CN111153967B - 一种对hpv16 e5蛋白特异性结合的多肽及其应用 - Google Patents

一种对hpv16 e5蛋白特异性结合的多肽及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111153967B
CN111153967B CN201911298557.7A CN201911298557A CN111153967B CN 111153967 B CN111153967 B CN 111153967B CN 201911298557 A CN201911298557 A CN 201911298557A CN 111153967 B CN111153967 B CN 111153967B
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
hpv16e5
polypeptide
hpv16
binding
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201911298557.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111153967A (zh
Inventor
张丽芳
陈俊
朱珊丽
陈韶
蒋朋飞
李文妺
董海艳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wenzhou Medical University
Original Assignee
Wenzhou Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wenzhou Medical University filed Critical Wenzhou Medical University
Priority to CN201911298557.7A priority Critical patent/CN111153967B/zh
Publication of CN111153967A publication Critical patent/CN111153967A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111153967B publication Critical patent/CN111153967B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses

Abstract

本发明涉及一种对HPV16E5蛋白特异性结合的多肽及其应用，首次揭示了一种对HPV16E5蛋白特异性结合的多肽；本发明还提供了该多肽的在诊断检测中的应用，并作为靶向载体在药物或分子靶向试剂的诊断或治疗用途。

Description

一种对HPV16 E5蛋白特异性结合的多肽及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，更具体地，本发明涉及一种对HPV16 E5蛋白特异性结合的多肽及其应用。
背景技术
人乳头瘤病毒(HPV)是宫颈癌和宫颈发育不良的主要原因。几乎所有宫颈癌患者都感染了高危型的HPV，其中最常见的是16,18,31和45型，而HPV16占50％以上。预防性HPV疫苗已经上市，被用于在患者首次遇到HPV之前对其进行保护。然而，已经感染的女性，例如患有宫颈癌前病变或晚期宫颈癌的患者不能从中受益，因此，治疗性疫苗的制备是必要的。
到目前为止，大多数HPV治疗性疫苗都集中在HPV E6和E7癌基因上。然而，这些疫苗不能完全根除病变。HPV中的第三个致癌基因E5受到越来越多的关注，因为在组织培养实验中证明了它能转化小鼠成纤维细胞并参与细胞增殖的作用，能够通过许多途径改变上皮细胞的生长和分化，包括赋予对细胞凋亡的抗性并影响参与细胞粘附和细胞运动的几种细胞途径。与单一的癌蛋白相比，E5与E6或E7共表达促进细胞转化的程度更大。多项研究也已经表明E5在HPV相关癌症早期的癌发生中起重要作用，同时它与E6和E7在增强永生化潜能方面具有协同作用。
在人类宫颈癌中，HPV16 E5基因在将病毒DNA整合到宿主细胞基因组中时经常缺失，并且很难在宫颈癌中检测到E5蛋白。然而，病毒基因组在一些HPV16阳性宫颈癌中仍然作为质粒存在，并且在HPV16阳性宫颈病变及癌前期检测到E5蛋白，说明HPV16 E5可能导致宫颈癌恶性进展，监测E5的表达可用于判断宫颈癌的病变程度，阻断E5可控制宫颈癌恶性发展。
亲和蛋白凭借其能与靶蛋白通过亲和力结合而被广泛研究，亲和蛋白的研究不仅有助于对相应靶蛋白的研究，而且在临床上诊断及靶向治疗都有重要意义。
基于上述说明，本领域仍然亟待研究与HPV16 E5特异性结合的蛋白，用以辅助HPV16感染的宫颈癌的早期诊断，以及靶向性治疗HPV16病毒感染及其相关肿瘤的新药物或新方法，以改善目前临床现状。
发明内容
本发明的目的在于提供一种对HPV16 E5蛋白特异性结合的多肽及其用途。
本发明的第一方面，一种对HPV16 E5蛋白特异性结合的多肽，所述多肽为对HPV16E5蛋白特异性结合的多肽，相对于SEQ ID NO:1所示的葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列，所述的对HPV16 E5蛋白特异性结合的多肽的：
第9位氨基酸突变为R或S或F；
第10位氨基酸突变为L或W或A；
第11位氨基酸突变为R、A或S；
第13位氨基酸突变为C或S；
第14位氨基酸突变为A、Y或S；
第17位氨基酸突变为P、L或R；
第18位氨基酸突变为R、Q或N；
第24位氨基酸突变为G或A；
第25位氨基酸突变为D或E或A；
第27位氨基酸突变为R、H或A；
第28位氨基酸突变为Q、A或H；
第32位氨基酸突变为R或L；
第35位氨基酸突变为A、G或E。
在另一优选例中，所述的对HPV16 E5蛋白特异性结合的多肽的氨基酸序列如SEQIDNO:2-4任一所示。
在本发明的另一方面，提供一种靶向HPV16 E5蛋白的靶向性分子，所述的靶向性分子包括前面任一所述的多肽，以及与该多肽相连接(或偶联)的偶联物，所述的偶联物包括(但不限于)：半胱氨酸残基；多肽标签；抑制HPV16病毒的药物；抗癌活性的物质；或可检测标记物，该可检测标记物包括但不限于：荧光标记、酶、生物素或放射性同位素。
在一优选例中，所述抗癌活性的物质包括但不限于：用于本发明多肽引导效应酶：羧肽酶；用于募集免疫系统的效应细胞和其它组分的蛋白：IL-2、IFNγ、IL-12、TNFα、IP10；促凝血因子，组织因子、vonWillebrand因子；毒素；细胞毒性药物：auristatin类似物、阿霉素、放射性同位素。
在另一优选例中，所述抑制HPV16病毒的药物包括但不限于：白喉毒素、蓖麻毒素、绿脓杆菌外毒素或所述白喉毒素、蓖麻毒素、绿脓杆菌外毒素的功能性片段、calcheamicin、美登木素生物碱；
在另一优选例中，所述酶包括但不限于：碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。
在另一个优选例中，所述的偶联物是肽，所述的偶联物与所述的对HPV16E5蛋白特异性结合的多肽构成融合多肽。
在另一优选例中，所述的偶联物与所述的对HPV16 E5蛋白特异性结合的多肽以柔性肽连接，所述柔性肽包括(但不限于)：(Gly4Ser)3。
在另一优选例中，所述的多肽标签包括但不限于：His标签(如6×His)，Myc标签，GST标签，Flag标签。
在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，其编码前面任一所述的对HPV16E5蛋白特异性结合的多肽，该多核苷酸序列如序列SEQIDNO:5、6、7所示。
在本发明的另一方面，提供一种重组载体，该载体包含所述的多核苷酸。
在本发明的另一方面，提供一种宿主细胞，该宿主细胞包含所述的重组载体，或其包含有或基因组中整合有所述的多核苷酸。
在本发明的另一方面，提供一种制备前面任一所述的对HPV16 E5蛋白特异性结合的多肽的方法，所述方法包括：(1)培养所述的细胞，从而表达所述的对HPV16 E5蛋白特异性结合的多肽；(2)分离纯化(1)获得的多肽。
在本发明的另一方面，提供所述的对HPV16 E5蛋白特异性结合的多肽或所述的靶向HPV16 E5蛋白的靶向性分子的用途，所述的靶向HPV16 E5蛋白的靶向性分子中，所述的偶联物是抗肿瘤药物，所述的对HPV16 E5蛋白特异性结合的多肽，或所述的靶向HPV16 E5蛋白的靶向性分子用于治疗HPV16 E5蛋白表达阳性肿瘤。
在本发明的另一方面，提供所述的对HPV16 E5蛋白特异性结合的多肽或所述的靶向HPV16 E5蛋白的靶向性分子的用途，所述的靶向HPV16 E5蛋白的靶向性分子中，所述的偶联物是可检测标记物，荧光标记、酶、生物素或放射性同位素，所述的对HPV16 E5蛋白特异性结合的多肽，或所述的靶向HPV16 E5蛋白的靶向性分子用于诊断HPV16病毒感染疾病或HPV16 E5蛋白表达阳性肿瘤的诊断试剂。
在另一优选例中，所述的HPV16 E5蛋白表达阳性肿瘤包括：鼻咽癌、口腔腺体肿瘤、淋巴瘤、何杰金氏病、胃癌以及器官移植后的B细胞淋巴瘤、艾滋病相关的淋巴瘤等。
在本发明的另一方面，提供一种药物组合物，其包含：前面所述的对HPV16E5蛋白特异性结合的多肽或所述的靶向HPV16 E5蛋白的靶向性分子；和药学上可接受的载体。
在本发明的另一方面，提供一种用于诊断HPV16 E5蛋白表达阳性肿瘤的药盒，所述的药盒中包括：所述的靶向HPV16 E5蛋白的靶向性分子，所述的靶向HPV16 E5蛋白的靶向性分子，所述靶向性分子偶联有多肽标签或者可检测标记物，和检测多肽标签或者可检测标记物的检测试剂。
在本发明的另一方面，提供一种用于治疗HPV16 E5蛋白表达阳性肿瘤的药盒，所述的药盒中包括：所述的对HPV16 E5蛋白特异性结合的多肽；或所述的靶向HPV16 E5蛋白的靶向性分子，所述靶向性分子偶联有所述的抑制HPV16病毒的药物或者所述的抗癌活性的物质；或所述的药物组合。
在一个优选例中，所述的对HPV16 E5蛋白特异性结合的多肽或所述的靶向HPV16E5蛋白的靶向性分子是有效量的。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明做进一步介绍。
附图说明
图1、各ZHPV16 E5蛋白以及Zwt序列的对比，本发明的多肽ZHPV16 E5蛋白中被修饰的氨基酸位点在图中己用下划线标出(SEQIDNO：2-4)；
图2、ZHPV16 E585、ZHPV16 E51244、ZHPV16 E51259重组质粒构建示意图；
图3、ZHPV16 E585、ZHPV16 E51244、ZHPV16 E51259测序峰图；
图4、ZHPV16 E5蛋白的原核表达及纯化鉴定图，4a为HPV16 E5蛋白的原核表达鉴定图:M:蛋白marker；1：Eoli.BL21；2：pET21a(+)/Eoli.BL21；3：pET21a(+)/ZHPV16 E585/Eoli.BL21；4：pET21a(+)/ZHPV16 E51244/Eoli.BL21；5：pET21a(+)/ZHPV16 E51259/Eoli.BL21；6：pET21a(+)/Zwt/Eoli.BL21；4b为ZHPV16E5affibody重组蛋白纯化鉴定图：M:蛋白marker；1：pET21a(+)/ZHPV16 E585；2：pET21a(+)/ZHPV16 E51244；3：pET21a(+)/ZHPV16 E51259；4：pET21a(+)/Zwt；
图5、ZHPV16 E5蛋白Western Blot鉴定图，a：一抗为His单抗(1:5000)，b.一抗为Zwt鼠多克隆抗体(1:2000)，
图a和图b各泳道加样相同分别为M:蛋白marker；1：pET21a(+)/ZHPV16 E585；2：pET21a(+)/ZHPV16 E51244；3：pET21a(+)/ZHPV16 E51259；4：pET21a(+)/Zwt；
图6、ZHPV16 E585、ZHPV16 E51244、ZHPV16 E51259蛋白与HPV16 E5 ELISA检测结果，a.不同浓度ZHPV16 E5蛋白与HPV16 E5的ELISA分析b.ZHPV16 E5蛋白(终浓度为200ng/μL)与HPV16E5的ELISA分析，*表示两组数据之间有统计学差异(p<0.05)；
图7、pcDNA3.1/HPV16 E5真核表达质粒构建；a：pcDNA3.1/HPV16 E5真核表达质粒构建模式图b：pcDNA3.1/HPV16 E5真核表达质粒测序峰图c：pcDNA3.1/HPV16 E5真核表达质粒测序结果与理论序列比对结果；
图8、pLVX/HPV16 E5真核表达质粒构建测序峰图；
图9、ZHPV16 E585、ZHPV16 E51244、ZHPV16 E51259与细胞内HPV16 E5蛋白特异性靶向结合的细胞免疫荧光鉴定；
图10、ZHPV16 E585、ZHPV16 E51244、ZHPV16 E51259与组织细胞的HPV16 E5特异性结合检测图；
图11、BALB/c nu荷瘤裸鼠成瘤过程图；
图12、BALB/c nu荷瘤裸鼠成瘤体重变化图；
图13、TC-1-E5及TC-1-NC细胞荷瘤裸鼠肿瘤及各组织PCR及RT-PCR检测产物电泳图，a.TC-1-E5细胞荷瘤裸鼠肿瘤及各组织PCR检测产物电泳图b.TC-1-NC细胞荷瘤裸鼠肿瘤及各组织PCR检测产物电泳图c.TC-1-E5细胞荷瘤裸鼠肿瘤及各组织RT-PCR检测产物电泳图d.TC-1-NC细胞荷瘤裸鼠肿瘤及各组织RT-PCR检测产物电泳图,各图各泳道均为M：DL2000；1：肿瘤；2：心脏；3：肝脏，4：脾脏；5：肠；6：肾脏；7：皮肤；8：肌肉；9：肺，10：脑；
图14、荧光标记重组蛋白SDS-PAGE鉴定图，a图为考马斯亮蓝染色图，b图为荧光成像图，各泳道分别为M：Marker；1.Dy755-ZHPV16 E585；2.Dy755-ZHPV16 E51244；3.Dy755-ZHPV16  E51259；4.Dy755-Zwt；
图15、Dy755-ZHPV16 E51259蛋白在正常裸鼠中的代谢分布，a.荧光成像b.荧光信号强度量化；
图16、Dy755-ZHPV16 E5蛋白在裸鼠肿瘤模型中的代谢分布，a.荧光成像b.荧光强度量化分析c.同一Dy755-ZHPV16 E5注射4h后在·模型的荧光强度比较d.同一荷瘤裸鼠肿瘤模型在注射不同Dy755-ZHPV16 E5注射4h后的荧光强度比较,*表示两组数据之间有统计学差异(p<0.05)。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定，该领域的技术工程师可根据上述发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。
如本文所用，所述的“对HPV16 E5蛋白特异性结合的多肽”是指以葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列作为骨架，进行12-20个氨基酸变异后获得的多肽，且该多肽能够特异性结合HPV16 E5蛋白、具有极少或没有非特异性结合。
如本文所用，所述的“本发明的多肽”、“对HPV16 E5蛋白特异性结合的多肽”、“HPV16 E5蛋白结合多肽”、“HPV16 E5蛋白结合多肽”、“ZHPV16 E5蛋白affibody多肽”、“ZHPV16 E5蛋白affibody”、“ZHPV16 E5蛋白”、“affibody蛋白”、“affibody重组蛋白”、“ZHPV16 E5蛋白重组蛋白”可以互换使用；HPV16 E5蛋白与HPV16 E5蛋白可以互换使用；ZEBVHPV16 E5蛋白与ZHPV16 E5蛋白可以互换使用；SPAZ与Zwt可以互换使用。
如本文所用，所述的“靶向性分子”是指将本发明的对HPV16 E5蛋白(EBVLMP1(187～386aa)蛋白)具有结合亲和力的多肽与其它功能性偶联物连接后获得的、可以靶向HPV16E5蛋白的分子。所述的偶联物可以是半胱氨酸残基，多肽标签，抑制HPV16 E5蛋白的药物，酶或可检测标记物等。
如本文所用，所述的“融合多肽”是所述的“靶向性分子”的下位概念，是指本发明的对HPV16 E5蛋白特异性结合的多肽与其它功能性肽(例如毒素蛋白或功能性蛋白片段)连接后获得的、可以靶向HPV16 E5蛋白胞浆区的分子。
本发明人选择HPV16 E5蛋白作为靶抗原。本发明人以葡萄球菌A蛋白的Z结构域(Zwt，SEQIDNO:1)作为支架，将其表面氨基酸残基模拟抗体结合位点进行随机突变，通过噬菌体展示技术构建突变体文库，以HPV16 E5蛋白作为靶抗原对该文库进行亲和筛选，经过大量的筛选工作，最终获得了对于HPV16 E5蛋白具有高度亲和力的多肽。
本发明的多肽是以葡萄球菌A蛋白Z结构域的氨基酸序列作为骨架，进行14-20个(较佳地为14个)氨基酸变异后获得的多肽。作为本发明的优选方式，本发明的多肽相对于葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列(SEQIDNO:1)，在第9-11，13-14，17-18，24-25，27-28，32，35位上发生氨基酸突变。更优选地，本发明的多肽具有SEQIDNO:2-4任一所示的氨基酸序列，如图1所示。
本发明还涵盖了在所述HPV16 E5蛋白结合多肽的氨基酸序列任一末端或两端加入额外的氨基酸残基而形成的多肽。这些额外的氨基酸残基可以在多肽结合HPV16 E5蛋白时起作用，但是也可同样用于其它目的，如涉及该多肽的生产、纯化、稳定、偶联或检测的一种或几种。这些额外的氨基酸残基可以包括一或多种为了化学偶联目的而添加的氨基酸残基。如在多肽链的第一位或最后一位添加，即在N或C末端添加一个半胱氨酸残基等。这种额外的氨基酸残基也可以包括用于多肽纯化或检测的一个“标记”，如与标记抗体相互作用的六组氨酸肽(His6)标记，或“myc”标记或“flag”标记。此外，其它本领域技术人员熟知的替代方式也包含在本发明中。
所述“额外的氨基酸残基”也可构成具有预期功能的一个或多个多肽结构域，如与第一个、HPV16 E5蛋白结合结构域相同的结合功能，或者其它结合功能，或是一种酶促功能，或是一种荧光功能，或是其组合。
本发明也包含在所述的HPV16 E5蛋白结合多肽基础上，经修饰进而增加其在碱性条件下的稳定性的多肽。这种稳定性包括用对于碱性条件较不敏感的氨基酸残基定点取代在没有修饰的序列中出现的任何天冬酞胺残基。由于在不同的反应之间亲和层析柱要经受频繁的强碱处理以进行洗脱，这种对碱降低敏感性的特性，有利于使用本发明的多肽作为亲和层析中的亲和配体，能够延长亲和层析基质的使用寿命。
本发明也包含在本发明的HPV16 E5蛋白结合多肽基础上，进行其它修饰后获得的多肽。这些修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明的HPV16 E5蛋白结合多肽可以与偶联物连接，从而构成功能性的靶向性分子，这种连接可通过化学键(包括肽键)相连或吸附；所述的化学键是共价键或非共价键。作为一种优选方式，通过肽键连接，从而形成融合多肽。所述的HPV16 E5蛋白结合多肽与偶联物之间可以直接相连接，或者通过多肽连接子(连接肽)连接。所述的连接子例如包括1-30个氨基酸；较佳地为1-20个氨基酸。连接肽的设置基本上不影响融合蛋白中各多肽的活性。较佳地，可以利用柔性肽(Gly4Ser)3进行连接。其它本领域技术人员熟知的连接肽也可应用于本发明。
在“异源”融合多肽中，所述HPV16 E5蛋白结合多肽构成了第一个结构域或第一个部分，第二和其它部分具有除了结合HPV16 E5蛋白外的其它功能，这些可预期的结果也在本发明的范围内。该融合多肽的第二和其它部分可能包含对除了HPV16 E5蛋白外的其它靶分子具有亲和力的结合结构域。这种结合结构域也可能与SPA结构域相关，但在1到大约20个位置具有取代突变。结果是融合多肽有至少一个HPV16 E5蛋白结合结构域和至少一个与所述其它靶分子具有亲和力的结构域。这扩展了本发明的多肽的应用，如作为治疗制剂或作为捕获、检测或分离试剂。
本发明融合多肽第二和其它部分的其它选择包括用于治疗性应用的一或多种部分。在治疗性应用中，其它分子也可以通过其它方法共价或非共价偶联到本发明的多肽上，如将改造的铜绿假单胞菌外毒素PE38KDEL或颗粒酶(GrB)等通过柔性肽连接于HPV16 E5蛋白结合多肽的C-末端，构成融合蛋白。非限制性例子包括用本发明多肽引导效应酶(例如羧肽酶)而进行“ADEPT"(抗体介导的酶前药治疗，antibody-directedenzymeprodrugtherapy)的酶；包括用以募集免疫系统的效应细胞和其它组分的蛋白质；包括细胞因子，如IL-2、IFNγ、IL-12、TNFα、IP10；包括促凝血因子，如组织因子、vonWillebrand因子；包括毒素，如蓖麻毒蛋白、calcheamicin、美登木素生物碱；包括毒性小分子，如auristatin类似物、阿霉素等。同时，为了更方便掺入放射性核素(如68Ga、76Br、111In、99Tc、124I、125I)用于诊断或放射性核素(如90Y、131I、211At)用于治疗，可以考虑上述列举的额外的氨基酸(特别是六组胺酸标记和半胱氨酸)，其目的是将放射性同位素的鳌合剂偶联到多肽序列。
本发明还涵盖了在所述的HPV16 E5蛋白结合多肽上连接一个可检测标记物(如荧光标记，生物素或放射性同位素)，从而可基于本发明的多肽的特异性，实现检测表达HPV16E5蛋白阳性肿瘤的目的。
本发明还提供了编码本发明的HPV16 E5蛋白结合多肽或靶向性分子或融合多肽的分离的核酸，也可以是其互补链。所述核酸可以全序列人工合成，也可用PCR扩增的方法分别获得。
本发明还提供了包含编码所述核酸分子的载体。所述的载体还可包含与所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，以便于所述融合蛋白的表达。如本文所用，“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制以编码序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。
在本发明中，任何合适的载体都可以使用，比如一些用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞的克隆和表达的载体，如Pouwels等，克隆载体：实验室手册中所描述的。
此外，含有所述核酸序列的重组细胞也包括在本发明中。术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌等；例如可为大肠杆菌细胞(E.coli)，如大肠杆菌HMS174(DE3)、或BL21(DE3)。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。
生产本发明的HPV16 E5蛋白结合多肽或靶向性分子或融合多肽的方法也已包括在本发明中。所述方法包括培养含有相应多肽的编码核酸的重组细胞，获得产物多肽。可将上述制备获得的多肽纯化为基本均一的性质，例如在SDS-PAGE电泳上呈单一条带。
基于要表达多肽的信息和目前重组表达蛋白质的技术水平，结合本发明揭示的内容，本领域技术人员易于制备本发明的多肽。例如，表达未被修饰的Z结构域的质粒可以用作起始材料。使用已知技术，所需的取代突变可以被引入这个质粒中以获得本发明的表达载体。
当使用化学多肽合成方法制备本发明的多肽或靶向性分子或融合蛋白时，上述多肽中的任何天然产生的氨基酸残基都可以被任何相应的、非天然产生的氨基酸残基或其衍生物所取代，只要产物多肽的功能基本不被损害。
本发明还涉及所述的HPV16 E5蛋白结合多肽或靶向性分子或融合多肽在不同方面的应用，包括应用于治疗、诊断和/或检测。
本发明的HPV16 E5蛋白结合多肽可作为HPV16 E5蛋白抗体在不同应用中的一种替代物。
作为非限制性的实例，其可用于治疗特征以HPV16 E5蛋白表达为特征的疾病，例如肿瘤(如鼻咽癌)等。通过结合胞内HPV16 E5蛋白以抑制细胞信号传导，用于相关疾病的体内和体外诊断。本发明的多肽可作为一种检测试剂、一种捕获试剂或者分离试剂，而且还可直接用作为一种治疗制剂或者将其它治疗制剂靶向HPV16 E5蛋白的手段。体外使用本发明的多肽的方法可以不同方式进行，如微量滴定板、蛋白阵列、生物传感器表面和组织切片等等。为了使本发明多肽适用于特异的用途，在不偏离本发明的范围的情况下，可以对本发明的多肽进行修饰和/或添加。
在下面详细描述了这些修饰和添加，其可能包括在同一多肽链中包含的额外的氨基酸，或者标记和/或治疗制剂，其化学修饰或以其它方式结合本发明的多肽。另外，本发明还涵盖了保留了结合HPV16 E5蛋白能力的该多肽的片段。
本发明多肽的HPV16 E5蛋白胞浆区结合特性以及用该多肽生产靶向性分子(包括融合蛋白)和/或标记的结合分子的稳定性意味着该多肽也可以用于将其它活性物质靶向肿瘤部位，这些肿瘤包括表达HPV16 E5蛋白的细胞。因此，本发明的另一方面是提供了本文所述的HPV16 E5蛋白结合多肽与一种具有抗癌活性的物质偶联的应用，以将所述物质运送到表达HPV16 E5蛋白的细胞，产生靶细胞的损伤或凋亡。
这种抗癌活性的物质可能是通过融合或通过化学键偶联到HPV16 E5蛋白结合多肽上的蛋白质，如选自用于“ADEPT”
(antibody-directedenzymeprodrugtherapy)应用的效应酶；用于募集免疫系统的效应细胞和其它组分的蛋白；细胞因子，如IL-2、IFNγ、IL-12、TNFαa、IP10等；促凝血因子，如组织因子、vonWillebrand因子等；毒素，如蓖麻毒蛋白、假单胞菌外毒素、calcheamicin、美登木素生物碱等。或者，所述活性物质也可能是细胞毒性药物，如auristatin类似物或阿霉素或放射性同位素(如90Y、131I、211At等)，这种同位素可与HPV16E5蛋白结合多肽直接结合，或通过一种鳌合剂，如熟知的鳌合剂DOTA或DTPA而与HPV16 E5蛋白结合多肽结合。
在相关方面，本发明还提供了一种在体内将具有抗癌活性的物质导向表达HPV16E5蛋白细胞的方法，包括施用给患者本文所述的所述活性物质与HPV16 E5蛋白结合多肽的偶联物。这种偶联物在前文已被适当描述。
本发明还包括使用所述的与HPV16 E5蛋白结合的多肽检测样品中的HPV16 E5蛋白。
例如，这种检测可以用来诊断特征为表达HPV16 E5蛋白的疾病情况。检测HPV16E5蛋白的存在可以在体内也可以在体外进行。体内诊断的优选选择是使用正电子放射X线断层摄影术，PET。被检测的样品可以例如是生物学液体样品或组织样品。现在的普遍方法是用针对与HPV16 E5蛋白的抗体，这种方法可以适用于本发明的与HPV16 E5蛋白结合多肽，这种方法是组织化学方法检测与HPV16 E5蛋白的存在，用来鉴定新鲜、冷冻或福尔马林固定、石蜡包埋的组织样品中与HPV16 E5蛋白的表达。
本发明的多肽也能用作融合蛋白的一部分，其中其它结构域是报告酶或荧光酶。或者，其也可以是被一个或多个荧光制剂和/或放射性同位素标记的，任选通过鳌合剂标记。合适的放射性同位素包括68Ga、76Br、111In、99Tc、124I和125I等。
本发明还包括将所述的HPV16 E5蛋白结合多肽应用于检测生物学液体样品中HPV16 E5蛋白。这个方法包括以下步骤：(1)提供被检测患者的生物学液体样品，(2)将本文所述的HPV16 E5蛋白结合多肽在能使所述多肽与样品中存在的任何HPV16 E5蛋白结合的条件下加入样品中，(3)除去非结合的多肽，及(4)检测结合的多肽。被检测到的结合的多肽的量与样品中存在的HPV16 E5蛋白量相关。在步骤(2)中，HPV16 E5蛋白结合多肽可以以任何适宜的形式加入到样品中，包括例如这样的情况，当HPV16 E5蛋白结合多肽被固定在一种固体支持物上，通过其使样品接触，或HPV16 E5蛋白结合多肽存在于溶液中。
所述的HPV16 E5蛋白结合多肽的其它应用还包括：检测样品中HPV16 E5蛋白的方法，包括如下步骤：(1)提供一种怀疑含有HPV16 E5蛋白的组织样品，例如冷冻切片或用福尔马林包埋的组织切片，(2)在适宜条件下加入本发明的HPV16 E5蛋白结合多肽到所述样品中，所述条件为益于所述多肽与样品中存在的任何HPV16 E5蛋白结合，(3)除去未结合的多肽，及(4)检测结合的多肽。检测到的结合的多肽的量与样品中存在的HPV16 E5蛋白的量相关。
本发明还提供了一个诊断组织样品中HPV16 E5蛋白表达的试剂盒，包括与报告酶(如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)融合的本发明的HPV16 E5蛋白结合多肽、检测酶活性的试剂，和/或阳性对照组织切片，和/或阴性对照组织切片。
本发明还提供了一个诊断组织样品中HPV16 E5蛋白表达的试剂盒，包括通过抗体检测的与标记(如flag标记或myc标记)融合的本发明的HPV16 E5蛋白结合多肽、一个特异于标记的一抗、特异于一抗并与报告酶偶联的二抗、检测酶活性的试剂，和/或阳性对照组织切片，和/或阴性对照组织切片。诊断应用的一个领域就是在体内检测癌细胞或其聚集物。本发明提供了一个进行这种诊断的试剂盒，该试剂盒包括标记有一个鳌合物的、本发明的HPV16 E5蛋白结合多肽、一种诊断用放射性同位素(非限制性的例子是68Ga、76Br、111In、99Tc、124I和125I等)，以及用于分析掺入效率的试剂。
如上所述，本发明涵盖了本发明的HPV16 E5蛋白结合多肽将活性物质靶向表达HPV16 E5蛋白的细胞如某些类型的癌症细胞的应用。本发明还提供了一个用于此目的的试剂盒，该试剂盒包括用一个鳌合物标记的本发明的HPV16 E5蛋白结合多肽、一个治疗性放射性同位素(非限制性的例子是90Y、131I、211At)，以及用于分析掺入效率的试剂。
本发明还提供一种药物组合物，其包含：有效量的本发明所述的对HPV16 E5蛋白特异性结合的多肽或靶向HPV16 E5蛋白的靶向性分子，和药学上可接受的载体。
如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’sPharmaceuticalSciences(MackPub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的载体的充分说明。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和山梨醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质和稳定剂，如白蛋白等。
可将所述的组合物制成各种适合于哺乳动物给药的剂型，所述剂型包括但不限于：注射剂、胶囊剂、片剂、乳剂、栓剂。
在使用时，是将安全有效量的本发明所述的对HPV16 E5蛋白特异性结合的多肽或靶向性分子施用于哺乳动物(如人)，其中该安全有效量通常至少约1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约1微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1、HPV16 E5蛋白结合多肽的文库构建及筛选研究
构建噬菌体展示HPV16 E5蛋白(HPV16 E5蛋白)结合多肽的随机组合文库，即许多不同的SPA结构域相关多肽的文库，从该文库中筛选HPV16 E5蛋白结合多肽，并对其亲和性进行了鉴定。
1、HPV16 E5蛋白结合多肽的随机组合噬菌体展示文库的构建和鉴定
根据野生型SPA-Z的氨基酸序列及结构(NilssonB等，ProteinEng.1987；1(2):107-113)，针对其三个螺旋结构区对应的编码序列设计随机引物，利用PCR方法扩增获得可导致随机氨基酸突变的SPA编码序列，命名为SPA。按分子克隆常规方法，通过SfiI和NotI位点将SPA编码序列克隆至pCANTAB5E载体构建pCANTAB5E/SPA重组质粒，转化至感受态E.coliTG1细胞中，涂布2YT-A平板，37℃培养过夜。即为初级库，标记为affibody初级库备用。随机挑取平板上长出的20个单克隆菌落，将提取质粒用SfiI和NotI双酶切鉴定为阳性克隆，经测序和分析其随机性。
结果：根据测序结果，送测序的20个克隆中有测序结果18个克隆，随机性完全不同，故重组率为18/20＝90％；多样性为18/18＝100％。取上述转化后培养的菌液，用2×YT培养液倍比稀释(1:10，1:102……)，涂布SOB-AG平板，计算平板上的单菌落数，推算库容。通过增加连接转化次数累计库容，多次连接转化后使克隆数达到2.4×106个Z蛋白变体(affibody分子)，其在第9、10、11、13、14、17、18、24、25、27、28、32、35具有随机的氨基酸残基。
2、HPV16 E5蛋白结合多肽的筛选和滴度测定
将纯化的HPV16 E5蛋白包被96孔酶标板，经封闭、加噬菌体文库(初级库)孵育、再加入E.coliTG137℃，轻摇温育；取100μl，用2*YT培养基做梯度倍比稀释，取稀释液100μl涂布SOB-AG平板，30℃过夜，计数结合噬菌体感染菌落数，计算HPV16 E5蛋白结合噬菌体滴度；用噬菌体文库(初级库)对靶蛋白EBVLMP1(187～386aa)重组蛋白进行三轮淘洗实验，菌液加1010辅助噬菌体M13KO7和卡那霉素培养过夜，离心后取上清经0.22μm滤膜过滤，获得HPV16 E5蛋白亲和筛选后的噬菌体文库，结果可见，第一轮淘洗后，在稀释105倍平板上可见几个单克隆菌落，在稀释106倍平板上未见单克隆菌落，说明经过第一轮淘洗滴度在1:105水平。第二轮淘洗后，在稀释105倍平板上可见单克隆，在稀释106倍平板上未见单克隆菌落，说明经过第二轮淘洗滴度依然在1:105水平。第三轮淘洗后，在稀释104倍平板可见数个单克隆，在稀释105倍平板未见单克隆菌落，说明经过第三轮淘洗滴度在1:104水平，且每一轮淘洗时噬菌体感染有效性均达到105水平以上。
3、HPV16 E5蛋白结合多肽单克隆噬菌体的制备及ELISA鉴定
ELISA用于筛选表达HPV16 E5蛋白结合affibody分子的噬菌体。蛋白包被缓冲液稀释EBVLMP1(187～386aa)重组蛋白至终浓度10μg/ml，100μl/孔包被96孔酶标板，4℃过夜；PBS洗涤，用3％脱脂奶粉封闭2h；洗涤，取三轮筛选后获得的噬菌体与等体积的3％脱脂奶粉混匀，100μl/孔，37℃，2h。洗涤，加入1:10000稀释的HRP/anti-M13酶标二抗(兔抗M13，Abcam#ab6188)，100μl/孔，37℃，1h；洗涤，加入OPD显色液200μl/孔，37℃，15min；2MH2SO450μl/孔，终止反应；置酶标仪(ELx800TM，BIO-TEK，Winooski，USA)读取OD450值。
在三轮淘选循环中选择结合抗原的affibody分子，经过这三轮选择循环，进一步用噬菌体ELISA检测以分析其与HPV16 E5蛋白结合活性，用高于0.5的A450的ELISA值为选择标准，鉴定编码HPV16 E5蛋白结合多肽的噬菌体，选择高于这个ELISA信号值的100个克隆进行DNA序列分析。
4、HPV16 E5蛋白亲和体分子的序列检测及筛选
共100个单克隆送中国上海生工公司测序。测序结果用DNASTAR软件分析对标准序列Zwt与SPA进一步分析其三个螺旋区的随机性和多样性。结果获49个完全正确克隆序列。
根据DNA测序结果进行分析，在上述测序正确的49个克隆中，选择与HPV16E5蛋白结合活性最强的3个单克隆噬菌体(即呈现HPV16 E5蛋白亲和体分子的单克隆噬菌体)的DNA序列(分别为ZEBVLMP1:85、ZEBVLMP1:1244、ZEBVLMP1:1259)作为靶目标进行研究，氨基酸序列为图1和序列表SEQIDNO:2、3、4所示，它们的编码序列如SEQIDNO:5、6、7。用于下一步用于HPV16 E5蛋白结合亲和体的分子克隆和表达及功能检测。
实施例2、HPV16 E5蛋白结合多肽重组质粒构建和原核蛋白表达及纯化
如前选择了具有较高ELISA读数的3个克隆(图1中的ZEBVLMP1:85、ZEBVLMP1:1244、ZEBVLMP1:1259)，及Zwt作为HPV16 E5蛋白结合多肽的阴性对照。为了对筛选的affibody分子进行功能检测，对其进行重组质粒构建、原核蛋白的表达及其鉴定，并制备纯化蛋白。
1.pET21a(+)/ZHPV16 E5的重组质粒构建和鉴定
由于上述噬菌体展示技术得到的单克隆affibody的序列位于pcantAB5E这个噬菌粒上，不能用于原核表达，所以本实验需要将affibody的序列从测序正确的单克隆中扩增出来，重新构建至原核表达载体pET21a(+)上，并在affibody的C端加上His-tag(用于纯化)才可以进行原核表达。理论上需要构建的重组质粒图(ZHPV16 E585、ZHPV16 E51244、ZHPV16 E51259重组质粒)，如图2所示，选用的酶切位点为NedI和Xhol两个酶切位点(NedI中含ATG起始密码子，可表达出只含His-tag的ZHPV16 E5蛋白)。用实验室前期设计的引物ozlf-384的序列如SEQIDNO:8所示，(gggAATTCCATATggTTgACAACAAATTCAACAAAgAA)及ozlf-385的序列如SEQIDNO:9所示，(CCgCTCgAgTTTCggAgCCTgAgCgTCg)从测序正确的单克隆中扩增出含酶切位点的目的片段，再通过酶切酶连构建至pET21a(+)载体上，形成新的重组质粒，并通过测序鉴定(如图3所示)。
2.pET21a(+)/ZHPV16 E5蛋白的原核表达和纯化
将重组质粒转化至大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中，37℃，培养16h；加0.8mM异丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)(默克公司，德国)IPTG诱导培养6h表达带有His标签的ZHPV16 E5及Zwtaffibody蛋白。经诱导后表达的重组蛋白，用镍螯合亲和层析胶体(Ni-NTAAgarose)(QIAGEN公司，美国)亲和层析法纯化并经SDS-PAGE分析鉴定。结果，利用分子生物学技术成功构建了pET21a(+)/ZHPV16 E5重组质粒，并采用原核表达系统制备了纯化的ZEBVLMP1:85、ZEBVLMP1:1244、ZEBVLMP1:1259及Zwtaffibody重组融合蛋白，经SDS-PAGE电泳分析证实，如图4a所示，转有重组质粒的菌株再10kD的marker以下有明显的很浓的条带，与预计的affibody的条带位置一致，则说明affibody蛋白诱导成功。
将细菌破碎，除去细菌碎片，将蛋白上清过柱，使带有His标签的affibody蛋白与镍柱结合后，用不同浓度的咪唑洗脱，将纯化后的蛋白处理后用SDS-PAGE凝胶鉴定其纯度，结果如图4b所示。可见在10kD蛋白marker以下有明显条带，与预计的affibody大小相一致，且条带较为单一，则说明蛋白纯化成功。
用Tris-Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳的方法进行实验，并在转膜后用戊二醛对蛋白进行固定。为了检测蛋白，一抗采用两种抗体，分别为His单抗以及实验室前期制备的affibody通用抗体Zwt鼠多克隆抗体进行孵育。实验结果如图5，从图中可以看出，在10kD以下位置有明显的单一条带，且两种抗体孵育的结果一致(其中两图中的4泳道均为Zwt，作为对照蛋白)则可以得出结论，纯化后的蛋白为目的蛋白。
实施例3、ZHPV16 E5affibody多肽与HPV16 E5蛋白重组蛋白的结合
为鉴定ZHPV16 E5蛋白affibody多肽与HPV16 E5蛋白重组蛋白结合的特异性，利用表面等离子共振技术(SPR)分析筛选的ZEBVLMP1:85、ZEBVLMP1:1244、ZEBVLMP1:1259及其对照Zwtaffibody与靶蛋白HPV16 E5蛋白重组蛋白结合的亲和力和特异性。
1.ZHPV16 E585、ZHPV16 E51244、ZHPV16 E51259在分子水平与HPV16 E5进行亲和力鉴定-酶连免疫吸附试验
1)如实施例2步骤制备affibody蛋白；
2)抗原包被：用包被缓冲液稀释多肽，终浓度20μg/mL包被酶标板，100μL/孔，每个样品3个副孔，放置于4℃冰箱包被过夜；
3)包被结束后弃包被液，1×PBST洗涤3次，每次3min，拍干；
4)3％脱脂牛奶封闭，100μL/孔，37℃静置1h；
5)封闭结束后取出，1×PBS洗涤3次，每次3min，拍干；
6)3％脱脂牛奶稀释原核表达制备得到的affibody蛋白(ZHPV16 E585、ZHPV16 E51244、ZHPV16 E51259、Zwt)，稀释浓度为200ng/uL、100ng/uL、50ng/uL、25ng/uL、5ng/uL、1ng/uL，设三个副孔，4℃孵育过夜；
7)1×PBST洗涤3次，每次3min，拍干；
8)3％脱脂牛奶稀释His单抗，稀释比例为1:5000，100μL/孔，37℃静置1h；
9)1×PBST洗涤3次，每次3min，拍干；
10)3％脱脂牛奶稀释Goat-anti mouse-HRP二抗，稀释比例为1:5000，100μL/孔，37℃静置1h；
11)1×PBST洗涤3次，每次3min，拍干；
12)避光加入TMB显色液，100μL/孔，37℃静置15-20min，避光加入终止液，10％H2SO4 50μL/孔；
13)酶标仪读取450nm-630nm处吸光值读数。
用ELISA的方法在分子水平上检测ZHPV16 E5蛋白与HPV16 E5的亲和性。从实验结果可知，随着ZHPV16 E5蛋白浓度的升高，在450nm波长的OD值越大，则说明ZHPV16 E5蛋白与HPV16E5的亲和性越高，而对照蛋白Zwt在450nm波长的OD值则变化不大且都很低，说明Zwt与HPV16 E5几乎没有亲和性(如图6a所示)。将ZHPV16 E5蛋白浓度稀释至200ng/μL时，在450nm波长的OD值Zwt<ZHPV16 E585<ZHPV16 E51244<ZHPV16 E51259，且通过统计学分析，每个ZHPV16 E5蛋白的OD值大小与Zwt相比均有统计学差异(如图6b)，说明ZHPV16 E5蛋白与HPV16 E5的亲和力大小为ZHPV16 E585<ZHPV16 E51244<ZHPV16 E51259。
实施例4、ZHPV16 E5affibody多肽与表达HPV16 E5蛋白细胞的结合
1.pcDNA3.1/HPV16 E5真核表达质粒的构建
通过PCR方法将HPV16 E5从siha细胞总DNA中扩增出，将空载pCDNA3.1用BamHI及Xhol酶切后，利用无缝克隆的方法将目的片段连接至线性载体上，构建出重组质粒pCDNA3.1/HPV16 E5(如图7a)，经测序，将测序结果(测序峰图如图7b)与理论序列比对，比对结果虽有碱基突变，但翻译后的氨基酸序列正确(如图7c)，说明pcDNA3.1/HPV16 E5真核表达质粒构建成功。
2.pLVX/HPV16 E5真核表达质粒的构建
通过PCR方法将HPV16 E5从构建好的pcDNA3.1/HPV16 E5重组质粒中扩增出，将空载pLVX用BamHI及AscI酶切后，利用无缝克隆的方法将目的片段连接至线性载体上，构建出重组质粒，经测序，将测序结果(测序峰图如图8)与理论序列比对，比对结果完全正确，说明pLVX/HPV16 E5真核表达质粒构建成功。
3.建立稳定表达HPV16 E5细胞株
1)建立稳定细胞株
A.细胞铺板：转染前24h，将培养好的TC-1细胞，消化后，计数。在六孔板中加入细胞(数量为覆盖六孔板80-90％)，将培养基补足至2mL，待细胞贴壁完全后进行细胞转染；
B.将构建好的pLVX/HPV16 E5及空载pLVX用限制性核酸内切酶FspI酶切线性化；
C.利用lipo2000将线性化质粒转染至TC-1细胞中：每孔转染1μg线性化质粒(pLVX/HPV16 E5及空载pLVX)，各重复3个孔；
D.转染48h后对孔板进行换液，换作含3μg/mL嘌呤霉素的完全培养基，使未转染成功的细胞被杀死；
E.每隔一天更换一次培养基，以除去未整合的细胞；
F.持续筛选两到三周后，将细胞扩大培养，冻存一部分，选剩下的一部分进行稀释，将细胞接种在96孔板中，进行单克隆筛选；
G.将筛选出的稳转细胞株用含有嘌呤霉素的完全培养基持续选择进行培养。
4.ZHPV16 E585、ZHPV16 E51244、ZHPV16 E51259在细胞水平与HPV16 E5进行亲和力鉴定-免疫荧光实验
将纯化的蛋白ZHPV16 E585、ZHPV16 E51244、ZHPV16 E51259以及对照蛋白Zwt孵育稳转细胞株TC-1-E5及对照稳转细胞株TC-1-NC，孵育6h，用His单抗标记ZHPV16 E5蛋白在细胞中位置，用HA抗体来标记细胞中表达的HPV16 E5的位置，然后用FITC(绿色荧光)标记His，用Cy3(红色荧光)标记HA，通过荧光的共定位来检测重组蛋白ZHPV16 E585、ZHPV16 E51244、ZHPV16  E51259与细胞内表达的HPV16 E5的靶向结合力。通过实验结果(如图9)可知在TC-1-E5细胞中既有绿色荧光团块聚集，也有红色荧光团块聚集，且从图中可以看出绿色和红色荧光团块几乎在同一位置的，而阴性细胞TC-1-NC中则无绿色及红色荧光团块的聚集，从中可以得出结论ZHPV16 E5蛋白在细胞内能与HPV16 E5特异性结合。
5.ZHPV16 E585、ZHPV16 E51244、ZHPV16 E51259在组织水平与组织细胞中天然的HPV16 E5进行亲和力鉴定-免疫组化实验
取人宫颈石蜡组织标本(宫颈癌2例，癌前病变15例，正常宫颈3例)切片，每例标本切6张，其中一张做HE染色，其余5张用于做组化。用于做组化的5张片子分别孵育ZHPV16 E585、ZHPV16 E51244、ZHPV16 E51259、PBS血清以及兔多克隆抗体，孵育PBS血清为阴性对照，孵育HPV16 E5兔血清为阳性对照。HE染色及组化完成后，组织切片用中性树脂封片，置于显微镜下观察，用200倍数进行拍摄，阳性结果为细胞胞核与胞浆均可见棕黄色沉淀，阴性结果为细胞胞核跟胞浆未见棕黄色沉淀(图10)，各ZHPV16 E5检测出的阳性结果如表1所示，ZHPV16  E51259检出阳性率与HPV16 E5兔血清阳性率一致，ZHPV16 E51244、ZHPV16 E585在癌症及正常宫颈标本中检出率与HPV16 E5兔血清一致。
表1 ZHPV16 E585、ZHPV16 E51244、ZHPV16 E51259对宫颈标本HPV16 E5阳性检出率
Figure BDA0002320335740000161
实施例5、ZHPV16 E5affibody多肽在荷瘤裸鼠中的生物分布和肿瘤靶向特性
1.动物肿瘤模型的制备
选择6-7周龄BALB/c-nu小鼠(购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证SCXK(沪)2012-0002)，体重为15-18g。将培养至对数生长期，生长状态良好将稳转细胞(TC-1-E5及TC-1-NC)进行接种消化后，用无血清的培养基重悬细胞，并将其细胞密度调整至2×107个/mL，将细胞悬液转移至1.5mL Ep管中，用锡箔纸包裹Ep管，经紫外照射后传递进SPF级屏障系统中。用一次性胰岛素注射器吸取100μL细胞悬液，在裸鼠右侧肩胛位置缓慢皮下注射，每种细胞注射12只裸鼠。每隔3天观察小鼠的精神状态、活动力、反应、饮食、体重及皮下接种区域外观及触感，并以电子游标卡尺测量瘤体大小直径。
结果显示，裸鼠皮下接种上述细胞均可见明显的肿瘤生长，接种裸鼠全部成瘤。2周后，肿瘤最大直径达到约200-300mm3时开始实验，从实验结果(如图11)可以看出，肿瘤第三天就有微小突起，随着时间的增长，在12d左右，裸鼠的肿瘤大小长至可以进行实验，小鼠的成瘤率为100％。从体重称量情况来看，接种肿瘤前，裸鼠体重增长迅速，接种肿瘤后体重增长变慢(如图12)，基本没什么变化。
TC-1-E5和TC-1-NC细胞荷瘤裸鼠肿瘤及各组织PCR及RT-PCR鉴定，结果如图13所示，在肿瘤组织的泳道在280bp位置可见单一的条带，而其它组织则没有。结果表明，构建的稳转细胞株在动物体内也稳定表达HPV16 E5。
1.Dlight755荧光标记ZHPV16 E5蛋白及荧光蛋白的鉴定
1)将购买的Dylight755荧光染料粉末12000rpm，4℃离心20min，蘸取一小部分于用锡箔纸避光的1.5mL Ep管中，加入1mL DMF溶液溶解染料。
2)配置500ng/μL ZHPV16 E5蛋白，每个重组蛋白取900μL置于锡箔纸避光的1.5mL Ep管中，再往里加入100μL溶解后的染料，轻轻吹打混匀，插于冰盒中，将冰盒置于4℃冰箱中偶联过夜；
3)将偶联后的蛋白(取名为Dy755-ZHPV16 E5)取出后，对其用3kD孔径大小的透析袋进行透析，具体方法同第三部分，以除去未偶联的荧光素。
4)取透析后的偶联蛋白10μL，按照第三部分进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，电泳过程中需要对电泳系统进行避光。
经15％SDS-PAGE凝胶电泳后，用成像系统进行标记蛋白的荧光成像检测验证，在约10kD位置出现单一荧光条带(图14b)，并将成像后的SDS-PAGE用考马斯亮蓝染色，通过凝胶成像系统检测在约10kD同一位置处出现蓝色结果(图14a)。结果表明，Dlight755荧光素标记ZHPV16 E5蛋白(Dy755-ZHPV16E5)成功。
2.Dy755-ZHPV16 E5蛋白在裸鼠体内荧光成像
1)裸鼠麻醉：将拿出屏障系统的小鼠称重，根据重量注射2.5％水合氯醛(10mL/Kg)；
2)待小鼠麻醉后，经尾静脉注射100μL偶联后的荧光重组蛋白(Dy755-ZHPV16 E585、Dy755-ZHPV16 E51244、Dy755-ZHPV16 E51259、Dy755-Zwt)，注射时注意避光；
3)打开近红外小动物活体成像仪，选择671-705nm激发光滤片，750nm发射光滤片，用810-830nm波长每隔10nm曝光2000ms扫描，分别在0min、5min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h、24h、48h、72h对注射了荧光重组蛋白的裸鼠进行拍摄，获得蛋白在裸鼠体内的分布情况的图像信息；
4)运用Cri Maestro 2.10近红外活体成像仪对图像信息进行数据量化，并用SPSS软件进行统计学分析。
将ZHPV16 E51259蛋白从尾静脉进行注射后在小鼠活体成像仪进行拍摄，结果注射后的5min、15min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h，其荧光分布见图15a，通过分析肾脏与皮肤荧光之间的信号强度比值(图15b)，尾静脉注射荧光重组蛋白，蛋白会在5min内迅速扩散到全身，然后向肾脏聚集，在6h时肾脏与皮肤荧光之间的信号强度比值达到高峰，之后通过尿液逐步排出体外，在48h时，从图中可以看到已经大体代谢完毕。
将Dy755-ZHPV16 E585、Dy755-ZHPV16 E51244、Dy755-ZHPV16 E51259、Dy755-Zwt蛋白从尾静脉进行注射后在小鼠活体成像仪进行拍摄，结果注射后的0h、5min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h，其荧光分布见图16a，通过分析肿瘤与皮肤荧光之间的信号强度比值(T/S)(图16b)，在TC-1-E5细胞荷瘤裸鼠模型中，Dy755-ZHPV16 E585荧光信号可维持6h，T/S值在4h时达到最高，然后开始下降；Dy755-ZHPV16 E51244荧光信号可维持4h，T/S值在2h时达到最高，然后开始下降；Dy755-ZHPV16 E51259荧光信号可维持6h，T/S值在2h时达到最高，然后开始下降；注射了Zwt的组别T/S值几乎没什么变化。在TC-1-NC细胞荷瘤裸鼠模型中，注射了Dy755-ZHPV16 E585、Dy755-ZHPV16 E51244、Dy755-ZHPV16E51259、Dy755-Zwt蛋白，T/S值均几乎没什么变化，Dy755-ZHPV16 E5蛋白在HPV16 E5阳性表达的肿瘤中聚集，则说明ZHPV16 E5蛋白对HPV16 E5具有靶向结合作用。
将注射Dy755-ZHPV16 E585、Dy755-ZHPV16 E51244、Dy755-ZHPV16 E51259的TC-1-E5细胞及TC-1-NC细胞的荷瘤裸鼠模型的T/S值与注射Dy755-Zwt蛋白进行统计学分析,结果如图16d。注射Dy755-ZHPV16 E585、Dy755-ZHPV16 E51244、Dy755-ZHPV16 E51259的TC-1-E5细胞的荷瘤裸鼠模型的T/S值与注射Dy755-Zwt蛋白的TC-1-E5细胞的荷瘤裸鼠模型的T/S值均有统计学差异，注射TC-1-NC细胞的荷瘤裸鼠模型则无统计学差异。
将注射同一Dy755-ZHPV16 E5蛋白4h后的TC-1-E5细胞及TC-1-NC细胞的荷瘤裸鼠模型的T/S值进行统计学分析(如图16c)，同一Dy755-ZHPV16 E5蛋白在两株细胞的荷瘤裸鼠模型的T/S值存在统计学差异。
                         序列表
<110>  温州医科大学
<120>  一种对HPV16 E5蛋白特异性结合的多肽及其应用
<160>  9
<170>  SIPOSequenceListing 1.0
<210>  1
<211>  58
<212>  PRT
<213>  Staphylococcus aureus
<220>
<221>  人工序列
<222>  (1)..(30)
<400>  1
Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1               5                   10                  15
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
            20                  25                  30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
        35                  40                  45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
    50                  55
<210>  2
<211>  58
<212>  PRT
<213>  人工序列()
<400>  2
Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Arg Leu Arg Ala Cys Ser Glu Ile
1               5                   10                  15
Arg Arg Leu Pro Asn Leu Asn Gly Asp Gln Ala His Ala Phe Ile Arg
            20                  25                  30
Ser Leu Ala Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
        35                  40                  45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
    50                  55
<210>  3
<211>  58
<212>  PRT
<213>  人工序列()
<400>  3
Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Ser Trp Ala Ala Ser Ala Glu Ile
1               5                   10                  15
Leu Gln Leu Pro Asn Leu Asn Ala Glu Gln His Ala Ala Phe Ile Leu
            20                  25                  30
Ser Leu Glu Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
        35                  40                  45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
    50                  55
<210>  4
<211>  58
<212>  PRT
<213>  人工序列()
<400>  4
Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Phe Ala Ser Ala Cys Thr Glu Ile
1               5                   10                  15
Pro Asn Leu Pro Asn Leu Asn Gly Ala Gln Arg Gln Ala Phe Ile Arg
            20                  25                  30
Ser Leu Gly Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
        35                  40                  45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
    50                  55
<210>  5
<211>  174
<212>  DNA
<213>  Staphylococcus aureus
<400>  5
gttgacaaca aattcaacaa agaacgcttg cgcgcttgca gcgaaatccg caggctgccg  60
aacctgaacg gagaccaggc gcacgctttc atccgatctc tggccgacga cccgtctcag 120
tctgctgagc tcctggctga agctaaaaaa ctgaacgacg ctcaggctcc gaaa       174
<210>  6
<211>  174
<212>  DNA
<213>  Staphylococcus aureus
<400>  6
gttgacaaca aattcaacaa agaaagctgg gccgcttccg ccgaaatctt gcagctgccg  60
aacctgaacg cagaacagca tgcagctttc atcctttctc tggaggacga cccgtctcag 120
tctgctgagc tcctggctga agctaaaaaa ctgaacgacg ctcaggctcc gaaa       174
<210>  7
<211>  174
<212>  DNA
<213>  Staphylococcus aureus
<400>  7
gttgacaaca aattcaacaa agaattcgcg tcggcttgct acgaaatccc gaacctgccg  60
aacctgaacg gtgctcagcg ccaggctttc atccgatctc tgggggacga cccgtctcag 120
tctgctgagc tcctggctga agctaaaaaa ctgaacgacg ctcaggctcc gaaa       174
<210>  8
<211>  38
<212>  DNA
<213>  Staphylococcus aureus
<400>  8
gggaattcca tatggttgac aacaaattca acaaagaa                          38
<210>  9
<211>  28
<212>  DNA
<213>  Staphylococcus aureus
<400>  9
ccgctcgagt ttcggagcct gagcgtcg                                     28

Claims (9)

1.一种对HPV16 E5蛋白特异性结合的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列选自：SEQ ID NO:2-4任一所示的序列。
2.一种靶向HPV16 E5蛋白的靶向性分子，其特征在于，所述的靶向性分子包括权利要求1中任一所述的多肽，以及与该多肽相连接的偶联物，所述的偶联物包括：半胱氨酸残基，多肽标签，可检测标记物，或抑制HPV16 E5蛋白的药物。
3.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1中任一所述的对HPV16 E5蛋白特异性结合的多肽，该多核苷酸序列如序列SEQ ID NO:5、6、7所示。
4.一种重组载体，其特征在于，该载体包含权利要求3所述的多核苷酸。
5.一种宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞包含权利要求4所述的重组载体,或其包含有基因组中整合有权利要求3所述的多核苷酸。
6.权利要求2任一所述的靶向HPV16病毒靶向性分子的用途，其特征在于，
所述偶联物是抑制HPV16 E5蛋白的药物，用于制备治疗HPV16病毒感染疾病或HPV16E5蛋白表达阳性肿瘤的药物；
或所述偶联物是多肽标签或可检测标记物，用于制备检测HPV16病毒感染的检测试剂或用于制备诊断HPV16病毒感染疾病或HPV16 E5蛋白表达阳性肿瘤的诊断试剂。
7.一种药物组合物，其特征在于，其包含：权利要求1任一所述的对HPV16 E5蛋白特异性结合的多肽或权利要求2所述的靶向HPV16 E5蛋白的靶向性分子；和药学上可接受的载体。
8.一种用于诊断HPV16病毒感染疾病或HPV16 E5蛋白表达阳性肿瘤的药盒，其特征在于，所述的药盒中包括：权利要求2中任一所述的靶向HPV16 E5蛋白的靶向性分子，所述靶向性分子为多肽标签或者可检测标记物，和检测多肽标签或者可检测标记物的检测试剂。
9.一种用于治疗HPV16病毒感染疾病或HPV16 E5蛋白表达阳性肿瘤的药盒，其特征在于，所述的药盒中包括：权利要求1中任一所述的对HPV16 E5蛋白特异性结合的多肽，或权利要求2中任一所述的靶向HPV16 E5蛋白的靶向性分子，或权利要求7所述的药物组合。
CN201911298557.7A 2019-12-16 2019-12-16 一种对hpv16 e5蛋白特异性结合的多肽及其应用 Active CN111153967B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911298557.7A CN111153967B (zh) 2019-12-16 2019-12-16 一种对hpv16 e5蛋白特异性结合的多肽及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911298557.7A CN111153967B (zh) 2019-12-16 2019-12-16 一种对hpv16 e5蛋白特异性结合的多肽及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111153967A CN111153967A (zh) 2020-05-15
CN111153967B true CN111153967B (zh) 2023-04-07

Family

ID=70557354

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911298557.7A Active CN111153967B (zh) 2019-12-16 2019-12-16 一种对hpv16 e5蛋白特异性结合的多肽及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111153967B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113173978B (zh) * 2021-04-22 2024-03-01 温州医科大学 一种对hpv16e6蛋白具有结合亲和力的多肽及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1297944A (zh) * 1999-11-24 2001-06-06 上海生元基因开发有限公司 一种钙结合/肌动蛋白交联蛋白及编码它的多核苷酸序列
US7026443B1 (en) * 1999-12-10 2006-04-11 Epimmune Inc. Inducing cellular immune responses to human Papillomavirus using peptide and nucleic acid compositions
CN110128513A (zh) * 2019-03-22 2019-08-16 温州医科大学 一种对eb病毒lmp2蛋白c端胞膜外区具有结合亲和力的多肽及其应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2883550A1 (en) * 2013-12-12 2015-06-17 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des Öffentlichen Rechts Novel promiscuous HPV16-derived T helper epitopes for immunotherapy

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1297944A (zh) * 1999-11-24 2001-06-06 上海生元基因开发有限公司 一种钙结合/肌动蛋白交联蛋白及编码它的多核苷酸序列
US7026443B1 (en) * 1999-12-10 2006-04-11 Epimmune Inc. Inducing cellular immune responses to human Papillomavirus using peptide and nucleic acid compositions
CN110128513A (zh) * 2019-03-22 2019-08-16 温州医科大学 一种对eb病毒lmp2蛋白c端胞膜外区具有结合亲和力的多肽及其应用
CN110144003A (zh) * 2019-03-22 2019-08-20 温州医科大学 一种对eb病毒lmp2a蛋白n端胞浆区特异性结合的多肽及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN111153967A (zh) 2020-05-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11466085B2 (en) Anti-PD-L1 nanobody, coding sequence and use thereof
Löfblom et al. Affibody molecules: engineered proteins for therapeutic, diagnostic and biotechnological applications
US20190322747A1 (en) Anti-pd-1 nano-antibody and application thereof
EP1024835B1 (en) J-chain and analogues as epithelial cell targeting conjugates
CN110835371A (zh) 抗ccr8单克隆抗体及其应用
US20020048777A1 (en) Method of diagnosing monitoring, staging, imaging and treating prostate cancer
JP2015193653A (ja) プロタンパク質およびその使用方法
CN109485726B (zh) 放射性标记抗纳米抗体在癌症的预后、诊断中的应用
CN110144003B (zh) 一种对eb病毒lmp2a蛋白n端胞浆区特异性结合的多肽及其应用
CN114106190A (zh) 一种抗vegf/pd-l1双特异性抗体及其用途
WO2011071279A2 (ko) Bpb-기반 카르고 운반 시스템
CN110330551B (zh) 一种胰腺癌特异结合肽及其制备方法与用途
JPH04504713A (ja) 共役ポリペプチドとその調製および使用方法
CN105859846B (zh) 对hpv16 e7具有结合亲和力的多肽及其用途
CN111153967B (zh) 一种对hpv16 e5蛋白特异性结合的多肽及其应用
CN105820219B (zh) 对hpv18 e7蛋白具有结合亲和力的多肽及其应用
WO2022011717A1 (zh) 针对新型冠状病毒的纳米抗体及其应用
WO2018059117A1 (zh) 一种用于检测病理组织切片中癌蛋白表达的单克隆抗体
CN110642928B (zh) 一种对eb病毒lmp1c端蛋白特异性结合的多肽及其应用
CN111978379B (zh) 一种对人黑色素瘤抗原a3蛋白具有结合亲和力的多肽及其用途
CN107987168B (zh) 一种抗vegf和egfr的单链双特异的抗体及其应用
CN113173978B (zh) 一种对hpv16e6蛋白具有结合亲和力的多肽及其应用
CN109593131B (zh) 一种抗14-3-3η蛋白单克隆抗体及其用途
CN113461825A (zh) 一种抗pd-l2纳米抗体及其应用
CN108129564B (zh) 一种全人源的抗vegf单链抗体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant