JP6215231B2 - リゾチームのタグとしての使用 - Google Patents
リゾチームのタグとしての使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6215231B2 JP6215231B2 JP2014552662A JP2014552662A JP6215231B2 JP 6215231 B2 JP6215231 B2 JP 6215231B2 JP 2014552662 A JP2014552662 A JP 2014552662A JP 2014552662 A JP2014552662 A JP 2014552662A JP 6215231 B2 JP6215231 B2 JP 6215231B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- lysozyme
- polypeptide
- amino acids
- fusion protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/35—Fusion polypeptide containing a fusion for enhanced stability/folding during expression, e.g. fusions with chaperones or thioredoxin
Description
(a)対象となるタンパク質をコードする遺伝子が発現する条件下で宿主細胞を培養するステップと;
(b)このタンパク質、ペプチド、又はアミノ酸を単離するステップと;
を具える。
(a)本発明に係るベクター;
(b)リゾチームに特異的な抗体;
(c)選択的に、ここに記載した方法によるベクターと抗体の使用指示書;
を具えるキットを提供する。
(a)宿主細胞中に誘導タンパク質を発現させるステップと、
(b)この融合タンパク質を単離するステップと、
を具え、この融合タンパク質のポリペプチドドメインの一つがリゾチームである。
(a)宿主細胞中に融合タンパク質を発現させるステップと、
(b)この融合タンパク質を宿主細胞と培地から単離するステップと、
を具え、この融合タンパク質のポリペプチドドメインの一つがリゾチームであり、ステップ(a)の融合タンパク質の収率が、リゾチームポリペプチドドメインを含まないタンパク質の収率に比べて、少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍より高い。
(a)宿主細胞中に融合タンパク質を発現させるステップと、
(b)この融合タンパク質を宿主細胞と培地から単離するステップと、
を具え、この融合タンパク質のポリペプチドドメインの一つがリゾチームであり、ステップ(a)で発現した融合タンパク質が、凝集又は封入体を形成しない。
(a)宿主細胞中に誘導タンパク質を発現させるステップであって、融合タンパク質が対象となるポリペプチド又はタンパク質とリゾチームを含むステップと、
(b)この融合タンパク質を単離するステップと、
を具える。
(a)宿主細胞中に誘導タンパク質を発現させるステップであって、融合タンパク質が対象となるポリペプチド又はタンパク質とリゾチームを含むステップと、
(b)この融合タンパク質を宿主細胞と培地から単離するステップと、
を具える。
用語「ポリペプチド」は、ここでは、当業者に認識されている最も広い意味で使用されている。ポリペプチドは、ペプチド結合を介して結合された少なくとも二つのアミノ酸を含む。通常、ポリペプチドは30以上のアミノ酸を含む。
例えば、標準pcDNA3.1ベクター(Invitorogen)又はpMAX発現ベクター(図1、図2)などの真核発現ベクターであり、pcDNA3.1に基づいて改変した発現ベクターを用いて、本発明を実行した。pMAX発現ベクターは、効率のよいトランスクリプションと翻訳のために、例えば、複製源、抗生物質耐性、並びに調節配列(例えば、促進剤、強化材、ポリアデニル化部位)を含む。各融合パートナー又はタグ(例えば、リゾチーム、GST,His,Fc)を、標準サブクローニングを用いて、多重クローニング部位(MCS)の3’−末端に挿入した(図1)。図2では、ニワトリリゾチームを含むpMax発現構造のヌクレオチド配列が例示されている。
実施例1に係るベクターの様々な変異を精製して、特定のタグ(例えば、リゾチーム、GST,His,Fc)に融合した対象となる特定のたんぱく質をコードして、哺乳類宿主細胞の転写した。
3.1 8種のタンパク質を分析
対象となる8種類のタンパク質を、リゾチーム融合タンパク質として発現させ及び精製するために選択した。全てのタンパク質は哺乳類細胞株(例えば、HKB11)によって発現及び分泌され、細胞培地上澄から生成した。選択したタンパク質は、非常に発現率が低く、及び/又はFc−融合、GST−融合、あるいはHis−タグ化タンパク質として高い凝集を示した。反対に、リゾチームとの融合は、すべてのタンパク質について、発現率を高め、及び/又は、タンパク質の品質を大きく改善した。
タンパク質1は、哺乳類発現ベクターでコードされ、二つの異なるタグの特定の組み合わせに融合した。これによって、His−タグ又はリゾチームタグのいずれかを使用して、His−タグ(固定化金属親和性クロマトグラフィ、IMACを用いて)又はリゾチーム(セファロース4FFに結合したリゾチーム特異的抗体としてMOR3207を用いて)を介して生成を行った。His−タグを用いてはタンパク質1の発現が検出されなかったのに対して、リゾチームを用いた融合によって、タンパク質1を発現することができた(表1)。更に、リゾチーム特異的抗体を介した融合タンパク質の精製では、IMACを介した精製に比べて非常に大量のタンパク質を算出した。更に、精製したタンパク質の凝集は検出されなかった。
分析したタンパク質4、5、及び6は、発現率が強化されているだけではなく、リゾチーム融合タンパク質として発現されている場合に凝集が少ないことを示す。タンパク質4の発現は3倍以上増えており、タンパク質がHisに代えてリゾチームと融合している場合は、凝集が3倍以上低減された(表4)。
Claims (13)
- 単離した単量体ポリペプチド又はタンパク質を生成する方法において、当該方法が:
(a)前記単量体ポリペプチド又はタンパク質を宿主細胞中で融合タンパク質として発現させるステップであって、前記融合タンパク質が前記単量体ポリペプチド又はタンパク質とリゾチームとを含み、前記融合タンパク質が前記宿主細胞から細胞培地上澄へと分泌されるステップ;および
(b)前記分泌融合タンパク質を前記細胞培地上澄から単離するステップ;
を具え、前記単量体ポリペプチド又はタンパク質が少なくとも110アミノ酸長の長さを有することを特徴とする方法。 - 請求項1に記載の方法において、前記融合タンパク質の収率が、リゾチームを含まない単量体ポリペプチド又はタンパク質の収率に比べて、少なくとも2倍高いことを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法において、前記単量体ポリペプチド又はタンパク質及びリゾチームを含む融合タンパク質の15%未満が凝集体を形成することを特徴とする方法。
- 請求項1乃至3のいずれか1項に記載の方法において、前記宿主細胞が真核細胞又は原核細胞であることを特徴とする方法。
- 請求項1乃至4のいずれか1項に記載の方法において、前記宿主細胞が、前記単量体ポリペプチド又はタンパク質とリゾチームとを含む前記融合タンパク質をコードする発現ベクターでトランスフェクトされていることを特徴とする方法。
- 請求項1乃至5のいずれか1項に記載の方法において、前記単量体ポリペプチド又はタンパク質が、少なくとも120アミノ酸長、少なくとも125アミノ酸長、少なくとも150アミノ酸長、少なくとも200アミノ酸長、少なくとも250アミノ酸長、少なくとも300アミノ酸長、少なくとも400アミノ酸長、又は少なくとも500アミノ酸長の長さを有することを特徴とする方法。
- 請求項1乃至6のいずれか1項に記載の方法において、前記融合タンパク質が培地から単離されていることを特徴とする方法。
- 請求項7に記載の方法において、前記融合タンパク質が、リゾチームに特異的な抗体で単離されていることを特徴とする方法。
- 請求項1乃至8のいずれか1項に記載の方法において、前記リゾチームが哺乳類リゾチームであることを特徴とする方法。
- 請求項1乃至9のいずれか1項に記載の方法において、前記リゾチームが、リゾチームの断片、類似体、同族体、変異又は誘導体であることを特徴とする方法。
- 請求項1乃至10のいずれか1項に記載の方法に用いるための、少なくとも110アミノ酸長の長さのポリペプチド又はタンパク質とリゾチームとを含む融合タンパク質をコードする発現ベクターと、リゾチームに特異的な抗体とを含むことを特徴とするキット。
- 請求項11に記載のキットにおいて、前記リゾチームに特異的な抗体が、支持基体に付着していることを特徴とするキット。
- 請求項12に記載のキットにおいて、前記支持基体が、アガロース、セファロース、ポリアクリルアミド、アガロース/ポリアクリルアミドコポリマー、デキシトラン、セルロース、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ニトロセルロース、ガラス、紙、及び磁気粒子からなる群から選択されることを特徴とするキット。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201261589408P | 2012-01-23 | 2012-01-23 | |
US61/589,408 | 2012-01-23 | ||
EP12152095.1 | 2012-01-23 | ||
EP12152095 | 2012-01-23 | ||
PCT/EP2013/051181 WO2013110627A1 (en) | 2012-01-23 | 2013-01-23 | Use of lysozyme as a tag |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2015504683A JP2015504683A (ja) | 2015-02-16 |
JP6215231B2 true JP6215231B2 (ja) | 2017-10-18 |
Family
ID=48872896
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014552662A Active JP6215231B2 (ja) | 2012-01-23 | 2013-01-23 | リゾチームのタグとしての使用 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9689014B2 (ja) |
EP (1) | EP2807179B1 (ja) |
JP (1) | JP6215231B2 (ja) |
KR (1) | KR20140122729A (ja) |
CN (1) | CN104066745B (ja) |
AU (1) | AU2013211651C1 (ja) |
CA (1) | CA2860916A1 (ja) |
ES (1) | ES2582802T3 (ja) |
HK (1) | HK1202298A1 (ja) |
IN (1) | IN2014DN06660A (ja) |
WO (1) | WO2013110627A1 (ja) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105524942A (zh) * | 2016-02-05 | 2016-04-27 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种表达载体及胰岛素样生长因子结合蛋白3的表达方法 |
WO2018113745A1 (en) * | 2016-12-21 | 2018-06-28 | Novozymes A/S | Polypeptides having lysozyme activity, polynucleotides encoding same and uses and compositions thereof |
EP3559224A4 (en) | 2016-12-21 | 2021-01-20 | Novozymes A/S | POLYPEPTIDES WITH LYSOZYMACTIVITY, POLYNUCLEOTIDES FOR CODING THEREOF, AND USES AND COMPOSITIONS THEREOF |
CN107794254A (zh) * | 2017-09-30 | 2018-03-13 | 昆明理工大学 | 重组高温裂解酶的快速纯化方法 |
WO2022133068A1 (en) * | 2020-12-16 | 2022-06-23 | Danisco Us Inc | Enzymes and enzyme compositions for cleaning |
WO2023168234A1 (en) * | 2022-03-01 | 2023-09-07 | Danisco Us Inc. | Enzymes and enzyme compositions for cleaning |
Family Cites Families (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US2459701A (en) | 1945-07-16 | 1949-01-18 | Harper Esther Pardee | Mechanical instrument holder |
US4355022A (en) | 1981-07-01 | 1982-10-19 | Interon, Inc. | Method of dental treatment |
JP2761881B2 (ja) * | 1988-03-10 | 1998-06-04 | チッソ株式会社 | 抗体を固定化したアフイニテイクロマトグラフイ用担体 |
DK0425016T3 (da) | 1989-10-27 | 1996-05-06 | Genencor Int | Antimikrobiel fremgangsmåde og formulering med anvendelse af type II endoglycosidase og antimikrobielt middel |
EP1007842B1 (de) | 1997-08-22 | 2004-12-15 | Siemens Aktiengesellschaft | Verfahren zur klopfregelung einer brennkraftmaschine |
CA2346075A1 (en) | 1998-10-15 | 2000-04-20 | Dsm N.V. | Antimicrobial enzymes in animal feed |
EP1194570A1 (en) * | 1999-06-23 | 2002-04-10 | PPL Therapeutics (Scotland) Limited | Fusion proteins incorporating lysozyme |
AU2003205053B2 (en) | 2002-01-07 | 2008-10-16 | Lifesensors, Inc. | Methods and compositions for protein expression and purification |
DE10237317B4 (de) | 2002-08-15 | 2010-04-08 | 3M Espe Ag | Enzymhaltige Zusammensetzung, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung |
CA2404356A1 (en) | 2002-09-18 | 2004-03-18 | Canadian Inovatech Inc. | Gram-positive antibacterial composition and method for use |
US7428273B2 (en) | 2003-09-18 | 2008-09-23 | Promptu Systems Corporation | Method and apparatus for efficient preamble detection in digital data receivers |
NZ549198A (en) | 2004-02-25 | 2009-05-31 | Novozymes As | Fungal cell wall degrading lysozyme for use as an inhibitor of dental biofilms |
EP2826462A1 (en) | 2007-04-10 | 2015-01-21 | Saint Simeon Lda. | Novel compositions containing lysozyme and C-1/C-4 polysaccharides and use thereof in oral care, cosmetology and dermatology, contraception, urology and gynecology |
EP2767591A1 (en) | 2007-10-17 | 2014-08-20 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Method and composition for crystallizing G protein-coupled receptors |
CN101817883B (zh) * | 2010-03-12 | 2012-06-13 | 广东药学院 | 一种家蝇天蚕素-人溶菌酶融合蛋白及其制备方法和应用 |
-
2013
- 2013-01-23 KR KR1020147023426A patent/KR20140122729A/ko not_active Application Discontinuation
- 2013-01-23 ES ES13700913.0T patent/ES2582802T3/es active Active
- 2013-01-23 AU AU2013211651A patent/AU2013211651C1/en active Active
- 2013-01-23 CA CA2860916A patent/CA2860916A1/en not_active Abandoned
- 2013-01-23 US US14/368,513 patent/US9689014B2/en active Active
- 2013-01-23 EP EP13700913.0A patent/EP2807179B1/en active Active
- 2013-01-23 JP JP2014552662A patent/JP6215231B2/ja active Active
- 2013-01-23 IN IN6660DEN2014 patent/IN2014DN06660A/en unknown
- 2013-01-23 WO PCT/EP2013/051181 patent/WO2013110627A1/en active Application Filing
- 2013-01-23 CN CN201380006389.4A patent/CN104066745B/zh active Active
-
2015
- 2015-03-18 HK HK15102797.4A patent/HK1202298A1/xx unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN104066745B (zh) | 2017-04-12 |
US20140349343A1 (en) | 2014-11-27 |
CN104066745A (zh) | 2014-09-24 |
EP2807179A1 (en) | 2014-12-03 |
KR20140122729A (ko) | 2014-10-20 |
JP2015504683A (ja) | 2015-02-16 |
HK1202298A1 (en) | 2015-09-25 |
US9689014B2 (en) | 2017-06-27 |
EP2807179B1 (en) | 2016-04-20 |
AU2013211651C1 (en) | 2017-10-12 |
CA2860916A1 (en) | 2013-08-01 |
IN2014DN06660A (ja) | 2015-05-22 |
ES2582802T3 (es) | 2016-09-15 |
WO2013110627A1 (en) | 2013-08-01 |
AU2013211651A1 (en) | 2014-07-24 |
AU2013211651B2 (en) | 2017-03-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6215231B2 (ja) | リゾチームのタグとしての使用 | |
KR20190044059A (ko) | 신규한 알칼리 안정성 면역글로불린 결합 단백질 | |
JPWO2010110288A1 (ja) | 免疫グロブリンに親和性を有するタンパク質および免疫グロブリン結合性アフィニティーリガンド | |
JP2010075175A (ja) | 改善された特異性を有する新規免疫グロブリン結合タンパク質 | |
CN101351550A (zh) | 具有卓越的伴侣和折叠活性的嵌合融合蛋白 | |
EP2881403A1 (en) | Scavenger containing protein formed from tandem-type multimer of mutant extracellular domain of protein g | |
WO2013018880A1 (ja) | プロテインgの細胞膜外ドメイン変異体のタンデム型多量体から成る新規な改変型タンパク質 | |
US20220112236A1 (en) | Immunoglobulin binding proteins for affinity purification | |
JP5307716B2 (ja) | ドックリンポリペプチドおよびそれを利用した組換え融合タンパク質の精製方法 | |
JP2009297018A (ja) | 弱酸性域での解離特性を改良した抗体結合性タンパク質及び抗体捕捉剤 | |
US8426572B2 (en) | Artificial entropic bristle domain sequences and their use in recombinant protein production | |
Zhang et al. | Fusion partners as a tool for the expression of difficult proteins in mammalian cells | |
JPH10509038A (ja) | 免疫、精製及び検出適用のためのたんぱく質、ペプチド及び複合物の高い水準の発現と容易な精製 | |
US20120277410A1 (en) | Dehydrin-based entropic bristle domain sequences and their use in recombinant protein production | |
US20090137004A1 (en) | Artificial entropic bristle domain sequences and their use in recombinant protein production | |
US8916154B2 (en) | Antibodies against delta-5 desaturase and uses thereof | |
CN104945488B (zh) | 一种具有免疫球蛋白结合能力的多肽 | |
KR20240002371A (ko) | 코로나바이러스의 수용체 결합 도메인 및 대장균의 항원 43 단백질의 융합 단백질 및 이의 용도 | |
AU2021307552A1 (en) | Immunoglobulin binding proteins for affinity purification | |
KR20200053906A (ko) | 재조합 항원을 이용하여 목적 항원 특이적인 항체를 제조하는 방법 | |
Dodson et al. | Production of antisera using fusion proteins | |
WO2015093507A1 (ja) | プロテインgの細胞膜外ドメインの新規な改変型タンパク質 | |
JP2005269935A (ja) | 蛋白質の生産方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20160122 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20161122 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20170222 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170424 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20170829 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20170920 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6215231 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |