CN111333726B - 抗恶性疟原虫hrp-ii抗体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗恶性疟原虫HRP‑II抗体。本发明提供抗恶性疟原虫HRP‑II抗体或其抗原结合片段，所述抗体包含SEQ ID NO：1‑3所示的氨基酸序列或其变体的重链CDRs，SEQ ID NO：4‑6所示的氨基酸序列或其变体的轻链CDRs。本发明提供所述抗体的用途以及制备所述抗体的方法。

Description

抗恶性疟原虫HRP-II抗体

技术领域

本发明涉及疟原虫抗体、其用途以及制备方法。具体而言，本发明涉及恶性疟原虫富组氨酸蛋白-II(Histidine-rich protein II，HRP-II)的抗体，其用于检测或诊断疟疾的用途，以及制备所述抗体的方法。

背景技术

疟疾(Malaria)是经按蚊叮咬或输入带疟原虫者的血液而感染疟原虫所引起的一种虫媒传染病。寄生于人体的疟原虫主要有四种：间日疟原虫(Plasmodium vivax，pv)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum，Pf)、三日疟原虫(Plasmodium malariae，pm)、卵形疟原虫(Plasmodium ovale，po)。恶性疟原虫是常见的感染性疟原虫(75％)，是危害最大的病原体，它感染力强，增殖迅速，症状严重，初次感染者致死率高，由其引起的死亡占感染者死亡总数的95％以上，主要存在于非洲、南美和亚洲的热带地区。恶性疟原虫感染是非洲5岁以下儿童的最主要死亡原因。间日疟原虫是第二常见的疟原虫(20％)，其感染所致症状较轻，但其分布更为广泛，受其威胁的人口大约为26～28.5亿，每年发病超过8000万，主要分布在东南亚、南亚和美洲亚热带地区。WHO建议所有疟疾疑似患者应该即时进行疟疾的检测，疾病的快速、准确诊断对于抗疟药的正确使用，避免耐药株的产生及控制病情恶化、降低死亡率至关重要。

疟疾诊断是疟疾防治工作的重点。从检测技术原理上进行归类，目前检测疟原虫的方法可以分为四类。一是显微镜直接检测疟原虫，包括厚血膜和薄血膜，这也是目前临床上疟疾诊断的金标准。但费时，费力，需要熟练的技术人员和一定的实验条件。二是疟原虫核酸检测，检测靶标为疟原虫18S核糖体RNA等特异性核苷酸片段，常用的方法为荧光PCR方法和环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification LAMP)。该类方法虽然灵敏度和特异性高，但需要更复杂的仪器设备和技术条件作为支持，不适合作为疟疾流行区常规的检测手段，难以在基层推广应用。三是检测疟原虫色素，通常采用流式细胞检测技术或质谱方法。该方法需要专业的检测仪器，一般用于实验室研究，不适用现场检测。四是抗原抗体的免疫反应检测疟原虫，方法学上有免疫层析快速诊断试剂(RDT)和酶联免疫吸附(ELISA)，检测的靶抗原大多为LDH、HRP-II等诊断抗原。以抗原为检测目标的RDT应用在恶性疟原虫流行的落后地区具有重要意义，因其操作简便、快速、结果直观，无需复杂设备、敏感性和特异性高等优点，是WHO推荐用于现场诊断的方法。

目前，常用的检测疟疾抗原主要为恶性疟原虫特有的富组氨酸蛋白-II(Histidine-rich protein II，HRP-II)和疟原虫乳酸脱氢酶(PlasmodiumLactatedehydiogenase，PLDH)。HRP-II是恶性疟原虫特有的35-105kDa水溶性蛋白质，只在红内期无性体期和早期配子体期合成，合成开始于未成熟的环状体，含量在整个红内期随裂殖子的分裂逐渐升高，能持续28d，对成熟配子体期难以检测到。HRP-II蛋白以可溶形式分泌入宿主血液中，同时该蛋白在脑脊液、尿液及唾液中均可检测到，是最为认可的恶性疟原虫诊断标志物。通过特异的单克隆抗体检测HRP-II可以判断人体内恶性疟原虫的存在。

目前，市场上以HRP-II作为靶蛋白用于检测疟原虫的试剂盒有很多，如国外的ParaSight-F试剂盒，ICT Malaria P.f.＆P.f/P.v诊断试剂盒，

试剂盒，CareStart疟疾HRP-II/PLDH复合测试盒；国内的有艾康P.f/P.v胶体金免疫层析检测试剂盒等。ParaSight-F试剂盒为世界卫生组织推荐的应用产品，用鼠抗HRP-IIIgG1类单克隆抗体及对照HRP-II抗原以线状和虚线状包被于条形硝酸纤维素膜上分别作为捕获抗体和检测线，以硫代罗丹明B作为指示剂显色，只能检测恶性疟。ICT Malaria P.f/P.v诊断试剂盒在硝酸纤维膜上包被1株抗恶性疟原虫HRP-II单抗和1株间日疟种属特异单抗作为捕获抗体，以胶体金标记进行显色，用于恶性疟、间日疟和混合感染。

试剂盒应用了2种不同单克隆抗体，检测靶蛋白是HRP-II和醛缩酶，HRP-II为恶性疟特有，醛缩酶是4种感染人体疟原虫所共有的成分，同时检测单纯恶性疟和除恶性疟外的其他人疟原虫。CareStart疟疾HRP-II/PLDH复合测试盒用2中单克隆单体在膜上形成独立的两条检测线，分别是抗疟原虫属(恶性疟、间日疟、卵形疟、三日疟)的乳酸脱氢酶(PLDH)单抗和抗HRP-II单抗，专用于恶性疟和其他型疟疾的鉴别诊断。艾康P.f/P.v胶体金免疫层析检测试剂盒分别采用抗恶性疟原虫HRP-II和抗间日疟原虫PLDH单抗作捕获抗体，同时诊断单纯恶性疟和单纯间日疟的感染。现有试剂盒都需要用到针对HRP-II的高灵敏度及高特异性的单克隆抗体。然而，现有检测该项目的单克隆抗体灵敏度和特异性都存在一些缺陷，且该项目检测所用抗体量高，而现有生产方式限制了该产品的批量及成本。

发明内容

本发明提供抗恶性疟原虫HRP-II抗体或其抗原结合片段。本发明还提供所述抗体的制备方法、包含所述抗体的抗体偶联物、融合蛋白和试剂盒/诊断剂，以及所述抗体用于诊断恶性疟原虫感染的用途。

在一些实施方案中，本发明提供抗体或其抗原结合片段，所述抗体结合恶性疟原虫富组氨酸蛋白-II，即HRP-II，其中所述抗体包含下述氨基酸序列或与其具有至少80％序列同一性(例如至少81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高序列同一性)的互补决定区：

重链CDR1，其包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列G-Y-X1-F-X2-S-Y-W，或由其组成，其中X1是T或S；X2是G、P或A；

重链CDR2，其包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列N-X1-Y-P-G-S-X2-T-N-Y-X3-E-N-F，或由其组成，其中X1是L、V或I；X2是GG或N；X3是E或D，优选D；和

重链CDR3，其包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列T-G-X1-W-X2-Y-X3-G，或由其组成，其中X1是Q、H或N；X2是D或E；X3是W或F，优选W；

并且所述抗体还包含：

轻链CDR1，其包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列K-S-L-X1-H-S-N-X2-D-T-X3-L-F，或由其组成，其中X1是I、V或L；X2是G、A或P；X3是F或Y，优选Y；

轻链CDR2，其包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列I-Y-X1-M-S-N-X2-A-X3-G，或由其组成，其中X1是R或K；X2是I、V或L；X3是T或S，优选S；和

轻链CDR3，其包含SEQ ID NO：6所示的序列M-X1-H-L-E-Y-P-X2-T-X3-G，或由其组成，其中X1是N或Q；X2是I、V或L；X3是W或F，优选F；

例如，所述抗体可以包含含有下表所示的氨基酸残基置换组合的重链CDR1，重链CDR2，重链CDR3，轻链CDR1，轻链CDR2，和轻链CDR3：

i)所述抗体包含下表所示的氨基酸残基置换组合：

ii)i)中的抗体进一步包含下表所示的氨基酸残基置换组合：

其中所述抗体以2x10^-9M，例如1x10^-9M或更小的KD结合HRP-II蛋白。

在一些实施方案中，本发明提供抗体或其抗原结合片段，所述抗体结合HRP-II，其中所述抗体包含：

重链CDR1，其包含SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列或由其组成；

重链CDR2，其包含SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列或由其组成；和

重链CDR3，其包含SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列或由其组成；

并且所述抗体还包含：

轻链CDR1，其包含SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列或由其组成；

轻链CDR2，其包含SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列或由其组成；和

轻链CDR3，其包含SEQ ID NO：26所示的序列或由其组成。

在一些实施方案中，本发明的抗体还可以包含重链可变区的框架区FR-H1，FR-H2，FR-H3和FR-H4，和轻链可变区的框架区FR-L1，FR-L2，FR-L3和FR-L4，其中

FR-H1包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：27所示的序列具有至少70％，75％，80％，85％，90％，优选至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸突变(优选保守突变，优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其列组成；

FR-H2包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列或与SEQ ID NO：28所示的序列具有至少70％，75％，80％，85％，90％，优选至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸突变(优选保守突变，优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成；

FR-H3包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列或与SEQ ID NO：29所示的序列具有至少70％，75％，80％，85％，90％，优选至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸突变(优选保守突变，优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成；

FR-H4包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：30所示的序列具有至少70％，75％，80％，85％，90％，优选至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸突变(优选保守突变，优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列或由其组成；和

FR-L1包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列或与SEQ ID NO：31所示的序列具有至少70％，75％，80％，85％，90％，优选至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸突变(优选保守突变，优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成；

FR-L2包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列或与SEQ ID NO：32所示的序列具有至少70％，75％，80％，85％，90％，优选至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸突变(优选保守突变，优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成；

FR-L3包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列或与SEQ ID NO：33所示的序列具有至少70％，75％，80％，85％，90％，优选至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸突变(优选保守突变，优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成；

FR-L4包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列或与SEQ ID NO：34所示的序列具有至少70％，75％，80％，85％，90％，优选至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸突变(优选保守突变，优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成。

在一些实施方案中，本发明提供抗体或其抗原结合片段，所述抗体结合HRP-II，其中所述抗体包含：

(i)重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：

SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列，或

与SEQ ID NO：17所示的序列具有至少70％，75％，80％，85％，90％，优选至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的序列，或

与SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸突变(优选保守突变，优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，和

(II)轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：

SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列，或

与SEQ ID NO：19所示的序列具有至少70％，75％，80％，85％，90％，优选至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的序列，或

与SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸突变(优选保守突变，优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明所述抗体以10^-10M或更小的KD结合HRP-II蛋白。

在一些实施方案中，本发明所述抗体以小于大约100nM，例如小于大约10nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM或更小的EC50结合HRP-II蛋白。

在一些实施方案中，本发明所述抗体的抗原结合片段可以包括Fab，Fab′，F(ab′)₂，Fd，Fv，互补决定区(CDR)片段，单链抗体(例如，scFv)，双价抗体或结构域抗体。

在一些实施方案中，本发明提供分离的多肽，其选自以下各项组成的组：

(1)分离的多肽，其包含SEQ ID NO：21，22和23所示的序列，其中所述多肽作为抗HRP-II的抗体的一部分，特异性结合HRP-II，所述抗体还包含SEQ ID NO：24，25和26所示的序列；

(2)分离的多肽，其包含SEQ ID NO：24，25和26所示的序列，其中所述多肽作为抗HRP-II的抗体的一部分，特异性结合HRP-II，所述抗体还包含SEQ ID NO：21，22和23所示的序列；

(3)分离的多肽，其包含SEQ ID NO：17所示的序列或与所述序列具有至少70％，75％，80％，85％，90％，优选至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸突变(优选保守突变，优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，其中所述多肽作为抗HRP-II的抗体的一部分，特异性结合HRP-II，所述抗体还包含SEQ ID NO：19所示的序列或与所述序列具有至少70％，75％，80％，85％，90％，优选至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸突变(优选保守突变，优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列；

(4)分离的多肽，其包含SEQ ID NO：19所示的序列或与所述序列具有至少70％，75％，80％，85％，90％，优选至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸突变(优选保守突变，优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，其中所述多肽作为抗HRP-II的抗体的一部分，特异性结合HRP-II，所述抗体还包含SEQ ID NO：17所示的序列或与所述序列具有至少70％，75％，80％，85％，90％，优选至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸突变(优选保守突变，优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列；

(5)分离的多肽，其包含SEQ ID NO：18所示的序列或与所述序列具有至少70％，75％，80％，85％，90％，优选至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸突变(优选保守突变，优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，其中所述多肽作为抗HRP-II的抗体的一部分，特异性结合HRP-II，所述抗体还包含SEQ ID NO：20所示的序列或与所述序列具有至少70％，75％，80％，85％，90％，优选至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸突变(优选保守突变，优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列；

(6)分离的多肽，其包含SEQ ID NO：20所示的序列或与所述序列具有至少70％，75％，80％，85％，90％，优选至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸突变(优选保守突变，优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，其中所述多肽作为抗HRP-II的抗体的一部分，特异性结合HRP-II，所述抗体还包含SEQ ID NO：18所示的序列或与所述序列具有至少70％，75％，80％，85％，90％，优选至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸突变(优选保守突变，优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供分离的多核苷酸，其编码本发明的抗体或其抗原结合片段或分离的多肽。

在一些实施方案中，本发明提供载体，其包含本文描述的分离的多核苷酸。

在一些实施方案中，本发明提供宿主细胞，其包含本文描述的分离的多核苷酸或载体。

在一些实施方案中，本发明提供制备本文描述的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括培养本文描述的宿主细胞。

在一些实施方案中，本发明提供抗体偶联物，其包含本文描述的抗体或其抗原结合片段以及与其偶联的偶联部分，优选地，所述偶联部分包括选自纯化标签(如His标签)，可检测的标记，例如胶体金、放射性标记、发光物质、有色物质、酶，例如荧光标记，发色团标记，电子致密标记，例如放射性同位素，荧光团，罗丹明及其衍生物，荧光素酶，荧光素，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖类氧化酶，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，生物素/抗生物素蛋白，自旋标记。

在一些实施方案中，本发明提供试剂盒或诊断剂，其包括本文描述的抗体或其抗原结合片段，抗体偶联物或融合蛋白，其中：

1)优选地，所述试剂盒还包含结合除HRP-II以外的疟原虫抗原的抗体或其抗原结合片段，抗体偶联物，或融合蛋白，例如恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和/或卵形疟原虫特异性抗原或共有抗原，例如醛缩酶，例如乳酸脱氢酶PLDH，例如疟原虫属乳酸脱氢酶PLDH或疟原虫种特异性乳酸脱氢酶PLDH，

2)优选地，所述试剂盒还包括另外一种或多种抗体，其特异性识别本文描述的抗体或其抗原结合片段，抗体偶联物，或融合蛋白；和/或特异性识别结合除HRP-II以外的疟原虫抗原的抗体或其抗原结合片段，抗体偶联物，或融合蛋白，任选地，所述另外一种或多种抗体还包括可检测的标记，例如胶体金、放射性标记、发光物质、有色物质、酶，例如荧光标记，发色团标记，电子致密标记，例如放射性同位素，荧光团，罗丹明及其衍生物，荧光素酶，荧光素，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖类氧化酶，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，生物素/抗生物素蛋白，自旋标记；

3)任选地，所述试剂盒为快速诊断(RDT)试剂盒，例如应用薄膜免疫层析的试剂盒，例如采用胶体金法的薄膜免疫层析的试剂盒，例如包含固相支持物如膜支持物，将结合疟原虫抗原的抗体或其抗原结合片段，抗体偶联物，或融合蛋白以及任选的对照抗体固定到所述固相支持物；

4)任选地，所述试剂盒为酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒。

在一些实施方案中，本发明提供本文描述的抗体或其抗原结合片段，抗体偶联物，或融合蛋白在制备试剂盒或诊断剂中的用途，所述试剂盒用于1)检测HRP-II在样品中的存在或其水平，2)诊断恶性疟原虫感染，和/或3)鉴别诊断恶性疟原虫感染与其他疟原虫感染。

在一些实施方案中，所述样品的来源没有特别限制，例如可以包括组织、细胞或流体样品，例如体液的样品，例如脑脊液、尿液、唾液、血液样品。为了避免传统杂交瘤技术的不足之处，本发明提供一种抗恶性疟原虫HRP-II单克隆抗体的表达载体，提供了一种抗恶性疟原虫HRP-II单克隆抗体序列，用于通过重组技术表达抗恶性疟原虫HRP-II单克隆抗体，用于恶性疟的诊断。

在一些实施方案中，本发明包括以下一个或多个方面：

1)抗HRP-II单克隆抗体轻链基因的克隆；

2)抗HRP-II单克隆抗体重链基因的克隆；

3)抗HRP-II单克隆抗体表达载体的构建；

4)针对步骤3)的表达载体，采用表达系统如真核表达系统如CHO真核表达系统获得Anti-HRP-II单克隆抗体；

5)针对步骤4)，对Anti-HRP-II单克隆抗体进行活性鉴定及亲和力分析。

在一些实施方案中，本发明所涉及的单克隆抗体优选采用重组技术制备。在一些实施方案中，本发明的方法制备的抗体灵敏度和特异性相较现有产品都有较大优势，抗体生产方式为发酵方式，批量大、成本更低。

附图说明

图1：纯化抗体还原性SDS-PAGE图，其中泳道1、2显示ProteinA亲和层析柱纯化获得的4μg抗体还原性SDS-PAGE图。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明，所描述的各个具体实施方式不是限制性的，并且可以相互组合。

术语“氨基酸”表示天然存在或非天然存在的羧基α-氨基酸。术语“氨基酸”用在本申请中可以包括天然存在的氨基酸和非天然存在的氨基酸。天然存在的氨基酸包括丙氨酸(三字母密码：Ala，单字母密码：A)，精氨酸(Arg，R)，天冬酰胺(Asn，N)，天冬氨酸(Asp，D)，半胱氨酸(Cys，C)，谷氨酰胺(Gln，Q)，谷氨酸(Glu，E)，甘氨酸(Gly，G)，组氨酸(His，H)，异亮氨酸(Ile，I)，亮氨酸(Leu，L)，赖氨酸(Lys，K)，甲硫氨酸(Met，M)，苯丙氨酸(Phe，F)，脯氨酸(Pro，P)，丝氨酸(Ser，S)，苏氨酸(Thr，T)，色氨酸(Trp，W)，酪氨酸(Tyr，Y)，和缬氨酸(Val，V)。非天然存在的氨基酸包括但不限于α-氨基己二酸，氨基丁酸，瓜氨酸，高瓜氨酸，高亮氨酸，高精氨酸，羟基脯氨酸，正亮氨酸，吡啶基丙氨酸，肌氨酸等等。

在本文中，肽、多肽、蛋白质不作严格区分，在一些情形中可以相互替代使用，一般指通过肽键连接的氨基酸组成的聚合物，不管是天然产生的还是合成的。多肽也可以包含非氨基酸成分，如碳水化合物基团、金属离子或羧酸酯。非氨基酸成分可以是由表达所述多肽的细胞所加入的，并且可以随细胞类型而不同。多肽在本文中关于其氨基酸骨架结构或编码其的核酸而限定。如碳水化合物基团的添加通常没有规定，但是，是可以存在的。所有的多肽序列按照通常接受的惯例书写，其中α-N-端氨基酸残基在左侧，且α-C-端氨基酸残基在右侧。当用于本文时，术语“N-端”是指多肽中氨基酸的游离的α-氨基基团，术语“C-端”是指多肽中氨基酸的游离的α-羧酸端。在N-端以某基团结束的多肽是指在N-端氨基酸残基的α-氨基氮上携带基团的多肽。在N-端以某基团结束的氨基酸是指在α-氨基氮上携带基团的氨基酸。

“保守”氨基酸置换是其中氨基酸残基被带有具有相似理化性质的侧链的氨基酸残基置换的那些置换。具有相似侧链的氨基酸残基在本领域中是已知的，并且包括带有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，带有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，带有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，带有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，带有β分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和带有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。保守氨基酸置换的特殊形式包括用不在由遗传密码编码的正常的20个氨基酸中的氨基酸置换的那些。本发明的实施方案包括使用合成肽，因此在本文公开的肽中可以使用这种“非天然存在的”氨基酸残基，并且可以将氨基酸残基侧链中的天然饱和碳链交换为更短或更长的饱和碳链。

在两个氨基酸序列的情形中，在最优化比对时，如通过程序GAP或BESTFIT使用默认缺口权重比对时，本发明的序列涵盖与序列表中所示的序列具有至少99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，84％，83％，82％，81％，80％，75％，70％的序列同一性的相应序列。例如，在一些实施方案中，本发明的抗体包括与SEQ ID NO：1-3所示重链CDR，SEQ ID NO：4-6所示轻链CDR，或者SEQ ID NO：21-23所示重链CDR，SEQ ID NO：24-26所示轻链CDR具有至少99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，84％，83％，82％，81％，80％，75％，70％的序列同一性的相应重链CDR和轻链CDR的抗体。例如，在一些实施方案中，本发明的抗体包括与SEQ ID NO：27-30所示重链FR1-4，SEQ ID NO：31-34所示轻链FR1-4具有至少99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，84％，83％，82％，81％，80％，75％，70％的序列同一性的相应重链FR1-4和轻链FR1-4的抗体。例如，在一些实施方案中，本发明的抗体包括与SEQ ID NO：17所示重链可变区，SEQ IDNO：19所示轻链可变区具有至少99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，84％，83％，82％，81％，80％，75％，70％的序列同一性的相应重链可变区和轻链可变区的抗体。例如，在一些实施方案中，本发明的抗体包括与SEQ IDNO：18所示重链，SEQ ID NO：20所示轻链可变区具有至少99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，84％，83％，82％，81％，80％，75％，70％的序列同一性的相应重链和轻链的抗体。在一些实施方案中，本发明涵盖所述抗体的抗原结合片段，抗体偶联物，或融合蛋白。在一些实施方案中，本发明还包括含有上述抗体重链和/或轻链相应的分离的多肽。在一些实施方案中，本发明包括编码所述抗体和分离多肽的多核苷酸、载体、宿主细胞。

在一些实施方案中，本发明的抗体的不相同的残基差别在于保守氨基酸置换。如本领域技术人员已知的，可以用序列分析软件测量序列同一性。例如，公共可用的GCG软件包含程序如“Gap”和“BestFit”，可以以默认参数使用所述软件来确定紧密相关的多肽之间或野生型蛋白质与其突变蛋白质之间的序列同源性或序列同一性。也可以使用FASTA或ClustalW，使用默认或推荐参数比较多肽序列。GCG版本6.1.中的程序，FASTA(例如，FASTA2和FASTA3)给出查询和检索序列之间的最佳重叠区域的比对和百分比序列同一性。另一种算法是使用默认参数的计算机程序BLAST，尤其是blastp。

本文中的术语“抗体”在最广义上使用，其可以包括全长单克隆抗体，双特异性或多特异性抗体，嵌合抗体，以及抗体片段，只要他们展示所需的生物学活性，如特异性结合HRP-II抗原或其片段。“抗体片段”包括全长抗体的部分，优选地其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab，Fab′，F(ab′)₂，Fd，Fv，互补决定区(CDR)片段，单链抗体(例如，scFv)，双价抗体或结构域抗体。在一些实施方案中，本发明包括抗体或抗体片段的融合蛋白，例如融合可检测的标记或标签，如GFP、HA、Flag、His、GST、Myc等，也可与其他适合促进抗原检测的多肽融合。

在一些实施方案中，本发明包括含有编码抗恶性疟原虫HRP-II的抗体或其片段的核酸序列。在本文中，核酸序列包含其保守置换的变体(例如简并密码子的置换)和互补序列。术语“核酸”和“多核苷酸”是同义的，包含基因、cDNA分子、mRNA分子以及它们的片段例如寡核苷酸。

在一些实施方案中，本发明包括含有编码抗恶性疟原虫HRP-II的抗体或其片段的核酸序列的表达载体，其中的核酸序列与至少一种调节序列可操作连接。“可操作连接”指的是编码序列以允许编码序列的表达的方式与调节序列连接。调节序列选择用来在合适的宿主细胞中指导目的蛋白质的表达，包含启动子、增强子和其它的表达调控元件。

在本文中，载体包括含有本发明的核酸或其片段的、能够携带遗传信息并且可以将遗传信息递送到细胞中的分子或试剂。典型的载体包括质粒、病毒、噬菌体、黏粒和微型染色体。载体可以是克隆载体(即用于将遗传信息转移到细胞中的载体，可以繁殖所述细胞并且可以选择存在或不存在所述遗传信息的所述细胞)或表达载体(即包含必要的遗传元件从而允许所述载体的遗传信息在细胞中表达的载体)。因此，克隆载体可以包含选择标记，以及与所述克隆载体所指定的细胞类型相匹配的复制起点，而表达载体则包含对于影响指定靶细胞中的表达必要的调节元件。

本发明的核酸或其片段可以插入到合适的载体中以形成携带本发明核酸片段的克隆载体或表达载体。在一些实施方案中，所述载体可以包括质粒、噬菌体、黏粒、微型染色体或病毒，也包括只在特定细胞中瞬时表达的裸DNA。在一些实施方案中，载体包含携带有目的基因和筛选标记(如Dhfr，GS标记或抗性基因neo、hygro等)的序列。在一些实施方案中，本发明的载体包括1)单顺反子载体，例如抗体的重链和轻链使用不同载体，共转染宿主细胞；也可以将重链和轻链基因串联到同一载体，分别使用各自的启动子、终止子转录翻译；2)双顺反子载体，例如在载体中构建核糖体内部进入位点，在其两端串联轻链、重链基因，实现轻链、重链的同时转录翻译；3)反式互补载体，例如表达轻链、重链的两个载体分别含有编码筛选标记基因的不同序列，只有当轻链、重链同时转染时，筛选标记才能正确表达，从而提高筛选效率。可以用任何方法向编码序列中引入突变以产生本发明的变体，这些突变可以包含缺失或插入或置换等。

本发明的表达载体用于转化宿主细胞。这种转化细胞也是本发明的一部分，可以是用于增殖本发明的核酸片段和载体、或用于重组制备本发明的多肽的培养细胞或细胞系。本发明的宿主细胞包括适合制备重组抗体的任何工程细胞。在一些实施方案中，宿主细胞可以包括微生物如细菌(如大肠杆菌、芽孢杆菌等)，多细胞生物如酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞，优选来自人类的细胞。在一些实施方案中，宿主细胞可以用于制备本文描述的抗体如单链抗体或者抗体片段，或者分离的多肽，融合蛋白等。在一些实施方案中，本发明的宿主细胞包括适合制备重组抗体的哺乳动物细胞，如CHO、骨髓瘤细胞，杂交瘤细胞，PerC.6，HEK293，NS0，sp2/0等。在一些实施方案中，所述宿主细胞优选包括生长性好、无血清悬浮培养密度高，异源表达能力强，并且具有正确翻译后修饰能力的细胞。

在一些实施方案中，本发明提供了抗恶性疟原虫HRP-II的抗体、抗原结合片段、变体和功能衍生物的制备方法。在一些实施方案中，通过重组技术表达抗恶性疟原虫HRP-II单克隆抗体。在一些实施方案中，用编码抗恶性疟原虫HRP-II抗体的核酸载体转染宿主细胞，在合适的条件下培养该宿主细胞使其表达抗恶性疟原虫HRP-II的抗体。宿主细胞也可以用一个或多个表达载体转染，该表达载体可以单独或结合地包含编码至少一部分抗恶性疟原虫HRP-II的抗体的DNA。在一些实施方案中，当重组制备本发明的抗体时，所述表达产物可以输出到培养基中或携带在所述转化细胞的表面。利用常规的纯化蛋白质和肽的技术可从培养基或细胞裂解物中分离抗恶性疟原虫HRP-II的抗体，所述技术包括硫酸铵沉淀，层析(如离子交换，凝胶过滤，亲合层析等)和/或电泳。在一些实施方案中，用于制备抗体的免疫原可以含有完整的恶性疟原虫HRP-II，或其片段或衍生物。优选的免疫原含有全部或部分的恶性疟原虫HRP-II。

在一些实施方案中，本文描述的抗体如抗恶性疟原虫HRP-II的抗体可以用于检测一种或多种靶分子如HRP-II在生物样品中的存在。术语“检测”用于本文中时，包括定量或定性检测。在一些实施方案中，生物样品包含细胞或组织。

在一些实施方案中，提供用于诊断或检测方法，所述方法包括将生物样品与本文描述的抗体如抗恶性疟原虫HRP-II的抗体在允许所述抗体与靶标结合的条件下接触，并检测在所述抗体与靶标之间是否形成复合物。在一些实施方案中，该方法可以是体外或体内方法。本发明还涉及对可能感染恶性疟原虫的受试者进行疟疾诊断的方法，其包含将来自所述受试者的生物学样品与本发明的抗体相接触，所述接触在能够使得所述抗体与可能存在于所述生物学样品中靶标形成抗原/抗体复合物的条件下进行，并检测可能形成的抗原/抗体复合物。在该方法中，可通过ELISA分析进行体外诊断。在一些实施方案中，本发明的方法还可以包括将所述生物学样品与诊断其他疟原虫抗原的一种或多种抗体相接触，所述其他抗原可以是例如LSA-1、LSA-3、LSA-5、SALSA、STARP、TRAP、PfEXP1、CS、MSP-3-1、MSP-3-2、MSP-3-5、MSP-3-6、MSP1、MSP2、MSP4、MSP5、AMA-1、SERP和GLURP。

在一些实施方案中，提供标记的抗恶性疟原虫HRP-II的抗体。在一些实施方案中，标记包括但不限于荧光标记，发色团标记，电子致密标记，化学发光标记，和放射性标记，以及间接标记如酶或配体，例如，通过酶促反应或分子相互作用来间接检测。在一些实施方案中，示例性标记包括但不限于放射性同位素，荧光团，罗丹明及其衍生物，荧光素酶，荧光素，辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖类氧化酶，例如，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，生物素/抗生物素蛋白，自旋标记，噬菌体标记等等。

在一些实施方案中，本发明的抗恶性疟原虫HRP-II的抗体或其片段可用作抗原用于HRP-II抗体检测的免疫测定和相应试剂盒中。在一些实施方案中，本发明的免疫测定包括ELISA，间接免疫荧光测定IFA，还包括放射免疫测定RIA以及其它非酶联抗体结合试验或方法。

在一些实施方案中，例如在ELISA双抗原夹心实验方案中，可以将HRP-II抗体包被微量反应板，捕获样品中的HRP-II抗原，然后用标记的抗体与结合在反应板上的抗原再次结合，经显色后读取结果。在一些实施方案中，本发明的HRP-II抗体可以用于包被微量反应板或用作标记的第二抗体。在一些实施方案中，抗恶性疟原虫HRP-II的抗体或其片段固定到一个表面上，例如固相支持物上，例如塑料、膜如硝酸纤维素膜、玻璃或金属支持物。在一些实施方案中，所述固相支持物可以制成条形或者卡片状。在一些实施方案中，来自受试者的样品与所述固相支持物接触，然后接触带有可检测标记如罗丹明标记的抗体指示剂显色。在一些实施方案中，可以采用封闭剂如牛血清白蛋白、奶粉溶液、明胶、PVP、Superblock封闭非特异性位点，因此減少非特异性结合造成的背景。在一些实施方案中，可以采用稀释剂，如应用BSA和磷酸缓冲盐液(PBS)/吐温稀释抗血清，有助于减少非特异性背景。

在一些实施方案中，本文涉及用于确定HRP-II抗原存在或定量的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将可能包含HRP-II抗原的生物样品与本发明的抗恶性疟原虫HRP-II的抗体接触，并且定量或定性确定所述至少一种抗恶性疟原虫HRP-II的抗体与所述样品中的抗原之间的结合。所述方法可以采用任何形式，并且可以例如非竞争性或竞争性的ELISA、RIA或磁性免疫测定、凝集测定和基于表面等离子共振的测定如Biacore测定。

在本文中，生物样品可以指处于健康和/或病理状态的生物组织、细胞或流体如体液的样品。在一些实施方案中，所述生物样品来自怀疑感染疟疾的受试者。在一些实施方案中，所述生物样品可以是体液样品，如脑脊液、尿液、唾液、血液等样品。

在一些实施方案中，本文提供测试或诊断装置或相关试剂盒，其可以包括：

(i)能够结合HRP-II抗原的抗恶性疟原虫HRP-II的抗体；和

(II)当所述抗原结合所述抗恶性疟原虫HRP-II的抗体时指示的指示剂。

在一些实施方案中，试剂盒还可以包括除本发明的抗恶性疟原虫HRP-II的抗体外针对疟原虫其他抗原的抗体，例如用于鉴别不同疟原虫感染。在一些实施方案中，其他抗原包括例如恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和/或卵形疟原虫特异性抗原或共有抗原，例如醛缩酶，例如乳酸脱氢酶PLDH，例如疟原虫属乳酸脱氢酶PLDH或疟原虫种特异性乳酸脱氢酶PLDH，例如疟原虫谷氨酸脱氢酶PGDH，LSA-1、LSA-3、LSA-5、SALSA、STARP、TRAP、PfEXP1、CS、MSP-3-1、MSP-3-2、MSP-3-5、MSP-3-6、MSP1、MSP2、MSP4、MSP5、AMA-1、SERP和GLURP。

在一些实施方案中，所述试剂盒可以包括测试条或测试卡，来自于所述受试者的所述液体样品放置到所述测试条上，或者ELISA测定板，所述ELISA测定板具有其中可放置来自于单个受试者的液体样品的孔。在一些实施方案中，所述试剂盒可以包括配置用于流式细胞仪、生物分析仪、生物传感器中的测试装置。

在一些实施方案中，所述试剂盒为快速诊断(RDT)试剂盒，例如应用薄膜免疫层析的试剂盒，例如采用胶体金法的薄膜免疫层析的试剂盒，例如包含固相支持物如膜支持物，将结合疟原虫抗原的抗体或其抗原结合片段，抗体偶联物，或融合蛋白以及任选的对照抗体固定到所述固相支持物。在一些实施方案中，所述试剂盒如快速诊断(RDT)试剂盒可以包括测试条或测试卡，所述测试条或测试卡可以包括样品垫、与所述样品垫邻接的含有疟原虫抗体(可以包括一种或多种抗体，如本文描述的抗恶性疟原虫HRP-II的抗体和针对疟原虫其他抗原的抗体，所述抗体可以具有可检测标记如胶体金)的标记垫、与标记垫邻接的膜如纤维素膜和邻接的吸水垫。在一些实施方案中，所述膜上可以设置相互分离的检测线和质控线，所述检测线含有与标记抗体结合不同表位的疟原虫特异性抗体，所述质控线可以含有能与所述标记抗体特异性结合的抗体。在一些实施方案中，测试条或测试卡可以包括支持物、样品垫、标记垫、膜如硝酸纤维素膜、吸收垫、一条或多条检测线、及质控线，所述样品垫、所述标记垫、所述硝酸纤维素膜及所述吸收垫从所述支持物的一端向另一端依次设置，所述样品垫与所述标记垫部分重叠，所述标记垫与所述硝酸纤维素膜部分重叠，所述硝酸纤维素膜与所述吸收垫部分重叠，所述一条或多条检测线和所述质控线分别间隔设在所述硝酸纤维素膜上，所述标记垫上可以包被有可检测标记如胶体金标记的疟原虫抗体，所述一条或多条检测线可以含有与标记抗体结合不同表位的疟原虫特异性抗体，所述质控线可以含有能与所述标记抗体特异性结合的抗体。

在一些实施方案中，本发明提供一种试剂盒，其包含可用于诊断疟原虫感染的材料。在一些实施方案中，该试剂盒包括容器和在容器上或与容器一起的标签或包装说明书。在一些实施方案中，适合的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器等。所述容器可以由各种材料如玻璃或塑料制成。容器装有组合物，所述组合物是单独地或与可有效用于诊断疟原虫感染的另一种组合物结合。组合物中至少一种活性试剂是本文的抗恶性疟原虫HRP-II的抗体。此外，所述试剂盒可以包含：(a)其中包含组合物的第一容器，其中所述组合物包含本文的抗恶性疟原虫HRP-II的抗体；和(b)其中包含组合物的第二容器，其中所述组合物包含第二抗体和/或其它相关试剂。在一些实施方案中，试剂盒中可以包括除本发明的抗恶性疟原虫HRP-II的抗体外针对疟疾其他抗原的抗体，例如用于鉴别不同疟原虫感染。本发明的试剂盒还可以包括包装说明书，所述包装说明书指明所述组合物可以用于诊断所述疾病或感染。所述试剂盒还可以包括第二或第三容器，所述第二或第三容器包含缓冲剂，如注射用水，磷酸盐缓冲盐水，葡萄糖溶液，还可以包括其他材料，如其他缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。

在一些实施方案中，本文提供包括所述抗恶性疟原虫HRP-II的抗体的试剂盒，如微量滴定板(其上可以包被有所述抗恶性疟原虫HRP-II的抗体)。在一些实施方案中，微量滴定板可以包含滴定孔如聚苯乙烯微量滴定孔，这些加样孔包被抗恶性疟原虫HRP-II的抗体、或疟原虫感染的完整细跑、或其细胞裂解物。

在一些实施方案中，本文提供用于确定例如感染疟原虫的受试者的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种本发明的抗恶性疟原虫HRP-II的抗体，相关的缓冲剂，用于使液体样品与所述抗恶性疟原虫HRP-II的抗体反应所需的试剂，以及用于确定抗体和所述抗恶性疟原虫HRP-II的抗体之间存在阳性或阴性结合反应的试剂。这种试剂盒可以包括用于分离和/或储存液体样品的容器，用于使所述抗恶性疟原虫HRP-II的抗体与样品接触的容器和试剂，以及用于确定抗恶性疟原虫HRP-II的抗体与样品中的成分之间的结合存在的试剂。为了确定抗体的存在，所述试剂盒可以例如利用带有第二标记的抗体或抗原(双抗原夹心法)，其中所述标记可以是任何合适的标记，如荧光或放射性标记、酶标记或结合标记，如用于结合链霉亲和素的生物素标记。在试剂盒中，抗恶性疟原虫HRP-II的抗体可以与固体支持物结合，或者所述试剂盒至少可以包括适于结合所述抗恶性疟原虫HRP-II的抗体的固体支持物。

在一些实施方案中，试剂盒的HRP-II抗体可为液体溶液形式、附着于固体支持物上的形式、或为干燥粉剂。当HRP-II抗体试剂为一种液体溶液时，该液体溶液可以是水溶液。当试剂是附着于固体支持物上的形式时，优选的固体支持物可以是层析介质如薄膜、测试条、塑料珠或平板、或显微镜栽玻片。当试剂为一种干燥粉剂时，通过加入适当溶剂可重构粉剂。在一些实施方案中，试剂盒可进一步包括一种包含适当溶剂的容器。

在一些实施方案中，试剂盒包括一种容器，其中包括定量的第二抗体，如偶联碱性磷酸酶的第二抗体，以及第二个容器，其中包括一定量的缓冲液。在其它实施方案中，试剂盒可进一步包括第三个容器，它包括适当的底物，如用于碱性磷酸酶的PNPP，或用于过氧化物酶的底物。第四个容器可以包括一种适当的“终止”缓冲剂。

实施例

1.表达质粒构建

本实施例中限制性内切酶、Prime Star DNA聚合酶购自Takara公司。MagExtractor-RNA提取试剂盒购自TOYOBO公司。BD SMART^TM RACE cDNA AmplificationKit 试剂盒购自Takara公司。pMD-18T载体购自Takara公司。质粒提取试剂盒购自天根公司。引物合成和基因测序由Invitrogen公司完成。分泌Anti-HRP-II 7G11单克隆抗体的杂交瘤细胞株为已有的杂交瘤细胞株。由MA-HRPII Ag蛋白(MyBioSource，MBS319418)免疫小鼠后的脾细胞与SP 2/0细胞进行融合筛选获得，将细胞从液氮中快速复苏后加入完全培养基(20％胎牛血清+80％RPMI 1640)中进行培养备用。

1.1、引物

扩增Heavy Chain和Light Chain 5’RACE引物：

1.2、抗体可变区基因克隆及测序

从分泌Anti-HRP-II 7G11单克隆抗体的杂交瘤细胞株中提取中RNA，按照制造商建议的方案，用SMARTER^TM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒及试剂盒中的SMARTER IIA Oligonucleotide和5′-CDS引物进行第一链cDNA合成，获得的第一链cDNA产物作为PCR扩增模板。Light Chain基因以Universal Primer A Mix(UPM)、Nested Universal Primer A(NUP)和mIg-LR引物进行扩增，Heavy Chain基因以Universal Primer A Mix(UPM)、NestedUniversal Primer A(NUP)和mIg-HR引物进行扩增。其中Light Chain的引物对扩增出0.7KB左右的目的条带，Heavy Chain的引物对扩增出1.8KB左右的目的条带。用琼脂糖凝胶电泳纯化回收，产物用rTaq DNA聚合酶进行加A反应后插入到pMD-18T载体中，转化到DH5α感受态细胞中，长出菌落后分别取Heavy Chain及Light Chain基因克隆4个克隆送Invitrogen公司进行测序。

1.3、Anti-HRP-II 7G11抗体可变区基因的序列分析

将上述测序得到的基因序列放在IMGT抗体数据库中进行分析，并利用VNTI11.5软件进行分析确定重链和轻链引物对扩增出的基因都是正确的，其中Light Chain扩增出的基因片段中，VL基因序列为396bp，属于VkII基因家族，其前方有60bp的前导肽序列；HeavyChain引物对扩增出的基因片段中，VH基因序列为396bp，属于VH1基因家族，其前方有57bp的前导肽序列。抗体序列如SEQ ID NOs：35-38所示。

1.4、重组抗体表达质粒的构建

pcDNA^TM 3.4

vector为构建的重组抗体真核表达载体，购自ThermoScientific。该表达载体已经引入HindIII、BamHI、EcoRI等多克隆酶切位点，并命名为pcDNA3.4A表达载体，后续简称3.4A表达载体；根据上述pMD-18T中抗体可变区基因测序结果，设计Anti-HRP-II 7G11的VL和VH基因特异性引物，两端分别带有HindIII、EcoRI酶切位点和保护碱基，引物如下：

通过PCR扩增方法扩出0.72KB的Light Chain基因片段和1.764kb的Heavy Chain基因片段。Heavy Chain和Light Chain基因片段分别采用HindIII/EcoRI双酶切，3.4A载体采用HindIII/EcoRI双酶切，将片段和载体纯化回收后Heavy Chain基因和Light Chain基因分别连接3.4A表达载体中，分别得到Heavy Chain和Light Chain的重组表达质粒。

2.稳定细胞株筛选

2.1重组抗体表达质粒瞬时转染CHO细胞，确定表达质粒活性

将上述实施例1中构建好的含有抗体轻重链DNA的3.4A重组表达质粒用超纯水稀释至400ng/ml，调节CHO细胞1.43×10⁷cells/ml于离心管中，100μl质粒与700μl细胞混合，转入电转杯，电转，转入10ml含CD CHO AGT(Thermo Scientific)培养基中，37℃摇床中培养(8％CO₂、震幅115～200rpm)；第3、5、7天取样计数，第7天收样检测。

用50mM碳酸盐缓冲液稀释HRP-II到指定浓度，每孔100uL，4℃过夜包被；次日，用PBST洗涤液清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120uL，37℃，1h，拍干；加入稀释后的细胞上清，100uL/孔，37℃，30min(部分上清1h)；用PBST洗涤液清洗5次，拍干；加入羊抗鼠IgM-HRP(公司自产Abcam，ab97019)，每孔100uL，37℃，30min；用PBST洗涤液清洗5次，拍干；加入过氧化脲(50uL/孔)、四甲基联苯胺(50uL/孔)，进行显色10min；加入稀盐酸终止反应，50uL/孔；酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。

注：对照品从100ng/ml始依次进行2倍倍比稀释，空白孔无对照品

从上表结果见，构建的3.4A重组表达质粒瞬转后产生的抗体对HRP-II蛋白具有活性。

2.2重组抗体表达质粒线性化

准备下述试剂：Buffer 50ul、DNA 100ug/管、Puv I酶10ul、无菌水补至500ul，37℃水浴酶切过夜；先用等体积酚/氯仿/异戊醇(下层)25∶24∶1，再用氯仿(水相)依次进行抽提；0.1倍体积(水相)3M醋酸钠和2倍体积乙醇冰上沉淀，70％乙醇漂洗沉淀，去除有机溶剂，待乙醇挥发完全用适量的灭菌水进行复融，最后进行浓度的测定。

2.3重组抗体表达质粒稳定转染，加压筛选稳定细胞株

将上述Heavy Chain和Light Chain的重组表达质粒用超纯水稀释至400ng/ml，调节CHO细胞1.43×10⁷cells/ml于离心管中，100ul质粒与700ul细胞混合，转入电转杯，电转，次日计数；25umol/LMSX 96孔加压培养约25天。

显微镜下观察标记长有细胞的克隆孔，并记录汇合度；取培养上清，送样检测；挑选抗体浓度、相对浓度高的细胞株转24孔，3天左右转6孔；3天后保种批培，调整细胞密度0.5×106cells/ml，2.2ml进行批培养，细胞密度0.3×10⁶cells/ml，2ml进行保种；7天6孔批培上清送样检测，挑选抗体浓度及细胞直径较小的细胞株转TPP保种传代。

3.重组抗体生产

3.1细胞扩培

细胞复苏之后先在125ml规格的摇瓶中培养，接种体积为30ml，培养基为100％Dynamis培养基，放置于转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％的摇床中。培养72h，以50万cells/ml接种密度接种扩培，扩培体积根据生产需求进行计算，培养基为100％Dynamis培养基。之后每72h扩培一次。当细胞量满足生产需求时，严格控制接种密度为50万cells/ml左右进行生产。

3.2摇瓶生产及纯化

摇瓶参数：转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％。流加补料：在摇瓶中培养至少72h时开始每天补料，HyCloneTM Cell BoostTM Feed 7a每天流加初始培养体积的3％，Feed 7b每天流加量为初始培养体积的千分之一，一直补到第12天(第12天补料)。葡萄糖在第六天补加3g/L。第13天收样。用proteinA亲和层析柱进行亲和纯化。取4μg纯化的抗体进行还原性SDS-PAGE，4μg外来对照抗体作为对照，电泳图如图所示。在还原性SDS-PAGE后显示两条带，1条Mr为70KD(重链)，另一条Mr为28KD(轻链)。结果见图1，泳道1、2均为4ug上样量。

3.3亲和力分析

以活性鉴定相同方式酶免间接法做数据，包被做四个梯度1ug/ml、0.5ug/ml、0.25ug/ml、0.125ug/ml；抗体从1000ng/ml开始2倍梯度稀释至0.977ng/ml上样。得出不用包被浓度下不同抗体浓度对应的OD值。在同一包被浓度下，以抗体浓度为横坐标，OD值为纵坐标，对数作图，根据拟合方程计算出50％最大OD值时的抗体浓度；带入公式：K＝(n-1)/(2*(n*Ab′-Ab))计算出亲和力常数的倒数，其中Ab和Ab`分别表示对应包被浓度(Ag、Ag`)下50％最大OD值时的抗体浓度，n＝Ag/Ag`；每两个包被浓度可以组合计算出一个K值，最后可得六个K值，取其平均数值，再求其倒数则为亲和力常数KD。

纯化后的Anti-HRP-II 7G11单抗亲和力分析数据

样品	KD
		HRP II 7G11	1.312E-09

3.4活性鉴定

用50mM碳酸盐缓冲液包被液稀释MA-HRPII Ag重组MA蛋白(MyBioSource，MBS319418)(自产150520-1)到1ug/ml进行微孔板包被，每孔100uL，4℃过夜；次日，洗涤液用PBST清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120uL，37℃，1h，拍干；加入稀释后的HRPII单克隆抗体，从1000ng/ml始进行5倍倍比稀释，上样，100uL/孔，37℃，30min(部分上清1h)；用PBST洗涤液清洗5次，拍干；加入羊抗鼠IgM-HRP，每孔100uL，37℃，30min；用PBST洗涤液清洗5次，拍干；加入过氧化脲(50uL/孔)，加入四甲基联苯胺(50uL/孔)，10min；加入稀盐酸终止反应，50uL/孔；酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值.

纯化后的Anti-HRP-II 7G11单抗活性鉴定

样品ng/ml	111.11	37.04	12.35	4.12	1.37	0
							HRP II 7G11	2.025	1.084	0.427	0.186	0.050	0.046

提供抗恶性疟原虫HRP-II单克隆抗体序列，通过重组抗体技术获得具有活性且亲和力较高的Anti-HRP-II单克隆抗体，其有利地具备下述优势：

1)与杂交瘤技术相比，CHO细胞株更稳定，在传代、冻存与复苏的过程中不易丢失抗体分泌能力，更易于珍贵细胞株的保存。

2)成功构建抗HRP-II重组抗体的表达载体，可在CHO细胞进行表达并具有生物活性。与杂交瘤技术相比，CHO细胞株的重组抗体表达产量可达2g/L左右，大量生产时成本较低；此外，细胞株更稳定，生产稳定性好，批间差更小，纯化难度更小，成本更少。

3)采用重组抗体技术，构建能特异性识别恶性疟HRP-II蛋白抗原表位的表达载体，生产一种特异性的单克隆抗体，减少非特异性反应的发生，提高检测恶性疟的特异性。

3.对上述实施例得到的抗体(具有序列如SEQ ID NO：20以及18所示的轻链和重链，作为WT)的轻链CDR及重链CDR进行突变。

经分析，重链的互补决定区(WT)：

CDR-VH1为G-Y-X1(T)-F-X2(G)-S-Y-W；

CDR-VH2为N-X1(V)-Y-P-G-S-X2(N)-T-N-Y-X3(E)-E-N-F；

CDR-VH3为T-G-X1(H)-W-X2(E)-Y-X3(F)-G；

轻链的互补决定区：

CDR-VL1为K-S-L-X1(I)-H-S-N-X2(A)-D-T-X3(F)-L-F；

CDR-VL2为I-Y-X1(R)-M-S-N-X2(I)-A-X3(T)-G；

CDR-VL3为M-X1(N)-H-L-E-Y-P-X2(V)-T-X3(W)-G；

其中，X1、X2、X3均为突变位点。

突变位点设计

在突变后对抗体活性进行检测，包被液稀释MA-HRPII Ag蛋白(菲鹏生物，150520-1)到lug/ml进行微孔板包被，每孔100uL，4℃过夜；次日，洗涤液清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120uL，37℃，1h，拍干；加入稀释后的Anti-HRP-II 7G11单克隆抗体，100uL/孔，37℃，30min(部分上清1h)；洗涤液清洗5次，拍干；加入羊抗鼠IgG-HRP，每孔100uL，37℃，30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入过氧化脲(50uL/孔)、四甲基联苯胺(50uL/孔)进行显色10min；加入稀盐酸终止反应，50uL/孔；酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。部分结果如下：

抗体活性分析数据

“-”代表无活性。

从上表可知，突变1和突变2的活性较好，尤其突变1活性最好。进一步以突变1作为骨架序列筛选效价较好的突变位点(保证筛选得到的抗体活性与突变1相近，抗体活性±10％)，部分结果如下。

效价较好的突变位点列表

亲和力分析

以活性鉴定相同方式酶免间接法做数据，包被做四个梯度0.5ug/ml、0.25ug/ml、0.125ug/ml、0.0625ug/ml；抗体从100ng/ml开始2倍梯度稀释至0.195ng/ml上样。得出不同包被浓度下不同抗体浓度对应的OD值。在同一包被浓度下，以抗体浓度为横坐标，OD值为纵坐标，对数作图，根据拟合方程计算出50％最大OD值时的抗体浓度；带入公式：K＝(n-1)/(2^*(n^*Ab′-Ab))计算出亲和力常数的倒数，其中Ab和Ab`分别表示对应包被浓度(Ag、Ag`)下50％最大OD值时的抗体浓度，n＝Ag/Ag`；每两个包被浓度可以组合计算出一个K值，最后可得六个K值，取其平均数值，再求其倒数则为亲和力常数KD。

筛选的突变抗体的亲和力分析数据

因此，筛选得到的突变位点对抗体的亲和力影响不大。为验证上述结果，以WT作为骨架序列重复上述实验，进行突变位点的亲和力验证，部分结果如下。

以WT为骨架进行的突变

亲和力分析数据

	KD(M)
		WT	1.312E-9
WT 1-1	8.326E-10
		WT 1-2	6.219E-10
WT 1-3	6.655E-10
		WT 1-4	5.143E-10
WT 1-5	1.753E-9

从上述结果可见，在保证具有抗体活性的前提下，上述突变位点与其他位点的关联也不大。

相关序列说明：

CDR-VH1.G-Y-X1-F-X2-S-Y-W(SEQ ID NO.1)

其中：

X1是T或S；

X2是G、P或A；

CDR-VH2.N-X1-Y-P-G-S-X2-T-N-Y-X3-E-N-F(SEQ ID NO.2)

其中：

X1是L、V或I；

X2是GG或N；

X3是E或D，优选D；

CDR-VH3.T-G-X1-W-X2-Y-X3-G(SEQ ID NO.3)

其中：

X1是Q、H或N；

X2是D或E；

X3是W或F，优选W；

CDR-VL1.K-S-L-X1-H-S-N-X2-D-T-X3-L-F(SEQ ID NO.4)

其中：

X1是I、V或L；

X2是G、A或P；

X3是F或Y，优选Y；

CDR-VL2.I-Y-X1-M-S-N-X2-A-X3-G(SEQ ID NO.5)

其中：

X1是R或K；

X2是I、V或L；

X3是T或S，优选S；

CDR-VL3.M-X1-H-L-E-Y-P-X2-T-X3-G(SEQ ID NO.6)

其中：

X1是N或Q；

X2是I、V或L；

X3是W或F，优选F；

序列描述：

Claims (42)

1.抗体或其抗原结合片段，所述抗体结合恶性疟原虫富组氨酸蛋白-II，即HRP-II，其中所述抗体的重链CDR1，重链CDR2，重链CDR3，轻链CDR1，轻链CDR2，和轻链CDR3如下：

重链CDR1，其序列为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列G-Y-X1-F-X2-S-Y-W，其中X1是T或S；X2是G、P或A；

重链CDR2，其序列为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列N-X1-Y-P-G-S-X2-T-N-Y-X3-E-N-F，其中X1是L、V或I；X2是GG或N；X3是D；和

重链CDR3，其序列为SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列T-G-X1-W-X2-Y-X3-G，其中X1是Q、H或N；X2是D或E；X3是W；

轻链CDR1，其序列为SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列K-S-L-X1-H-S-N-X2-D-T-X3-L-F，其中X1是I、V或L；X2是G、A或P；X3是Y；

轻链CDR2，其序列为SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列I-Y-X1-M-S-N-X2-A-X3-G，其中X1是R或K；X2是I、V或L；X3是S；和

轻链CDR3，其序列为SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列M-X1-H-L-E-Y-P-X2-T-X3-G，其中X1是N或Q；X2是I、V或L；X3是F，

其中所述抗体以2x10^-9 M或更小的KD结合HRP-II蛋白，其中所述抗原结合片段选自Fab，Fab'，F(ab')₂，Fd，Fv，互补决定区(CDR)片段，单链抗体，双价抗体或结构域抗体。

2.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体以10^-10M或更小的KD结合HRP-II蛋白。

3.抗体或其抗原结合片段，所述抗体结合恶性疟原虫富组氨酸蛋白-II，即HRP-II，其中所述抗体的重链CDR1，重链CDR2，重链CDR3，轻链CDR1，轻链CDR2，和轻链CDR3如下：

重链CDR1，其氨基酸序列为G-Y-X1-F-X2-S-Y-W

重链CDR2，其氨基酸序列为N-X1-Y-P-G-S-X2-T-N-Y-D-E-N-F；和

重链CDR3，其氨基酸序列为T-G-X1-W-X2-Y-W-G；

轻链CDR1，其氨基酸序列为K-S-L-X1-H-S-N-X2-D-T-Y-L-F；

轻链CDR2，其氨基酸序列为I-Y-X1-M-S-N-X2-A-S-G；和

轻链CDR3，其氨基酸序列为M-X1-H-L-E-Y-P-X2-T-F-G，

其中，所述抗体包含下表所示的氨基酸残基置换组合：

其中所述抗原结合片段选自Fab，Fab'，F(ab')₂，Fd，Fv，互补决定区(CDR)片段，单链抗体，双价抗体或结构域抗体。

4.抗体或其抗原结合片段，所述抗体结合恶性疟原虫富组氨酸蛋白-II，即HRP-II，其中所述抗体的重链CDR1，重链CDR2，重链CDR3，轻链CDR1，轻链CDR2，和轻链CDR3如下：

重链CDR1，其氨基酸序列为G-Y-X1-F-X2-S-Y-W

重链CDR2，其氨基酸序列为N-X1-Y-P-G-S-X2-T-N-Y-E-E-N-F；和

重链CDR3，其氨基酸序列为T-G-X1-W-X2-Y-F-G；

轻链CDR1，其氨基酸序列为K-S-L-X1-H-S-N-X2-D-T-F-L-F；

轻链CDR2，其氨基酸序列为I-Y-X1-M-S-N-X2-A-T-G；和

轻链CDR3，其氨基酸序列为M-X1-H-L-E-Y-P-X2-T-W-G，

其中，所述抗体包含下表所示的氨基酸残基置换组合：

其中所述抗原结合片段选自Fab，Fab'，F(ab')₂，Fd，Fv，互补决定区(CDR)片段，单链抗体，双价抗体或结构域抗体。

5.权利要求1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体还包含重链可变区的框架区FR-H1，FR-H2，FR-H3和FR-H4，和轻链可变区的框架区FR-L1，FR-L2，FR-L3和FR-L4，其中

FR-H1包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:27所示的序列具有至少90％序列同一性的序列，或由其列组成；

FR-H2包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列或与SEQ ID NO:28所示的序列具有至少90％序列同一性的序列，或由其组成；

FR-H3包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列或与SEQ ID NO:29所示的序列具有至少90％序列同一性的序列，或由其组成；

FR-H4包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:30所示的序列具有至少90％序列同一性的序列；和

FR-L1包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列或与SEQ ID NO:31所示的序列具有至少90％序列同一性的序列，或由其组成；

FR-L2包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列或与SEQ ID NO:32所示的序列具有至少90％序列同一性的序列，或由其组成；

FR-L3包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列或与SEQ ID NO:33所示的序列具有至少90％序列同一性的序列，或由其组成；

FR-L4包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列或与SEQ ID NO:34所示的序列具有至少90％序列同一性的序列，或由其组成。

6.权利要求1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含：

(i)重链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：

SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:17所示的序列具有至少90％序列同一性的序列，和

(II)轻链可变区，其包含下述序列或由下述序列组成：

SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:19所示的序列具有至少90％序列同一性的序列。

7.权利要求3-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体以10^-10M或更小的KD结合HRP-II蛋白。

8.权利要求1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体以小于100nM的EC50结合HRP-II蛋白。

9.权利要求1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体以小于10nM的EC50结合HRP-II蛋白。

10.权利要求1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体以小于1nM的EC50结合HRP-II蛋白。

11.分离的多肽，其选自以下各项组成的组：

(1)分离的多肽，其包含SEQ ID NO:21，22和23所示的重链CDR1、重链CDR2、和重链CDR3序列，其中所述多肽作为抗HRP-II的抗体的重链，所述抗体特异性结合HRP-II，所述抗体还包含SEQ ID NO:24，25和26所示的轻链CDR1、轻链CDR2、和轻链CDR3序列；

(2)分离的多肽，其包含SEQ ID NO:24，25和26所示的轻链CDR1、轻链CDR2、和轻链CDR3序列，其中所述多肽作为抗HRP-II的抗体的轻链，所述抗体特异性结合HRP-II，所述抗体还包含SEQ ID NO:21，22和23所示的重链CDR1、重链CDR2、和重链CDR3序列；

(3)分离的多肽，其包含SEQ ID NO:17所示的重链可变区序列，其中所述多肽作为抗HRP-II的抗体重链，所述抗体特异性结合HRP-II，所述抗体还包含SEQ ID NO:19所示的轻链可变区序列；

(4)分离的多肽，其包含SEQ ID NO:19所示的轻链可变区序列，其中所述多肽作为抗HRP-II的抗体的轻链，所述抗体特异性结合HRP-II，所述抗体还包含SEQ ID NO:17所示的重链可变区序列；

(5)分离的多肽，其包含SEQ ID NO:18所示的重链序列，其中所述多肽作为抗HRP-II的抗体的重链，所述抗体特异性结合HRP-II，所述抗体还包含SEQ ID NO:20所示的轻链序列；

(6)分离的多肽，其包含SEQ ID NO:20所示的轻链序列，其中所述多肽作为抗HRP-II的抗体的轻链，所述抗体特异性结合HRP-II，所述抗体还包含SEQ ID NO:18所示的重链序列。

12.分离的多核苷酸，其编码权利要求1-10任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求11中所述的分离的多肽。

13.载体，其包含权利要求12所述的分离的多核苷酸。

14.宿主细胞，其包含权利要求12所述的分离的多核苷酸或权利要求13所述的载体。

15.制备权利要求1-10任一项所述抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括培养权利要求14所述的宿主细胞。

16.抗体偶联物，其包含权利要求1-10任一项所述的抗体或其抗原结合片段以及与其偶联的偶联部分。

17.权利要求16所述的抗体偶联物，其中所述偶联部分包括纯化标签或可检测的标记。

18.权利要求16所述的抗体偶联物，其中所述偶联部分包括His标签、胶体金、放射性标记、发光物质、有色物质、酶、生物素/抗生物素蛋白或自旋标记。

19.权利要求16所述的抗体偶联物，其中所述偶联部分包括荧光标记，发色团标记，电子致密标记，或放射性同位素。

20.权利要求16所述的抗体偶联物，其中所述偶联部分包括荧光团，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。

21.权利要求16所述的抗体偶联物，其中所述偶联部分包括罗丹明及其衍生物，荧光素酶，糖类氧化酶，或荧光素。

22.试剂盒或诊断剂，其包括权利要求1-10任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求16-21任一项所述的抗体偶联物。

23.权利要求22所述的试剂盒或诊断剂，其中所述试剂盒或诊断剂还包含结合除HRP-II以外的疟原虫抗原的抗体或其抗原结合片段，抗体偶联物，或融合蛋白。

24.权利要求23所述的试剂盒或诊断剂，其中所述除HRP-II以外的疟原虫抗原包括恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和/或卵形疟原虫特异性抗原或共有抗原。

25.权利要求23所述的试剂盒或诊断剂，其中除HRP-II以外的疟原虫抗原包括醛缩酶，乳酸脱氢酶PLDH，疟原虫谷氨酸脱氢酶PGDH，疟原虫抗原LSA-1、LSA-3、LSA-5、SALSA、STARP、TRAP、PfEXP1、CS、MSP-3-1、MSP-3-2、MSP-3-5、MSP-3-6、MSP1、MSP2、MSP4、MSP5、AMA-1、SERP和GLURP。

26.权利要求23所述的试剂盒或诊断剂，其中除HRP-II以外的疟原虫抗原包括疟原虫属乳酸脱氢酶PLDH或疟原虫种特异性乳酸脱氢酶PLDH。

27.权利要求22所述的试剂盒或诊断剂，其中所述试剂盒或诊断剂还包括另外一种或多种抗体，其特异性识别权利要求1-10任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求16-21任一项所述的抗体偶联物；和/或特异性识别结合除HRP-II以外的疟原虫抗原的抗体或其抗原结合片段，抗体偶联物，或融合蛋白。

28.权利要求27所述的试剂盒或诊断剂，其中所述另外一种或多种抗体还包括可检测的标记。

29.权利要求28所述的试剂盒或诊断剂，其中所述可检测的标记包括胶体金、放射性标记、发光物质、有色物质、酶、生物素/抗生物素蛋白或自旋标记。

30.权利要求28所述的试剂盒或诊断剂，其中所述可检测的标记包括荧光标记，发色团标记，电子致密标记，或放射性同位素。

31.权利要求28所述的试剂盒或诊断剂，其中所述可检测的标记包括荧光团，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖类氧化酶，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。

32.权利要求28所述的试剂盒或诊断剂，其中所述可检测的标记包括括罗丹明及其衍生物，荧光素酶，或荧光素。

33.权利要求22所述的试剂盒或诊断剂，其中所述试剂盒为快速诊断(RDT)试剂盒。

34.权利要求22所述的试剂盒或诊断剂，其中所述试剂盒为应用薄膜免疫层析的试剂盒，或采用胶体金法的薄膜免疫层析的试剂盒。

35.权利要求22所述的试剂盒或诊断剂，其中所述试剂盒包含固相支持物。

36.权利要求22所述的试剂盒或诊断剂，其中所述试剂盒包含膜支持物。

37.权利要求35或36所述的试剂盒或诊断剂，其中将结合疟原虫抗原的抗体或其抗原结合片段，抗体偶联物，或融合蛋白以及任选的对照抗体固定到所述固相支持物。

38.权利要求22所述的试剂盒或诊断剂，其中试剂盒为酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒，间接免疫荧光测定(IFA)试剂盒，或放射免疫测定(RIA)试剂盒。

39.权利要求1-10任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求16-21任一项所述的抗体偶联物在制备诊断剂或试剂盒中的用途，所述诊断剂或试剂盒用于1)检测HRP-II在样品中的存在或其水平，2)诊断恶性疟原虫感染，和/或3)鉴别诊断恶性疟原虫感染与其他疟原虫感染。

40.权利要求39所述的用途，其中所述样品包括组织、细胞或流体样品。

41.权利要求39所述的用途，其中所述样品包括体液的样品。

42.权利要求39所述的用途，其中所述样品包括脑脊液、尿液、唾液、血液样品。

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