KR20220092896A - 단백질 정제 - Google Patents
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Abstract
백신 또는 생물치료제에 유용한, 단백질의 정제 방법, 구체적으로, 당단백질, 예컨대 HIV 외피 단백질의 정제 방법이 본원에 개시된다.
Description
인간 면역결핍 바이러스(Human Immunodeficiency Virus, HIV)는 전 세계적으로 수백만 명의 사람에게서 발생하며, 광범위한 항레트로바이러스 치료 시대에서도 유효한 백신을 통한 HIV의 예방은 매우 높은 우선순위로 남아 있다. HIV-1의 높은 유전적 변이성은 HIV-1 백신의 개발을 유례없는 난제로 만든다. 잠재적 T-세포 에피토프의 커버리지를 개선하고 세포 반응을 개선하기 위해, HIV 군 항원(Gag), 폴리머라아제(Pol), 및 외피(Env) 단백질로부터 유래되는 "모자이크(mosaic)" HIV-1 Gag, Pol 및 Env 항원이 다른 연구자에 의해 기술되었고 잠재적 T-세포 에피토프의 최대 커버리지를 제공하기 위한 시도로 개발되었다(예를 들어, 문헌[Barouch et al, Nat Med 2010, 16: 319-323]). 모자이크 항원은 길이 및 도메인 구조가 야생형, 자연 발생 HIV-1 항원과 유사하다.
HIV에 대한 효과적인 백신은 고도로 글리코실화된, 예를 들어, 20개 이상의 글리코실화 부위를 갖는 하나 이상의 면역원성 단백질을 포함할 수 있다. (글리코실화된) 단백질 중 일부는 또한 생물치료제에 사용되는 표준 단클론 항체보다 상당히 더 클 수 있다. 백신 또는 다른 제약 조성물에서 활성 성분으로 사용될 수 있는 단백질, 구체적으로 글리코실화된 면역원성 단백질의 생성 및 정제를 위한 개선된 방법이 필요하다. 바람직하게는, 본 공정은 허용가능한 전체 회수율 및 높은 순도의 단백질을 가지면서 수율을 개선하고 관심 단백질의 형태 안정성을 유지하며 대규모 생산 및/또는 정제를 위한 기존 시설에 쉽게 적응할 수 있다.
상이한 단백질들은 상이하게 거동하며, 다양한 단백질에 대해 설명된 많은 상이한 가능한 정제 방법에도 불구하고 어떤 공정이 주어진 단백질에 대한 위의 요건을 충족할 것인지를 본질적으로 예측할 수 없다.
본 발명은 단백질, 바람직하게는 글리코실화된 단백질, 예컨대 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 항원성 단백질, 더 바람직하게는 HIV 외피 단백질, 예컨대 HIV-1 클레이드 C의 외피 단백질 또는 모자이크 외피 단백질, 예컨대 HIV gp140 단백질, 예를 들어, 삼량체 HIV 클레이드 C gp140 단백질 또는 삼량체 HIV 모자이크 gp140 단백질의 정제 방법에 관한 것이다.
일반적인 일 양태에서, 본 발명은 단백질, 예컨대 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 외피 단백질의 정제 방법에 관한 것이며, 본 방법은 하기 단계를 포함한다:
a. 단백질을 포함하는 세포 샘플, 예컨대 세포 상청액을 얻는 단계;
b. 세포 샘플의 pH를 약 5.0으로 조정하여 세포 샘플 중 숙주 세포 단백질(host cell protein; HCP)을 침전시키는 단계;
c. 침전된 HCP를 심층 여과에 의해 세포 샘플로부터 제거하여 상기 단백질을 포함하는 여과액을 얻는 단계; 및
d. 단백질을 크로마토그래피에 의해 여과액으로부터 정제하는 단계.
일부 실시 형태에서, HIV 외피 단백질은 HIV-1 클레이드 C의 gp140, 또는 gp140 모자이크 단백질이다.
일부 실시 형태에서, 세포 상청액과 같은 세포 샘플은 진핵 숙주 세포, 바람직하게는 포유류 숙주 세포와 같이, 단백질을 재조합적으로 발현하는 숙주 세포로부터 유래된다. 특정 실시 형태에서, 숙주 세포는 생물반응기에서 유가식 공정으로 단백질을 생산한다. 특정 실시 형태에서, 생물반응기는 약 1 L 내지 약 20000 L, 예를 들어 약 10 L 내지 약 16500 L의 부피를 갖는다.
특정 실시 형태에서, 숙주 세포는, 세포 샘플, 예컨대 세포 상청액의 pH를 조정하기 전에 예를 들어 중력 침강에 의해, 또는 바람직하게는 원심분리, 더 바람직하게는 연속 원심분리에 의해 제거된다.
특정 실시 형태에서, 숙주 세포는, 저 pH 응집에 의해 세포 샘플의 pH를 조정한 후에 예를 들어 중력 침강에 의해, 또는 바람직하게는 원심분리, 더 바람직하게는 연속 원심분리에 의해 제거된다.
특정 실시 형태에서, 본 공정은 하나 이상의 한외여과 및 정용여과(UFDF) 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 단계 c)의 심층 여과는 한외여과 및 정용여과(UFDF) 단계가 뒤따를 수 있다.
특정 실시 형태에서, 단백질은 HIV 외피 단백질, 예를 들어, HIV-1 클레이드 C gp140 또는 HIV-1 모자이크 gp140이며, 크로마토그래피는 바람직하게는 소수성 상호작용 및 양이온 교환 특성을 포함하는 다중모드 수지(혼합 모드 수지로도 칭해짐)를 사용한 포획 단계를 포함한다. 놀랍게도, 이러한 수지가 우수한 정제 결과를 제공함이 밝혀졌다. 특정한 비제한적 예에서, 다중모드 수지는 Capto MMC 또는 Capto MMC ImpRes(Cytiva로부터 구매가능함)이다. 특정 실시 형태에서, HIV 외피 단백질은 특정 염 농도 및 pH에서 로딩되고, 로딩 조건과 비교하여 증가된 염 농도 및 증가된 pH에서 더 순수한 형태로 용출된다.
특정 실시 형태에서, 포획 단계에서 다중모드 수지로부터 용출된 부분 정제 HIV 외피 단백질은 제2 크로마토그래피 공정 단계, 예를 들어 직교 크로마토그래피 단계를 거친다. 특정한 바람직한 실시 형태에서, 제2 크로마토그래피 단계는 음이온 교환 수지, 예를 들어 약한 음이온 교환 수지(예를 들어 Capto DEAE), 또는 바람직하게는 강한 음이온 교환 수지(예를 들어 POROS 50 HQ)를 포함한다. 바람직하게는 HIV 외피 단백질은 이 수지에 결합되고, 후속적으로, 예를 들어 로딩 조건과 비교하여 용출을 위해 증가된 염 농도를 사용하여, 더 순수한 형태로 용출된다.
특정 실시 형태에서, HIV 외피 단백질 함유 분획은 리간드 덱스트란 술페이트를 포함하는 수지, 예를 들어, Capto DeVirS(상이한 유형들의 바이러스에 대해 친화성-유사 거동을 갖는 것으로 알려진 양이온 매체)를 사용하여, 제3 크로마토그래피 단계를 거친다. HIV 외피 단백질은 이 수지에 결합하고, 후속적으로, 예를 들어 이 수지의 로딩 조건과 비교하여 증가된 염 농도를 사용하여, 추가 정제 형태로 용출될 수 있다. 이 단계는 상기 단백질이 클레이드 C gp140 단백질인 경우 특히 유용하다.
특정 실시 형태에서, 저 pH 바이러스 불활성화 단계, 예를 들어 약 pH 3.5에서 약 1시간 동안 유지한 후 0.45~0.2 마이크로미터 필터를 통해 여과시키는 단계는 리간드 덱스트란 술페이트를 갖는 수지가 사용되지 않은 경우 제2 크로마토그래피 단계 후에 수행되거나 리간드 덱스트란 술페이트를 포함하는 수지가 사용되는 경우 제3 크로마토그래피 단계 후에 수행된다.
특정 실시 형태에서, 제4 크로마토그래피 단계(이는 예를 들어 모자이크 gp140 단백질에 대해 전술한 바와 같은 리간드 덱스트란 술페이트를 포함하는 수지가 사용되지 않는 경우 제3 크로마토그래피 단계임)가 수행되고, 여기서, 이전 크로마토그래피 단계(전술한 바와 같은 제2 또는 제3 크로마토그래피 단계)의 HIV 외피 함유 분획은 음이온 교환 및 소수성 작용체를 갖는 혼합 모드 수지, 예를 들어, Capto Adhere 수지에 적용된다. 본 발명의 특정 실시 형태에서, 이 단계의 혼합 모드 수지는 결합 및 용출 모드로 사용된다. 본 발명의 다른 실시 형태에서, 이 수지는 유통(flow-through) 모드로 사용된다. 당업자는 본 개시 내용을 고려하여 HIV 외피 단백질의 정제를 위한 폴리싱 단계로서 이러한 수지의 사용 모드에 적합한 조건을 선택할 수 있다. 이 크로마토그래피 단계는, 바람직하게는 삼량체 HIV-1 gp140을 포함하는 HIV 외피 단백질로부터 육량체 및 숙주 세포 단백질 불순물을 추가로 감소시킬 수 있다.
특정 실시 형태에서, 상기 마지막 크로마토그래피 단계로부터의 정제된 HIV 외피 단백질은 바이러스 체류 여과 단계(예를 들어 Virosart HC 또는 Planova 20N 필터를 사용)를 거친다.
특정 실시 형태에서, 정제된 HIV 외피 단백질은 최종 UFDF 단계를 거친다. 생성된 물질은, 예를 들어 백신으로 사용하기 위한 그의 최종 제형으로 제형화될 수 있다.
본 발명의 일 양태는 HIV-1 gp140 단백질을 정제하는 방법을 제공하는 것이며, 본 방법은 소수성 상호작용 및 양이온 교환 특성을 포함하는 다중모드 수지 상에 단백질을 포획하는 단계, 및 정제된 분획을 상기 수지로부터 용출시키는 단계를 포함하고, 여기서, HIV-1 gp140 단백질의 순도는 포획 단계 동안 수지에 로딩되는 혼합물 중 단백질과 비교하여 실질적으로 증가된다. 이러한 다중모드 수지는 HIV-1 gp140 단백질의 정제에 특히 적합한 것으로 보인다.
본 발명의 또 다른 양태에서, HIV-1 gp140 단백질의 정제 방법이 제공되며, 본 방법은 다음의 단계를 포함한다:
i) HIV-1 gp140 단백질 및 HIV-1 gp140 단백질이 발현된 숙주 세포로부터 유래된 숙주 세포 단백질과 같은 다른 원하지 않는 단백질을 포함하는 조성물을 제공하는 단계;
ii) 소수성 상호작용 및 양이온 교환 특성을 포함하는 다중모드 수지 상에 HIV-1 gp140 단백질을 포획하고, HIV-1 gp140 단백질을 포함하는 정제된 분획을 상기 수지로부터 용출시키는 단계;
iii) HIV-1 gp140 단백질을 결합시키기 위한 음이온 교환 수지에 단계 ii)의 정제된 분획을 적용하고, HIV-1 gp140 단백질을 포함하는 추가 정제 분획을 상기 수지로부터 용출시키는 단계; 및
iv) 단계 iii)의 추가 정제 분획을 음이온 교환 및 소수성 작용체를 갖는 혼합 모드 수지에 적용하고, 추가 정제 HIV-1 gp140 단백질을 용출시키는 단계. 바람직한 실시 형태에서, 이 공정에서 HIV-1 gp140 단백질은 모자이크 gp140 단백질이다.
이 방법의 특정 실시 형태에서, 본 방법은 리간드 덱스트란 술페이트를 포함하는 수지에 단계 iii)의 HIV-1 gp140 단백질의 추가 정제 분획을 적용하고, HIV-1 gp140 단백질을 포함하는 추가 정제 분획을 상기 수지로부터 용출시킨 후, 이 분획을 이 방법의 단계 iv)에 적용하는 추가 단계를 포함한다. 이들 실시 형태는 HIV-1 gp140 단백질이 클레이드 C gp140 단백질인 경우 특히 유용하다.
전술한 요약과, 다음의 [발명을 실시하기 위한 구체적인 내용]은 첨부된 도면과 함께 읽을 때 더 잘 이해될 것이다. 본 발명은 도면에 나타낸 정확한 실시 형태에 한정되지 않음이 이해될 것이다.
도 1a는 원심분리, 이어서 저 pH 응집 및 심층 여과, 및 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 단백질 정제 공정을 보여주며(HIV-1 gp140 단백질에 대한 chrom #1은 예를 들어 소수성 상호작용 및 양이온 교환 특성을 포함하는 혼합 모드 수지를 사용한 포획 단계일 수 있음); 도 1b는 산성 침전 동안 수확물의 탁도 증가를 보여주며;
도 2a 및 도 2b는 도 2a에 예시된 공정을 사용하여 정제 생성물에서 원하는 최소 수준의 숙주 세포 단백질(HCP)이 달성되었음을 보여주며(도 2b); HIV-1 클레이드 C gp140의 경우, 예시된 크로마토그래피 단계에서 사용된 컬럼의 예로는 chrom #1(소수성 상호작용 및 양이온 교환 특성을 포함하는 혼합 모드 수지를 사용한 포획 단계), chrom #2(음이온 교환 수지), chrom #3(리간드 덱스트란 술페이트를 포함하는 수지), chrom #4(음이온 교환 및 소수성 작용체를 갖는 혼합 모드 수지)가 있으며;
도 3은 HIV-1 클레이드 C의 gp140의 정제를 위한 공정 흐름도를 예시하며;
도 4는 gp140 모자이크 단백질의 정제를 위한 공정 흐름도를 예시한다.
도 1a는 원심분리, 이어서 저 pH 응집 및 심층 여과, 및 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 단백질 정제 공정을 보여주며(HIV-1 gp140 단백질에 대한 chrom #1은 예를 들어 소수성 상호작용 및 양이온 교환 특성을 포함하는 혼합 모드 수지를 사용한 포획 단계일 수 있음); 도 1b는 산성 침전 동안 수확물의 탁도 증가를 보여주며;
도 2a 및 도 2b는 도 2a에 예시된 공정을 사용하여 정제 생성물에서 원하는 최소 수준의 숙주 세포 단백질(HCP)이 달성되었음을 보여주며(도 2b); HIV-1 클레이드 C gp140의 경우, 예시된 크로마토그래피 단계에서 사용된 컬럼의 예로는 chrom #1(소수성 상호작용 및 양이온 교환 특성을 포함하는 혼합 모드 수지를 사용한 포획 단계), chrom #2(음이온 교환 수지), chrom #3(리간드 덱스트란 술페이트를 포함하는 수지), chrom #4(음이온 교환 및 소수성 작용체를 갖는 혼합 모드 수지)가 있으며;
도 3은 HIV-1 클레이드 C의 gp140의 정제를 위한 공정 흐름도를 예시하며;
도 4는 gp140 모자이크 단백질의 정제를 위한 공정 흐름도를 예시한다.
다양한 간행물, 논문 및 특허가 [배경기술] 및 명세서 전체에 걸쳐 인용되거나 기술되며; 각각의 이러한 참고문헌은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 본 명세서에 포함된 문헌, 행위, 물질, 디바이스, 물품 등의 논의는 본 발명의 맥락을 제공하는 목적을 위한 것이다. 이러한 논의는 이들 사항 전부 또는 그 중 임의의 것이, 개시되거나 청구되는 임의의 발명에 대해 선행 기술의 일부를 형성한다고 인정하는 것이 아니다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명과 관련된 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 다르게는, 본원에서 사용되는 특정 용어는 명세서에 제시된 바와 같은 의미를 갖는다. 본원에서 인용되는 모든 특허, 공개된 특허 출원 및 공보는 마치 본원에 전체가 제시된 것처럼 참고로 포함된다. 본원에서 그리고 첨부된 청구범위에서 사용되는 단수형 "a", "an", 및 "the"는 문맥상 명확히 달리 기재되지 않는 한 복수의 언급 대상을 포함한다는 것이 주목되어야 한다.
본 명세서 및 이후의 청구범위에 걸쳐서, 맥락이 달리 요구하지 않으면, 단어 "포함하다", 및 "포함한다" 및 "포함하는"과 같은 변형은 명시된 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹의 포함을 의미하지만 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹의 배제를 의미하지 않는 것으로 이해될 것이다. 본 명세서에서 사용될 때 용어 "포함하는"은 용어 "함유하는" 또는 "포함하고 있는"으로 치환될 수 있거나 또는 때때로, 본 명세서에서 사용될 때 용어 "갖는"으로 치환될 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때 "이루어지는"은 청구범위 요소에서 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "본질적으로 이루어지는"은 청구범위의 기본적이고 새로운 특징에 실질적으로 영향을 주지 않는 물질 또는 단계를 배제하지 않는다. 전술한 용어 “포함하는”, “함유하는”, “포함하고 있는” 및 “갖는” 중 임의의 것은, 본 발명의 양태 또는 실시 형태의 맥락에서 본 명세서에서 사용될 때마다, 용어 "이루어지는" 또는 "본질적으로 이루어지는"으로 대체되어 본 발명의 범주를 변경할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 숫자와 함께 사용될 때 “약”이라는 용어는 언급된 숫자의 ±10, 예를 들어 ±5, 또는 ±1% 내의 임의의 숫자를 지칭한다. 예를 들어, 약 5.0의 pH는 4.5~5.5의 임의의 pH를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 다수의 열거된 요소 사이의 접속 용어 "및/또는"은 개별 및 조합 옵션 둘 모두를 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 두 요소가 "및/또는"에 의해 결합될 경우, 첫 번째 옵션은 제2 요소 없이 제1 요소의 적용가능성을 나타낸다. 두 번째 옵션은 제1 요소 없이 제2 요소의 적용가능성을 나타낸다. 세 번째 옵션은 제1 및 제2 요소 둘 다의 적용가능성을 나타낸다. 이들 옵션 중 어느 것이든 그 의미 내에 속하며 따라서 본 명세서에서 사용되는 용어 "및/또는"의 요건을 충족하는 것으로 이해된다. 옵션 중 하나 보다 많은 것의 동시 적용가능성도 그 의미 내에 속하며 따라서 용어 "및/또는"의 요건을 충족하는 것으로 이해된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "대상체"는 본 발명의 실시 형태에 따른 단백질 또는 백신이 투여될 것이거나 투여된 임의의 동물, 바람직하게는 포유류, 가장 바람직하게는 인간을 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "포유류"라는 용어는 임의의 포유류를 포괄한다. 포유류의 예는 소, 말, 양, 돼지, 고양이, 개, 마우스, 래트, 토끼, 기니피그, 원숭이, 인간 등, 더 바람직하게는 인간을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 일반적으로 단백질, 바람직하게는 글리코실화된 단백질, 더 바람직하게는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 외피 단백질, 예컨대 HIV-1 클레이드 C의 외피 단백질 또는 HIV-1 모자이크 외피 단백질을 정제하는 방법에 관한 것이며, 본 방법은 다음의 단계를 포함한다:
a. 단백질을 포함하는 세포 샘플, 예컨대 세포 상청액을 얻는 단계;
b. 세포 샘플의 pH를 약 5.0으로 조정하여 세포 샘플 중 숙주 세포 단백질(HCP)을 침전시키는 단계;
c. 침전된 HCP를 심층 여과에 의해 세포 샘플로부터 제거하여 상기 단백질을 포함하는 여과액을 얻는 단계; 및
d. 여과액 중 상기 단백질을 크로마토그래피에 의해 정제하는 단계.
바람직하게는, 세포 샘플은 세포에 의해 분비되는 단백질을 포함하는 세포 상청액이다. 세포 샘플은 또한 세포 용해물 또는 세포에 의해 생성된 단백질을 포함하는 프로세싱된 세포 용해물일 수 있다. 이러한 용해물은 예를 들어 세포의 막을 분해함으로써 준비될 수 있다. 적용 공정에 유용한 세포 샘플은 본 개시 내용을 고려하여 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수득될 수 있다. 예를 들어, 세포 상청액은 세포를 제거하기 위해 원심분리에 세포 배양물을 적용함으로써 얻어질 수 있다. 세포 용해물은 세포를 파괴하거나 용해시키고 원심분리에 의해 세포 잔사를 제거함으로써 얻어질 수 있다. 세포 상청액 또는 세포 용해물은 직접 사용될 수 있거나 적용 공정에 사용하기 전에 추가로 프로세싱될 수 있다. 바람직하게는, 연속 원심분리를 사용하여 생물반응기로부터 생성된 세포를 제거하여 적용 공정에 유용한 세포 샘플을 얻는다.
일부 실시 형태에서, 숙주 세포는 생물반응기에서 유가식 공정으로 단백질을 생산한다.
특정 실시 형태에서, 생물반응기는 약 1 L 내지 약 20000 L, 예를 들어 약 10 L 내지 약 16500 L, 예를 들어 약 100 L 내지 약 15000 L의 부피를 갖는다.
세포 상청액과 같은 세포 샘플의 pH는 예를 들어, 세포 샘플 중 숙주 세포 단백질(HCP)을 침전시키도록 세포 샘플에 적절한 양의 산(예를 들어, 1 M 아세트산)을 첨가함으로써 조정될 수 있다. 이 공정은 때때로 "저 pH 응집"으로도 지칭된다. 바람직하게는, 세포 샘플의 pH는, 세포 샘플 중 충분한 양의 관심 단백질(예를 들어, HIV gp140)은 침전되지 않으면서 세포 샘플 중 숙주 세포 단백질(HCP)은 침전되도록, 약 5, 예를 들어, 약 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 또는 그 사이의 임의의 값으로 조정된다. 세포용 배양 배지의 단백질과 같은 세포 샘플 중 다른 단백질도 약 5의 pH에서 침전될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 저 pH 응집 공정 동안, 세포 샘플은 HCP를 침전시키기 위해 대략 pH 5에서 약 15분 내지 약 15시간 동안, 예를 들어, 0.5시간 내지 12시간 동안, 예를 들어 약 1시간 내지 3시간, 예를 들어 약 3시간, 바람직하게는 약 1시간 동안 인큐베이션된다.
일부 실시 형태에서, 저 pH 응집은 원심분리 후에 수행될 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 저 pH 응집은 원심분리 전에 수행된다.
세포 샘플로부터의 침전된 HCP를 심층 여과에 의해 제거하여 단백질을 포함하는 여과액을 얻을 수 있다. 다양한 매체 유형(셀룰로오스, 폴리아크릴 섬유, 규조토, 실리카, 활성탄 등의 단층 또는 다층) 및 다양한 등급을 갖는 심층 필터는 본원의 개시 내용을 고려하여 적용 공정에서 심층 여과에 사용될 수 있다. 본 발명에 유용한 심층 필터의 예는 Millipore Sigma의 Millistak+® 패밀리 및 Clarisolve® 심층 필터와 같은 상업적 공급처로부터 입수가능한 심층 필터를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 특정 실시 형태에서, 심층 여과는 Millistak+® C0HC, C0SP, CE35, CE50, D0HC, D0SP, DE, A1HC, B1HC, F0HC, X0HC, X0SP 등과 같은 심층 필터를 사용한다. 사용 전 심층 필터를 평형화하고 산 침전 수확물(예를 들어, 침전 HCP 및 기타 단백질)을 심층 필터를 통해 여과한 후 필터를 추적하기 위해 적합한 완충제가 사용될 수 있다. 바람직하게는, 완충제는 약 5.0의 pH를 갖는다. 바람직하게는, 심층 여과액은 예를 들어 0.45 μm 이하, 바람직하게는 0.22 μm의 필터 기공 크기로 임의의 오염 미생물을 제거하기 위해 살균 여과된다.
특정 실시 형태에서, 한외여과 및 정용여과(UFDF) 단계는 크로마토그래피 단계 전 또는 그 사이에 HCP를 제거하고 관심 단백질(예를 들어, gp140)을 농축하는 데 사용된다. 한외여과(UF)는 묽은 생성물 스트림을 농축하기 위해 일반적으로 사용되는 공정이다. 이것은 막 기공 크기 또는 분자량 컷오프를 기반으로 하여 용액 중 분자를 분리한다. 정용여과(DF)는 종종 생성물을 원하는 완충제로 교환하는 데 사용된다(예를 들어, 용출 완충제로부터 최종 제형 완충제 내로). UF 및 DF는 전형적으로 접선 유동 여과를 사용하며, 여기서 공급물은 막 표면에 수직이 아니라 막 표면에 평행하게 유동한다. 예를 들어, 셀룰로오스 아세테이트, 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 및 폴리에테르술폰(PES)의 막을 비롯한 다양한 UF/DF 막이 사용될 수 있다. 필요에 따라, UF/DF에 사용되는 막들은 상이한 분자량 컷오프(MWCO)를 가질 수 있다. 예를 들어, UF/DF의 MWCO는 예를 들어, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 kDa일 수 있다. 일부 실시 형태에서, UF/DF는 함께 적층된 하나 이상의 평판 막으로 구성된다. UF/DF 공정은 예를 들어 소독 및 사용 전 테스트, 평형화, 농축, 정용여과, 생성물 회수, 세척 및 사용 후 테스트, 및 보관을 포함한다. UF/DF 시스템의 무결성은 확산 테스트를 사용하여 확인될 수 있다. 적합한 UF 및/또는 DF 완충제는 본 개시 내용을 고려하여 UF/DF 공정에 사용될 수 있다. 예를 들어, 완충제는 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 또는 8.5의 pH를 가질 수 있다. 본 개시 내용을 고려하여, 필요에 따라 다양한 교차 유속 및 막 로딩율을 사용할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 적용 공정은 3개 이상의 크로마토그래피 컬럼 단계를 사용한다. 본 개시 내용을 고려하여, 적합한 컬럼이 본 발명에서 사용될 수 있다. 이러한 컬럼의 예는 실시 형태에서 설명되고 예를 들어 도 3 및 도 4에 예시된 것을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
일 실시 형태에서, 적용 공정은 다중모드 수지(혼합 모드 수지로도 칭해짐)를 사용한 포획 크로마토그래피 단계를 포함한다. 다중모드 또는 혼합 모드 크로마토그래피 수지는 본질적으로 다음의 여러 상이한 유형의 상호작용이 가능한 리간드로 작용화된 매체를 기반으로 한다: 예를 들어 이온 교환, 친화성, 크기 배제 및 소수성 중 둘 이상의 조합. 이러한 단백질 분리 모드를 병합하고 활용하는 능력은 정제 공정에서 전반적인 선택성을 향상시킬 수 있다. 이 향상된 선택성은 제거를 위해 다수의 프로세싱 단계가 필요한 단일 컬럼 단계에서 공정 불순물을 제거하는 데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 다중모드 수지는 소수성 상호작용 및 양이온 교환 특성을 가지며, 이는 염 내용성이 더 커서 희석을 최소화하거나 전혀 하지 않고도 단백질을 수지에 결합시킬 수 있다.
본 발명에 유용한 수지는 다양한 형식으로, 예를 들어, 비드, 필터(막), 카트리지 등으로서 존재할 수 있으며(모두 본 발명에 따라 '수지'로 간주됨), 특정 실시 형태에서 수지는 컬럼에서 사용될 수 있는 비드 형태로 존재하며, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 수지는 벤더, 예를 들어 Cytiva(구 GE Healthcare) 및/또는 기타의 것으로부터 상업적으로 입수될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 다중모드 수지는 베이스 수지 상에 선택도가 상이한 2개 이상의 유형의 작용기를 직접 또는 간접적으로 고정화함으로써 제조된 수지일 수 있다. 예를 들어, 다중모드 수지는 고유동 아가로스의 매트릭스 및 리간드로서 다중모드 강 음이온 교환기, 또는 고유동 아가로스의 매트릭스 및 리간드로서 다중모드 약 양이온 교환기를 갖는 다중모드 강 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 포함할 수 있다. 다중모드 수지의 구체적인 예는 Capto Adhere, Capto MMC, Capto Adhere ImpRes 또는 Capto MMC ImpRes(이는 Cytiva에 의해 제조된 것으로서, Capto는 등록 상표임), HEA HyperCel, PPA HyperCel, MEP HyperCel(이는 Pall Corp.에 의해 제조된 것으로서, HyperCel은 상표임), TOYOPEARL(등록 상표) MX-Trp-650M(TOSOH Corp.에 의해 제조) 등을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
특정 실시 형태에서, 다중모드 포획 크로마토그래피는 유통 방식으로 수행된다.
바람직한 실시 형태에서, 다중모드 포획 크로마토그래피는 결합 및 용출 모드로 수행된다.
바람직하게는, 다중모드 포획 크로마토그래피는 숙주 세포 단백질 및 DNA를 제거하기 위해 결합 및 용출 모드로 수행된다. 관심 단백질을 특정 염 농도 및 pH에서 다중모드 포획 수지, 예를 들어 컬럼에 로딩하고, 컬럼에 결합시키고, 그 후 추후 용출 용액에 의해 용출시켜 풀링된 용출물을 얻는다. 관심 단백질은 임의의 적합한 완충제(예컨대 아세테이트 완충제, 히스티딘 완충제, HEPES 완충제, 인산염 완충제 또는 트리스 완충제) 및/또는 염 용액(예컨대 염화나트륨 용액), 예를 들어 약 15~100 mM(예를 들어, 25 mM)의 아세트산나트륨 및 약 10~50 mM(예를 들어, 25 mM)의 염화나트륨을 포함하는 용액(임의의 적합한 pH, 예컨대 약 4~6의 pH(예를 들어, pH 4 또는 5), 및 임의의 적합한 전도도, 예컨대 약 1~50 mS/cm, 예를 들어 예컨대 약 3~50 mS/cm, 예를 들어 약 5~50 mS/cm, 예를 들어 약 3~40 mS/cm, 예를 들어 약 6~40 mS/cm, 바람직하게는 약 3~20 mS/cm, 예를 들어 약 10~20 mS/cm(예를 들어, 약 5 mS/cm, 또는 약 15 mS/cm)의 전도도)에서 컬럼에 로딩될 수 있다. 용출 용액은 임의의 적합한 완충제(예컨대 2-[4-(2-히드록시에틸)피페라진-1-일]에탄술폰산(HEPES) 완충제) 및/또는 염 용액(예컨대 염화나트륨 용액), 예를 들어 약 20~80 mM(예를 들어 50 mM)의 HEPES 및 약 50~600 mM, 예를 들어 약 100~600 mM(예를 들어, 400 mM)의 염화나트륨을 포함하는 용액(임의의 적합한 pH, 예컨대 약 4~8, 예를 들어, 약 4.5~7.5의 pH(예를 들어, pH 7), 및 임의의 적합한 전도도, 예컨대 10~60 mS/cm(예를 들어, 40 mS/cm))를 포함할 수 있다. 관심 단백질은 또한 구배 용출에 의해 다중모드 포획 컬럼으로부터 용출될 수 있다.
또 다른 실시 형태에서, 적용 공정은 음이온 교환 수지를 포함하는 제2 크로마토그래피를 포함한다. 이 단계에서 사용되는 음이온 교환기는 강 음이온 교환기 또는 약 음이온 교환기일 수 있다. 바람직하게는, 음이온 교환기는 4차 암모늄, 4차 아미노에틸, 디에틸아미노에틸, 트리메틸아미노에틸 또는 디메틸아미노에틸과 같은 음이온 교환 리간드를 포함한다. 더 바람직하게는, 음이온 교환기는 약 음이온 교환 수지(예를 들어 Capto DEAE) 또는 강 음이온 교환 수지(예를 들어 POROS 50 HQ)로부터 선택된다. 음이온 교환기의 다른 예는 DEAE 세파로스 FF, Q-세파로스(HP 및 FF), AEX 세파로스 FF(저 및 고 치환), Capto Q, Q XP, Source 30 Q 및 15 Q, 가장 바람직하게는 Fractogel DEAE 및 MPHQ를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
특정 실시 형태에서, 제2 크로마토그래피는 유통 모드로 수행된다.
바람직한 실시 형태에서, 제2 크로마토그래피는 결합 및 용출 모드로 수행된다.
바람직하게는, 제2 크로마토그래피는 숙주 세포 단백질 및 DNA를 추가로 제거하기 위해 결합 및 용출 모드로 수행된다. 관심 단백질은 특정 염 농도 및 pH에서 음이온 교환 수지, 예를 들어 컬럼에 로딩하고, 컬럼에 결합시키고, 그 후 추후 용출 용액에 의해 용출시켜 풀링된 용출물을 얻는다. 관심 단백질은 임의의 적합한 완충제(예컨대 트리스 완충제 또는 HEPES 완충제) 및/또는 염 용액(예컨대 염화나트륨 용액), 예를 들어 약 15~75 mM(예를 들어, 25 mM)의 트리스, 및 약 0~75 mM, 예를 들어 약 25~75 mM(예를 들어, 50 mM, 또는 예를 들어 5 mM)의 염화나트륨을 포함하는 용액(임의의 적합한 pH, 예컨대 약 6~8의 pH(예를 들어, pH 7.5 또는 8), 및 임의의 적합한 전도도, 예컨대 약 2~8 mS/cm(예를 들어 5.5 mS/cm)의 전도도)에서 컬럼에 로딩될 수 있다. 용출 용액은 임의의 적합한 완충제(예컨대 트리스 완충제) 및/또는 염 용액(예컨대 염화나트륨 용액), 예를 들어 약 15~75 mM(예를 들어 25 mM, 또는 예를 들어 50 mM)의 트리스 및 약 50~500 mM, 예를 들어, 약 100~300 mM(예를 들어 185 mM, 또는 200 mM)의 염화나트륨을 포함하는 용액(임의의 적합한 pH, 예컨대 약 6~9의 pH(예를 들어 pH 7.5) 및 임의의 적합한 전도도, 예컨대 약 5~50 mS/cm, 예를 들어 약 5~40 mS/cm(예를 들어, 20 mS/cm)의 전도도)을 포함할 수 있다. 관심 단백질은 또한 구배 용출에 의해 제2 컬럼으로부터 용출될 수 있다.
또 다른 실시 형태에서, 적용 공정은 글리칸에 결합하는 친화성 매체를 사용한 제3 크로마토그래피를 포함한다. 친화성 매체 수지는 리간드 술페이트 또는 덱스트란 술페이트를 포함할 수 있다. 친화성 매체의 예는 셀룰로오스 술페이트 매체 또는 아가로스 술페이트 매체, 예컨대 Cellufine 술페이트, Cellufine 술페이트 m, Cellufine 술페이트 c, Cellulofine 술페이트 m, Cellulofine 술페이트 c, Cellufine 술페이트 m 또는 Cellufine 술페이트 c(이는 JNC Corp.에 의해 제조됨), Cytiva CAPTO™ Core 700 또는 Capto DeVirS(Cytiva에 의해 제조) 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
특정 실시 형태에서, 제3 크로마토그래피는 유통 모드로 수행된다.
바람직한 실시 형태에서, 제3 크로마토그래피는 결합 및 용출 모드로 수행된다.
바람직하게는, 제3 크로마토그래피는 숙주 세포 단백질 및 DNA를 추가로 제거하기 위해 결합 및 용출 모드로 수행된다. 관심 단백질은 특정 염 농도 및 pH에서 친화성 매체 수지에 로딩되어 컬럼에 결합되고, 그 후 추후 용출 용액에 의해 용출되어 풀링된 용출물을 얻는다. 관심 단백질은 임의의 적합한 완충제(예컨대 트리스 완충제 또는 HEPES 완충제) 및/또는 염 용액(예컨대 염화나트륨 용액), 예를 들어 약 5~25 mM(예를 들어, 6 mM)의 트리스 또는 약 5~50 mM(예를 들어 20 mM)의 HEPES, 및 약 0~100 mM, 예를 들어 약 25~75 mM(예를 들어, 45 mM, 또는 50 mM)의 염화나트륨을 포함하는 용액(임의의 적합한 pH, 예컨대 약 4~8, 예를 들어, 약 5~8의 pH(예를 들어, pH 6.5), 및 임의의 적합한 전도도, 예컨대 1~15 mS/cm, 예를 들어, 약 1~10 mS/cm(예를 들어, 5 mS/cm)의 전도도)에서 컬럼에 로딩될 수 있다. 용출 용액은 임의의 적합한 완충제(예컨대 트리스 완충제) 및/또는 염 용액(예를 들어 염화나트륨 용액), 예를 들어 약 10~100 mM, 예를 들어 약 15~75 mM(예를 들어 25 mM)의 트리스 및 약 100~300 mM(예를 들어 185 mM)의 염화나트륨을 포함하는 용액(임의의 적합한 pH, 예컨대 약 6~9의 pH(예를 들어 pH 7.5), 및 임의의 적합한 전도도, 예컨대 약 10~30 mS/cm, 예를 들어 약 15~25 mS/cm(예를 들어, 19 mS/cm)의 전도도)을 포함할 수 있다. 관심 단백질은 또한 구배 용출에 의해 제3 컬럼으로부터 용출될 수 있다.
특정 실시 형태에서, 적용 공정은 저 pH 바이러스 불활성화 단계, 예를 들어 약 pH 3~4, 예를 들어 약 3.5의 pH에서 약 15분 내지 약 4시간, 약 1시간 동안 유지, 및 후속적으로 0.45~0.2 마이크로미터 필터를 통한 여과를 포함한다. 이 단계는 친화성 매체를 사용한 제3 크로마토그래피를 사용하지 않는 경우 2차 크로마토그래피 단계 후에, 또는 제3 크로마토그래피 단계가 수행되는 경우 제3 크로마토그래피 단계 후에 수행된다. 그 후, 여과액은 다음 프로세싱 단계 전에 pH 5~7과 같은 목표 pH까지 중화된다. 저 pH 바이러스 비활성화 단계는 바이러스 오염 물질의 단백질을 변성시킬 수 있으며, 이는 그 후 후속 컬럼 크로마토그래피에서 제거될 수 있다.
또 다른 실시 형태에서, 적용 공정은 다중모드 수지, 바람직하게는 음이온 교환 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 작용체를 포함하는 다중모드 수지를 사용한 제4 크로마토그래피를 포함한다. 다중모드 수지의 구체적인 예는 Capto Adhere, Capto MMC, Capto Adhere ImpRes 또는 Capto MMC ImpRes(이는 Cytiva에 의해 제조된 것으로서, Capto는 등록 상표임), HEA HyperCel, PPA HyperCel, MEP HyperCel(이는 Pall Corp.에 의해 제조된 것으로서, HyperCel은 상표임), TOYOPEARL(등록 상표) MX-Trp-650M(TOSOH Corp.에 의해 제조) 등을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. Capto Adhere와 같은 적합한 다중모드 수지가 본 개시 내용을 고려하여 이 단계에서 사용될 수 있다. 다중모드 크로마토그래피는 결합 및 용출 모드 또는 바람직하게는 유통 모드로 수행된다. 제4 크로마토그래피는 생성물 풀 중 육량체 및 숙주 세포 단백질 불순물을 추가로 감소시킬 수 있다.
바람직하게는, 제4 크로마토그래피는 숙주 세포 단백질 및 핵산을 제거하기 위해 유통 모드로 수행된다. 관심 단백질은 임의의 적합한 완충제(예컨대 아세트산나트륨 완충제) 및/또는 염 용액(예컨대 염화나트륨 용액), 예를 들어 약 25~75 mM(예를 들어, 50 mM)의 아세트산나트륨, 및 약 50~800 mM, 예를 들어 약 200~800 mM(예를 들어, 317 mM 또는 650 mM)의 염화나트륨을 포함하는 용액(임의의 적합한 pH, 예컨대 약 3~8, 예를 들어 약 3~5의 pH(예를 들어, pH 3.5 또는 4.5), 및 임의의 적합한 전도도, 예컨대 약 5~70 mS/cm의 전도도)에서 수지, 예를 들어 컬럼에 로딩될 수 있다. 바람직하게는, 유통 용액은 HIV Env 단백질, 예를 들어, gp140 단백질을 포함하는 반면, 특정 불순물은 여전히 컬럼에 결합된 채로 있다.
또 다른 실시 형태에서, 적용 공정은 나노여과(바이러스 체류 여과) 단계 및 최종 UFDF 단계 중 하나 이상을 포함한다. 바이러스 체류 여과는 크기 배제 원칙에 따라 작동한다. 예를 들어, 최대 75 nm의 유효 기공 크기를 갖는 바이러스 필터를 바이러스 체류 여과에 사용할 수 있다. 바이러스 체류 여과를 위한 필터의 예는 Virosart HC, Virosart® HF, Planova 20N 필터 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
또 다른 실시 형태에서, 적용 공정은 최종 제형화 단계를 포함하며, 여기서, 정제된 단백질은 백신 또는 면역원성 조성물과 같은 최종 생성물로 제형화될 수 있다. 본 발명의 최종 생성물은 경구(경장) 투여 및 비경구 주사를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 투여를 용이하게 하고 효능을 개선하기 위해 대상체에 투여하기에 적합한 임의의 물질로 제형화될 수 있다.
각각의 크로마토그래피 단계는 본원의 개시 내용을 고려하여 적합한 조건 하에 수행될 수 있다. 특정 실시 형태에서, HIV 외피 단백질과 같은 관심 단백질은 특정 염 농도 및 pH에서 로딩되고, 로딩 조건과 비교하여 증가된 염 농도 및 증가된 pH에서 더 순수한 형태로 용출된다.
본 발명의 일 양태는 HIV-1 gp140 단백질을 정제하는 방법을 제공하는 것이며, 본 방법은 소수성 상호작용 및 양이온 교환 특성을 포함하는 다중모드 수지 상에 단백질을 포획하는 단계, 및 정제된 분획을 상기 수지로부터 용출시키는 단계를 포함하고, 여기서, HIV-1 gp140 단백질의 순도는 포획 단계 동안 수지 상에 로딩된 혼합물 중 단백질과 비교하여 실질적으로 증가한다. 이러한 다중모드 수지는 HIV-1 gp140 단백질의 정제에 특히 적합한 것으로 보인다.
본 발명의 또 다른 양태에서, HIV-1 gp140 단백질의 정제 방법이 제공되며, 본 방법은 다음의 단계를 포함한다:
i) HIV-1 gp140 단백질 및 HIV-1 gp140 단백질이 발현된 숙주 세포로부터 유래된 숙주 세포 단백질과 같은 다른 원하지 않는 단백질을 포함하는 조성물을 제공하는 단계;
ii) 소수성 상호작용 및 양이온 교환 특성을 포함하는 다중모드 수지 상에 HIV-1 gp140 단백질을 포획하고, HIV-1 gp140 단백질을 포함하는 정제된 분획을 상기 수지로부터 용출시키는 단계;
iii) HIV-1 gp140 단백질을 결합시키기 위한 음이온 교환 수지에 단계 ii)의 정제된 분획을 적용하고, HIV-1 gp140 단백질을 포함하는 추가 정제 분획을 상기 수지로부터 용출시키는 단계; 및
iv) 단계 iii)의 추가 정제 분획을 음이온 교환 및 소수성 작용체를 갖는 혼합 모드 수지에 적용하고, 추가 정제 HIV-1 gp140 단백질을 용출시키는 단계.
특정 실시 형태에서, HIV-1 gp140 단백질은 클레이드 C gp140 단백질 또는 모자이크 gp140 단백질, 바람직하게는 모자이크 gp140 단백질이다.
특정 실시 형태에서, 본 방법은 덱스트란 술페이트를 포함하는 수지에 단계 iii)의 HIV-1 gp140 단백질의 추가 정제 분획을 적용하고, HIV-1 gp140 단백질을 포함하는 추가 정제 분획을 상기 수지로부터 용출시킨 후, 이 분획을 이 방법의 단계 iv)에 적용하는 단계를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 이들 실시 형태에서 HIV-1 gp140 단백질은 클레이드 C gp140 단백질이다.
본 출원의 실시 형태에 따르면, 본 발명의 방법은 실험실 규모 및 상업적 규모 둘 다에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 단백질 정제 공정은 조사 연구 목적으로 정제 HIV-1 gp140 단백질을 제공하는 데 사용될 수 있다. 적용 공정은 또한 대량의 정제된 HIV-1 gp140 단백질을 바람직하게는 삼량체 상태로 제공하기 위해 상업적 규모로 대규모로 사용될 수 있다. 특히, 클레이드 C gp140 단백질의 대규모 정제는 도 3에 기술된 공정을 사용하여 달성될 수 있고, 모자이크 gp140 단백질의 대규모 정제는 도 4에 기술된 공정을 사용하여 달성될 수 있다.
인간 면역결핍 바이러스(HIV)는 레트로바이러스과(family of Retroviridae)의 일부인 렌티바이러스속(genus Lentivirinae)의 구성원이다. 다음 2가지의 HIV 종이 인간을 감염시킨다: HIV-1 및 HIV-2. HIV-1은 HIV 바이러스의 가장 일반적인 주이고, HIV-2보다 더 병원성인 것으로 알려져 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "인간 면역결핍 바이러스" 및 "HIV"는 HIV-1 및 HIV-2를 지칭하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
HIV는 높은 정도의 유전적 다양성을 갖는 복수의 클레이드로 분류된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "HIV 클레이드" 또는 "HIV 아형"은 이들의 유전적 유사성 정도에 따라 분류되는 관련된 인간 면역결핍 바이러스를 지칭한다. 현재 3개 군의 HIV-1 단리체: M, N 및 O가 존재한다. M군(주요 주)은 A부터 J까지의 적어도 10개 클레이트로 이루어진다. O군(외부 주)은 유사한 수의 클레이드로 이루어질 수 있다. N군은 M 또는 O군 중 하나로 분류되지 않은 새로운 HIV-1 단리체이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "HIV 항원성 폴리펩티드", "HIV 항원성 단백질", "HIV 항원", 및 "HIV 면역원"은 대상체에서 HIV에 대한 면역 반응, 예를 들어, 체액성 및/또는 세포성 매개 반응을 유도할 수 있는 폴리펩티드를 지칭한다. 항원성 폴리펩티드 또는 항원은 대상체에서 HIV에 대한 면역 반응을 유도할 수 있거나 면역성, 예를 들어, 보호 면역성을 생성할 수 있는, HIV의 단백질, 이의 단편 또는 에피토프, 또는 다수의 HIV 단백질들 또는 이의 일부의 조합일 수 있다.
바람직하게는, 항원성 폴리펩티드 또는 항원은 숙주에서 보호 면역 반응을 일으키는 것, 예를 들어 바이러스 질환 또는 감염에 대한 면역 반응을 유도하는 것, 및/또는 바이러스 질환 또는 감염에 대해 대상체에서 면역성(바이러스 질환 또는 감염에 대해 대상체를 보호)을 생성(즉, 백신화)하는 것이 가능하다. 예를 들어, 항원성 폴리펩티드 또는 항원은 시미안 면역결핍 바이러스(SIV) 또는 HIV 유래의 단백질 또는 이의 단편, 예컨대 HIV 또는 SIV 외피 gp160 단백질, HIV 또는 SIV 매트릭스/캡시드 단백질, 및 HIV 또는 SIV gag, pol 및 env 유전자 산물을 포함할 수 있다.
HIV 항원성 폴리펩티드 또는 항원은 임의의 HIV-1 또는 HIV-2 항원 또는 이의 단편일 수 있다. HIV 항원의 예는 구조 단백질 및 필수 효소를 코딩하는 gag, pol, 및 env 유전자 산물을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. Gag, pol, 및 env 유전자 산물은 폴리단백질로서 합성되는데, 이는 다수의 다른 단백질 산물로 추가 프로세싱된다. gag 유전자의 일차 단백질 산물은 바이러스 구조 단백질 gag 폴리단백질로, 이는 MA, CA, SP1, NC, SP2, 및 P6 단백질 산물로 추가 프로세싱된다. pol 유전자는 바이러스 효소(Pol, 폴리머라아제)를 코딩하고, 일차 단백질 산물은 RT, RNase H, IN, 및 PR 단백질 산물로 추가 프로세싱된다. env 유전자는 구조 단백질, 특히 비리온 외피의 당단백질을 코딩한다. env 유전자의 일차 단백질 산물은 gp160으로, 이는 gp120 및 gp41로 추가 프로세싱된다. HIV 항원의 다른 예는 유전자 조절 단백질 Tat 및 Rev; 액세서리 단백질 Nef, Vpr, Vif 및 Vpu; 캡시드 단백질, 뉴클레오캡시드 단백질 및 p24 바이러스 단백질을 포함한다.
특정 실시 형태에서, HIV 항원성 폴리펩티드 또는 항원은 HIV Gag, Env, 또는 Pol 항원, 또는 이의 임의의 항원성 부분 또는 에피토프 또는 조합, 바람직하게는 HIV-1 Gag, Env, 또는 Pol 항원 또는 이의 임의의 항원성 부분 또는 에피토프 또는 조합을 포함한다.
HIV 항원성 폴리펩티드는 또한 모자이크 HIV 항원일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "모자이크 항원"은 천연 서열의 단편으로부터 조립되는 재조합 단백질을 지칭한다. 모자이크 항원은 천연 항원과 유사하지만, 천연 서열에서 발견되는 잠재적 T-세포 에피토프의 커버리지를 최대화하도록 최적화되는데, 이는 면역 반응의 폭 및 커버리지를 개선한다. 모자이크 HIV 항원은 예를 들어 모자이크 Gag, Pol, 및/또는 Env 항원일 수 있고, 더 바람직하게는 모자이크 HIV-1 Env 항원일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "모자이크 HIV Gag, Pol, 및/또는 Env 항원"은 구체적으로 HIV의 Gag, Pol 및/또는 Env 폴리단백질 서열 중 하나 이상으로부터 유래된 다중 에피토프를 포함하는 모자이크 항원을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "HIV 외피 단백질", "env 단백질" 및 "Env” 각각은 HIV 비리온의 외피 상에서 발현되고 HIV가 HIV 감염 세포의 원형질막을 표적화하여 이에 부착되는 것을 가능하게 하는 단백질, 또는 이의 단편 또는 유도체(이는 필요로 하는 대상체에서 HIV에 대해 면역 반응을 유도할 수 있거나 면역을 생성할 수 있음)를 지칭한다. HIV env 유전자는 전구 단백질 gp160을 코딩하는데, 이는 단백질 분해에 의해 2개의 성숙 외피 당단백질, gp120 및 gp41로 절단된다. 상기 절단 반응은 레트로바이러스 외피 당단백질 전구체에서 고도로 보존된 서열에서 숙주 세포 프로테아제, 푸린에 의해 매개된다. 더 구체적으로, gp160은 (gp160)3으로 삼량체화되며, 그 후 2개의 비공유적 회합 gp120 및 gp41로 절단된다. 바이러스 진입은 이후 gp120/gp41 헤테로이량체의 삼량체에 의해 매개된다. Gp120은 수용체 결합 단편이고, 예를 들어 T-헬퍼 세포와 같은 CD4 수용체를 갖는 표적 세포 상의 CD4 수용체에 결합한다. gp120에 비공유적으로 결합된 gp41은 융합 단편이고 HIV가 세포에 진입하는 제2 단계를 제공한다. Gp41은 원래 바이러스 외피 내에 묻혀있지만, gp120이 CD4 수용체에 결합할 때, gp120은 gp41이 노출되도록 이의 형태를 변화시키며, 여기에서 이것은 숙주 세포와의 융합을 보조할 수 있다. Gp140은 삼량체 gp160, 즉 (gp160)3의 절단되지 않은 엑토도메인이며, 이는 천연 상태의 절단된 바이러스 스파이크에 대한 대리물로 사용되었다.
본 발명의 실시 형태에 따르면, “HIV 외피 단백질”은 gp160, gp140, gp120, gp41 단백질, 또는 이들의 조합물, 융합물, 절두된 것 또는 유도체일 수 있다. 예를 들어, “HIV 외피 단백질”은 gp41 단백질과 비공유적으로 회합된 gp120 단백질을 포함할 수 있다. 이것은 또한 gp140의 삼량체를 안정화시키는 삼량체화 도메인을 가질 수 있거나 이를 포함하도록 변형될 수 있는 안정화된 삼량체 gp140 단백질을 포함할 수 있다. 삼량체화 도메인의 예는 T4-피브리틴 "폴드온(foldon)" 삼량체화 도메인; GCN4로부터 유래된 코일드-코일(coiled-coil) 삼량체화 도메인; 및 삼량체 태그로서 이. 콜라이(E. coli) 아스파르테이트 트랜스카르바모일라아제의 촉매 서브유닛을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 또한 “HIV 외피 단백질”은 엑토도메인(즉, 세포외 공간 내로 연장된 도메인)에서의 C-말단 절두, gp41에서의 절두, 예컨대 gp41의 막관통 도메인에서의 절두, 또는 gp41의 세포질 도메인에서의 절두를 포함하는 외피 단백질을 포함하지만 이에 한정되지 않는 절두형 HIV 외피 단백질일 수 있다. “HIV 외피 단백질”은 또한, 예를 들어 푸린 절단 부위에서 서열 돌연변이 및/또는 소위 SOSIP 돌연변이를 갖는 천연 발생 HIV 외피 단백질의 유도체일 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시 형태에서, HIV 외피 단백질은 gp140 단백질, 더 바람직하게는 HIV-1 클레이드 C gp140 단백질 또는 HIV-1 모자이크 gp140 단백질이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "안정화된 삼량체 gp140 단백질" 및 "gp140의 안정화된 삼량체"는 삼량체 구조의 안정성을 증가시키는 폴리펩티드 서열을 포함하는 gp140 폴리펩티드의 삼량체를 지칭한다. gp140 폴리펩티드는 gp140의 삼량체를 안정화시키는 삼량체화 도메인을 가질 수 있거나 이를 포함하도록 변형될 수 있다. 삼량체화 도메인의 예는 T4-피브리틴 "폴드온" 삼량체화 도메인; GCN4로부터 유래된 코일드-코일 삼량체화 도메인; 및 삼량체 태그로서 이. 콜라이 아스파르테이트 트랜스카르바모일라아제의 촉매 서브유닛을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
항원성 HIV 외피 폴리펩티드의 예는 문헌[Nkolola et al 2010, J. Virology 84(7): 3270-3279]; 문헌[Kovacs et al, PNAS 2012, 109(30):12111-6]; WO 2010/042942 및 WO 2014/107744(이들 모두는 그 전체가 참고로 포함됨)에 기술된 것과 같은 안정화된 삼량체 gp140이다.
본 발명의 일부 실시 형태에서, "외피 폴리펩티드" 또는 "외피 당단백질"은 하나 이상의 HIV 클레이드의 Env 폴리단백질 서열 중 하나 이상으로부터 유래된 다중 에피토프를 포함하는 모자이크 외피 단백질이다. 예를 들어, 본원에서 사용되는 바와 같이, "gp140 단백질"은 하나 이상의 HIV 클레이드의 하나 이상의 gp140 단백질 서열로부터 유래된 다중 에피토프를 함유하는 "모자이크 gp140 단백질"일 수 있다. 바람직하게는, 모자이크 gp140 단백질은 안정화된 삼량체 gp140 단백질이다.
바람직한 실시 형태에서, 모자이크 gp140 단백질은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 모자이크 gp140 단백질의 안정화된 삼량체이다.
본 발명의 일부 실시 형태에서, "외피 폴리펩티드" 또는 "외피 당단백질"은 HIV 클레이드 A, B, 또는 C와 같은 특정 HIV 클레이드로부터 유래된 외피 단백질이다. 예를 들어, 본원에서 사용되는 바와 같이, "gp140 단백질"은 HIV 클레이드 C로부터 유래된 외피 단백질 서열을 함유하는 "클레이드 C gp140 단백질"일 수 있다. 바람직하게는, 클레이드 C gp140 단백질은 안정화된 삼량체 클레이드 C gp140 단백질이다.
바람직한 실시 형태에서, 클레이드 C gp140 단백질은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 클레이드 C gp140 단백질의 안정화된 삼량체이다.
본 발명의 특정 실시 형태에 따르면, 안정화된 삼량체 gp140 단백질과 같은 gp140 폴리펩티드는 바이러스 발현 벡터, 예를 들어, 아데노바이러스 26과 함께 투여될 수 있다(예를 들어, WO 2016/049287, WO 2017/102929 참조).
특정 실시 형태에서, 2가지 gp140 단백질(바람직하게는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 클레이드 C gp140 및 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 모자이크 gp140)이 동일한 대상체에게 투여된다. 이들 2가지 gp140 단백질은 하나의 제약 조성물에 함께 있을 수 있으며, 바람직하게는 인산알루미늄 아쥬반트와 같은 아쥬반트와 함께 투여된다. 인간에게 투여하기 위한 gp140의 총량에 대한 바람직한 용량은 약 125 내지 350 μg, 예컨대 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350 μg 또는 그 사이의 임의의 양, 바람직하게는 약 250 μg이다. 클레이드 C gp140 및 모자이크 gp140이 둘 다 투여되는 경우, 적합한 용량은 인간 대상체에게 투여하기 위한 총 용량 250 μg의 gp140 당단백질을 제공하기 위해, 예를 들어 각 당단백질 약 125 μg이 될 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 달리 지시되지 않는 한, gp140 폴리펩티드의 양은 당단백질로 측정된 gp140 폴리펩티드의 양을 지칭한다.
단리된 gp140 단백질은 아데노바이러스(예를 들어, Ad26) 발현 벡터 또는 MVA와 같은 다른 발현 벡터와 함께 공동-전달 또는 투여될 수 있다. 바람직한 실시 형태에 따르면, gp140 단백질 및 Ad26 또는 다른 발현 벡터는 2개의 별개의 제형으로 개별적으로 투여된다. 대안적으로, gp140 단백질은 단일 제형으로 Ad26 또는 다른 발현 벡터와 함께 투여될 수 있다. 동시 투여 또는 공동-전달은 동시에, 1시간 이내에 또는 같은 날에 발생할 수 있다. 또한, gp140 단백질은 아쥬반트 처리 제형으로 투여될 수 있다. 적합한 아쥬반트는 예를 들어 인산알루미늄 또는 사포닌계 아쥬반트, 바람직하게는 인산알루미늄 아쥬반트일 수 있다.
gp140과 같은 항원성 폴리펩티드는 본 개시 내용을 고려하여 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 생성 및 단리될 수 있다. 예를 들어, 항원성 폴리펩티드는 숙주 세포, 바람직하게는 항원성 폴리펩티드의 생산에 최적화된 재조합 숙주 세포로부터 발현될 수 있다. 본 발명의 실시 형태에 따르면, 재조합 유전자는 절단 및 융합 활성을 제거하기 위한 돌연변이를 함유하는 gp140 단백질, 바람직하게는 대상체(예를 들어, 인간)의 면역화 시에(예를 들어, 조성물, 예를 들어 백신에 혼입될 때) 생성된 항바이러스 면역 반응(예를 들어, 세포 또는 체액성 면역 반응)의 증가된 폭, 강도, 깊이 또는 수명을 갖는 최적화된 gp140 단백질을 발현하는 데 사용된다. 최적화된 gp140 단백질은 또한 절단 부위 돌연변이(들), 인자 Xa 부위 및/또는 폴드온 삼량체화 도메인을 포함할 수 있다. 리더/신호 서열은 최대 단백질 발현을 위해 최적화 gp140 단백질의 N-말단에 작동가능하게 연결될 수 있다. 리더/신호 서열은 일반적으로 소포체의 내강으로 수송되는 동안 초기 폴리펩티드로부터 절단된다. 관심 숙주 세포에 적합한 임의의 리더/신호 서열이 사용될 수 있다. 예시적인 리더/신호 서열은 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함한다.
바람직하게는, "HIV 외피 단백질"은 "합성 HIV 외피 단백질"이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "합성 HIV 외피 단백질"은 필요로 하는 대상체에서 하나 이상의 자연 발생 HIV 주에 대해 면역 반응을 유도하거나 면역을 생성하도록 최적화된 자연 비발생 HIV 외피 단백질을 지칭한다. 모자이크 HIV Env 단백질은 합성 HIV Env 단백질의 예이고, 본 발명은 합성 HIV Env 항원, 예를 들어 서열 번호 1 또는 서열 번호 2를 포함하는 것을 제공한다.
본 출원의 실시 형태에 따른 방법에 의해 정제하고자 하는 관심 단백질은 숙주 세포, 바람직하게는 재조합 숙주 세포에 의해 발현될 수 있다. 특정 실시 형태에서, HIV 외피 단백질과 같은 관심 단백질은 신호 서열을 가지고서 발현될 수 있고, 신호 서열은 소포체(ER)의 내강으로의 수송 동안 초기 폴리펩티드 사슬로부터 절단된다. 임의의 적합한 신호 서열이 사용될 수 있다. 바람직하게는 HIV Env 신호 서열 또는 이의 변이체가 사용된다. HIV Env 단백질에 대해 당업계에서 상이한 신호 서열들이 사용되어 왔다(예를 들어, WO 2014/107744 참조).
바람직한 실시 형태에서, 관심 단백질은 HIV 외피 단백질과 같은 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포로부터 재조합적으로 생산된다. 플라스미드, 코스미드, 박테리아 인공 염색체, 효모 인공 염색체, 박테리오파지 등과 같은 비-바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 배큘로바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, MVA 벡터, 장 바이러스 벡터, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 벡터, 셈리키 포레스트 바이러스 벡터, 담배 모자이크 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등과 같은 바이러스 벡터를 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 적합한 발현 벡터가 재조합 단백질 발현에 사용될 수 있다.
합성 HIV 외피 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있으며, 이는 핵산이 프로모터의 제어 하에 있음을 의미한다. 프로모터는 상동성 프로모터(즉, 벡터와 동일한 유전자 소스로부터 유래됨) 또는 이종성 프로모터(즉, 상이한 벡터 또는 유전자 소스로부터 유래됨)일 수 있다. 아데노바이러스 벡터에 적합한 프로모터의 비제한적 예는 사이토메갈로바이러스(CMV) 극초기 프로모터 및 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터를 포함한다. 바람직하게는, 프로모터는 발현 카세트 내 핵산의 상류에 위치한다.
전형적으로 숙주 세포는 본 발명에 사용하기에 충분한 양의 단백질을 생산하는 데 사용된다.
바람직한 실시 형태에 따르면, 적합한 세포 배양물의 세포는 발현 벡터로 형질전환되거나 형질감염될 수 있다. 관심 단백질을 코딩하는 발현 벡터로 형질감염되는 PER.C6, HEK293, CHO 세포 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 숙주 세포, 바람직하게는 진핵 숙주 세포, 더 바람직하게는 포유류 숙주 세포가 재조합 단백질 발현에 사용될 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 관심 단백질을 발현하는 재조합 숙주 세포의 확인 및 단리를 용이하게 하는 마커 및/또는 선발 유전자를 포함하는 카세트를 또한 함유한다. 그러나 재조합 숙주 세포는 PCR 기술로도 확인될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 재조합 단백질, 예를 들어, HIV 외피 단백질을 코딩하는 핵산은 숙주 세포의 게놈에 통합된다. 이것은 안정한 숙주 세포주로부터의 재조합 단백질의 생산을 가능하게 한다.
유전자 코드의 축퇴성을 고려하면, 당업자는 본 기술 분야에서 전적으로 일상적인 방법에 따라 동일 단백질을 코딩하는 여러 핵산 서열들이 설계될 수 있음을 잘 알고 있다. HIV 외피 단백질과 같은 관심 단백질을 코딩하는 핵산은 숙주 세포에서의 적절한 발현을 보장하기 위해 선택적으로 코돈 최적화될 수 있다. 코돈 최적화는 당업계에서 널리 적용되는 기술이다.
따라서, 본 발명의 방법은 재조합 숙주 세포로부터 HIV 항원성 폴리펩티드와 같은 관심 단백질을 생산하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 방법은 프로모터에 작동가능하게 연결된 HIV 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터로 숙주 세포를 형질감염시키는 단계, 합성 HIV 항원성 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에 형질감염 세포를 성장시키는 단계, 및 본 발명의 방법을 사용하여 합성 HIV 항원성 폴리펩티드를 세포로부터 단리하는 단계를 포함한다. 재조합 단백질 발현에 사용되는 기술은 본 개시 내용을 고려하여 당업자에게 잘 알려져 있다.
본 발명의 또 다른 일반적인 양태는 본 발명의 방법에 의해 정제된 단백질, 및 담체를 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물과 같은 제약 조성물에 관한 것이다. 담체는 하나 이상의 제약상 허용가능한 부형제, 예컨대 결합제, 붕해제, 팽윤제, 현탁제, 유화제, 습윤제, 활택제, 착향제, 감미제, 방부제, 염색제, 가용화제 및 코팅을 포함할 수 있다. 담체 또는 기타 물질의 정확한 성질은 투여 경로, 예를 들어 근육내, 피하, 경구, 정맥내, 피부, 점막내(예를 들어, 소화관), 비강내 또는 복강내 경로에 따라 다를 수 있다. 액상 주사용 제제, 예를 들어 현탁액 및 용액에 있어서, 적합한 담체 및 첨가제는 물, 글리콜, 오일, 알코올, 방부제, 착색제 등을 포함한다. 고형 경구 제제, 예를 들어, 산제, 캡슐, 당의정, 겔캡 및 정제에 있어서, 적합한 담체 및 첨가제는 전분, 당, 희석제, 과립화제, 활택제, 결합제, 붕해제 등을 포함한다. 코 스프레이/흡입제 혼합물에 있어서, 수성 용액/현탁액은 적합한 담체 및 첨가제로서 물, 글리콜, 오일, 연화제, 안정화제, 습윤제, 방부제, 방향제, 착향제 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구(장관) 투여 및 비경구 주사를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌, 투여를 촉진하고 효능을 개선하기 위해 대상체에 투여하기에 적합한 임의의 물질로 제형화될 수 있다. 비경구 주사는 정맥내 주사 또는 주입, 동맥내 주사, 피하 주사, 근육내 주사 및 관절내 주사를 포함한다. 본 발명의 조성물은 또한 경점막, 안구, 직장, 투여, 장시간 작용성 이식, 설하 투여, 혀 아래, 문맥 순환을 우회하는 구강 점막으로부터, 흡입, 또는 비내 투여를 포함하는 기타 투여 경로용으로 제형화될 수 있다.
본 발명의 특정 실시 형태에 따르면, 조성물은 본 발명의 방법에 의해 정제된 HIV 외피 단백질과 같은 단백질의 면역원성 유효량, 및 선택적으로 하나 이상의 추가 HIV 항원 및/또는 아쥬반트를 포함한다. 상기 조성물은 본 개시 내용을 고려하여 당업계에 공지된 방법에 따라 백신("면역원성 조성물"로도 지칭됨)으로서 제형화될 수 있다. 일반적으로, 단리된 항원성 폴리펩티드와 같은 폴리펩티드와 관련하여 사용될 때, 면역원성 유효량은 예를 들어 약 0.3 내지 약 3000 마이크로그램(μg), 예를 들어 1~1000 μg, 예를 들어 10~500 μg, 예를 들어 약 50 또는 250 μg의 범위일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 조성물은 면역 반응을 향상시키기 위해 아쥬반트를 선택적으로 추가로 포함할 수 있다. 용어 "아쥬반트" 및 "면역 자극제"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 면역계의 자극을 야기하는 하나 이상의 물질로서 정의된다. 이와 관련하여, 아쥬반트는 본 발명의 합성 HIV 외피 단백질 및 선택적으로 하나 이상의 추가 HIV 항원을 코딩하는 벡터들과 조합되어 사용되는, 본 발명의 합성 HIV 외피 단백질 및 선택적으로 하나 이상의 추가 HIV 항원 및/또는 HIV 항원성 폴리펩티드를 코딩하는 벡터들에 대한 면역 반응을 향상시키는 데 사용된다.
본 발명에 사용하기에 적합한 아쥬반트는, 예를 들어, QS-21, Detox-PC, MPL-SE, MoGM-CSF, TiterMax-G, CRL- 1005, GERBU, TERamide, PSC97B, Adjumer, PG-026, GSK-I, GcMAF, B-alethine, MPC-026, Adjuvax, CpG ODN, Betafectin, 알루미늄 염(예를 들어, AdjuPhos), Adjuplex, 및 MF59와 같은, 사람에 있어서 잠재적으로 안전하고, 내용성이 우수하고, 효과적인 것이어야 할 것이다. 제형 내 각각의 성분의 최적 비는 본 개시 내용을 고려하여 당업자에게 잘 공지된 기술에 의해 결정될 수 있다.
바람직한 실시 형태에서, 아쥬반트는 알루미늄 염, 예컨대 수산화알루미늄 또는 인산알루미늄, 예를 들어, AdjuPhos이다. 특정 실시 형태에서, 인산알루미늄은 바람직하게는 gp140과 같은 단리된 HIV 항원성 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 존재하거나 이와 함께 투여된다.
면역원성 조성물의 제조 및 사용은 당업자에게 잘 알려져 있다. 액체 제약 조성물은 일반적으로 액체 담체, 예를 들어 물, 석유, 동물성 또는 식물성 오일, 광유 또는 합성 오일을 포함한다. 생리 식염수, 덱스트로스 또는 다른 당류 용액 또는 글리콜, 예를 들어 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜도 포함될 수 있다.
대안적으로, 백신 샷은 제형 중 바이러스의 단계적 동결 건조에 의해 제조될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 제형은 추가 첨가제, 예컨대 만니톨, 덱스트란, 당, 글리신, 락토스, 폴리비닐피롤리돈, 또는 생체 내 투여에 적합한 재조합 단백질(예를 들어 인간 혈청 알부민), 안정화제, 또는 불활성 가스 또는 산화방지제를 포함하지만 이에 한정되지 않는 것과 같은 기타 첨가제를 함유한다. 그 후 앰플을 밀봉하고, 적합한 온도, 예를 들어 4℃ 내지 실온에서 수 개월 동안 보관할 수 있다. 그러나, 필요성이 존재하지 않는 한 앰플은 바람직하게는 -20℃ 미만의 온도에서 보관된다.
백신접종 또는 치료법을 포함하는 다양한 실시 형태에서, 동결건조물은 0.1 내지 0.5 ml의 수성 용액, 바람직하게는 생리식염수 또는 트리스(히드록시메틸)아미노메탄(트리스) 완충제에 용해되고, 전신 또는 국부적으로, 즉 비경구, 피하, 정맥내, 근육내, 비강내, 피내 경로, 또는 숙련된 의사에게 알려진 임의의 다른 투여 경로에 의해 투여된다. 투여 양식, 용량 및 투여 횟수의 최적화는 당업자의 기술 및 지식 내에 있다.
특정 실시 형태에서, 본 발명에 따른 방법에 의해 제조된 gp140 단백질과 같은 HIV 외피 단백질은 소르비톨(예를 들어, 2 내지 15%(w/v), 예를 들어 5% 또는 12%), 폴리소르베이트 20(예를 들어, 0.01 내지 0.05%(w/v), 예를 들어 0.02%) 및 히스티딘 완충제(예를 들어 5 내지 20 mM, pH 5.5 내지 7.0, 예를 들어 pH 6.5에서 10 mM)를 포함하는 조성물에 포함되며, 예를 들어 WO 2017/216288을 참조한다. 이러한 조성물은 선택적으로 아쥬반트, 예를 들어, 인산알루미늄(예를 들어 0.7 내지 4.0 mg/mL, 예를 들어 0.7 ~ 1 mg/mL, 예를 들어 085 mg/mL)을 추가로 포함할 수 있다. HIV 외피 단백질은 예를 들어 약 0.05 ~ 5 mg/mL, 예를 들어 0.2 mg/mL 또는 1 mg/mL의 농도로 존재할 수 있다. 이러한 조성물은 예를 들어 약 -80℃ 내지 약 25℃, 예를 들어 약 -80℃, -60℃, -20℃, 또는 바람직하게는 약 2~8℃에서 보관될 수 있으며, 이는 백신으로서의 투여에 직접 사용할 수 있는 안정한 액체 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 필요로 하는 대상체에서 본 발명의 제약 조성물 또는 백신을 사용하여 하나 이상의 HIV 클레이드에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 실시 형태에 따르면, "면역 반응을 유도하는 것"은 본원에 기술되는 방법 및 조성물과 관련하여 사용될 때, 예방 목적을 위해 HIV 감염과 같은 감염에 대하여 보호 면역성을 제공하고/하거나 대상체를 백신접종하는 것과, 치료 목적을 위해 HIV 감염과 같은 감염에 대하여 이를 필요로 하는 대상체에서 요망되는 면역 반응 또는 효과를 야기하는 것, 즉, 치료적 백신접종을 포괄한다. "면역 반응 유도"는 또한 병원체, 즉, HIV에 대한 치료를 위한 치료 면역을 제공하는 것을 포함한다. 전형적으로, 예방적 백신접종의 경우, 조성물 및 백신은 이전에 HIV에 감염된 적이 없는 대상체에게 투여되는 반면, 치료적 백신접종의 경우 조성물 및 백신은 이미 HIV에 감염된 대상체에게 투여된다. 면역 반응은 세포성 면역 반응 및/또는 체액성 면역 반응일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "보호 면역" 또는 "보호 면역 반응"은 백신접종된 대상체가 병원체(이에 대해 백신접종이 행해짐)의 감염을 제어할 수 있음을 의미한다. 보통, "보호 면역 반응"이 생긴 대상체는 단지 경도 내지 중등도 임상 증상을 나타내거나 전혀 증상을 나타내지 않는다. 보통, 특정 물질에 대한 "보호 면역 반응" 또는 "보호 면역"을 갖는 대상체는 상기 물질의 감염의 결과로서 사망하지 않을 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료적 면역" 또는 "치료적 면역 반응"은 HIV 감염된 백신접종된 대상체가 병원체, 즉 HIV(이에 대해 백신접종이 행해짐)의 감염을 제어할 수 있음을 의미한다. 특정 실시 형태에서, 본 발명에 따른 면역 반응을 유도하는 방법은 본원에 기술된 조성물 및 백신이 이미 HIV에 감염된 대상체에게 투여되는 치료적 백신접종과 같은 치료 목적을 위한 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "HIV 감염" 및 "HIV-감염된"은 HIV에 의한 인간 숙주의 침입을 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "HIV-감염된 대상체"는 HIV가 침입하고 후속적으로 숙주 내에서 복제 및 전파되어 숙주가 HIV에 감염되도록 하거나 HIV 감염 또는 이의 증상을 갖도록 하는 대상체를 지칭한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 단백질 및 조성물은 예를 들어 HIV에 감염되지 않은 대상체, 바람직하게는 인간 대상체에 투여함으로써 예방적 백신접종에 사용될 수 있다.
항원성 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물의 투여는 전형적으로 근육내, 피내 또는 피하 투여이다. 그러나, 정맥내, 직장, 피부, 경구, 비강 등과 같은 다른 투여 방식도 예상될 수 있다. 면역원성 조성물의 근육내 투여는 항원성 폴리펩티드의 현탁액을 주사하기 위해 바늘을 이용하여 달성될 수 있다. 대안으로는 백신을 함유하는 동결-건조 분말 또는 조성물을 투여하기 위한 바늘 없는 주사 기구의 사용(예를 들어, BiojectorTM의 사용)이 있다.
근육내, 정맥내, 피부 또는 피하 주사, 또는 고통 부위에서의 주사의 경우, 단리된 항원성 폴리펩티드는 전형적으로 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용가능한 용액의 형태일 것이다. 당업자는, 예를 들어, 등장성 비히클, 예컨대 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 및 젖산 링거 주사액을 이용하여 적합한 용액을 잘 제조할 수 있다. 필요하다면, 보존제, 안정화제, 완충제, 산화방지제 및/또는 다른 첨가제가 포함될 수 있다. 서방출 제형이 또한 사용될 수 있다. HIV gp140 단백질에 적합한 제형의 예는 본원에 참고로 포함된 WO 2017/216288에 제공되어 있다.
검출가능한 면역 반응을 유도하기에 충분한 조성물의 양은 "면역원성 유효 용량" 또는 "면역원성 유효량"으로 정의된다. 실제 투여되는 양, 및 투여 속도 및 시간-과정은 치료 중인 것의 특성 및 중증도에 따라 정해질 것이다. 치료의 처방, 예를 들어, 투약량 등의 결정은 일반적 실행자 및 기타 의사, 또는 수의학과 관련하여 수의사의 책임 내에 있으며, 전형적으로 치료될 장애, 개별 환자의 상태, 전달 부위, 투여 방법 및 실행자에게 공지된 기타 인자를 고려한다. 위에서 언급된 기술 및 프로토콜의 예는 일반적으로 사용가능한 교과서 및 매뉴얼에서 찾을 수 있다.
실시예
재조합 PER.C6 세포주에 의해 발현되는 재조합 단백질(예를 들어, 클레이드 C HIV의 gp140(서열 번호 1) 또는 모자이크 HIV gp140(서열 번호 2))의 생산 및 정제를 위한 상류 및 하류 공정을 연구하였다. 생물반응기에서 재조합 숙주 세포의 유전자 발현 및 생산성을 개선하기 위해 다수의 성장 배지를 테스트하였다. 예를 들어, 생물 반응기로의 공급물은 생산성을 증가시키기 위해 20% 농축하였다.
예를 들어 최종 숙주 세포 단백질(HCP) 수준을 최소화하고, 생성물 변이 수준 및/또는 형태를 유지하고, DNA 및 기타 오염을 제거하는 것을 목표로 하여, 그리고 비교적 높은 수율(예를 들어, 적어도 약 10%, 바람직하게는 적어도 약 15%의 전체 수율)로 관심 단백질(예를 들어 클레이드 C HIV의 gp140 또는 모자이크 HIV gp140)을 정제하는 것에 대해 다양한 공정, 조건 및 컬럼을 연구하였다. 본 발명의 방법을 사용하여, 최종 gp140 단백질 생성물 중 HCP 수준을 5000 ppm 미만, 전형적으로 1000 ppm 미만으로 감소시켰고, 숙주 세포 DNA는 검출 수준 미만이었다.
재조합 숙주 세포의 높은 세포 밀도와 세포 유형으로 인해 세포 수확물을 여과하기가 어려웠다. 중력 기반 세포 침강은 관심 단백질의 대규모 생산에 대해 실현가능하지 않다. 따라서 중력 침강 단계를 대체하기 위해 연속 원심 분리를 사용하였다.
제1 정제 컬럼(소수성 상호작용 및 양이온 교환 특성을 포함하는 혼합 모드 수지로서, 이는 놀랍게도 다양한 가능성으로부터 가장 적합한 포획 컬럼인 것으로 밝혀짐) 상에 로딩하기 위한 준비에서 제1 한외여과 후 침전이 발생함을 알 수 있었다. 침전물에 의한 필터 막의 파울링을 피하기 위해 제1 한외여과를 하기 전에 여과액 중 충분한 양의 관심 단백질(예를 들어 HIV gp140)을 유지하면서 산 침전(또는 저 pH 응집) 및 심층 여과를 사용하여 세포 잔사 및 기타 침전물을 제거하였다. (예를 들어 1 M 아세트산을 사용하여) pH 5.0 +/- 0.1로 조정된 청징화된 수확 물질의 탁도는 약 3시간의 인큐베이션 후에 약 70 비탁 탁도 단위(NTU)의 평탄역에 도달했지만 최종 NTU의 > 95%에 도달한 것으로 나타났다(예를 들어 도 1a 및 도 1b 참조). 산 침전 동안 큰 침전이 관찰되었지만, 재조합 단백질의 회수 수율이 클레이드 C gp140에 대해 약 100%로 또한 높았으며, 이는 산 침전 동안 클레이드 C gp140이 전혀 침전 또는 손실되지 않거나 최소량의 클레이드 C gp140이 침전 또는 손실됨을 시사한다. 산 침전 물질을 필터 선택을 위해 다양한 심층 필터를 통해 여과하고, 탁도를 여과 후 다시 측정하였다. 적합한 필터는 탁도와 HCP의 제거를 유의하게 감소시켰지만 재조합 단백질의 유의한 손실은 없었다.
한외여과(UF) 및 정용여과(DF)를 컬럼 분리 전 생성물 농축 및 완충제 교환에 사용한다(도 1a). UF/DF에 의해 다음 크로마토그래피 단계를 위한 생성물을 준비하였다. 컬럼은 종종 다른 pH 또는 몰 농도 조건 하에서 작동 중이며, 생성물을 UF 및 DF로 미리 크로마토그래피 사용용으로 프라이밍해야 한다. 적합한 UF/DF는 본 출원의 개시 내용을 고려하여 선택될 수 있다.
본 발명의 방법은 생성물의 UF/DF가 선행될 수 있는 3개 이상의 크로마토그래피 컬럼 단계를 포함한다. 대규모 제조 공정 동안 충분한 수율 및 고순도의 요건을 충족하기 위해 주어진 특정 단백질에 적합한 컬럼 조합을 예측할 수 없음을 고려하여 스크리닝 방법을 통해 다양한 수지를 평가하였다. 결합 등온선을 생성하여 생성물 불순물 결합을 평가하였다. 상이한 컬럼들을 연구하고 비교하였다. 결합 용량이 가장 큰 컬럼을 "포획" 컬럼으로 간주하였다. 도 2a에 예시된 정제 공정을 사용하여 원하는 낮은 수준의 HCP를 달성하였다(도 2b).
스케일업 생산을 최적화하기 위해 공정을 더 개선하였다. 시설 적합성과 공정 견고성에 중점을 둔 개발 노력이 수행되었다. 이러한 노력은 예를 들어 공급물 변동, 시드(seed) 밀도, pH 감도, 생물반응기 온도, pCO2 변동, 반응기 지속 시간 등을 포함한다. 파일럿 규모, 스케일다운 모델 및 엔지니어링 원칙을 사용하여 우수 제조 관리 기준(GMP) 생산 공정에 대한 준비가 됨을 보여주었다.
도 3에 기술된 공정을 사용한 클레이드 C gp140 단백질의 정제 및 도 4에 기술된 공정을 사용한 모자이크 gp140 단백질의 정제에 대해 우수한 결과가 발견되었다. 이러한 공정은 제약 등급 제품의 대규모 제조에 적합한 것으로 밝혀졌다.
실시예 1. 클레이드 C gp140의 정제
클레이드 C gp140을 유가식 세포 배양 공정으로 제조하였다. 세포 확장과 클레이드 C gp140의 생산은 클레이드 C gp140을 발현하는 PER.C6 세포주를 사용하는 단계 1(전배양 및 시드 생물반응기), 및 단계 2(15,000 L~16,500 L의 부피를 가진 생물반응기에서의 생산)를 포함하는 이 공정의 처음 2개 단계에서 일어났다. 후속 정제 및 제형화된 벌크(FB)의 제조는 나머지 11개 단계에서 일어났다. 전배양으로부터의 클레이드 C gp140 원료 의약품 제조 공정 및 원료 의약품(DS)을 통한 확장의 흐름도가 도 3에 도시되어 있다.
15,000 L 생산 공정의 목표 가동 기간은 18일이다. 그 후 15,000 L 생산의 내용물은 25% 아세트산을 사용하여 pH 4.8의 목표로 조정함으로써 응집을 겪는다(단계 3, 저 pH 응집). 응집 후 원심분리 및 심층/폴리싱 여과를 통한 청징화(단계 4)가 이어진다. 후속 한외여과 및 정용여과(UFDF) 단계(단계 5)를 pH 7.6에서 50 mM 트리스(히드록시메틸)아미노메탄(트리스) 및 150 mM 염화나트륨을 함유하는 용액에서 수행하여 풀링된 UFDF 보유물을 얻었다.
단계 6에서, 풀링된 UFDF 보유물의 pH를 1 M 아세트산으로 5.0으로 조정하였다. 그 후 보유물을 Capto MMC ImpRes의 컬럼에 로딩하였는데, 이는 pH 5.0의 50 mM 아세트산나트륨 함유 용액으로 이미 평형화되었다. 이 Capto MMC ImpRes 컬럼 크로마토그래피를 결합 및 용출 모드로 수행하여 숙주 세포 단백질 및 잠재적으로 존재하는 DNA를 제거하였다. 컬럼에 결합된 클레이드 C gp140을 추후 pH 7.0에서 50 mM 2-[4-(2-히드록시에틸)피페라진-1-일]에탄술폰산(HEPES) 및 400 mM 염화나트륨을 함유하는 용출 용액으로 용출하여 풀링된 용출물을 얻었다.
단계 7에서, 상기 Capto MMC ImpRes 크로마토그래피 단계로부터 수집된 풀링된 용출물을 1 M 트리스(pH 9.0)로 pH 7.5로 중화한 다음 주사용수로 희석시켰다(6 mS/cm 미만의 전도도까지). 생성된 pH 조정되고 희석된 용출물을 pH 7.5의 25 mM 트리스 함유 용액으로 이미 평형화된 POROS 50 HQ의 컬럼에 로딩하였다. 이 POROS 50 HQ 컬럼 크로마토그래피를 결합 및 용출 모드로 수행하여 숙주 세포 단백질 및 잠재적으로 DNA를 추가로 제거하였다. 컬럼에 결합된 클레이드 C gp140을 추후 25 mM 트리스 및 185 mM 염화나트륨을 함유하는 용출 용액(pH 7.5)(전도도 약 19 mS/cm)으로 용출하여 풀링된 용출물을 얻었다.
단계 8에서, 상기 POROS 50 HQ 크로마토그래피 단계로부터 수집된 풀링된 용출물을 1 M 아세트산으로 pH 6.5로 조정한 다음 주사용수로 희석시켰다(7 mS/cm 미만의 전도도까지). 생성된 pH 조정되고 희석된 용출물을 Capto DeVirS의 컬럼에 로딩하였는데, 이는 pH 6.5의 20 mM HEPES 및 50 mM 염화나트륨 함유 용액으로 이미 평형화되었다. 이 Capto DeVirS 컬럼 크로마토그래피를 결합 및 용출 모드로 수행하였다. 컬럼에 결합된 클레이드 C gp140을 추후 25 mM 트리스 및 185 mM 염화나트륨을 함유하는 용출 용액(pH 7.5)(전도도 약 19 mS/cm)으로 용출하여 풀링된 용출물을 얻었다.
단계 9에서, 5 M 염화나트륨을 상기 Capto DeVirS 크로마토그래피 단계로부터 수집된 풀링된 용출물에 첨가하여 그의 전도도를 62 mS/cm로 조정하고, 바이러스 불활성화를 위해 1 M 아세트산으로 pH 3.5로 조정하고, 1 M 트리스(pH 9.0)를 사용하여 pH 4.5까지 중화시키고, 그 후 주사용수로 30 mS/cm의 전도도까지 희석시켰다.
단계 10에서, 단계 9로부터 얻은 희석된 용출물을 Capto Adhere의 컬럼에 로딩하였는데, 이는 pH 4.5의 50 mM 아세트산나트륨 및 317 mM 염화나트륨 함유 용액으로 이미 평형화되었다. 이 Capto Adhere 컬럼 크로마토그래피를 유통 모드로 수행하여 잠재적으로 존재하는 핵산 및 숙주 세포 단백질을 제거하였으며, 유통 용액은 50 mM 아세트산나트륨 및 317 mM 염화나트륨(pH 4.5) 중 클레이드 C gp140 단백질을 함유한다.
단계 11에서, 상기 Capto Adhere 크로마토그래피 단계로부터 수집된 용출물(실제로는 유통물)을 1 M 트리스(pH 9.0)로 pH 6.5가 되도록 중화시키고, 그 후 바이러스 체류 여과를 위해 Planova 20N 바이러스 필터를 통해 프로세싱하였다. 수득된 여과액을 제형 완충제 내로의 최종 한외여과 및 정용여과(UFDF)에 적용하고(단계 12), 최종 원료 의약품 제형(단계 13)에 적용하였다.
정제 공정은 제조 공정의 각 공정 단계 동안 수행되는 공정 제어(in-process control; IPC) 테스트도 포함하였다. IPC 테스트는 생성된 API 또는 완제품이 사양을 준수하는지 확인하기 위해 공정을 모니터링하고 필요한 경우 조정하기 위해 제조 과정 동안 이루어지는 테스트, 체크 및 측정으로 정의되었다. 나머지 공정 중 테스트는 공정 모니터링 테스트(Process Monitoring test; PMT)로 정의되었으며, 일상적인 생산 과정 동안 공정을 모니터링하여 공정이 제어 상태를 유지하는지를 확인하기 위해 수행되는 테스트, 체크 및 측정이다.
실시예 2. 모자이크 gp140의 정제
전배양으로부터의 모자이크 gp140 원료 의약품 제조 공정 및 원료 의약품(DS)을 통한 확장의 흐름도가 도 4에 도시되어 있다. 모자이크 gp140의 대규모 제조는 단계 1(전배양 및 시드 생물반응기), 단계 2(일회용 생물반응기(single use bioreactor; SUB)에서의 2000 L 생산), 단계 3(pH 5 응집) 및 단계 4(청징화) 공정을 포함한다. 전배양 공정은 모자이크 gp140을 발현하는 PER.C6 세포주를 사용하며, 진탕 플라스크, 웨이브 백 및 500 L 시드 생물반응기를 통한 바이알 해동으로부터의 확장을 수반한다. 단계 1의 최대 기간은 시드 생물반응기를 포함한 전배양의 경우 40일이다. 그 후 배치는 접종 후 2000 L 생산 SUB 공정(단계 2)으로 옮겨진다. 2000 L 생산 SUB 공정의 목표 가동 기간은 19일이다. 그 후 2000 L 생산 SUB의 내용물은 1 M 아세트산을 사용하여 pH 5.0의 목표까지 조정함에 의해 응집을 겪는다(단계 3). 응집에 이어서, 원심분리, 심층 여과 및 폴리싱 여과를 통한, 또는 심층 여과 및 폴리싱 여과만을 통한 청징화(4단계)가 뒤따른다.
단계 5에서, 얻어진 여과액을 1 M 트리스(pH 9) 및 5 M 염화나트륨을 사용하여 pH 5.25(전도도 15 mS/cm)로 조정하고, 그 후 Capto MMC ImpRes의 컬럼에 로딩하였는데, 이는 pH 5.0의 50 mM 아세트산나트륨 함유 용액으로 이미 평형화되었다. 이 Capto MMC ImpRes 컬럼 크로마토그래피를 결합 및 용출 모드로 수행하여 숙주 세포 단백질 및 잠재적으로 존재하는 DNA를 제거하였다. 컬럼에 결합된 모자이크 gp140을 추후 50 mM HEPES 및 400 mM 염화나트륨을 함유하는 용출 용액(pH 7.0)으로 용출하여 풀링된 용출물을 얻었다.
단계 6에서, 위의 Capto MMC ImpRes 크로마토그래피 단계로부터 수집된 풀링된 용출물을 1 M 트리스(pH 9.0)로 중화시키고, 그 후 주사용수로 희석하여 풀링된 용출물(pH 8.0, 전도도 5.5 mS/cm)을 얻었다. 생성된 pH 조정되고 희석된 용출물을 pH 8.0의 50 mM 트리스 함유 용액으로 이미 평형화된 POROS 50 HQ의 컬럼에 로딩하였다. 이 POROS 50 HQ 컬럼 크로마토그래피를 결합 및 용출 모드로 수행하여 숙주 세포 단백질 및 잠재적으로 존재하는 DNA를 추가로 제거하였다. 컬럼에 결합된 모자이크 gp140을 구배 길이가 11.0 CV인 완충제 B의 6%~42% 구배 용출에 의해 추후 용출시켰으며, 여기서, 완충제 A는 pH 8.0의 50 mM 트리스이고, 완충제 B는 50 mM 트리스와 500 mM 염화나트륨의 혼합물(pH 8.0)이고, 전도도는 약 6 mS/cm로부터 20 mS/cm까지 증가되었다.
단계 7에서, 상기 POROS 50 HQ 크로마토그래피 단계로부터 수집된 풀링된 용출물에 5 M 염화나트륨을 첨가하여 풀링된 용출물의 전도도를 56 mS/cm가 되도록 조정하고, 바이러스 불활성화를 위해 1 M 아세트산으로 pH 3.5로 조정하였다.
단계 8에서, 단계 7로부터 얻은 용출물을 Capto Adhere의 컬럼에 로딩하였는데, 이는 pH 3.5의 50 mM 아세트산나트륨 및 650 mM 염화나트륨 함유 용액으로 이미 평형화되었다. 이 Capto Adhere 컬럼 크로마토그래피를 유통 모드로 수행하여 잠재적으로 존재하는 핵산 및 숙주 세포 단백질을 제거하였다. 풀링된 용출물을 1 M 트리스(pH 9.0)로 pH 6.5까지 중화시켰다.
단계 9에서, 중화된 용출물을 바이러스 체류 여과를 위해 Planova 20N 바이러스 필터를 통해 프로세싱하였다. 수득된 여과액을 제형 완충제 내로의 최종 한외여과 및 정용여과(UFDF)에 적용하고(단계 10), 최종 원료 의약품 제형(단계 11)에 적용하였다.
본원에 기술된 실시예 및 실시 형태는 단지 예시적인 목적을 위한 것이고, 이의 광범위한 발명 개념으로부터 벗어나지 않으면서 위에 기술된 실시 형태에 대한 변화가 이루어질 수 있음이 이해된다. 따라서, 본 발명은 개시된 특정 실시 형태에 한정되지 않고, 첨부된 청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 사상 및 범주 내에서의 변형을 포함하고자 함이 이해된다.
[표 1]
SEQUENCE LISTING
<110> Janssen Vaccines & Prevention B.V.
<120> Protein Purification
<130> CRU6034WOPCT1
<150> US 62/932,180
<151> 2019-11-07
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 679
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HIV clade C gp140 protein
<400> 1
Ala Glu Asn Leu Trp Val Gly Asn Met Trp Val Thr Val Tyr Tyr Gly
1 5 10 15
Val Pro Val Trp Thr Asp Ala Lys Thr Thr Leu Phe Cys Ala Ser Asp
20 25 30
Thr Lys Ala Tyr Asp Arg Glu Val His Asn Val Trp Ala Thr His Ala
35 40 45
Cys Val Pro Thr Asp Pro Asn Pro Gln Glu Ile Val Leu Glu Asn Val
50 55 60
Thr Glu Asn Phe Asn Met Trp Lys Asn Asp Met Val Asp Gln Met His
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ile Ser Leu Trp Asp Gln Ser Leu Lys Pro Cys Val Lys
85 90 95
Leu Thr Pro Leu Cys Val Thr Leu His Cys Thr Asn Ala Thr Phe Lys
100 105 110
Asn Asn Val Thr Asn Asp Met Asn Lys Glu Ile Arg Asn Cys Ser Phe
115 120 125
Asn Thr Thr Thr Glu Ile Arg Asp Lys Lys Gln Gln Gly Tyr Ala Leu
130 135 140
Phe Tyr Arg Pro Asp Ile Val Leu Leu Lys Glu Asn Arg Asn Asn Ser
145 150 155 160
Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Leu Ile Asn Cys Asn Ala Ser Thr Ile Thr
165 170 175
Gln Ala Cys Pro Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Pro Ile His Tyr Cys
180 185 190
Ala Pro Ala Gly Tyr Ala Ile Leu Lys Cys Asn Asn Lys Thr Phe Ser
195 200 205
Gly Lys Gly Pro Cys Asn Asn Val Ser Thr Val Gln Cys Thr His Gly
210 215 220
Ile Lys Pro Val Val Ser Thr Gln Leu Leu Leu Asn Gly Ser Leu Ala
225 230 235 240
Glu Lys Glu Ile Ile Ile Arg Ser Glu Asn Leu Thr Asp Asn Val Lys
245 250 255
Thr Ile Ile Val His Leu Asn Lys Ser Val Glu Ile Val Cys Thr Arg
260 265 270
Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser Met Arg Ile Gly Pro Gly Gln Thr
275 280 285
Phe Tyr Ala Thr Gly Asp Ile Ile Gly Asp Ile Arg Gln Ala Tyr Cys
290 295 300
Asn Ile Ser Gly Ser Lys Trp Asn Glu Thr Leu Lys Arg Val Lys Glu
305 310 315 320
Lys Leu Gln Glu Asn Tyr Asn Asn Asn Lys Thr Ile Lys Phe Ala Pro
325 330 335
Ser Ser Gly Gly Asp Leu Glu Ile Thr Thr His Ser Phe Asn Cys Arg
340 345 350
Gly Glu Phe Phe Tyr Cys Asn Thr Thr Arg Leu Phe Asn Asn Asn Ala
355 360 365
Thr Glu Asp Glu Thr Ile Thr Leu Pro Cys Arg Ile Lys Gln Ile Ile
370 375 380
Asn Met Trp Gln Gly Val Gly Arg Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Ala
385 390 395 400
Gly Asn Ile Thr Cys Lys Ser Asn Ile Thr Gly Leu Leu Leu Val Arg
405 410 415
Asp Gly Gly Glu Asp Asn Lys Thr Glu Glu Ile Phe Arg Pro Gly Gly
420 425 430
Gly Asn Met Lys Asp Asn Trp Arg Ser Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val
435 440 445
Ile Glu Leu Lys Pro Leu Gly Ile Ala Pro Thr Gly Ala Lys Glu Arg
450 455 460
Val Val Glu Arg Glu Glu Arg Ala Val Gly Ile Gly Ala Val Phe Leu
465 470 475 480
Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly Ala Ala Ser Leu Thr
485 490 495
Leu Thr Val Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser Ser Ile Val Gln Gln Gln
500 505 510
Ser Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Met Leu Gln Leu
515 520 525
Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Thr Arg Val Leu Ala Ile Glu
530 535 540
Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly
545 550 555 560
Lys Leu Ile Cys Thr Thr Asn Val Pro Trp Asn Ser Ser Trp Ser Asn
565 570 575
Lys Ser Gln Thr Asp Ile Trp Asn Asn Met Thr Trp Met Glu Trp Asp
580 585 590
Arg Glu Ile Ser Asn Tyr Thr Asp Thr Ile Tyr Arg Leu Leu Glu Asp
595 600 605
Ser Gln Thr Gln Gln Glu Lys Asn Glu Lys Asp Leu Leu Ala Leu Asp
610 615 620
Ser Trp Lys Asn Leu Trp Ser Trp Phe Asp Ile Ser Asn Trp Leu Trp
625 630 635 640
Tyr Ile Lys Ser Arg Ile Glu Gly Arg Gly Ser Gly Gly Tyr Ile Pro
645 650 655
Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp
660 665 670
Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu
675
<210> 2
<211> 695
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HIV mosaic gp140 protein
<400> 2
Ala Gly Lys Leu Trp Val Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys
1 5 10 15
Glu Ala Thr Thr Thr Leu Phe Cys Ala Ser Asp Ala Lys Ala Tyr Asp
20 25 30
Thr Glu Val His Asn Val Trp Ala Thr His Ala Cys Val Pro Thr Asp
35 40 45
Pro Asn Pro Gln Glu Val Val Leu Glu Asn Val Thr Glu Asn Phe Asn
50 55 60
Met Trp Lys Asn Asn Met Val Glu Gln Met His Glu Asp Ile Ile Ser
65 70 75 80
Leu Trp Asp Gln Ser Leu Lys Pro Cys Val Lys Leu Thr Pro Leu Cys
85 90 95
Val Thr Leu Asn Cys Thr Asp Asp Val Arg Asn Val Thr Asn Asn Ala
100 105 110
Thr Asn Thr Asn Ser Ser Trp Gly Glu Pro Met Glu Lys Gly Glu Ile
115 120 125
Lys Asn Cys Ser Phe Asn Ile Thr Thr Ser Ile Arg Asn Lys Val Gln
130 135 140
Lys Gln Tyr Ala Leu Phe Tyr Lys Leu Asp Val Val Pro Ile Asp Asn
145 150 155 160
Asp Ser Asn Asn Thr Asn Tyr Arg Leu Ile Ser Cys Asn Thr Ser Val
165 170 175
Ile Thr Gln Ala Cys Pro Lys Val Ser Phe Glu Pro Ile Pro Ile His
180 185 190
Tyr Cys Ala Pro Ala Gly Phe Ala Ile Leu Lys Cys Asn Asp Lys Lys
195 200 205
Phe Asn Gly Thr Gly Pro Cys Thr Asn Val Ser Thr Val Gln Cys Thr
210 215 220
His Gly Ile Arg Pro Val Val Ser Thr Gln Leu Leu Leu Asn Gly Ser
225 230 235 240
Leu Ala Glu Glu Glu Val Val Ile Arg Ser Glu Asn Phe Thr Asn Asn
245 250 255
Ala Lys Thr Ile Met Val Gln Leu Asn Val Ser Val Glu Ile Asn Cys
260 265 270
Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile His Ile Gly Pro Gly
275 280 285
Arg Ala Phe Tyr Thr Ala Gly Asp Ile Ile Gly Asp Ile Arg Gln Ala
290 295 300
His Cys Asn Ile Ser Arg Ala Asn Trp Asn Asn Thr Leu Arg Gln Ile
305 310 315 320
Val Glu Lys Leu Gly Lys Gln Phe Gly Asn Asn Lys Thr Ile Val Phe
325 330 335
Asn His Ser Ser Gly Gly Asp Pro Glu Ile Val Met His Ser Phe Asn
340 345 350
Cys Gly Gly Glu Phe Phe Tyr Cys Asn Ser Thr Lys Leu Phe Asn Ser
355 360 365
Thr Trp Thr Trp Asn Asn Ser Thr Trp Asn Asn Thr Lys Arg Ser Asn
370 375 380
Asp Thr Glu Glu His Ile Thr Leu Pro Cys Arg Ile Lys Gln Ile Ile
385 390 395 400
Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Arg
405 410 415
Gly Gln Ile Arg Cys Ser Ser Asn Ile Thr Gly Leu Leu Leu Thr Arg
420 425 430
Asp Gly Gly Asn Asp Thr Ser Gly Thr Glu Ile Phe Arg Pro Gly Gly
435 440 445
Gly Asp Met Arg Asp Asn Trp Arg Ser Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val
450 455 460
Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Lys Glu Arg
465 470 475 480
Val Val Gln Arg Glu Glu Arg Ala Val Gly Ile Gly Ala Val Phe Leu
485 490 495
Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly Ala Ala Ser Met Thr
500 505 510
Leu Thr Val Gln Ala Arg Leu Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln
515 520 525
Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu
530 535 540
Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Val Leu Ala Val Glu
545 550 555 560
Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly
565 570 575
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580 585 590
Lys Ser Leu Asp Lys Ile Trp Asn Asn Met Thr Trp Met Glu Trp Glu
595 600 605
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610 615 620
Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp
625 630 635 640
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660 665 670
Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp
675 680 685
Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu
690 695
<210> 3
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HIV leader/signal sequence
<400> 3
Met Arg Val Arg Gly Ile Gln Arg Asn Cys Gln His Leu Trp Arg Trp
1 5 10 15
Gly Thr Leu Ile Leu Gly Met Leu Met Ile Cys Ser Ala
20 25
Claims (20)
- 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 외피(Env) 단백질을 정제하는 방법으로서, 다음의 단계를 포함하는, 방법:
a. HIV Env 단백질을 포함하는 세포 상청액 등의 세포 샘플을 얻는 단계;
b. 세포 샘플의 pH를 약 5.0으로 조정하여 세포 샘플 중 숙주 세포 단백질(host cell protein; HCP)을 침전시키는 단계;
c. 침전된 HCP를 심층 여과에 의해 세포 샘플로부터 제거하여 HIV Env 단백질을 포함하는 여과액을 얻는 단계; 및
d. 여과액 중 HIV Env 단백질을 크로마토그래피에 의해 정제하는 단계. - 제1항에 있어서, 샘플을 대략 pH 5에서 바람직하게는 약 1~3시간, 바람직하게는 약 3시간 동안 인큐베이션하여 HCP를 침전시키는, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 크로마토그래피는 다음의 단계를 포함하는, 방법:
a. 단백질을 포함하는 여과액을 한외여과(UF) 및 정용여과(DF)에 적용하여 HIV Env 단백질을 포함하는 보유물을 얻는 단계; 및
b. HIV Env 단백질을 정제하기 위해 제1 컬럼에 보유물을 적용하는 단계. - 제3항에 있어서, HIV Env 단백질은 HIV-1 gp140 단백질이며, 제1 컬럼은 소수성 상호작용 및 양이온 교환 특성을 포함하는 다중모드 수지를 포함하는, 방법.
- HIV-1 gp140 단백질을 정제하는 방법으로서, 상기 방법은 소수성 상호작용 및 양이온 교환 특성을 포함하는 다중모드 수지 상에 단백질을 포획하는 단계, 및 정제된 분획을 다중모드 수지로부터 용출시키는 단계를 포함하며, HIV-1 gp140 단백질의 순도는 상기 단백질을 다중모드 수지 상에 로딩할 때의 혼합물 중 단백질과 비교하여 실질적으로 증가하는, 방법.
- HIV-1 gp140 단백질을 정제하는 방법으로서, 다음의 단계를 포함하는, 방법:
i) HIV-1 gp140 단백질 및 HIV-1 gp140 단백질이 발현되는 숙주 세포로부터 유래된 숙주 세포 단백질 등의 다른 원하지 않는 단백질을 포함하는 조성물을 제공하는 단계;
ii) 소수성 상호작용 및 양이온 교환 특성을 포함하는 다중모드 수지 상에 HIV-1 gp140 단백질을 포획하고, HIV-1 gp140 단백질을 포함하는 정제된 분획을 다중모드 수지로부터 용출시키는 단계;
iii) HIV-1 gp140 단백질을 결합시키기 위한 음이온 교환 수지에 단계 ii)의 정제된 분획을 적용하고, HIV-1 gp140 단백질을 포함하는 추가 정제 분획을 음이온 교환 수지로부터 용출시키는 단계; 및
iv) 단계 iii)의 추가 정제 분획을 음이온 교환 및 소수성 작용체를 갖는 다중모드 수지에 적용하고, 추가 정제 HIV-1 gp140 단백질을 용출시키는 단계. - 제6항에 있어서, HIV-1 gp140 단백질은 클레이드 C gp140 단백질(바람직하게는 서열 번호 1을 포함함)인, 방법.
- 제6항 또는 제7항에 있어서, HIV-1 gp140 단백질은 단계 ii)에서 다중모드 수지에 결합되고 추후 용출되는, 방법.
- 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 iv)의 다중모드 수지는 유통(flow-through) 모드로 사용되는, 방법.
- 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 iii)의 HIV-1 gp140 단백질의 추가 정제 분획을 친화성 매체 수지에 적용하고, HIV-1 gp140 단백질을 포함하는 추가 정제 분획을 상기 수지로부터, 바람직하게는 이 분획을 단계 iv)에 적용하기 전에 용출시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제10항에 있어서, HIV-1 gp140 단백질은 모자이크 gp140 단백질(바람직하게는 서열 번호 2를 포함함)인, 방법.
- 제10항 또는 제11항에 있어서, 친화성 매체 수지는 리간드 술페이트 또는 덱스트란 술페이트를 포함하는, 방법.
- 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, HIV-1 gp140 단백질은 친화성 매체 수지에 결합되고 추후 용출되는, 방법.
- 제6항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 i)의 조성물은 생물반응기에서 숙주 세포에 의해 생성되는, 방법.
- 제14항에 있어서, 생물반응기는 약 1 L 내지 약 20000 L, 바람직하게는 약 10 L 내지 약 16500 L의 부피를 갖는, 방법.
- 제6항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 i) 전에 조성물의 pH를 약 5.0으로 조정하여 조성물 중 숙주 세포 단백질(HCP)을 침전시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제6항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 HIV-1 gp140 단백질을 바이러스 체류 여과 단계에 적용하는, 방법.
- 제6항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 HIV-1 gp140 단백질을 한외여과(UF) 및 정용여과(DF)에 적용하는, 방법.
- 제6항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 HIV-1 gp140 단백질을 최종 제형화 단계에 적용하는, 방법.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 방법에 의해 단리된 단백질 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 백신.
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