CN112262213A

CN112262213A - 新型抗pad2抗体

Info

Publication number: CN112262213A
Application number: CN201980038636.6A
Authority: CN
Inventors: 齐藤宪二; 坂田知子; 川野边峻哲; 古贺启太
Original assignee: Fumar Corp
Current assignee: Fumar Corp; Pharma Foods International Co Ltd
Priority date: 2018-06-20
Filing date: 2019-06-19
Publication date: 2021-01-22
Also published as: EP3816289A1; JP7084057B2; US20210246225A1; WO2019244934A1; CA3102360A1; EP3816289A4; JP2022119899A; JPWO2019244934A1; JP7411264B2

Abstract

取得具有优异的PAD2抑制活性的抗PAD2抗体。使用与PAD2的341～357位特异性结合的抗PAD2抗体。或者使用与由序列编号1所示的氨基酸序列构成的肽特异性结合的抗PAD2抗体。

Description

新型抗PAD2抗体

技术领域

本发明涉及新型抗PAD2抗体。

背景技术

已知PAD2(肽基精氨酸脱亚氨酶2)是参与蛋白质中精氨酸的瓜氨酸化的酶。该瓜氨酸化是构成蛋白质的氨基酸中碱性最强的精氨酸转化为中性瓜氨酸的反应，因此对于蛋白质的结构与反应而言是非常重要的。

基于PAD2的瓜氨酸化与疾病的关联性已有很多报道。例如非专利文献1记载了PAD2与TNFα诱导性瓜氨酸化和关节炎有关(Abstract)。非专利文献2中记载了瓜氨酸化髓磷脂碱性蛋白代表多发性硬化症发病的生化途径(Abstract)。非专利文献3中记载了瓜氨酸化组蛋白与关节炎发作的关联性(Abstract)。

专利文献1中记载了用兔PAD2对小鼠进行免疫来制备抗PAD2抗体(Example 1)，该抗体与人PAD2的1～165位结合(Example 3)，检查该抗体的PAD2抑制活性(Example 4)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO/2014/086365

非专利文献

非专利文献1：“Peptidylarginine deiminase 2is required for tumornecrosis factor alpha-induced citrullination and arthritis,but not neutrophilextracellular trap formation.”,Bawadekar et al.,J Autoimmun.2017 Jun；80:39-47.

非专利文献2：“The role of citrullinated proteins suggests a novelmechanism in the pathogenesis of multiple sclerosis.”,Moscarello et al.,Neurochem Res.2007Feb；32(2):251-6.Epub 2006Sep 22.

非专利文献3：“Local Joint inflammation and histone citrullination in amurine model of the transition from preclinical autoimmunity to inflammatoryarthritis.”Sohn et al.,Arthritis Rheumatol.2015 Nov；67(11):2877-87.

发明内容

发明要解决的课题

然而，上述专利文献1的抗PAD2抗体不具有足够强的PAD2抑制活性，存在改善的余地。此外，关于具有优异PAD2抑制活性的抗体也未被报道。

本发明是鉴于上述情况而完成的，其目的在于提供一种具有优异PAD2抑制活性的抗PAD2抗体等。

解决课题的技术手段

本申请发明人等按照下文实施例所记载将由序列编号1所示的氨基酸序列构成的肽(PAD2的341～357位)作为抗原来制备抗PAD2抗体。然后研究了所得抗体对PAD2的反应性，结果惊奇地发现显示出了对PAD2优异的抑制活性。特别是该抗体与根据上述专利文献1制备的抗PAD2抗体(#2和#34)相比，显示出了预想不到的显著优异的PAD2抑制活性。

即根据本发明的一个方面，提供一种与PAD2(肽基精氨酸脱亚氨酶2)的341～357位特异性结合的抗PAD2抗体。使用该抗体能够检测PAD2。使用该抗体能够抑制PAD2的功能。

另外，根据本发明的一个方面，提供一种与由序列编号1所示的氨基酸序列构成的肽特异性结合的抗PAD2抗体。使用该抗体能够检测PAD2。使用该抗体，能够抑制PAD2的功能。

另外，根据本发明的一个方面，提供一种与PAD2的344～357位特异性结合的抗PAD2抗体。使用该抗体，能够检测PAD2。使用抗体，能够抑制PAD2的功能。

另外，根据本发明的一个方面，提供一种编码上述抗PAD2抗体的多核苷酸或载体。根据本发明的一个方面，提供一种含有上述抗PAD2抗体的组合物。根据本发明的一个方面，提供一种含有上述抗PAD2抗体的PAD2的瓜氨酸化活性抑制剂。根据本发明的一个方面，提供一种抗PAD2抗体的生产方法，其包括使含有多核苷酸或载体的细胞增殖的工序。

另外，根据本发明的一个方面，对上述PAD2的KD(M)可以是9.0×10^-8以下，上述结合部位可以是由3个氨基酸取代的丙氨酸扫描确定的结合部位，上述抗PAD2抗体可以是单克隆抗体，上述抗PAD2抗体可以是抗原结合性片段。

附图说明

图1是表示实施例所使用的抗PAD2抗体的亲和性测定的结果的图。

图2是表示添加实施例所使用的抗PAD2抗体时的人PAD2的瓜氨酸化活性的测定结果的图。根据t检验(两侧)观察到相对于抗DNP抗体(阴性对照)具有统计学差异的抗体的结果表示为*(p<0.01)。

图3是表示实施例所使用的抗PAD2抗体的表位(epitope)的评价结果的图。

具体实施方式

以下对本发明实施方式进行详细说明。应予说明，为避免对相同内容的重复赘述，本文对说明进行适当省略。

本发明的一个实施方式为新型的抗PAD2抗体。该抗体例如为与PAD2的341～357位特异性结合的抗PAD2抗体。或者也可以是与由序列编号1所示的氨基酸序列构成的肽特异性结合的抗PAD2抗体。或者也可以是与PAD2的344～357位特异性结合的抗PAD2抗体。使用该抗体，例如能够抑制PAD2的功能。

已知PAD2为通常参与蛋白质中精氨酸的瓜氨酸化的酶。PAD2的氨基酸序列等详细内容可从NCBI(National Center for Biotechnology Information)或HGNC(HUGO GeneNomenclature Committee)等网站获知。NCBI中记载的PAD2的登记号(Accession number)例如为NP_031391.2。PAD2的氨基酸序列例如为序列编号2。PAD2只要具有PAD2活性，其生物来源就没有限定。PAD2例如包括来自人、猴、小鼠、大鼠、狗或猫的PAD2。典型的是，Y、L、N、R、G、D、R、W、I、Q、D、E、I、E、F、G、Y(氨基酸单字母缩写)分别位于PAD2的341～357位。

在本发明的一个实施方式中，“抗PAD2抗体”包括对PAD2具有结合性的抗体。该抗PAD2抗体的生产方法没有特别限定，例如可以通过用PAD2对哺乳类或鸟类进行免疫来生产。与PAD2的341～357位特异性结合的抗PAD2抗体例如可通过用由序列编号1所示的氨基酸序列构成的肽对哺乳类或鸟类进行免疫来生产。与PAD2的344～357位或344～355位特异性结合的抗PAD2抗体例如可通过用由序列编号1所示的氨基酸序列构成的肽或者由序列编号1的4～17位或4～15位的氨基酸序列构成的肽对哺乳类或鸟类来进行免疫来生产。与PAD2的344～357位或344～355位特异性结合的抗PAD2抗体例如可通过筛选对野生型PAD2显示结合性且对344～357或344～355位的Ala变异型PAD2不显示结合性的抗PAD2抗体的工序来获得。

本发明的一个实施方式所涉及的抗PAD2抗体可以是抑制PAD2功能的抗体。功能抑制例如包括抑制瓜氨酸化的活性。本发明的一个实施方式所涉及的抗PAD2抗体可以是与钙结合体PAD2结合的抗体或者抑制钙结合体PAD2功能的抗体。本发明的一个实施方式所涉及的抗PAD2抗体可具有抑制PAD2活性的功能。本发明的一个实施方式所涉及的抗PAD2抗体可具有与钙结合体PAD2结合的抗体或者抑制钙结合体PAD2活性的功能。

本发明的一个实施方式所涉及的抗PAD2抗体可以是单克隆抗体。单克隆抗体与多克隆抗体相比，能够更有效率地作用于PAD2。从更有效率地生产具有所期望效果的抗PAD2单克隆抗体的观点考虑，优选用PAD2对鸡进行免疫。如果没有特别说明，用作抗原的PAD2包含全长PAD2或PAD2肽片段。

本发明的一个实施方式所涉及的抗PAD2抗体的抗体类别没有特别限定，例如可以是IgM、IgD、IgG、IgA、IgE或IgY。另外抗体亚类没有特别限定，例如可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2。

本发明的一个实施方式所涉及的抗PAD2抗体可以是具有PAD2结合活性的抗体片段(以下有时也称为“抗原结合性片段”)。此时具有稳定性或抗体的生产效率提高等效果。

本发明的一个实施方式所涉及的抗PAD2抗体可以是融合蛋白。该融合蛋白可以在PAD2的N或C末端结合有多肽或寡肽。这里，寡肽可以是His标签。另外，融合蛋白可以融合有小鼠、人或鸡的抗体部分序列。像这种融合蛋白也包含在本实施方式所涉及的抗PAD2抗体的一种形式中。

本发明的一个实施方式所涉及的抗PAD2抗体可以是经过用PAD2对鸡进行免疫的工序而获得的抗体。

本发明的一个实施方式所涉及的抗PAD2抗体的KD(M)例如可以是9.0×10^-8、7.0×10^-8、5.0×10^-8、3.0×10^-8、1.0×10^-8、9.0×10^-9、7.0×10^-9、5.0×10^-9、3.0×10^-9以下，也可以是这些数值中任意2个数值的范围内。

本发明的一个实施方式所涉及的抗PAD2抗体可以是与PAD2的野生型或变异型结合的抗体。变异型包含像SNPs这种由个体间DNA序列的差异引起的变异。野生型或变异型的PAD2的氨基酸序列相对于序列编号2所示的氨基酸序列具有优选80％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上、特别优选98％以上的同一性。

在本发明的一个实施方式中，“与PAD2的341～357位特异性结合的抗PAD2抗体”包括与PAD2的341～357位的氨基酸区域内结合的抗体。该抗体例如只要与由序列编号1所示的氨基酸序列构成的肽具有结合性，在PAD2的341～357位内抗体识别的部位就没有限定。该抗体例如包括与含有PAD2的341～357位的1个以上的氨基酸的表位特异性结合的抗体。该抗体包括例如与PAD2的344～357位特异性结合的抗体。在本发明的一个实施方式中，“与PAD2的344～357位特异性结合的抗PAD2抗体”包括与PAD2的344～357位的氨基酸区域内结合的抗体。该抗体包括例如与含有PAD2的344～357位的1个以上的氨基酸的表位特异性结合的抗体。该抗体例如包括与PAD2的344～346位、347～349位、350～352位、353～355位或356～357位特异性结合的抗体。另外，该抗体包括例如与PAD2的344～355位特异性结合的抗体。在本发明的一个实施方式中，“与PAD2的344～355位特异性结合的抗PAD2抗体”包括与PAD2的344～355位的氨基酸区域内结合的抗体。该抗体包括例如与含有PAD2的344～355位的1个以上氨基酸的表位特异性结合的抗体。该抗体包括例如与PAD2的344～346位、347～349位、350～352位或353～355位特异性结合的抗体。另外，该抗体例如包括与PAD2的347～355位特异性结合的抗体。在本发明的一个实施方式中，“与PAD2的347～355位特异性结合的抗PAD2抗体”包括与PAD2的347～355位的氨基酸区域内结合的抗体。该抗体包括例如与含有PAD2的347～355位的1个以上的氨基酸的表位特异性结合的抗体。该抗体包括例如与PAD2的347～349位、350～352位或353～355位特异性结合的抗体。

本发明的一个实施方式所涉及的抗PAD2抗体可以是对野生型PAD2具有结合性且对344～357位的Ala变异型PAD2不具有结合性的抗体。在本发明的一个实施方式中，“344～357位的Ala变异型PAD2”包括PAD2的344～346位、347～349位、350～352位、353～355位、356～357位或344～355位的Ala变异型抗体。另外，344～357位的Ala变异型PAD2除了344～346位、347～349位、350～352位、353～355位或356～357位以外可以不被取代。在本发明的一个实施方式中，“不具有结合性”只要实质上不具有结合性即可。或者包括不具有显著结合性的情况。或者在与对野生型的EC₅₀相比，对评价对象的EC₅₀为2倍以上时可以评价为不具有结合性。此时，EC₅₀为Not determined(不确定)时可以评价为不具有结合性。或者在与对野生型的结合性相比，对评价对象的结合性为50％以下时可以评价为不具有结合性。

本发明的一个实施方式所涉及的抗PAD2抗体可以是对344～357位的Ala变异型PAD2的EC₅₀与对野生型PAD2的EC₅₀相比为2倍以上的抗体。本发明的一个实施方式所涉及的抗PAD2抗体可以是对344～357位的Ala变异型PAD2的EC₅₀与使用了抗PAD2多克隆抗体的情况的EC₅₀相比为2倍以上的抗体。在本发明的一个实施方式中，“2倍以上”例如可以是2、3、4、5、10、100、10⁵、10¹⁰或10¹⁵，也可以是这些数值中任意2个数值的范围内。EC₅₀为Notdetermined(不确定)时也可以评价为包括在2倍以上。反应性例如可采用ELISA或表面等离子体共振分析法来评价。在本发明的一个实施方式中，“抗PAD2多克隆抗体”例如包括抗血清。结合性或反应性包括亲和性。

本发明的一个实施方式所涉及的抗PAD2抗体可以是对344～357位的Ala变异型PAD2的结合性与对野生型PAD2的结合性相比为50％以下的抗体。本发明的一个实施方式所涉及的抗PAD2抗体可以是对344～357位的Ala变异型PAD2的结合性与使用了抗PAD2多克隆抗体的情况的结合性相比为50％以下的抗体。在本发明的一个实施方式中，“50％以下”例如可以是50、45、40、35、30、25、20、15、10、5、1或0％，也可以是这些数值中任意2个数值的范围内。

本发明的一个实施方式所涉及的抗PAD2抗体可以是通过包括如下工序的生成方法获得的抗体：筛选对野生型的PAD2显示显著结合性的抗体的工序，或者筛选对344～357位的Ala变异型PAD2不显示结合性的抗体的工序。

本发明的一个实施方式所涉及的抗PAD2抗体只要对PAD2的341～357位具有特异结合性，也可以对表位内的其它氨基酸残基具有结合性。与特定部位特异性结合的抗体可以是识别特定部位的抗体。

本发明的一个实施方式所涉及的抗PAD2抗体可以是与PAD2的341～357位内的表位特异性结合的抗体。本发明的一个实施方式所涉及的抗PAD2抗体可以是与含有PAD2的341～357位的表位特异性结合的抗体。本发明的一个实施方式所涉及的抗PAD2抗体可以与表位内的PAD2的341～357位以外的氨基酸残基具有结合性。

本发明的一个实施方式所涉及的抗PAD2抗体可以是对序列编号1所示的氨基酸序列的肽具有结合性且对序列编号3～8所示的氨基酸序列的肽的1种以上不具有结合性的抗体。本发明的一个实施方式所涉及的抗PAD2抗体可以是对不含PAD2的341～357位的缺失型PAD2不具有结合性的抗体。

本发明的一个实施方式所涉及的抗PAD2抗体可以是对序列编号3～8所示的氨基酸序列的肽的1种以上的EC₅₀与对野生型PAD2的EC₅₀相比为2倍以上的抗体。本发明的一个实施方式所涉及的抗PAD2抗体可以是对序列编号3～8所示的氨基酸序列的肽的1种以上的EC₅₀与使用了抗PAD2多克隆抗体的情况的EC₅₀相比为2倍以上的抗体。

本发明的一个实施方式所涉及的抗PAD2抗体可以是对序列编号3～8所示的氨基酸序列的肽的1种以上的结合性与对野生型PAD2的结合性相比为50％以下的抗体。本发明的一个实施方式所涉及的抗PAD2抗体可以是对序列编号3～8所示的氨基酸序列的肽的1种以上的结合性与使用了抗PAD2多克隆抗体的情况的的结合性相比为50％以下的抗体。

本发明的一个实施方式所涉及的抗PAD2抗体可以是与序列编号1所示的氨基酸序列的肽的4～17位或4～15位特异性结合的抗体。该抗体只要对序列编号1所示的氨基酸序列的肽的4～17位或4～15位具有结合性，也可以对表位内的其它氨基酸残基具有结合性。应予说明，在本发明的一个实施方式中，“与肽特异性结合的抗体”包括与肽具有特异结合性的抗体。与肽特异性结合的抗体可以是抗体所具有的结合性之一被确定的抗体，对肽具有结合性，对其它化合物也可以具有结合性。“与序列编号1所示的氨基酸序列的肽特异性结合的抗体”包括对其肽具有特异结合性，并且对全长PAD2具有结合性的抗体。与序列编号1所示的氨基酸序列的肽的4～17位或4～15位特异性结合的抗体也相同。

本发明的一个实施方式所涉及的抗PAD2抗体结合的部位例如可以通过丙氨酸扫描来评价。在本发明的一个实施方式中，“丙氨酸扫描”例如为将蛋白质所具有的氨基酸取代成丙氨酸，研究与该蛋白质结合的抗体的性质的方法。采用丙氨酸扫描的评价，例如可以是经由如下工序而能够评价的部位：(i)将抗原的3个氨基酸残基取代成Ala，制备Ala变异体的工序；(ii)测定Ala变异体与被检抗体的亲和性的工序；或者(iii)将被检抗体未显示显著反应性的Ala变异体所对应的Ala取代前的氨基酸残基评价为结合部位的工序。上述工程(i)可包括将多个抗原的3个氨基酸残基取代成Ala，制备多个Ala变异体的工序。该评价方法可包括(iv)测定被检抗体对野生型PAD2的亲和性的工序或者测定Ala变异体与抗PAD2多克隆抗体的亲和性的工序。该评价方法可包括如下工序：(v)测定被检抗体与Ala变异体的亲和性时的被检抗体的EC₅₀值与测定被检抗体与野生型的亲和性时的被检抗体的EC₅₀值相比为2倍以上时，评价为被检抗体未显示显著的反应性的工序；或者测定被检抗体与Ala变异体的亲和性时的被检抗体的EC₅₀値与测定抗PAD2多克隆抗体与Ala变异体的亲和性时的被检抗体的EC₅₀值相比为2倍以上时，评价为被检抗体未显示显著的反应性的工序。丙氨酸扫描可通过3个氨基酸取代进行。此时，抗原中含有的氨基酸数被3除不尽时，抗原的一端也可以是2个氨基酸取代。丙氨酸扫描所使用的抗原可以是PAD2或其肽片段。亲和性例如可采用ELISA或表面等离子体共振分析法来评价。

本发明的一个实施方式所涉及的抗PAD2抗体可以是与含有PAD2的347～354位的表位特异性结合的抗体。本发明的一个实施方式所涉及的抗PAD2抗体可以是与含有PAD2的351、352、353或354位的表位特异性结合的抗体。该抗体只要对PAD2的351、352、353或354位具有结合性，也可以对表位内的其它氨基酸残基具有结合性。本发明的一个实施方式所涉及的抗PAD2抗体可以是与序列编号1所示的氨基酸序列的肽的8、9、10或11位特异性结合的抗体。该抗体只要对肽的8、9、10或11位具有结合性，也可以对表位内的其它氨基酸残基具有结合性。本发明的一个实施方式所涉及的抗PAD2抗体可以是对在PAD2的351、352、353或354位具有Ala变异的变异型PAD2不具有特异结合性的抗体。从瓜氨酸化抑制能力的观点考虑，该抗体特别优选识别PAD2的351、352、353或354位的抗体。此时，结合性可采用将1个氨基酸残基取代成Ala的丙氨酸扫描来评价。

在本发明的一个实施方式中，“抗体”包括能与抗原上的特定表位特异性结合的分子或其群体(population)。另外，抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。抗体可以多种形式存在，例如可以是选自全长抗体(具有Fab区域和Fc区域的抗体)、Fv抗体、Fab抗体、F(ab’)₂抗体、Fab’抗体、双特异抗体(diabody)、单链抗体(例如scFv)、dsFv、多价特异性抗体(例如二价特异性抗体)、具有抗原结合性的肽或多肽、嵌合抗体、小鼠抗体、鸡抗体、人源化抗体、人抗体或它们的同等物(或等价物)中的1种以上的形式。另外，抗体包含抗体修饰物或抗体非修饰物。抗体修饰物可以是抗体与例如聚乙二醇等各种分子结合。抗体修饰物可通过使用公知方法对抗体实施化学修饰来获得。抗体的氨基酸序列、类别或亚类例如可以来源于人、除人以外的哺乳类(例如大鼠、小鼠、兔、牛、猴等)或鸟类(例如鸡)等。另外，抗体包括例如分离抗体、纯化抗体或重组抗体。另外抗体例如可在体外(in vitro)或体内(in vivo)。

在本发明的一个实施方式中，“多克隆抗体”可通过例如对哺乳类(例如大鼠、小鼠、兔、牛、猴等)或鸟类(例如鸡)等施用含靶抗原的免疫原来生成。免疫原可通过注入1种以上的免疫剤或佐剂来施用。佐剂可用来增强免疫反应，可包括弗氏佐剂(完全或不完全)、矿物胶(氢氧化铝等)或表面活性物质(溶血卵磷脂等)等。免疫方案为本领域公知的方案，有时根据所选择的宿主生物采用诱导免疫反应的任意方法进行实施(蛋白质实验手册,羊土社(2003):86-91.)。

在本发明的一个实施方式中，“单克隆抗体”包括构成群体的各个抗体与实质上相同的表位反应时的抗体。或者可以是构成群体(抗体群)的各个抗体实质上相同(允许可自然发生的突变)时的抗体。单克隆抗体具有高度特异性，与通常的多克隆抗体不同，多克隆抗体包括与不同表位对应的不同抗体。单克隆抗体的制备方法没有特别限定，例如可采用例如与“Kohler G,Milstein C.,Nature.1975Aug 7；256(5517):495-497.”中记载的杂交瘤法相同的方法来制备。或者单克隆抗体可采用与美国专利第4816567号中记载的重组法相同的方法来制备。或者单克隆抗体可使用与“Clackson et al.,Nature.1991Aug 15；352(6336):624-628.”或“Marks et al.,J Mol Biol.1991Dec 5；222(3):581-597.”中记载的技术相同的方法从噬菌体抗体库中分离。或者可采用“蛋白质实验手册,羊土社(2003):92-96.”中记载的方法来制备。

在本发明的一个实施方式中，“Fv抗体”是包括抗原识别部位的抗体。该区域包含基于非共有結合的1个重链可变域和1个轻链可变域的二聚体。在该构成中，各可变域的3个CDR可相互作用而在VH-VL二聚体的表面形成抗原结合部位。

在本发明的一个实施方式中，“Fab抗体”例如为用蛋白水解酶木瓜蛋白酶处理包含Fab区域和Fc区域的抗体而得到的片段中，H链的N末端侧的大约一半与L链整体介由部分二硫键结合而成的抗体。Fab例如可通过用蛋白水解酶木瓜蛋白酶处理包含Fab区域和Fc区域的上述本发明实施方式所涉及的抗PAD2抗体来获得。

在本发明的一个实施方式中，“F(ab’)₂抗体”例如是用蛋白水解酶胃蛋白酶处理包含Fab区域和Fc区域的抗体而得到的片段中，含有2个与Fab相当的部位的抗体。F(ab’)₂例如可通过用蛋白水解酶胃蛋白酶处理包含Fab区域和Fc区域的上述本发明实施方式所涉及的抗PAD2抗体来获得。另外，例如可通过使下述Fab’介由硫醚键或二硫键进行键合来制备。

在本发明的一个实施方式中，“Fab’抗体”例如是将F(ab’)₂的铰链区域的二硫键切断而得到的抗体。例如，可用还原剂二硫苏糖醇处理F(ab’)₂来获得。

在本发明的一个实施方式中，“scFv抗体”是VH与VL介由适当的肽接头连接而成的抗体。scFv抗体例如可通过如下方式生产：取得编码上述本发明实施方式所涉及的抗PAD2抗体的VH和VL的cDNA，构筑编码VH-肽接头-VL的多核苷酸，将该多核苷酸组入载体中使用表达用细胞进行生产。

在本发明的一个实施方式中，“diabody”(双特异抗体)是具有二价抗原结合活性的抗体。二价的抗原结合活性可以相同，也可以使一者为不同的抗原结合活性。diabody例如可通过如下方式生产：将编码scFv的多核苷酸构筑成肽接头的氨基酸序列的长度为8残基以下，将载体组入所得多核苷酸中，使用表达用细胞进行生产。

在本发明的一个实施方式中，“dsFv”是将VH以及VL中导入有半胱氨酸残基的多肽介由上述半胱氨酸残基间的二硫键结合而成的抗体。导入半胱氨酸残基的位置可按照Reiter等示出的方法(Reiter et al.,Protein Eng.1994May；7(5):697-704.)根据抗体的立体结构预测来选择。

在本发明的一个实施方式中，“具有抗原结合性的肽或多肽”是含有抗体的VH、VL或它们的CDR1、2或3而构成的抗体。含有多个CDR的肽可直接结合或者介由适合的肽接头结合。

上述Fv抗体、Fab抗体、F(ab’)₂抗体、Fab’抗体、scFv抗体、diabody、dsFv抗体、具有抗原结合性的肽或多肽(以下有时称为“Fv抗体等”)的生产方法没有特别限定。例如可将编码上述本发明实施方式所涉及的抗PAD2抗体中的Fv抗体等区域的DNA组入表达用载体，使用表达用细胞来生产。或者也可以采用Fmoc法(氟烯基甲氧羰基法)、tBOC法(叔丁氧羰基法)等化学合成法来生产。应予说明，上述本发明实施方式所涉及的抗原结合性片段可以是上述Fv抗体等的1种以上。

在本发明的一个实施方式中，“嵌合抗体”例如是将异种生物间的抗体的可变区与抗体的恒定区连接而成的抗体，可通过基因重组技术建立。例如可举出小鼠-人嵌合抗体、鸡-人嵌合抗体、鸡-小鼠嵌合抗体等。小鼠-人嵌合抗体例如可采用“Roguska et al.,ProcNatl Acad Sci U S A.1994Feb 1；91(3):969-973.”中记载的方法制备。用于制备小鼠-人嵌合抗体的基本方法例如将克隆化的cDNA中存在的小鼠前导序列和可变区序列与对哺乳类细胞的表达载体中已经存在的人抗体恒定区进行编码的序列连接。或者可以在将克隆化的cDNA中存在的小鼠前导序列和可变区序列与编码人抗体恒定区的序列连接之后再与哺乳类细胞表达载体连接。人抗体恒定区的片段可以成为任意人抗体的H链恒定区和人抗体的L链恒定区的片段，例如关于人H链的片段，可举出Cγ1、Cγ2、Cγ3或Cγ4，关于L链的片段，可分别举出Cλ或Cκ。

在本发明的一个实施方式中，“人源化抗体”例如是具有非人类来源的1个以上的CDR和人免疫球蛋白来源的框架区、以及人免疫球蛋白来源的恒定区，且与所期望的抗原结合的抗体。抗体的人源化可采用本领域已知的各种方法。在本发明的一个实施方式中“人抗体”例如是包含构成抗体的重链的可变区和恒定区、轻链的可变区和恒定区的区域来自于编码人免疫球蛋白的基因的抗体。人抗体的制备可采用本领域已知的各种方法。

本发明的一个实施方式所涉及的抗PAD2抗体可以是scFv的形态，此时重链与轻链间可以具有接头。接头例如代表性地可举出由G和P构成的0～5个氨基酸的序列，但并不限定于此。接头并非必需，也可以不存在。

在本发明的一个实施方式中，“氨基酸”是具有氨基和羧基的有机化合物的总称。本发明实施方式所涉及的抗体含有“特定的氨基酸序列”时，该氨基酸序列中的任意氨基酸可接受化学修饰。另外，该氨基酸序列中的任意氨基酸可以形成盐或溶剂合物。另外，该氨基酸序列中的任意氨基酸可以是L型或D型。在这种情况下，本发明的实施方式所涉及的抗体可以说也含有上述“特定的氨基酸序列”。作为蛋白质中含有的氨基酸在机体内受到的化学修饰，例如已知有N末端修饰(例如乙酰化、豆蔻酰化等)、C末端修饰(例如酰胺化、糖基磷脂酰肌醇加成等)或侧链修饰(例如磷酸化、糖链加成等)等。

本发明的一个实施方式为编码上述本发明实施方式所涉及的抗PAD2抗体的多核苷酸或载体。通过将该多核苷酸或载体导入细胞，可制备转化体。转化体可以是人或除人以外的哺乳动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠、兔、牛、猴等)的细胞。作为哺乳动物细胞，例如可举出中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、猴细胞COS-7、人胎儿来源的肾细胞(例如HEK293细胞)等。或者转化体可以是Escherichia属菌、酵母等。上述多核苷酸或载体可构建成能够表达抗PAD2抗体。上述多核苷酸或载体例如可包含启动子、增强子、复制起点或抗生素抗性基因等蛋白质表达所需的构成要素。上述多核苷酸或载体可以具有异种来源的碱基序列。异种来源的碱基序列例如可含有选自人和除人以外的生物(例如细菌、古细菌、酵母、昆虫、鸟类、病毒或除人以外的哺乳动物等)的2种以上的生物来源的碱基序列。

作为上述载体，例如可使用来自大肠杆菌的质粒(例如pET-Blue)、来自枯草菌的质粒(例如pUB110)、来自酵母的质粒(例如pSH19)、动物细胞表达质粒(例如pA1-11、pcDNA3.1-V5/His-TOPO)、λ噬菌体等来自噬菌体、病毒的载体等。载体可以是表达载体，可以为环状。

作为将上述多核苷酸或载体导入细胞的方法，例如可采用磷酸钙法、脂质转染法、电穿孔法、基于腺病毒的方法、基于逆转录病毒的方法或微注射等(改订第4版新基因工程手册,羊土社(2003):152-179.)。作为使用了细胞的抗体的生产方法，例如可采用“蛋白质实验手册,羊土社(2003):128-142.”中记载的方法。

本发明的一个实施方式为抗PAD2抗体的生产方法，包括使含有上述本发明实施方式所涉及的多核苷酸或载体的细胞增殖的工序。上述增殖工序包括培养工序。另外，该生产方法可包括回收抗PAD2抗体的工序。另外，该生产方法可包括制备细胞培养液的工序。另外，该生产方法可包括纯化抗PAD2抗体的工序。

在本发明的一个实施方式中、抗体纯化例如可使用硫酸铵、乙醇沉淀、蛋白A、蛋白G、凝胶过滤色谱、阴离子、阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水性相互作用色谱、亲和层析、羟磷灰石色谱或凝集素层析等(蛋白质实验手册,羊土社(2003):27-52.)。

本发明的一个实施方式为含有上述本发明实施方式所涉及的抗PAD2抗体的组合物。使用该组合物能够有效地检测PAD2。另外，能够有效抑制PAD2的瓜氨酸化。该组合物所含有的成分没有特别限定，例如可含有缓冲液。对于该组合物，可适用后述的抑制剂和医药组合物所涉及的各种实施方式(例如可含有载体等)中的1个以上。

本发明的一个实施方式为含有上述本发明实施方式所涉及的抗PAD2抗体的PAD2的瓜氨酸化活性抑制剂。使用该抑制剂能够有效抑制基于PAD2的瓜氨酸化。上述抑制剂引起的瓜氨酸化活性的降低率可以是20、30、40、60、80％以上，也可以是这些数值中任意2个数值的范围内。该降低率例如可由将使用PBS时的降低率设为0％时的相对比例来表示。在本发明的一个实施方式中，“剂”例如包括用于研究或治疗的组合物。上述抑制剂例如包括治疗剂。上述抑制剂例如可在体外或体内使用。上述抑制剂可含有上述本发明实施方式所涉及的组合物。本发明的一个实施方式为PAD2的瓜氨酸化活性抑制方法，包括使上述本发明实施方式所涉及的抗PAD2抗体与PAD2接触的工序。本发明的一个实施方式为PAD2的瓜氨酸化活性抑制方法，包括对患者施用上述本发明实施方式所涉及的抗PAD2抗体的工序。上述抑制方法包括为研究或治疗而进行的抑制方法。本发明的一个实施方式为上述本发明实施方式所涉及的抗PAD2抗体在生产PAD2的瓜氨酸化活性抑制剂中的用途。在本发明的一个实施方式中，进行瓜氨酸化的蛋白质没有特别限定，例如包括具有精氨酸的蛋白质。该蛋白质例如包括组蛋白、髓磷脂碱性蛋白。

本发明的一个实施方式为含有上述本发明实施方式所涉及的抗PAD2抗体的医药组合物。该医药组合物可含有药学上可接受的1种以上的载体。医药组合物例如包括关节炎、类风湿关节炎或多发性硬化症的治疗用医药组合物。上述医药组合物可以包括上述本发明实施方式所涉及的组合物。本发明的一个实施方式为疾病治疗方法，包括将上述本发明实施方式所涉及的抗PAD2抗体(或者含抗PAD2抗体的医药组合物)施用于患者的工序。治疗例如包括关节炎、类风湿关节炎、多发性硬化症或舍格伦综合征的治疗。后述实施例中记载的S4等抗PAD2抗体能够强力抑制组蛋白的瓜氨酸化，因此对关节炎或类风湿关节炎的治疗特别有效。另外，S4等抗PAD2抗体能够强力抑制髓磷脂碱性蛋白的瓜氨酸化，因此对多发性硬化症的治疗特别有效。本发明的一个实施方式为上述本发明实施方式所涉及的抗PAD2抗体在生产医药组合物中的用途。

本发明的一个实施方式为PAD2的检测试剂，其含有上述本发明实施方式所涉及的抗PAD2抗体。使用该试剂能够有效检测PAD。本发明的一个实施方式为PAD2的检测方法，其包括使上述本发明实施方式所涉及的抗PAD2抗体与试验样品接触的工序。本发明的一个实施方式为试剂盒，其含有上述本发明实施方式所涉及的抗PAD2抗体。使用该试剂盒，例如能够治疗、诊断疾病或者检测PAD2。该试剂盒例如可含有上述本发明实施方式所涉及的组合物、抑制剂、医药组合物、诊断药物或检测试剂，还可以含有说明书、缓冲液、容器或包装。

在本发明的一个实施方式中，“治疗”包括发挥对患者疾病或伴随于疾病的1个以上症状的症状改善效果、抑制效果或予防效果。在本发明的一个实施方式中，“治疗药物”可以是含有有效成分和药学上可接受的1种以上的载体的医药组合物。在本发明的一个实施方式中，“医药组合物”例如可以将有效成分和上述载体混合，采用制剂学技术领域已知的任意方法制备。另外，医药组合物只要是用于治疗的组合物其使用方式没有限制，可以是单独的有效成分，也可以是有效成分与任意成分的混合物。另外，上述载体的形状没有特别限定，例如可以是固体或液体(例如缓冲液)。上述载体的含量例如可以是制剂学上的有效量。有效量例如可以是对于有效成分在制剂学上的稳定性或递送而言足够的量。例如缓冲液对药瓶中有效成分的稳定化是有效的。给药量、给药间隔、给药方法没有特别限定，可根据患者的年龄、体重、症状、目标脏器等适当选择。另外，医药组合物优选含有治疗有效量或可发挥所期望作用的有效量的有效成分。

本发明的一个实施方式为促进组合物的瓜氨酸化活性抑制能力的方法，包括增加组合物中与PAD2的341～357位特异性结合的抗PAD2抗体的比例的工序。本发明的一个实施方式为含抗PAD2抗体的组合物，组合物中的抗PAD2抗体分子的90％以上是与PAD2的341～357位特异性结合的抗PAD2抗体。本发明的一个实施方式为含抗PAD2抗体的抗体群，抗体群中的抗PAD2抗体分子的90％以上是与PAD2的341～357位特异性结合的抗PAD2抗体。上述90％以上例如可以是90、95、96、97、98、99％以上或100％，也可以是这些数值中任意2个数值的范围内。

本发明的一个实施方式为由序列编号1所示的氨基酸序列构成的肽。使用该肽能够生产与PAD2结合的抗体。另外，能够检测与PAD2结合的抗体。由序列编号1所示的氨基酸序列构成的肽可以被化学修饰(例如KLH修饰)，这种化学修饰肽也包括在由序列编号1所示的氨基酸序列构成的肽的一种形式中。由序列编号1所示的氨基酸序列构成的肽可以是经分离、纯化或浓缩的肽。

本发明的一个实施方式为含有由序列编号1所示的氨基酸序列的肽的抗原组合物。该抗原组合物例如可以含有缓冲液或佐剂。本发明的一个实施方式为抗PAD2抗体的生产方法，包括用由序列编号1所示的氨基酸序列构成的肽对哺乳类或鸟类进行免疫的工序。本发明的一个实施方式为抗PAD2抗体的生产方法，包括使由序列编号1所示的氨基酸序列构成的肽与抗体或抗体库接触的工序。本发明的一个实施方式为与PAD2结合的抗体的检测方法，包括使由序列编号1所示的氨基酸序列构成的肽与含抗PAD2抗体的试验样品接触的工序。本发明的一个实施方式为含有由序列编号1所示的氨基酸序列构成的肽的与活性型PAD2结合的抗体的检测用组合物。

在本发明的一个实施方式中，“结合”可以是共价结合或非共价结合中的任一种，例如可以是离子键、氢键、疏水性相互作用或亲水性相互作用。

在本发明的一个实施方式中，“显著”例如可以是使用student t检验(单侧或两侧)评价统计学显著差异为p＜0.05或p＜0.01的状态。或者可以是产生实质性差异的状态。

本说明书中引用的所有刊行物、公报类(专利或专利申请)可通过参照整体援引。

在本说明书中，“或者”在采用文章中列举事项中的“至少1者以上”时使用。“或”也同样适用。在本说明书中，指定“2个数值的范围内”时，该范围包含该2个数值本身。在本说明书中，“A～B”是指A以上且B以下。

以上对本发明的实施方式进行了阐述，但这些仅为本发明的例示，也可以采用上述以外的各种构成。另外，还可以将上述实施方式所述的构成组合使用。

【实施例】

以下通过实施例进一步说明本发明，但本发明并不限定于这些实施例。

＜实施例1＞抗PAD2抗体的制备

用经KLH修饰的肽抗原(序列编号1、PAD2的341～357位)分别对3只3月龄的BorisBrown(鸡)以每只333μg进行腹腔免疫。一次免疫使用完全弗氏佐剂(014-09541、Wako)免疫抗原，二次和三次免疫使用不完全弗氏佐剂(011-09551、Wako)免疫抗原。四次免疫静脉注射稀释于PBS(phosphate buffered saline；磷酸盐缓冲溶液)的抗原。每隔一周从翼下静脉采血，采用ELISA确认抗体滴度。实施至三次免疫，将四次免疫周五最终免疫。最终免疫3天后，回收鸡脾脏，采用使用了Ficoll paque PLUS(17-1440-03、GE Healthcare)的密度梯度离心分离淋巴细胞，使用TRIzole Reagent(15596026、Life Technologies)提取RNA。采用使用了PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(6210A、TAKARA)的RT-PCR从提取的RNA合成cDNA，制作scFv噬菌体库。表达载体使用插入鸡λ链代替pPDS的小鼠κ链的类型的表达载体。scFv噬菌体库的制作按照参考文献：“Nakamura et al.,J Vet MedSci.2004Ju；66(7):807-814”中记载的方法进行。

使用scFv噬菌体抗体库，利用固定化有全长PAD2的板进行淘选。淘选按照参考文献：“Nakamura et al.,J Vet Med Sci.2004Ju；66(7):807-814”中记载的方法进行。进行5次淘选后，采用使用了固定化有合成肽的板的ELISA确认抗体库的反应性，从反应性开始提高的抗体库筛选噬菌体。筛选过程中，用大肠杆菌感染噬菌体，接种至含有氨苄西林(50μg/ml、nacalai公司)的2×YT Agar plate，将所得菌落在含有氨苄西林的2×YT液体培养基中培养。感染辅助噬菌体后，在含有氨苄西林(50μg/ml)、卡那霉素(25μg/ml、明治制果株式会社)、IPTG(100μg/ml、nacalai)的2×YT液体培养基中进行噬菌体的诱导。采用使用了抗原固定化板的ELISA确认所得培养上清液中的scFv噬菌体抗体的反应性。对所得阳性克隆使用DNA测序仪(ABI PRISM3100-Genetic Analyzer、Applied Biosystems)进行测序，确定序列。

对于序列不同的克隆，以编码scFv抗体的DNA链为模板，采用PCR对鸡来源的抗体基因H链可变区和L链可变区的扩增后，将PCR产物用SacII和NheI限制酶处理(R0157S、R0131S、BioLabs)，将H链可变区和L链可变区分别重组到同样经限制酶处理的小鼠/鸡嵌合抗体(IgG1)表达载体(H链用表达载体：pcDNA4/myc-His；L链用表达载体：pcDNA3/myc-His、Invitrogen)中。将制备的H链和L链的构建体转染于CHO细胞后，采用固定有全长PAD2的ELISA确认反应性。小鼠嵌合表达载体使用Tateishi et al.,J Vet Med Sci.2008Apr；70(4):397-400中记载的载体。将根据以上获得的抗体克隆中的S4、S10、S24、S47、S108、S113、S170、S309用于以下实验。以下，有时将这些抗体统称为“S4等”。

＜实施例2＞抗PAD2抗体的反应性评价

(2-1)ELISA

按以下条件进行ELISA，评价S4等对人PAD2的反应性。

(2-1-1)材料

·抗体：抗PAD2抗体(S4、S10、S24、S47、S108、S113、S170、S309)、WO/2014/086365的抗PAD2抗体(#2、#34)、抗二硝基苯基(DNP)抗体(阴性对照抗体)。上述#2、#34使用根据WO/2014/086365的实施例中记载的可变区的氨基酸序列制备的抗体(以下实施例也相同)。

·抗原：全长人PAD2抗原

(2-1-2)实验条件

【表1】

(2-1-3)结果

根据抗PAD2抗体的ELISA的结果求出50％效果浓度(EC₅₀)的值。将结果示于表2。值越小表示反应性越高。所有抗体均显示出对PAD2的高反应性。

【表2】

	EC<sub>50</sub>(ng/mL)
		S4	7.9
S10	2.7
		S24	10.7
S47	3.5
		S108	4.8
S113	3.0
		S170	16.1
S309	30.8
		#2	26.2
#34	1.9

(2-2)Biacore(生物大分子相互作用分析仪)

使用Biacore(GE Healthcare、Biacore T200)评价S4等对人PAD2的亲和性。

(2-2-1)材料

·抗体：抗PAD2抗体(S4、S10、S24、S47、S108、S113、S170、S309)

·抗原：全长人PAD2抗原

(2-2-2)方法

使用Biacore(GE Healthcare、Biacore T200)评价S4等对人PAD2的亲和性。亲和性的测定使用Mouse Antibody Capture Kit(GE Healthcare、BR-1008-38)。具体而言，按照商家提供的标准规程使用NHS/EDC，采用利用了CM5芯片表面的游离羧基的氨基偶联法将兔抗小鼠多克隆抗体固定于CM5芯片表面。接着将S4等捕获于兔抗小鼠多克隆抗体。向Biacore T200供给各种浓度的人PAD2，制作动力学传感图。

(2-2-3)结果

将亲和性测定的结果示于表3和图1。所有抗体均显示出对PAD2的高亲和性。

【表3】

＜实施例3＞抗PAD2抗体的瓜氨酸化抑制活性能力的评价

按以下条件测定抗PAD2抗体抑制PAD2的瓜氨酸化活性的能力。

(3-1)材料

·重组蛋白：含有全长重组人PAD2的粗组分

·底物：BAEE(Nα-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯盐酸盐)

·抗体：抗DNP抗体(阴性对照)、抗PAD2抗体(S4、S10、S24、S47、S108、S113、S170、S309)、WO/2014/086365的抗PAD2抗体(#34)

(3-2)方法

使用制备好的抗PAD2抗体(S4、S10、S24、S47、S108、S113、S170、S309)、#34、抗DNP抗体(阴性对照)分别制备5μL的1-6000nM抗体溶液。制备5μL的3.75ng/μL(50nM)人PAD2。接着将这些溶液与Tris-HCl缓冲液(pH 7.6)、NaCl、DTT按总量44μL混合。将该溶液在室温下静置30分钟后，同时加入5μL的100mM BAEE(苯甲酰精氨酸乙酯)、1μL的0.05M CaCl₂并充分搅拌。此时的溶液总量为50μL，最终浓度分别为20mM Tris-HCl(pH7.6)、150mM NaCl、1mMDTT、10mM BAEE、1mM CaCl₂、5nM人PAD2和0.1-600nM的各抗体。将该溶液在37℃静置4小时，加入12.5μL的5M高氯酸终止反应。将该溶液中含有的瓜氨酸化的BAEE进行比色定量。

(3-3)结果

将对人PAD2赋予50％活性抑制的抗体浓度(EC₅₀)示于表4。在浓度为600nM以下且无法算出赋予50％活性抑制的抗体浓度时，记为ND(Not determined)。表示S4等抗体具有比#34高的抑制活性能力。

【表4】

	EC<sub>50</sub>(nM)
		S4	14.83
S10	14.22
		S24	19.83
S47	15.31
		S108	14.69
S113	9.42
		S170	20.25
S309	8.88
		#34	ND

＜实施例4＞抗PAD2抗体的瓜氨酸化抑制活性能力的评价

按以下条件测定抗PAD2抗体抑制钙结合体PAD2的瓜氨酸化活性的能力。

(4-1)材料

·重组蛋白：含有全长重组人PAD2的粗组分

·底物：BAEE(Nα-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯盐酸盐)

·抗体：抗DNP抗体(阴性对照)、抗PAD2抗体(S4、S10、S24、S47、S108、S113、S170、S309)、WO/2014/086365的抗PAD2抗体(#2)

(4-2)方法

制备5μL的3.75ng/μL(50nM)人PAD2，以总量成为29μL与Tris-HCl缓冲液(pH7.6)、NaCl、DTT混合。向该溶液中添加5μL的CaCl₂在室温下静置30分钟。向该溶液中同时加入含有制备好的抗PAD2抗体(S4、S10、S24、S47、S108、S113、S170、S309)、#2或抗DNP抗体(阴性对照)的0.5-3000nM抗体溶液10μL；100mM BAEE(苯甲酰精氨酸乙酯)5μL、水1μL并充分搅拌。此时的溶液总量为50μL，最终浓度为20mM Tris-HCl(pH 7.6)、150mM NaCl、1mM DTT、10mM BAEE、1mM CaCl₂、5nM人PAD2、以及0.1-600nM各抗体。将该溶液在37℃静置4小时，加入5M的高氯酸12.5μL终止反应。将该溶液中含有的瓜氨酸化的BAEE进行比色定量。

(4-3)结果

将对人PAD2赋予25％活性抑制的抗体浓度(EC₂₅)示于表5。在浓度为600nM以下且无法算出赋予25％活性抑制的抗体浓度时，记为ND(Not determined)。关于钙结合体PAD2的瓜氨酸化活性，显示出S4等抗体具有比#2高的抑制活性能力。

【表5】

	EC<sub>25</sub>(nM)
		S4	16.7
S10	3.5
		S24	86.9
S47	5.4
		S108	4.9
S113	2.9
		S170	160.9
S309	7.2
		#2	ND

＜实施例5＞抗PAD2抗体的瓜氨酸化抑制活性能力的评价

按以下条件测定抗PAD2抗体抑制PAD2的瓜氨酸化活性。此时，底物使用小牛胸腺来源的组蛋白。

(5-1)材料

·重组蛋白：含有全长重组人PAD2的粗组分

·底物：来自小牛胸腺的组蛋白

·抗体：抗DNP抗体(阴性对照)、抗PAD2抗体(S4、S10、S24、S47、S108、S113、S170)、WO/2014/086365的抗PAD2抗体(#2、#34)

(5-2)方法

使用制备好的抗PAD2抗体(S4、S10、S24、S47、S108、S113、S170)、#2、#34、抗DNP抗体(阴性对照)分别制备1-6000nM的抗体溶液5μL，制备3.75ng/μL(50nM)人PAD2 5μL，将这些溶液与Tris-HCl缓冲液(pH 7.6)、NaCl、DTT按总量为44μL混合。将该溶液在室温下静置30分钟后，同时加入5μL的小牛胸腺来源的组蛋白、1μL的0.05M CaCl₂并充分搅拌。此时的溶液总量为50μL，最终浓度为20mM Tris-HCl(pH 7.6)、150mM NaCl、1mM DTT、1.8mg/mL组蛋白、1mM CaCl₂、5nM人PAD2、和0.1-600nM的各抗体。将该溶液在37℃静置4小时，加入5M的高氯酸12.5μL终止反应。将该溶液中含有的瓜氨酸化的小牛胸腺来源的组蛋白进行比色定量。

(5-3)结果

将对人PAD2赋予50％活性抑制的抗体浓度(EC₅₀)示于表6。在浓度为600nM以下且无法算出赋予50％活性抑制的抗体浓度时，记为ND(Not determined)。显示出S4等抗体具有比#2和#34高的抑制活性能力。

【表6】

	EC<sub>50</sub>(nM)
		S4	14.7
S10	7.6
		S24	15.2
S47	7.5
		S108	8.2
S113	6.2
		S170	16.5
#2	150.8
		#34	ND

＜实施例6＞抗PAD2抗体的瓜氨酸化活性抑制能力的评价

按以下条件测定抗PAD2抗体抑制PAD2的瓜氨酸化活性。此时，底物使用牛来源的髓磷脂碱性蛋白。

(6-1)材料

·重组蛋白：含有全长重组人PAD2的粗组分

·底物：牛来源的髓磷脂碱性蛋白

·抗体：抗DNP抗体(阴性对照)、抗PAD2抗体(S4、S10、S24、S47、S108、S113、S170、S309)、WO/2014/086365的抗PAD2抗体(#2、#34)

(6-2)方法

使用制备好的抗PAD2抗体(S4、S10、S24、S47、S108、S113、S170、S309)、#2、#34、抗DNP抗体(阴性对照)分别制备6000nM的抗体溶液5μL，制备3.75ng/μL(50nM)人PAD2 5μL，将这些溶液与Tris-HCl缓冲液(pH7.6)、NaCl、DTT按总量44μL混合。将该溶液在室温下静置30分钟后，同时加入5μL的牛来源的髓磷脂碱性蛋白、1μL的0.05M CaCl₂并充分搅拌。此时的溶液总量为50μL，最终浓度为20mM Tris-HCl(pH7.6)、150mM NaCl、1mM DTT、1.8mg/mL牛来源的髓磷脂碱性蛋白、1mM CaCl₂、5nM人PAD2、和600nM的各抗体。将该溶液在37℃静置4小时，加入5M的高氯酸12.5μL终止反应。将该溶液中含有的瓜氨酸化的牛来源的髓磷脂碱性蛋白进行比色定量。

(6-3)结果

将添加各抗体时的人PAD2的瓜氨酸化活性能的测定结果示于图2。图2的值为将TBS的值设为100％时的平均值和标准偏差。#2和#34的抗体未观察到抑制活性。另一方面，S4等抗体显示出高抑制活性能力。与抗DNP抗体(阴性对照)具有显著差异的抗体表示为*(p<0.01)。

＜实施例7＞表位评价

(7-1)方法

对抗原序列(YLNRGDRWIQDEIEFGY、序列编号1)的氨基酸残基，每次将3个连续氨基酸取代成丙氨酸，合成6个Ala变异体(序列编号3～8)。评价各Ala变异体与制备好的抗PAD2抗体(S4、S10、S24、S108、S170、S309)的反应性(ELISA)。将S4等抗体未显示出显著反应性的Ala变异体所对应的Ala取代前的氨基酸残基评价为表位。

(7-2)Ala变异体

AAARGDRWIQDEIEFGY(序列编号3)

YLNAAARWIQDEIEFGY(序列编号4)

YLNRGDAAAQDEIEFGY(序列编号5)

YLNRGDRWIAAAIEFGY(序列编号6)

YLNRGDRWIQDEAAAGY(序列编号7)

YLNRGDRWIQDEIEFAA(序列编号8)

(7-3)实验条件

【表7】

(7-4)结果

S4等相对于各Ala变异体和原始抗原序列的50％效果浓度(EC₅₀)的值示于图3。根据该结果可知，S4等对在与PAD2的344～357位对应的位置具有变异的Ala变异体未显示出显著的反应性。因此可知，S4等可识别341～357位中特别是PAD2的344～357位内的氨基酸。

根据以上实施例可知，与PAD2的341～357位结合的抗体对于基于PAD2的瓜氨酸化具有优异的抑制活性。

以上基于实施例对本发明进行了说明。这些实施例仅为例示，本领域技术人员应当理解，本发明还存在各种变形例，这些变形例也包括在本发明的范围内。

序列表

<110> 富尔玛株式会社（PHARMA FOODS INTERNATIONAL CO., LTD.）

<120> 新型抗PAD2抗体

<130> 6415PFI

<150> JP2018-117142

<151> 2018-06-20

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 肽

<400> 1

Tyr Leu Asn Arg Gly Asp Arg Trp Ile Gln Asp Glu Ile Glu Phe Gly

1 5 10 15

Tyr

<210> 2

<211> 665

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 2

Met Leu Arg Glu Arg Thr Val Arg Leu Gln Tyr Gly Ser Arg Val Glu

1 5 10 15

Ala Val Tyr Val Leu Gly Thr Tyr Leu Trp Thr Asp Val Tyr Ser Ala

20 25 30

Ala Pro Ala Gly Ala Gln Thr Phe Ser Leu Lys His Ser Glu His Val

35 40 45

Trp Val Glu Val Val Arg Asp Gly Glu Ala Glu Glu Val Ala Thr Asn

50 55 60

Gly Lys Gln Arg Trp Leu Leu Ser Pro Ser Thr Thr Leu Arg Val Thr

65 70 75 80

Met Ser Gln Ala Ser Thr Glu Ala Ser Ser Asp Lys Val Thr Val Asn

85 90 95

Tyr Tyr Asp Glu Glu Gly Ser Ile Pro Ile Asp Gln Ala Gly Leu Phe

100 105 110

Leu Thr Ala Ile Glu Ile Ser Leu Asp Val Asp Ala Asp Arg Asp Gly

115 120 125

Val Val Glu Lys Asn Asn Pro Lys Lys Ala Ser Trp Thr Trp Gly Pro

130 135 140

Glu Gly Gln Gly Ala Ile Leu Leu Val Asn Cys Asp Arg Glu Thr Pro

145 150 155 160

Trp Leu Pro Lys Glu Asp Cys Arg Asp Glu Lys Val Tyr Ser Lys Glu

165 170 175

Asp Leu Lys Asp Met Ser Gln Met Ile Leu Arg Thr Lys Gly Pro Asp

180 185 190

Arg Leu Pro Ala Gly Tyr Glu Ile Val Leu Tyr Ile Ser Met Ser Asp

195 200 205

Ser Asp Lys Val Gly Val Phe Tyr Val Glu Asn Pro Phe Phe Gly Gln

210 215 220

Arg Tyr Ile His Ile Leu Gly Arg Arg Lys Leu Tyr His Val Val Lys

225 230 235 240

Tyr Thr Gly Gly Ser Ala Glu Leu Leu Phe Phe Val Glu Gly Leu Cys

245 250 255

Phe Pro Asp Glu Gly Phe Ser Gly Leu Val Ser Ile His Val Ser Leu

260 265 270

Leu Glu Tyr Met Ala Gln Asp Ile Pro Leu Thr Pro Ile Phe Thr Asp

275 280 285

Thr Val Ile Phe Arg Ile Ala Pro Trp Ile Met Thr Pro Asn Ile Leu

290 295 300

Pro Pro Val Ser Val Phe Val Cys Cys Met Lys Asp Asn Tyr Leu Phe

305 310 315 320

Leu Lys Glu Val Lys Asn Leu Val Glu Lys Thr Asn Cys Glu Leu Lys

325 330 335

Val Cys Phe Gln Tyr Leu Asn Arg Gly Asp Arg Trp Ile Gln Asp Glu

340 345 350

Ile Glu Phe Gly Tyr Ile Glu Ala Pro His Lys Gly Phe Pro Val Val

355 360 365

Leu Asp Ser Pro Arg Asp Gly Asn Leu Lys Asp Phe Pro Val Lys Glu

370 375 380

Leu Leu Gly Pro Asp Phe Gly Tyr Val Thr Arg Glu Pro Leu Phe Glu

385 390 395 400

Ser Val Thr Ser Leu Asp Ser Phe Gly Asn Leu Glu Val Ser Pro Pro

405 410 415

Val Thr Val Asn Gly Lys Thr Tyr Pro Leu Gly Arg Ile Leu Ile Gly

420 425 430

Ser Ser Phe Pro Leu Ser Gly Gly Arg Arg Met Thr Lys Val Val Arg

435 440 445

Asp Phe Leu Lys Ala Gln Gln Val Gln Ala Pro Val Glu Leu Tyr Ser

450 455 460

Asp Trp Leu Thr Val Gly His Val Asp Glu Phe Met Ser Phe Val Pro

465 470 475 480

Ile Pro Gly Thr Lys Lys Phe Leu Leu Leu Met Ala Ser Thr Ser Ala

485 490 495

Cys Tyr Lys Leu Phe Arg Glu Lys Gln Lys Asp Gly His Gly Glu Ala

500 505 510

Ile Met Phe Lys Gly Leu Gly Gly Met Ser Ser Lys Arg Ile Thr Ile

515 520 525

Asn Lys Ile Leu Ser Asn Glu Ser Leu Val Gln Glu Asn Leu Tyr Phe

530 535 540

Gln Arg Cys Leu Asp Trp Asn Arg Asp Ile Leu Lys Lys Glu Leu Gly

545 550 555 560

Leu Thr Glu Gln Asp Ile Ile Asp Leu Pro Ala Leu Phe Lys Met Asp

565 570 575

Glu Asp His Arg Ala Arg Ala Phe Phe Pro Asn Met Val Asn Met Ile

580 585 590

Val Leu Asp Lys Asp Leu Gly Ile Pro Lys Pro Phe Gly Pro Gln Val

595 600 605

Glu Glu Glu Cys Cys Leu Glu Met His Val Arg Gly Leu Leu Glu Pro

610 615 620

Leu Gly Leu Glu Cys Thr Phe Ile Asp Asp Ile Ser Ala Tyr His Lys

625 630 635 640

Phe Leu Gly Glu Val His Cys Gly Thr Asn Val Arg Arg Lys Pro Phe

645 650 655

Thr Phe Lys Trp Trp His Met Val Pro

660 665

<210> 3

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 肽

<400> 3

Ala Ala Ala Arg Gly Asp Arg Trp Ile Gln Asp Glu Ile Glu Phe Gly

1 5 10 15

Tyr

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 肽

<400> 4

Tyr Leu Asn Ala Ala Ala Arg Trp Ile Gln Asp Glu Ile Glu Phe Gly

1 5 10 15

Tyr

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 肽

<400> 5

Tyr Leu Asn Arg Gly Asp Ala Ala Ala Gln Asp Glu Ile Glu Phe Gly

1 5 10 15

Tyr

<210> 6

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 肽

<400> 6

Tyr Leu Asn Arg Gly Asp Arg Trp Ile Ala Ala Ala Ile Glu Phe Gly

1 5 10 15

Tyr

<210> 7

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 肽

<400> 7

Tyr Leu Asn Arg Gly Asp Arg Trp Ile Gln Asp Glu Ala Ala Ala Gly

1 5 10 15

Tyr

<210> 8

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 肽

<400> 8

Tyr Leu Asn Arg Gly Asp Arg Trp Ile Gln Asp Glu Ile Glu Phe Ala

1 5 10 15

Ala

Claims

1.一种抗PAD2抗体，其与PAD2(肽基精氨酸脱亚氨酶2)的341～357位或由序列编号1所示的氨基酸序列构成的肽特异性结合。

2.根据权利要求1所述的抗PAD2抗体，其为与由序列编号1所示的氨基酸序列构成的肽特异性结合的抗体。

3.根据权利要求1或2所述的抗PAD2抗体，其为与PAD2的344～357位特异性结合的抗体。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗PAD2抗体，其抑制PAD2的瓜氨酸化活性。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗PAD2抗体，其对PAD2的KD(M)为9.0×10^-8以下。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗PAD2抗体，其中，所述结合部位是通过3个氨基酸取代的丙氨酸扫描确定的结合部位。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的抗PAD2抗体，其为单克隆抗体。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的抗PAD2抗体，其为抗原结合性片段。

9.一种多核苷酸或载体，其编码权利要求1至8中任一项所述的抗PAD2抗体。

10.一种组合物，其含有权利要求1至8中任一项所述的抗PAD2抗体。

11.一种PAD2的瓜氨酸化活性抑制剂，其含有权利要求1～8中任一项所述的抗PAD2抗体。

12.一种抗PAD2抗体的生产方法，其包括使含有权利要求9所述的多核苷酸或载体的细胞增殖的工序。

13.一种肽，其由序列编号1所示的氨基酸序列构成。

14.根据权利要求13所述的肽，其为化学修饰肽。

15.一种抗原组合物，其含有权利要求13或14所述的肽。

16.一种抗PAD2抗体的生产方法，其含有用权利要求13或14所述的肽对哺乳类或鸟类进行免疫的工序。