中，37℃、200r/min的条件下培养至OD600为0.6，加入200μL1mM的IPTG，16℃、200r/min的条件下继续培养24h。然后分装至50mL离心管中，4℃、8000r/min离心15min，弃去上清，加入菌体1/20体积的bufferA进行重悬，超声破碎菌液：超声3s，间歇3s，功率30％，时间20min；4℃、12000r/min离心10min，分离上清和沉淀。
2、Bp26蛋白的纯化
HIS标签纯化重力柱流干保护液，加入10倍柱体积的bufferA平衡重力柱；将上述步骤1中得到的上清用0.45μM滤器过滤，加入重力柱，使上清和介质充分接触30min，然后调整流速为0.5mL/min，并收集流穿液；加入5～10倍体积的bufferA洗涤柱子，至A280吸光度达到基线水平；加入5～10倍体积的bufferB洗涤柱子，去除非特异性吸附的杂蛋白并收集流出液，至A280吸光度达到基线水平；使用0.1～0.5倍体积的Elution buffer进行洗脱，分段收集洗脱液，至A280吸光度达到基线水平，进行SDS-PAGE检测。将洗脱的蛋白透析36h，每12h更换一次透析液，透析结束后使用PEG8000进行浓缩，并测定蛋白浓度，分装后于-80℃冻存。
图1是本实施例的Bp26蛋白纯化结果图；其中，泳道1：流穿液；泳道2：BufferA洗杂液；泳道3～4：BufferB洗杂液；泳道5～9：洗脱目的蛋白。如图显示，Bp26重组蛋白纯化成功。
3、骆驼血清中Bp26抗体滴度测定
ELISA检测骆驼血清效价：将2μg/mL的Bp26蛋白包被在96孔酶标板上，4℃过夜。PBST洗涤三次，用2.5％脱脂奶粉封闭1h，PBST洗涤三次。将未免疫的骆驼血清和免疫三次的骆驼血清按103、104、105、106、107进行稀释，每孔100μL，37℃孵育1h，PBST洗涤三次。加入1:2000稀释的兔抗骆驼lgG多抗，37℃孵育1h；PBST洗涤三次，每次5min。加入1:4000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔lgG，37℃孵育1h；PBST洗涤三次，每次5min。加入TMB显色液室温孵育15min，3M硫酸终止反应。酶标仪设定吸光度值450nm，读值并分析免疫效果。
图2是本实施例的间接ELISA检测骆驼血清中Bp26抗体滴度结果。结果显示，抗Bp26蛋白的特异性抗体效价达到1:10000。
实施例2
本实施例为检测布鲁氏菌Bp26的特异性纳米抗体的筛选及验证，所用布鲁氏菌A19疫苗株噬菌体展示文库参考发明专利CN115043939A；特异性纳米抗体的筛选具体步骤为：
1、Bp26特异性噬菌体的淘选
将Bp26蛋白按10μg/孔包被在96孔酶标板上，重复3个孔，并设置PBS对照孔，4℃条件下包被过夜。弃去包被液，PBST洗涤三次，每次5min，用2.5％脱脂奶粉封闭，放置37℃封闭1h。弃去封闭液，PBST洗涤三次，每次10min，加入5×1010PFU/孔噬菌体，放置37℃孵育2h。弃去液体，PBST洗涤五次，每次5min。加入100μL0.1M三乙胺(需现配现用)，室温静置10min后吸出液体并用等体积的1MTris-HCl中和。取0.2mL淘选产物进行噬菌体文库的救援，并测定重组噬菌体的滴度。再包被10、5μg/孔的Bp26蛋白，分别进行第二轮、三轮的淘选。Bp26特异性噬菌体三轮淘选滴度检测结果见表1。
所述噬菌体文库的救援步骤为：
取0.2mL淘选产物接入200mL2×YT/AMP-GLU培养基，37℃培养至对数生长期，加入20MOI辅助噬菌体M13K07混合均匀，37℃孵育30min，3000g室温离心15min，弃去上清，用200mL2×YT/AMP-KAN培养基重悬沉淀，37℃培养12h，3000g离心30min，收集上清，加入1/5体积的预冷至4℃的PEG/NaCl溶液，冰上孵育6～8h；3500g，4℃离心30min弃去上清，用1mLPBS溶液重悬沉淀，为了充分溶解，4℃摇床孵育过夜，4℃、12000r/min离心15min，收集上清，并使用对数生长期的TG1测定重组噬菌体的滴度；其中，PEG/NaCl溶液的制备方法为：将200gPEG6000和146gNaCl加水溶解，定容至1L，然后高压灭菌。
表1Bp26特异性噬菌体三轮淘选滴度检测结果。
2、纳米抗体粗提物的制备
在上述步骤1淘选的最后一轮，挑取96个噬菌体单克隆加入100μLLB/AMP-GLU培养基，在96孔细胞培养板中培养，37℃200r/min培养8h后吸取10μL转接至24孔细胞培养板(每孔1mL，TB培养基)，37℃培养至OD600为0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG继续培养12h；12000r/min离心5min收集菌体，在超低温-80℃和37℃反复冻融三次裂解菌体，加入500μLPBS重悬菌体，4℃孵育2h，12000r/min离心5min，收集上清即为纳米抗体粗提物。
3、间接ELISA方法检测纳米抗体粗提物
将2μg/mLBp26重组蛋白和PBS包被在96孔酶标板上，4℃过夜。PBST洗涤三次，每次5min，加入2.5％脱脂奶粉封闭1h，PBST洗涤三次，每次5min。加入100μL上述步骤2中得到的纳米抗体粗提物，37℃孵育1h，PBST洗涤五次，每次5min。加入稀释(1:3000)的小鼠抗HA抗体，37℃孵育1h，PBST洗涤三次，每次5min。使用HRP标记的山羊抗小鼠IgG，1:5000稀释后加入孔中，37℃孵育1h，PBST洗涤三次，每次5min。洗涤完毕后加入TMB显色液孵育15min，3MH2SO4终止反应。酶标仪设定吸光度值为OD450，读值并分析试验结果。挑选阳性克隆送公司测序，并进行序列比对，结果获得五种Bp26特异性纳米抗体序列，命名为纳米抗体Nb1、纳米抗体Nb2、纳米抗体Nb3、纳米抗体Nb4、纳米抗体Nb5。
图3是本实施例的间接ELISA检测Bp26特异性纳米抗体粗提物的结果图，将OD值大于PBS对照3倍以上判断为阳性，结果显示，选取的96个克隆中有84个为阳性克隆。
图4是本实施例的Bp26特异性纳米抗体Nb1、Nb2、Nb3、Nb4、Nb5的氨基酸序列分析图。如图所示，纳米抗体Nb1、纳米抗体Nb2、纳米抗体Nb3、纳米抗体Nb4和纳米抗体Nb5均包括4个框架区FR1、FR2、FR3、FR4和3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，所述4个框架区和3个互补决定区的排列顺序为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4；
对于纳米抗体Nb1：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，FR4的氨基酸序列如SEQ IDNO.14所示，CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示；
对于纳米抗体Nb2：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示，FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示，FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示，FR4的氨基酸序列如SEQ IDNO.21所示，CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示；
对于纳米抗体Nb3：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示，FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示，FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示，FR4的氨基酸序列如SEQ IDNO.28所示，CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.30所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.31所示；
对于纳米抗体Nb4：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.32所示，FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.33所示，FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.34所示，FR4的氨基酸序列如SEQ IDNO.35所示，CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.36所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.37所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.38所示；
对于纳米抗体Nb5：FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.39所示，FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.40所示，FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.41所示，FR4的氨基酸序列如SEQ IDNO.42所示，CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.43所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.44所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.45所示。
实施例3
本实施例为westernblot验证所选纳米抗体的特异性。
取1μg/μLBp26蛋白10μL，加入Loadingbuffer混合均匀，100℃金属浴10min。上样完毕后开始电泳，设置条件：80V恒压30min，120V恒压90min。用湿转方法转膜，转膜结束后5％脱脂奶粉封闭1h，PBST洗涤三次，每次5min。纳米抗体粗提物为一抗，室温孵育1h，PBST洗涤三次；室温孵育小鼠抗HA标签抗体1h，PBST洗涤三次；室温孵育HRP-山羊抗小鼠lgG1h并用PBST洗涤三次。ECL发光液显色，成像并分析结果。
图5是本实施例的纳米抗体识别Bp26蛋白westernblot鉴定图。结果显示，纳米抗体粗提物可以和布鲁氏菌Bp26蛋白特异性结合。
实施例4
本实施例为间接ELISA方法检测所选纳米抗体粗提物的亲和力，具体步骤为：
(1)将Bp26蛋白稀释至2μg/mL包被96孔酶标板，4℃过夜；
(2)PBST洗板三次，用2.5％的脱脂奶粉37℃封闭1h；
(3)将纳米抗体粗提物按1:10、1:102、1:103、1:104稀释，每孔加入100μL，37℃孵育1h，PBST洗板3次；
(4)加入小鼠抗HA标签抗体孵育1h，PBST洗板3次；
(5)加入HRP-山羊抗小鼠lgG孵育1h，PBST洗板3次；
(6)加入TMB底物显色液孵育15min后终止液终止反应，酶标仪OD450读值，分析实验结果。
图6是本实施例的纳米抗体粗提物与Bp26亲和力的测定结果。结果显示，五种纳米抗体粗提物与Bp26的亲和力都很高，其中Nb5的粗提物与Bp26的亲和力最高。
实施例5
本实施例为纳米抗体和辣根过氧化物酶(HRP)融合蛋白表达载体的构建方法，该方法包括以下步骤：
(1)构建重组真核表达载体：利用TAKARAprimestarGXL酶PCR扩增Nb1、Nb2、Nb3、Nb4、Nb5的基因序列，回收纯化；用PstI和Not I酶双酶切目的片段和pCMV-HRP表达载体，将目的片段与质粒进行连接，连接产物转化至BL21感受态细胞，涂板，挑取单克隆并进行PCR验证，验证成功后送公司测序；
PCR扩增反应体系：5XPrimeSTARGXLBuffer10μL，dNTPMixture4μL，primerF1μL，primerR1μL，PrimeSTARGXLDNA聚合酶1μL，模板1μL，ddH2O32μL；
PCR扩增反应程序：98℃10s，60℃15s，68℃24s，30个循环。
(2)将测序正确的阳性样品提取质粒，获得无内毒素的pCMV-Nb1-HRP、pCMV-Nb2-HRP、pCMV-Nb3-HRP、pCMV-Nb4-HRP、pCMV-Nb5-HRP质粒。
(3)将HEK-293T细胞铺设12孔板，待细胞长满70％～80％，使用ThermoTurboFect转染试剂，体系为：TurboFect4μL、质粒1μg、无血清DMEM培养基200μL，混合均匀后室温孵育15min，加入HEK-293T细胞，72h后收取上清，得到Nb1-HRP、Nb2-HRP、Nb3-HRP、Nb4-HRP、Nb5-HRP融合蛋白，进行活性验证。
实施例6
本实施例为ELISA方法检测Nb1-HRP、Nb2-HRP、Nb3-HRP、Nb4-HRP、Nb5-HRP融合蛋白与Bp26蛋白的亲和力，具体步骤为：
(1)将10μg/mLBp26蛋白包被96孔酶标板，4℃过夜；
(2)PBST洗板三次，用2.5％的脱脂奶粉37℃封闭1h，PBST洗板3次；
(3)按4、16、64、256、1024、4096倍梯度分别稀释Nb1-HRP、Nb2-HRP、Nb3-HRP、Nb4-HRP、Nb5-HRP，加入酶标板中，37℃孵育1h，PBST洗板3次；
(4)加入TMB底物显色液孵育15min，终止液终止反应，酶标仪OD450读值，分析实验结果。
图7是本实施例的Nb1-HRP、Nb2-HRP、Nb3-HRP、Nb4-HRP、Nb5-HRP与Bp26的亲和力测定结果。结果显示，Nb2-HRP与Bp26的亲和力最高。
实施例7
本实施例为纳米抗体表达载体的应用，所述纳米抗体表达载体表达的融合蛋白可用于建立竞争ELISA方法，来检测布鲁氏菌Bp26抗体。本实施例所用纳米抗体表达载体表达的融合蛋白为Nb2-HRP，竞争ELISA方法的构建包括以下步骤：
1、棋盘法确定最佳抗原抗体工作浓度
(1)包被抗原：将Bp26蛋白浓度稀释到1、2、4μg/mL包被到ELISA板上，4℃条件过夜；
(2)封闭：PBST溶液洗涤三次，每次5min，加入100μL2.5％的脱脂奶粉，37℃封闭1h，PBST洗涤三次；
(3)孵育抗体：以2、4、8、16、32、64、128倍稀释Nb2-HRP，加入酶标板中，37℃孵育1h，PBST洗涤三次；
(4)显色和终止：加入100μLTMB显色液室温孵育15min，50μL3M硫酸终止反应，读取450nm吸光值。
分析试验结果，确定2μg/mL是最佳抗原包被浓度，1:32是最佳抗体稀释浓度。
2、确定竞争ELISA方法的血清稀释度
(1)包被抗原：将2μg/mLBp26蛋白包被到96孔酶标板上，4℃过夜；
(2)封闭：PBST溶液洗涤三次，加入100μL2.5％的脱脂奶粉，37℃封闭1h，PBST洗涤三次；
(3)稀释血清：选取阳性血清和阴性血清各四份，按照1:5、1:10、1:15、1:20倍稀释，并与1:32稀释的Nb2-HRP进行混合，每孔加入100μL混合液，37℃孵育1h，PBST洗涤三次；
(4)显色和终止：TMB显色液室温孵育15min，3M硫酸终止反应。450nm读取吸光值。
分析试验结果，确定竞争ELISA方法的最佳血清稀释度为1:10。
3、基于Nb2-HRP建立竞争ELISA方法
(1)包被抗原：将2μg/mLBp26蛋白包被到96孔酶标板上，4℃孵育过夜；
(2)封闭：PBST溶液洗涤三次，每次5min，加入100μL2.5％的脱脂奶粉，37℃封闭1h，PBST洗涤三次；
(3)制备血清和纳米抗体混合液：血清按照1:10稀释，Nb2-HRP按照1:32稀释，制备混合液并加入酶标板中，每孔100μL，37℃孵育1h，PBST洗涤三次；
(4)显色和终止：加入TMB显色液孵育15min后用3M硫酸终止反应，OD450检测吸光度，分析试验结果。
图8是本实施例的基于Nb2-HRP的竞争ELISA方法检测血清中Bp26抗体的结果图。结果显示，Nb2-HRP能够有效阻断布鲁氏菌阳性血清与Bp26的结合。
本发明的Bp26特异性纳米抗体的表达载体还可以用于建立夹心ELISA、胶体金检测试纸条等检测方法对布鲁氏菌病进行检测。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。

Claims (5)

1.一种用于检测布鲁氏菌Bp26的特异性纳米抗体的制备方法，其特征在于，该方法为：
步骤一、Bp26重组蛋白的诱导表达
将pET32a-Bp26菌液按千分之一的比例接入LB-Amp培养基，在37℃、200r/min的条件下培养至对数生长期，再将活化后的菌液接入200mL新的LB-Amp培养基中，37℃、200r/min培养至OD600为0.6，加入200μL1mM的IPTG诱导，转入16℃、200r/min培养24h；在4℃、8000r/min的条件下离心15min，弃掉上清，菌体用1/20体积的buffer A重悬，然后以超声3s，间歇3s，功率30％，时间20min超声破碎菌液；在4℃、12000r/min的条件下离心10min，分离上清和沉淀；
步骤二、Bp26蛋白的纯化
HIS标签纯化重力柱流干保护液，加入10倍柱体积的buffer A平衡重力柱；将步骤一得到的上清用0.45μM滤器过滤，加入重力柱，接触30min，调整流速为0.5mL/min，收集流穿液；加入5～10倍体积的buffer A洗涤柱子，至A280吸光度达到基线水平；加入5～10倍体积的buffer B洗涤柱子，去除非特异性吸附的杂蛋白并收集流出液，至A280吸光度达到基线水平；使用0.1～0.5倍体积的Elution buffer进行洗脱，分段收集洗脱液，至A280吸光度达到基线水平，进行SDS-PAGE检测；将洗脱的蛋白透析36h，每12h更换一次透析液，透析结束后使用PEG8000进行浓缩，并测定蛋白浓度，分装后于-80℃冻存；
步骤三、Bp26特异性噬菌体的淘选
将步骤二纯化的Bp26蛋白按10μg/孔包被在96孔酶标板上，重复3个孔，并设置PBS对照孔，4℃条件下包被过夜；弃去包被液，PBST洗涤三次，每次5min，用2.5％脱脂奶粉封闭，37℃封闭1h；弃去封闭液，PBST洗涤三次，每次10min，加入5×1010PFU/孔噬菌体，放置37℃孵育2h；弃去液体，PBST洗涤五次，每次5min；加入100μL 0.1M三乙胺，室温静置10min后吸出液体并用100μL 1M Tris-HCl中和；取0.2mL淘选产物接入200mL 2×YT/AMP-GLU培养基，37℃培养至对数生长期，加入20MOI辅助噬菌体M13K07混合均匀，37℃孵育30min，3000g室温离心15min，弃去上清，用200mL 2×YT/AMP-KAN培养基重悬沉淀，37℃培养12h，3000g离心30min，收集上清，加入1/5体积的预冷至4℃的PEG/NaCl溶液，冰上孵育6～8h；3500g，4℃离心30min，弃去上清，用1mL PBS溶液重悬沉淀；4℃摇床孵育过夜，4℃高速离心15min，收集上清，使用TG1测定重组噬菌体的滴度；后续包被10、5μg/孔的Bp26蛋白，分别进行第二轮、三轮的淘选；所述PEG/NaCl溶液的制备方法为：将200gPEG6000和146g NaCl加水溶解，定容至1L，然后高压灭菌；
步骤四、纳米抗体粗提物的制备
在步骤三淘选的最后一轮，挑取96个噬菌体单克隆加入100μLLB/AMP-GLU培养基在96孔细胞培养板中培养，37℃、200r/min培养8h；吸取10μL转接至24孔细胞培养板，每孔1mLTB培养基，37℃培养到OD600为0.6，加入终浓度为1mM的IPTG继续培养12h；12000r/min离心5min，收集菌体，-80℃和37℃反复冻融三次裂解菌体，加入500μL PBS重悬菌体，4℃孵育2h，12000r/min离心5min，收集上清即为纳米抗体粗提物；
步骤五、ELISA检测纳米抗体粗提物
将2μg/mL纯化的Bp26重组蛋白和PBS包被在96孔酶标板上，4℃过夜；PBST洗涤三次，每次5min，加入2.5％脱脂奶粉封闭1h，PBST洗涤三次，每次5min；加入100μL步骤四得到的纳米抗体粗提物，37℃孵育1h，PBST洗涤五次，每次5min；加入1:3000稀释后的小鼠抗HA抗体，37℃孵育1h，PBST洗涤三次，每次5min；使用HRP标记的山羊抗小鼠IgG，1:5000稀释后加入孔中，37℃孵育1h，PBST洗涤三次，每次5min；洗涤完毕后加入TMB显色液孵育15min，3MH2SO4终止反应；酶标仪设定吸光度值为OD450，读值并分析结果；挑选阳性克隆测序，得到五种Bp26特异性纳米抗体，分别命名为纳米抗体Nb1、纳米抗体Nb2、纳米抗体Nb3、纳米抗体Nb4、纳米抗体Nb5；
所述纳米抗体Nb1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述纳米抗体Nb2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述纳米抗体Nb3的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述纳米抗体Nb4的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；
所述纳米抗体Nb5的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测布鲁氏菌Bp26的特异性纳米抗体的制备方法，其特征在于，所述纳米抗体Nb1、纳米抗体Nb2、纳米抗体Nb3、纳米抗体Nb4和纳米抗体Nb5均包括4个框架区FR1、FR2、FR3、FR4和3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，所述4个框架区和3个互补决定区的排列顺序为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4；
对于所述纳米抗体Nb1：所述FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示，所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示，所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示；
对于所述纳米抗体Nb2：所述FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示，所述FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示，所述FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示，所述FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示，所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示，所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示，所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示；
对于所述纳米抗体Nb3：所述FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示，所述FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示，所述FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示，所述FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.28所示，所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示，所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.30所示，所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.31所示；
对于所述纳米抗体Nb4：所述FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.32所示，所述FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.33所示，所述FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.34所示，所述FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.35所示，所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.36所示，所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.37所示，所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.38所示；
对于所述纳米抗体Nb5：所述FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.39所示，所述FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.40所示，所述FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.41所示，所述FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.42所示，所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.43所示，所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.44所示，所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.45所示。
3.一种如权利要求1所述方法制备的用于检测布鲁氏菌Bp26的特异性纳米抗体的表达载体的构建方法，其特征在于，该方法为：
将所述Bp26特异性纳米抗体的基因序列通过PstI和NotI两个酶切位点插入到pCMV-HRP载体中，分别构建重组质粒，PCR和测序验证重组质粒的正确性，分别提取无内毒素的pCMV-Nb1-HRP、pCMV-Nb2-HRP、pCMV-Nb3-HRP、pCMV-Nb4-HRP、pCMV-Nb5-HRP重组质粒，将HEK-293T细胞铺设12孔板，待细胞长满70％～80％，使用Thermo TurboFect转染试剂混合重组质粒转染至HEK-293T细胞，72h后收取上清，分别得到Nb1-HRP、Nb2-HRP、Nb3-HRP、Nb4-HRP、Nb5-HRP融合蛋白；所述Bp26特异性纳米抗体包括纳米抗体Nb1、纳米抗体Nb2、纳米抗体Nb3、纳米抗体Nb4和纳米抗体Nb5。
4.一种如权利要求3所述构建方法构建的表达载体的应用，其特征在于，所述表达载体表达的融合蛋白可用于构建竞争ELISA方法，检测布鲁氏菌Bp26抗体。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述竞争ELISA方法通过以下步骤构建：
S1、棋盘法确定最佳抗原抗体工作浓度
S101、包被抗原：将Bp26蛋白浓度稀释到1、2、4μg/mL包被到ELISA板上，4℃条件包被过夜；
S102、封闭：PBST溶液洗涤三次，每次5min，加入100μL 2.5％的脱脂奶粉，37℃封闭1h，PBST洗涤三次；
S103、孵育抗体：以2、4、8、16、32、64、128倍稀释纳米抗体表达载体表达的融合蛋白，加入酶标板中，37℃孵育1h，PBST洗涤三次；
S104、显色和终止：加入100μL TMB显色液室温孵育15min，50μL 3M硫酸终止反应，450nm读取吸光值，分析结果，确定竞争ELISA的最佳抗原、抗体稀释浓度；
其中，S103所述纳米抗体表达载体表达的融合蛋白为Nb1-HRP、Nb2-HRP、Nb3-HRP、Nb4-HRP、Nb5-HRP中与Bp26蛋白亲和力最高的融合蛋白；
S2、确定竞争ELISA方法的血清稀释度
S201、包被抗原：将S1得到最佳抗原稀释浓度的Bp26蛋白包被到96孔酶标板上，4℃过夜；
S202、封闭：PBST溶液洗涤三次，加入100μL 2.5％的脱脂奶粉，37℃封闭1h，PBST洗涤三次；
S203、稀释血清：选取阳性血清和阴性血清各四份，按照1:5、1:10、1:15、1:20倍稀释，并与S1得到最佳抗体稀释度稀释的纳米抗体表达载体表达的融合蛋白进行混合，每孔加入100μL混合液，37℃孵育1h，PBST洗涤三次；
S204、显色和终止：TMB显色液室温孵育15min，3M硫酸终止反应；450nm读取吸光值，分析结果，确定竞争ELISA方法的最佳血清稀释度；
S3、基于纳米抗体表达载体表达的融合蛋白建立竞争ELISA方法
S301、包被抗原：将S1得到最佳抗原稀释浓度的Bp26蛋白包被到96孔酶标板上，4℃孵育过夜；
S302、封闭：PBST溶液洗涤三次，每次5min，加入100μL 2.5％的脱脂奶粉，37℃封闭1h；
S303、制备血清和纳米抗体混合液：血清按照S2得到的最佳血清稀释度稀释，纳米抗体表达载体表达的融合蛋白按照S1得到的最佳抗体稀释度稀释，制备混合液并加入酶标板中，每孔100μL，37℃孵育1h，PBST洗涤三次；
S304、显色和终止：加入TMB显色液孵育15min后用3M硫酸终止反应，OD450检测吸光度，分析结果。
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