CN1618955A - 一种CHO/dhfr－细胞定点整合表达系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种CHO/dhfr－细胞定点整合表达系统，该系统能够实现外源基因在CHO/dhfr－细胞基因组中定点整合和有效表达。该系统的制备方法主要包括：构建新的真核表达载体；筛选在基因组中转录活跃区整合FRT位点的CHO/dhfr－细胞株。利用该系统可以实现人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体－低分子量尿激酶融合基因在CHO/dhfr－细胞株基因组中的定点整合和表达。本发明的定点整合表达系统能够方便地应用于重组蛋白在CHO/dhfr－细胞中的高表达研究及CHO/dhfr－细胞株的改造等方面，具有广阔的应用前景。

Description

一种CHO/dhfr-细胞定点整合表达系统

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说涉及一种利用基因工程技术制备的CHO/dhfr-细胞定点整合表达系统。

背景技术

哺乳动物表达系统由于具有更精确的转录后加工，翻译后修饰(糖基化，二硫键形成等)，所以其表达产物在分子结构，理化性质和生物学功能等方面与天然蛋白更接近。因而在制备一些翻译后修饰较复杂的重组蛋白时，往往必须利用哺乳动物细胞表达系统。但是，与其他表达系统相比，实现重组蛋白在哺乳动物细胞中高表达存在研制周期长，综合成本高等问题。这主要是由于筛选高表达细胞株是一个既费时又费力的过程。因而研制高效、经济的真核表达系统一直是生物工程技术领域，尤其是蛋白制药领域的一个主要发展方向。

目前研究结果表明，决定重组蛋白在哺乳动物细胞中表达水平的因素是多方面的，包括目的基因在基因组上的拷贝数，目的基因在基因组的整合位点，目的基因表达的转录和翻译效率，表达产物的稳定性等。很多商业化真核表达系统都针对这些因素进行了优化设计，如选用强启动子(CMV或EF启动子)，带有加压扩增系统(DHFR或GS加压扩增系统)。但是利用这些商业化的载体来建立目的蛋白的高表达细胞株时，仍然需要耗费大量的人力和时间。这主要是因为绝大多数真核表达载体都为随机整合载体，而随机整合所导致的位置效应决定了大部分克隆的表达水平较低；而且，在这些载体上，目的基因的表达与筛选基因的表达通常是分离的，也导致出现大量的假阳性克隆。而解决这些问题就需要有效地实现目的基因在基因组中转录活跃区(或称热点hot spot)的整合。为实现此目的，目前主要有两个思路，其一就是通过弱化筛选基因表达及实现筛选基因与目的基因的表达偶联，从而提高目的基因在热点的整合概率。其二为通过同源重组或位点特异性重组直接将外源基因整合到热点。由于体细胞的同源重组(即体细胞打靶)比较困难，所以目前只有少量的成功报道(An efficient homologous recombination vector pTV(I)contains a hot spot for increased recombinant protein expression in chinesehamster ovary cells.Gene.2001，280：87-95)；而位点特异性重组技术则相对比较成熟，invitrogen公司已建立的一些哺乳动物细胞(包括293细胞、BHK细胞和CHO细胞)的定点整合表达系统，但这些细胞株不能很好地与常用的加压系统(尤其是MTX加压扩增系统，因该扩增系统需要宿主细胞为dhfr基因缺陷型)配合，定点整合的外源基因的表达水平通常都较低，只能应用于实验室研究，而不能方便地用于建立适合中试生产的高表达细胞株。Kito M等在2002年报道了基于cre-loxP重组系统的CHO/dhfr-细胞定点整合系统(Construction of engineered CHO strains for high-level production ofrecombinant proteins.Appl Microbiol Biotechnol.2002 Dec；60(4)：442-8.)，而国内外都未见基于flp-FRT重组系统的CHO/dhfr-细胞定点整合表达系统的报道。

发明内容

本发明公开了一种CHO/dhfr-细胞定点整合表达系统，该系统为一种能够实现外源基因在基因组中定点整合和有效表达的新型CHO/dhfr-细胞株，该细胞株的基因组中整合有FRT(Flp recombination target)位点。

本发明的CHO/dhfr-细胞株是利用随机整合的方法将FRT位点整合到CHO/dhfr-细胞的基因组中制备的，利用FRT位点介导的位点特异性重组实现特定外源基因在基因组中FRT位点的定点整合和有效表达。本发明主要内容如下：

1、真核表达载体pFRT/lacZeo3的构建

以invitrogen公司的一个真核表达载体pFRT/lacZeo为基础，利用PCR等常规分子生物学方法，对该载体中sv40启动子进行了弱化改造，构建了新型真核表达载体pFRT/lacZeo3(图1)。新构建的pFRT/lacZeo3将更方便地筛选到在基因组中转录活跃区(或称热点)整合有FRT位点的细胞株。

2、适合外源基因定点整合的CHO/dhfr-细胞株的筛选及鉴定

利用Invitrogen公司的阳离子脂质体Lipofectin2000将pFRT/lacZeo3质粒转染CHO/dhfr-细胞随后用抗生素Zeocin筛选阳性克隆。然后首先检测各个阳性克隆的LacZ的表达，然后提取基因组DNA，以同位素标记的LacZ基因片断为探针进行Southern Blot分析以确定pFRT/lacZeo3质粒在基因组中的拷贝数，并最终筛选到1株整合了单拷贝的pFRT/lacZeo3的细胞株，该细胞株命名为CHOfrt/dhfr-。

3、重组质粒pMCE-IInUK的构建

质粒pMCE-IInUK含有两个表达单元，其一为由pCMV启动的单链抗体-低分子量尿激酶融合基因(IIn-UK)表达单元，另一个表达单元为pSV40启动的neo基因的表达单元，其构建方法如下：

3.1真核表达质粒pMCE的构建

首先扩增DHFR基因，与载体pIRESneo进行双酶切，将DHFR基因克隆至载体pIRESneo，构建质粒pIRESdhfr；然后双酶切载体pIRESdhfr和pcDNA3.1(+)，回收两者的片段并连接，构建载体pMCE(图2)。

3.2融合基因IIn-UK的构建与克隆

首先通过PCR反应，扩增IIn-UK融合基因，然后将处理后的载体pMCE和PCR产物进行连接，构建真核表达质粒pMCE-IInUK(图3)，转化大肠杆菌，提取质粒进行鉴定。

4、适合IIn-UK融合基因定点整合的真核表达载体pMCEfrt-IInUK的构建

以质粒pMCE-IInUK为基础，利用PCR等常规分子生物学方法构建新型真核表达质粒pMCEfrt-IInUK(图4)。

5、IIn-UK融合基因在CHO/dhfr-细胞基因组中的定点整合及有效表达

利用invitrogen公司的阳离子脂质体Lipofectin2000将质粒pMCEfrt-IInUk和pOG44共转染细胞株CHOfrt/dhfr-，利用G418进行筛选阳性克隆，并对阳性克隆进行一系列分析表明，IIn-UK融合基因已在CHO/dhfr-基因组中的FRT位点定点整合和有效表达(图5、6)。

本发明建立的基于flp-FRT重组系统的CHO/dhfr-细胞定点整合和表达系统能够方便、快速地实现特定DNA序列在CHO/dhfr-细胞基因组中的定点整合，不仅能够应用于建立特定外源基因的高表达细胞株，而且能够应用于CHO/dhfr-细胞株本身的改造。

附图说明

图1质粒pFRT/lacZeo3结构示意图。

图2为质粒pMCE结构示意图。

图3为质粒pMCE-IInUK结构示意图。

图4质粒pMCEfrt-IInUK结构示意图。

图5为western blot检测培养上清中重组蛋白。其中A为蛋白质分子量标准，CHO/dhfr-培养上清，B为Clone#1培养上清，C为Clone#5培养上清。

图6为溶圈法分析培养上清中尿激酶的溶纤活性。其中A为0.25IU尿激酶标准，B为CHO/dhfr-培养上清，C为Clone#1培养上清，D为Clone#2培养上清，E为Clone#3培养上清，F为Clone#4培养上清，G为Clone#5培养上清。

具体实施方式

           实施例一  重组质粒pMCE-IInUK的构建

一、材料

质粒pcDNA3.1(+)购自invitrogen公司；质粒pSV2-dhfr，购自ATCC公司；质粒pIRESneo购自Clontech公司。质粒pET15b-IIn-UK为发明人构建(参见文献：生物工程学报，2002，18(4)：509-511)，该质粒克隆有人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体(IIn)基因及低分子量尿激酶(scuPA32k)突变基因，该基因的突变都为同义突变，不改变其编码的氨基酸序列。

大肠杆菌菌株XL1-blue，CHO/dhfr-细胞株，购自美国ATCC公司(CRL-9096)。质粒pFRT/lacZeo购自invitrogen公司，其中pFRT/lacZeo质粒含有lacZ-Zeocin融合蛋白的表达单元，用于筛选在基因组中合适位点整合有FRT位点的细胞株。

限制性内切酶及各种修饰酶购自TAKARA公司，pfu DNA聚合酶购自上海生工公司，血清和IMDM培养基购自Hyclone公司，阳离子脂质体Lipofectin2000购自invitrogen公司，抗生素Zeocin购自Invitrogen公司，β半乳糖苷酶活性分析试剂盒购自promega公司。随机引物DNA标记试剂盒购自Takara公司，其他常用生化试剂购自军事医学科学院条件处，为分析纯。

引物：Pfrt1sv40见序列表中序列4，Pfrt2sv40见序列表中序列5，Placz1见序列表中序列6，Placz2见序列表中序列7，S10见序列表中序列8。

实验设备：PCR仪(Perkin Elmer GeneAmp PCR system 2400)，超声波破碎仪(Cole Palmer CPX-600)，透射式紫外分析仪(LKB 2011 Macrovue)，高速冷冻离心机(Beckman J2-21)，台式高速冷冻离心机(Sigma 3K12)，低温循环水浴槽(LKB 2219 Multiteivip II)，低温冰箱(SanYo Medical freezer)

二、方法与结果

1、真核表达质粒pMCE的构建

以质粒pSV2-dhfr为模板，以P9和P10为引物(其序列分别见序列表中序列12和序列13)，扩增出DHFR基因，然后利用smaI+xbaI双酶切分别处理载体pIRESneo和回收的PCR产物，将DHFR基因克隆至载体pIRESneo(替换neo基因)，构建质粒pIRESdhfr；然后利用EcoRV+xbaI双酶切，分别处理载体pIRESdhfr和pcDNA3.1(+)，前者回收约1700bp的小片断，后者回收约5400bp的载体大片断，连接，构建载体pMCE(图2)。转化E.coliXL1-blue，挑取单克隆，提取质粒进行酶切鉴定和序列分析，结果表明序列完全正确。

2、融合基因IIn-UK的构建与克隆

以质粒pET15b-IIn-UK为模板，首先以P11和P12为引物(其序列分别见序列表中序列14和序列15)，用pfuDNA聚合酶进行PCR反应，然后再以回收的PCR产物为模板，以P13和P12为引物(P13序列见序列表中序列16)，用pfuDNA聚合酶扩增出IIn-UK融合基因，并在融合基因的5’端添加一个抗体的信号肽的编码基因。然后对PCR产物首先用NdeI切开，并用T4DNA聚合酶补平，热灭活T4DNA聚合酶后，再用EcoRV处理；载体pMCE先用EcoRI，并用T4DNA聚合酶补平，热灭活T4DNA聚合酶后，再用EcoRV处理，随后将处理后的载体和PCR产物进行连接，构建真核表达质粒pMCE-IInUK(图3)，转化E.coli XL1-blue，挑取单克隆，提取质粒进行酶切鉴定和序列分析，结果表明序列完全正确。

       实施例二  适合外源基因定点整合和有效表达

                 的CHO/dhfr-细胞株的制备

一、材料同上面实施例。

二、方法与结果

1、质粒载体pFRT/lacZeo3的构建

以质粒pMCE-IInUK为模板，以Pfrt1sv40和Pfrt2sv40为引物，扩增出缺失部分增强子序列(99bp)的突变SV40启动子，并在3/端添加NcoI酶切位点，琼脂糖电泳回收约280bp的PCR产物。回收的RCR产物用NcoI进行部分酶切并回收约280bp的大片断，而载体pFRT/lacZeo首先用TthIII单切并用T4 DNA聚合酶补平，热灭活T4 DNA聚合酶后，再用NcoI切开，随后回收载体大片断，并与NcoI酶切处理后的PCR产物连接，构建新的质粒pFRT/lacZeo3，转化XL1-blue，挑取单克隆，提取质粒进行酶切鉴定并利用引物S10进行序列分析，结果表明克隆序列与理论序列完全一致。pFRT/lacZeo3与pFRT/lacZeo的区别在于：新质粒中指导lacZ-Zeocin融合基因表达的为缺失部分增强子的SV40启动子，该突变启动子的转录活性只有野生型SV40启动子的约1/60。

2、适合外源基因定点整合的细胞株的筛选及鉴定

利用ScaI将质粒pFRT/lacZeo3进行线性化，然后利用Invitrogen公司的阳离子脂质体Lipofectin2000转染CHO/dhfr-细胞，随后用100μg/mL Zeocin筛选。挑选约30个阳性克隆，首先检测各个克隆的细胞裂解物的LacZ表达水平，然后挑选表达量较高的10个克隆提取基因组DNA，用HindIII进行完全消化，以同位素标记的LacZ基因片断(即以pFRT/lacZeo3为模板，以Placz1和Placz2为引物进行PCR而得到得lacZ基因片断)为探针进行Southern Blot分析以确定pFRT/lacZeo3质粒在基因组中的拷贝数，并最终筛选到1株只整合了单拷贝的pFRT/lacZeo3的细胞株CHOfrt/dhfr-。

实施例三  IIn-UK融合基因在细胞株CHOfrt/dhfr-基因组中的定点整

          合、有效表达及重组蛋白的活性分析

一、材料

质粒pOG44，购自invitrogen公司，含有Flp重组酶的表达单元，通过与特定质粒的共转染，可实现特定质粒在基因组中FRT位点的定点整合；抗生素G418购自GIBCO公司，β半乳糖苷酶活性分析试剂盒购自promega公司。兔抗尿激酶IgG为本实验室制备，HRP-羊抗兔IgG购自北京中山生物技术有限公司，其它与实施例一相同。

引物：Pfrtneo1见序列表中序列9，Pfrtneo2见序列表中序列10，S8见序列表中序列11。

二、方法与结果

1、适合IIn-UK融合基因定点整合的真核表达载体pMCEfrt-IInUK的构建

以质粒pMCE-IInUK为模板，以Pfrtneo1和Pfrtneo2为引物，用pfu DNA聚合酶进行PCR扩增出无启动子，但在5/端融合有FRT位点的neo基因的前半部分。随后用XhoI+BssHII双酶切处理回收的PCR以及质粒载体pMCE-IInUK，然后分别回收载体大片段及PCR产物，用T4 DNA连接酶进行连接，构建新的质粒pMCEfrt-IInUK，转化XL1-blue，挑取单克隆，提取质粒进行酶切鉴定并利用引物S8和pfrtneo2为引物进行序列分析，结果表明克隆序列与理论序列完全一致。

2、IIn-UK融合基因在CHO/dhfr-细胞基因组中的定点整合和有效表达

2.1 IIn-UK融合基因在CHO/dhfr-细胞基因组中的定点整合

利用invitrogen公司的阳离子脂质体Lipofectin2000将质粒pMCEfrt-IInUk和pOG44共转染细胞株CHOfrt/dhfr-，利用G418筛选阳性克隆。

2.2阳性克隆的zeocin抗性、细胞裂解物的lacZ活性分析

随机挑选5株阳性克隆，制备细胞裂解物，利用promega公司的β半乳糖苷酶活性分析试剂盒分析各个克隆的lacZ表达水平，结果表明5个克隆都表现无lacZ基因表达。同时将这些克隆分别传代于含100μg/mL Zeocin的IMDM培养基中培养，约2周后，细胞都死亡，表明这些克隆都为zeocin抗性敏感。这些结果显示IIn-UK融合基因定点整合到CHO/dhfr-细胞基因组中的FRT位点。

2.3阳性克隆培养上清中IInUK融合蛋白的鉴定及活性分析

2.3.1 Western blot鉴定培养上清表达的重组IIn-UK融合蛋白

阳性克隆的培养上清经三氯乙酸沉淀浓缩10倍后，制备样品进行SDS-PAGE，随后转印至硝酸纤维素膜，封闭后，依次加入兔抗尿激酶IgG和HRP-羊抗兔IgG，最后加入DAB显色液。结果在预期位置(约59KD)出现明显的表达带，表明定点整合的IIn-UK融合基因获得有效表达(图5)。

2.3.2溶圈法测定尿激酶的溶纤活性，方法参见军事医学科学院院刊，1987；11：101，结果表明培养上清中具有明显的尿激酶溶纤活性(图6)。

2.3.3 ELISA分析单链抗体的活性

抗原DD包被酶联孔，随后用1％BSA-1‰Tween20封闭；培养上清样品中先加BSA至1％，加Tween20至1‰进行封闭，然后加封闭后的上清样品至酶联孔，37℃，1h；洗涤后加入兔抗尿激酶IgG，37℃，1h；洗涤后加入HRP-羊抗兔IgG抗体，37℃，1h；洗涤后加入OPD底物液显色至适当强度，用2mol/L H2SO4终止反应并测定OD492。结果表明，培养上清具有单链抗体结合抗原DD活性(表1)。

表1：ELISA分析培养上清中IIn-UK杂合体的抗体活性

                  样品(n＝3)

CHO/dhfr-   Clone#1    Clone#2    Clone#3    Clone#4    Clone#5

OD₄₉₂  0.04±0.01   0.50±0.10   0.45±0.08   0.52±0.10   0.55±0.10   0.48±0.06

                         序列表

<110>  中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所

<120>  一种CHO/dhfr-细胞定点整合表达系统

<130>

<160>  16

<170>  PatentIn version 3.2

<210>  1

<211>  48

<212>  DNA

<213>

<400>  1

gaagttccta ttccgaagtt cctattctct agaaagtata ggaacttc                 48

<210>  2

<211>  233

<212>  DNA

<213>

<400>  2

gactgggtcg caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccatagtc    60

ccgcccctaa ctccgcccat cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc   120

catggctgac taattttttt tatttatgca gaggccgagg ccgcctctgc ctctgagcta   180

ttccagaagt agtgaggagg cttttttgga ggcctaggct tttgcaaaaa gct          233

<210>  3

<211>  847

<212>  DNA

<213>

<400>  3

gaagttccta ttccgaagtt cctattctct agaaagtata ggaacttcct tggccattga    60

acaagatgga ttgcacgcag gttctccggc cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga   120

ctgggcacaa cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg   180

gcgcccggtt ctttttgtca agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaggacga   240

ggcagcgcgg ctatcgtggc tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt   300

tgtcactgaa gcgggaaggg actggctgct attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct   360

gtcatctcac cttgctcctg ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct   420

gcatacgctt gatccggcta cctgcccatt cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg   480

agcacgtact cggatggaag ccggtcttgt cgatcaggat gatctggacg aagagcatca   540

ggggctcgcg ccagccgaac tgttcgccag gctcaaggcg cgcatgcccg acggcgagga    600

tctcgtcgtg acccatggcg atgcctgctt gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt    660

ttctggattc atcgactgtg gccggctggg tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt    720

ggctacccgt gatattgctg aagagcttgg cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct    780

ttacggtatc gccgctcccg attcgcagcg catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt    840

cttctga                                                              847

<210>  4

<211>  37

<212>  DNA

<213>

<400>  4

agtcgactgg gtcgcaggca gaagtatgca aagcatg                              37

<210>  5

<211>  34

<212>  DNA

<213>

<400>  5

cagtccatgg cgtgctgatc agatccgaaa atgg                                 34

<210>  6

<211>  23

<212>  DNA

<213>

<400>  6

tgtacgcgcg cgtggatgaa gac                                             23

<210>  7

<211>  24

<212>  DNA

<213>

<400>  7

gcaggagctc gttatcgcta tgac                                            24

<210>  8

<211>  19

<212>  DNA

<213>

<400>  8

 gtgcactctc agtacaatc                                                 19

<210>  9

<211>  89

<212>  DNA

<213>

<400>  9

agtcctcgag aagttcctat tccgaagttc ctattctcta gaaagtatag gaacttcctt    60

ggccattgaa caagatggat tgcacgcag                                      89

<210>  10

<211>  21

<212>  DNA

<213>

<400>  10

ggcatgcgcg ccttgagcct g                                              21

<210>  11

<211>  18

<212>  DNA

<213>

<400>  11

ctctatggct tctgaggc                                                  18

<210>  12

<211>  36

<212>  DNA

<213>

<400>  12

agcccgggcc gccttcatgg ttcgaccatt gaactg                              36

<210>  13

<211>  32

<212>  DNA

<213>

<400>  13

agtctagatt agtctttctt ctcgtagact tc                                  32

<210>  14

<211>  59

<212>  DNA

<213>

<400>  14

tctctttctc ttgtcaggaa ctggaggtgt cctctctcag gtgaagctgg ttgaatctg     59

<210>  15

<211>  35

<212>  DNA

<213>

<400>  15

gctctagaca tatgttatca gagggccagg ccatt                               35

<210>  16

<211>  61

<212>  DNA

<213>

<400>  16

tctctttctc ttgtcaggaa ctggaggtgt cctctcttta aaatttcagt gtggccaaaa    60

g                                                                    61

Claims (8)

1、一种CHO/dhfr-细胞定点整合表达系统，其特征在于一种CHO/dhfr-细胞株，该细胞株的基因组中整合有FRT位点，FRT位点具有如序列表中序列1所示的DNA序列。

2、制备权利要求1所述的CHO/dhfr-细胞株的方法，包括以下步骤：

(1)构建真核表达载体pFRT/lacz3；

(2)将质粒pFRT/lacz3转染CHO/dhfr-细胞，用抗生素筛选阳性克隆；

(3)分析阳性克隆的lacZ表达水平及基因组中lacZ基因的拷贝数。

3、根据权利要求2所述方法，其中质粒pFRT/lacz3包含缺失增强子的SV40启动子，其序列如序列表中序列2所示。

4、权利要求1所述的CHO/dhfr-细胞株在利用位点特异性重组实现特定外源基因定点整合和有效表达中的应用。

5、根据权利要求4所述的应用，其特征在于重组特异位点为FRT，重组酶为flp。

6、根据权利要求4或5所述的应用，包括以下步骤：

(1)构建适合特定外源基因进行定点整合的真核表达质粒；

(2)将(1)中构建好的真核表达质粒和质粒pOG44共转染权利要求1所述的CHO/dhfr-细胞株；

(3)筛选阳性克隆；

(5)利用MTX加压扩增，建立特定外源基因的高表达细胞株。

7、根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述的真核表达质粒包含FRT-neo融合基因，该基因具有序列表中序列3所示的DNA序列。

8、根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于所述的外源基因为人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体-低分子量尿激酶融合基因。

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