CN110642928B

CN110642928B - 一种对eb病毒lmp1c端蛋白特异性结合的多肽及其应用

Info

Publication number: CN110642928B
Application number: CN201910836377.3A
Authority: CN
Inventors: 张丽芳; 陈俊; 朱珊丽; 蒋朋飞; 薛向阳
Original assignee: Wenzhou Medical University
Current assignee: Wenzhou Medical University
Priority date: 2019-09-05
Filing date: 2019-09-05
Publication date: 2021-08-03
Anticipated expiration: 2039-09-05
Also published as: CN110642928A

Abstract

本发明涉及一种对EB病毒LMP1 C端蛋白特异性结合的多肽及其应用。首次揭示了一种对EB病毒LMP1 C端蛋白具有结合亲和力的多肽；本发明还提供了该多肽的在诊断检测中的应用，并作为靶向载体在药物或分子靶向试剂的诊断或治疗用途。

Description

一种对EB病毒LMP1C端蛋白特异性结合的多肽及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，更具体地，本发明涉及一种对EB病毒LMP1C端蛋白特异性结合的多肽及其应用。

背景技术

EB病毒（Epstein-Barrvirus,EBV）属于人类疱疹病毒，在人群中感染普遍。EB病毒不仅是传染性单核细胞增多症的病原，并与鼻咽癌（NPC）、口腔腺体肿瘤、淋巴瘤、何杰金氏病、胃癌以及器官移植后的B细胞淋巴瘤、艾滋病相关的淋巴瘤等密切相关。据统计全世界鼻咽癌（NPC）病例中约80％发生于我国，尤其我国南方为高发区，但至今尚无有效的疫苗和特异性的防治方法。研究提示，几乎100％未分化和低分化NPC患者均潜伏感染EB病毒，且在鼻咽癌组织中均能够检测到EB病毒的基因组及其表达的相应蛋白。EB病毒潜伏感染时，主要表达六种核蛋白（EBNA）和潜伏膜蛋白（Latentmembraneprotein，LMP）1和2。LMP1为EB病毒恶性转化基因，可诱导B淋巴细胞转化；LMP1(187～386aa)是游离于胞浆区的200个氨基酸，含有三个功能结构域，即C末端活化区域（C-termina1activationregion）CTAR1，CTAR2和CTAR3，这三个结构域提供了信号分子对接蛋白的结合位点，如TNFR相关因子(TRAFs),TNFR相关死亡结构域(TRADD),受体相互作用蛋白激酶(RIP),和BS69等，通过NF-кB,p38-SAPK,PI3-K/Akt，ERK-MAPK和JAK/STAT等信号通路转导细胞信号。从而产生促进细胞增殖、抑制细胞凋亡，增强细胞迁移等多种生物学作用。如C端功能区的CTRA1和CTAR2可直接与TNFR相关因子蛋白或TNFR相关死亡结构域(TRADD)结合,进而激活NF-кB的活性,促进细胞增生；CTAR3通过募集JAK3,进而活化STAT3。因此，EBVLMP1的187～386aa，即LMP1C端蛋白在EBV诱导细胞转化和癌变过程中发挥重要作用。因此，LMP1C端蛋白是EB病毒相关肿瘤预防和治疗研究的理想靶抗原之一。

靶向治疗是目前肿瘤治疗中最具希望的方法和策略。以表皮生长因子受体（EGFR）和肿瘤血管生成为靶点进行治疗，如EGFR单克隆抗体（赫赛汀），HER2单抗（西妥昔单抗）、贝伐单抗、小分子化合物酪氨酸激酶拮抗剂（舒尼替尼）等，通过特异性阻断肿瘤细胞的信号传导或是通过封闭受体阻止肿瘤血管生成，从而抑制肿瘤细胞生长或促使肿瘤细胞凋亡。但基于抗体分子的靶向治疗仍然存在其应用的局限性，如渗透性差、成本昂贵、具有较强的免疫原性和毒副反应严重等有待进一步研究改善。尤其毒副作用产生的毒性效应已经成为发展针对肿瘤治疗性抗体的主要障碍，产生肝、肾及神经系统毒性而使其功能降低。用同位素标记抗体进行放射性免疫治疗也会导致骨髓抑制等。

基于上述说明，本领域仍然亟待研究靶向性治疗EB病毒感染及其相关肿瘤的新药物或新方法，以改善目前临床现状。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对EB病毒LMP1C端蛋白特异性结合的多肽及其用途。

本发明的第一方面，一种对EB病毒LMP1C端蛋白具有结合亲和力的多肽，多肽是以如SEQIDNO:1所示的葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列作为骨架，进行12-20个氨基酸变异后获得的多肽。

在另一优选例中，对EB病毒LMP1C端蛋白具有结合亲和力的多肽在如SEQIDNO:1所示的葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列的第9-11，13-14，17-18，24-25，27-28，32，35位上发生氨基酸突变。

在另一优选例中，对EB病毒LMP1C端蛋白具有结合亲和力的多肽在如SEQIDNO:1所示的葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列的第9-11，13-14，17-18，24-25，27-28，32，35位上发生氨基酸突变，包括

第9位氨基酸突变为R或L；

第10位氨基酸突变为S或W；

第11位氨基酸突变为W、D或V；

第13位氨基酸突变为L、M或T；

第14位氨基酸突变为R、M或S；

第17位氨基酸突变为P、L或R；

第18位氨基酸突变为T、G或Y；

第24位氨基酸突变为P或A；

第25位氨基酸突变为G或Q；

第27位氨基酸突变为L、H或A；

第28位氨基酸突变为Q、R或V；

第32位氨基酸突变为L、R或A；

第35位氨基酸突变为A、G或L。

在另一优选例中，所述的对EB病毒LMP1C端蛋白特异性结合的多肽的氨基酸序列如SEQIDNO:2-4任一所示。

在另一优选例中，所述的对EB病毒LMP1C端蛋白特异性结合的多肽与EB病毒LMP1C端蛋白相互作用的KD值为1×10^-4M至1×10^-8M。

在本发明的另一方面，提供一种靶向EB病毒LMP1C端蛋白的靶向性分子，所述的靶向性分子包括前面任一所述的多肽，以及与该多肽相连接（或偶联）的偶联物，所述的偶联物包括（但不限于）：半胱氨酸残基；多肽标签；抑制EB病毒的药物；抗癌活性的物质；或可检测标记物，该可检测标记物包括但不限于：荧光标记、酶、生物素或放射性同位素。

在一优选例中，所述抗癌活性的物质包括但不限于：用于本发明多肽引导效应酶：羧肽酶；用于募集免疫系统的效应细胞和其它组分的蛋白：IL-2、IFNγ、IL-12、TNFα、IP10；促凝血因子，组织因子、vonWillebrand因子；毒素；细胞毒性药物：auristatin类似物、阿霉素、放射性同位素。

在另一优选例中，所述抑制EB病毒的药物包括但不限于：白喉毒素、蓖麻毒素、绿脓杆菌外毒素或所述白喉毒素、蓖麻毒素、绿脓杆菌外毒素的功能性片段、calcheamicin、美登木素生物碱；

在另一优选例中，所述酶包括但不限于：碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。

在另一个优选例中，所述的偶联物是肽，所述的偶联物与所述的对EB病毒LMP1C端蛋白具有结合亲和力的多肽构成融合多肽。

在另一优选例中，所述的偶联物与所述的对LMP1C端蛋白特异性结合的多肽以柔性肽连接，所述柔性肽包括（但不限于）：(Gly4Ser)3。

在另一优选例中，所述的多肽标签包括但不限于：His标签（如6×His），Myc标签，GST标签，Flag标签。

在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，其编码SEQ ID NO:3序列所示的的对EB 病毒LMP1 C端蛋白具有结合亲和力的多肽的多核苷酸序列，该多核苷酸序列如序列SEQID NO: 6所示，其编码SEQ ID NO:4序列所示的对EB 病毒LMP1 C端蛋白具有结合亲和力的多肽的多核苷酸序列，该多核苷酸序列如序列SEQID NO: 7所示。

在本发明的另一方面，提供一种重组载体，该载体包含所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种宿主细胞，该宿主细胞包含所述的重组载体，或其包含有或基因组中整合有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种制备前面任一所述的对EB病毒LMP1C端蛋白具有结合亲和力的多肽的方法，所述方法包括：(1)培养所述的细胞，从而表达所述的对LMP1C端蛋白具有结合亲和力的多肽；(2)分离纯化(1)获得的多肽。

在本发明的另一方面，提供所述的对LMP1C端蛋白具有结合亲和力的多肽或所述的靶向LMP1C端蛋白的靶向性分子的用途，所述的靶向EB病毒LMP1C端蛋白的靶向性分子中，所述的偶联物是抗肿瘤药物，所述的对EB病毒LMP1C端蛋白具有结合亲和力的多肽，或所述的靶向EB病毒LMP1C端蛋白的靶向性分子用于治疗EB病毒LMP1C端蛋白表达阳性肿瘤。

在本发明的另一方面，提供所述的对LMP1C端蛋白具有结合亲和力的多肽或所述的靶向LMP1C端蛋白的靶向性分子的用途，所述的靶向EB病毒LMP1C端蛋白的靶向性分子中，所述的偶联物是可检测标记物，荧光标记、酶、生物素或放射性同位素，所述的对EB病毒LMP1C端蛋白具有结合亲和力的多肽，或所述的靶向EB病毒LMP1C端蛋白的靶向性分子用于诊断EB病毒感染疾病或EB病毒LMP1C端蛋白表达阳性肿瘤的诊断试剂。

在另一优选例中，所述的EB病毒LMP1C端蛋白表达阳性肿瘤包括：鼻咽癌、口腔腺体肿瘤、淋巴瘤、何杰金氏病、胃癌以及器官移植后的B细胞淋巴瘤、艾滋病相关的淋巴瘤等。

在本发明的另一方面，提供一种药物组合物，其包含：前面所述的对EB病毒LMP1C端蛋白具有结合亲和力的多肽或所述的靶向EB病毒LMP1C端蛋白的靶向性分子；和药学上可接受的载体。

在本发明的另一方面，提供一种用于诊断EB病毒LMP1C端蛋白表达阳性肿瘤的药盒，所述的药盒中包括：所述的靶向EB病毒LMP1C端蛋白的靶向性分子，所述的靶向EB病毒LMP1C端蛋白的靶向性分子，所述靶向性分子偶联有多肽标签或者可检测标记物，和检测多肽标签或者可检测标记物的检测试剂。

在本发明的另一方面，提供一种用于治疗EB病毒LMP1C端蛋白表达阳性肿瘤的药盒，所述的药盒中包括：所述的对EB病毒LMP1C端蛋白具有结合亲和力的多肽；或所述的靶向EB病毒LMP1C端蛋白的靶向性分子，所述靶向性分子偶联有所述的抑制EB病毒的药物，或者所述的抗癌活性的物质;或所述的药物组合物。

在一个优选例中，所述的对EB病毒LMP1C端蛋白具有结合亲和力的多肽或所述的靶向EB病毒LMP1C端蛋白的靶向性分子是有效量的。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明做进一步介绍。

附图说明

图1、各Z_LMP1以及Zwt序列的对比，本发明的多肽Z_{LMP1C端蛋白}中被修饰的氨基酸位点在图中己用下划线标出（SEQIDNO：2-4）；

图2、实施例Z_EBVLMP1:114中产生的Z_LMP1多肽重组质粒构建图;

图3、pET21a(+)/Z_LMP1affibody的重组质粒电泳图;

A-C分别为pET21a(+)/Z_EBVLMP1:15、pET21a(+)/Z_EBVLMP1:114和pET21a(+)/Z_EBVLMP1:277的重组质粒电泳图。M1:1kbDNAmarker;1：pET21a(+)载体质粒;2：pET21a(+)/Z_{LMP1C端蛋白}ffibody重组质粒;3：pET21a(+)/Z_LMP1affibody/NdeI+XhoI;4：Z_LMP1affibodyDNA片段;M2:DL2000DNAmarker；

图4、Z_LMP1affibody重组蛋白原核表达(A)及纯化的SDS-PAGE电泳分析(B);

(A)M：蛋白marker；1-2分别为BL21(DE3)菌株和pET21(+)空载体转染的BL21(DE3)菌株，3-6分别为pET21a(+)/Z_EBVLMP1:15、pET21a(+)/Z_EBVLMP1:114和pET21a(+)/Z_EBVLMP1:277及pET21a(+)/Zwt的重组质粒转染的BL21(DE3)菌株。

(B)M：蛋白marker；1-4分别为纯化的Z_EBVLMP1:15、Z_EBVLMP1:114、Z_EBVLMP1:277及Zwtaffibody重组蛋白；

图5、EB病毒LMP1C端重组蛋白原核表达鉴定及制备兔血清抗体的分析

(A)EB病毒LMP1C端重组纯化蛋白SDS-PAGE电泳分析，M：蛋白Marker；1：纯化后的EB病毒LMP1C端蛋白重组蛋白；2：纯化后GST载体蛋白；(B)EB病毒LMP1C端重组纯化蛋白Westernblot分析，一抗为his-tag单克隆抗体，1：纯化后的EB病毒LMP1C端重组蛋白；2：纯化后GST载体蛋白；(C)为EB病毒LMP1C端重组蛋白免疫兔血清抗体的反应；(D)为EB病毒LMP1C端重组蛋白免疫后兔血清抗体的效价；

图6、Z_LMP1affibody多肽与EB病毒LMP1C端重组蛋白亲和力在ProteOnXPR36仪器上的SPR检测

A-D分别为Z_EBVLMP1:15、Z_EBVLMP1:114、Z_EBVLMP1:277及Zwt蛋白与靶蛋白EB病毒LMP1C端重组蛋白的亲和力分析；

图7、Z_LMP1affibody多肽与EB病毒LMP1C端蛋白天然蛋白结合的细胞免疫荧光方法鉴定

A-D分别为Z_EBVLMP1:15、Z_EBVLMP1:114、Z_EBVLMP1:277及Zwt蛋白与天然蛋白结合的间接免疫荧光检测；

图8、Z_EBVLMP1:15、Z_EBVLMP1:114、Z_EBVLMP1:277重组蛋白对裸鼠肿瘤组织中LMP1的免疫组织化学分析（400倍镜下拍摄）；

图9、Z_EBVLMP1:15、Z_EBVLMP1:114、Z_EBVLMP1:277重组蛋白对鼻咽癌肿瘤组织中LMP1的免疫组织化学分析（400倍镜下拍摄）。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定，该领域的技术工程师可根据上述发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。

如本文所用，所述的“对EB病毒LMP1C端蛋白具有结合亲和力的多肽”是指以葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列作为骨架，进行12-20个氨基酸变异后获得的多肽，且该多肽能够特异性结合EB病毒LMP1C端蛋白、具有极少或没有非特异性结合。

如本文所用，所述的“本发明的多肽”、“对EB病毒LMP1C端蛋白具有结合亲和力的多肽”、“EB病毒LMP1C端蛋白结合多肽”、“EB病毒LMP1C端蛋白结合多肽”、“Z_{LMP1C端蛋白}affibody多肽”、“Z_{LMP1C端蛋白}affibody”、“Z_{LMP1C端蛋白}”、“affibody蛋白”、“affibody重组蛋白”、“Z_{LMP1C端蛋白}重组蛋白”可以互换使用;EB病毒LMP1C端蛋白与LMP1C端蛋白可以互换使用;Z_{EBVLMP1C端蛋白}与Z_{LMP1C端蛋白}可以互换使用;SPAZ与Zwt可以互换使用。

如本文所用，所述的“靶向性分子”是指将本发明的对EB病毒LMP1C端蛋白（EBVLMP1(187～386aa)蛋白）具有结合亲和力的多肽与其它功能性偶联物连接后获得的、可以靶向EB病毒LMP1C端蛋白的分子。所述的偶联物可以是半胱氨酸残基，多肽标签，抑制EB病毒LMP1C端蛋白的药物，酶或可检测标记物等。

如本文所用，所述的“融合多肽”是所述的“靶向性分子”的下位概念，是指本发明的对EB病毒LMP1C端蛋白具有结合亲和力的多肽与其它功能性肽(例如毒素蛋白或功能性蛋白片段)连接后获得的、可以靶向EB病毒LMP1C端蛋白胞浆区的分子。

本发明人选择EB病毒LMP1C端蛋白作为靶抗原。本发明人以葡萄球菌A蛋白的Z结构域(Zwt，SEQIDNO:1)作为支架，将其表面氨基酸残基模拟抗体结合位点进行随机突变，通过噬菌体展示技术构建突变体文库，以EB病毒LMP1C端蛋白作为靶抗原对该文库进行亲和筛选，经过大量的筛选工作，最终获得了对于EB病毒LMP1C端蛋白具有高度亲和力的多肽。

本发明的多肽是以葡萄球菌A蛋白Z结构域的氨基酸序列作为骨架，进行14-20个（较佳地为14个）氨基酸变异后获得的多肽。作为本发明的优选方式，本发明的多肽相对于葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列（SEQIDNO:1），在第9-11，13-14，17-18，24-25，27-28，32，35位上发生氨基酸突变。更优选地，本发明的多肽具有SEQIDNO:2-4任一所示的氨基酸序列，如图1所示。

本发明还涵盖了在所述EB病毒LMP1C端蛋白结合多肽的氨基酸序列任一末端或两端加入额外的氨基酸残基而形成的多肽。这些额外的氨基酸残基可以在多肽结合EB病毒LMP1C端蛋白时起作用，但是也可同样用于其它目的，如涉及该多肽的生产、纯化、稳定、偶联或检测的一种或几种。这些额外的氨基酸残基可以包括一或多种为了化学偶联目的而添加的氨基酸残基。如在多肽链的第一位或最后一位添加，即在N或C末端添加一个半胱氨酸残基等。这种额外的氨基酸残基也可以包括用于多肽纯化或检测的一个“标记”，如与标记抗体相互作用的六组氨酸肽（His₆）标记，或“myc”标记或“flag”标记。此外，其它本领域技术人员熟知的替代方式也包含在本发明中。

所述“额外的氨基酸残基”也可构成具有预期功能的一个或多个多肽结构域，如与第一个、EB病毒LMP1C端蛋白结合结构域相同的结合功能，或者其它结合功能，或是一种酶促功能，或是一种荧光功能，或是其组合。

本发明也包含在所述的EB病毒LMP1C端蛋白结合多肽基础上，经修饰进而增加其在碱性条件下的稳定性的多肽。这种稳定性包括用对于碱性条件较不敏感的氨基酸残基定点取代在没有修饰的序列中出现的任何天冬酞胺残基。由于在不同的反应之间亲和层析柱要经受频繁的强碱处理以进行洗脱，这种对碱降低敏感性的特性，有利于使用本发明的多肽作为亲和层析中的亲和配体，能够延长亲和层析基质的使用寿命。

本发明也包含在本发明的EB病毒LMP1C端蛋白结合多肽基础上，进行其它修饰后获得的多肽。这些修饰（通常不改变一级结构）形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶（如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶）而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基（如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸）的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明的EB病毒LMP1C端蛋白结合多肽可以与偶联物连接，从而构成功能性的靶向性分子，这种连接可通过化学键（包括肽键）相连或吸附；所述的化学键是共价键或非共价键。作为一种优选方式，通过肽键连接，从而形成融合多肽。所述的EB病毒LMP1C端蛋白结合多肽与偶联物之间可以直接相连接，或者通过多肽连接子（连接肽）连接。所述的连接子例如包括1-30个氨基酸；较佳地为1-20个氨基酸。连接肽的设置基本上不影响融合蛋白中各多肽的活性。较佳地，可以利用柔性肽(Gly4Ser)3进行连接。其它本领域技术人员熟知的连接肽也可应用于本发明。

在“异源”融合多肽中，所述EB病毒LMP1C端蛋白结合多肽构成了第一个结构域或第一个部分，第二和其它部分具有除了结合EB病毒LMP1C端蛋白外的其它功能，这些可预期的结果也在本发明的范围内。该融合多肽的第二和其它部分可能包含对除了EB病毒LMP1C端蛋白外的其它靶分子具有亲和力的结合结构域。这种结合结构域也可能与SPA结构域相关，但在1到大约20个位置具有取代突变。结果是融合多肽有至少一个EB病毒LMP1C端蛋白结合结构域和至少一个与所述其它靶分子具有亲和力的结构域。这扩展了本发明的多肽的应用，如作为治疗制剂或作为捕获、检测或分离试剂。

本发明融合多肽第二和其它部分的其它选择包括用于治疗性应用的一或多种部分。在治疗性应用中，其它分子也可以通过其它方法共价或非共价偶联到本发明的多肽上，如将改造的铜绿假单胞菌外毒素PE38KDEL或颗粒酶（GrB）等通过柔性肽连接于LMP1C端蛋白结合多肽的C-末端，构成融合蛋白。非限制性例子包括用本发明多肽引导效应酶(例如羧肽酶)而进行“ADEPT"（抗体介导的酶前药治疗，antibody-directedenzymeprodrugtherapy）的酶；包括用以募集免疫系统的效应细胞和其它组分的蛋白质；包括细胞因子，如IL-2、IFNγ、IL-12、TNFα、IP10；包括促凝血因子，如组织因子、vonWillebrand因子；包括毒素，如蓖麻毒蛋白、calcheamicin、美登木素生物碱；包括毒性小分子，如auristatin类似物、阿霉素等。同时，为了更方便掺入放射性核素（如⁶⁸Ga、⁷⁶Br、¹¹¹In、⁹⁹Tc、¹²⁴I、¹²⁵I）用于诊断或放射性核素（如⁹⁰Y、¹³¹I、²¹¹At）用于治疗，可以考虑上述列举的额外的氨基酸（特别是六组胺酸标记和半胱氨酸），其目的是将放射性同位素的鳌合剂偶联到多肽序列。

本发明还涵盖了在所述的EB病毒LMP1C端蛋白结合多肽上连接一个可检测标记物（如荧光标记，生物素或放射性同位素），从而可基于本发明的多肽的特异性，实现检测表达EB病毒LMP1C端蛋白阳性肿瘤的目的。

“EB病毒LMP1C端蛋白(EBVLMP1C端蛋白)结合亲和力”是指可以例如通过利用表面等离子共振（surfaceplasmonresonance）技术如Biocore^®装置进行检测的一种多肽特性。EB病毒LMP1C端蛋白结合亲和力可以通过一个实验进行检测，其中将EB病毒LMP1C端蛋白固定在该装置的感应芯片上，然后将含有待测多肽的样品通过该芯片。或者，也可以将待检测的多肽固定在该装置的感应芯片上，然后将含有EB病毒LMP1C端蛋白的样品通过该芯片。本领域技术人员可以利用所获得的感应图像建立多肽的EB病毒LMP1C端蛋白结合亲和力的至少一种定性测量方法。如果需要定量测量方法，例如为了建立相互作用间的某个KD值，也可以使用表面等离子共振方法。例如，结合值可以利用Biocore^®2000装置(BiocoreAB)进行测定。EB病毒LMP1C端蛋白固定于该装置的感应芯片上，而亲和力待检测的多肽样品通过连续稀释制备并以随机顺序进行注射。然后可从结果中计算KD值。在本发明的实施例中，所述的多肽的KD值达到1.70×10^-5M至7.52×10^-7M。

本发明还提供了编码本发明的EB病毒LMP1C端蛋白结合多肽或靶向性分子或融合多肽的分离的核酸，也可以是其互补链。所述核酸可以全序列人工合成，也可用PCR扩增的方法分别获得。

本发明还提供了包含编码所述核酸分子的载体。所述的载体还可包含与所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，以便于所述融合蛋白的表达。如本文所用，“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制以编码序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。

在本发明中，任何合适的载体都可以使用，比如一些用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞的克隆和表达的载体，如Pouwels等，克隆载体：实验室手册中所描述的。

此外，含有所述核酸序列的重组细胞也包括在本发明中。术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌等；例如可为大肠杆菌细胞(E.coli)，如大肠杆菌HMS174(DE3)、或BL21(DE3)。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。

生产本发明的EB病毒LMP1C端蛋白结合多肽或靶向性分子或融合多肽的方法也已包括在本发明中。所述方法包括培养含有相应多肽的编码核酸的重组细胞，获得产物多肽。可将上述制备获得的多肽纯化为基本均一的性质，例如在SDS-PAGE电泳上呈单一条带。

基于要表达多肽的信息和目前重组表达蛋白质的技术水平，结合本发明揭示的内容，本领域技术人员易于制备本发明的多肽。例如，表达未被修饰的Z结构域的质粒可以用作起始材料。使用已知技术，所需的取代突变可以被引入这个质粒中以获得本发明的表达载体。

当使用化学多肽合成方法制备本发明的多肽或靶向性分子或融合蛋白时，上述多肽中的任何天然产生的氨基酸残基都可以被任何相应的、非天然产生的氨基酸残基或其衍生物所取代，只要产物多肽的功能基本不被损害。

本发明还涉及所述的EB病毒LMP1C端蛋白结合多肽或靶向性分子或融合多肽在不同方面的应用，包括应用于治疗、诊断和/或检测。

本发明的EB病毒LMP1C端蛋白结合多肽可作为EB病毒LMP1C端蛋白抗体在不同应用中的一种替代物。

作为非限制性的实例，其可用于治疗特征以EB病毒LMP1C端蛋白表达为特征的疾病，例如肿瘤（如鼻咽癌）等。通过结合胞内EB病毒LMP1C端蛋白以抑制细胞信号传导，用于相关疾病的体内和体外诊断。本发明的多肽可作为一种检测试剂、一种捕获试剂或者分离试剂，而且还可直接用作为一种治疗制剂或者将其它治疗制剂靶向EB病毒LMP1C端蛋白的手段。体外使用本发明的多肽的方法可以不同方式进行，如微量滴定板、蛋白阵列、生物传感器表面和组织切片等等。为了使本发明多肽适用于特异的用途，在不偏离本发明的范围的情况下，可以对本发明的多肽进行修饰和/或添加。

在下面详细描述了这些修饰和添加，其可能包括在同一多肽链中包含的额外的氨基酸，或者标记和/或治疗制剂，其化学修饰或以其它方式结合本发明的多肽。另外，本发明还涵盖了保留了结合EB病毒LMP1C端蛋白能力的该多肽的片段。

本发明多肽的EB病毒LMP1C端蛋白胞浆区结合特性以及用该多肽生产靶向性分子（包括融合蛋白）和/或标记的结合分子的稳定性意味着该多肽也可以用于将其它活性物质靶向肿瘤部位，这些肿瘤包括表达EB病毒LMP1C端蛋白的细胞。因此，本发明的另一方面是提供了本文所述的EB病毒LMP1C端蛋白结合多肽与一种具有抗癌活性的物质偶联的应用，以将所述物质运送到表达EB病毒LMP1C端蛋白的细胞，产生靶细胞的损伤或凋亡。

这种抗癌活性的物质可能是通过融合或通过化学键偶联到EB病毒LMP1C端蛋白结合多肽上的蛋白质，如选自用于“ADEPT”（antibody-directedenzymeprodrugtherapy）应用的效应酶；用于募集免疫系统的效应细胞和其它组分的蛋白；细胞因子，如IL-2、IFNγ、IL-12、TNFαa、IP10等；促凝血因子，如组织因子、vonWillebrand因子等；毒素，如蓖麻毒蛋白、假单胞菌外毒素、calcheamicin、美登木素生物碱等。或者，所述活性物质也可能是细胞毒性药物，如auristatin类似物或阿霉素或放射性同位素（如⁹⁰Y、¹³¹I、²¹¹At等），这种同位素可与EB病毒LMP1C端蛋白结合多肽直接结合，或通过一种鳌合剂，如熟知的鳌合剂DOTA或DTPA而与EB病毒LMP1C端蛋白结合多肽结合。

在相关方面，本发明还提供了一种在体内将具有抗癌活性的物质导向表达EB病毒LMP1C端蛋白细胞的方法，包括施用给患者本文所述的所述活性物质与EB病毒LMP1C端蛋白结合多肽的偶联物。这种偶联物在前文已被适当描述。

本发明还包括使用所述的与EB病毒LMP1C端蛋白结合的多肽检测样品中的EB病毒LMP1C端蛋白。

例如，这种检测可以用来诊断特征为表达EB病毒LMP1C端蛋白的疾病情况。检测EB病毒LMP1C端蛋白的存在可以在体内也可以在体外进行。体内诊断的优选选择是使用正电子放射X线断层摄影术，PET。被检测的样品可以例如是生物学液体样品或组织样品。现在的普遍方法是用针对与EB病毒LMP1C端蛋白的抗体，这种方法可以适用于本发明的与EB病毒LMP1C端蛋白结合多肽，这种方法是组织化学方法检测与EB病毒LMP1C端蛋白的存在，用来鉴定新鲜、冷冻或福尔马林固定、石蜡包埋的组织样品中与EB病毒LMP1C端蛋白的表达。

本发明的多肽也能用作融合蛋白的一部分，其中其它结构域是报告酶或荧光酶。或者，其也可以是被一个或多个荧光制剂和/或放射性同位素标记的，任选通过鳌合剂标记。合适的放射性同位素包括⁶⁸Ga、⁷⁶Br、¹¹¹In、⁹⁹Tc、¹²⁴I和¹²⁵I等。

本发明还包括将所述的EB病毒LMP1C端蛋白结合多肽应用于检测生物学液体样品中EB病毒LMP1C端蛋白。这个方法包括以下步骤：(1)提供被检测患者的生物学液体样品，(2)将本文所述的EB病毒LMP1C端蛋白结合多肽在能使所述多肽与样品中存在的任何EB病毒LMP1C端蛋白结合的条件下加入样品中，(3)除去非结合的多肽，及(4)检测结合的多肽。被检测到的结合的多肽的量与样品中存在的EB病毒LMP1C端蛋白量相关。在步骤(2)中，EB病毒LMP1C端蛋白结合多肽可以以任何适宜的形式加入到样品中，包括例如这样的情况，当EB病毒LMP1C端蛋白结合多肽被固定在一种固体支持物上，通过其使样品接触，或EB病毒LMP1C端蛋白结合多肽存在于溶液中。

所述的EB病毒LMP1C端蛋白结合多肽的其它应用还包括：检测样品中EB病毒LMP1C端蛋白的方法，包括如下步骤：(1)提供一种怀疑含有EB病毒LMP1C端蛋白的组织样品，例如冷冻切片或用福尔马林包埋的组织切片，(2)在适宜条件下加入本发明的EB病毒LMP1C端蛋白结合多肽到所述样品中，所述条件为益于所述多肽与样品中存在的任何EB病毒LMP1C端蛋白结合，(3)除去未结合的多肽，及(4)检测结合的多肽。检测到的结合的多肽的量与样品中存在的EB病毒LMP1C端蛋白的量相关。

本发明还提供了一个诊断组织样品中EB病毒LMP1C端蛋白表达的试剂盒，包括与报告酶(如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)融合的本发明的EB病毒LMP1C端蛋白结合多肽、检测酶活性的试剂，和/或阳性对照组织切片，和/或阴性对照组织切片。

本发明还提供了一个诊断组织样品中EB病毒LMP1C端蛋白表达的试剂盒，包括通过抗体检测的与标记（如flag标记或myc标记）融合的本发明的EB病毒LMP1C端蛋白结合多肽、一个特异于标记的一抗、特异于一抗并与报告酶偶联的二抗、检测酶活性的试剂，和/或阳性对照组织切片，和/或阴性对照组织切片。诊断应用的一个领域就是在体内检测癌细胞或其聚集物。本发明提供了一个进行这种诊断的试剂盒，该试剂盒包括标记有一个鳌合物的、本发明的EB病毒LMP1C端蛋白结合多肽、一种诊断用放射性同位素（非限制性的例子是⁶⁸Ga、⁷⁶Br、¹¹¹In、⁹⁹Tc、¹²⁴I和¹²⁵I等），以及用于分析掺入效率的试剂。

如上所述，本发明涵盖了本发明的EB病毒LMP1C端蛋白结合多肽将活性物质靶向表达EB病毒LMP1C端蛋白的细胞如某些类型的癌症细胞的应用。本发明还提供了一个用于此目的的试剂盒，该试剂盒包括用一个鳌合物标记的本发明的EB病毒LMP1C端蛋白结合多肽、一个治疗性放射性同位素（非限制性的例子是⁹⁰Y、¹³¹I、²¹¹At），以及用于分析掺入效率的试剂。

本发明还提供一种药物组合物，其包含：有效量的本发明所述的对EB病毒LMP1C端蛋白具有结合亲和力的多肽或靶向EB病毒LMP1C端蛋白的靶向性分子，和药学上可接受的载体。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应（如毒性）的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’sPharmaceuticalSciences（MackPub.Co.，N.J.1991）中可找到关于药学上可接受的载体的充分说明。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和山梨醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质和稳定剂，如白蛋白等。

可将所述的组合物制成各种适合于哺乳动物给药的剂型，所述剂型包括但不限于：注射剂、胶囊剂、片剂、乳剂、栓剂。

在使用时，是将安全有效量的本发明所述的对EB病毒LMP1C端蛋白具有结合亲和力的多肽或靶向性分子施用于哺乳动物（如人），其中该安全有效量通常至少约1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约1微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1、EB病毒LMP1C端蛋白结合多肽的文库构建及筛选研究

构建噬菌体展示EB病毒LMP1C端蛋白(LMP1C端蛋白)结合多肽的随机组合文库，即许多不同的SPA结构域相关多肽的文库，从该文库中筛选EB病毒LMP1C端蛋白结合多肽，并对其亲和性进行了鉴定。

、EB病毒LMP1C端蛋白结合多肽的随机组合噬菌体展示文库的构建和鉴定

根据野生型SPA-Z的氨基酸序列及结构(NilssonB等，ProteinEng.1987；1(2):107-113)，针对其三个螺旋结构区对应的编码序列设计随机引物，利用PCR方法扩增获得可导致随机氨基酸突变的SPA编码序列，命名为SP。按分子克隆常规方法，通过SfiI和NotI位点将SP编码序列克隆至pCANTAB5E载体构建pCANTAB5E/SP重组质粒，转化至感受态E.coliTG1细胞中，涂布2YT-A平板，37℃培养过夜。即为初级库，标记为affibody初级库备用。随机挑取平板上长出的20个单克隆菌落，将提取质粒用SfiI和NotI双酶切鉴定为阳性克隆，经测序和分析其随机性。

结果：根据测序结果，送测序的20个克隆中有测序结果18个克隆，随机性完全不同，故重组率为18/20=90%；多样性为18/18=100%。取上述转化后培养的菌液，用2×YT培养液倍比稀释(1:10，1:10²……)，涂布SOB-AG平板，计算平板上的单菌落数，推算库容。通过增加连接转化次数累计库容，多次连接转化后使克隆数达到2.4×10⁶个Z蛋白变体(affibody分子)，其在第9、10、11、13、14、17、18、24、25、27、28、32、35具有随机的氨基酸残基。

、EB病毒LMP1C端蛋白结合多肽的筛选和滴度测定

将纯化的EB病毒LMP1C端蛋白包被96孔酶标板，经封闭、加噬菌体文库(初级库)孵育、再加入E.coliTG137℃，轻摇温育；取100μl，用2*YT培养基做梯度倍比稀释，取稀释液100μl涂布SOB-AG平板，30℃过夜，计数结合噬菌体感染菌落数，计算EB病毒LMP1C端蛋白结合噬菌体滴度；用噬菌体文库(初级库)对靶蛋白EBVLMP1(187～386aa)重组蛋白进行三轮淘洗实验，菌液加10¹⁰辅助噬菌体M13KO7和卡那霉素培养过夜，离心后取上清经0.22μm滤膜过滤，获得EB病毒LMP1C端蛋白亲和筛选后的噬菌体文库，结果可见，第一轮淘洗后，在稀释10⁵倍平板上可见几个单克隆菌落，在稀释10⁶倍平板上未见单克隆菌落，说明经过第一轮淘洗滴度在1:10⁵水平。第二轮淘洗后，在稀释10⁵倍平板上可见单克隆，在稀释10⁶倍平板上未见单克隆菌落，说明经过第二轮淘洗滴度依然在1:10⁵水平。第三轮淘洗后，在稀释10⁴倍平板可见数个单克隆，在稀释10⁵倍平板未见单克隆菌落，说明经过第三轮淘洗滴度在1:10⁴水平，且每一轮淘洗时噬菌体感染有效性均达到10⁵水平以上。

、EB病毒LMP1C端蛋白结合多肽单克隆噬菌体的制备及ELISA鉴定

ELISA用于筛选表达EB病毒LMP1C端蛋白结合affibody分子的噬菌体。蛋白包被缓冲液稀释EBVLMP1(187～386aa)重组蛋白至终浓度10μg/ml，100μl/孔包被96孔酶标板，4℃过夜；PBS洗涤，用3%脱脂奶粉封闭2h；洗涤，取三轮筛选后获得的噬菌体与等体积的3%脱脂奶粉混匀，100μl/孔，37℃，2h。洗涤，加入1:10000稀释的HRP/anti-M13酶标二抗(兔抗M13，Abcam#ab6188)，100μl/孔，37℃，1h；洗涤，加入OPD显色液200μl/孔，37℃，15min；2MH₂SO₄50μl/孔，终止反应；置酶标仪(ELx800^TM，BIO-TEK，Winooski，USA)读取OD450值。

在三轮淘选循环中选择结合抗原的affibody分子，经过这三轮选择循环，进一步用噬菌体ELISA检测以分析其与EB病毒LMP1C端蛋白结合活性，用高于0.5的A450的ELISA值为选择标准，鉴定编码EB病毒LMP1C端蛋白结合多肽的噬菌体，选择高于这个ELISA信号值的117个克隆进行DNA序列分析。

、EB病毒LMP1C端蛋白亲和体分子的序列检测及筛选

共117个单克隆送中国上海生工公司测序，测序引物为CATATGGTTGACAACAAATTCAACAAAGAA(SEQIDNO:9)。测序结果用DNASTAR软件分析对标准序列Zwt与SP进一步分析其三个螺旋区的随机性和多样性。结果获42个完全正确克隆序列。

根据DNA测序结果进行分析，在上述测序正确的42个克隆中，选择与EB病毒LMP1C端蛋白结合活性最强的3个单克隆噬菌体(即呈现EB病毒LMP1C端蛋白亲和体分子的单克隆噬菌体)的DNA序列(分别为Z_EBVLMP1:15、Z_EBVLMP1:114、Z_EBVLMP1:277)作为靶目标进行研究，氨基酸序列为图1所示，对应的序列为SEQIDNO:2、3、4，其中SEQIDNO: 3核苷酸编码序列如SEQIDNO:6所示，其中SEQIDNO:4核苷酸编码序列如SEQIDNO:7所示。用于下一步用于EB病毒LMP1C端蛋白结合亲和体的分子克隆和表达及功能检测。

实施例2、EB病毒LMP1C端蛋白结合多肽重组质粒构建和原核蛋白表达及纯化

如前选择了具有较高ELISA读数的3个克隆(图1中的Z_EBVLMP1:15、Z_EBVLMP1:114、Z_EBVLMP1:277)，及Zwt作为EB病毒LMP1C端蛋白结合多肽的阴性对照。为了对筛选的affibody分子进行功能检测，对其进行重组质粒构建、原核蛋白的表达及其鉴定，并制备纯化蛋白。

的重组质粒构建和鉴定

参照affibody基因序列(GenBank：GY324633.1)设计PCR引物，上游引物5’GGGAATTC CATATG GTTGACAACAAATTCAACAAAGAA3’(SEQIDNO:10，斜体和下划线表示NedI酶切位点)，下游引物5’CCG CTCGAG TTTCGGGAGCCTGAGCGTCG3’(SEQIDNO:11，斜体和下划线表示XhoⅠ酶切位点)；以筛选的测序正确三级库单克隆Z_EBVLMP1:114、Z_EBVLMP1:277为模板，通过PCR扩增affibody目的基因,其序列如(SEQIDNO: 6、7)所示，同时将affibodyZwt经原核密码子优化后全序列(SEQIDNO:8)合成作为阴性对照。将PCR扩增的目的基因经NdeⅠ和XhoⅠ克隆至pET21a(+)载体，构建pET21a(+)/Z_{LMP1C端蛋白}的重组质粒，并经测序鉴定(图2，图3)。

．Z_LMP1原核蛋白制备

将重组质粒转化至大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中，37℃，培养16h；加0.8mM异丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)(默克公司，德国)IPTG诱导培养6h表达带有His标签的Z_LMP1及Zwtaffibody蛋白。经诱导后表达的重组蛋白，用镍螯合亲和层析胶体(Ni-NTAAgarose)(QIAGEN公司，美国)亲和层析法纯化并经SDS-PAGE分析鉴定。结果，利用分子生物学技术成功构建了pET21a(+)/Z_LMP1重组质粒，并采用原核表达系统制备了纯化的Z_EBVLMP1:15、Z_EBVLMP1:114、Z_EBVLMP1:277及Zwtaffibody重组融合蛋白，经SDS-PAGE电泳分析（图4）证实，出现考马斯亮蓝浓染的条带分子质量约7kDa，与预期Z_LMP1affibody多肽的分子质量大小一致。本发明选择pET21a(+)载体，在设计上利用其多克隆位点的起始酶位点为NdeI(CATATG)，其密码子ATG即为目的蛋白翻译的氨基酸(M)起始密码子，这样利用原核表达系统表达的蛋白即为全长的目的蛋白Z_LMP1而不带载体蛋白片段，避免了载体蛋白对实验结果的干扰。

实施例3、Z_LMP1affibody多肽与EB病毒LMP1C端蛋白重组蛋白的结合

为鉴定Z_{LMP1C端蛋白}affibody多肽与EB病毒LMP1C端蛋白重组蛋白结合的特异性，利用表面等离子共振技术(SPR)分析筛选的Z_EBVLMP1:15、Z_EBVLMP1:114、Z_EBVLMP1:277及其对照Zwtaffibody与靶蛋白EB病毒LMP1C端蛋白重组蛋白结合的亲和力和特异性。

病毒LMP1C端蛋白重组蛋白的制备和鉴定

将实验室构建并保存的pGEX-4T-1/EB病毒-LMP1C端蛋白重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导后表达重组蛋白，用Ni-NTA亲和层析法纯化制备蛋白，并常规免疫日本大白耳兔制备血清抗体。结果，SDS-PAGE电泳显示一明显蛋白条带出现在相对分子质量(Mr)约27kDa的位置，与预期蛋白Mr大小相符(图5A)；以小鼠抗6×HismAb为一抗进行Westernblot分析，均可见在Mr27kDa处出现单一的信号反应带(图5B)，表明EB病毒LMP1C端蛋白重组蛋白能被His标签抗体所特异性识别和结合。纯化重组蛋白EBVLMP1(187～386aa)并进行透析和浓缩，利用蛋白浓度测定试剂盒测得重组蛋白EBVLMP1(187～386aa)浓度可达700μg/mL。用浓缩后蛋白EBVLMP1(187～386aa)包被酶标板，利用间接ELISA法检测兔0周、2周、4周、6周、8周血清中EBVLMP1(187～386aa)特异性IgG抗体，结果显示，EBVLMP1(187～386aa)蛋白免疫后第2周开始产生特异性抗体，至第6周达到高峰(图5B)。取8周时血清做抗体稀释滴度检测，结果显示，EBVLMP1(187～386aa)兔多克隆抗体的效价可达1:40000(图5D)。

．Z_LMP1多肽的传感器分析

在ProteOnXPR36系统仪器(Bio-Rad公司)进行EB病毒LMP1C端蛋白重组蛋白和Z_LMP1多肽之间相互作用的亲和力分析，即利用表面等离子共振技术(SPR)分析上述带有His标签的Z_EBVLMP1:15、Z_EBVLMP1:114、Z_EBVLMP1:277及其对照Zwtaffibody分子与EB病毒LMP1C端蛋白重组蛋白之间的相互作用。根据操作手册，在不同的流动池上通过偶联于GLH芯片将EB病毒LMP1C端蛋白重组蛋白固定，进行与筛选多肽之间的亲和力测定。第6个流动池表面被激活和失活以作为注射时的空白对照。affibody分子分别进行5个不同梯度浓度稀释，即20.00nM、10.00nM、5.00nM、2.50nM、1.25nM，分别与EB病毒LMP1C端蛋白重组蛋白结合。所有的分析在25℃进行，注射标本的容量为200μl，并以流速30μl/min随机顺序注射，随后用100mMHCl(BIO-RAD货号：#176-2250100mMHCl)洗涤6min(解离)，利用ProteOnManager^TM软件(BIO-RAD)的1：1朗缪尔结合模型分析结合曲线(感应图)。

结果随着Z_{LMP1C端蛋白}亲和体分子浓度升高，其与靶蛋白EB病毒LMP1C端蛋白相互作用的能力增强，亲和力平衡解离常数KD值，Z_EBVLMP1:15、Z_EBVLMP1:114、Z_EBVLMP1:277及其对照Zwtaffibody分子分别的为4.31×10^-7mol/L、7.52×10^-7mol/L、1.70×10^-5mol/L及1.63mol/L(图6)。Z_{LMP1C端蛋白}affibody分子的KD值相差至1x10⁷倍。经筛选获得的Z_EBVLMP1:15、Z_EBVLMP1:114、Z_EBVLMP1:277均能与EB病毒LMP1C端蛋白重组蛋白结合以高亲和力结合，与此同时野生型的Zwtaffibody分子和EB病毒LMP1C端蛋白重组蛋白几乎没有结合力。表明筛选出的Z_LMP1affibody分子与EB病毒LMP1C端蛋白重组蛋白具有较高的特异亲和力，同时也表明原核诱导表达的Z_LMP1affibody分子与EB病毒LMP1C端蛋白重组蛋白均具有生物活性。

因此，本发明的Z_EBVLMP1:15、Z_EBVLMP1:114、Z_EBVLMP1:277分子与EB病毒LMP1C端蛋白靶蛋白分子具有相互结合和识别能力。从蛋白水平验证了Z_EBVLMP1:15、Z_EBVLMP1:114、Z_EBVLMP1:277分子与EB病毒LMP1C端蛋白靶蛋白之间的亲和力。

实施例4、Z_LMP1affibody多肽与表达EB病毒LMP1C端蛋白细胞的结合

为进一步验证筛选的Z_LMP1affibody多肽与EB病毒LMP1C端蛋白靶蛋白的亲和力，利用表达EB病毒LMP1C端蛋白的肿瘤细胞作为研究对象，即B95-8细胞株(EB病毒转化的绒猴淋巴细胞，作为阳性对照)、EB病毒阳性的鼻咽癌细胞株C666-1、CNE-2Z和EB病毒阴性的黑色素瘤细胞株A-375(作为阴性对照)，进一步验证Z_{LMP1C端蛋白}分子与EB病毒LMP1C端蛋白分子之间的结合。

细胞培养：B95-8、C666-1和CNE-2Z细胞培养于RPMI1640培养基(10%胎牛血清，2.05mML-谷氨酞胺和100IU/ml青霉素及100μg/ml链霉素)。黑色素瘤细胞系A375细胞培养于DMEM培养基(10%胎牛血清，2.05mML-谷氨酞胺和100IU/ml青霉素及100μg/ml链霉素)。细胞在37℃含有5%CO₂的培养箱中培养至24h，细胞状态良好时进行免疫荧光检测。

细胞免疫荧光检测：将灭菌的盖玻片放入六孔板中，将培养至24h的B95-8、C666-1、CNE-2Z和A375细胞调整数目为1×10⁵/孔，5%CO₂、37℃培养24h至单层细胞。分别加入终浓度为50μg/ml的Z_EBVLMP1:15、Z_EBVLMP1:114、Z_EBVLMP1:277及其对照Zwtaffibody多肽于上述含10%FBS培养基中，5%CO₂、37℃培养6h，吸出培养液，用预冷PBS洗涤；采用2%多聚甲醛固定单层细胞10min，PBST洗涤3次，加入0.3%TritonX-100打孔10min，洗涤后加入10%FBS+1640培养基37℃封闭1h，洗涤；加入鼠抗His单克隆抗体(ABR公司，美国，1：2000)，置37℃1h，洗涤后加FITC-羊抗鼠IgG二抗(上海联科生物技术公司，中国)和PI(索莱宝公司，北京)2μl/孔1h，避光，洗涤后加盖玻片并用缓冲甘油封片，共聚焦荧光显微镜(LeicaTCSSP2microscope德国)观察并拍片(400×)。

结果显示，Z_EBVLMP1:15、Z_EBVLMP1:114、Z_EBVLMP1:277蛋白孵育的B95-8、C666-1和CNE-2Z细胞株的细胞浆近胞膜处可见多个强绿色的点状或团块状荧光蛋白(图7A-D)，而A375细胞株均未见明显的荧光团块(图7A-C)；同时Zwt对照肽孵育的B95-8、C666-1CNE-2Z和A375细胞株的细胞浆均未见明显的荧光团块(图7D)。表明，Z_EBVLMP1:15、Z_EBVLMP1:114、Z_EBVLMP1:277重组蛋白能特异性识别细胞株天然表达的EB病毒LMP1C端蛋白，本发明制备的Z_LMP1affibody重组蛋白和活细胞表达的EB病毒LMP1C端蛋白有很强的特异结合能力。

上述结果进一步从细胞水平验证了Z_EBVLMP1:15、Z_EBVLMP1:114、Z_EBVLMP1:277affibody重组蛋白与EB病毒LMP1C端蛋白具有很强的亲和力和结合的特异性。

实施例5、Z_LMP1affibody多肽在荷瘤裸鼠中的生物分布和肿瘤靶向特性

在本实施例的实验中，用Z_EBVLMP1:15、Z_EBVLMP1:114、Z_EBVLMP1:277及其对照Zwtaffibody多肽，孵育肿瘤组织，HE染色，进行Z_LMP1affibody多肽生物分布研究和成像定位，以研究标记多肽的生物分布和肿瘤靶向特性。

动物肿瘤模型的制备

选择6-7周龄BALB/c-nu小鼠(购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证SCXK(沪)2012-0002)，体重为15-18g。将培养至对数生长期，生长状态良好的C666-1、CNE-2Z及A375细胞用EDTA（胰酶）消化后，用含10%血清细胞培养液进行吹打、收集，常温1000rpm离心3min，将离心细胞用不含血清的培养液重悬并计数，配制成1×10⁶/ml，取0.2ml于背部近右前臂皮下注射接种裸鼠。每隔3天观察小鼠的精神状态、活动力、反应、饮食、体重及皮下接种区域外观及触感，并以电子游标卡尺测量瘤体大小直径。

结果显示，裸鼠皮下接种上述细胞均可见明显的肿瘤生长，接种裸鼠全部成瘤。2周后，肿瘤最大直径达到约300-500mm³时开始实验。

重组蛋白Z_EBVMP1:15、Z_EBVMP1:114、Z_EBVMP1:277特异性识别结合裸鼠肿瘤组织的免疫组织化学分析鉴定

用4％福尔马林溶液固定动物肿瘤模型剥离的肿瘤组织，用石蜡包埋组织后切片。对组织切片进行HE染色观察：

（1）将肿瘤组织切片置于70℃烘箱中0.5h，取出后二甲苯浸泡3次，每次10min，然后分别用100%、95%、85%、75%乙醇浸泡，每次3min，取出后1×PBS（PH7.4-7.6）浸泡2次，每次5min；

（2）将切片置于双氧水中10min，消除内源性过氧化物酶活性；再于高压锅中，加热柠檬酸至96-100℃，3min，冷却至室温后1×PBS（PH7.4-7.6）洗3次，每次5min；

（3）5%山羊血清（PBS稀释），37℃孵育15分钟，用滤纸吸去血清不洗；

（4）配制终浓度为150μg/mL的重组蛋白Z_EBVLMP1:15、Z_EBVLMP1:114、Z_EBVLMP1:277和野生型Zwt，并取LMP1兔多克隆抗体和PBS兔血清作为对照，湿盒置于4℃过夜；第二天取出片子，1×PBS（PH7.4-7.6）洗3次，每次5min；

（5）用一抗稀释液以1:200的比例稀释His-Tag，滴加于玻片上，置于37℃烘箱0.5h，1×PBS（PH7.4-7.6）洗3次，每次5min；

（6）孵育二抗，滴加HRPIgG(H+L)二抗，湿盒放置于37℃孵育0.5h。取出片子，1×PBS（PH7.4-7.6）洗3次，每次5min；

（7）滴加DAB显色液于组织上显色，观察至有棕黄色沉淀后用流动水冲洗玻片；

（8）苏木精复染3min,流动水冲洗10min；

（9）将切片分别置于75%、85%、95%、100%乙醇钟浸泡，每次3min，二甲苯浸泡2次，每次5min，用中性树脂封片保存，显微镜下观察，拍照。

HE染色组织切片后发现C666-1、CNE-2Z及Siha裸鼠肿瘤组织细胞核大，颜色染色深，形态大小不一致。用重组蛋白Z_EBVLMP1:15、Z_EBVLMP1:114、Z_EBVLMP1:277孵育肿瘤组织，显微镜下可见细胞胞浆中有明显的黄褐色沉淀，部分细胞核中也有黄褐色沉淀，而孵育Zwt蛋白和PBS的各组标本中未见上述黄褐色颗粒沉淀；在LMP1表达阴性的Siha组织切片中，孵育各蛋白后均未见黄褐色沉淀（图8）。显示筛选出的重组蛋白Z_EBVLMP1:15、Z_EBVLMP1:114、Z_EBVLMP1:277对于鼻咽癌组织的肿瘤细胞胞浆中LMP1有一定的靶向结合能力。

3.Z_LMP1affibody多肽特异性识别和结合鼻咽癌患者组织中LMP1的免疫组织化学分析鉴定

用4％福尔马林溶液固定鼻咽癌患者组织手术切除的肿瘤组织，用石蜡包埋组织后切片。对组织切片进行HE染色观察：

其步骤如裸鼠肿瘤组织的HE染色过程，其中鼻咽癌患者组织手术切除的肿瘤组织来源于温州医科大学附属第一医院的手术病例保留标本。

结果显示，HE染色组织切片后发现组织细胞核大，颜色染色深，形态大小不一致。用重组蛋白Z_EBVLMP1:15、Z_EBVLMP1:114、Z_EBVLMP1:277孵育肿瘤组织，显微镜下可见细胞胞浆中有明显的黄褐色沉淀，部分细胞核中也有黄褐色沉淀，孵育野生型Zwt蛋白和PBS的对照组中未见上述黄褐色颗粒沉淀（图9）。这显示筛选得到的Z_EBVLMP1affibody分子有较强的识别鼻咽癌患者组织表达的LMP1。

序列表

<110> 温州医科大学

<120> 一种对EB 病毒LMP1 C端蛋白特异性结合的多肽及其应用

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 58

<212> PRT

<213> Staphylococcus aureus

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(58)

<400> 1

Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 2

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(58)

<400> 2

Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Leu Ser Trp Ala Leu Arg Glu Ile

1 5 10 15

Pro Thr Leu Pro Asn Leu Asn Pro Gly Gln Leu Arg Ala Phe Ile Leu

20 25 30

Ser Leu Ala Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Glu Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 3

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(58)

<400> 3

Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Arg Trp Asp Ala Met Met Glu Ile

1 5 10 15

Leu Gly Leu Pro Asn Leu Asn Ala Gln Gln His Val Ala Phe Ile Arg

20 25 30

Ser Leu Gly Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Glu Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 4

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(58)

<400> 4

Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Leu Ser Val Ala Thr Ser Glu Ile

1 5 10 15

Arg Tyr Leu Pro Asn Leu Asn Pro Gly Gln Ala Gln Ala Phe Ile Ala

20 25 30

Ser Leu Leu Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Glu Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 5

<211> 174

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<222> (1)..(174)

<210> 5

<211> 174

<212> DNA

<213> Staphylococcus aureus

<221> misc_feature

<222> (1)..(174)

<400> 5

gttgacaaca aattcaacaa agaacagcag aacgctttct acgaaatcct 50

gcacctgccg aacctgaacg aagaacagcg taacgctttc atccagtctc 100

tgaaagacga cccgtctcag tctgctaacc tgctggctga agctaaaaaa 150

ctgaacgacg ctcaggctcc gaaa 174

<210> 6

<211> 174

<212> DNA

<213> Staphylococcus aureus

<221> misc_feature

<222> (1)..(174)

<400> 6

gttgacaaca aattcaacaa agaacgttgg gacgctatga tggaaatcct 50

gggtctgccg aacctgaacg ctcagcagca cgttgctttc atccgttctc 100

tgggtgacga cccgtctcag tctgctgaac tgctggctga agctaaaaaa 150

ctgaacgacg ctcaggctcc gaaa 174

<210> 7

<211> 174

<212> DNA

<213> Staphylococcus aureus

<221> misc_feature

<222> (1)..(174)

<400> 7

gttgacaaca aattcaacaa agaactgtct gttgctacct ctgaaatccg 50

ttacctgccg aacctgaacc cgggtcaggc tcaggctttc atcgcttctc 100

tgctggacga cccgtctcag tctgctgaac tgctggctga agctaaaaaa 150

ctgaacgacg ctcaggctcc gaaa 174

<210> 8

<211> 174

<212> DNA

<213> Staphylococcus aureus

<221> 人工序列

<222> (1)..(174)

<400> 8

gttgacaaca aattcaacaa agaacagcag aacgctttct acgaaatcct gcacctgccg 60

aacctgaacg aagaacagcg taacgctttc atccagtctc tgaaagacga cccgtctcag 120

tctgctaacc tgctggctga agctaaaaaa ctgaacgacg ctcaggctcc gaaa 174

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> Staphylococcus aureus

<221> 人工序列

<222> (1)..(30)

<400> 9

catatggttg acaacaaatt caacaaagaa 30

<210> 10

<211> 38

<212> DNA

<213> Staphylococcus aureus

<221> 人工序列

<222> (1)..(38)

<400> 10

gggaattcca tatggttgac aacaaattca acaaagaa 38

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> Staphylococcus aureus

<221> 人工序列

<222> (1)..(28)

<400> 11

ccgctcgagt ttcgggagcc tgagcgtcg 29

Claims

1.一种对EB 病毒LMP1 C端蛋白具有结合亲和力的多肽，其特征在于：对EB 病毒LMP1C端蛋白具有结合亲和力的多肽在如SEQ ID NO:1所示的葡萄球菌A 蛋白Z 段的氨基酸序列的第9-11，13-14，17-18，24-25，27-28，32，35位上发生氨基酸突变，所述多肽的氨基酸序列选自：SEQ ID NO:2-4任一所示的序列。

2.如权利要求1所述的一种对EB 病毒LMP1 C端蛋白具有结合亲和力的多肽，其特征在于，该多肽与EB病毒LMP1 C端蛋白相互作用的KD值为1×10^-4M至1×10^-8M。

3.一种靶向EB病毒LMP1 C端蛋白的靶向性分子，其特征在于，所述的靶向性分子包括权利要求1或2任一所述的多肽，以及与该多肽相连接的偶联物，所述的偶联物包括：半胱氨酸残基，多肽标签，可检测标记物，或抑制EB 病毒LMP1 的药物。

4.一种分离的多核苷酸，其特征在于，多核苷酸为编码权利要求1 或2所述的对EB 病毒LMP1 C端蛋白具有结合亲和力的多肽的多核苷酸。

5.一种重组载体，其特征在于，该载体包含权利要求4所述的多核苷酸。

6.一种宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞包含权利要求5所述的重组载体, 或其包含有基因组中整合有权利要求4所述的多核苷酸。

7.权利要求3任一所述的靶向EB病毒LMP1 C端蛋白的靶向性分子的用途，其特征在于，所述偶联物是抑制EB 病毒LMP1 的药物，用于制备治疗EB病毒感染疾病或EB病毒LMP1 C端蛋白表达阳性肿瘤的药物；

或所述偶联物是多肽标签或可检测标记物，用于制备检测EB病毒感染的检测试剂或用于制备诊断EB病毒感染疾病或EB病毒LMP1 C端蛋白表达阳性肿瘤的诊断试剂。

8.一种药物组合物，其特征在于，其包含：权利要求1或2任一所述的对EB 病毒LMP1 C端蛋白具有结合亲和力的多肽或权利要求3所述的靶向EB病毒LMP1 C端蛋白的靶向性分子；和药学上可接受的载体。

9.一种用于诊断EB病毒感染疾病或EB病毒LMP1蛋白表达阳性肿瘤的药盒，其特征在于，所述的药盒中包括：权利要求3任一所述的靶向EB病毒LMP1 C端蛋白的靶向性分子和检测靶向性分子的检测试剂，所述靶向性分子包括多肽标签或者可检测标记物。

10.一种用于治疗EB病毒感染疾病或EB病毒LMP1 C端蛋白表达阳性肿瘤的药盒，其特征在于，所述的药盒中包括：权利要求1或2任一所述的对EB 病毒LMP1 C端蛋白具有结合亲和力的多肽，或权利要求3所述的靶向EB病毒LMP1 C端蛋白的靶向性分子，或权利要求8所述的药物组合物。