KR20140122729A

KR20140122729A - 태그로서 리소자임의 용도

Info

Publication number: KR20140122729A
Application number: KR1020147023426A
Authority: KR
Inventors: 스테판 하엘트레; 세바스티안 자에거; 다니엘라 다우베르트
Original assignee: 모르포시스 아게
Priority date: 2012-01-23
Filing date: 2013-01-23
Publication date: 2014-10-20
Also published as: JP6215231B2; ES2582802T3; CA2860916A1; US9689014B2; JP2015504683A; HK1202298A1; CN104066745B; WO2013110627A1; US20140349343A1; EP2807179B1; CN104066745A; AU2013211651A1; AU2013211651C1; EP2807179A1; AU2013211651B2; IN2014DN06660A

Abstract

본 발명은 폴리펩티드 및 단백질을 발현 및 정제하는 방법을 제공한다. 본 발명에는 융합 파트너로서 리소자임의 용도가 개시된다. 또한, 리소자임-태깅된 폴리펩티드 및 단백질을 리소자임-특이적 항체에 의해서 단리하는 정제방법이 기술된다. 보다 상세하게는, 본 발명은 태그로서 리소자임을 사용함으로써 단량체 폴리펩티드 및 단백질을 발현 및 정제하는 방법을 제공한다.

Description

태그로서 리소자임의 용도{USE OF LYSOZYME AS A TAG}

본 발명은 태그로서 리소자임의 용도에 관한 것이다.

재조합 폴리펩티드 및 단백질의 발현 및 정제는 생명공학 연구에서 일상적인 방법이다. 일반적으로, 정제 방법은 원핵 또는 진핵 세포에서 바람직한 폴리펩티드의 발현에 이어서 숙주 세포의 다른 비-단백질성 및 단백질성 입자들로부터의 분리를 포함한다. 이에 의해서 다양한 타입의 크로마토그래피가 예를 들어, 크기, 전하 또는 소수성에 의해서 바람직한 분자를 정제하기 위해 사용된다.

한가지 추가의 특이적 전략은 관심이 있는 폴리펩티드에 융합되는 태그를 사용하는 것이다. 특이적인 태그는 관심이 있는 폴리펩티드의 폴딩(folding), 용해도, 안정성 및 발현을 지지하도록 사용될 수 있는 한편, 다른 태그들은 주로 정제를 위해서 사용된다. 이에 의해서, 바람직한 폴리펩티드는 원핵 또는 진핵 세포 내에서 융합 작제물로서 발현되고, 특이적인 항원 결합 모이어티(moiety)에 의해서 검출되는 융합된 태그에 의해 정제될 수 있다. 이러한 종류의 정제 전략을 친화도 크로마토그래피라 부른다.

과학계에서 사용되는 한가지 정제-태그는 예를 들어, His-태그이다. 이에 의해서, His-태그와 융합된 폴리펩티드는 예를 들어, His-태그에 대해 강력한 친화도를 갖는 고정화된 니켈 또는 코발트 이온을 갖는 정제 컬럼을 사용함으로써 분리될 수 있다. 그 후에, 단백질은 니켈 또는 코발트 결합에 대해 His-태그와 경쟁하는 이미다졸을 포함하는 용출 과정에서 컬럼으로부터 방출된다. 추가의 예는 Flag-태그 및 Strep-태그이며, 이들은 둘 다 관심이 있는 폴리펩티드에 융합되어 각각 예를 들어, 항체 또는 스트렙탁틴(Streptactin)과 같은 각각의 태그-특이적 항원 결합 모이어티를 위한 항원으로서 작용한다. 정제(예를 들어, 각각 Flag-태그, Strep-태그 또는 His-태그를 통한)를 위해서 사용되는 이들 결합 모이어티(예를 들어, 항체, 스트렙탁틴 또는 금속 이온)는 예를 들어, 고체 기질(예를 들어, 막, 비드) 상에 고정화될 수 있다. 정의된 태그에 대해 특이적인 결합 모이어티와 커플링된 이들 고체 기질은 용해물 또는 조건화 배지처럼 복잡한 샘플로부터 태깅된 폴리펩티드를 쉽게 포획하기 위해서 사용될 수 있다. 그러나, 짧은 펩티드인 Flag-, Strep- 및 His-태그는 때때로 특이적 폴리펩티드 또는 단백질의 3차원 구조 내에 접근할 수 없으며, 따라서 정제에 적합하지 않다. 추가로, Strep-태그를 통한 포유류 세포 배양 상등액으로부터의 정제는 대부분의 배지의 높은 비오틴 농도로 인해 손상된다.

특정한 더 큰 구형 태그는 단백질로서 발현하기 어려운 폴리펩티드의 폴딩, 용해도 및 발현을 지지할 수 있다. 대부분의 이용 가능한 유전자-융합-기술은 이. 콜라이(E. coli)에서의 발현 및 미정제 용해물로부터의 정제를 위해서 개발되었다. 이들 융합 단백질의 예는 MBP(말토스 결합 단백질), GST(글루타티온-S-트랜스퍼라제) 및 SUMO(소형 유비퀴틴 변형 단백질; 참조예: WO 03/057174)이다.

SUMO-태그는 원래는 원핵성 발현(예를 들어, SUMOpro™ 발현 키트, http://www.lifesensors.com)을 위해서 고안되었으며, 그 후에 포유류 발현(SUMOstar™ 발현 키트, http://www.lifesensors.com)을 위해서 추가 개발되었다. SUMO는 샤페론(chaperon), 및 관심이 있는 단백질의 용해도 및 발현 레벨을 개선시키기 위한 단백질 폴딩의 개시제 둘 모두로서 작용한다. 데수모일라제(desumoylase)를 사용함으로써, 관심이 있는 단백질의 N-말단에 융합된 SUMO 태그를 제거할 수 있고 그 결과 단백질의 천연 N-말단을 생성할 수 있다. 관심이 있는 단백질의 C-말단에 SUMO 태그를 융합하면, 융합 태그는 제거되지 않는다. SUMO 태그에 융합된 표적 단백질의 정제에는 SUMO 태그가 이용되지 않지만, His-태그와 같은 정제 태그의 적용을 필요로 한다.

포유류 발현을 위한 대안은 인간 IgG1의 힌지-영역, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 Fc-태그의 사용이다. Fc-태그는 특이적 폴리펩티드의 발현, 폴딩 및 분비를 지지하기 위해서 사용되며, 동시에 이의 정제를 위한 태그로도 사용된다. His- 및 Flag-태그는 저분자량을 갖는 짧은 펩티드이며 가용성 폴리펩티드 및 단백질의 발현에 매우 적합한 반면에, Fc-태그는 200개 아미노산을 초과하는 폴리펩티드이며, 특이적인 소수성의 가용성이 낮은 단백질의 발현을 지지한다. 그러나, 비교적 큰 Fc-부분은 이황화-가교된 응집체를 형성하여 단리 및 정제된 관심이 있는 단백질의 이량체 또는 다량체 형태를 초래한다.

그 밖의 다른 통상적인 대안은 각각 글루타티온 및 말토스에 결합하는 GST(글루타티온 S-트랜스퍼라제) 및 MBP(말토스 결합 단백질)이다. 두 태그 모두는 고분자량(>25 kDa)을 가지며, 관심이 있는 폴리펩티드 또는 단백질의 용해도 및 안정성을 상당히 증가시킨다. 그러나, 두 유전자-융합 시스템 모두는 조건화된 포유류 세포 배양 상등액으로부터의 분비된 단백질의 단백질 정제를 위해서 사용될 수 없는데, 이는 배지의 성분들이, 융합 태그가 이의 결합 파트너, 즉 글루타티온 또는 말토스에 결합하는 것을 방지하지 때문이다. 추가로, 두 융합 태그 모두는 포유류 발현 시스템에서 응집하는 경향을 가지며, 또한 봉입체(inclusion bodies)를 형성하는 경향이 있다.

따라서, 예를 들어 Fc-태그는 단량체 폴리펩티드 및 단백질의 발현 및 정제에 적합하지 않지만, 다른 모든 이용 가능한 태그들은 특이적인 이점 및 단점들을 갖고, 특정한 특이적인 폴리펩티드 또는 단백질의 발현 및/또는 정제에 적합하지 않다. 종합적으로, 발현 및 정제의 품질은 관심이 있는 폴리펩티드 또는 단백질의 성질뿐만 아니라 사용되는 각각의 태그에 좌우된다. 따라서, 특이적 태그와 관심이 있는 특이적 폴리펩티드 또는 단백질의 조합이 최상의 결과를 위해 중요하지만, 거의 예측하기가 어렵다. 결과적으로, 특이적인 도전적 재조합 폴리펩티드 및 단백질의 발현 및 정제를 가능하게 하거나 품질을 개선시킬 수 있는 신규하며 편리한 태그가 끊임없이 요구되고 있다. 본 출원에 개시된 방법은 태그로서 리소자임을 사용함으로써 폴리펩티드 또는 단백질을 발현시키고 정제하는 효율적인 방식을 제공한다.

본 발명의 목적은 폴리펩티드 및 단백질을 발현 및 정제하는 방법을 제공하는 것인데, 특히 본 발명은 융합 파트너로서 리소자임의 용도, 그리고 리소자임-태깅된 폴리펩티드 및 단백질을 리소자임-특이적 항체에 의해서 단리하는 정제방법을 제공하는 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명의 과제는 태그로서 리소자임을 사용함으로써 단량체 폴리펩티드 및 단백질을 발현 및 정제하는 방법을 제공하는 것이다.

발명의 요약

본 발명은 단량체 폴리펩티드 및 단백질을 발현시키고 정제하는 방법을 제공한다. 본 발명은 당 분야에서 공지된 다른 태그들을 사용함으로써는 발현 및 정제될 수 없는 폴리펩티드 및 단백질의 정제를 가능하게 한다. 본 발명에는, 융합 파트너로서 리소자임의 사용이 개시되어 있다. 또한, 리소자임-특이적 항체에 의해 리소자임-태깅된 폴리펩티드 및 단백질을 단리하는 정제 방법이 기술되어 있다. 태그로서 리소자임의 사용은 특이적인 단량체 폴리펩티드 및 단백질의 발현을 가능하게 하거나, 종래의 다른 태그들에 비해서 폴리펩티드 및 단백질의 발현율을 개선시키는 것으로 나타났다. 원치 않으며 바람직하지 않은 다량체 단백질의 형성을 초래하는 부적절한 폴딩, 낮은 용해도 및 발현, 활성의 상실뿐만 아니라 단리된 폴리펩티드의 응집은 융합 파트너로서 리소자임을 사용함으로써 회피될 수 있다. 또한, 리소자임을 사용하는 것의 또 다른 장점은 멸균 조건 하에서의 세포 배양 및 단백질 발현의 과정을 위해 통상적으로 필요한 항생제의 감소 또는 회피를 허용하는 이의 항균 활성이다.

뮤라미다제 또는 N-아세틸뮤라미드 글리칸하이드롤라제로도 공지되어 있는 리소자임(EC 3.2.1.17)은 대략 14.6 kDa의 분자량을 가지며, 펩티도글리칸 내의 N-아세틸뮤라민산과 N-아세틸-D-글루코사민 잔기 사이 및 키토덱스트린 내의 N-아세틸-D-글루코사민 잔기들 사이의 1,4-베타-결합의 가수분해를 촉진시킨다.

리소자임은 전형적으로 바이러스, 식물, 곤충, 새, 파충류 및 포유류와 같은 많은 생물들에 의해서 박테리아에 대한 방어기전으로서 생산된다. 상기 효소는 박테리아 내의 중요한 구조적 분자인 펩티도글리칸의 글리코시드 결합을 절단함으로써 박테리아 세포벽의 가수분해를 야기한다. 리소자임 작용에 의해서 그들의 세포벽이 약화된 후에, 박테리아 세포는 삼투압의 결과로 용해한다.

리소자임은 5개의 상이한 글리코시드 하이드롤라제(GH) 패밀리로 분류된다(Cazy, http://www.cazy.org): 암탉 난백 리소자임(hen egg-white lysozyme; GH22), 거위 난백 리소자임(goose egg-white lysozyme; GH23), 박테리오파지 T4 리소자임(GH24), 스핑고모나스 편모 단백질(Sphingomonas flagellar protein; GH73) 및 칼라롭시스(Chalaropsis) 리소자임(GH25). 리소자임 패밀리 GH25는 다른 리소자임 패밀리들과는 구조적으로 관련이 없는 것으로 밝혀졌다.

리소자임의 사용은 동물 사료에서(참조예: WO 00/21381 및 WO 04/026334), 치즈 생산에서(참조예: WO 05/080559), 식품 보존을 위해서(문헌: Hughey and Johnson(1987) Appl Environ Microbiol 53:2165), 세제로서(참조예: 미국 출원 제07/428,273호 및 EP 0425016), 구강 관리에(참조예: 미국 출원 제06/279,536호, WO04/017988 및 WO08/124764), 미용학 및 피부과학, 피임, 비뇨기학 및 부인과학에서(참조예: WO 08/124764)에서 제안되었다. 암탉 난백 리소자임은 상업적으로 이용 가능한 리소자임 생성물이다. 미생물뿐만 아니라 포유류 공급원으로부터 단리된 리소자임이 또한 공지되어 있다. 그러나, 포유류 세포 배양물에서의 재조합 리소자임 발현 또는 세포 배양 시의 리소자임에 융합된 펩티드 또는 단백질의 발현에 대한 공개 보고는 없다.

미국 출원 제10/024,597호 및 WO 01/00855는 트랜스제닉 동물의 밀크에서 리소자임에 융합된 소형 펩티드의 발현을 개시하고 있다. 리소자임은 천연적으로 발현된 유단백질이기 때문에, 리소자임-융합 펩티드가 발현되었고, 기본적인 리소자임 융합 펩티드는 밀크 내에서 주로 산성 단백질로부터 정제될 수 있었다. 그러나, 유선으로부터의 세포는 세포 배양 시에 리소자임과 같은 유단백질을 생산할 수 없는 것으로 기술되었다(문헌: Streuli and Bissell(1990) The Journal of Cell Biology, Volume 110, April 1990 1405-1415). 또한, 트랜스제닉 동물에서 유단백질의 단백질 발현은 세포 배양 발현의 경우에는 예견할 수 없으며, 각각의 발견은 세포 배양 시스템으로 전이될 수 없다(참조예: 문헌[Furth et al., (1991), 19 Nucleic Acids Res. 6205] 및 문헌[Whitelaw et al., (1991); 1 Transgenic Res. 3]).

또 다른 응용에서, 코빌카(Kobilka) 등은 GPCRs의 결정화를 가능하게 하는 G-단백질 커플링된 수용체(GPCRs)에 대한 안정화제로서 리소자임을 사용하였다. 이에 의해서, T4 리소자임은 곤충 세포에서 발현된 각각의 GPCR의 세포내 루프 중의 하나 내로 삽입된다(참조: WO 09/051769).

본 발명은 (a) 숙주 세포를 관심이 있는 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하는 단계, 및 (b) 단백질, 펩티드 또는 아미노산을 단리하는 단계를 포함하여, 리소자임에 융합된 것으로서 숙주 세포 내의 단리된 단백질, 펩티드 및/또는 아미노산을 생산 및 정제하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 본원에 기술된 방법에서 사용되는 숙주 세포 및 벡터를 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 발효기와 같은 반응 용기를 제공한다. 본 발명은 또한 (a) 본 발명에 따른 벡터, (b) 리소자임에 대해 특이적인 항체, 및 (c) 선택적으로, 본원에 기술된 방법에 따라 상기 벡터 및 항체를 사용하기 위한 지침을 포함하는 키트를 제공한다.

도 1: 리소자임 융합 단백질의 발현을 위해서 사용된 벡터. 닭 리소자임을 인코딩하는 서열이 pMax 벡터 골격 내로 서브클로닝되었다.
도 2a 내지 도 2c: 닭 리소자임(밑줄 표시)을 포함하는 전체 pMax 발현 작제물(SEQ ID NO: 15)을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열.

하나의 양태에서, 본 발명은 관심이 있는 폴리펩티드 또는 단백질을 리소자임을 포함하는 융합 단백질로서 발현시킴으로써 관심이 있는 폴리펩티드 또는 단백질의 발현을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 관심이 있는 폴리펩티드 또는 단백질은 관심이 있는 단량체 폴리펩티드 또는 단백질이다. 추가의 구현예에서, 관심이 있는 폴리펩티드 또는 단백질은 생리학적 단량체 조성을 갖는다. 또 다른 구현예, 관심이 있는 폴리펩티드 또는 단백질은 생리학적 단량체 조성을 가지며, 단량체로서 작용한다. 또 다른 구현예에서, 관심이 있는 단백질은 생리학적으로 단량체로서 발현되는 세포 표면 수용체이다. 추가의 구현예에서, 관심이 있는 단백질은 생리학적으로 단량체로서 발현되는 가용성 단백질이다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 융합 단백질은 관심이 있는 폴리펩티드 또는 단백질 및 리소자임을 포함하며, 여기에서 리소자임은 관심이 있는 폴리펩티드 또는 단백질의 N-말단에 융합된다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 융합 단백질은 관심이 있는 폴리펩티드 또는 단백질 및 리소자임을 포함하며, 여기에서 리소자임은 관심이 있는 폴리펩티드 또는 단백질의 C-말단에 융합된다.

하나의 구현예에서, 본 발명은 관심이 있는 폴리펩티드 또는 단백질을 리소자임을 포함하는 융합 단백질로서 발현시킴으로써, 관심이 있는 폴리펩티드 또는 단백질의 발현을 증진시키는 방법에 관한 것이며, 여기에서 상기 융합 단백질의 수율은 리소자임을 포함하지 않는 관심이 있는 폴리펩티드 또는 단백질의 수율보다 적어도 2배 더 크다.

하나의 구현예에서, 본 발명은 관심이 있는 폴리펩티드 또는 단백질을 리소자임을 포함하는 융합 단백질로서 발현시킴으로써, 관심이 있는 폴리펩티드 또는 단백질의 발현을 증진시키는 방법에 관한 것이며, 여기에서 관심이 있는 폴리펩티드 또는 단백질 및 리소자임을 포함하는 융합 단백질은 어떤 응집체 또는 봉입체도 형성하지 않는다. 본 발명의 추가의 구현예에서는, 관심이 있는 폴리펩티드 또는 단백질 및 리소자임을 포함하는 융합 단백질의 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만이 응집체를 형성한다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 융합 단백질은 숙주 세포에서 발현된다. 본 발명의 추가의 구현예에서, 상기 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포이다. 바람직한 구현예에서, 숙주 세포는 진핵 세포이다. 본 발명의 더욱 바람직한 구현예에서, 상기 진핵 세포는 CHO 세포, PER.C6 세포, HKB11 세포 및 HEK293 세포로부터 선택된다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 숙주 세포는 관심이 있는 폴리펩티드 또는 단백질 및 리소자임을 포함하는 상기 융합 단백질을 인코딩하는 발현 벡터를 사용하여 트랜스펙션되었다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 융합 단백질은 숙주 세포에서 발현되며, 여기에서 상기 숙주 세포의 배양은 리소자임에 융합되지 않은 관심이 있는 상기 단백질 또는 폴리펩티드의 배양을 위한 배양 배지에 비해 배양 배지에 대한 보충물로서 적어도 50% 미만의 항생제를 필요로 한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 융합 단백질은 숙주 세포에서 발현되며, 여기에서 상기 숙주 세포의 배양은 리소자임에 융합되지 않은 관심이 있는 상기 단백질 또는 폴리펩티드의 배양을 위한 배양 배지에 비해 배양 배지에 대한 보충물로서 적어도 50% 미만, 60% 미만, 70% 미만, 80% 미만, 90% 미만 또는 95% 미만의 항생제를 필요로 한다. 본 발명의 더욱 바람직한 구현예에서, 상기 융합 단백질은 숙주 세포에서 발현되며, 여기에서 상기 숙주 세포의 배양을 위한 배양 배지는 항생제를 함유하지 않는다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 관심이 있는 폴리펩티드 또는 단백질 및 리소자임을 포함하는 상기 융합 단백질은 발현 후에 단리된다. 본 발명의 추가의 구현예에서, 상기 융합 단백질은 숙주 세포, 배양 배지 또는 둘 모두로부터 단리된다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 융합 단백질은 리소자임에 대해 특이적인 항체에 의해서 단리된다. 본 발명의 추가의 구현예에서, 리소자임에 대해 특이적인 항체는 단리된 항체이다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 리소자임에 대해 특이적인 항체는 모노클로날 항체이다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 리소자임에 대해 특이적인 항체는 서열 NSAAWS의 HCDR1 영역(SEQ ID NO: 9), 서열 RIYYRSKWYNDYAVSVKS의 HCDR2 영역(SEQ ID NO: 10), 서열 LDHRYHEDTVYPGMDV의 HCDR3 영역(SEQ ID NO: 11), 서열 SGDNLPAYTVT의 LCDR1 영역(SEQ ID NO: 12), 서열 DDSDRPS의 LCDR2 영역(SEQ ID NO: 13), 및 서열 ASWDPSSGV의 LCDR3 영역(SEQ ID NO: 14)을 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 리소자임에 대해 특이적인 항체는 MOR03207이다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 리소자임에 대해 특이적인 항체는 MOR03207과 동일한 에피토프에 결합한다. 본 발명의 추가의 구현예에서, 리소자임에 대해 특이적인 항체는 MOR03207과 경쟁한다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 리소자임에 대해 특이적인 항체는 지지 기질(support substrate)에 부착된다. 본 발명의 추가의 구현예에서, 리소자임에 대해 특이적인 항체는 아가로스, 세파로스, 폴리아크릴아미드, 아가로스/폴리아크릴아미드 공중합체, 덱스트란, 셀룰로스, 폴리프로필렌, 폴리카보네이트, 니트로셀룰로스, 유리, 종이 및 자분(magnetic particle)으로 구성된 군으로부터 선택된 지지 기질에 부착된다. 추가의 구현예에서, 지지 기질은 정제 컬럼 내에 통합된다. 추가의 구현예에서, 지지 기질은 분리 가능한 비드 상에 통합된다.

본 발명의 하나의 양태에서, 관심이 있는 폴리펩티드 또는 단백질은 포유류 리소자임에 융합된다. 하나의 구현예에서, 포유류 리소자임은 인간, 마우스, 랫트, 닭, 토끼, 염소 및 영장류 리소자임으로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 포유류 리소자임은 닭 리소자임이다.

본 발명의 하나의 양태에서, 관심이 있는 폴리펩티드 또는 단백질은 리소자임 또는 이의 단편, 유사체, 동족체, 변이체 또는 유도체에 융합된다. 하나의 구현예에서, 리소자임 또는 이의 단편, 유사체, 동족체, 변이체 또는 유도체는 포유류 리소자임으로부터 유도된다. 추가의 구현예에서, 포유류 리소자임은 인간, 마우스, 랫트, 닭, 토끼, 염소 및 영장류 리소자임으로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 포유류 리소자임은 닭 리소자임이다.

하나의 구현예에서, 융합 단백질은 관심이 있는 폴리펩티드 또는 단백질, 리소자임 또는 이의 단편, 유사체, 동족체, 변이체 또는 유도체 및 프로테아제 절단 부위를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 절단 부위는 인자(Factor)Xa, 엔테로키나제(엔테로펩티다제), TEV-프로테아제 또는 HRV3C-프로테아제(선절단(PreScission) 프로테아제)이다. 바람직한 구현예에서, 프로테아제 절단 부위는 리소자임 폴리펩티드 도메인의 제거를 위해서 사용될 수 있다.

하나의 양태에서, 본 발명은 관심이 있는 폴리펩티드 또는 단백질 및 리소자임을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 발현 벡터, 및 리소자임에 대해 특이적인 항체를 포함하는 키트에 관한 것이다. 하나의 구현예에서, 리소자임에 대해 특이적인 상기 항체는 지지 기질에 부착된다. 바람직한 구현예에서, 상기 지지 기질은 고체 지지 기질이다. 추가의 구현예에서, 상기 고체 지지 기질은 아가로스, 세파로스, 폴리아크릴아미드, 아가로스/폴리아크릴아미드 공중합체, 덱스트란, 셀룰로스, 폴리프로필렌, 폴리카보네이트, 니트로셀룰로스, 유리, 종이 및 자분으로 구성된 군으로부터 선택된다.

하나의 양태에서, 본 발명은 관심이 있는 폴리펩티드 또는 단백질 및 리소자임을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이며, 여기에서 관심이 있는 폴리펩티드 또는 단백질은 적어도 5 아미노산, 적어도 10 아미노산, 적어도 20 아미노산, 적어도 50 아미노산, 적어도 80 아미노산, 적어도 90 아미노산, 적어도 100 아미노산, 적어도 110 아미노산, 적어도 120 아미노산, 적어도 125 아미노산, 적어도 150 아미노산, 적어도 200 아미노산, 적어도 250 아미노산, 적어도 300 아미노산, 적어도 400 아미노산 또는 적어도 500 아미노산의 길이를 갖는다.

하나의 양태에서, 본 발명은 리소자임으로 태깅된 폴리펩티드 또는 단백질에 관한 것이다. 하나의 구현예에서, 리소자임으로 태깅된 폴리펩티드 또는 단백질은 길이가 적어도 5 아미노산, 적어도 10 아미노산, 적어도 20 아미노산, 적어도 50 아미노산, 적어도 80 아미노산, 적어도 90 아미노산, 적어도 100 아미노산, 적어도 110 아미노산, 적어도 120 아미노산, 적어도 125 아미노산, 적어도 150 아미노산, 적어도 200 아미노산, 적어도 250 아미노산, 적어도 300 아미노산, 적어도 400 아미노산, 또는 적어도 500 아미노산이다.

하나의 양태에서, 본 발명은 관심이 있는 단량체 폴리펩티드 또는 단백질을 리소자임을 포함하는 융합 단백질로서 발현시킴으로써, 관심이 있는 단량체 폴리펩티드 또는 단백질의 발현을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

하나의 구현예에서, 본 발명은 관심이 있는 단량체 폴리펩티드 또는 단백질을 리소자임을 포함하는 융합 단백질로서 발현시킴으로써, 관심이 있는 단량체 폴리펩티드 또는 단백질의 발현을 증진시키는 방법에 관한 것이며, 여기에서 상기 융합 단백질의 수율은 리소자임을 포함하지 않는 관심이 있는 단량체 폴리펩티드 또는 단백질의 수율에 비해 적어도 2배 더 크거나, 적어도 3배 더 크거나, 적어도 4배 더 크거나, 적어도 5배 더 크거나, 적어도 6배 더 크거나, 적어도 7배 더 크거나, 적어도 7배 더 크거나, 적어도 8배 더 크거나, 적어도 10배 더 크거나, 적어도 15배 더 크거나, 적어도 20배 더 크거나, 적어도 25배 더 크거나, 적어도 50배 더 크거나, 적어도 100배 더 크다.

하나의 구현예에서, 본 발명은 관심이 있는 단량체 폴리펩티드 또는 단백질을 리소자임을 포함하는 융합 단백질로서 발현시킴으로써, 관심이 있는 단량체 폴리펩티드 또는 단백질의 발현을 증진시키는 방법에 관한 것이며, 여기에서 관심이 있는 단량체 폴리펩티드 또는 단백질 및 리소자임을 포함하는 융합 단백질은 어떤 응집체나 봉입체도 형성하지 않는다. 본 발명의 추가의 구현예에서, 관심이 있는 단량체 폴리펩티드 또는 단백질 및 리소자임을 포함하는 융합 단백질의 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만이 응집체를 형성한다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 숙주 세포를 관심이 있는 단량체 폴리펩티드 또는 단백질 및 리소자임을 포함하는 상기 융합 단백질을 인코딩하는 발현 벡터로 트랜스펙션시켰다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 융합 단백질은 관심이 있는 단량체 폴리펩티드 또는 단백질 및 리소자임을 포함하며, 여기에서 리소자임은 관심이 있는 단량체 폴리펩티드 또는 단백질의 N-말단에 융합된다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 융합 단백질은 관심이 있는 단량체 폴리펩티드 또는 단백질 및 리소자임을 포함하며, 여기에서 리소자임은 관심이 있는 단량체 폴리펩티드 또는 단백질의 C-말단에 융합된다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 관심이 있는 단량체 폴리펩티드 또는 단백질 및 리소자임을 포함하는 상기 융합 단백질은 발현 후에 단리된다. 본 발명의 추가의 구현예에서, 상기 융합 단백질은 숙주 세포, 배양 배지 또는 둘 모두로부터 단리된다.

하나의 양태에서, 본 발명은 (a) 숙주 세포 내에서 융합 단백질을 발현시키는 단계, 및 (b) 상기 융합 단백질을 단리하는 단계를 포함하여, 융합 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이며, 여기에서, 상기 융합 단백질의 폴리펩티드 도메인 중의 하나는 리소자임이다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 융합 단백질은 숙주 세포로부터 단리된다. 추가의 구현예에서, 융합 단백질은 배양 배지로부터 단리된다. 바람직한 구현예에서, 융합 단백질은 숙주 세포 및 배양 배지로부터 단리된다.

하나의 양태에서, 본 발명은 (a) 숙주 세포 내에서 융합 단백질을 발현시키는 단계, 및 (b) 상기 융합 단백질을 숙주 세포 및 배양 배지로부터 단리하는 단계를 포함하여, 융합 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이며, 여기에서 상기 융합 단백질의 폴리펩티드 도메인 중의 하나는 리소자임이며, 여기에서 단계 (a)에서의 상기 융합 단백질의 수율은 리소자임 폴리펩티드 도메인을 포함하지 않는 단백질의 수율에 비해서 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배 더 크다.

하나의 양태에서, 본 발명은 (a) 숙주 세포 내에서 융합 단백질을 발현시키는 단계, 및 (b) 상기 융합 단백질을 숙주 세포 및 배양 배지로부터 단리하는 단계를 포함하여, 융합 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이며, 여기에서 상기 융합 단백질의 폴리펩티드 도메인 중의 하나는 리소자임이고, 여기에서 단계 (a)에서 발현된 융합 단백질은 어떤 응집체나 봉입체도 형성하지 않는다.

본 발명의 하나의 구현예에서는, 단리된 융합 단백질의 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만이 응집체를 형성한다.

하나의 양태에서, 본 발명은 (a) 숙주 세포 내에서 융합 단백질을 발현시키는 단계(여기에서, 상기 융합 단백질은 관심이 있는 상기 폴리펩티드 또는 단백질 및 리소자임을 포함한다), 및 (b) 상기 융합 단백질을 단리하는 단계를 포함하여, 관심이 있는 단리된 폴리펩티드 또는 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.

하나의 양태에서, 본 발명은 단리된 단량체 폴리펩티드 또는 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다. 하나의 양태에서, 본 발명은 관심이 있는 단리된 단량체 폴리펩티드 또는 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 폴리펩티드 또는 단백질은 생리학적 단량체 조성을 갖는다. 바람직한 구현예에서, 관심이 있는 단백질은 생리학적 단량체 조성을 갖는다. 바람직한 구현예에서, 관심이 있는 단백질은 생리학적으로 단량체로서 발현되는 세포 표면 수용체이다. 바람직한 구현예에서, 관심이 있는 단백질은 생리학적으로 단량체로서 발현되는 가용성 단백질이다.

하나의 양태에서, 본 발명은 (a) 숙주 세포 내에서 융합 단백질을 발현시키는 단계(여기에서, 상기 융합 단백질은 관심이 있는 상기 단량체 폴리펩티드 또는 단백질 및 리소자임을 포함한다), 및 (b) 상기 융합 단백질을 숙주 세포 및 배양 배지로부터 단리하는 단계를 포함하여, 관심이 있는 단리된 단량체 폴리펩티드 또는 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 단계 (a)에서의 상기 융합 단백질의 수율은 리소자임을 포함하지 않는 관심이 있는 단량체 폴리펩티드 또는 단백질의 수율에 비해서 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배 더 크다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 단계 (a)에서 발현된 융합 단백질은 어떤 응집체 또는 봉입체도 형성하지 않는다. 본 발명의 바람직한 구현예에서는, 단리된 융합 단백질의 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11 %, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만이 응집체를 형성한다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 리소자임은 태그이다. 추가의 구현예에서, 리소자임은 발현 또는 정제 태그이다. 바람직한 구현예에서, 리소자임은 발현 및 정제 태그이다.

하나의 양태에서, 본 발명은 리소자임에 융합된 관심이 있는 폴리펩티드 또는 단백질을 발현시키고, 리소자임에 융합된 관심이 있는 상기 폴리펩티드 또는 단백질을 단리하는 것을 특징으로 하는, 관심이 있는 폴리펩티드 또는 단백질의 생산을 위한 태그로서의 리소자임의 용도에 관한 것이다.

하나의 양태에서, 본 발명은 리소자임에 융합된 관심이 있는 폴리펩티드 또는 단백질을 숙주 세포 내에서 발현시키고, 리소자임에 융합된 관심이 있는 상기 폴리펩티드 또는 단백질을 숙주 세포 및 배양 배지로부터 단리하는 것을 특징으로 하는, 관심이 있는 폴리펩티드 또는 단백질의 생산을 위한 태그로서의 리소자임의 용도에 관한 것이다.

하나의 양태에서, 본 발명은 리소자임에 융합된 관심이 있는 폴리펩티드 또는 단백질을 숙주 세포 내에서 발현시키고, 리소자임에 융합된 관심이 있는 상기 폴리펩티드 또는 단백질을 숙주 세포 및 배양 배지로부터 단리하는 것을 특징으로 하는, 관심이 있는 폴리펩티드 또는 단백질의 생산을 위한 태그로서의 리소자임의 용도에 관한 것이며, 여기에서, 리소자임에 융합된 관심이 있는 상기 폴리펩티드 또는 단백질은 리소자임에 대해 특이적인 항체에 의해서 단리된다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 리소자임에 융합된 관심이 있는 상기 폴리펩티드 또는 단백질의 수율은 리소자임 폴리펩티드 도메인을 포함하지 않는 관심이 있는 상기 폴리펩티드 또는 단백질의 수율에 비해서 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배 더 크다.

정의

용어 "폴리펩티드"는 숙련된 전문가에 의해서 인식되는 바와 같은 이의 가장 광범한 의미로 본원에서 사용된다. 폴리펩티드는 펩티드 결합을 통해 연결된 적어도 두 개의 아미노산을 포함한다. 전형적으로, 폴리펩티드는 30개를 초과하는 아미노산을 포함한다.

용어 "단백질"은 또한 숙련된 전문가에 의해서 인식되는 바와 같은 이의 가장 광범한 의미로 본원에서 사용된다. 단백질은 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하며, 여기에서 폴리펩티드의 적어도 일부분은 이의 폴리펩티드 사슬(들) 내에 및/또는 사이에 이차, 삼차 또는 사차 구조를 형성함으로써 정의된 삼차원 구조 배열을 갖거나 획득할 수 있다. 단백질은 단량체(하나의 폴리펩티드 사슬로 구성됨) 또는 다량체(두 개 이상의 폴리펩티드 사슬로 구성됨)일 수 있다.

본원에서 사용된 것으로서 용어 "숙주 세포"는 진핵 및 원핵 숙주 세포를 포함하는, 외인성 폴리펩티드 또는 단백질의 생산에 통상적으로 사용되는 다수의 세포 중의 어떤 것이라도 될 수 있다. 본 발명의 바람직한 숙주 세포는 진균 세포, 효모 세포, 식물 세포, 곤충 세포 또는 포유류 세포와 같은 진핵 숙주 세포이다. 가장 바람직한 것은 포유류 숙주 세포이다. 또한 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 포유류 숙주 세포는 CHO 세포(European Collection of Cell Culture; ECACC #85050302), PER.C6 세포(Crucell, Leiden, The Netherlands), HKB11 세포(Bayer HealthCare, Berkley/CA, USA) 및 HEK293 세포(American Type Culture Collection; Order no. CRL-1573)로부터 선택된다.

본원에서 사용된 것으로서 용어 "[폴리펩티드의] 발현을 허용하는 조건"은 소정의 폴리펩티드의 발현을 초래하는 조건을 말한다. 숙주 세포의 조건의 목적이 있는 선택은 본 발명의 폴리펩티드의 발현의 개시(또는 정지)를 가능하게 한다. 전형적으로, 조건의 이러한 변화는 숙주 세포의 성장 배지에 화학적 또는 천연적으로 존재하는 화합물인 "유도제(inducer)"를 첨가해서 초래된다. 사용된 특이적 프로모터에 따라 유도제의 성질이 달라진다. 폴리펩티드의 발현을 초래할 수 있는 조건의 다른 변화는 온도의 증가 또는 빛이나 UV에 대한 노출이다.

본원에서 사용된 것으로서 용어 "리소자임"은 암탉 난백 리소자임과 같은 모든 천연적으로 존재하는 리소자임, 합성 리소자임, 및 인간 재조합 리소자임과 같은 재조합 리소자임뿐만 아니라 리소자임 염을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 리소자임은 닭 리소자임(SEQ ID NO: 1)이다. 하나의 구현예에서, 용어 "리소자임"은 조류(algae), 고세균, 박테리아, 효모, 사상균류 또는 원생동물과 같은 미생물로부터의 리소자임을 말한다. 하나의 구현예에서, 용어 "리소자임"은 포유류, 조류(birds), 파충류 및 양서류로부터의 리소자임을 말한다. 하나의 구현예에서, 용어 "리소자임"은 마우스(SEQ ID NO: 2), 토끼(SEQ ID NO: 3), 염소(SEQ ID NO: 4), 인간(SEQ ID NO: 5), 소(SEQ ID NO: 6), 랫트(SEQ ID NO: 7) 또는 시노몰구스(SEQ ID NO: 8) 리소자임을 말한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에서 사용된 리소자임은 천연적으로 존재하는 생물에 의해서 발현된 리소자임의 아미노산 서열에서 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는다.

용어 "변이체"는 본원에서 하나 이상의(몇 개의) 특이적 위치에서 하나 이상의(몇 개의) 아미노산 잔기의 치환, 삽입, 및/또는 결실과 같은 변경을 포함하는 폴리펩티드로서 정의된다. 변경된 폴리펩티드(변이체)는 모(parental) 리소자임을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형에 의한 인간 개입을 통해서 수득될 수 있다. 모 리소자임은 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 이들 서열 중의 하나와 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열에 의해서 인코딩될 수 있다. 변이체 폴리펩티드 서열은 바람직하게는 천연에서 발견되지 않는 것이다. 본 발명은 바람직하게는 하나 이상의(몇 개의) 위치에서 치환 및/또는 삽입 및/또는 결실의 형태로의 변경을 포함하는 리소자임 변이체에 관한 것이다.

본원에서 사용된 것으로서 용어 "단리된"은 공급원, 예를 들어, 이것이 발현되는 숙주 세포로부터 단리된 폴리펩티드 또는 단백질 또는 이들의 변이체를 말한다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 SDS-PAGE에 의해서 밝혀진 바와 같이, 적어도 40% 순도, 예를 들어 적어도 60% 순도, 적어도 80% 순도, 적어도 90% 순도, 또는 적어도 95% 순도를 갖는다.

용어 "융합 단백질"은 단일의 천연 폴리펩티드에 통상적으로 존재하지 않는 적어도 2개의 폴리펩티드 도메인을 갖는 단일의 폴리펩티드 사슬을 나타낸다. 따라서, 천연적으로 존재하는 단백질은 본원에서 사용된 바와 같은 "융합 단백질"이 아니다. 바람직하게는, 관심이 있는 폴리펩티드는 펩티드 결합을 통해서 적어도 하나의 폴리펩티드 도메인과 융합되며, 융합 단백질은 또한 별개의 단백질로부터 유도된 아미노산 부분들 사이의 아미노산의 연결 영역을 포함할 수 있다. 관심이 있는 폴리펩티드에 융합된 폴리펩티드 도메인은 관심이 있는 폴리펩티드의 용해도 및/또는 발현을 증진시킬 수 있으며, 또한 숙주 세포 또는 배양 상등액, 또는 둘 모두로부터의 재조합 융합 단백질의 정제를 허용하는 정제 태그를 제공할 수 있다. 관심이 있는 폴리펩티드에 융합된 폴리펩티드 도메인은 관심이 있는 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에서 융합될 수 있다.

용어 "재조합"은 예를 들어, 화학적 합성에 의해서, 또는 유전자 조작기술에 의한 아미노산 또는 핵산의 단리된 절편의 조작에 의해서 서열의 다른 식으로 분리된 두 개의 절편의 인공적 조합을 말한다.

본원에서 사용된 것으로서 용어 "발현"은 기능적 최종-생성물, 예를 들어, mRNA 또는 단백질(전구체 또는 성숙체)의 생산을 말한다.

용어 "벡터"는 이것이 연결된 또 다른 폴리뉴클레오티드를 수송할 수 있는 폴리뉴클레오티드 분자를 나타내고자 한다. 벡터의 한가지 타입은 추가의 DNA 절편이 삽입될 수 있는 원형의 이중 가닥 DNA 루프를 나타내는 "플라스미드"이다. 또한, 관심이 있는 유전자의 코딩 서열은 세포의 전사 기기에 의해서 특정의 벡터로부터 전사될 수 있으며, 관심이 있는 단백질로 추가로 번역될 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 칭한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용성이 있는 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태이다. 플라스미드가 가장 통상적으로 사용되는 벡터의 형태이기 때문에, 본 명세서에서 "플라스미드" 및 "벡터"는 상호 교환하여 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 동등한 기능을 하는 바이러스 벡터(예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관된 바이러스)와 같은 발현 벡터의 이러한 다른 형태들을 포함하고자 한다.

본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "단량체" 및 이의 문법적 동등어는 단일 폴리펩티드 사슬로 구성된 폴리펩티드 또는 단백질을 말한다. 본 발명의 단량체 폴리펩티드 또는 단백질은 또 다른 폴리펩티드 또는 단백질과 공유적으로도 비-공유적으로도 회합되거나 결합되지 않는다.

용어 "태그"가 본 명세서에서 사용되며, 제2의 폴리펩티드에 부착될 수 있는 펩티드 또는 폴리펩티드 서열을 말한다. 바람직하게는, 태그는 정제 태그 또는 발현 태그, 또는 둘 모두이다.

본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "정제 태그"는 폴리펩티드의 정제 또는 확인에 적합한 임의의 펩티드 서열을 말한다. 정제 태그는 정제 태그에 대한 친화성을 갖는 또 다른 모이어티에 특이적으로 결합한다. 정제 태그에 특이적으로 결합하는 이러한 모이어티는 통상적으로 아가로스 비드와 같은 매트릭스 또는 수지에 부착된다. 정제 태그에 특이적으로 결합하는 모이어티는 항체, 다른 단백질(예를 들어, 단백질 A 또는 스트렙타비딘), 니켈 또는 코발트 이온 또는 수지, 비오틴, 아밀로즈, 말토스 및 사이클로덱스트린을 포함한다. 예시적인 정제 태그에는 히스티딘(HIS) 태그(예를 들어, 헥사히스티딘 펩티드)가 포함되며, 이는 니켈 또는 코발트 이온과 같은 금속 이온에 결합할 것이다. 그 밖의 다른 예시적인 정제 태그는 myc 태그(EQKLISEEDL), Strep 태그(WSHPQFEK), Flag 태그(DYKDDDDK) 및 V5 태그(GKPIPNPLLGLDST)이다. 용어 "정제 태그"는 또한 "에피토프 태그", 즉 항체에 의해서 특이적으로 인식되는 펩티드 서열을 포함한다. 예시적인 에피토프 태그에는 모노클로날 항-FLAG 항체에 의해서 특이적으로 인식되는 FLAG 태그가 포함된다. 항-FLAG 항체에 의해서 인식되는 펩티드 서열은 서열 DYKDDDDK 또는 이의 실질적으로 동일한 변이체로 구성된다. 용어 "정제 태그"는 또한 정제 태그의 실질적으로 동일한 변이체를 포함한다. 본원에서 사용된 것으로서 "실질적으로 동일한 변이체"는 원래의 정제 태그에 비해서 변형되지만(예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 통해), 정제 태그를 특이적으로 인식하는 모이어티에 특이적으로 결합하는 정제 태그의 특성을 보유하는 정제 태그의 유도체 또는 단편을 말한다.

본원에서 사용된 것으로서 용어 "발현 태그"는 제2 폴리펩티드에 부착될 수 있는 임의의 펩티드 또는 폴리펩티드를 말하며, 관심이 있는 재조합 폴리펩티드의 용해도, 안정성 및/또는 발현을 지지하는 것으로 추정된다. 예시적인 발현 태그는 Fc-태그 및 SUMO-태그를 포함한다. 원칙적으로, 임의의 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 발현 태그로서 사용될 수 있다.

본원에서 사용된 것으로서 용어 "항체"는 온전한 항체 및 이의 임의의 단편 또는 단일 사슬을 포함한다. 천연적으로 존재하는 "항체"는 이황화 결합에 의해서 상호-연결된 적어도 2개의 중(H)쇄 및 2개의 경(L)쇄를 포함하는 단백질이다. 바람직한 구현예에서, 본 출원에 개시된 항체는 "모노클로날 항체"이다. 본원에서 사용된 것으로서 용어 "모노클로날 항체"는 단일 분자 조성의 항체 분자의 제제를 말한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정 에피토프에 대해 유일한 결합 특이성 및 친화성을 갖는 유일한 결합 부위를 나타낸다.

본원에서 사용된 것으로서 용어 "트랜스펙션"은 외인성 DNA를 원핵성 또는 진핵성 숙주 세포 내로 도입시키는데 통상적으로 사용되는 광범한 종류의 기술, 예를 들어, 일렉트로포레이션, 칼슘-포스페이트 침전, DEAE-덱스트란 트랜스펙션 등을 말한다. 숙주 세포는 숙련된 전문가에게 공지된 임의의 통상적인 방법에 의해서 본 발명의 벡터를 사용하여 "트랜스펙션"될 수 있다. 예를 들어, 트랜스펙션은 일시적 트랜스펙션일 수 있다. 그러므로, 본 발명의 특정의 구현예에서는 관심이 있는 폴리펩티드 또는 단백질 및 리소자임을 포함하는 상기 융합 단백질을 인코딩하는 상기 유전자를 일시적 트랜스펙션을 통해 상기의 진핵성 숙주 세포 내로 도입시킨다.

본 명세서 및 첨부된 특허청구범위 전체에 걸쳐서 사용된 것으로 용어 "동일성 %"는 다음과 같이 계산된다. 질의 서열을 CLUSTAL W 알고리즘(문헌: Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J., Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680(1994))을 사용하여 표적 서열에 대해서 정렬한다. 비교는 정렬된 서열들 중의 가장 짧은 것에 상응하는 창에 대해서 이루어진다. 각각의 위치에서 아미노산 잔기를 비교하고, 표적 서열에서 동일한 상동성을 갖는 질의 서열에서의 위치의 백분율을 동일성 %로서 보고한다.

실시예

모든 시약은 예를 들어, Sigma-Aldrich, Sartorius, TTP, GE Healthcare 등으로부터 상업적으로 입수할 수 있고 구입하였으며, 분자생물학 실험실에서 사용되는 표준 시약들이다.

달리 나타내지 않는 한, 분자 클로닝은 본질적으로 문헌(Sambrook et al.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3 Vol.; Cold Spring Harbor Laboratory(December 2000))에 기술된 바와 같은 표준 프로토콜을 사용하여 수행되었다. 발현 및 정제는 문헌(Current Protocols in Protein Science(Wiley Interscience))에 기술된 바와 같은 표준 절차에 따라 수행되었다.

실시예 1: 본 발명의 방법에서 사용하는데 적합한 벡터의 생성

진핵성 발현 벡터, 예를 들어, 표준 pcDNA3.1 벡터(Invitrogen), 또는 pcDNA3.1을 기초로 하여 변형된 발현 벡터인 pMAX 발현 벡터(도 1, 도 2)를 사용하여 본 발명을 수행하였다. pMAX 발현 벡터는 예를 들어, 효율적인 전사 및 번역을 위한 복제 원점, 항생제 내성뿐만 아니라 조절 서열들(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 부위)을 포함한다. 각각의 융합 파트너 또는 태그(예를 들어, 리소자임, GST, His, Fc)를 표준 서브-클로닝에 의해 다중 클로닝 부위(MCS)의 3'-말단에 삽입하였다(도 1). 도 2에는, 닭 리소자임을 포함하는 pMax 발현 작제물의 뉴클레오티드 서열을 예시한다.

관심이 있는 임의의 단백질의 인코딩 서열을 발현 벡터의 MCS 내로 삽입하여 관심이 있는 유전자 및 예를 들어, 리소자임의 융합 작제물을 수득할 수 있다. 수득된 벡터를 관심이 있는 단백질을 포함하는 융합 단백질이 발현되었던 조건 하에서 포유류 숙주 세포, 예를 들어, HKB11 또는 HEK293 세포 내로 트랜스펙션시켰다.

실시예 2: 적합한 숙주 세포 내로의 벡터의 트랜스펙션

실시예 1에 따라 특이적 태그(예를 들어, 리소자임, GST, His, Fc)에 융합된 관심이 있는 특이적 단백질을 인코딩하는 발현 벡터의 다양한 변이체들을 생성시키고, 포유류 숙주 세포 내로 트랜스펙션시켰다.

예를 들어, HKB11 현탁 세포를 0.5 x 10⁶ vc/㎖의 밀도로 시딩하고, 가습 CO₂ 배양기에 37℃ 및 6% CO₂ 하에서 인큐베이션하였다. 다음날 세포를 제조자의 지침에 따라 리포펙타민(Lipofectamin) 2000 및 OptiMEM(Invitrogen)을 사용하여 플라스미드-DNA로 트랜스펙션시켰다. 3일 후에, 조건화 세포 배양 상등액을 수확하였다. 그 후에, 발현된 단백질을 표준 정제방법(Fc-태그에 대한 단백질 A 친화도 크로마토그래피 또는 His-태그에 대한 IMAC)에 의해서, 또는 리소자임-태깅된 단백질의 경우에는 리소자임에 대해 특이적인 항체(MOR03207)를 사용하여 수확된 상등액으로부터 정제하였다. 이 경우에는, 리소자임에 대해 특이적인 항체를 제조자의 지침에 따라 세파로스 4 FF(GE Healthcare)에 커플링시켰다. 관심이 있는 발현된 융합 단백질을 컬럼에 결합시키고, 샘플을 100 mM 글리신, pH 4.0으로 용출시켰다.

단백질 농도 결정을 위해서는 280 ㎚에서 UV 흡수치의 측정을 사용하였다. 네이트브 상태의 정제된 단백질을 크기-배제-크로마토그래피(응집체 %의 측정을 위해서 사용됨) 및 동적 광산란(입자 크기의 측정을 위해서 사용됨)에 의해서 분석하였다.

실시예 3: 태그로서 리소자임을 사용한 관심이 있는 단백질의 발현 및 정제

3.1. 분석된 8개의 단백질

관심이 있는 8개의 단백질을 리소자임 융합 단백질로서의 발현 및 정제를 위해서 선택하였다. 모든 단백질을 포유류 세포주(예를 들어, HKB11)에 의해서 발현 및 분비시키고, 세포 배양 상등액으로부터 정제하였다. 선택된 단백질은 매우 낮은 발현율 및/또는 Fc-, GST-융합물로서, 또는 His-태깅된 단백질로서의 높은 응집을 나타내었다. 대조적으로, 리소자임과의 융합은 모든 예 전체에 걸쳐서 증가된 발현율 및/또는 매우 개선된 단백질 품질을 초래하였다.

표 1 내지 표 8에서는, 8개의 상이한 단백질의 발현 및 정제를 시험하고 비교하였다. 관심이 있는 모든 분석된 단백질은 생리학적으로 단량체로서 발현되고, 110 아미노산보다 긴 단백질이다. 예시된 단백질은 단백질 1의 경우에는 116 아미노산의 최소 크기를 갖고, 여기에서 단백질 2는 길이가 517 아미노산이며, 단백질 3은 길이가 257 아미노산이고, 단백질 4는 길이가 237 아미노산이며, 단백질 5는 길이가 217 아미노산이고, 단백질 6 및 단백질 7은 둘 모두 길이가 193 아미노산이며, 단백질 8은 길이가 209 아미노산이다.

일부의 예시된 단백질은 Fc-태그에 융합되는 경우에 발현되지 않는 것으로 나타났다. 결과적으로, His-태그, 리소자임 또는 이들의 조합을 상기의 관심이 있는 단량체 단백질을 발현하도록 시험하였다. 후속 정제는 His-태그에 의해서, 또는 리소자임에 의해서 수행되었다. Avi-태그는 각각의 단백질의 후속 비오티닐화를 위한 추가의 태그로 사용되었다. Avi-태그는 길이가 15 아미노산이며, 부위-특이적 비오티닐화를 매개하는 BirA 효소에 대한 인식 부위를 포함한다. Avi-태그는 재조합적으로 발현된 폴리펩티드 또는 단백질의 발현 수준에 대해 영향을 미치지 않으며, 이의 응집하는 경향을 손상시키지 않는다.

3.2. 단백질 발현을 가능하게 하거나 증진시킨 리소자임-태그

단백질 1을 포유류 발현 벡터 상에 인코딩시키고, 2개의 상이한 태그의 특이적 조합에 융합시켰다. 이에 의해서, His-태그 또는 리소자임 태그를 사용하였으며, 정제를 His-태그에 의해(고정화된 금속 친화도 크로마토그래피(IMAC)를 사용하여) 또는 리소자임에 의해(세파로스 4 FF에 커플링된 리소자임 특이적 항체로서 MOR3207을 사용하여) 수행하였다. 단백질 1의 발현은 His-태그를 사용하여 검출할 수 없었던 반면에, 리소자임과의 융합은 단백질 1의 발현을 가능하게 하였다(표 1). 추가로, 리소자임 특이적 항체에 의한 융합 단백질의 정제는 IMAC에 의한 정제에 비해 상당히 더 많은 양을 수득하였다. 더구나, 정제된 단백질의 응집은 검출할 수 없었다.

His- 또는 리소자임-태그에 융합된 단백질 1의 발현 및 정제. 단백질 1은 116 aa의 크기를 갖는다.
작제물	발현	정제	수율 [㎎/ℓ]	응집체 ² [%]
pMax_단백질 1_His	200 ㎖ 일시적	IMAC	0	n.d.
pMax_단백질 1_Lys	200 ㎖ 일시적	Lys (MOR3207)	2.0	0

표 2 및 표 3에서는 Fc- 또는 His-태그의 조합을 사용하여 발현될 수 없는 추가의 단백질이 예시된다. 그러나, 리소자임과의 융합은 단백질 2 및 단백질 3의 두 가지 단백질 모두의 발현 및 정제를 가능하게 하였다. 단백질 2의 경우에는, 단백질 2에 리소자임을 융합시킴으로써 정제 후에 0.3 ㎎/l로부터 4.0 ㎎/l로의 수율의 증가가 달성되었다. 더구나, 응집의 수준은 정제된 융합 단백질의 7% 미만이었다.

Fc-, His- 또는 리소자임-태그에 융합된 단백질 2의 발현 및 정제. 단백질 2는 517 aa의 크기를 갖는다.
작제물	발현	정제	수율 [㎎/ℓ]	응집체 [%]
pMax_단백질 2_Fc-Avi_His	600 ㎖ 일시적	IMAC	0.3	n.d.
pMax_단백질 2_Avi-His	600 ㎖ 일시적	IMAC	0	n.d.
pMax_단백질 2_Lys-Avi	200 ㎖ 일시적	Lys (MOR3207)	4.0	3.44%

Fc-, His- 또는 리소자임-태그에 융합된 단백질 3의 발현 및 정제. 단백질 3은 257 aa의 크기를 갖는다.
작제물	발현	정제	수율 [㎎/ℓ]	응집체 [%]
pMax_단백질 3_Fc_His	200 ㎖ 일시적	IMAC	0	n.d.
pMax_단백질 3_His	200 ㎖ 일시적	IMAC	0	n.d.
pMax_단백질 3-Lys-His	200 ㎖ 일시적	Lys (MOR3207)	0.4	6.6
pMax_단백질 3_Lys-Avi	200 ㎖ 일시적	Lys (MOR3207)	0.1	2

3.2. 리소자임 융합 단백질은 응집을 덜 나타낸다.

분석된 단백질 4, 5 및 6은 리소자임-융합 단백질로서 발현되는 경우에 증진된 발현율을 나타낼 뿐만 아니라 응집을 덜 나타내었다. 단백질이 His 대신에 리소자임으로 태깅된 경우에, 단백질 4의 발현은 3배를 초과하여 증가되었고, 응집은 3배를 초과하여 감소되었다(표 4).

His- 또는 리소자임-태그에 융합된 특정의 단백질의 발현 및 정제. 단백질 4는 237 aa의 크기를 갖는다.
작제물	발현	정제	수율 [㎎/ℓ]	응집체 [%]
pMax_단백질 4_His	200 ㎖ 일시적	IMAC	3.4	7
pMax_단백질 4_Lys-Avi	200 ㎖ 일시적	Lys (MOR3207)	13	2

리소자임 태그를 GST-태그와 비교하는 경우에, 유사한 결과가 단백질 5(표 5) 및 6(표 6)에 의해서 관찰되었다.

GST- 또는 리소자임-태그에 융합된 특정의 단백질의 발현 및 정제. 단백질 5는 217 aa의 크기를 갖는다.
작제물	발현	정제	수율 [㎎/ℓ]	응집체 [%]
pMax_단백질 5_GST_His	200 ㎖ 일시적	IMAC	3.8	13.4
pMax_단백질 5_Lys-Avi	200 ㎖ 일시적	Lys (MOR3207)	10.4	5.7

GST- 또는 리소자임-태그에 융합된 특정의 단백질의 발현 및 정제. 단백질 6은 193 aa의 크기를 갖는다.
작제물	발현	정제	수율 [㎎/ℓ]	응집체 [%]
pMax_단백질 6_GST_His	200 ㎖ 일시적	IMAC	8.8	10
pMax_단백질 6_Lys-Avi	200 ㎖ 일시적	Lys (MOR3207)	13.5	< 2

따라서, 표 7 및 8에서 분석된 단백질은 또한 GST-His 또는 His-태그에 융합된 단백질과 비교하여 리소자임으로 태깅하면 상당히 더 낮은 응집으로 정제될 수 있었다. 또한, 단백질 8의 발현 수준은 GST-His- 또는 His-태그와 비교하여 리소자임-융합에 의해 증가되는 반면에, 단백질 7의 발현 레벨은 단지 His-태그에 비해서 증가되었지만, GST-His-태그에 비해서는 증가되지 않았다.

GST-, His- 또는 리소자임-태그에 융합된 특정의 단백질의 발현 및 정제. 단백질 7은 193 aa의 크기를 갖는다.
작제물	발현	정제	수율 [㎎/ℓ]	응집체 [%]
pMax_단백질 7_GST_His	200 ㎖ 일시적	IMAC	19.2	17
pMax_단백질 7_His	200 ㎖ 일시적	IMAC	4.2	5(2 종)
pMax_단백질 7_Lys-Avi	200 ㎖ 일시적	Lys (MOR3207)	9.8	5

GST-, His- 또는 리소자임-태그에 융합된 특정의 단백질의 발현 및 정제. 단백질 8은 209 aa의 크기를 갖는다.
작제물	발현	정제	수율 [㎎/ℓ]	응집체 [%]
pMax_단백질 8_GST_His	200 ㎖ 일시적	IMAC	4.7	17
pMax_단백질 8_His	200 ㎖ 일시적	IMAC	1.2	응집체로 인하여 SEC에서 낮은 회수율
pMax_단백질 8_Lys-Avi	200 ㎖ 일시적	Lys (MOR3207)	7.5	0

3.3. 요약

종합적으로, 분석된 모든 단백질에 대한 리소자임의 융합은 대안적 태그(예를 들어, His, GST_His, Fc_His, His)와 비교하여 유익하였다.

단백질 1, 2 및 3의 경우에 발현 수준은 단백질이 리소자임에 융합되었을 때에 상당히 증가하였다. 단백질 7의 경우에, 발현 레벨은 증가하지 않았지만, 리소자임에 대한 융합은 감소된 응집의 관점에서 정제된 단백질의 품질을 상당히 개선시켰다. 그러나, 단백질 4, 5, 6 및 8의 경우에는 단백질이 리소자임에 융합되었을 때에 증가된 발현율과 함께 응집에 대해 상당히 감소된 경향이 관찰되었다.

SEQUENCE LISTING <110> MorphoSys AG <120> Use of lysozyme as a tag <160> 15 <170> BiSSAP 1.0 <210> 1 <211> 129 <212> PRT <213> Gallus gallus <220> <221> SOURCE <222> 1..129 <223> /mol_type="protein" /note="Chicken lysozyme" /organism="Gallus gallus" <400> 1 Lys Val Phe Gly Arg Cys Glu Leu Ala Ala Ala Met Lys Arg His Gly 1 5 10 15 Leu Asp Asn Tyr Arg Gly Tyr Ser Leu Gly Asn Trp Val Cys Ala Ala 20 25 30 Lys Phe Glu Ser Asn Phe Asn Thr Gln Ala Thr Asn Arg Asn Thr Asp 35 40 45 Gly Ser Thr Asp Tyr Gly Ile Leu Gln Ile Asn Ser Arg Trp Trp Cys 50 55 60 Asn Asp Gly Arg Thr Pro Gly Ser Arg Asn Leu Cys Asn Ile Pro Cys 65 70 75 80 Ser Ala Leu Leu Ser Ser Asp Ile Thr Ala Ser Val Asn Cys Ala Lys 85 90 95 Lys Ile Val Ser Asp Gly Asn Gly Met Asn Ala Trp Val Ala Trp Arg 100 105 110 Asn Arg Cys Lys Gly Thr Asp Val Gln Ala Trp Ile Arg Gly Cys Arg 115 120 125 Leu <210> 2 <211> 130 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> SOURCE <222> 1..130 <223> /mol_type="protein" /note="Mouse lysozyme" /organism="Mus musculus" <400> 2 Lys Val Tyr Asn Arg Cys Glu Leu Ala Arg Ile Leu Lys Arg Asn Gly 1 5 10 15 Met Asp Gly Tyr Arg Gly Val Lys Leu Ala Asp Trp Val Cys Leu Ala 20 25 30 Gln His Glu Ser Asn Tyr Asn Thr Arg Ala Thr Asn Tyr Asn Arg Gly 35 40 45 Asp Arg Ser Thr Asp Tyr Gly Ile Phe Gln Ile Asn Ser Arg Tyr Trp 50 55 60 Cys Asn Asp Gly Lys Thr Pro Arg Ser Lys Asn Ala Cys Gly Ile Asn 65 70 75 80 Cys Ser Ala Leu Leu Gln Asp Asp Ile Thr Ala Ala Ile Gln Cys Ala 85 90 95 Lys Arg Val Val Arg Asp Pro Gln Gly Ile Arg Ala Trp Val Ala Trp 100 105 110 Arg Thr Gln Cys Gln Asn Arg Asp Leu Ser Gln Tyr Ile Arg Asn Cys 115 120 125 Gly Val 130 <210> 3 <211> 130 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <220> <221> SOURCE <222> 1..130 <223> /mol_type="protein" /note="Rabbit lysozyme" /organism="Oryctolagus cuniculus" <400> 3 Lys Ile Tyr Glu Arg Cys Glu Leu Ala Arg Thr Leu Lys Lys Leu Gly 1 5 10 15 Leu Asp Gly Tyr Lys Gly Val Ser Leu Ala Asn Trp Met Cys Leu Thr 20 25 30 Lys Trp Glu Ser Ser Tyr Asn Thr Gln Ala Thr Asn Tyr Asn Pro Gly 35 40 45 Asp Lys Ser Thr Asp Tyr Gly Ile Phe Gln Ile Asn Ser Arg Tyr Trp 50 55 60 Cys Asn Asp Gly Lys Thr Pro Arg Ala Val Asn Ala Cys His Ile Pro 65 70 75 80 Cys Ser Asp Leu Leu Lys Asp Asp Ile Thr Gln Ala Val Ala Cys Ala 85 90 95 Lys Arg Val Val Ser Asp Pro Gln Gly Ile Arg Ala Trp Val Ala Trp 100 105 110 Arg Asn His Cys Gln Ser Gln Asp Leu Thr Ser Tyr Ile Gln Gly Cys 115 120 125 Gly Val 130 <210> 4 <211> 130 <212> PRT <213> Capra hircus <220> <221> SOURCE <222> 1..130 <223> /mol_type="protein" /note="Goat lysozyme" /organism="Capra hircus" <400> 4 Lys Val Phe Glu Arg Cys Glu Leu Ala Arg Thr Leu Lys Arg Phe Gly 1 5 10 15 Met Asp Gly Phe Arg Gly Ile Ser Leu Ala Asn Trp Met Cys Leu Ala 20 25 30 Arg Trp Glu Ser Ser Tyr Asn Thr Gln Ala Thr Asn Tyr Asn Ser Gly 35 40 45 Asp Arg Ser Thr Asp Tyr Gly Ile Phe Gln Ile Asn Ser His Trp Trp 50 55 60 Cys Asn Asp Gly Lys Thr Pro Gly Ala Val Asn Ala Cys His Ile Pro 65 70 75 80 Cys Ser Ala Leu Leu Gln Asp Asp Ile Thr Gln Ala Val Ala Cys Ala 85 90 95 Lys Arg Val Val Ser Asp Pro Gln Gly Ile Arg Ala Trp Val Ala Trp 100 105 110 Arg Ser His Cys Gln Asn Gln Asp Leu Thr Ser Tyr Ile Gln Gly Cys 115 120 125 Gly Val 130 <210> 5 <211> 130 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SOURCE <222> 1..130 <223> /mol_type="protein" /note="Human lysozyme" /organism="Homo sapiens" <400> 5 Lys Val Phe Glu Arg Cys Glu Leu Ala Arg Thr Leu Lys Arg Leu Gly 1 5 10 15 Met Asp Gly Tyr Arg Gly Ile Ser Leu Ala Asn Trp Met Cys Leu Ala 20 25 30 Lys Trp Glu Ser Gly Tyr Asn Thr Arg Ala Thr Asn Tyr Asn Ala Gly 35 40 45 Asp Arg Ser Thr Asp Tyr Gly Ile Phe Gln Ile Asn Ser Arg Tyr Trp 50 55 60 Cys Asn Asp Gly Lys Thr Pro Gly Ala Val Asn Ala Cys His Leu Ser 65 70 75 80 Cys Ser Ala Leu Leu Gln Asp Asn Ile Ala Asp Ala Val Ala Cys Ala 85 90 95 Lys Arg Val Val Arg Asp Pro Gln Gly Ile Arg Ala Trp Val Ala Trp 100 105 110 Arg Asn Arg Cys Gln Asn Arg Asp Val Arg Gln Tyr Val Gln Gly Cys 115 120 125 Gly Val 130 <210> 6 <211> 129 <212> PRT <213> Bos taurus <220> <221> SOURCE <222> 1..129 <223> /mol_type="protein" /note="Cow lysozyme" /organism="Bos taurus" <400> 6 Lys Val Phe Glu Arg Cys Glu Leu Ala Arg Thr Leu Lys Lys Leu Gly 1 5 10 15 Leu Asp Gly Tyr Lys Gly Val Ser Leu Ala Asn Trp Leu Cys Leu Thr 20 25 30 Lys Trp Glu Ser Ser Tyr Asn Thr Lys Ala Thr Asn Tyr Asn Pro Ser 35 40 45 Ser Glu Ser Thr Asp Tyr Gly Ile Phe Gln Ile Asn Ser Lys Trp Trp 50 55 60 Cys Asn Asp Gly Lys Thr Pro Asn Ala Val Asp Gly Cys His Val Ser 65 70 75 80 Cys Ser Glu Leu Met Glu Asn Asp Ile Ala Lys Ala Val Ala Cys Ala 85 90 95 Lys His Ile Val Ser Glu Gln Gly Ile Thr Ala Trp Val Ala Trp Lys 100 105 110 Ser His Cys Arg Asp His Asp Val Ser Ser Tyr Val Gln Gly Cys Thr 115 120 125 Leu <210> 7 <211> 130 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <220> <221> SOURCE <222> 1..130 <223> /mol_type="protein" /note="Rat lysozyme" /organism="Rattus norvegicus" <400> 7 Lys Ile Tyr Glu Arg Cys Glu Phe Ala Arg Thr Leu Lys Arg Asn Gly 1 5 10 15 Met Ser Gly Tyr Tyr Gly Val Ser Leu Ala Asp Trp Val Cys Leu Ala 20 25 30 Gln His Glu Ser Asn Tyr Asn Thr Gln Ala Arg Asn Tyr Asn Pro Gly 35 40 45 Asp Gln Ser Thr Asp Tyr Gly Ile Phe Gln Ile Asn Ser Arg Tyr Trp 50 55 60 Cys Asn Asp Gly Lys Thr Pro Arg Ala Lys Asn Ala Cys Gly Ile Pro 65 70 75 80 Cys Ser Ala Leu Leu Gln Asp Asp Ile Thr Gln Ala Ile Gln Cys Ala 85 90 95 Lys Arg Val Val Arg Asp Pro Gln Gly Ile Arg Ala Trp Val Ala Trp 100 105 110 Gln Arg His Cys Lys Asn Arg Asp Leu Ser Gly Tyr Ile Arg Asn Cys 115 120 125 Gly Val 130 <210> 8 <211> 91 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <220> <221> SOURCE <222> 1..91 <223> /mol_type="protein" /note="Cynomolgus lysozyme" /organism="Macaca fascicularis" <400> 8 Ala Ser Leu Ile Ser Arg Cys Asp Leu Ala Gln Val Leu Gln Leu Glu 1 5 10 15 Asp Leu Asp Gly Phe Glu Ser Tyr Ser Leu Ser Asp Trp Leu Cys Leu 20 25 30 Ala Phe Val Glu Ser Lys Phe Asn Ile Ser Lys Ile Asn Glu Asn Ala 35 40 45 Asp Gly Ser Phe Asp Tyr Gly Leu Phe Gln Ile Asn Gly His Tyr Trp 50 55 60 Cys Asn Asp Tyr Arg Ser His Ser Glu Asn Leu Cys Gln Val Asp Cys 65 70 75 80 Gln Gly Leu Ala Arg Ala Pro Gly Trp Glu Arg 85 90 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> synthetic construct <220> <221> SOURCE <222> 1..6 <223> /mol_type="protein" /note="MOR3207 HCDR1" /organism="synthetic construct" <400> 9 Asn Ser Ala Ala Trp Ser 1 5 <210> 10 <211> 18 <212> PRT <213> synthetic construct <220> <221> SOURCE <222> 1..18 <223> /mol_type="protein" /note="MOR3207 HCDR2" /organism="synthetic construct" <400> 10 Arg Ile Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Val Ser Val 1 5 10 15 Lys Ser <210> 11 <211> 16 <212> PRT <213> synthetic construct <220> <221> SOURCE <222> 1..16 <223> /mol_type="protein" /note="MOR3207 HCDR3" /organism="synthetic construct" <400> 11 Leu Asp His Arg Tyr His Glu Asp Thr Val Tyr Pro Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> synthetic construct <220> <221> SOURCE <222> 1..11 <223> /mol_type="protein" /note="MOR3207 LCDR1" /organism="synthetic construct" <400> 12 Ser Gly Asp Asn Leu Pro Ala Tyr Thr Val Thr 1 5 10 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cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat 420 gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa 480 gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca 540 tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca 600 tggtgatgcg gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat 660 ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa aatcaacggg 720 actttccaaa atgtcgtaac aactccgccc cattgacgca aatgggcggt aggcgtgtac 780 ggtgggaggt ctatataagc agagctctct ggctaactag agaacccact gcttactggc 840 ttatcgaaat taatacgact cactataggg agacccaagc tggctagcaa gcttctagcg 900 ccaccatggt gttgcagacc caggtcttca tttctctgtt gctctggatc tctggtgcct 960 acggggatgg taccgggaaa atgatggata tcatcgaggg ccggatggac aaggtgttcg 1020 gcagatgcga gctggccgct gccatgaagc ggcacggcct ggacaactac cggggctaca 1080 gcctgggcaa ctgggtctgc gccgccaagt tcgagagcaa cttcaatact caggccacca 1140 accggaacac cgacggcagc accgactacg gcatcctgca gatcaacagc cggtggtggt 1200 gcaacgacgg caggaccccc ggcagccgga acctgtgcaa catcccttgc agcgccctgc 1260 tgtccagcga catcaccgcc agcgtgaact gcgccaagaa aatcgtgtcc gacggcaacg 1320 gcatgaacgc ctgggtggcc tggcggaacc ggtgcaaggg cacagacgtg caggcctgga 1380 tcagaggctg cagactggtt aactctagag gtctgaacga catcttcgag gctcagaaaa 1440 tcgaatggca cgaataatga gaattctcta gataatgagt ttaaacgggt ggcatccctg 1500 tgacccctcc ccagtgcctc tcctggccct ggaagttgcc actccagtgc ccaccagcct 1560 tgtcctaata aaattaagtt gcatcatttt gtctgactag gtgtccttct ataatattat 1620 ggggtggagg ggggtggtat ggagcaaggg gcaagttggg aagacaacct gtagggcctg 1680 cggggtctat tgggaaccaa gctggagtgc agtggcacaa tcttggctca ctgcaatctc 1740 cgcctcctgg gttcaagcga ttctcctgcc tcagcctccc gagttgttgg gattccaggc 1800 atgcatgacc aggctcacct aatttttgtt tttttggtag agacggggtt tcaccatatt 1860 ggccaggctg gtctccaact cctaatctca ggtgatctac ccaccttggc ctcccaaatt 1920 gctgggatta caggcgtgaa ccactgctcc cttccctgtc cttctgattt taaaataact 1980 ataccagcag gaggacgtcc agacacagca taggctacct ggccatgccc aaccggtggg 2040 acatttgagt 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ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct gagcgggact ctggggttcg 3780 aaatgaccga ccaagcgacg cccaacctgc catcacgaga tttcgattcc accgccgcct 3840 tctatgaaag gttgggcttc ggaatcgttt tccgggacgc cggctggatg atcctccagc 3900 gcggggatct catgctggag ttcttcgccc accccaactt gtttattgca gcttataatg 3960 gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt 4020 ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca tgtctgtata ccgtcgacct 4080 ctagctagag cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc 4140 tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat 4200 gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc 4260 tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg 4320 ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag 4380 cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag 4440 gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc 4500 tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc 4560 agaggtggcg 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gccacctgac gtcgacggat cggga 6275

Claims

(a) 단량체 폴리펩티드 또는 단백질을 숙주 세포내에서 상기 단량체 폴리펩티드 또는 단백질 및 리소자임을 포함하는 융합 단백질로서 발현시키는 단계; 및
(b) 상기 융합 단백질을 단리하는 단계를 포함하여, 단리된 단량체 폴리펩티드 또는 단백질을 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 융합 단백질의 수율이 리소자임을 포함하지 않는 단량체 폴리펩티드 또는 단백질의 수율에 비해 적어도 2배 더 높은 방법.
제1항에 있어서, 단량체 폴리펩티드 또는 단백질 및 리소자임을 포함하는 융합 단백질의 15% 미만이 응집체를 형성하는 방법.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포가 원핵 세포 또는 진핵 세포인 방법.
제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포가 단량체 폴리펩티드 또는 단백질 및 리소자임을 포함하는 상기 융합 단백질을 인코딩하는 발현 벡터로 트랜스펙션되는 방법.
제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 단량체 폴리펩티드 또는 단백질이 적어도 100 아미노산의 길이를 갖는 방법.
제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질이 숙주 세포, 배양 배지 또는 둘 모두로부터 단리되는 방법.
제7항에 있어서, 상기 융합 단백질이 리소자임에 대해 특이적인 항체를 사용하여 단리되는 방법.
제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 리소자임이 포유류의 리소자임인 방법.
제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 리소자임이 리소자임의 단편, 유사체, 동족체, 변이체 또는 유도체인 방법.
폴리펩티드 또는 단백질 및 리소자임을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 발현 벡터 및 리소자임에 대해 특이적인 항체를 포함하는 키트.
제11항에 있어서, 리소자임에 대해 특이적인 상기 항체가 지지 기질에 부착된 키트.
제12항에 있어서, 상기 지지 기질이 아가로스, 세파로스, 폴리아크릴아미드, 아가로스/폴리아크릴아미드 공중합체, 덱스트란, 셀룰로스, 폴리프로필렌, 폴리카보네이트, 니트로셀룰로스, 유리, 종이 및 자분(magnetic particle)으로 구성된 군으로부터 선택되는 키트.