CN101817883B - 一种家蝇天蚕素-人溶菌酶融合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种家蝇天蚕素-人溶菌酶融合蛋白及其制备方法和应用。本发明家蝇天蚕素-人溶菌酶融合蛋白的序列如SEQ ID NO：1所示。该融合蛋白包含家蝇天蚕素的成熟肽序列，多肽接头序列和人溶菌酶的成熟肽序列。本发明根据家蝇天蚕素和人溶菌酶基因序列，以大肠杆菌偏爱密码子设计合成引物，通过重叠延伸拼接(SOE)法进行PCR扩增，得到融合蛋白基因序列以构建重组原核表达质粒，再将其转入宿主细胞，获得表达融合蛋白的工程菌，经过发酵培养和分离纯化，得到本发明家蝇天蚕素-人溶菌酶融合蛋白。本发明融合蛋白融合了家蝇天蚕素和人溶菌酶各自的特点，具有较为明显的抑菌、抗菌活性，可用于制备抗菌或抑菌的药物，有广阔的应用前景。

Description

一种家蝇天蚕素-人溶菌酶融合蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程抗菌蛋白的制备领域，具体涉及一种家蝇天蚕素-人溶菌酶融合蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

自青霉素被发现以来，各种天然、半合成及合成的化合物被大量、成功地应用于抵抗各种微生物感染，然而，随着环境的改变和微生物的适应性进化，大多数致病性微生物对传统抗生素产生耐药性已成为影响公众健康的严重问题(Bonomo RA.Multiple antibiotic-resistant bacteria in long-term-care facilities：Anemerging problem in the practice of infectious diseases[J].Clin Infect Dis，2000，31：1414-1422.；Murinda SE，Ebner PD，Nguyen LT，et al.Antimicrobial resistanceand class 1 integrons in pathogenic Escherichia coli from dairy farms[J].FoodbornePathog Dis，2005，2：348-352.；Wise R.The relentless rise of resistance？[J].JAntimicrob Chemother，2004，54：306-310.)。因此人们不断研制新抗生素或通过改造原有抗生素来对付耐药菌，然而抗生素的研制速度远远不及耐药菌产生的速度，且从本质上并没有超越原有抗生素的杀菌机制。针对此，“无毒、无残留、无耐药性”是新一代抗菌制剂的发展趋势和要求。

抗菌肽是生物体产生的一种具有抗菌作用的阳离子小肽，是生物先天性免疫的重要组成成分，不但具有广谱抗菌性，能抑杀耐药性菌株，而且它的杀菌机制使病原菌不易产生耐药性突变，从而成为最具开发前景的抗生素替代品之一，为解决细菌耐药性这一棘手难题提供了新途径(Kisich KO HM，BoguniewiczM，et al.The constitutive capacity of human keratinocytes to kill Staphylococcusaureus is dependent on beta-defensin 3[J].J Invest Dermatol，2007，127：2368-2380.；Liu PT，Modlin RL.Human macrophage host defense against Mycobacteriumtuberculosis[J].Curr Opin Immunol，2008，20：371-376.)。天蚕素(Cecropin)是发现最早、研究最多的一类抗菌肽，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有较强的抗菌活性，且对革兰氏阴性菌活性更强，而对高等动物机体的正常细胞几乎没有作用(Arcidiacono S，Soares JW，Meehan AM，et al.Membrane permeability andantimicrobial kinetics of cecropin P1 against Escherichia coli[J].J Pept Sci，2009，15：398-403.)。研究表明其杀菌机制为，首先在静电作用下与带负电荷的细菌细胞表面结合，疏水的C端插入细菌细胞膜中的疏水区域，随着Cecropin分子在细菌细胞膜上的集聚，使得膜外正电荷增多，两侧膜电位升高，最终改变了细胞膜的构象，多个Cecropin分子聚合在细菌细胞膜上形成离子通道，造成细菌细胞内物质泄漏和细菌死亡(Park Y，Hahm KS.Antimicrobial peptides(AMPs)：peptidestructure and mode of action [J].J Biochem Mol Biol，2005，38：507-516.；Ferre R，Melo MN，Correia AD，et al.Synergistic effects of the membrane actions ofcecropin-melittin antimicrobial hybrid peptide BP100[J].Biophys J，2009，96：1815-1827.；Gregory SM，Cavenaugh A，Journigan V，et al.A quantitative modelfor the all-or-none permeabilization of phospholipid vesicles by the antimicrobialpeptide cecropin A[J].J Food Prot，2008，94：1667-1680.)。

人溶菌酶是存在于正常体液和组织中的一类非特异性免疫因子，具有较强的杀菌活性尤其是对革兰氏阳性菌活性更强，而且对人体没有毒副作用。一般认为溶菌酶可以通过其活性中心破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的□-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。此外研究还发现抗菌肽天蚕素与溶菌酶之间存在着协同甚至是加强作用(Chalk R，Townson H，Natori S，et al.Purification of aninsect defensin from the mosquito，Aedes aegypti[J].Insect Biochem Mol Biol，1994，24：403-410.；Yoe SM，Kang CS，Han SS，et al.Characterization and cDNA cloningof hinnavin II，a cecropin family antibacterial peptide from the cabbage butterfly，Artogeia rapae[J].Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol，2006，144：199-205.)。

为了寻找具有更高抗菌活性或更广抗菌谱的肽类抗菌药物，国内外研究主要通过改变肽链长度、电荷、增强螺旋度，通过氨基酸替换改变其氨基酸的组成，以及融合相同或不同的抗菌肽或抗菌蛋白等方式来进行肽类抗菌药物分子设计。其中融合技术较为常用，目前国内外已有大量关于新型融合抗菌蛋白研究开发的报道。通过将两种或多种抗菌蛋白或其功能域或其它分子融合成一种新的蛋白，可以取长补短，发挥其综合效应，或使其某些活性显著提高，出现抗菌蛋白简单合用所不具备的生物学效应。如将Cecropin A的第1~8位氨基酸与Melittin的第1~12位氨基酸进行融合组成新的杂交肽(hybrid peptide CA-ME)，不仅保持了Cecropin A的广谱抗菌活性，而且获得一些Melittin的抗菌活性并且无Melittin的细胞毒性(Rodriguez-Hernandez MJ，Saugar J，Docobo-Perez F，et al.Studies on the antimicrobial activity of cecropin A-melittin hybrid peptides incolistin-resistant clinical isolates of Acinetobacter baumannii[J].J AntimicrobChemother，2006，58：95-100.)。Schmitt等将Cecropin A及其反向序列相连构成的双层肽(CECdir-CECret)具有比天然Cecropin A单体更高的抗菌活性及更广的抗菌谱(Schmitt P，Mercado L，Diaz M，et al.(2008)Characterization and functionalrecovery of a novel antimicrobial peptide(CECdir-CECret)from inclusion bodiesafter expression in Escherichia coli[J].Peptides，2008，29：512-519.)。将来源不同的Cecropin片段连接起来结果发现Cecropin A(1~11)-Cecropin D(12~37)比Cecropin A具有更强的抗菌活性，其中对Bacillus subtilis的活性是Cecropin A的6倍，对Streptococcus faecalis的活性是Cecropin A的9倍(Plunkett RM，Murray SI，Lowenberger CA，et al.Generation and characterization of the antibacterial activity ofa novel hybrid antimicrobial peptide comprising functional domains from differentinsect cecropins[J].Can J Microbiol，2009，55(5)：p.520-8.)。此外，研究发现Cecropins和Magainins对Staphylococcus aureus和Staphylococcus pyogenes的活性较弱，而其杂合肽Cecropin A(1~8)-Magainin 2(1~12)活性更强(Xu X，Jin F，Yu X，et al.High-level expression of the recombinant hybrid peptidececropinA(1-8)-magainin2(1-12)with an ubiquitin fusion partner in Escherichia coli[J].Protein Expr Purif，2007，55：175-182.)。国内苏志坚等构建和表达了一种带有凝血酶切割位点的Cecropin杂合肽AD和人酸性成纤维细胞生长因子突变体的融合蛋白S，从而开发出一种既能杀菌又能促进伤口愈合的新型药物(苏志坚，吴晓萍，郑青等，抗菌肽和人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白在毕赤酵母中的表达及其活性鉴定[J].中国药科大学学报，2005，36(1)：p.63-68.)。

融合蛋白技术不仅可以用于进一步探讨融合蛋白的生物学效应、结构和功能、受体信号传导等理论研究，而且为开发临床抗感染新药开辟新的道路。然而，大多数类似的实验都是基于融合作用机理相同或相似(即均以细胞膜为作用靶目标)的蛋白/肽，如上述的CA-ME、(CECdir-CECret)、Cecropin A(1~11)-Cecropin D(12~37)、Cecropin A(1~8)-Magainin 2(1~12)等，有关将作用机制不同且具有协同作用的抗菌蛋白进行融合的报道还很少。

从目前的研究进展来看，虽然Cecropin类抗菌肽、人溶菌酶等肽类抗菌物质在耐药性日益严重的情况下显示出了良好的应用前景，但是肽类抗菌物质的开发与应用还存在很多问题需要解决。首先是和传统抗生素相比，目前所发现的肽类抗菌物质抗菌活性还不太理想，如Cecropin类抗菌肽对不同的微生物的杀灭作用并非完全相同；而溶菌酶的抗菌谱还不广泛，若单独使用则对革兰氏阴性菌的抑制作用并不明显；其次是大量低成本生产肽类抗菌物质，只有获得一定质和量的纯品，才能满足结构活性、毒理试验，乃至治疗等大规模应用的要求。因此进一步研究抗菌蛋白结构与活性的关系、筛选新的高效抗菌蛋白和设计改造已有抗菌蛋白的工作以及寻找低成本大量获得肽类抗菌物质的方法显的尤为重要。

从天然资源中提取肽类抗菌物质，成本高、得率低、工序繁琐；固相合成肽又价格相当昂贵，不适合我国国情，都难以应用于实际临床。通过基因工程方法进行微生物发酵生产肽类抗菌物质则更切实可行，具有实际意义(Mai WJ，Hu CQ.Molecular cloning，characterization，expression and antibacterial analysis ofa lysozyme homologue from Fenneropenaeus merguiensis[J].Mol Biol Rep，2008，36：1587-1595.；Xu X，Jin F，Yu X，et al.Expression and purification of arecombinant antibacterial peptide，cecropin，from Escherichia coli[J].Protein ExprPurif，2007，53：293-301.；Huang L，Leong SSJ，Jiang RR.Soluble fusion expressionand characterization of bioactive human beta-defensin 26and 27[J].Appl MicrobiolBiotechnol，2009，84：301-308.)。肽类抗菌物质和其它蛋白质药物一样，可以通过降解、排泄以及受体介导的内吞等作用方式被清除，因而不会在体内蓄积，对人体无毒副作用。

发明内容

本发明的目的在于根据现有肽类抗菌物质中存在的成本高、抗菌谱不广泛、抑菌作用不明显等问题，提供一种新的、具有多重作用机制的家蝇天蚕素-人溶菌酶融合蛋白。

本发明另一目的在于提供上述家蝇天蚕素-人溶菌酶融合蛋白的制备方法。

本发明还有一个目的在于提供上述家蝇天蚕素-人溶菌酶融合蛋白的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

一种家蝇天蚕素-人溶菌酶融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明家蝇天蚕素-人溶菌酶融合蛋白包含家蝇天蚕素的成熟肽序列，多肽接头序列和人溶菌酶的成熟肽序列。其中，所述多肽接头序列为(GGGGS)_n，其中n是大于或等于1的整数，G表示甘氨酸残基，S表示丝氨酸残基。

本发明家蝇天蚕素(Mdc)-人溶菌酶(Hly)融合蛋白的制备方法包括如下步骤：设计引物，序列如SEQ ID NO：2~5所示，扩增后的序列通过重叠延伸拼接(SOE)法得到融合蛋白基因(Mdc-hly)序列以构建重组原核表达质粒，再将其转入宿主细胞，获得表达融合蛋白的工程菌，经过发酵培养和分离纯化，得到家蝇天蚕素-人溶菌酶融合蛋白。

作为一种优选方案，本发明家蝇天蚕素-人溶菌酶融合蛋白的制备方法包括如下步骤：

(1)家蝇天蚕素和人溶菌酶成熟肽序列的克隆：设计引物，序列如SEQ IDNO：6~9所示，前两段引物扩增家蝇天蚕素成熟肽基因序列，后两段引物扩增人溶菌酶成熟肽基因序列，将所得两段序列分别克隆入pMD 20-T载体，得到相应的家蝇天蚕素重组质粒和人溶菌酶重组质粒；

(2)融合基因重组：分别以步骤(1)所述两个重组质粒为模板设计两对引物，引物序列如SEQ ID NO：2~5所示，用两对引物分别进行PCR扩增，得到的PCR产物通过重叠延伸拼接(SOE)法得到融合蛋白基因序列，将该序列克隆入pMD 20-T载体，得到重组质粒，所述融合蛋白基因全序列如SEQ ID NO：10所示；

(3)将步骤(2)所得重组质粒和表达载体pET32a经酶切连接后，得到家蝇天蚕素-人溶菌酶融合蛋白基因重组表达质粒；

(4)将家蝇天蚕素-人溶菌酶融合蛋白基因表达质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，经筛选，挑取阳性菌落培养，收集菌体进行超声破碎，经分离纯化，得到家蝇天蚕素-人溶菌酶融合蛋白。

本发明家蝇天蚕素-人溶菌酶融合蛋白可以用于制备抗菌药物、抑菌药物或防腐剂。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明通过融合家蝇抗菌肽cecropin及人溶菌酶，优化所融合的两种蛋白的性能，拓展抗菌肽及溶菌酶的抗菌谱，增强二者的抗菌活性，降低细菌的耐受机率，甚至产生新功能。本发明融合抗菌蛋白技术不仅可以用于进一步探讨抗菌肽的生物学效应、结构和功能、受体信号传导等理论研究，而且为开发临床抗感染新药开辟新的道路；

(2)本发明可大量生产：本发明用基因工程方法，利用原核表达系统以融合方式进行微生物发酵使抗菌融合蛋白获得大量表达，克服了由于抗菌肽分子量过小导致表达过程中降解等问题，并且根据大肠杆菌偏好密码子，对抗菌肽基因修饰和密码子优化，不仅提高了抗菌融合蛋白在大肠杆菌中的表达效率，还可以避免部分专利的限制，与传统的多肽合成方法及从天然资源提取多肽的方法相比，本发明的制备方法突破了以往仅从天然资源中提取多肽或以氨基酸合成方法获得抗菌肽的禁锢，使得大批量、低成本的规模生产成为可能，具有很好的应用前景；

(3)本发明研制的基因工程抗菌融合蛋白生产成本低廉，所用的表达载体带有HIS标签，为进一步纯化重组蛋白提供了极大的方便。所需要的培养基和发酵用的实验设备均具有价格低廉和易于操作的优点，十分适于推广；

(4)许多资料显示，抗菌肽具有广谱抗菌活性且不会向抗生素一样产生耐药性同时无残留，因为抗菌肽是蛋白质药物，而抗生素是化学药物，使其在食品防腐和动物饲料添加剂等方面具有很好的应用前景。

附图说明

图1是Mdc和Hly基因的获得及融合基因Mdc-hly的重组，其中，M为DNA分子量标准(DL 2000)，1为Mdc PCR扩增产物，2为Mdc-Linker PCR扩增产物，3为Hly PCR扩增产物，4为Linker-Hly PCR扩增产物，5为重组的融合基因Mdc-hly；

图2是pET32a载体的物理图谱；

图3是原核表达质粒Mdc-hly/pET32a构建示意图；

图4是重组质粒Mdc-hly/pET32a的核苷酸测序图；

图5是目的蛋白Trx-6His-Mdc-hly的表达、纯化、酶切和融合蛋白Mdc-hly的获得，其中，M为蛋白质分子质量标准；1~2为E.coliBL21/pET32a-Mdc-hly诱导前和诱导后全菌蛋白，3为E.coliBL21/pET32a-Mdc-hly超声破菌后包涵体，4为纯化后目的蛋白Trx-6His-Mdc-hly，5为目的蛋白Trx-6His-Mdc-hly酶切后混合物，6为Trx-6His-Mdc-hly酶切后纯化的Mdc-hly蛋白，7为Trx-6His-Mdc-hly酶切后洗脱液中的Trx标签；

图6是目的蛋白Trx-6His-Mdc-hly的Western-blotting鉴定，其中，M为蛋白质分子质量标准，1为E.coli BL21/pET32a-Mdc-hly诱导前全菌蛋白，2为E.coli BL21/pET32a-Mdc-hly诱导后全菌蛋白。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件进行，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。

实施例1

本方案利用Novagen公司的pET表达系统表达融合基因Mdc-hly，pET32a(+)质粒为表达载体，宿主细胞为大肠杆菌。

1家蝇天蚕素(Mdc)和人溶菌酶(Hly)成熟肽序列的克隆(参见图1)

参照Trizol Reagent使用说明分别提取家蝇三龄幼虫和人胎盘组织总RNA，根据Genebank公布的天蚕素(Genebank登录号：EF175878)和人溶菌酶(Genebank登录号：J03801)cDNA序列，用Primer Premier 5.0生物软件设计4条特异引物，P1~P4，引物序列如SEQ ID NO：6~9所示。引物P1、P2扩增Cecropin成熟肽序列，其中上游P1引入Nco I酶切位点，下游P2去掉终止密码子，增加一个天冬酰氨密码子AAC并引入BamH I酶切位点；引物P3、P4扩增人溶菌酶成熟肽序列，上游P3含BamH I酶切位点，下游P4含Hind III酶切位点。利用RT-PCR技术扩增得到家蝇天蚕素和人溶菌酶成熟肽基因的编码区序列，分别将目的片段克隆入pMD 20-T载体，得到家蝇天蚕素重组质粒Mdc/pMD 20-T和人溶菌酶重组质粒Hly/pMD 20-T，分别转化大肠杆菌DH₅□，经过蓝白斑筛选、菌液PCR鉴定、酶切鉴定及DNA测序分析后，表明获得与Genebank公布一致的天蚕素和人溶菌酶成熟肽序列。

2 融合基因重组(图1)

利用Gene-SOEing技术构建融合基因，具体方法如下：

(1)引物设计：分别以pMD 20-T/Mdc和pMD 20-T/Hly重组质粒为模板，设计两对特异性引物P5~8，序列如SEQ ID NO：2~5所示，引物(P5)：5′-CATGCCATGGCGATGGGCTGGTTGAAAAAAATCGGCAAGAA-3′，(P6)：5′-

TTCCACCGCCACCGTTACCCTTTAAT-3′(划线部分为Nco I酶切位点，斜体为疏水性多肽接头(Gly₄Ser)₃的重叠DNA序列部分)用于扩增带Linker的天蚕素的成熟肽序列。引物(P7)：5′-

CGGTGGCGGCAGCAAGGTCTTTGAAA -3′，(P8)：5′-CCCAAGCTTATTACACTCCACAACCTTGAACATACTGACGGACAT-3′(划线部分为Hind III酶切位点，斜体为疏水性多肽接头(Gly₄Ser)₃的重叠DNA序列部分)用于扩增带Linker的溶菌酶的成熟肽序列。

(2)PCR扩增Mdc-Linker

以质粒Mdc/pMD20-T为模板，用引物P5和P6扩增Mdc-Linker特异片段。向0.2ml Eppendorf管中逐项加入下表所列成分：

5×PrimeSTAR Buffer(Mg²⁺ plus)               5.0μl

dNTP Mixture(2.5mmol/L each)                 2.0μl

Sterile H₂O                                  15.75μl

P5Primer(10μM/L)                            0.5μl

P6Primer(10μM/L)                            0.5μl

Mdc/pMD20-T Plasmid                          1.0μl

PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5units/μl)    0.25μl

Total volume                                 25.0μl

Eppendorf管置入DNA扩增仪中，反应条件为：98℃ 10sec，68℃ 30sec，循环30次。采用北京TIANGEN公司的TIANgel Midi Purification Kit纯化PCR产物。

(3)PCR扩增Linker-Hly

以质粒Hly/pMD20-T为模板，用引物P7和P8扩增Linker-Hly特异片段。向0.2ml Eppendorf管中逐项加入下表所列成分：

5×PrimeSTAR Buffer(Mg²⁺plus)                5.0μl

dNTP Mixture(2.5mmol/L each)                 2.0μl

Sterile H₂O                                  15.75μl

P7 Primer(10μM/L)                           0.5μl

P8 Primer(10μM/L)                           0.5μl

Hly/pMD20-T Plasmid                          1.0μl

PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5units/μl)    0.25μl

Total volume                                 25.0μl

Eppendorf管置入DNA扩增仪中，反应条件为：98℃ 10sec，68℃ 30sec，循环30次。采用北京TIANGEN公司的TIANgel Midi Purification Kit纯化PCR产物。

(4)利用Gene-SOEing技术，通过三步法构建融合基因，具体方法如下：第一步以PCR回收产物Mdc-Linker、Linker-Hly为模板，由于Mdc-Linker的3’端和Linker-Hly的5’端具有部分重叠链，在扩增反应中通过重叠链的延伸从而将两段基因拼接起来，合成全长的融合蛋白基因。第二步再以引物P5和P8进行大量扩增。第三步用TaKaRa Taq聚合酶为融合基因加上Poly A尾，以利于下一步的TA克隆。PCR反应体系及条件如下：

向0.2ml Eppendorf管中逐项加入下表所列成分：

5×PrimeSTAR Buffer(Mg²⁺plus)                5.0μl

dNTP Mixture(2.5mmol/L each)                 2.0μl

Sterile H₂O                                  12.75μl

Mdc-Linker                                   2.0μl

Linker-Hly                                   2.0μl

PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5units/μl)    0.25μl

Total volume                                 24.0μl

Eppendorf管置入DNA扩增仪中，反应条件为：98℃ 10sec，68℃ 30sec，循环10次。取出Eppendorf管加入

P5 Primer(10μM/L)                           0.5μl

P8 Primer(10μM/L)                           0.5μl

Eppendorf管置入DNA扩增仪中，反应条件为：98℃ 10sec，68℃ 40sec，循环30次。取出Eppendorf管加入

TaKaRa Taq(5units/μl)                       0.125μl

Eppendorf管置入DNA扩增仪中，72℃延伸20min。用TIANgel MidiPurification Kit回收，纯化PCR产物。将目的片段克隆入pMD 20-T载体，得到重组质粒Mdc-hly/pMD 20-T，分别转化大肠杆菌DH5□，经过蓝白斑筛选、菌液PCR鉴定、酶切鉴定及DNA测序分析后，表明获得融合基因中Mdc、Hly及linker序列、拼接组合的顺序及方向完全正确，说明融合基因重组成功。

3 融合基因表达载体的构建(图3、图4)

将重组质粒Mdc-hly/pMD 20-T和表达载体pET32a分别用限制性内切酶NcoI和Hind III进行双酶切，然后用T4连接酶连接过夜，连接产物转化E.coli BL21，转化菌种涂于含有氨苄青霉素的平板，培养16~18h后，挑取单菌落培养后进行菌液PCR、酶切鉴定及DNA测序验证，结果表明融合基因表达质粒Mdc-hly/pET32a构建成功。

4 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达及表达产物分析鉴定(参见图5、图6)

将纯化的Mdc-hly/pET32a质粒转化已制备好的E.coli BL21(DE3)感受态细胞，经氨苄抗性筛选，挑取pET32a/Mdc-hly阳性单菌落到5ml LB液体培养基中(1wt％的蛋白胨，0.5wt％的酵母抽提粉，85mmol/L的氯化钠)，37℃、220rpm振摇8~12h，然后将此菌液按1∶100比例接种到新鲜的LB液体培养基中，37℃、220rpm振摇至OD₆₀₀约0.6时，加入终浓度为1.0mmol/L的异丙基-□-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导4~6h。离心收集菌细胞加入1×SDS-PAGE Buffer(50mMTris-HCl pH6.8，100mM DTT，2wt％SDS，0.1wt％溴酚蓝，10wt％甘油)，煮沸5min，离心，取上清加样。制作6体积％的浓缩胶，15体积％的分离胶，电泳电压：浓缩胶80V，分离胶120V。电泳结束后，凝胶进行考马斯亮蓝染色、脱色、扫描分析，因融合蛋白含187个氨基酸，理论分子量约为20.13KD，而载体pET32a具有Trx标签蛋白，分子量约为18kDa因此表达的目的蛋白应是大约38kDa。SDS-PAGE结果表明：诱导后菌体有明显表达条带与预期相符，

目的蛋白主要是以包涵体的形式存在于超声裂菌后的沉淀中，约占总不溶性蛋白的82％。由于目的蛋白含有pET32a编码的6×His标签，采用鼠源His单克隆抗体为一抗进行Western Blotting，结果显示诱导后的含重组质粒表达菌株在38kDa处有一条特异性条带而未诱导的没有，进一步证实了表达的蛋白为带有His标签的目的蛋白

5 分离纯化融合蛋白Mdc-hly(图5)

按最佳诱导表达条件诱导表达基因工程重组菌1000ml，离心收集诱导表达的菌体进行超声破菌，4℃ 14000rpm离心30min，收集沉淀。用包涵体溶解液(50mmoL/L Tris-HCl buffer，8mmoL/L urea，PH8.0)溶解包涵体沉淀。由于诱导表达的目的蛋白带有6×His标签，能与6×His配体特异性结合因而可利用GE healthcare的HisTrap^TM HP和蛋白纯化系统进行亲和层析纯化。将变性液离心之后所得上清过预平衡的HisTrap^TM HP纯化柱，用Binding buffer洗去柱子上非特异性蛋白之后进行线性洗脱，咪哇浓度范围为0~500mM，洗脱总体积为柱床的10倍。经凝胶扫描分析系统分析纯化产物Trx-6His-Mdc-hly的纯度约为95％。经4℃下进行梯度透析逐步去除变性剂，得到的复性蛋白用重组Enterokinase室温下酶切16h。酶切后的蛋白混合溶液用Enterokinase Capture Kit去除残留肠激酶，滤液再过HisTrap^TM HP柱去除N端Trx标签，收集穿透液，用U-Tube concentrator超滤除盐浓缩。最终，每升发酵菌液得到纯度为95％的融合蛋白Mdc-hly约21.4mg。

实施例2 融合蛋白Mdc-hly的抑菌活性分析

采用微量肉汤稀释法分别测定金黄色葡萄球菌(S.aureus)ATCC25923，溶壁微球菌(M.lysodeikticus)CICC23645，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)ATCC6633，和大肠埃希氏菌(E.coli)ATCC25922，铜绿假单孢菌(P.aeruginosa)ATCC27853，沙门氏菌(S.paratyphi-B)CICC 21495的MIC值。将Mdc、Hly、Mdc-hly分别用sterile Milli-Q water倍比稀释至终浓度为200，100，75，50，25，12.5，6.25，3.121.56，0.78，and 0.39uM。分别接种单菌落至Mueller Hinton(简称M-H)培养基中，过夜培养后，按1∶100接种于新鲜M-H培养液，35℃培养到对数生长期，分别于血细胞计数板镜下计数，并以M-H培养液调整浓度至2×10⁶CFU/ml(colonyforming units per ml)。取无菌96孔板，于各孔中分别加入新鲜配制的菌液100微升，再分别加入倍比稀释的Mdc，Hly，Mdc-hly溶液100微升。同时设立阳性对照和阴性对照，阳性对照以sterile Milli-Q water水100微升代替蛋白溶液，而阴性对照为蛋白溶液不含菌液。各药敏板于37℃培养16-20h。各试验重复3次。实验组无菌生长的最小稀释度所对应的浓度为最小抑菌浓度(MIC)。结果见表1。

表1 融合蛋白及其亲本蛋白的最小抑菌浓度

注：a是ND(inhibitory activity was not detected)

如表1所示，Mdc对6种测试菌株的MIC范围为0.78μM到50μM，革兰氏阴性菌比革兰氏阳性菌更敏感。Hly对3种革兰氏阳性菌的MIC范围为1.56μM到12.5μM，对3种革兰氏阴性菌在测试浓度范围内均无杀菌作用。而融合蛋白对6种菌株，包括革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌均有较强的杀菌活性(MIC范围为0.39μM到25μM/l)，其中E.coli最敏感，M.lysodeikticus和S.paratyphi-B其次。相比其亲本蛋白，融合蛋白Mdc-hly的抗菌谱更广，抗菌活性也有显著增强。

 序列表

<110>广东药学院

<120>一种家蝇天蚕素-人溶菌酶融合蛋白及其制备方法和应用

<130>

<160>10

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>187

<212>PRT

<213>人工序列

<400>1

Met Gly Trp Leu Lys Lys Ile Gly Lys Lys Ile Glu Arg Val Gly Gln

1               5                   10                  15

His Thr Arg Asp Ala Thr Ile Gln Thr Ile Gly Val Ala Gln Gln Ala

            20                  25                  30

Ala Asn Val Ala Ala Thr Leu Lys Gly Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly

        35                  40                  45

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Val Phe Glu Arg Cys Glu

    50                  55                  60

Leu Ala Arg Thr Leu Lys Arg Leu Gly Met Asp Gly Tyr Arg Gly Ile

65                  70                  75                  80

Ser Leu Ala Asn Trp Met Cys Leu Ala Lys Trp Glu Ser Gly Tyr Asn

                85                  90                  95

Thr Arg Ala Thr Asn Tyr Asn Ala Gly Asp Arg Ser Thr Asp Tyr Gly

            100                 105                 110

Ile Phe Gln Ile Asn Ser Arg Tyr Trp Cys Asn Asp Gly Lys Thr Pro

        115                 120                 125

Gly Ala Val Asn Ala Cys His Leu Ser Cys Ser Ala Leu Leu Gln Asp

    130                 135                 140

Asn Ile Ala Asp Ala Val Ala Cys Ala Lys Arg Val Val Arg Asp Pro

145                 150                 155                 160

Gln Gly Ile Arg Ala Trp Val Ala Trp Arg Asn Arg Cys Gln Asn Arg

                165                 170                 175

Asp Val Arg Gln Tyr Val Gln Gly Cys Gly Val

            180                 185

<210>2

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

catgccatgg cgatgggctg gttgaaaaaa atcggcaaga a                         41

<210>3

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

ccactacccc ccccgccgct tccaccgcca ccgttaccct ttaat                     45

<210>4

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

gcggcggggg gggtagtggc ggtggcggca gcaaggtctt tgaaa                     45

<210>5

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

cccaagctta ttacactcca caaccttgaa catactgacg gacat                     45

<210>6

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

catgccatgg cgatgggctg gttgaaaaaa at                                   32

<210>7

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

cgggatccgt taccctttaa tgtggcggca aca                                  33

<210>8

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

cgggatccaa ggtctttgaa aggtgtgagt                                      30

<210>9

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

cccaagctta ttacactcca caaccttgaa cat                                  33

<210>10

<211>561

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

atgggctggt tgaaaaaaat cggcaagaaa attgaacgtg ttggtcaaca tacccgcgat     60

gctacaattc aaactattgg tgtggcccag caggcagcta atgttgccgc cacattaaag    120

ggtaacggtg gcggtggaag cggcgggggg ggtagtggcg gtggcggcag caaggtcttt    180

gaaaggtgtg agttggccag aactctgaaa agattgggaa tggatggcta caggggaatc    240

agcctagcaa actggatgtg tttggccaaa tgggagagtg gttacaacac acgagctaca    300

aactacaatg ctggagacag aagcactgat tatgggatat ttcagatcaa tagccgctac    360

tggtgtaatg atggcaaaac cccaggagca gttaatgcct gtcatttatc ctgcagtgct    420

ttgctgcaag ataacatcgc tgatgctgta gcttgtgcaa agagggttgt ccgtgatcca    480

caaggcatta gagcatgggt ggcatggaga aatcgttgtc aaaacagaga tgtccgtcag    540

tatgttcaag gttgtggagt g                                              561

Claims (7)

1.一种家蝇天蚕素-人溶菌酶融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的家蝇天蚕素-人溶菌酶融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白包含家蝇天蚕素的成熟肽序列，多肽接头序列和人溶菌酶的成熟肽序列。

3.根据权利要求2所述的家蝇天蚕素-人溶菌酶融合蛋白，其特征在于所述多肽接头序列为(GGGGS)_n，其中n是大于或等于1的整数，G表示甘氨酸残基，S表示丝氨酸残基。

4.制备权利要求1～3任一项所述家蝇天蚕素-人溶菌酶融合蛋白的方法，其特征在于包括如下步骤：设计引物，序列如SEQ ID NO：2～5所示，扩增后的序列通过重叠延伸拼接法得到融合蛋白基因序列以构建重组原核表达质粒，再将其转入宿主细胞，获得表达融合蛋白的工程菌，经过发酵培养和分离纯化，得到家蝇天蚕素-人溶菌酶融合蛋白。

5.根据权利要求4所述家蝇天蚕素-人溶菌酶融合蛋白的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：

(1)家蝇天蚕素和人溶菌酶成熟肽序列的克隆：设计引物，序列如SEQ IDNO：6～9所示，前两段引物扩增家蝇天蚕素成熟肽基因序列，后两段引物扩增人溶菌酶成熟肽基因序列，将所得两段序列分别克隆入pMD 20-T载体，得到相应的家蝇天蚕素重组质粒和人溶菌酶重组质粒；

(2)融合基因重组：分别以步骤(1)所述两个重组质粒为模板设计两对引物，引物序列如SEQ ID NO：2～5所示，用两对引物分别进行PCR扩增，得到的PCR产物通过重叠延伸拼接法得到融合蛋白基因序列，将该序列克隆入pMD20-T载体，得到重组质粒，所述融合蛋白基因全序列如SEQ ID NO：10所示；

(3)将步骤(2)所得重组质粒和表达载体pET32a经酶切连接后，得到家蝇天蚕素-人溶菌酶融合蛋白基因重组表达质粒；

(4)将家蝇天蚕素-人溶菌酶融合蛋白基因表达质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，经筛选，挑取阳性菌落培养，IPTG诱导表达后收集菌体进行超声破碎，经分离纯化，得到家蝇天蚕素-人溶菌酶融合蛋白。

6.权利要求1～3所述家蝇天蚕素-人溶菌酶融合蛋白在制备抗菌或抑菌药物中的应用。

7.权利要求1～3所述家蝇天蚕素-人溶菌酶融合蛋白在制备防腐剂中的应用。

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