JP2015213511A - 免疫グロブリン溶液を精製するための方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】酸のpH値の範囲を調節すること及びそれに続く酸性化された溶液のインキュベーションによって、宿主細胞核酸及び宿主細胞タンパク質を沈殿させ、標的ポリペプチドが、溶液にとどまり、沈殿物を除去し、その後沈殿として回収される、混入した宿主細胞成分を簡単な物理的分離工程によって除去する方法。
【選択図】図10
Description
組み換えモノクローナル抗体及び他のタンパク質などの生物学的巨大分子は、広範囲の診断および治療分野で使用されている。特に、モノクローナル抗体は、現在、癌または関節リウマチのような、種々の深刻な疾病において、広く使用されている。一般に、これらの複雑な生物学的分子は、バクテリア、酵母、または、哺乳類細胞の発酵工程で製造される。伝統的には、微生物細胞または哺乳類細胞は、遠心分離またはろ過によって、発酵ブロスから除去され、その後、細胞のない上澄み液がさらに濾過、沈殿、及びクロマトグラフィーのような種々の方法によって、発酵関係の不純物をさらに除かれ精製される。
(i) 酸及び水からなる溶液を、細胞及び細胞片が除去された細胞培養上澄み液に加え、pH値をpH4.5〜pH5.5の値に調節する工程であって、それによって溶液に二価の陽イオンが実質的に無いようにする、工程、
(ii) pHが調節された細胞培養上澄み液をインキュベートする工程、及び
(iii) インキュベートされた細胞培養上澄み液から沈殿物を除去する工程であって、それによって免疫グロブリンを生産または得る、工程、
ここで、細胞培養上澄みは、10mg/mlを超えない濃度で免疫グロブリンを含み、加える酸の濃度は、5.5mol/l以下である。
(a) ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を培養する工程、
(b) 細胞培養上澄み液から細胞及び細胞片を除去する工程、
(c) 細胞培養上澄み液のpH値を、pH5.5未満の値に調節する工程、
(d) pHが調節された細胞培養上澄み液をインキュベートする工程、及び
(e) インキュベートされた細胞培養上澄み液から沈殿物を除去する工程であって、それによってポリペプチドを生産する、工程。
(a) 細胞培養上澄み液のpH値をpH5.5未満の値に調節する工程、
(b) pHが調節された細胞培養上澄み液をインキュベートする工程、及び
(c) インキュベートされた細胞培養上澄み液から沈殿物を除去する工程であって、それによって細胞培養上澄み液を精製する、工程。
(i) ポリペプチドをコードする核酸を含む哺乳類細胞を提供する工程、
(ii) 無血清条件下で細胞を培養する工程、
(iii) 細胞培養上澄み液を回収し、任意で、細胞及び細胞片を細胞培養上澄み液から除去する工程、及び
(iv) 細胞培養上澄み液を下記の工程によって精製する工程であって、それによってポリペプチドを生産する、工程、
(a) 酸及び水からなる溶液を、溶液に二価の陽イオンが実質的にない細胞培養上澄み液に加え、pH値をpH5.5未満の値に調節する工程、
(b) pHが調節された細胞培養上澄み液をインキュベートする工程、及び
(c) インキュベートされた細胞培養上澄み液から沈殿物を除去する工程、
ここで、細胞培養上澄み液は、10mg/mlを超えない濃度でポリペプチドを含み、ここで、加える酸の濃度は、5.5mol/l以下である。
[本発明1001]
(i) 細胞及び細胞断片が除去された細胞培養上澄み液に、酸と水からなる溶液を加え、pH値をpH4.5〜pH5.5の値に調節する工程であって、それによって溶液に二価の陽イオンが実質的にない、工程、
(ii) pHが調節された細胞培養上澄み液をインキュベートする工程、及び
(iii) インキュベートされた細胞培養上澄み液から沈殿物を除去する工程であって、それによって免疫グロブリンを生産する、工程、
を含む、免疫グロブリンを生産するための方法であって、
細胞培養上澄み液が、免疫グロブリンを10mg/mlを超えない濃度で含み、
加えられた酸の濃度が5.5mol/l以下である、方法。
[本発明1002]
少なくとも90%の免疫グロブリンが、インキュベートする工程の間溶液にとどまっていることを特徴とする、本発明1001の方法。
[本発明1003]
インキュベートする工程が、2℃〜10℃の温度で行われることを特徴とする、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1004]
pH調節された細胞培養上澄み液をインキュベートする工程が、約4℃の温度で行われることを特徴とする、本発明1003の方法。
[本発明1005]
pH調節された上澄み液をインキュベートする工程が、少なくとも約2時間行われることを特徴とする、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1006]
インキュベートする工程が、約2時間〜約72時間行われることを特徴とする、本発明1005の方法。
[本発明1007]
インキュベートする工程が、約2時間〜約48時間行われることを特徴とする、本発明1006の方法。
[本発明1008]
インキュベートする工程が、約24時間行われることを特徴とする、本発明1007の方法。
[本発明1009]
免疫グロブリンがサブクラスIgG1であり、インキュベートする工程が、pH4.5〜pH3.5のpH値で約2時間〜約48時間行われることを特徴とする、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1010]
免疫グロブリンがサブクラスIgG4であり、インキュベートする工程が、pH5.5〜pH4.5のpH値で約2時間〜約30時間行われることを特徴とする、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1011]
除去する工程が、沈降、デカンテーション、濾過、沈下及び遠心分離から選択される方法によることを特徴とする、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1012]
酸が、酢酸、クエン酸、塩酸、及びリン酸から選択されることを特徴とする、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1013]
酸の濃度が、1.5mol/l〜5.5mol/lであることを特徴とする、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1014]
酸が、1.5mol/l〜4mol/lの濃度の酢酸であることを特徴とする、本発明1012〜1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
免疫グロブリンの濃度が、1mg/ml〜5mg/mlであることを特徴とする、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1016]
細胞がCHO細胞であることを特徴とする、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1017]
インキュベートする工程が、約pH5または約pH4のpH値で、約4℃の温度で約2時間行われることを特徴とする、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1018]
インキュベートする工程が、約pH5または約pH4のpH値で、約4℃の温度で約2時間〜約48時間行われることを特徴とする、本発明1001〜1016のいずれかの方法。
本明細書では、下記の工程を含む、ポリペプチドを精製するための方法を報告する:
(a) ポリペプチドを含む細胞培養上澄み液のpH値をpH3.5〜5.5のpH値に調節する工程、
(b) pHが調節された細胞培養上澄み液をインキュベートする工程、及び
(c) インキュベートされた細胞培養上澄み液から沈殿物を除去する工程であって、それによってポリペプチドを精製する、工程。
材料及び方法
抗体
本明細書で報告される方法は、WO2008/017963に報告されたanti-EGFR抗体を用いて説明される。
残留するDNA濃度は、Q-PCR(定量ポリメラーゼ連鎖反応)によって、測定した。したがって、試料中のDNAを変性させるため、試料を高温でインキュベートした。DNAは、シリカマトリックスによって溶液から捕捉し、製造者の指示に従ってそこから緩衝液で溶出した。抽出のために、QIAamp Viral RNA Kitを含むQIAcubeロボット(両方とも、Qiagen、Hilden、ドイツ)を使用した。したがって、試料、溶解バッファー、及び担体RNAを混合し、10分間インキュベートした。エタノールを各チューブに加え、QIAamp Viral RNA Kitのカラムに試料‐エタノール溶液をロードし、遠心分離した。その後洗浄溶液をカラムに適用し、再度カラムを遠心分離した。その後異なる洗浄溶液をカラムに適用し、カラムを再度遠心分離した。溶出バッファーを適用したのち、カラムは二度遠心分離される。
マイクロタイタープレートのウェルの壁は、血清アルブミン及びストレプトアビジンの混合物でコーティングされている。HCPに対するヤギ由来のポリクローナル抗体が、マイクロタイタープレートのウェルの壁に結合している。洗浄工程の後、マイクロタイタープレートの異なるウェルが、異なる濃度のHCP較正用配列及び試料溶液を用いてインキュベートされる。インキュベーションの後、非結合試料材料が、緩衝溶液で洗浄され除去される。検出のために、ウェルは、結合宿主細胞タンパク質を検出するための抗体ペルオキシダーゼ複合体とともにインキュベートされる。固定化されたペルオキシダーゼの活性は、ABTSとのインキュベーション及び405nmでの検出で検出される。
ASI-100HPLCシステム(Dionex、Idstein、ドイツ)のTosoh Haas TSK 3000 SWXLカラムで、クロマトグラフィーを行った。溶出のピークは、UVダイオードアレイ検出器(Dionex)によって、280nmでモニターした。濃縮された試料を1mg/mlに溶解したのち、200mMリン酸二水素カリウム及び250mMの塩化カリウムからなるpH7.0の緩衝液で、安定したベースラインが達成されるまでカラムを洗浄した。分析ランは、0.5ml/分の流速で30分、室温で、均一濃度の条件下で行った。Chromeleon(Dionex、Idstein、ドイツ)を用い、クロマトグラムを手動で積分した。
イオン交換クロマトグラフィーを用いて、タンパク質の電荷不均一性を解析した。陽イオン交換Dionex ProPac クロマトグラフィーカラムをDionex Chromeleon HPLC システムで使用した。
クロマトグラフィー方法を、試料中に存在する抗体の量を定量化するのに使用した。抗体のFc領域と結合するPoros Aカラムを使用した。抗体はカラムに結合し、続いて低いpH条件で溶出される。タンパク質の濃度は、320nmの参照波長で、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、280nmでの光学濃度(OD)を決定することによって決定された。
手法
試料は、個々の抗体を分泌する株化細胞の培地から直接得た。細胞及び細胞片の除去後、培養上澄み液をそれぞれ200mlのいくつかのアリコットに分け、それぞれに10%または20%(v/v)の酢酸を加えることによって、pH値をpH4.0、pH5.0、pH6.0に調節した。参照のアリコットに関しては、必要である場合pH値をおおよそpH7に調節した。アリコットは4℃で貯蔵し、2、24、及び48時間後に各アリコットから試料を採取した。
Claims (18)
- (i) 細胞及び細胞断片が除去された細胞培養上澄み液に、酸と水からなる溶液を加え、pH値をpH4.5〜pH5.5の値に調節する工程であって、それによって溶液に二価の陽イオンが実質的にない、工程、
(ii) pHが調節された細胞培養上澄み液をインキュベートする工程、及び
(iii) インキュベートされた細胞培養上澄み液から沈殿物を除去する工程であって、それによって免疫グロブリンを生産する、工程、
を含む、免疫グロブリンを生産するための方法であって、
細胞培養上澄み液が、免疫グロブリンを10mg/mlを超えない濃度で含み、
加えられた酸の濃度が5.5mol/l以下である、方法。 - 少なくとも90%の免疫グロブリンが、インキュベートする工程の間溶液にとどまっていることを特徴とする、請求項1記載の方法。
- インキュベートする工程が、2℃〜10℃の温度で行われることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- pH調節された細胞培養上澄み液をインキュベートする工程が、約4℃の温度で行われることを特徴とする、請求項3記載の方法。
- pH調節された上澄み液をインキュベートする工程が、少なくとも約2時間行われることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- インキュベートする工程が、約2時間〜約72時間行われることを特徴とする、請求項5記載の方法。
- インキュベートする工程が、約2時間〜約48時間行われることを特徴とする、請求項6記載の方法。
- インキュベートする工程が、約24時間行われることを特徴とする、請求項7記載の方法。
- 免疫グロブリンがサブクラスIgG1であり、インキュベートする工程が、pH4.5〜pH3.5のpH値で約2時間〜約48時間行われることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 免疫グロブリンがサブクラスIgG4であり、インキュベートする工程が、pH5.5〜pH4.5のpH値で約2時間〜約30時間行われることを特徴とする、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
- 除去する工程が、沈降、デカンテーション、濾過、沈下及び遠心分離から選択される方法によることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 酸が、酢酸、クエン酸、塩酸、及びリン酸から選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 酸の濃度が、1.5mol/l〜5.5mol/lであることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 酸が、1.5mol/l〜4mol/lの濃度の酢酸であることを特徴とする、請求項12〜13のいずれか一項記載の方法。
- 免疫グロブリンの濃度が、1mg/ml〜5mg/mlであることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 細胞がCHO細胞であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- インキュベートする工程が、約pH5または約pH4のpH値で、約4℃の温度で約2時間行われることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- インキュベートする工程が、約pH5または約pH4のpH値で、約4℃の温度で約2時間〜約48時間行われることを特徴とする、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法。
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