JP2015504683A - リゾチームのタグとしての使用 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)対象となるタンパク質をコードする遺伝子が発現する条件下で宿主細胞を培養するステップと;
(b)このタンパク質、ペプチド、又はアミノ酸を単離するステップと;
を具える。
(a)本発明に係るベクター;
(b)リゾチームに特異的な抗体;
(c)選択的に、ここに記載した方法によるベクターと抗体の使用指示書;
を具えるキットを提供する。
(a)宿主細胞中に誘導タンパク質を発現させるステップと、
(b)この融合タンパク質を単離するステップと、
を具え、この融合タンパク質のポリペプチドドメインの一つがリゾチームである。
(a)宿主細胞中に融合タンパク質を発現させるステップと、
(b)この融合タンパク質を宿主細胞と培地から単離するステップと、
を具え、この融合タンパク質のポリペプチドドメインの一つがリゾチームであり、ステップ(a)の融合タンパク質の収率が、リゾチームポリペプチドドメインを含まないタンパク質の収率に比べて、少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍より高い。
(a)宿主細胞中に融合タンパク質を発現させるステップと、
(b)この融合タンパク質を宿主細胞と培地から単離するステップと、
を具え、この融合タンパク質のポリペプチドドメインの一つがリゾチームであり、ステップ(a)で発現した融合タンパク質が、凝集又は封入体を形成しない。
(a)宿主細胞中に誘導タンパク質を発現させるステップであって、融合タンパク質が対象となるポリペプチド又はタンパク質とリゾチームを含むステップと、
(b)この融合タンパク質を単離するステップと、
を具える。
(a)宿主細胞中に誘導タンパク質を発現させるステップであって、融合タンパク質が対象となるポリペプチド又はタンパク質とリゾチームを含むステップと、
(b)この融合タンパク質を宿主細胞と培地から単離するステップと、
を具える。
用語「ポリペプチド」は、ここでは、当業者に認識されている最も広い意味で使用されている。ポリペプチドは、ペプチド結合を介して結合された少なくとも二つのアミノ酸を含む。通常、ポリペプチドは30以上のアミノ酸を含む。
例えば、標準pcDNA3.1ベクター(Invitorogen)又はpMAX発現ベクター(図1、図2)などの真核発現ベクターであり、pcDNA3.1に基づいて改変した発現ベクターを用いて、本発明を実行した。pMAX発現ベクターは、効率のよいトランスクリプションと翻訳のために、例えば、複製源、抗生物質耐性、並びに調節配列(例えば、促進剤、強化材、ポリアデニル化部位)を含む。各融合パートナー又はタグ(例えば、リゾチーム、GST,His,Fc)を、標準サブクローニングを用いて、多重クローニング部位(MCS)の3’−末端に挿入した(図1)。図2では、ニワトリリゾチームを含むpMax発現構造のヌクレオチド配列が例示されている。
実施例1に係るベクターの様々な変異を精製して、特定のタグ(例えば、リゾチーム、GST,His,Fc)に融合した対象となる特定のたんぱく質をコードして、哺乳類宿主細胞の転写した。
3.1 8種のタンパク質を分析
対象となる8種類のタンパク質を、リゾチーム融合タンパク質として発現させ及び精製するために選択した。全てのタンパク質は哺乳類細胞株(例えば、HKB11)によって発現及び分泌され、細胞培地上澄から生成した。選択したタンパク質は、非常に発現率が低く、及び/又はFc−融合、GST−融合、あるいはHis−タグ化タンパク質として高い凝集を示した。反対に、リゾチームとの融合は、すべてのタンパク質について、発現率を高め、及び/又は、タンパク質の品質を大きく改善した。
タンパク質1は、哺乳類発現ベクターでコードされ、二つの異なるタグの特定の組み合わせに融合した。これによって、His−タグ又はリゾチームタグのいずれかを使用して、His−タグ(固定化金属親和性クロマトグラフィ、IMACを用いて)又はリゾチーム(セファロース4FFに結合したリゾチーム特異的抗体としてMOR3207を用いて)を介して生成を行った。His−タグを用いてはタンパク質1の発現が検出されなかったのに対して、リゾチームを用いた融合によって、タンパク質1を発現することができた(表1)。更に、リゾチーム特異的抗体を介した融合タンパク質の精製では、IMACを介した精製に比べて非常に大量のタンパク質を算出した。更に、精製したタンパク質の凝集は検出されなかった。
分析したタンパク質4、5、及び6は、発現率が強化されているだけではなく、リゾチーム融合タンパク質として発現されている場合に凝集が少ないことを示す。タンパク質4の発現は3倍以上増えており、タンパク質がHisに代えてリゾチームと融合している場合は、凝集が3倍以上低減された(表4)。
Claims (13)
- 単離した単量体ポリペプチド又はタンパク質を生成する方法において、当該方法が:
(a)前記単量体ポリペプチド又はタンパク質を宿主細胞中で融合タンパク質として発現させるステップであって、当該融合タンパク質が単量体ポリペプチド又はタンパク質、及びリゾチームを含んでおり、
(b)前記融合タンパク質を単離するステップ;
を具えることを特徴とする方法。 - 請求項1に記載の方法において、前記融合タンパク質の収率が、リゾチームを含まない単量体ポリペプチド又はタンパク質に比べて、少なくとも2倍高いことを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法において、前記単量体ポリペプチド又はタンパク質及びリゾチームを含む融合タンパク質の15%以下が凝集を形成することを特徴とする方法。
- 請求項1乃至3のいずれか1項に記載の方法において、前記宿主細胞が真核細胞又は原核細胞であることを特徴とする方法。
- 請求項1乃至4のいずれか1項に記載の方法において、前記宿主細胞が、前記単量体ポリペプチド又はタンパク質とリゾチームとを含む前記融合タンパク質をコードする発現ベクターで形質転換されていることを特徴とする方法。
- 請求項1乃至5のいずれか1項に記載の方法において、前記単量体ポリペプチド又はタンパク質が、少なくとも100アミノ酸長を有することを特徴とする方法。
- 請求項1乃至6のいずれか1項に記載の方法において、前記融合タンパク質が、前記宿主細胞、培地、又はその両方から単離されていることを特徴とする方法。
- 請求項7に記載の方法において、前記融合タンパク質が、リゾチームに特異的な抗体で単離されていることを特徴とする方法。
- 請求項1乃至8のいずれか1項に記載の方法において、前記リゾチームが哺乳類リゾチームであることを特徴とする方法。
- 請求項1乃至9のいずれか1項に記載の方法において、前記リゾチームが、リゾチームの断片、類似体、同族体、変異又は誘導体であることを特徴とする方法。
- ポリペプチド又はタンパク質とリゾチームを含む融合タンパク質をコードする発現ベクターと、リゾチームに特異的な抗体を含むことを特徴とするキット。
- 請求項11に記載のキットにおいて、前記リゾチームに特異的な抗体が、支持基体に付着していることを特徴とするキット。
- 請求項12に記載のキットにおいて、前記支持基体が、アガロース、セファロース、ポリアクリルアミド、アガロース/ポリアクリルアミドコポリマー、デキシトラン、セルロース、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ニトロセルロース、ガラス、紙、及び磁気粒子からなる群から選択されることを特徴とするキット。
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