KR20240002371A

KR20240002371A - 코로나바이러스의 수용체 결합 도메인 및 대장균의 항원 43 단백질의 융합 단백질 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20240002371A
Application number: KR1020220079487A
Authority: KR
Inventors: 안지영; 김양훈; 윤효원
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2022-06-29
Filing date: 2022-06-29
Publication date: 2024-01-05

Abstract

본 발명은 코로나바이러스의 수용체 결합 도메인 및 대장균의 항원 43 단백질의 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 융합 단백질은 코로나바이러스의 RBD와 대장균의 Ag43 단백질이 융합된 융합 단백질로서, 대장균의 외막에 RBD 단백질이 발현된 형태로 대량생산할 수 있고 생산된 RBD 단백질이 ACE2 단백질과 결합하여 그 활성을 유지함으로써, 코로나바이러스 감염증의 진단이나, 항체생산 확인에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

코로나바이러스의 수용체 결합 도메인 및 대장균의 항원 43 단백질의 융합 단백질 및 이의 용도{FUSION PROTEIN COMPRISING RECEPTOR BINDING DOMAIN OF CORONAVIRUS AND ANTIGEN 43 PROTEIN OF E.COLI AND USE THE SAME}

본 발명은 코로나바이러스의 수용체 결합 도메인 및 대장균의 항원 43 단백질의 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.

SARS-CoV-2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)에 의해 발병되는 신종코로나바이러스 감염증(coronavirus disease 2019, COVID-19)은 2019년 12월 중국 우한에서 처음 발생한 뒤 2020년 3월 범유행전염병으로 선언된 호흡기 감염질환이다. COVID-19의 예방을 위해 백신 접종이 이루어지고 있지만, 시간 경과에 따른 항체 감소와 돌발성 감염, 돌연변이 발생으로 인해 여전히 감염과 전염의 위험이 있다.

한편, SARS-CoV-2의 구조 단백질 중에서 스파이크(spike, S) 단백질은 숙주세포를 감염시키는 중요한 부위로서, 숙주세포의 안지오텐신 전환 효소(Angiotensin-converting enzyme 2, ACE2)와 결합하며 SARS-CoV-2 바이러스가 세포 내부로 침투하는데 중요한 역할을 한다. 이때, S 단백질 중, 수용체 결합 부위(Receptor Binding Domain, RBD)가 핵심 부위로서 작용하며, 이는 COVID-19 환자에서 생성되는 중화 항체와의 결합에 강한 상관 관계를 나타낸다. 따라서, COVID-19 감염에 대해 숙주에서 생성되는 항체의 표적부위인 RBD는 백신 및 항체 기반의 진단 분석의 표적 부위로 연구되고 있다.

관련하여, 대한민국 특허공개 제10-2022-0012810호는 SARS-CoV-2 바이러스 S 단백질의 에피토프에 결합하는 중화 결합 분자에 관한 것으로, SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질의 RBD 내 특정 에피토프에 특이적으로 우수한 결합력으로 결합하고, SARS-CoV-2 바이러스의 중화 효과를 나타내는 항체가 COVID-19의 진단, 예방 또는 치료에 유용함을 개시하고 있다.

현재 COVID-19 연구에 사용하기 위한 RBD 재조합 단백질은 곤충세포, 효모, 동물 세포 발현 시스템 등을 이용하여 제작되고 있다. 이와 같은 진핵세포는 번역 후 변형과정이 사람과 유사하게 이루어질 수 있어 정확한 항원 단백질을 생성할 수 있다. 그러나, 낮은 발현 수율과 긴 배양 시간으로 재조합 항원의 효율적 대량생산이 어렵다는 단점이 있다. 반면, 대장균과 같은 박테리아의 발현 시스템은 이용이 간편하고, 저렴하며, 배양 시간이 짧기에 대량 생산이 가능한 장점이 있다. 그러나, 이 경우 생산된 단백질의 폴딩과정을 별도로 수행해야 하고, 생산된 RBD 단백질이 활성을 나타내지 않으며, 발현률이 낮다는 단점이 있다.

대한민국 특허공개 제10-2022-0012810호

본 발명의 목적은 SARS-CoV-2의 수용체 결합 도메인 및 대장균의 항원 43 단백질의 융합 단백질 및 이의 용도를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 코로나바이러스의 수용체 결합 도메인(receptor binding domain, RBD) 및 대장균의 항원 43(antigen 43, Ag43) 단백질의 융합 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 이를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드 및 재조합 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 융합 단백질 또는 상기 숙주세포를 포함하는 코로나바이러스 감염증 진단용 조성물 및 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 융합 단백질 또는 상기 숙주세포를 시료와 반응시키는 단계를 포함하는 코로나바이러스 감염증 진단의 정보를 제공하기 위한 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 융합 단백질 또는 상기 숙주세포를 포함하는 코로나바이러스에 대한 항체생성 확인용 조성물 또는 키트를 제공한다.

나아가, 본 발명은 상기 융합 단백질 또는 상기 숙주세포를 시료와 반응시키는 단계를 포함하는 코로나바이러스에 대한 항체생성 확인 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 융합 단백질은 코로나바이러스의 RBD와 대장균의 Ag43 단백질이 융합된 융합 단백질로서, 대장균의 외막에 RBD 단백질이 발현된 형태로 대량생산할 수 있고 생산된 RBD 단백질이 ACE2 단백질과 결합하여 그 활성을 유지함으로써, 코로나바이러스 감염증의 진단이나, 항체생산 확인에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 대장균에서 Ag43 단백질이 발현되며 외막에 표지되는 기전을 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 제조된 RBD 및 Ag43 융합 단백질의 발현 카세트(expression cassette)를 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서 제조된 RBD 및 Ag43 융합 단백질을 발현하는 발현벡터의 구조를 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에서 RBD 및 Ag43 융합 단백질을 발현하는 세포에서 외막을 분리하는 과정을 나타내는 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에서 제조된 RBD를 표면에 발현하는 대장균 외막을 현미경으로 관찰한 사진 및 크기 분포를 확인한 결과 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에서 제조된 RBD를 표면에 발현하는 외막에서 RBD 및 Ag43의 발현을 웨스턴블롯으로 확인한 결과 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에서 제조된 RBD를 표면에 발현하는 외막과 ACE2 단백질의 결합 친화도를 확인한 결과 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에서 제조된 RBD를 표면에 발현하는 외막을 이용하여 SARS-CoV-2 단백질을 ELISA 방법으로 확인한 결과 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 코로나바이러스의 수용체 결합 도메인(receptor binding domain, RBD) 및 대장균의 항원 43(antigen 43, Ag43) 단백질의 융합 단백질을 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어, '코로나바이러스(coronavirus)'는 코로나바이러스과(Coronaviridae)에 속하고, 양성-단일가닥 RNA 바이러스로서 약 26 내지 32 kb 크기의 게놈을 가진다. 또한, 코로나바이러스는 80 내지 220 ㎚ 직경의 구형으로 표면에 꽃잎 모양의 돌기를 갖는 외피로 둘러싸여 있다. 상기 코로나바이러스는 α-코로나바이러스, β-코로나바이러스, γ-코로나바이러스 및 δ-코로나바이러스를 모두 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 코로나바이러스는 신종 코로나바이러스(SARS-CoV-2)일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "수용체 결합 도메인(receptor binding domain, RBD)"은 코로나바이러스의 스파이크 단백질에 포함되는 부위로, 스파이크 단백질이 숙주세포의 ACE2 단백질과 결합할때 중요한 역할을 한다. 상기 RBD 도메인은 스파이크 단백질의 S1 서브유닛(subunit)에 포함되며, S1 서브유닛의 318 내지 541 아미노산 잔기에 해당될 수 있다.

상기 RBD는 통상의 기술분야에 코로나바이러스의 RBD라고 알려진 모든 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 RBD는 신종 코로나바이러스의 S 단백질에 포함되는 RBD일 수 있고, 이는 구체적으로 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드일 수 있다. 또한, 상기 RBD를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 서열 또한 통상의 기술분야에 알려진 모든 염기서열을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 7로 기재되는 염기서열로 구성될 수 있다.

또한, 본 명세서에서 사용된 용어, "항원 43(antigen 43, Ag43) 단백질"은 대장균의 자가수송체 경로인 제5형 분비 시스템(Type Ⅴ Secretion System, T5SS)에 포함되는 당단백질로서, 대장균의 내막을 가로질러 외막에 삽입된 형태로 발현된다. 상기 Ag43 단백질은 단백질이 내막으로 이동할 수 있는 신호 펩타이드(Signal peptide, SP), 대장균 표면에 표지된 패신져(passenger), 외막에 전위 구멍을 형성하는 전위 단위(Trnaslocation unit, TU)로 구성될 수 있다. 상기 Ag43 단백질은 통상의 기술분야에 대장균의 Ag43 단백질이라고 알려진 모든 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 Ag43 단백질은 Ag43 단백질의 전위 단위일 수 있다. 구체적으로, 상기 Ag43 단백질의 TU는 통상의 기술분야에 대장균 Ag43 단백질의 TU라고 알려진 모든 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 TU는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드일 수 있다. 또한, 상기 TU를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 서열 또한 통상의 기술분야에 알려진 모든 염기서열을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 2로 기재되는 염기서열로 구성될 수 있다.

본 발명에 따른 융합 단백질은, 제조된 융합 단백질이 숙주세포의 외막에 발현될 수 있도록 이의 N-말단에 신호서열(signal peptide, SP)을 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 신호서열은 세포 내에서 생산된 재조합 단백질을 숙주세포의 외막으로 이동시킬 수 있다고 알려진 모든 신호서열을 포함할 수 있다.

일례로, 상기 신호서열은 Ag43 단백질의 신호서열일 수 있다. 구체적으로, 상기 신호서열은 통상의 기술분야에 대장균 Ag43 단백질의 신호서열이라고 알려진 모든 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 신호서열은 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드일 수 있다. 또한, 상기 신호서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 서열 또한 통상의 기술분야에 알려진 모든 염기서열을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 구성될 수 있다.

상기 서술된 폴리펩티드는 단백질 각각의 활성을 유지하는 범위 내에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합에 의해 상이한 서열을 갖는 변이체를 포함할 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 또는 펩티드에서의 아미노산 교환은 통상의 기술분야에 잘 알려져 있다. 또한, 상기 폴리펩티드는 이를 구성하는 아미노산 서열과 70%, 80%, 90%, 95% 또는 97% 이상의 상동성을 가질 수 있다. 상기 폴리펩티드는 경우에 따라서 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylaton), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수 있다.

상기 융합 단백질은 통상의 기술분야에 잘 알려진 방법으로 제조될 수 있다. 일례로, 상기 융합 단백질은 하나의 발현벡터에서 융합 단백질의 형태로 발현되거나, 각각의 발현벡터에서 발현된 후 융합 단백질의 형태를 형성할 수 있다. 이때, 상기 두 단백질은 링커로 연결될 수 있다. 상기 링커는 융합 단백질 각각의 활성에 영향을 주지 않는 한 적당한 길이로 삽입될 수 있다. 구체적으로, 상기 링커는 RBD의 C-말단에 연결될 수 있다. 상기 링커는 통상의 기술분야에 융합 단백질의 제조에 사용될 수 있다고 알려진 모든 종류의 링커를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 링커는 글라이신(glycine, G) 및 세린(serine, S)으로 구성된 폴리펩티드일 수 있고, 20개 이하의 아미노산 잔기로 구성된 폴리펩티드일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 링커는 서열번호 3으로 기재되는 폴리펩티드일 수 있다.

본 발명에 따른 융합 단백질 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드는 상술한 바와 같은 융합 단백질에 포함되는 RBD 및 Ag43 단백질을 암호화하는 염기서열로 구성될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 RBD 및 Ag43 단백질을 암호화하는 염기서열뿐 아니라 단백질의 활성을 유지하는 한, 하나 이상의 염기가 치환, 결실 또는 삽입된 변이체를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 이를 구성하는 염기서열과 70%, 80%, 90%, 95% 또는 97% 이상의 상동성을 가질 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, '발현벡터(expression vector)'는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터, 코스미드 백터, 박테리오파지 벡터, 바이러스 벡터 등을 모두 포함할 수 있다. 상기 발현벡터는 이에 포함되는 핵산으로부터 펩티드를 생성하기 위해 필요한 요소를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 발현벡터는 신호서열, 복제기점, 마커 유전자, 프로모터, 전사 종결 서열 등을 포함할 수 있다. 이때, 본 발명에 따른 융합 단백질이 암호화된 폴리뉴클레오티드는 프로모터와 작동적으로 연결될 수 있다.

일례로, 원핵세포에 사용되는 발현벡터는 전사를 진행시키는 프로모터, 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리, 및 전사와 해독의 종결서열을 포함할 수 있다. 한편, 진핵세포에 사용되는 발현벡터는 포유동물 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 폴리아데닐화 서열을 포함할 수 있다.

또한, 상기 발현벡터에 포함되는 마커 유전자로는 통상의 기술분야에 알려진 것을 모두 사용할 수 있으며, 구체적으로 항생제 내성 유전자일 수 있다. 구체적으로, 상기 항생제 내성 유전자는 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 네오마이신, 테트라사이클린 등을 포함하는 항생제에 대해 내성을 나타내는 유전자일 수 있다.

본 발명에 따른 숙주세포에 포함되는 폴리뉴클레오티드 및 재조합 벡터는 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.

상기 숙주세포는 통상의 기술분야에 융합 단백질을 생산하기 위해 사용될 수 있다고 알려진 모든 종류의 세포를 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 숙주세포는 원핵세포, 효모 또는 진핵세포일 수 있다. 상기 원핵세포는 대장균(E. coli), 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스 속 균주, 슈도모나스 속 균주, 스타필로코쿠스 속 균주 등을 포함할 수 있고, 상기 효모는 사카로마이세스 세레비지애 등을 포함할 수 있다. 한편, 상기 진핵세포는 COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PERC6, SP2/0, NS-0, U20S 및 HT1080 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 숙주세포는 대장균일 수 있다.

또한, 상기 숙주세포는 통상의 기술분야에 알려진 방법에 따라 상술한 바와 같은 폴리뉴클레오티드 및 재조합 벡터가 형질주입된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 형질주입은 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개 형질감염(DEAE dextran-mediated transfection), 폴리브렌-매개 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법, 유전자 총(gene gun) 등의 방법으로 수행될 수 있다. 또한, 상기 방법은 통상의 기술자에 의해 적절히 변형될 수 있다.

상기 코로나바이러스 감염증 진단용 조성물 및 키트에 포함되는 융합 단백질 또는 숙주세포는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 또한, 상기 코로나바이러스도 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있고, 일례로, 상기 코로나바이러스는 SARS-CoV-2일 수 있다.

또한, 상기 조성물은 본 발명에 따른 융합 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함할 수 있다. 상기 리간드는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체가 표지된 접합체, 및 스트렙타비딘 또는 아비딘이 처리된 리간드일 수 있다. 본 발명의 진단용 조성물은 상기 서술한 바와 같은 시약 외에도 이들의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 더 포함할 수 있다.

또한, 상기 키트는 이에 포함되는 융합 단백질의 세척이나 복합체의 분리 등과 같은 이후 단계를 용이하게 하기 위해 고형 기질에 결합될 수 있다. 이때, 고형 기질로는 합성수지, 니트로셀룰로오스, 유리기판, 금속기판, 유리섬유, 미세구체 또는 미세비드가 사용될 수 있다. 또한, 합성수지로는 폴리에스터, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, PVDF 또는 나일론 등이 사용될 수 있다.

또한, 상기 키트는 당업자에게 알려진 종래의 제조방법에 의해 제조될 수 있으며, 완충액, 안정화제, 불활성 단백질 등을 더 포함할 수 있다.

상기 코로나바이러스 감염증 진단의 정보를 제공하기 위한 방법에 사용되는 융합 단백질 또는 숙주세포는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 또한, 상기 코로나바이러스도 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있고, 일례로, 상기 코로나바이러스는 SARS-CoV-2일 수 있다.

상기 시료는 코로나바이러스 감염증을 진단하고자 하는 시료라면 모든 종류의 시료를 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 방법은 코로나바이러스의 RBD를 이용하여 시료 내에 존재하는 코로나바이러스의 항체를 검출함으로써, 코로나바이러스 감염증을 간접적으로 진단하기 위한 정보를 제공할 수 있다. 이때, 융합 단백질을 이용하여 시료 내에 존재하는 항체를 검출하는 방법은 통상의 기술분야에 잘 알려져 있으며, 이는 필요에 따라 통상의 기술자에 의해 적절히 변형되어 수행될 수 있다.

상기 코로나바이러스에 대한 항체생성 확인용 조성물 또는 키트에 포함되는 융합 단백질 또는 숙주세포는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 또한, 상기 코로나바이러스도 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있고, 일례로, 상기 코로나바이러스는 SARS-CoV-2일 수 있다.

또한, 상기 조성물 및 키트도 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.

상기 코로나바이러스에 대한 항체생성 확인 방법에 사용되는 융합 단백질 또는 숙주세포는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 또한, 상기 코로나바이러스도 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있고, 일례로, 상기 코로나바이러스는 SARS-CoV-2일 수 있다.

또한, 상기 확인 방법은 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다, 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 이들에 의해 본 발명이 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 청구범위에 기재된 기술적 사상과 실질적으로 동일한 구성을 갖고 동일한 작용 효과를 이루는 것은 어떠한 것이라도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.

실시예 1. 수용체 결합 도메인(receptor binding domain, RBD) 및 항원 43(antigen 43, Ag43)의 융합 단백질 제조

SARS-CoV-2의 RBD와 Ag43의 융합 단백질을 다음과 같이 제조하였다.

먼저, 독도-프렙 박테리아 게놈 DNA 정제 키트(Dokdo-prep bacterial genomic DNA purification kit)를 사용하여 대장균으로부터 게놈 DNA를 분리하였다. 분리된 게놈 DNA를 주형으로 Ag43 유전자의 신호서열(signal peptide, SP) 및 전위 단위(translocation unit, TU; β-barrel) 부위를 통상적인 방법으로 PCR을 수행하여 각각 증폭시켰고, 이때, 퓨전™ 하이-피델리티 DNA 중합효소(Phusion™ high-fidelity DNA polymerase)를 사용하였다. 그 결과, 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 구성된 SP 및 서열번호 2로 기재되는 염기서열로 구성된 TU를 각각 수득하였다. 한편, SARS-CoV-2의 RNA(NCCP43326, 국가병원체자원은행, NCCP)를 주형으로 톱스크립트™ cDNA 합성 키트(TOPscript™ cDNA synthesis kit)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 주형으로 통상적인 방법으로 PCR을 수행함으로써 스파이크 단백질의 RBD 도메인을 수득하였다. 이때, RBD 도메인의 C-말단에 히스티딘 태그(his tag) 및 링커(서열번호 3: GGGGS)의 순서대로 포함시켜, 최종적으로 서열번호 9로 기재되는 RBD 유전자 서열(서열번호 8: RBD 아미노산 서열)을 수득하였다. 상기 수득된 서열번호 9로 기재되는 폴리뉴클레오티드를 서열번호 1로 기재되는 SP 서열과 통상적인 방법으로 PCR을 수행함으로써 융합시켰다. 이후, 수득된 Ag43의 TU 및 SP-RBD 유전자는 익스핀™ 콤보 GP(Expin™ combo GP)를 사용하여 증폭 및 정제하고, T-블런트 PCR 클로닝 키트(T-blunt PCR cloning kit)를 사용하여 T-벡터에 각각 삽입하였다. 제작된 플라스미드를 대장균 DH5α에 형질전환하고, Ag43의 TU 및 SP-RBD 유전자를 포함하는 T-벡터를 각각 수득하였다. Ag43의 TU 유전자가 포함된 T-벡터는 BamHI 및 HindIII 제한효소를, SP-RBD 유전자가 포함된 T-벡터는 XhoI 및 HindIII 제한효소를 사용하여 pET28(b) 발현벡터에 삽입하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 pET-28b-Ag43_RBD 발현벡터를 수득하였다.

실시예 2. RBD 단백질을 외막에 발현하는 대장균의 제조

상기에서 제작된 pET-28b-Ag43_RBD 발현벡터를 대장균에 형질전환하고, 이를 50 ㎍/㎖의 카나마이신이 포함된 400 ㎖의 LB 배지에서 배양하였다. 배양은 37℃ 및 200 rpm의 조건으로 수행되었으며, 배양액의 흡광도(OD 600 ㎚)가 0.5 내지 0.6에 도달할때까지 배양하였다. 여기에 0.5 mM의 IPTG를 첨가하고 25℃에서 200 rpm으로 20시간 동안 더 배양하여 Ag43 및 RBD 융합 단백질의 발현을 유도하였다. Ag43 및 RBD 융합 단백질은 Ag43 단백질에 의해 대장균의 외막에 RBD 단백질이 노출된 형태로 발현된다(도 4). Ag43 및 RBD 융합 단백질이 발현된 세포를 회수하여 36 ㎖의 200 mM Tris-HCl(pH 8.0) 용액에 재현탁하고, 60 mM 수크로즈, 0.2 mM EDTA 및 200 ㎍/㎖의 리소자임(lysozyme)을 첨가하고, 최종 부피가 120 ㎖이 되도록 증류수를 첨가하였다. 이를 실온에서 10분 동안 반응시키고, 1 mM PMSF 및 아프로티닌(aprotinin)을 첨가하였다. 여기에 120 ㎖의 추출용 완충액(50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 2%v/v triton X-100, 10 mM MgCl₂) 및 DNase를 첨가하고 얼음에서 25분 동안 반응시켰다. 반응물을 7,000 ×g에서 5분 동안 원심분리하여 상층액을 수득하고, 35,000 ×g에서 15분 동안 원심분리하여 대장균 외막이 포함된 펠렛을 수득하였다. 수득된 펠렛을 3회세척하고, 10 mM Tris-HCl이 포함된 PBS(pH 7.4)에 현탁시켰다.

실시예 3. RBD 단백질이 발현된 외막입자 형태 확인

상기 실시예에서 수득된 RBD 단백질이 표면에 발현된 대장균 외막의 형태를 바이오 투과전자현미경(bio transmission electroscope, Bio-TEM)을 이용하여 확인하였다. 또한, NP200 나노포어를 사용하여 대장균 외막의 크기 분포도를 통상적인 방법으로 확인하였다. 그 결과, 현미경 관찰 결과 및 확인된 크기 분포도를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, 대장균 외막은 평균 160 ㎚의 크기로 확인되었다.

실시예 4. RBD 단백질의 발현 확인

상기 실시예에서 수득된 대장균의 외막에서 RBD 단백질의 발현을 웨스턴블롯으로 확인하였다. 구체적으로, 대장균의 외막을 분해시키지 않는 농도의 트립신을 처리하여, 표면에 발현된 RBD 단백질의 분해를 웨스턴블롯으로 확인함으로써, 대장균의 외막에 RBD 단백질의 발현을 확인하였다.

구체적으로, 상기 수득된 0.5 ㎎/㎖의 세포에 0, 0.5, 2.5 또는 5 ㎍/㎖의 트립신을 처리하고 37℃에서 10분 동안 반응시켰다. 수득된 세포 용출물을 SDS-PAGE 겔에서 100 V로 90분 동안 전기영동하고, 250 ㎃에서 60분 동안 PVDF 막으로 이동시켰다. PVDF 막을 5%w/v의 탈지유가 포함된 PBS-Tween20(0.05%v/v) 완충액에 넣고 상온에서 1시간 동안 전처리하였다. 이를 1차 항체인 항-SARS-CoV-2 스파이크 토끼 항체 또는 항-OmpF 항체가 1:1,000의 비율로 희석된 완충액에 넣고 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, PVDF 막을 PBS-Tween20 완충액으로 15분씩 3회 세척하고, HRP가 결합된 2차 항체를 1:10,000의 비율로 희석된 완충액에 넣고, 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 결과, RBD 단백질 및 대장균 외막의 발현을 확인한 결과 사진을 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이, 2.5 및 5 ㎍/㎖의 농도로 트립신을 처리한 경우에 대장균의 외막(OmpF)은 제거되지 않은 반면, 외막의 표면에 발현된 RBD는 분해되어 웨스턴블롯에 의해 검출되지 않았다. 한편, 0.5 ㎍/㎖ 농도의 트립신은 대장균의 외막 및 RBD 모두를 분해시키지 못하여, 두 종류의 단백질 모두가 웨스턴블롯에 의해 검출되었다.

따라서, 상기 결과로부터 본 발명에 따른 융합 단백질이 대장균 외막에 RBD 단백질을 발현시킴을 알 수 있었다.

실시예 5. RBD 단백질 및 ACE2 단백질의 결합 친화도 확인

상기에서 대장균의 외막 표면에 발현된 것을 확인한 융합 단백질에서 RBD 단백질이 여전히 ACE2 단백질과 결합력을 유지하는지 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) 방법으로 확인하였다.

구체적으로, SRP는 센서칩 L1(sensor chip L1) 및 비아코어 ×100(Biacore ×100)을 확인하였다. 이때, 러닝 완충액은 10 mM Tris-HCl(pH 8.0)을, 재생 완충액은 40 mM의 n-옥틸 β-D-클루코피라노사이드(n-octyl β-D-glucopyranoside, OG)를 사용하였다. 먼저, 상기에서 수득된 대장균 외막을 0.08 ㎎/㎖의 OG로 표면을 전처리한 센서칩에 주입하고, 센서그램(sensorgram)이 평평해진 후 0, 0.1, 1, 5, 10 또는 20 μM의 ACE2 단백질을 플로우 셀에 주입하였다. RBD 단백질이 결합된 칩에 ACE2 단백질을 농도별로 처리하여 결합시킨 후, OG 완충액으로 이를 재생시켜 결합 친화도를 확인하였다. 이때, 대조군으로서는 RBD 단백질을 표면에 발현하지 않는 대장균 외막을 사용하였다. 그 결과, RBD 및 ACE2 단백질 사이의 결합 친화도를 확인한 결과를 도 7에, 해리속도(dissociation rate, kd)를 결합 속도(association rate, ka)로 나눠서 계산한 K_D 값을 표 1에 나타내었다.

	K_D(M)	ka(M^-1,s^-1)	kd(s^-1)
RBD 단백질이 발현된 외막	1.01×10^-3	4.55×10²	4.59×10^-1
대장균 외막	4.82×10^-7	8.43×10⁵	4.06×10^-1

도 7에 나타난 바와 같이, 대장균 외막에 발현된 RBD 단백질이 ACE2 단백질과 높은 결합 친화도를 유지하였다.

실시예 6. Ag43 및 RBD 융합 단백질을 이용한 ELISA

상기에서 수득된 RBD 단백질이 발현된 대장균 외막을 이용하여 간접(indirect) ELISA를 수행하여, 본 발명에 따른 융합 단백질이 SARS-CoV-2의 간접적인 진단이나 항체생성 확인에 사용될 수 있는지 확인하였다.

구체적으로, RBD 단백질이 발현된 대장균 외막(Ag43β700_RBD OMV)을 1 내지 4.0×10⁷ particles/㎖가 되도록 마이크로플레이트 표면에 50 ㎕씩 코팅하였다. 이를 200 ㎕의 PBS-Tween20으로 3회 세척하고, 3%w/v BSA가 포함된 PBS-Tween20 완충액으로 2시간 동안 전처리하였다. 전처리 후, 항-SARS-CoV-2 스파이크 1차 항체를 1:1,000의 비율로 희석하여 2시간 동안 처리하고, 다시 PBS-Tween20으로 3회 세척하였다. 세척된 플레이트에 HRP가 결합된 2차 항체를 1:10,000의 비율로 희석하여 처리하고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 플레이트를 동일한 방법으로 3회 세척하고, 50 ㎕의 TMB를 첨가하고 30분 동안 반응시킨 다음 50 ㎕의 0.16 M 황산을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 이때, 대조군으로서 HEL293 세포주에서 생산된 재조합 SARS-CoV-2 RBD 단백질(RBD)을 사용하였다. 플레이트를 450 ㎚의 파장에서 흡광도를 측정하고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타난 바와 같이, 대장균 외막에서 발현된 RBD 단백질은 항-SARS-CoV-2 단백질과 농도의존적으로 결합하였다.

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> FUSION PROTEIN COMPRISING RECEPTOR BINDING DOMAIN OF CORONAVIRUS AND ANTIGEN 43 PROTEIN OF E.COLI AND USE THE SAME <130> DP22-0192 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 156 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antigen 43 SP nucleotide sequence <400> 1 atgaaacgac atctgaatac ctgctacagg ctggtatgga atcacatgac gggcgctttc 60 gtggttgcct ccgaactggc ccgcgcacgg ggtaaacgtg gcggtgtggc ggttgcactg 120 tctcttgccg cagtcacgtc actcccggtg ctggct 156 <210> 2 <211> 1023 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antigen 43 TU nucleotide sequence <400> 2 ctgcgcagtg aaaatgctta tcgtgcagaa gtccccctgt atgcctccat gctgacacag 60 gcaatggact atgaccggat tgtggcaggc tcccgcagcc atcagaccgg tgtaaatggt 120 gaaaacaaca gcgtccgtct cagcattcag ggcggtcatc tcggtcacga taacaatggc 180 ggtattgccc gtggggccac gccggaaagc agcggcagct atggattcgt ccgtctggag 240 ggtgacctga tgagaacaga ggttgccggt atgtctgtga ccgcgggggt atatggtgct 300 gctggccatt cttccgttga tgttaaggat gatgacggct cccgtgccgg cacggtccgg 360 gatgatgccg gcagcctggg cggatacctg aatctggtac acacgtcctc cggcctgtgg 420 gctgacattg tggcacaggg aacccgccac agcatgaaag cgtcatcgga caataacgac 480 ttccgcgccc ggggctgggg ctggctgggc tcactggaaa ccggtctgcc cttcagtatc 540 actgacaacc tgatgctgga gccacaactg cagtatacct ggcagggact ttccctggat 600 gacggtaagg acaacgccgg ttatgtgaag ttcgggcatg gcagtgcaca acatgtgcgt 660 gccggtttcc gtctgggcag ccacaacgat atgacctttg gcgaaggcac ctcatcccgt 720 gcccccctgc gtgacagtgc aaaacacagt gtgagtgaat taccggtgaa ctggtgggta 780 cagccttctg ttatccgcac cttcagctcc cggggagata tgcgtgtggg gacttccact 840 gcaggcagcg ggatgacgtt ctctccctca cagaatggca catcactgga cctgcaggcc 900 ggactggaag cccgtgtccg ggaaaatatc accctgggcg ttcaggccgg ttatgcccac 960 agcgtcagcg gcagcagcgc tgaagggtat aacggtcagg ccacactgaa tgtgaccttc 1020 tga 1023 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 3 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 4 <211> 194 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Receptor Binding Domain amino acid sequence <400> 4 Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg 1 5 10 15 Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val 20 25 30 Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys 35 40 45 Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn 50 55 60 Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile 65 70 75 80 Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro 85 90 95 Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp 100 105 110 Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys 115 120 125 Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln 130 135 140 Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe 145 150 155 160 Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln 165 170 175 Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala 180 185 190 Thr Val <210> 5 <211> 340 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antigen 43 TU amino acid sequence <400> 5 Leu Arg Ser Glu Asn Ala Tyr Arg Ala Glu Val Pro Leu Tyr Ala Ser 1 5 10 15 Met Leu Thr Gln Ala Met Asp Tyr Asp Arg Ile Val Ala Gly Ser Arg 20 25 30 Ser His Gln Thr Gly Val Asn Gly Glu Asn Asn Ser Val Arg Leu Ser 35 40 45 Ile Gln Gly Gly His Leu Gly His Asp Asn Asn Gly Gly Ile Ala Arg 50 55 60 Gly Ala Thr Pro Glu Ser Ser Gly Ser Tyr Gly Phe Val Arg Leu Glu 65 70 75 80 Gly Asp Leu Met Arg Thr Glu Val Ala Gly Met Ser Val Thr Ala Gly 85 90 95 Val Tyr Gly Ala Ala Gly His Ser Ser Val Asp Val Lys Asp Asp Asp 100 105 110 Gly Ser Arg Ala Gly Thr Val Arg Asp Asp Ala Gly Ser Leu Gly Gly 115 120 125 Tyr Leu Asn Leu Val His Thr Ser Ser Gly Leu Trp Ala Asp Ile Val 130 135 140 Ala Gln Gly Thr Arg His Ser Met Lys Ala Ser Ser Asp Asn Asn Asp 145 150 155 160 Phe Arg Ala Arg Gly Trp Gly Trp Leu Gly Ser Leu Glu Thr Gly Leu 165 170 175 Pro Phe Ser Ile Thr Asp Asn Leu Met Leu Glu Pro Gln Leu Gln Tyr 180 185 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Leu Ser Leu Ala Ala Val Thr Ser Leu 35 40 45 Pro Val Leu Ala 50 <210> 7 <211> 582 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Receptor Binding Domain nucleotide sequence <400> 7 aatattacaa acttgtgccc ttttggtgaa gtttttaacg ccaccagatt tgcatctgtt 60 tatgcttgga acaggaagag aatcagcaac tgtgttgctg attattctgt cctatataat 120 tccgcatcat tttccacttt taagtgttat ggagtgtctc ctactaaatt aaatgatctc 180 tgctttacta atgtctatgc agattcattt gtaattagag gtgatgaagt cagacaaatc 240 gctccagggc aaactggaaa gattgctgat tataattata aattaccaga tgattttaca 300 ggctgcgtta tagcttggaa ttctaacaat cttgattcta aggttggtgg taattataat 360 tacctgtata gattgtttag gaagtctaat ctcaaacctt ttgagagaga tatttcaact 420 gaaatctatc aggccggtag cacaccttgt aatggtgttg aaggttttaa ttgttacttt 480 cctttacaat catatggttt ccaacccact aatggtgttg gttaccaacc atacagagta 540 gtagtacttt cttttgaact tctacatgca ccagcaactg tt 582 <210> 8 <211> 212 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Receptor Binding Domain, 6HIS, 2(G4S), KL amino acid sequence <400> 8 Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg 1 5 10 15 Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val 20 25 30 Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys 35 40 45 Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn 50 55 60 Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile 65 70 75 80 Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro 85 90 95 Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp 100 105 110 Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys 115 120 125 Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln 130 135 140 Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe 145 150 155 160 Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln 165 170 175 Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala 180 185 190 Thr Val His His His His His His Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Gly Ser Lys Leu 210 <210> 9 <211> 636 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 Receptor Binding Domain, 6HIS, 2(G4S), KL nucleotide sequence <400> 9 aatattacaa acttgtgccc ttttggtgaa gtttttaacg ccaccagatt tgcatctgtt 60 tatgcttgga acaggaagag aatcagcaac tgtgttgctg attattctgt cctatataat 120 tccgcatcat tttccacttt taagtgttat ggagtgtctc ctactaaatt aaatgatctc 180 tgctttacta atgtctatgc agattcattt gtaattagag gtgatgaagt cagacaaatc 240 gctccagggc aaactggaaa gattgctgat tataattata aattaccaga tgattttaca 300 ggctgcgtta tagcttggaa ttctaacaat cttgattcta aggttggtgg taattataat 360 tacctgtata gattgtttag gaagtctaat ctcaaacctt ttgagagaga tatttcaact 420 gaaatctatc aggccggtag cacaccttgt aatggtgttg aaggttttaa ttgttacttt 480 cctttacaat catatggttt ccaacccact aatggtgttg gttaccaacc atacagagta 540 gtagtacttt cttttgaact tctacatgca ccagcaactg ttcaccatca ccaccatcac 600 ggtggtggtg gttctggtgg tggtggttct aagctt 636

Claims

코로나바이러스의 수용체 결합 도메인(receptor binding domain, RBD) 및 대장균의 항원 43(antigen 43, Ag43) 단백질의 융합 단백질.
제1항에 있어서, 상기 코로나바이러스는 SARS-CoV-2인, 융합 단백질.
제1항에 있어서, 상기 RBD는 서열번호 4로 기재된 아미노산 서열로 구성되는, 융합 단백질.
제1항에 있어서, 상기 Ag43 단백질은 Ag43 단백질의 전위 단위(translocation unit, TU)인, 융합 단백질.
제4항에 있어서, 상기 Ag43 단백질의 TU는 서열번호 5로 기재된 아미노산 서열로 구성되는, 융합 단백질.
제1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 이의 N-말단에 신호서열(signal peptide, SP)을 더 포함하는, 융합 단백질.
제6항에 있어서, 상기 신호서열은 Ag43 단백질의 신호서열인, 융합 단백질.
제7항에 있어서, 상기 Ag43 단백질의 신호서열은 서열번호 6으로 기재된 아미노산 서열로 구성되는, 융합 단백질.
제1항의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
제9항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
제9항의 폴리뉴클레오티드 또는 제10항의 재조합 벡터를 포함하는 숙주세포.
제1항의 융합 단백질 또는 제11항의 숙주세포를 포함하는 코로나바이러스 감염증 진단용 조성물.
제12항에 있어서, 상기 코로나바이러스는 SARS-CoV-2인, 코로나바이러스 감염증 진단용 조성물.
제1항의 융합 단백질 또는 제11항의 숙주세포를 포함하는 코로나바이러스 감염증 진단용 키트.
제1항의 융합 단백질 또는 제11항의 숙주세포를 시료와 반응시키는 단계를 포함하는 코로나바이러스 감염증 진단의 정보를 제공하기 위한 방법.
제1항의 융합 단백질 또는 제11항의 숙주세포를 포함하는 코로나바이러스에 대한 항체생성 확인용 조성물.
제1항의 융합 단백질 또는 제11항의 숙주세포를 포함하는 코로나바이러스에 대한 항체생성 확인용 키트.
제1항의 융합 단백질 또는 제11항의 숙주세포를 시료와 반응시키는 단계를 포함하는 코로나바이러스에 대한 항체생성 확인 방법.