CN114891075A - 一种对新冠病毒s蛋白rbmfp结构域具有结合亲和力的多肽及其应用 - Google Patents

一种对新冠病毒s蛋白rbmfp结构域具有结合亲和力的多肽及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药及临床诊断领域，更具体地，本发明涉及一种对新型冠状病毒（SARS‑CoV‑2）S蛋白具有结合亲和力的多肽及其应用。该多肽对新型冠状病毒（SARS‑CoV‑2）S蛋白具有结合亲和力，因此可以用于检测检测环境中的新冠病毒，可以用于制备检测是否感染新冠病毒的生物靶向试剂或试剂盒以及用于制备治疗新冠病毒感染相关疾病的药物。

Description

一种对新冠病毒S蛋白RBMFP结构域具有结合亲和力的多肽及 其应用
技术领域
本发明涉及生物医药及临床诊断领域，更具体地，本发明涉及一种对新型冠状病毒（SARS-CoV-2）S蛋白具有结合亲和力的多肽及其应用。
背景技术
新型冠状病毒（SARS-CoV-2）简称新冠病毒，属β冠状病毒属，为正义单链RNA病毒，目前已鉴定7种可感染人的冠状病毒，其中SARS-CoV及MERS-CoV分别在2003及2012年爆发并引起感染者“非典型性肺炎”和“中东呼吸综合征”，死亡率分别为10%及30%。新冠病毒与SARS-CoV和MERS-CoV分别有79%和50%同源性，且在传播过程中不断突变，主要流行突变株为delta突变和omicron突变株。患者感染新冠病毒后主要表现为咳嗽、发热、味嗅觉失灵等上呼吸道症状或重症肺炎，由于目前用于治疗该病毒感染的特效药无法适用所有人群，加上病毒不断突变致感染力增强并免疫逃逸，2022年1月其已在全世界造成超2.9亿人感染和540万死亡，对世界经济发展和人类公共卫生健康带来巨大威胁。
新冠病毒主要表达刺突蛋白（S 蛋白）、膜蛋白（M蛋白）、包膜蛋白（E 蛋白）和核衣壳蛋白（N蛋白）4种结构性抗原蛋白。其中，S蛋白与细胞表面血管紧张素转化酶2（ACE2）结合并在病毒感染细胞过程中起最重要作用。S蛋白主要由S1和S2亚基组成，S1亚基包括N末端结构域（NTD）、受体结合区域（RBD），S2亚基包括融合肽(FP）、肽重复序列1和2(HR1，HR2）跨膜结构域和胞内结构域。其中，RBD中的受体结合基序（RBM）为S蛋白与ACE2主要结合区域，FP在病毒S蛋白与ACE2结合并变构后参与病毒与细胞膜融合过程。
目前，各种类型新冠病毒疫苗虽已在全世界大部分国家批准上市，但仍有部分人群因各种原因未接种疫苗，且现有疫苗大部分为在原始新冠毒株基础研发，部分人群接种后产生抗体滴度降低，并不能保证感染突变病毒株后不发病，因此单一依靠疫苗接种无法满足社会防疫需求。而针对新冠病毒的特效药目前上市的种类较少，多为康复者血清中分离的单克隆抗体制剂，也有一些是基于其他抗病毒小分子药物进行改造，或者两者合用来进行治疗。但抗体的分子量较大，无法深入S蛋白糖基化结合位点部位，且单克隆抗体制备及研发成本高，目前仅能用于院内静脉注射。小分子药物则缺乏相应的靶向性，对于小于12周岁及体重低于40kg的患者疗效未有确认，因此此类人群目前不在该药物效应范围内。特别是目前上市的用于治疗新冠病毒感染制剂，每疗程价格约2300元到4000元人民币，一定程度限制其临床大规模应用，对于疫情大规模流行防治工作不利。
基于上述说明，本领域仍然亟待研究有效的靶向治疗新冠病毒感染并可能降低其治疗成本的新药物或新方法，以改善目前临床现状。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种对新型冠状病毒（SARS-CoV-2）S蛋白具有结合亲和力的多肽及其应用。
本发明的第一方面，提供一种对新冠病毒S蛋白RBMFP结构域具有结合亲和力的多肽，多肽是以SEQ ID NO: 12所示的葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列作为骨架，进行11-20个氨基酸变异后获得的多肽。
优选的，所述多肽是如SEQ ID NO: 12所示的葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列在第9-11，13-14，17-18，24-25，27-28，32，35位中的至少11个氨基酸发生氨基酸突变得到的突变序列。
优选的，所述多肽的氨基酸序列中包括以下序列：
如SEQ ID NO: 12所示的葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列满足下列a-n的突变条件得到的突变序列：
a.第9位氨基酸突变为A、V、E或Q；
b.第10位氨基酸突变为R、L、Y或V；
c.第11位氨基酸突变为T、N、R或F；
d.第13位氨基酸突变为G、P或S ；
e.第14位氨基酸突变为Y、E、D或A；
f.第17位氨基酸突变为S、M、D或L；
g.第18位氨基酸突变为I、S、P或D；
h.第24位氨基酸突变为G、L或P；
i.第25位氨基酸突变为A、H或P；
j.第27位氨基酸突变为G、V、R或L；
k.第28位氨基酸突变为G、E或P；
l.第32位氨基酸突变为G、A、P或V；
m.第35位氨基酸突变为E、H或R；
n.第43位氨基酸突变为E或K。
优选的，所述多肽的氨基酸序列中包括如SEQ ID NO:1-4任一所示的序列。
本发明的第二方面，提供一种靶向新冠病毒S蛋白RBMFP结构域的靶向性分子，所述靶向性分子包括如上所述的多肽，以及与该多肽相连接的偶联物。
优选的，所述偶联物为半胱氨酸残基、多肽标签、可检测标记物、抑制新冠病毒的药物中的一种或多种。
其中，所述多肽标签包括但不限于：His 标签（如6×His），Myc 标签，GST 标签，Flag 标签。
本发明的第三方面，提供一种多核苷酸，其编码如上所述的多肽。
本发明的第四方面，提供一种重组载体，其包含如上所述的多核苷酸。
本发明的第五方面，提供一种宿主细胞，其内包含有如上所述的多核苷酸。
本发明的第六方面，提供如上所述的多肽在检测新冠病毒的应用，所述应用为非疾病诊断目的的。
本发明的第七方面，提供如上所述的多肽在制备检测新冠病毒的检测试剂或制备治疗新冠病毒感染相关疾病的药物的应用。
本发明的有益效果如下：本发明提供的多肽对新冠病毒S蛋白RBMFP结构域具有结合亲和力，因此可以用于检测检测环境中的新冠病毒，可以用于制备检测是否感染新冠病毒的生物靶向试剂或试剂盒以及用于制备治疗新冠病毒感染相关疾病的药物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。
图1、新冠病毒S蛋白结构域重组蛋白的原核表达和鉴定；其中，（A）新冠病毒的S蛋白全长及RBMFP结构域重组蛋白一级结构图；（B）新冠病毒S蛋白RBMFP结构域蛋白重组质粒图；（C）RBMFP重组蛋白SDS-PAGE电泳鉴定图：M：蛋白marker；1-2：pET21a(+)/RBMFP载体转染的BL21(DE3)菌株，3：pET21a(+)/RBMFP载体转染的BL21(DE3)菌株经IPTG诱导后；4：RBMFP重组蛋白纯化后。（D）RBMFP重组蛋白Western Blot验证：M：蛋白marker；1： pET21a(+)/RBMFP载体转染的BL21(DE3)菌株经IPTG诱导后；2：RBMFP重组蛋白纯化后；
图2、 RBMFP重组蛋白免疫BALB/c小鼠多克隆血清抗体效价鉴定；其中，（A）RBMFP重组蛋白免疫鼠血清抗体的反应；(B) RBMFP重组蛋白免疫后鼠血清抗体的效价。
图3、以RBMFP重组蛋白为抗原经噬菌体肽库淘洗3轮后各级肽库库容量鉴定；
图4、各ZRBMFPN（或ZN，N为对应的单克隆编号）以及Zwt 序列的对比。本发明的多肽ZRBMFPN中被修饰的氨基酸位点在图中己用白色氨基酸序列标出（SEQ ID NO：1-4），蓝色氨基酸标示为SPA-Z蛋白骨架氨基酸序列；
图5、ZRBMFPN原核表达及鉴定；其中，（A）pET21a(+)/ZRBMFPN重组质粒图；（B）ZRBMFPN重组质粒原核诱导表达SDS-PAGE鉴定图;(C)ZRBMFPN重组蛋白纯化SDS-PAGE鉴定图；（D）ZRBMFPN重组蛋白纯化Western Blot鉴定图；M：蛋白marker；C1：BL21(DE3)未转染质粒；C2：BL21(DE3)转染pET21a(+)质粒；其中，1：ZRBMFP14；2：ZRBMFP149；3：ZRBMFP171；4：ZRBMFP327；5：Zwt；
图6、ZRBMFPN多肽与新冠病毒RBMFP结构域重组蛋白在BiacoreX 100仪器上的SPR检测；其中，A-E分别为ZRBMFP14、ZRBMFP149、ZRBMFP171、ZRBMFP327及Zwt蛋白与靶蛋白新冠病毒RBMFP结构域重组蛋白的亲和力分析；F为ZRBMFP14、ZRBMFP149、ZRBMFP171、ZRBMFP327及Zwt与靶蛋白新冠病毒RBMFP结构域重组蛋白的结合常数、解离常数及亲和力常数；
图7、ZRBMFPN多肽对新冠病毒假病毒感染细胞中和作用；其中，A-D分别为ZRBMFP14、ZRBMFP149、ZRBMFP171、ZRBMFP327对新冠病毒假病毒（野生型）中和作用及半数感染抑制浓度（IC50）；E、F分别为ZRBMFP14 、ZRBMFP171对新冠病毒假病毒（delta突变型）中和作用及半数感染抑制浓度（IC50）。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定，该领域的技术工程师可根据上述发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。
如本文所用，所述的“对新冠病毒S蛋白具有结合亲和力的多肽”是指具有特定序列的能够特异性结合新冠病毒S蛋白RBMFP结构域的多肽。所述的“本发明的多肽”、“对新冠病毒S蛋白具有结合亲和力的多肽”、“与新冠病毒S蛋白具有特异性亲和力的多肽”、 “对新型冠状病毒（SARS-CoV-2）S蛋白具有结合亲和力的多肽”、“ZRBMFPN多肽”、“ZRBMFP” “ZN”、“affibody 蛋白”、“affibody 重组蛋白”、 “ZRBMFP affibody”、“SPA-N”、“ZRBMFP-N 重组蛋白” 、“靶向新冠病毒S蛋白的靶向性多肽”可以互换使用; RBMFP重组蛋白、RBMFP结构域重组蛋白与RBMFP 可以互换使用；“SPA-Z”与“Zwt”可以互换使用。
如本文所用，所述的“靶向性分子”是指将本发明的对新冠病毒S蛋白RBMFP结构域具有结合亲和力的多肽与其它功能性偶联物连接后获得的、可以靶向新冠病毒S蛋白RBMFP结构域的分子。所述的偶联物可以是半胱氨酸残基，多肽标签，抑制新冠病毒的药物，酶或可检测标记物等。
本发明选择新冠病毒S蛋白RBMFP结构域作为靶抗原，以葡萄球菌A 蛋白的Z 结构域(Zwt，SEQ ID NO: 12)作为支架，将其表面氨基酸残基在Zwt与抗体Fc结合的13个特定氨基酸位点（9-11，13-14，17-18，24-25，27-28，32，35）进行随机突变，通过噬菌体展示技术构建突变体文库，以新冠病毒S蛋白RBMFP结构域作为靶抗原对该文库进行亲和筛选，经过大量的筛选工作，最终获得了对于新冠病毒S蛋白RBMFP结构域具有高度亲和力的多肽片段序列。
基于上述工作，本发明提供一种对新冠病毒S蛋白RBMFP结构域具有结合亲和力的多肽，其氨基酸序列中包括以下序列：如SEQ ID NO: 12所示的葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列在第9-11，13-14，17-18 ，24-25，27-28，32，35位中发生氨基酸突变得到的对于新冠病毒S蛋白RBMFP结构域具有高度亲和力的多肽。
本发明的多肽可以为如SEQ ID NO: 12所示的葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列在第9-11，13-14，17-18，24-25，27-28，32，35位中发生氨基酸突变得到的突变序列，也可以为在以上突变序列的任一末端或两端加入额外的氨基酸残基而形成的多肽。这些额外的氨基酸残基可以在多肽结合新冠病毒S蛋白RBMFP结构域时起作用，但是也可同样用于其它目的，如涉及该多肽的生产、纯化、稳定、偶联或检测的一种或几种。这些额外的氨基酸残基可以包括一或多种为了化学偶联目的而添加的氨基酸残基。如在多肽链的第一位或最后一位添加，即在N 或C 末端添加一个半胱氨酸残基等。这种额外的氨基酸残基也可以包括用于多肽纯化或检测的一个“标记”，如与标记抗体相互作用的六组氨酸肽（His6）标记，或“myc”标记或“flag”标记。此外，其它本领域技术人员熟知的替代方式也包含在本发明中。
所述“额外的氨基酸残基”也可构成具有预期功能的一个或多个多肽结构域，如与另一个新冠病毒S蛋白RBMFP结构域蛋白结合的多肽结构域的功能，或者其它结合功能，或是一种酶促功能，或是一种荧光功能，或是其组合。
本发明提供的多肽也包含在所述的新冠病毒S蛋白RBMFP结构域结合多肽基础上，经修饰进而增加其在碱性条件下的稳定性的多肽。这种稳定性包括用对于碱性条件较不敏感的氨基酸残基定点取代在没有修饰的序列中出现的任何天冬酞胺残基。由于在不同的反应之间亲和层析柱要经受频繁的强碱处理以进行洗脱，这种对碱降低敏感性的特性，有利于使用本发明的多肽作为亲和层析中的亲和配体，能够延长亲和层析基质的使用寿命。
本发明提供的多肽也包含在本发明的新冠病毒S蛋白RBMFP结构域结合多肽基础上，进行其它修饰后获得的多肽。这些修饰（通常不改变一级结构）形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶（如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶）而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基（如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸）的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
其中，在本发明的新冠病毒S蛋白RBMFP结构域具有结合较优的亲和力的一些实施例中，其氨基酸序列中包括以下序列：
如SEQ ID NO: 12所示的葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列满足下列a-n的突变条件得到的突变序列：
a.第9位氨基酸突变为A、V、E或Q；
b.第10位氨基酸突变为R、L、Y或V；
c.第11位氨基酸突变为T、N、R或F；
d.第13位氨基酸突变为G、P或S ；
e.第14位氨基酸突变为Y、E、D或A；
f.第17位氨基酸突变为S、M、D或L；
g.第18位氨基酸突变为I、S、P或D；
h.第24位氨基酸突变为G、L或P；
i.第25位氨基酸突变为A、H或P；
j.第27位氨基酸突变为G、V、R或L；
k.第28位氨基酸突变为G、E或P；
l.第32位氨基酸突变为G、A、P或V；
m.第35位氨基酸突变为E、H或R；
n.第43位氨基酸突变为E或K。
更优选的，其中效果极为显著的一些实施例中，其氨基酸序列中包括如SEQ IDNO:1-4任一所示的序列。
上述的对新冠病毒S蛋白RBMFP结构域具有结合亲和力的多肽可以与偶联物连接，从而构成功能性的靶向性分子。多肽与偶联物之间的连接可通过化学键（包括肽键）相连或吸附；所述的化学键是共价键或非共价键。
作为一种优选方式，通过肽键连接，从而形成融合多肽。所述的新冠病毒S蛋白RBMFP结构域结合多肽与偶联物之间可以直接相连接，或者通过多肽连接子（连接肽）连接。所述的连接子例如包括1-30 个氨基酸；较佳地为1-20 个氨基酸。连接肽的设置基本上不影响融合蛋白中各多肽的活性。较佳地，可以利用柔性肽(Gly4Ser)3 进行连接。其它本领域技术人员熟知的连接肽也可应用于本发明。
在“异源”融合多肽中，所述新冠病毒S蛋白RBMFP结构域结合多肽构成了第一个结构域或第一个部分，第二和其它部分具有除了结合新冠病毒S蛋白RBMFP结构域的其它功能，这些可预期的结果也在本发明的范围内。该融合多肽的第二和其它部分可能包含对除了新冠病毒S蛋白RBMFP结构域的其它靶分子具有亲和力的结合结构域。这种结合结构域也可能与SPA 结构域相关，但在1 到大约20 个位置具有取代突变。结果是融合多肽有至少一个新冠病毒S蛋白结合结构域和至少一个与所述其它靶分子具有亲和力的结构域。这扩展了本发明的多肽的应用，如作为治疗制剂或作为捕获、检测或分离试剂。
本发明提供的靶向性分子还涵盖了在所述的新冠病毒S蛋白RBMFP结构域 结合多肽上连接一个可检测标记物（如荧光标记，生物素或放射性同位素等），从而可基于本发明的多肽的特异性，实现检测新冠病毒的目的。
“新冠病毒S蛋白RBMFP结构域结合亲和力” 是指可以例如通过利用表面等离子共振（surface plasmon resonance）技术如Biocore®装置进行检测的一种多肽特性。新冠病毒S蛋白RBMFP结构域结合亲和力可以通过一个实验进行检测，其中将新冠病毒S蛋白RBMFP结构域重组蛋白固定在该装置的感应芯片上，然后将含有待测多肽的样品通过该芯片。或者，也可以将待检测的多肽固定在该装置的感应芯片上，然后将含有新冠病毒S蛋白RBMFP结构域蛋白的样品通过该芯片。本领域技术人员可以利用所获得的感应图像建立多肽的新冠病毒S蛋白RBMFP结构域结合亲和力的至少一种定性测量方法。如果需要定量测量方法，例如为了建立相互作用间的某个KD值，也可以使用表面等离子共振方法。例如，结合值可以利用Biocore®2000 装置(Biocore AB)进行测定。新冠病毒S蛋白RBMFP结构域蛋白固定于该装置的感应芯片上，而亲和力待检测的多肽样品通过连续稀释制备并以随机顺序进行注射。然后可从结果中计算KD 值。在本发明的一些实施例中，所述的多肽的KD 值达到9.4×10-8—6.6×10-7M。
本发明还提供了编码本发明的新冠病毒S蛋白RBMFP结构域 结合多肽或靶向性分子或融合多肽的分离的核酸，也可以是其互补链。所述核酸可以全序列人工合成，也可用PCR 扩增的方法分别获得。
本发明还提供了包含编码所述核酸分子的载体。所述的载体还可包含与所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，以便于所述融合蛋白的表达。如本文所用，“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA 序列的某些部分能够影响同一线性DNA 序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制以编码序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。
在本发明中，任何合适的载体都可以使用，比如一些用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞的克隆和表达的载体，如Pouwels 等，克隆载体：实验室手册中所描述的。
此外，含有所述核酸序列的重组细胞也包括在本发明中。术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌等；例如可为大肠杆菌细胞(E. coli)，如大肠杆菌HMS174(DE3)、或BL21(DE3)。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。
生产本发明的新冠病毒S蛋白RBMFP结构域结合多肽或靶向性分子或融合多肽的方法也已包括在本发明中。所述方法包括培养含有相应多肽的编码核酸的重组细胞，获得产物多肽。可将上述制备获得的多肽纯化为基本均一的性质，例如在SDS-PAGE 电泳上呈单一条带。
基于要表达多肽的信息和目前重组表达蛋白质的技术水平，结合本发明揭示的内容，本领域技术人员易于制备本发明的多肽。例如，表达未被修饰的Z 结构域的质粒可以用作起始材料。使用已知技术，所需的取代突变可以被引入这个质粒中以获得本发明的表达载体。
当使用化学多肽合成方法制备本发明的多肽或靶向性分子或融合蛋白时，上述多肽中的任何天然产生的氨基酸残基都可以被任何相应的、非天然产生的氨基酸残基或其衍生物所取代，只要产物多肽的功能基本不被损害。
本发明还涉及所述的新冠病毒S蛋白RBMFP结构域结合多肽或靶向性分子或融合多肽在不同方面的应用，包括应用于治疗、诊断和/或检测。
本发明的新冠病毒S蛋白RBMFP结构域结合多肽可作为新冠病毒S蛋白抗体在不同应用中的一种替代物。
本发明提供一种新冠病毒的检测方法，用于判定环境中（如门把手、生活用品等）新冠病毒的存在与否或待检测患者咽拭子、鼻拭子、唾液及鼻腔分泌物是否含有新冠病毒的检测手段。
作为非限制性的实例，其可用于治疗以新冠病毒感染为特征的疾病，例如COVID-19、新冠病毒感染引起的肾炎等。
本发明的多肽可作为一种检测试剂、一种捕获试剂或者分离试剂，而且还可直接用作为一种治疗制剂或者将其它治疗制剂靶向新冠病毒S蛋白的手段。体外使用本发明的多肽的方法可以不同方式进行，如微量滴定板、蛋白阵列、生物传感器表面和组织切片等等。为了使本发明多肽适用于特异的用途，在不偏离本发明的范围的情况下，可以对本发明的多肽进行修饰和/或添加。
在下面详细描述了这些修饰和添加，其可能包括在同一多肽链中包含的额外的氨基酸，或者标记和/或治疗制剂，其化学修饰或以其它方式结合本发明的多肽。另外，本发明还涵盖了保留了结合新冠病毒S蛋白RBMFP结构域能力的该多肽的片段。
本发明还包括使用所述的与新冠病毒S蛋白RBMFP结构域结合的多肽检测样品中的新冠病毒或新冠病毒S蛋白的含量。
本发明还提供了一个诊断组织样品中新冠病毒S蛋白的试剂盒，包括与报告酶(如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)融合的、本发明的新冠病毒S蛋白RBMFP结构域结合多肽、检测酶活性的试剂、和阳性和阴性对照样本。
本发明还提供了一个诊断组织样品中新冠病毒S蛋白RBMFP结构域表达的试剂盒，包括通过抗体检测的与标记（如flag 标记或myc 标记）融合的本发明的新冠病毒S蛋白RBMFP结构域结合多肽、一个特异于标记的一抗、特异于一抗并与报告酶偶联的二抗、检测酶活性的试剂，和阳性和阴性对照组织切片样本。
本发明还提供一种药物组合物，其包含：有效量的本发明所述的对新冠病毒S蛋白RBMFP结构域蛋白具有结合亲和力的多肽或靶向新冠病毒S蛋白RBMFP结构域蛋白的靶向性分子，和药学上可接受的载体。
如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应（如毒性）的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences（Mack Pub. Co.，N.J.1991）中可找到关于药学上可接受的载体的充分说明。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和山梨醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH 缓冲物质和稳定剂，如白蛋白等。
可将所述的组合物制成各种适合于哺乳动物给药的剂型，所述剂型包括但不限于：注射剂、胶囊剂、片剂、乳剂、栓剂。
在使用时，是将安全有效量的本发明所述的对新冠病毒S蛋白RBMFP结构域蛋白具有结合亲和力的多肽或靶向性分子施用于哺乳动物（如人），其中该安全有效量通常至少约1 微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10 毫克/千克体重，较佳地该剂量是约1微克/千克体重-约1 毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1、新冠病毒S蛋白结构域的原核表达和鉴定
选取SARS-CoV-2相关S蛋白(GenBank: QHD43416.1)的RBM和FP区域序列（图1A），经全基因组合成新冠病毒S蛋白（RBMFP,aa436-829）的基因序列，经BamHI和SacI酶切位点将序列用酶切酶连方法插入pET21a(+)载体构建pET21a(+)/RBMFP重组质粒（图1B）并将重组质粒转化至大肠杆菌BL21 (DE3)，经IPTG 诱导后表达重组蛋白，用Ni-NTA亲和层析法纯化制备蛋白，并常规免疫BALB/c小鼠制备血清抗体。
结果:SDS-PAGE电泳显示诱导后可见明显蛋白条带出现在相对分子质量(Mr)约43kDa的位置，与预期蛋白Mr大小相符(图1 C)；经用亲和层析柱析纯化后，经SDS-PAGE分析在Mr 43 kDa 的位置处出现一条较为单一的的蛋白条带(图1D)。以小鼠抗6×His mAb一抗进行Western blot分析，均可见在Mr 43kDa 处出现单一的信号反应带(图1C)，表明诱导及纯化重组蛋白均能被相应的His标签抗体特异性识别。经ELISA检测，鼠被新冠病毒抗原重组蛋白免疫后出现了高效价的抗体反应，表明成功制备高效价的新冠病毒S蛋白结构域特异性鼠血清抗体(图2A,B)。
实施例2、新冠病毒S蛋白结构域结合多肽的筛选
利用本实验团队构建的噬菌体随机组合文库，即在指定的9-11,13-14,17-18,24-25，27-28,32,35氨基酸位置随机进行突变构成的多肽文库，从该文库中筛选新冠病毒S蛋白结合多肽，并对其亲和性进行了鉴定。
1、新冠病毒S蛋白结合多肽的筛选和滴度测定
将纯化的新冠病毒S结构域蛋白包被免疫管后封闭，加拯救噬菌体感染文库(初级库或后面几轮淘洗得到的二级或三级库)并37℃孵育，离心后取噬菌体上清加入免疫管进行特异性结合及非特异性洗脱后再加入空的E. coli TG1 37℃孵育并收获结合的特异性噬菌体；取100μl，用2*YT 培养基做梯度倍比稀释，取稀释液100μl 涂布SOB-AG 平板，30℃过夜，计数结合噬菌体感染菌落数，并挑取单克隆菌株编号，同时计算新冠病毒S结构域蛋白结合噬菌体滴度；如此重复三轮淘洗和富集筛选，经LB/Amp琼脂平板鉴定，该三级肽库滴度为1×106（图3）。
2、 结合多肽单克隆噬菌体的制备及ELISA 鉴定
将新冠病毒S结构域蛋白以2μg/孔包被96 孔酶标板，4 ℃ 过夜；PBST 洗涤，5%脱脂奶粉封闭；洗涤后将噬菌体加入挑取的单克隆菌株共孵育，离心后取上清，分别加入96孔，100μl/孔，37 ℃，孵育2 h。洗涤，加入1:5000 稀释的HRP/anti-M13 酶标二抗 (兔抗M13，Abcam # ab6188 )及TMB显色液，37 ℃，15 min；2 M H2SO4 50 μl/孔，终止反应；置酶标仪(ELx800TM，BIO-TEK，USA)读取OD450值。以高于0.5的OD450的ELISA值为选择标准，鉴定编码新冠病毒S结构域蛋白结合多肽的噬菌体，选择高于这个ELISA 信号值的100个单克隆菌株进行DNA 序列分析。
3.新冠病毒S结构域蛋白结合多肽的序列检测及筛选
共100 个单克隆菌株送杭州擎科生物技术有限公司测序，测序引物为CATATGGTTGACAACAAA TTCA ACAAAGAA(SEQ ID NO: 9)。测序结果用Chromas软件分析对标准序列SPA-Z 与SPA-N 进一步分析其三个螺旋区的随机性和多样性。
结果：共获得63个完全正确克隆序列，无重复序列，经后续实验验证，最终确定与新冠病毒S结构域蛋白结合活性最强的4 个单克隆菌株用于进一步研究(分别为ZRBMFP14（简写为Z14）、ZRBMFP149（简写为Z149）、ZRBMFP171（简写为Z171）、ZRBMFP327（简写为Z327）)。其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、2、3、4所示，它们的编码序列如SEQID NO: 5、6、7、8所示。
实施例3、新冠病毒S结构域蛋白结合多肽重组质粒构建和原核蛋白表达及纯化
将选择的4个克隆(ZRBMFP14、ZRBMFP149、ZRBMFP171、ZRBMFP327)，及Zwt作为新冠病毒S结构域蛋白结合多肽的阴性对照。对其进行重组质粒构建、原核蛋白的表达及其鉴定，并制备纯化蛋白。
1. pET21a(+)/ZRBMFP 的重组质粒构建和鉴定
参照affibody 基因序列(GenBank：GY324633.1)设计PCR引物，上游引物5’GGGAATTC CATATG GTTGACAACAAATTCAACAAAGAA 3’(SEQ ID NO:10，斜体和下划线表示Ned I 酶切位点)，下游引物5’ CCG GAATTC CGTTTCGGAGCCTGAGCGT 3’(SEQ ID NO:11，斜体和下划线表示XhoⅠ酶切位点)；以筛选的测序正确三级库单克隆菌株 ZRBMFP14、ZRBMFP149、ZRBMFP171、ZRBMFP327为模板，通过PCR 扩增affibody 目的基因(SEQID NO: 5、6、7、8)，同时将affibodyZwt经原核密码子优化后全序列(SEQ ID NO: 13)合成作为阴性对照。将PCR 扩增的目的基因经NdeⅠ和XhoⅠ克隆至pET21a(+)载体，构建pET21a(+)/Z RBMFP的重组质粒，并经测序鉴定(图4，图5A)。
2．Z RBMFP 原核表达蛋白制备
将重组质粒转化至大肠杆菌(E.coli)BL21 (DE3)中，37℃，培养过夜；加1mM 异丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG) (默克公司，德国)诱导培养6 h表达带有His标签的Z RBMFP affibody 及Zwt affibody 蛋白。经诱导后表达的重组蛋白，用镍螯合亲和层析胶体(Ni-NTA Agarose)(QIAGEN 公司) 亲和层析法纯化并经SDS-PAGE分析鉴定。
结果：成功构建了pET21a(+)/Z RBMFP 重组质粒，并采用原核表达系统制备了纯化的ZRBMFP14、ZRBMFP149、ZRBMFP171、ZRBMFP327 及Zwt affibody重组融合蛋白，经SDS-PAGE 电泳分析（图5B,C）证实，出现考马斯亮蓝浓染的条带分子质量约7.5kDa，与预期Z RBMFPaffibody 多肽的分子质量大小一致。经WB检测可见在Mr 7.5kDa 处出现单一的信号反应带(图5D)，表明纯化重组蛋白能被相应的His标签抗体特异性识别。
实施例4、Z RBMFP affibody多肽与新冠病毒S结构域重组蛋白的结合
为鉴定Z RBMFP affibody多肽与新冠病毒S结构域重组蛋白结合的结合能力，利用表面等离子共振技术(SPR)分析筛选的ZRBMFP14、ZRBMFP149、ZRBMFP171、ZRBMFP327及其对照Zwtaffibody 与靶蛋白新冠病毒S结构域重组蛋白的特异性结合。
在BIACORE X100系统仪器(GE公司)进行新冠病毒S结构域重组蛋白和Z RBMFPaffibody多肽之间相互作用的亲和力分析，即利用表面等离子共振技术(SPR)分析上述带有His 标签的ZRBMFP14、ZRBMFP149、ZRBMFP171、ZRBMFP327及Zwt affibody 蛋白(作为对照)与新冠病毒S结构域重组蛋白之间的相互作用。根据操作手册，在CM5 芯片表面通过EDC和NHS活化第二泳道后将新冠病毒S结构域重组蛋白固定，进行与筛选多肽之间的亲和力测定，第一泳道作为注射时的空白对照。affibody分子分别进行5个不同梯度浓度稀释与新冠病毒S结构域重组蛋白结合，即ZRBMFP14、ZRBMFP149、ZRBMFP171、ZRBMFP327浓度分别为16μM、8μM、4μM、2μM、1μM及Zwt affibody分子浓度为16μM、8μM、4μM、2μM、1μM，设置反应时间为180s，解离时间为300s，所有的分析在25℃进行，流速为30μl /min，反应时注射ZRBMFP14、ZRBMFP149、ZRBMFP171、ZRBMFP327、Zwt affibody分子，解离时注射运行仪器的磷酸盐缓冲液（PBS）。标本的容量为150μl，并以流速15μl /min随机顺序注射；随后用pH=2.5的Gly-HCl洗涤1min(再生)，利用BIACORE X100分析软件的1：1binding模式分析结合曲线并拟合(感应图)。
结果：随着ZRBMFP affibody分子浓度升高，其与靶蛋白新冠病毒S结构域重组蛋白相互作用的能力增强(图6A，B, C,D,E)，亲和力平衡解离常数KD 均值，ZRBMFP14、ZRBMFP149、ZRBMFP171、ZRBMFP327及Zwt 亲和体分子分别的为9.4×10-8mol/L、3.3×10-7 mol/L、2.4×10-7 mol/L、6.6 ×10-7 mol/L 及1.8×10-2 mol/L (图6F)。Z RBMFP分子较Zwt affibody 分子解离常数KD 值相差105 至106倍。经筛选获得的ZRBMFP14、ZRBMFP149、ZRBMFP171、ZRBMFP327均能与新冠病毒S结构域重组蛋白结合，亲和力均已经达到nmol/L级水平，与此同时，野生型的Zwt affibody 分子新冠病毒S结构域重组蛋白几乎没有结合力。表明筛选出的Z RBMFPaffibody 分子与新冠病毒S结构域重组蛋白具有较高的特异亲和力，同时也表明原核诱导表达的Z RBMFP affibody 分子与新冠病毒S结构域重组蛋白均具有生物活性。
因此，本发明的ZRBMFP14、ZRBMFP149、ZRBMFP171、ZRBMFP327蛋白分子与新冠病毒S结构域重组蛋白分子具有相互结合和识别能力。从分子水平验证了ZRBMFP14、ZRBMFP149、ZRBMFP171、ZRBMFP327多肽与新冠病毒S结构域重组蛋白之间的亲和力。
实施例5、Z RBMFP affibody 多肽对新冠假病毒的中和活性检测
将对数期的HEK-293T-ACE2细胞消化为单个悬浮细胞，调整细胞浓度为1×105/ml，每孔120μl加入96孔灭菌培养板贴壁培养。将0.22μm滤膜过滤的ZRBMFP14、ZRBMFP149、ZRBMFP171、ZRBMFP327及Zwt蛋白用完全培养基（含10%FBS）稀释（蛋白稀释后终浓度为：5μM、2.5μM、1.25μM、625nM、312.5nM），每个样本取295.5μl，各加入4.5μl SARS-CoV-2野生型假病毒及delta突变型假病毒(转染S全长蛋白质粒、GFP质粒及荧光素酶报告基因质粒的逆转录病毒，购自杭州擎科生物)混匀，同时设置阴性对照（假病毒4.5μl与295.5μl完全培养基混合）于37℃培养箱共孵育1h。弃铺板的细胞培养液，用1×PBS洗1遍后每孔分别加入100μl，每个样本重复3孔于细胞培养箱内感染细胞8h后弃掉培养液，换新鲜含10%FBS的DMEM培养基继续培养48h后于倒置荧光显微镜观察假病毒感染细胞后GFP基因表达情况，多功能酶标仪（Thermo Fisher，Varioskan LUX，USA）检测荧光素酶报告基因表达情况，用GraphpadPrism8.0软件计算半数病毒中和（IC50）浓度。
结果：携带SARS-CoV-2来源的全长S蛋白假病毒与ZRBMFP14、ZRBMFP149、ZRBMFP171、ZRBMFP327及Zwt共孵育中和后感染HEK-293T-ACE2细胞，经检测，ZRBMFP14、ZRBMFP149、ZRBMFP171、ZRBMFP327对携带S蛋白的野生型假病毒半数有效中和抑制浓度（IC50）值分别为1.54μM,1.8μM，1.1μM，1.26μM（图7 A、B、C、D）而Zwt则无抑制病毒感染细胞作用。经检测ZRBMFP14、ZRBMFP171（图7E、F）对携带S蛋白的delta突变型假病毒半数有效中和抑制浓度（IC50）值分别为1.71μM、1.34μM,而ZRBMFP149、ZRBMFP327及Zwt则无抑制病毒感染细胞作用。以上实验证明了ZRBMFP14、ZRBMFP171对于野生型SARS-CoV-2假病毒及delta突变型假病毒均有良好抑制其感染细胞的作用，ZRBMFP149、ZRBMFP327仅对野生型假病毒具有抑制其感染细胞作用，Zwt对两种假病毒均无抑制感染作用。
以上结果证明，原核表达得到的RBMFP结构域重组蛋白具有强免疫原性，经其所筛选得到的ZRBMFP affibody多肽具有潜在抑制新冠病毒感染的作用。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。
序列表
<110>温州医科大学
<120>一种对新冠病毒S蛋白RBMFP结构域具有结合亲和力的多肽及其应用
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 58
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 1
Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Ala Tyr Phe Ala Gly Asp Glu Ile
1 5 10 15
Leu Asp Leu Pro Asn Leu Asn Pro Pro Gln Leu Glu Ala Phe Ile Val
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Glu Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 2
<211> 58
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 2
Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Val Val Arg Ala Ser Glu Glu Ile
1 5 10 15
Asp Pro Leu Pro Asn Leu Asn Leu His Gln Arg Pro Ala Phe Ile Pro
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Glu Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 3
<211> 58
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 3
Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Glu Arg Asn Ala Pro Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Met Ser Leu Pro Asn Leu Asn Gly Ala Gln Val Glu Ala Phe Ile Ala
20 25 30
Ser Leu His Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Glu Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 4
<211> 58
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 4
Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Leu Thr Ala Pro Ala Glu Ile
1 5 10 15
Ser Ile Leu Pro Asn Leu Asn Gly Ala Gln Gly Gly Ala Phe Ile Gly
20 25 30
Ser Leu Glu Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Glu Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 5
<211> 174
<212> DNA
<213> Staphylococcus aureus
<400> 5
gttgataaca agttcaacaa ggaagcatat ttcgcagggg atgagattct ggatctgccg 60
aatctgaatc cgccgcagct ggaggcgttt attgtgagtc tgcgtgatga tccgagtcag 120
agtgcagagc tgctggcaga agcaaaaaag ttaaatgatg cacaggcacc gaaa 174
<210> 6
<211> 174
<212> DNA
<213> Staphylococcus aureus
<400> 6
gttgataaca agttcaacaa ggaagtggtt cgggcaagcg aagaaattga tccgctgccg 60
aatctgaatc tgcatcagcg tccggcgttt attccgagtc tgcgtgatga tccgagtcag 120
agtgcagaac tgctggcaga agcgaaaaaa ttaaatgatg cacaggcacc taaa 174
<210> 7
<211> 174
<212> DNA
<213> Staphylococcus aureus
<400> 7
gttgacaaca aattcaacaa agaagagcgc aacgctccct acgaaatcat gtcgctgccg 60
aacctgaacg gggcgcaggt cgaggctttc atcgcgtctc tgcatgacga cccgtctcag 120
tctgctgagc tcctggctga agctaaaaaa ctgaacgacg ctcaggctcc gaaa 174
<210> 8
<211> 174
<212> DNA
<213> Staphylococcus aureus
<400> 8
gttgataaca agttcaacaa ggaacagctg accgcaccgg cagagattag catactgccg 60
aatctgaatg gtgcacaggg tggtgcgttt attggtagtc tggaggatga tccgagtcag 120
agcgcagaac tgctggcgga agcaaaaaaa ttaaacgatg cacaggcacc gaaa 174
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 9
catatggttg acaacaaatt caacaaagaa 30
<210> 10
<211> 38
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 10
gggaattcca tatggttgac aacaaattca acaaagaa 38
<210> 11
<211> 28
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 11
ccggaattcc gtttcggagc ctgagctg 28
<210> 12
<211> 58
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 12
Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 13
<211> 174
<212> DNA
<213> Staphylococcus aureus
<220>
<221>人工序列
<222> (1)..(174)
<400> 13
gttgacaaca aattcaacaa agaacagcag aacgctttct acgaaatcct gcacctgccg 60
aacctgaacg aagaacagcg taacgctttc atccagtctc tgaaagacga cccgtctcag 120
tctgctaacc tgctggctga agctaaaaaa ctgaacgacg ctcaggctcc gaaa 174

Claims (10)

1.一种对新冠病毒S蛋白RBMFP结构域具有结合亲和力的多肽，其特征在于：多肽是以SEQ ID NO: 12所示的葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列作为骨架，进行11-20个氨基酸变异后获得的多肽。
2. 根据权利要求1所述的对新冠病毒S蛋白RBMFP结构域具有结合亲和力的多肽，其特征在于：如SEQ ID NO: 12所示的葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列在第9-11，13-14，17-18，24-25，27-28，32，35位中的至少11个氨基酸发生氨基酸突变得到的突变序列。
3. 根据权利要求2所述的对新冠病毒S蛋白RBMFP结构域具有结合亲和力的多肽，其特征在于：其氨基酸序列中包括如SEQ ID NO:1-4任一所示的序列。
4.一种靶向新冠病毒S蛋白RBMFP结构域的靶向性分子，其特征在于：所述靶向性分子包括如权利要求1-3任一项所述的多肽，以及与该多肽相连接的偶联物。
5.根据权利要求4所述的靶向新冠病毒S蛋白RBMFP结构域的靶向性分子，其特征在于：所述偶联物为半胱氨酸残基、多肽标签、可检测标记物、抑制新冠病毒的药物中的一种或多种。
6.一种多核苷酸，其编码如权利要求1-3任一项所述的多肽。
7.一种重组载体，其特征在于：其包含如权利要求6所述的多核苷酸。
8.一种宿主细胞，其特征在于：其内包含有如权利要求6所述的多核苷酸。
9.如权利要求1-3任一项所述的多肽在检测新冠病毒的应用，所述应用为非疾病诊断目的。
10.如权利要求1-3任一项所述的多肽在制备检测新冠病毒的检测试剂或制备治疗或预防新冠病毒感染相关疾病的药物的应用。
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