CN107090019B - 人类免疫缺陷病毒重组蛋白 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种人类免疫缺陷病毒重组蛋白。本申请的人类免疫缺陷病毒重组蛋白其包含与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少85％的序列同一性的多肽，其中所述多肽包括与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列第53、85、98、105、109、111、132和133的八个位点相对应位点的氨基酸置换，优选的，所述多肽进一步包括与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列第106、120和139三个位点中的一个或多个相对应位点的氨基酸置换。本申请还涉及所述人类免疫缺陷病毒重组蛋白质的制备和用途。本申请的人类免疫缺陷病毒重组蛋白质能够应用于人类免疫缺陷病毒(HIV)的抗体检测，具有活性高、检出率高、特异性好等特点。

Description

人类免疫缺陷病毒重组蛋白
技术领域
本发明涉及生物技术和医学领域，特别涉及人类免疫缺陷病毒(HIV)重组蛋白的生产和应用的生物技术和医学免疫诊断领域。
背景技术
人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)引起的艾滋病在20世纪80年代发现以来，已传遍全球。据联合国艾滋病总署报告，截止2010年底，全球感染艾滋病人数达3700万。我国目前大约有HIV感染者70余万。HIV会破坏人体的免疫能力，导致免疫系统市区抵抗力，从而导致各种疾病和癌症在人体内生存，发展到最后导致艾滋病。迄今为止尚无有效药物及疫苗来治疗和预防艾滋病，因而HIV感染已成为当今全球威胁最严重的传染病及公共卫生问题。
HIV病毒是带有包膜的RNA逆转录病毒，其单拷贝基因RNA全长约9.2-9.7Kb。HIV有三个主要结构基因：env、gag、pol，它们分别编码产生不同功能的蛋白质即抗原。HIV侵入机体后，一般在6周左右产生抗体。血清中首先出现的是HIV前体P55抗体和核心蛋白P24抗体；然后出现外包膜蛋白GP120抗体和跨膜糖蛋白gp41抗体。目前发现HIV有HIV-1、HIV-2、O型等，这几种类型在生物学特性上很相似，它们基因组有40％-50％的同源性。目前，我国流行的主要是HIV-1型。
由于HIV抗原和核酸检测所使用的仪器、试剂、人力成本过高，占据HIV检测市场主流的还是HIV抗体检测。目前，HIV抗体检测原料一方面朝着提高灵敏度和特异性，缩短窗口期的方向发展，另一方面朝着简便快速的方向发展。为了顺应以上发展趋势，本发明公开了一种可以应用于HIV-1抗体检测的HIV-1重组蛋白。
发明内容
在一些实施方案中，本文提供一种人类免疫缺陷病毒重组蛋白质，其包含与SEQID NO：1所示的氨基酸序列具有至少94％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，84％，83％，82％，81％，80％，75％，70％，65％，60％，55％，或50％的序列同一性的多肽，
SEQ ID NO：1：
其中所述多肽与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列第53、85、98、105、109、111、132和133的八个位点的氨基酸K，K，R，N，S，Q，E和S相对应的氨基酸分别置换为下述氨基酸：
酸性脂肪族氨基酸E或Q，
酸性脂肪族氨基酸E或D或Q，
K，
芳香族氨基酸F或Y，
R或T，
中性氨基酸L或I，
碱性带正电荷的R基氨基酸K或R或H，和
非羟基氨基酸V或N。
在一些实施方案中，所述人类免疫缺陷病毒重组蛋白质能够特异性结合HIV的抗体(例如HIV感染者如HIV-1感染者产生的HIV抗体)。在一些实施方案中，所述人类免疫缺陷病毒重组蛋白质能够用于诊断受试者是否感染HIV如HIV-1。
在一些实施方案中，所述多肽进一步包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列第106、120和139位点中的一个或多个氨基酸置换，其中所述置换选自T106E、R120K和N139D，其中中间的数字106、120、139表示位置，数字前面的氨基酸表示原SEQ ID NO：1中的氨基酸，数字后的氨基酸表示置换后的氨基酸(本说明书其它部分进行此类描述表示同样的含义)。在一些实施方案中，所述多肽在上述第53、85、98、105、109、111、132和133的八个位点的氨基酸置换之外，进一步包含T106E。在一些实施方案中，所述多肽在上述第53、85、98、105、109、111、132和133的八个位点的氨基酸置换之外，进一步包含R120K。在一些实施方案中，所述多肽在上述第53、85、98、105、109、111、132和133的八个位点的氨基酸置换之外，进一步包含N139D。在一些实施方案中，所述多肽在上述第53、85、98、105、109、111、132和133的八个位点的氨基酸置换之外，进一步包含T106E和R120K。在一些实施方案中，所述多肽在上述第53、85、98、105、109、111、132和133的八个位点的氨基酸置换之外，进一步包含T106E和N139D。在一些实施方案中，所述多肽在上述第53、85、98、105、109、111、132和133的八个位点的氨基酸置换之外，进一步包含R120K和N139D。在一些实施方案中，所述多肽在上述第53、85、98、105、109、111、132和133的八个位点的氨基酸置换之外，进一步包含T106E、R120K和N139D。
在一些实施方案中，进一步包含上述置换的所述人类免疫缺陷病毒重组蛋白质能够特异性结合HIV的抗体(例如HIV感染者如HIV-1感染者产生的HIV抗体)。在一些实施方案中，所述人类免疫缺陷病毒重组蛋白质能够优选的以更高的灵敏度用于诊断受试者是否感染HIV如HIV-1。
在一些实施方案中，所述的人类免疫缺陷病毒重组蛋白质与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％或至少94％的序列同一性，例如其与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的区别仅在于所述八个位点的氨基酸不同，例如其与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的区别仅在于第53、85、98、105、109、111、132、133位点和选自第106、120和139位点三个位点中的任意一个或多个位点的氨基酸不同(即仅存在九、十或十一个位点的不同)。
在一些实施方案中，本文提供一种核酸，其编码本文描述的人类免疫缺陷病毒重组蛋白质。
在一些实施方案中，本文提供一种载体，其包含本文描述的核酸。
在一些实施方案中，本文提供一种宿主细胞，其包含本文描述的核酸或的载体。
在一些实施方案中，本文提供一种试剂盒，其包含本文描述的人类免疫缺陷病毒重组蛋白质，本文描述的核酸或本文描述的载体。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包括用于标记所述人类免疫缺陷病毒重组蛋白质的标记，如酶标记、胶体金标记等。
在一些实施方案中，本文提供一种生产本文描述的人类免疫缺陷病毒重组蛋白质的方法，其包括制备本文描述的核酸或本文描述的载体的步骤。
在一些实施方案中，本文提供一种组合物，其包含本文描述的人类免疫缺陷病毒重组蛋白质。
在一些实施方案中，本文提供本文描述的人类免疫缺陷病毒重组蛋白质在制备用于检测人类免疫缺陷病毒感染的检测剂或试剂盒中的用途。
在一些实施方案中，本文提供包含来自如下序列的部分或全部的至少30个连续氨基酸的多肽：
SEQ ID No：2：
其中第n位的Xaa以Xn表示，其中
X53是K，E或Q，优选是E或Q，
X85是K，E或D或Q，优选是E或D或Q，
X98是R，K，优选是K，
X105是N，F或Y，优选是F或Y，
X106是T，E，优选是E，
X109是S，R或T，优选是R或T，
X111是Q，L或I，优选是L或I，
X120是R，K，优选是K，
X132是E，K或R或H，优选是K或R或H，
X133是S，V或N，优选是V或N，
X139是N，D，优选是D。
在一些实施方案中，本文提供的所述多肽的序列包括SEQ ID NO：2所示的序列，同时所述多肽相对于SEQ ID NO：1所示序列存在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11个氨基酸置换。
在一些实施方案中，在SEQ ID NO：2所示序列中：
X53是E或Q，
X85是E或D或Q，
X98是R，
X105是F或Y，
X106是T，
X109是R，
X111是L或I，
X120是R，
X132是K或R或H，
X133是V或N，
X139是N，
其余位置的氨基酸如上文所述。
在一些实施方案中，在SEQ ID NO：2所示序列中：
X53是E或Q，
X85是E或D或Q，
X98是R或K，
X105是F或Y，
X106是T或E，
X109是R或T，
X111是L或I，
X120是R或K，
X132是K或R或H，
X133是V或N，
X139是N或D，
其余位置的氨基酸如上文所述。
在一些实施方案中，所述多肽或人类免疫缺陷病毒重组蛋白质能够特异性结合HIV的抗体(例如HIV感染者如HIV-1感染者产生的HIV抗体)。在一些实施方案中，所述人类免疫缺陷病毒重组蛋白质能够用于诊断受试者是否感染HIV如HIV-1。
在一些实施方案中，在SEQ ID NO：2所示序列中：
X53是E或Q，
X85是E或D或Q，
X98是K，
X105是F或Y，
X106是E，
X109是T，
X111是L或I，
X120是K，
X132是K或R或H，
X133是V或N，
X139是D，
其余位置的氨基酸如上文所述。
在一些实施方案中，人类免疫缺陷病毒重组蛋白质包含上述SEQ ID NO：2部分或全部的至少30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130个连续氨基酸的多肽。在一些实施方案中，人类免疫缺陷病毒重组蛋白质包含上述SEQ ID NO：2全长的多肽。在一些实施方案中，人类免疫缺陷病毒重组蛋白质由上述SEQ ID NO：2全长的多肽组成。
在一些实施方案中，上述人类免疫缺陷病毒重组蛋白质能够特异性结合HIV的抗体(例如HIV感染者如HIV-1感染者产生的HIV抗体)。在一些实施方案中，上述人类免疫缺陷病毒重组蛋白质能够优选的以更高的灵敏度用于诊断受试者是否感染HIV如HIV-1。
在一些实施方案中，本文提供一种人类免疫缺陷病毒重组蛋白质，其特征在于该重组蛋白质含有下述的一种序列X1-X2-X3……X139-X140-X141(SEQ ID NO：1)，其中：
K，X53是E或Q；
K，X85是E或D或Q；
R，X98是K；
N，X105是F或Y；
T，X106是T或E；
S，X109是R或T；
Q，X111是L或I；
R，X120是K；
E，X132是K或R或H；
S，X133是V或N；和/或
N，X139是D；
在一些实施方案中，本文提供一种载体如质粒载体，该质粒载体含有能够编码与本文描述的序列具有90％同源性的重组蛋白的多核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文提供一种载体如质粒载体，该质粒载体含有能够编码本文描述的重组蛋白质的多核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文提供一种采用本文描述的载体转化的宿主细胞。
在一些实施方案中，本文提供一种本文描述的重组蛋白质的方法，包括：
(a)将编码具有所述重组蛋白质的多核苷酸序列连于载体如质粒载体，形成重组质粒；
(b)将步骤(a)中的重组质粒转入宿主细胞，形成转化子细胞；
(c)在适合的条件下，培养步骤(b)中的转化子细胞，表达该重组蛋白质；
(d)分离纯化出该重组蛋白质。
在一些实施方案中，本文提供包括所述人类免疫缺陷病毒重组蛋白质的制品，如微量滴定板(其上可以包被有所述人类免疫缺陷病毒重组蛋白质)。
在一些实施方案中，本文提供含有本文描述的重组蛋白质的HIV抗体检测试剂盒。
在一些实施方案中，所述检测试剂盒可以包括例如上述微量滴定板。在一些实施方案中，所述试剂盒中还可以包括容器，其中包含例如对HIV抗体具有亲和力的第二抗体。
在一些实施方案中，本文提供的人类免疫缺陷病毒重组蛋白，能够特异性结合早期HIV抗体。在一些实施方案中，本文提供的人类免疫缺陷病毒重组蛋白质能够用于检测HIV-1的抗体。在一些实施方案中，本文提供的人类免疫缺陷病毒重组蛋白用于检测HIV-1的抗体具有活性高，特异性好等特点。
在一些实施方案中，本文提供检测如早期检测HIV感染的方法，所述方法包括将来自受试者的样品如血液样品与本文提供的人类免疫缺陷病毒重组蛋白质接触，由此确定是否感染HIV。
在一些实施方案中，本文提供人类免疫缺陷病毒重组蛋白质，其用于检测如早期检测HIV感染，或用于筛选HIV感染的患者。
发明人已经令人吃惊的发现本文提供的序列与不具有所述一个或多个突变(例如不具有第53、85、98、105、109、111、132、133、106、120和139位点中的一个或多个位点的突变)的对照序列相比具有更好的效果，例如提高的灵敏度和/或特异性。在一些实施方案中，本文提供的重组蛋白、检测试剂盒或检测方法在检测如早期检测HIV感染或筛选HIV感染的患者时具有提高的灵敏度和/或特异性。在一些实施方案中，本文提供的重组蛋白、检测试剂盒或检测方法具有大于99％、大于99.1％、大于99.2％、大于99.3％、大于99.4％、大于99.5％、大于99.6％、大于99.7％、大于99.8％、大于99.9％的灵敏度。在一些实施方案中，本文提供的重组蛋白、检测试剂盒或检测方法具有99.5％以上、99.6％以上、大于99.7以上、大于99.8以上、大于99.9以上或具有100％的灵敏度。在一些实施方案中，本文提供的重组蛋白、检测试剂盒或检测方法具有大于99.4％(如99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上或更高)的特异性。
在一些实施方案中，本文提供获得或设计用于检测HIV的重组蛋白的方法，所述方法可以包括以下步骤中的一个或多个：
选取人类免疫缺陷病毒包膜蛋白，选取蛋白的部分区段，并对其中部分位点做突变设计，通过表达纯化制备相应的重组蛋白，通过活性及特异性筛选，获得活性高，特异性好的重组蛋白；
合成序列片段，并连接到载体如pMD18-T载体上，构建含有目的片段的T载体；
通过定点突变设计，构建含有特定突变目的片段的载体如pMD18-T载体；
重组蛋白的制备方法：设计上游引物(例如带EcoR I酶切位点)和下游引物(例如带BamH I酶切位点)，以含有目的片段的载体如T载体为模板，扩增目的基因，双酶切并纯化后连接到载体如pET-28a上，转化细胞如大肠杆菌BL21；筛选得到阳性克隆后，挑取单菌落接种到培养基如含50ul/ml Kan的LB培养基中，在适当温度如37度震荡培养；待OD600达到0.6-0.8后，加入1.0mM IPTG，37度诱导培养2-4h，提取总蛋白，SDS-PAGE鉴定重组蛋白表达情况；用NI离子螯合柱对目的蛋白进行第一次纯化，用SP柱对目的蛋白进行第二次纯化，SDS-PAGE鉴定重组蛋白的纯度。
通过本文描述的方法可以获得高纯度的重组蛋白，其能够用于HIV-1的抗体检测。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明，所描述的各个具体实施方式不是限制性的，并且可以相互组合。
氨基酸、肽、多肽、蛋白质
术语“氨基酸”表示天然存在或非天然存在的羧基α-氨基酸。术语“氨基酸”用在本申请中可以包括天然存在的氨基酸和非天然存在的氨基酸。天然存在的氨基酸包括丙氨酸(三字母密码：Ala，单字母密码：A)，精氨酸(Arg，R)，天冬酰胺(Asn，N)，天冬氨酸(Asp，D)，半胱氨酸(Cys，C)，谷氨酰胺(Gln，Q)，谷氨酸(Glu，E)，甘氨酸(Gly，G)，组氨酸(His，H)，异亮氨酸(Ile，I)，亮氨酸(Leu，L)，赖氨酸(Lys，K)，甲硫氨酸(Met，M)，苯丙氨酸(Phe，F)，脯氨酸(Pro，P)，丝氨酸(Ser，S)，苏氨酸(Thr，T)，色氨酸(Trp，W)，酪氨酸(Tyr，Y)，和缬氨酸(Val，V)。非天然存在的氨基酸包括但不限于α-氨基己二酸，氨基丁酸，瓜氨酸，高瓜氨酸，高亮氨酸，高精氨酸，羟基脯氨酸，正亮氨酸，吡啶基丙氨酸，肌氨酸等等。
在本文中，肽、多肽、蛋白质不作严格区分，在一些情形中可以相互替代使用，一般指通过肽键连接的氨基酸组成的聚合物，不管是天然产生的还是合成的。多肽也可以包含非氨基酸成分，如碳水化合物基团、金属离子或羧酸酯。非氨基酸成分可以是由表达所述多肽的细胞所加入的，并且可以随细胞类型而不同。多肽在本文中关于其氨基酸骨架结构或编码其的核酸而限定。如碳水化合物基团的添加通常没有规定，但是，是可以存在的。所有的多肽序列按照通常接受的惯例书写，其中α-N-端氨基酸残基在左侧，且α-C-端氨基酸残基在右侧。当用于本文时，术语“N-端”是指多肽中氨基酸的游离的α-氨基基团，术语“C-端”是指多肽中氨基酸的游离的a-羧酸端。在N-端以某基团结束的多肽是指在N-端氨基酸残基的α-氨基氮上携带基团的多肽。在N-端以某基团结束的氨基酸是指在α-氨基氮上携带基团的氨基酸。
“保守”氨基酸置换是其中氨基酸残基被带有具有相似理化性质的侧链的氨基酸残基置换的那些置换。具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域中是已知的，并且包括带有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，带有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，带有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，带有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，带有β分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和带有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。保守氨基酸置换的特殊形式包括用不在由遗传密码编码的正常的20个氨基酸中的氨基酸置换的那些。本发明的实施方案可以使用合成肽，因此在本文公开的肽中可以使用这种“非天然存在的”氨基酸残基，并且可以将氨基酸残基侧链中的天然饱和碳链交换为更短或更长的饱和碳链。
在一些实施方案中，尤其优选的相似性质的氨基酸置换包括例如将X53位的氨基酸由碱性脂肪族氨基酸K突变为酸性脂肪族氨基酸E或Q，将X85位的氨基酸由碱性脂肪族氨基酸K突变为脂肪族氨基酸E或D或Q，将X105位的氨基酸由酸性脂肪族氨基酸N突变为芳香族氨基酸F或Y，将X109位氨基酸由S突变为R，将X111位氨基酸由酸性脂肪族氨基酸Q突变为中性氨基酸L或I，将X132位氨基酸由酸性脂肪族氨基酸E突变为碱性带正电荷的R基氨基酸K或R或H，将X133位氨基酸由带羟基氨基酸S突变为非羟基氨基酸V或N。
在两个氨基酸序列的情形中，在最优化比对时，如通过程序GAP或BESTFIT使用默认缺口权重比对时，本发明的序列与SEQ ID NO：1所示的序列享有至少约94％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，84％，83％，82％，81％，80％，75％，70％，65％，60％，55％，或50％的序列同一性。在一些实施方案中，本发明的序列与SEQ ID NO：2所示的任一序列享有至少99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，84％，83％，82％，81％，80％，75％，70％，65％，60％，55％，或50％的序列同一性。在一些实施方案中，本发明的人类免疫缺陷病毒重组蛋白质包括SEQ ID NO：2所示的任一多肽或由其组成。在一些实施方案中，不相同的残基位置差别在于保守氨基酸置换。如本领域技术人员已知的，可以用序列分析软件测量序列同一性。例如，公共可用的GCG软件包含程序如“Gap”和“BestFit”，可以以默认参数使用所述软件来确定紧密相关的多肽之间或野生型蛋白质与其突变蛋白质之间的序列同源性或序列同一性。也可以使用FASTA或ClustalW，使用默认或推荐参数比较多肽序列。GCG版本6.1.中的程序，FASTA(例如，FASTA2和FASTA3)给出查询和检索序列之间的最佳重叠区域的比对和百分比序列同一性。另一种算法是使用默认参数的计算机程序BLAST，尤其是blastp。
本发明提供了人类免疫缺陷病毒重组蛋白质、生产人类免疫缺陷病毒重组蛋白质、片段和衍生物的方法。所述人类免疫缺陷病毒重组蛋白质如本文其它部分所详细描述。在一些实施方案中，本发明包含一种具有序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的人类免疫缺陷病毒重组蛋白质。本发明也包括人类免疫缺陷病毒重组蛋白质的“功能性衍生物”。“功能性衍生物”是指氨基酸替换的变体，一个功能性衍生物保留有可检测的人类免疫缺陷病毒重组蛋白质活性，优选为能结合HIV的抗体的活性。“功能性衍生物”可以包含“变体”和“片段”。因此，在一些实施方案中，本申请提供人类免疫缺陷病毒重组蛋白质，其包括的多肽与SEQ ID NO：1或2的任一氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高的同一性的氨基酸序列或者由其组成。
在一些实施方案中，本文提供生产人类免疫缺陷病毒重组蛋白质、片段和衍生物的方法。所述方法可以是例如，用编码至少一部分人类免疫缺陷病毒重组蛋白质的核酸载体转染宿主细胞，在合适的条件下培养该宿主细胞使其表达人类免疫缺陷病毒重组蛋白质。宿主细胞也可以用一个或多个表达载体转染，该表达载体可以单独或结合地包含编码至少一部分人类免疫缺陷病毒重组蛋白质的DNA。利用常规的纯化蛋白质和肽的技术可从培养基或细胞裂解物中分离人类免疫缺陷病毒重组蛋白质，所述技术包括硫酸铵沉淀，层析(如离子交换，凝胶过滤，亲合层析等)和/或电泳。
构建合适的含有目的编码和调控序列的载体可以使用本领域公知的标准连接和限制技术进行。将分离的质粒、DNA序列或合成的寡核苷酸按需要的形式切割、加尾和再连接。可以用任何方法向编码序列中引入突变以产生本发明的变体，这些突变可以包含缺失或插入或置换等。
本发明也提供抗体，包含单克隆的和多克隆的抗体，该抗体能与HIV的的表位发生反应，所述抗体可以使用本发明的人类免疫缺陷病毒重组蛋白质制备。免疫原可以含有完整的人类免疫缺陷病毒重组蛋白质，或其片段或衍生物。优选的免疫原含有全部或部分的人类免疫缺陷病毒重组蛋白质。可以用常规的杂交瘤技术用上述免疫原免疫动物如鼠，以在被免疫的动物中产生所需的抗体。
本文中的术语“抗体”在最广义上使用并且特定地包括全长单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体，以及抗体片段，只要他们展示所需的生物学活性。抗体可以是完全的人抗体、人源化抗体或嵌合抗体，或其衍生物。“抗体片段”包括全长抗体的部分，优选地其抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab)2、F(ab’)2、F(ab)3、Fv、单链Fv(scFv)、dsFv、Fd片段，和dAb片段；VH、VL、VhH和V-NAR结构域；微型抗体、双链抗体、三链抗体、四链抗体；和由抗体片段、和一个或多个分离的CDR或功能互补位形成的多特异性抗体片段，其中分离的CDR或抗原结合残基或多肽可以结合或连接在一起，以致形成功能抗体片段。
在一些实施方案中，本发明包括含有编码人类免疫缺陷病毒重组蛋白质的核酸序列。在本文中，核酸序列包含其保守置换的变体(例如简并密码子的置换)和互补序列。术语“核酸”和“多核苷酸”是同义的，包含基因、cDNA分子、mRNA分子以及它们的片段例如寡核苷酸。
在一些实施方案中，本发明包括含有编码人类免疫缺陷病毒重组蛋白质的核酸序列的表达载体，其中的核酸序列与至少一种调节序列可操作连接。“可操作连接”指的是编码序列以允许编码序列的表达的方式与调节序列连接。调节序列选择用来在合适的宿主细胞中指导目的蛋白质的表达，包含启动子、增强子和其它的表达调控元件。
在本文中，载体可以指包含本发明的核酸或其片段的、能够携带遗传信息并且可以将遗传信息递送到细胞中的分子或试剂。典型的载体包括质粒、病毒、噬菌体、黏粒和微型染色体。载体可以是克隆载体(即用于将遗传信息转移到细胞中的载体，可以繁殖所述细胞并且可以选择存在或不存在所述遗传信息的所述细胞)或表达载体(即包含必要的遗传元件从而允许所述载体的遗传信息在细胞中表达的载体)。因此，克隆载体可以包含选择标记，以及与所述克隆载体所指定的细胞类型相匹配的复制起点，而表达载体则包含对于影响指定靶细胞中的表达必要的调节元件。
本发明的核酸或其片段可以插入到合适的载体中以形成携带本发明核酸片段的克隆载体或表达载体。这种新载体也是本发明的一部分。所述载体可以包括质粒、噬菌体、黏粒、微型染色体或病毒，也包括只在特定细胞中瞬时表达的裸DNA。本发明克隆载体和表达载体能够自发的复制，因此能够为用于随后克隆的高水平表达或高水平复制目的提供高拷贝数。表达载体可以包括用于驱动本发明的核酸片段表达的启动子，可选的编码使所述肽表达产物分泌或整合到膜上的信号肽的核酸序列，本发明的核酸片段，以及可选的编码终止子的核酸序列。当在生产菌株或细胞系中操作表达载体时，载体引入到宿主细胞中时可以整合到宿主细胞的基因组中，也可以不能被整合到宿主细胞基因组中。载体通常携带复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标记序列。例如，使用源自大肠杆菌的质粒pBR322转化大肠杆菌。pBR322质粒包含氨苄青霉素和四环素抗性基因并且为鉴别转化的细胞提供容易的方法。
本发明的表达载体用于转化宿主细胞。这种转化细胞也是本发明的一部分，可以是用于增殖本发明的核酸片段和载体、或用于重组制备本发明的多肽的培养细胞或细胞系。本发明的转化细胞包括微生物如细菌(如大肠杆菌、芽孢杆菌等)。宿主细胞也包括来自多细胞生物如真菌、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞，优选来自人类的细胞。所述转化细胞能够复制本发明的核酸片段。当重组制备本发明的肽组合时，所述表达产物可以输出到培养基中或携带在所述转化细胞的表面。
在一些实施方案中，本文任何抗体或人类免疫缺陷病毒重组蛋白质可以用于检测一种或多种靶分子在生物样品中的存在。术语“检测”用于本文中时，包括定量或定性检测。在一些实施方案中，生物样品包含细胞或组织。
在一些实施方案中，提供用于诊断或检测方法，所述方法包括将生物样品与如本文的抗体或人类免疫缺陷病毒重组蛋白质抗原在允许所述抗体或人类免疫缺陷病毒重组蛋白质抗原与靶标结合的条件下接触，并检测在所述抗体或人类免疫缺陷病毒重组蛋白质抗原与靶标之间是否形成复合物。该方法可以是体外或体内方法。
在一些实施方案中，提供标记的抗体或标记的人类免疫缺陷病毒重组蛋白质。标记包括但不限于荧光标记，发色团标记，电子致密标记，化学发光标记，和放射性标记，以及间接标记如酶或配体，例如，通过酶促反应或分子相互作用来间接检测。示例性标记包括但不限于放射性同位素，荧光团，罗丹明及其衍生物，荧光素酶，荧光素，辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖类氧化酶，例如，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，生物素/抗生物素蛋白，自旋标记，噬菌体标记等等。
本发明的人类免疫缺陷病毒重组蛋白质或其片段可用作免疫原，例如，用于疫苗开发，或作为抗原用于HIV抗体检测的免疫测定。本发明的免疫测定包括ELISA，还包括RIA以及其它非酶联抗体结合试验或方法。
在ELISA试验的某些实施方案中，抗原序列的肽被固定到一个表面上，优选的表面显示蛋白质亲和性，如聚苯乙烯微量滴定板的加样孔。冲洗去除未完全吸收的物质后，将一种非特异性蛋白(如牛血清白蛋白、奶粉溶液、明胶、PVP、Superblock)，结合或包被到加样孔上。这能够封闭固定表面上的非特异性吸收位点，因此溅少抗血清在表面上非特弄性结合造成的背景。经适当的包被期(如3小时)后，用适当的蛋白质(如牛血清白蛋白、酪蛋白、奶粉溶液)包被加样孔，然后用适当的缓冲液如PBS冲洗数次。然后可使平板加样孔干燥，或在其依然潮湿的情况下使用。抗原物质与加样孔结合、用非反应性物质包被以減少背景、以及冲洗去除未结合的物质后，使固定表面与待测的抗血清、或者临床或生物提取物接触，其方式有助于免疫复合物(抗原/抗体)形成。这种条件优选包括用稀释剂，如应用BSA和磷酸缓冲盐液(PBS)/吐温稀释抗血清。这些加入的试剂有助于减少非特异性背景。待测标本与结合抗原之间形成特异性免疫复合物后进行冲洗，在一些实施方案中，可以通过将其置于对第一抗体有特异性的第二抗体中，可测定免疫复合物形成的发生或量。在这种试验中，典型的待测标本是来自人类的，第二抗体优选对人类IgG、IgM或IgA普遍有特异性的抗体。第二抗体优选具有一种偶联酶，后者与适当的显色底物孵育后会产生颜色。与第二酶标抗体孵育后随之冲洗去除未结合的物质，通过与显色底物孵育，对标记物的数量进行定量。通过测量颜色产生的程度能完成数量测定。在一些实施方案中，待测标本与结合抗原之间形成特异性免疫复合物后进行冲洗之后，也可以将其置于抗原中，可测定免疫复合物形成的发生或量。第二抗原可以具有一种偶联酶，后者与适当的显色底物孵育后会产生颜色。与第二酶标抗原孵育后随之冲洗去除未结合的物质，通过与显色底物孵育，对标记物的数量进行定量。通过测量颜色产生的程度能完成数量测定。
在一些实施方案中，本文涉及用于确定抗体存在的方法，所述抗体可以是感染HIV如HIV-1早期产生的抗体。在一些实施方案中，所述抗体结合本发明的人类免疫缺陷病毒重组蛋白质的氨基酸构成的表位。所述方法包括将可能包含所述抗体的生物样品与至少一种本发明的人类免疫缺陷病毒重组蛋白质接触，并且定量或定性确定所述至少一种人类免疫缺陷病毒重组蛋白质与所述样品中的抗体之间的结合。所述方法可以采用任何形式，并且可以例如非竞争性或竞争性的ELISA、RIA或磁性免疫测定、凝集测定和基于表面等离子共振的测定如Biacore测定。
在本文中，生物样品可以指处于健康和/或病理状态的生物组织、细胞或流体的样品。在一些实施方案中，所述生物样品来自怀疑感染HIV的受试者。在一些实施方案中，所述生物样品含有感染HIV后产生的抗体。在一些实施方案中，所述生物样品可以是血液样品。
本文提供的人类免疫缺陷病毒重组蛋白质可以用于确定例如感染HIV的受试者中的抗体的存在，由此具有预测价值。所述方法也将允许监测治疗的功效。
在一些实施方案中，本发明提供抗HIV抗体检测试验，该试验应用上述人类免疫缺陷病毒重组蛋白质或其片段作为靶抗原。所述试验可以是ELISA试验，其可以提供在试验中早期抗HIV抗体的检测，可以提供在常规EIA和WB技术测试为阴性的标本中检测早期抗HIV抗体。
在一些实施方案中，本文提供测试或诊断装置，所述装置包含：
(i)能够结合HIV抗体的人类免疫缺陷病毒重组蛋白质；和
(ii)当所述抗体结合所述人类免疫缺陷病毒重组蛋白质指示的指示剂。
所述测试装置可以是测试条，来自于所述受试者的所述液体样品放置到所述测试条上，或者ELISA测定板，所述ELISA测定板具有其中可放置来自于单个受试者的液体样品的孔。所述测试装置可被配置用于流式细胞仪、生物分析仪、生物传感器中。
在一些实施方案中，本发明提供一种制品(例如试剂盒)，所述制品包含可用于诊断HIV感染的材料。该制品包括容器和在容器上或与容器一起的标签或包装说明书。适合的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。所述容器可以由各种材料如玻璃或塑料制成。容器装有组合物，所述组合物是单独地或与可有效用于诊断HIV的另一种组合物结合。组合物中至少一种活性试剂是本文的抗体或人类免疫缺陷病毒重组蛋白质。此外，所述制品可以包含：(a)其中包含组合物的第一容器，其中所述组合物包含本文的抗体或人类免疫缺陷病毒重组蛋白质；和(b)其中包含组合物的第二容器，其中所述组合物包含第二抗体和/或其它相关试剂。本发明的制品还可以包括包装说明书，所述包装说明书指明所述组合物可以用于诊断所述疾病或感染。所述制品(例如试剂盒)还可以包括第二或第三容器，所述第二或第三容器包含缓冲剂，如注射用水，磷酸盐缓冲盐水，葡萄糖溶液，还可以包括其他材料，如其他缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。
在一些实施方案中，本文提供包括所述人类免疫缺陷病毒重组蛋白质的制品，如微量滴定板(其上可以包被有所述人类免疫缺陷病毒重组蛋白质)。
在一些实施方案中，本文提供含有本文描述的重组蛋白质的HIV抗体检测试剂盒。
在一些实施方案中，所述检测试剂盒可以包括例如上述微量滴定板。在一些实施方案中，所述试剂盒中还可以包括容器，其中包含例如对HIV抗体具有亲和力的第二抗体。
在一些实施方案中，微量滴定板可以包含滴定孔如聚苯乙烯微量滴定孔，这些加样孔包被人类免疫缺陷病毒重组蛋白质、或HIV感染的完整细跑、或其细胞裂解物。
在一些实施方案中，本文提供用于确定例如感染HIV的受试者中的抗体存在的试剂盒，所述抗体结合本申请的人类免疫缺陷病毒重组蛋白质的氨基酸组成的表位，所述试剂盒包含至少一种本发明的人类免疫缺陷病毒重组蛋白质，相关的缓冲剂，用于使液体样品与所述人类免疫缺陷病毒重组蛋白质反应所需的试剂，以及用于确定抗体和所述人类免疫缺陷病毒重组蛋白质之间存在阳性或阴性结合反应的试剂。这种试剂盒可以包括用于分离和/或储存液体样品的容器，用于使所述人类免疫缺陷病毒重组蛋白质与样品接触的容器和试剂，以及用于确定人类免疫缺陷病毒重组蛋白质与样品中的成分之间的结合存在的试剂。为了确定抗体的存在，所述试剂盒可以例如利用带有第二标记的抗体或抗原(双抗原夹心法)，其中所述标记可以是任何合适的标记，如荧光或放射性标记、酶标记或结合标记，如用于结合链霉亲和素的生物素标记。在试剂盒中，人类免疫缺陷病毒重组蛋白质可以与固体支持物结合，或者所述试剂盒至少可以包括适于结合所述人类免疫缺陷病毒重组蛋白质的固体支持物。
在一些实施方案中，本文提供一个试剂盒，其用于早期抗HIV抗体检测和人类免疫缺陷病毒感染。所述试剂盒包括能够检测与人类免疫缺陷病毒重组蛋白质抗原起免疫反应的早期抗HIV抗体的试剂。
在某些实施方案中，试剂盒还可能包括一种容器，其包括一种能够检测与人类免疫缺陷病毒重组蛋白质起免疫反应的早期抗HIV抗体的第二抗体。
试剂盒的HIV抗原试剂可为液体溶液形式、附着于固体支持物上的形式、或为干燥粉剂。当试剂为一种液体溶液时，该液体溶液优选是水溶液。当试剂是附着于固体支持物上的形式时，优选的固体支持物可以是层析介质、塑料珠或平板、或显微镜栽玻片。当试剂为一种干燥粉剂时，通过加入适当溶剂可重构粉剂。在其它的实施方案中，试剂盒可进一步包括一种包含适当溶剂的容器。
在某些实施方案中，试剂盒包括一种容器，其中包括定量的第二抗体，如偶联碱性磷酸酶的羊抗人IgG或IgM或其它抗人IgG第二抗体，以及第二个容器，其中包括一定量的缓冲液。在其它实施方案中，试剂盒可进一步包括第三个容器，它包括适当的底物，如用于碱性磷酸酶的PNPP，或用于过氧化物酶的底物。第四个容器可以包括一种适当的“终止”缓冲剂。
下文提供了一些实例用于示例性说明本发明，而不是限制本发明的范围。
实施例1
重组蛋白的设计
通过基因合成的方式合成编码SEQ ID NO：1的基因序列，并对其中X53、X85、X98、X105、X109、X111、X132、X133位点的氨基酸进行突变设计，
将X53位的氨基酸由碱性脂肪族氨基酸K突变为酸性脂肪族氨基酸E或Q，将X85位的氨基酸由碱性脂肪族氨基酸K突变为脂肪族氨基酸E或D或Q，将X98位的氨基酸由R置换为K，将X105位的氨基酸由酸性脂肪族氨基酸N突变为芳香族氨基酸F或Y，将X109位氨基酸由S突变为R，将X111位氨基酸由酸性脂肪族氨基酸Q突变为中性氨基酸L或I，将X132位氨基酸由酸性脂肪族氨基酸E突变为碱性带正电荷的R基氨基酸K或R或H，将X133位氨基酸由带羟基氨基酸S突变为非羟基氨基酸V或N。
根据以上突变方向构建突变克隆，其中优选方案为其中优选突变方案X53、X85、X105、X109、X111、X132、X133分别为E、E、F、R、L、K、V命名为HIV-Ag-1，分别为Q、D、F、R、L、R、V命名为HIV-Ag-2，分别为E、Q、Y、R、I、K、V命名为HIV-Ag-3，分别为Q、E、F、R、L、R、N命名为HIV-Ag-4，分别为Q、D、Y、R、L、K、N命名为HIV-Ag-5，分别为Q、E、Y、R、I、H、N命名为HIV-Ag-6，分别为E、Q、F、R、I、R、V命名为HIV-Ag-7，分别为E、Q、Y、R、I、H、N命名为HIV-Ag-8。并构建到pMD18-T载体(TaKara大连宝生物，货号：6011)中。SEQ ID NO：1的基因序列构建克隆命名为pMD18-T-HIV-Ag-0，突变克隆分别命名为pMD18-T-HIV-Ag-1至pMD18-T-HIV-Ag-8用于后续扩增与核酸片段保存。
实施例2
重组蛋白的设计
在实施例1基础上，对HIV-Ag-1至HIV-Ag-8中序列X98、X106、X109、X120和X139的氨基酸进行突变设计。
将X98位的氨基酸R突变为K，将X106位的氨基酸由T突变为E，将X109位氨基酸由R突变为T，将X120位的氨基酸由R突变为K，将X139位氨基酸由N突变为D。
新序列分别命名为HIV-Ag-9至HIV-Ag-16。并构建到pMD18-T载体中。分别命名为pMD18-T-HIV-Ag-9至pMD18-T-HIV-Ag-16用于后续扩增与核酸片段保存。
实施例3
重组蛋白表达载体的构建、诱导表达及纯化
重组蛋白表达载体的构建与诱导表达：设计上游引物(带EcoR I酶切位点)和下游引物(带BamH I酶切位点)，以pMD18-T-HIV-Ag-0至pMD18-T-HIV-Ag-8为模板，扩增目的基因。目的基因纯化后，用EcoR I(TaKara大连宝生物，货号：1010A)和BamH I限制性内切酶(TaKara大连宝生物，货号：1040A)进行双酶切，37℃孵育2h。纯化酶切后的产物并与经过相同酶切过的载体pET-28a进行连接，22℃孵育2h，16℃孵育2h。用热激法将连接产物转化大肠杆菌BL21感受态(NEB(New England Biolabs)，货号：C2530H)，并涂布于含50ug/ml Kan的LB平板，37℃培养16h。挑取阳性克隆，经菌液PCR鉴定、双酶切鉴定后送测序。选取测序完全正确的阳性单克隆接种到含50ug/ml Kan的LB培养基中，37度震荡培养。待OD600达到0.6-0.8后，加入1.0mM IPTG，37℃诱导培养2-4h，提取总蛋白，SDS-PAGE鉴定重组蛋白表达情况。通过重组蛋白N端带有的6*HIS标签，经过镍离子螯合纯化和SP柱纯化后得到纯度达到96％的蛋白。将得到的蛋白分别命名为HIV-Ag-0至HIV-Ag-16。
实施例4
突变克隆HIV-Ag-1至HIV-Ag-8重组抗原在酶免产品工艺中的应用与活性及特异性评价
酶免检测按如下方式进行操作：
包被：将重组蛋白按100ng/ml的工作浓度加入到50mM CB PH 9.6的包被液中，混匀后按每孔100ul加入到聚苯乙烯板中，4℃包被18-20小时。
封闭：取出包被板室温平衡30min，用洗涤液洗板2次，每孔加150ul封闭液37℃封闭2小时。拍干置于湿度小于30％的电子干燥箱中干燥24h后待用。
标记：将重组蛋白按推荐方式标记HR按50ng/ml用酶工作液稀释后混匀(酶稀释液配方：20mM PB 150mM NaCl 0.5％BSA 0.05％Tween-200 0.1％P300)。
反应模式和反应时间：50ul待测样品+50ul样品稀释液，37度恒温箱反应60min；洗板5次，拍干后加入100ul标记重组蛋白-HR工作液，37℃反应30min；洗板5次，加显色剂A和B各50ul，显色30min；加入终止液50ul，用450nm和630nm双波长检测，检测要求在10min之内读完。
与市售试剂盒进行性能对比实验，HIV-1阳性血清500份、HIV-1抗体阴性血清3000份。结果如表1所示，本发明的重组蛋白用于HIV-1抗体检测，灵敏度有提升，特异性明显改善，优于现有产品。
表1突变后检测结果对比1
实施例5
突变克隆HIV-Ag-1至HIV-Ag-16重组抗原在酶免工艺中的活性评价
酶免检测按如下方式进行操作：
包被：将重组蛋白按100ng/ml的工作浓度加入到50mM CB PH 9.6的包被液中，混匀后按每孔100ul加入到聚苯乙烯板中，4℃包被18-20小时。
封闭：取出包被板室温平衡30min，用洗涤液洗板2次，每孔加150ul封闭液37℃封闭2小时。拍干置于湿度小于30％的电子干燥箱中干燥24h后待用。
标记：将重组蛋白按推荐方式标记HR按50ng/ml用酶工作液稀释后混匀(酶稀释液配方：20mM PB 150mM NaCl 0.5％BSA 0.05％Tween-200 0.1％P300)。
反应模式和反应时间：50ul待测样品+50ul样品稀释液，37度恒温箱反应60min；洗板5次，拍干后加入100ul标记重组蛋白-HRP工作液，37℃反应30min；洗板5次，加显色剂A和B各50ul，显色30min；加入终止液50ul，用450nm和630nm双波长检测，检测要求在10min之内读完。
HIV-1阳性血清500份，每份按1∶200用样品稀释液进行稀释后作为待测标本进行活性检测。结果如表2所示，进行突变后，500份阳性标本稀释后检测的平均灵敏度有显著提高。
表2突变后检测结果对比2
序列表
SEQ ID NO：1
SEQ ID No：2：
其中第n位的Xaa以Xn表示，其中
X53是K，E或Q，优选是E或Q，
X85是K，E或D或Q，优选是E或D或Q，
X98是R，K，优选是K，
X105是N，F或Y，优选是F或Y，
X106是T，E，优选是E，
X109是S，R或T，优选是R或T，
X111是Q，L或I，优选是L或I，
X120是R，K，优选是K，
X132是E，K或R或H，优选是K或R或H，
X133是S，V或N，优选是V或N，
X139是N，D，优选是D。

Claims (10)

1.一种人类免疫缺陷病毒重组蛋白质，其序列为下述氨基酸置换的SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，其中所述置换为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列第53、85、98、105、109、111、132和133的八个位点的氨基酸K，K，R，N，S，Q，E和S分别置换为下述氨基酸：
酸性脂肪族氨基酸E或Q，
酸性脂肪族氨基酸E或D或Q，
K，
芳香族氨基酸F或Y，
R或T，
中性氨基酸L或I，
碱性带正电荷的R基氨基酸K或R或H，和
非羟基氨基酸V或N。
2.权利要求1所述的人类免疫缺陷病毒重组蛋白质，其中所述重组蛋白质进一步为SEQID NO:1所示的氨基酸序列第106、120和139位点中的一个或多个氨基酸置换的氨基酸序列，其中所述置换选自T106E、R120K和N139D。
3.一种核酸，其编码权利要求1-2中任一项所述的人类免疫缺陷病毒重组蛋白质。
4.一种载体，其包含权利要求3所述的核酸。
5.一种宿主细胞，其包含权利要求3所述的核酸或权利要求4所述的载体。
6.一种试剂盒，其包含权利要求1-2中任一项所述的人类免疫缺陷病毒重组蛋白质，权利要求3所述的核酸或权利要求4所述的载体。
7.权利要求6所述的试剂盒，其还包括用于标记所述人类免疫缺陷病毒重组蛋白质的标记。
8.权利要求7所述的试剂盒，其中用于标记所述人类免疫缺陷病毒重组蛋白质的标记是酶标记。
9.一种生产权利要求1-2任一项所述人类免疫缺陷病毒重组蛋白质的方法，其包括制备权利要求3所述核酸或权利要求4所述载体的步骤。
10.权利要求1-2任一项所述的人类免疫缺陷病毒重组蛋白质在制备用于检测人类免疫缺陷病毒感染的检测剂或试剂盒中的用途。
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