CN112725424A - 一种检测Flp-In宿主细胞系中FRT位点拷贝数的引物组、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测Flp‑In宿主细胞系中FRT位点拷贝数的引物组、试剂盒及方法，属于基因工程技术领域，所述引物组，包括检测LAC基因的引物对和检测内参基因的引物对；所述内参基因为人类基因SYNCRIP的内含子UCR；所述内参基因在NCBI数据库中的序列号为NG_031848.1；本发明提供的试剂盒以及方法能够实现FRT位点拷贝数的检测，与其它基因拷贝数检测方法相比，不仅操作简单、结果准确，而且具有重复性好、灵敏度高、特异性好、成本低、方便灵活的优点。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种检测Flp-In宿主细胞系中FRT位点拷贝数的引物组、试剂盒及方法。
背景技术
Flp-In完整系统(Flp-In Complete System)可使目的基因在哺乳动物细胞基因组的特定位点整合和表达。Flp-In系统涉及将Flp重组靶(FRT)位点导入所选哺乳动物细胞系的基因组中，然后通过Flp重组酶介导在FRT位点的DNA重组，使含有目的基因的表达载体整合到基因组中。
Flp-In系统的主要组分包括三部分：第一部分是Flp-Ino靶位点载体pFRT/lacZeo，用于制备含有FRT整合位点的宿主细胞系，由此产生的Flp-In宿主细胞系包含完整的FRT位点，且表达lacZ-Zeocino融合基因，FTR位点是这个系统的关键序列，它最初从酿酒酵母中分离出来，是Flp重组酶的结合位点，最短的FRT位点包括34个碱基序列；第二个主要组成部分是pcDNA5/FRT的表达载体，可以将感兴趣的基因克隆到该载体中。该表达质粒上还有与潮霉素抗性基因相连的FRT位点，用于在Flp重组酶介导下，整合和筛选表达目的基因的稳定细胞系；第三个主要组成部分是pOG44质粒，用于表达Flp重组酶。
建立Flp-In系统的优势在于一旦建立了包含完整FRT位点的Flp-In宿主细胞系后，那么就会快速而高效的建立表达目的基因的Flp-In细胞系的后代，且Flp-Ino系统产生的是稳定表达的细胞系，为研究目的基因，特别是与疾病相关的目标基因的功能研究提供良好的基础。
在创建一个稳定的Flp-In细胞系表达目的基因之前，首先需要创建一个包含完整的FRT位点稳定的哺乳动物细胞系，而pFRT/lacZeo质粒整合到基因组中是随机的，这样FRT整合的位点可能是一个或多个。基因组中如果存在多个整合的FRT位点可能会增加染色体重排或意外重组事件的发生，从而影响目的基因的表达和功能研究。所以对完整的FRT位点的拷贝数的检测是非常必要的，有利于获得单拷贝或低拷贝的FRT位点整合的细胞系，进行进一步研究或利用。那么当前迫切需要探索、筛选出一种适合Flp-In细胞系中FRT位点整合率的高效检测与评价方法，为利用该系统研究目的基因功能提供良好的基础。
传统外源基因拷贝数的检测方法是Southern blot，但耗时、费力、并需要大量基因组DNA。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测Flp-In宿主细胞系中FRT位点拷贝数的引物组、试剂盒及方法；本发明提供的试剂盒以及方法能够实现FRT位点拷贝数的检测，与其它基因拷贝数检测方法相比，不仅操作简单、结果准确，而且具有重复性好、灵敏度高、特异性好、成本低、方便灵活的优点。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供一种检测Flp-In宿主细胞系中FRT位点拷贝数的引物组，包括检测LAC基因的引物对和检测内参基因的引物对；所述内参基因为人类基因SYNCRIP的内含子UCR；所述内参基因在NCBI数据库中的序列号为NG_031848.1。
优选的，所述检测LAC基因的引物对包括的正向引物LAC13-F和反向引物LAC13-R，核苷酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。
优选的，所述检测内参基因的引物对包括正向引物UCR2-F和反向引物UCR2-R，核苷酸序列分别如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。
本发明提供了一种检测Flp-In宿主细胞系中FRT位点拷贝数的试剂盒，包括所述的引物组和PCR试剂。
优选的，所述PCR试剂包括PCR反应缓冲液、热启动TaqDNA聚合酶、dNTP、MgCl2和SYBR Green II荧光染料。
优选的，所述引物组中每条引物的使用浓度独立为8～12μmol/L。
本发明提供了一种检测Flp-In宿主细胞系中FRT位点拷贝数的方法，包括以下步骤：
1)提取Flp-In宿主细胞系基因组DNA；
2)以所述基因组DNA为模板，分别以检测LAC基因的引物对和检测内参基因的引物对为引物，进行实时定量荧光PCR，分别获得LAC基因扩增的溶解曲线、LAC基因的CT值CTlac、内参基因扩增的溶解曲线和内参基因的CT值CT内参；
3)当所述LAC基因扩增的溶解曲线和内参基因扩增的溶解曲线均为单峰，并且所述CT内参小于等于CTlac时，所述LAC基因的拷贝数为1；当所述LAC基因扩增的溶解曲线和内参基因扩增的溶解曲线均为单峰，并且所述CT内参大于CTlac时，根据以下公式计算LAC基因的拷贝数：LAC基因的拷贝数＝内参基因的拷贝数×2n+1，其中n＝(CT内参-CTlac)；所述LAC基因的拷贝数即为Flp-In宿主细胞系中FRT位点拷贝数。
优选的，步骤1)中所述基因组DNA的浓度为20～80ng/μl。
优选的，步骤2)中所述实时定量荧光PCR的程序如下：95℃3min；95℃15s，60℃60s，40个循环；95℃15s，60℃60s，95℃15s。
优选的，步骤2)中所述实时定量荧光PCR的体系以20μl计，包括以下组分：基因组DNA 2μl，正向引物0.4μl，反向引物0.4μl，2×SYBRGreen Real time PCR Master 10μl和ddH2O 7.2μl。
本发明的有益效果：本发明提供的检测Flp-In宿主细胞系中FRT位点拷贝数的引物组，其中内参基因选择人类基因SYNCRIP的内含子UCR，所述人类基因SYNCRIP的内含子UCR为人类基因组上的单拷贝基因，以其为内参基因能够通过荧光定量PCR成功、快速、准确的鉴定Flp-In宿主细胞系中FRT位点拷贝数，提高了检测效率，节约了DNA用量。
进一步的，本发明所述引物组中检测LAC基因的引物对和检测内参基因的引物对的扩增效率一致，能够通过相对定量的方法计算LAC基因的拷贝数。
进一步的，本发明所提供的检测LAC基因的引物对具有通用性，设计在载体的LAC基因区，适用于任何含有LAC基因载体的外源基因拷贝数检测。
本发明提供的引物组和方法具有特异性好、灵敏性高、反应体系可重复性好、稳定性好，适用于任何细胞系样本中的FRT位点拷贝数的检测。
附图说明
图1为UCR基因的southern杂交图，HindIII酶切基因组，UCR基因中无HindIII酶切位点，故southern杂交只显示一条带；
图2为内参基因UCR溶解曲线；
图3为检测基因LAC溶解曲线；
图4为内参基因UCR与检测基因LAC扩增效率检测图，其中a：检测基因LAC扩增标准曲线图，b：内参基因UCR扩增标准曲线图；
图5为不同样品中内参基因UCR扩增曲线图，其中不同的曲线代表不同的样本及重复；
图6为不同样品中检测基因LAC扩增曲线图，其中不同的曲线代表不同的样本及重复；
图7为不同样品检测拷贝数的柱形图；
图8为UCR基因和LAC基因不同引物的标准曲线图，其中a：LAC12引物的标准图，b：LAC15引物的标准曲线图，c：UCR1引物的标准曲线图，d：UCR3引物的标准曲线图，e：UCR4引物的标准曲线图；
图9为LAC和UCR基因质粒标准品扩增结果，其中a：以LAC13为引物的质粒标准品扩增曲线；b：以LAC13为引物的质粒标准品扩增的标准曲线；c：以UCR2为引物的质粒标准品扩增曲线；d：以UCR2为引物的质粒标准品扩增的标准曲线；
图10为提取样品DNA的电泳检测图，其中：M:Trans 5K；1～4表示4个样品。
具体实施方式
本发明提供一种检测Flp-In宿主细胞系中FRT位点拷贝数的引物组，包括检测LAC基因的引物对和检测内参基因的引物对；所述内参基因为人类基因SYNCRIP的内含子UCR；所述内参基因在NCBI数据库中的序列号为NG_031848.1。
在本发明中，所述检测LAC基因的引物对包括正向引物LAC13-F和反向引物LAC13-F；所述检测LAC基因的引物对选择pFRT/lacZeo载体上的LAC基因部分序列为模板设计获得，适用于任何含有LAC基因载体的外源基因拷贝数检测。
在本发明中，所述内参基因人类基因SYNCRIP的内含子UCR为人类基因组上的单拷贝基因，以所述人类基因SYNCRIP的内含子UCR为模板设计获得所述检测内参基因的引物对，所述检测内参基因的引物对包括正向引物UCR2-F和反向引物UCR2-R。
在本发明中，所述检测LAC基因的引物对和检测内参基因的引物对的核苷酸序列具体如表1所示。
表1 引物序列信息
本发明还提供了一种检测Flp-In宿主细胞系中FRT位点拷贝数的试剂盒，包括所述的引物组和PCR试剂。
在本发明中，所述PCR试剂优选的包括PCR反应缓冲液、热启动TaqDNA聚合酶、dNTP、MgCl2和SYBR Green II荧光染料；所述PCR试剂优选为进行荧光定量PCR所用，在本发明具体实施过程中，所述PCR试剂优选为市售的2×SYBRGreen Real time PCR Master；本发明对所述2×SYBRGreen Real time PCR Master的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。
在本发明中，所述引物组中每条引物的使用浓度独立优选为8～12μmol/L，更优选为9～11μmol/L，最优选为10μmol/L。本发明对所述试剂盒中每一条引物的储存浓度没有特殊限定，在使用时调整到限定的使用浓度即可。本发明对所述引物组中的引物的制备方法没有特殊限定，采用本领域常规的人工合成方法即可。
本发明还提供了一种检测Flp-In宿主细胞系中FRT位点拷贝数的方法，包括以下步骤：1)提取Flp-In宿主细胞系基因组DNA；2)以所述基因组DNA为模板，分别以检测LAC基因的引物对和检测内参基因的引物对为引物，进行实时定量荧光PCR，分别获得LAC基因扩增的溶解曲线、LAC基因的CT值CTlac、内参基因扩增的溶解曲线和内参基因的CT值CT内参；3)当所述LAC基因扩增的溶解曲线和内参基因扩增的溶解曲线均为单峰时，根据以下公式计算LAC基因的拷贝数：LAC基因的拷贝数＝内参基因的拷贝数×2n+1，其中n＝(CT内参-CTlac)；所述LAC基因的拷贝数即为Flp-In宿主细胞系中FRT位点拷贝数。
在本发明中，提取Flp-In宿主细胞系基因组DNA。本发明对所述Flp-In宿主细胞系的来源没有特殊限定，在本发明具体实施过程中，采用转化pFRT/lacZeo质粒的宿主细胞系Flp-In-K562；本发明对所述转化pFRT/lacZeo质粒的宿主细胞系Flp-In-K562的制备方法没有特殊限定，以K562细胞为原始细胞，将所述pFRT/lacZeo质粒实现转入即可。在本发明中，优选的采用DNA提取试剂盒提取基因组DNA，在本发明具体实施过程中，采用QIAGENQIAamp DNA mini kit试剂盒进行。本发明在提取获得基因组DNA后，优选的采用琼脂糖凝胶电泳检测提取获得的基因组DNA的质量，电泳后的DNA条带没有弥散拖尾现象，说明提取的DNA较完整，可以满足实验需求。然后利用核酸和蛋白定量分析仪对DNA进行质量及浓度测定，样品的OD260/280值在1.8～2.0范围内即可。在本发明中，优选的调整质量合格的基因组DNA的浓度至20～80ng/μl，更优选的为40～60ng/μl，最优选为50ng/μl。
本发明在获得所述基因组DNA后，以所述基因组DNA为模板，分别以检测LAC基因的引物对和检测内参基因的引物对为引物，进行实时定量荧光PCR，分别获得LAC基因扩增的溶解曲线、LAC基因的CT值CTlac、内参基因扩增的溶解曲线和内参基因的CT值CT内参。在本发明中，所述实时定量荧光PCR的程序优选的如下：95℃3min；95℃15s，60℃60s，40个循环；95℃15s，60℃60s，95℃15s；所述实时定量荧光PCR的体系以20μl计，包括以下组分：基因组DNA 2μl，正向引物0.4μl，反向引物0.4μl，2×SYBRGreen Real time PCRMaster 10μl和ddH2O 7.2μl。在本发明中，每一份待检测样品分别以所述检测LAC基因的引物对和检测内参基因的引物对进行实时定量荧光PCR扩增，每一份待检测样品优选的设置2～4个平行样品，更优选为3个平行样品；每一个平行样品优选的进行2～4次重复实验，更优选为3次。
在本发明中，通过LAC基因扩增的溶解曲线和内参基因扩增的溶解曲线是否为单峰，确定扩增产物的特异性；如果为单峰，则认为扩增产物具有特异性，可以进行后续操作，如果不是单峰，出现两个或两个以上的峰，说明有引物二聚体等非特异性扩增产生，则认为扩增产物不具有特异性，不进行后续操作。在本发明中，当所述LAC基因扩增的溶解曲线和内参基因扩增的溶解曲线均为单峰，并且所述CT内参小于等于CTlac时，所述LAC基因的拷贝数为1；当所述LAC基因扩增的溶解曲线和内参基因扩增的溶解曲线均为单峰，并且所述CT内参大于CTlac时，根据以下公式计算LAC基因的拷贝数：LAC基因的拷贝数＝内参基因的拷贝数×2n+1，其中n＝(CT内参-CTlac)；所述LAC基因的拷贝数即为Flp-In宿主细胞系中FRT位点拷贝数。
在本发明中，CT值是每个PCR反应管内荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数；模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。在本发明中，所述内参基因UCR为单拷贝基因，LAC基因每少一个CT值则代表LAC基因的拷贝数为UCR拷贝数的2倍，对应的FRT位点的拷贝数也为UCR拷贝数的2倍。由于基因组中存在同源染色体的情况，因此算LAC基因拷贝数为上述方法得到的数值的2倍；进而通过以下公式计算Flp-In宿主细胞系中FRT位点拷贝数：LAC基因的拷贝数＝内参基因的拷贝数×2n+1，其中n＝(CT内参-CTlac)。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
荧光定量PCR鉴定Flp-In宿主细胞系中FRT位点拷贝数
基因组DNA的准备
按照Thermo Fisher公司的Flp-InTMComplete System(货号：K601001)试剂盒的操作步骤构建获得的宿主细胞系Flp-In-K562。提取转化pFRT/lacZeo质粒的宿主细胞系Flp-In-K562基因组DNA。参照QIAGEN QIAamp DNA mini kit试剂盒提取细胞基因组DNA，1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，再利用核酸和蛋白定量分析仪对DNA进行质量及浓度测定，并用ddH2O统一稀释至50ng/μl。基因组电泳结果如图10所示，所提取的DNA条带完整，没有拖尾弥散现象，且测定样品的OD260/280值为1.9，在1.8～2.0范围内满足实验需求。
荧光定量PCR反应体系如表2所示。
表2 荧光定量PCR反应体系
将PCR管置于荧光定量PCR仪AB 7500仪器中，按照以下反应程序进行PCR反应：95℃3min；95℃15s，60℃60s，40个循环；95℃15s，60℃60s，95℃15s。在循环过程中，通过对溶解曲线是否单峰来判断扩增产物的特异性。每份样品分别进行内参基因UCR和待测基因LAC的PCR反应，每试样做3个平行，每个平行做3次重复实验。
荧光定量PCR溶解曲线分析
采用SYBR GreenⅡ荧光嵌合法检测时，由于SYBR GreenⅡ可以嵌合进所有的双链DNA的小沟区域，受激发而发出荧光，因此必需做PCR反应的特异性检测。通过溶解曲线来分析其扩增特异性。理想的溶解曲线应该是单峰型曲线，如果出现两个或两个以上的峰，说明有引物二聚体等非特异性扩增产生。本实施例中，UCR和LAC两个基因扩增的溶解曲线如图2和图3所示，可以看出UCR基因扩增的峰值在80℃且有单一的峰出现，LAC基因扩增的峰值在87℃且有单一峰出现，说明在PCR扩增过程中，没有出现非特异性扩增，由此确定荧光定量PCR扩增所获得的数据是可靠的。
内参基因UCR和目标基因LAC的扩增效率一致性检测
选用相对定量的标准是内参基因和目标基因必须有相一致的扩增效率，并尽可能的接近100％。这样操作的优势在于不用每次做标准曲线，操作简单、经济、通量高。
用上述设计好的UCR和LAC特异的引物制备标准曲线。计算出UCR和LAC引物的扩增效率。将样品DNA按照100ng，10ng，1ng，0.1ng的梯度稀释，制备梯度扩增曲线，将得到的CT值作为纵坐标，起始模板DNA上样量的对数作为横坐标生成标准曲线见图4。扩增LAC基因引物对的标准曲线见图4中的a，得到的线性回归方程为：Y＝-3.575X+28.13，二者的曲线相关系数R2＝0.9956，扩增效率为：90.41％。扩增UCR基因引物对的标准曲线见图4中的b，得到的线性回归方程为：Y＝-3.577X+27.63，二者的曲线相关系数R2＝0.9943，扩增效率为：90.37％。两种引物对的扩增效率相差0.04％，由此得出目标基因和内参基因的引物扩增效率大体一致，可以通过相对定量方法进行定量，即通过内参基因的拷贝数定量目标基因拷贝数。
Flp-In-K562宿主细胞系样品的拷贝数测定
根据LAC基因和内参基因UCR的CT值比较分析；CT值是每个PCR反应管内荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。内参基因UCR为单拷贝基因，LAC基因每少一个CT值则代表LAC基因的拷贝数为UCR拷贝数的2倍，对应的FRT位点的拷贝数也为UCR拷贝数的2倍。由于基因组中存在同源染色体的情况，因此算LAC基因拷贝数为上述方法得到的数值的2倍；进而通过以下公式计算Flp-In宿主细胞系中FRT位点拷贝数：LAC基因的拷贝数＝内参基因的拷贝数×2n+1，其中n＝(CT内参-CTlac)。
本实施例对7个Flp-In-K562宿主细胞系样品进行拷贝数分析，7个样品的LAC基因和UCR基因扩增曲线图如图5和图6所示。根据所述的拷贝数测量方法获得7个样品的FRT拷贝数计算如表3所示。
表3 7个Flp-In-K562宿主细胞系样品拷贝数检测结果
根据表中显示的拷贝数，可以得出在样品76中FRT位点是多拷贝，其余样品为单拷贝。我们以样品5拷贝数为对照标准品，得到其他样品的拷贝数的情况如图7所示。
实施例2
实施例1中方法的重复性检测
重新提取样品DNA，按照实施例1中的方法再次测量样品的拷贝数，观察两次的拷贝数计算方法是否具有重复性。结果如表4所示。
表4 7个Flp-In-K562宿主细胞系样品拷贝数二次检测结果
| 样品编号 | LAC平均CT值 | UCR平均CT值 | ΔCt | 拷贝数 |
| 5 | 22.968 | 21.056 | 1.912 | 1 |
| 6 | 22.702 | 20.903 | 1.799 | 1 |
| 23 | 23.522 | 21.635 | 1.887 | 1 |
| 30 | 22.936 | 21.322 | 1.614 | 1 |
| 58 | 23.153 | 21.184 | 1.969 | 1 |
| 63 | 22.131 | 21.594 | 0.537 | 1 |
| 76 | 20.014 | 21.195 | -1.181 | 5 |
从表4中可以得出7个样品结果是完全一致的。说明本发明提供的测定Flp-In-K562宿主细胞系中FRT位点拷贝数方法结果稳定，重复性良好。
对比例1
不同荧光定量PCR引物的溶解曲线和扩增效率的对比
对LAC基因和UCR基因设计多对荧光定量引物，对引物的溶解曲线和扩增效率进行对比。
针对LAC基因和UCR基因设计的引物对信息如表5所示。
表5 LAC基因和UCR基因设计的引物对信息
1.分析引物的溶解曲线和扩增效率
分别以LAC11、LAC12、LAC14、LAC154对引物对LAC基因进行荧光定量PCR，以UCR1、UCR3、UCR43对引物对UCR基因进行荧光定量PCR，分析各个引物对的溶解曲线和扩增效率。结果为除了LAC11和LAC14引物外，其他的引物都是单峰型溶解曲线。
用上述筛选出的UCR和LAC特异的引物制备标准曲线。计算出UCR和LAC引物的扩增效率。将得到的CT值作为纵坐标，起始模板DNA上样量的对数作为横坐标生成标准曲线见图8。LAC12引物的标准曲线见图8中a，得到的线性回归方程为：Y＝-3.650X+28.39，R2＝0.9942，扩增效率为：87.93％；LAC15引物的标准曲线见图8中b，得到的线性回归方程为：Y＝-3.415X+28.27R2＝0.9978，扩增效率为：96.29％。UCR1引物的标准曲线见图8中的c，得到的线性回归方程为：Y＝-3.587X+28.59，R2＝0.98984b，扩增效率：90.02％；UCR3引物的标准曲线见图8中的d，得到的线性回归方程为：Y＝-3.462X+27.64，R2＝0.9971，扩增效率：94.49％；UCR4引物的标准曲线见图8中的e，得到的线性回归方程为：Y＝-3.311X+29.11，R2＝0.9946，扩增效率：100.45％。
实施例1中用到的LAC13引物的标准曲线见图4中a，得到的线性回归方程为：Y＝-3.575X+28.13，R2＝0.9956，扩增效率为：90.41％，UCR2引物的标准曲线见图4中的b，得到的线性回归方程为：Y＝-3.577X+27.63，R2＝0.9943，扩增效率为：90.37％，
比较上述LAC基因和UCR基因引物的扩增效率，各个引物对的扩增效率均不相同，不能通过相对定量方法对LAC基因的拷贝数进行定量。
而实施例1中的LAC13引物和UCR2引物的扩增效率基本一致，作为荧光定量PCR法检测Flp-In宿主细胞系中FRT位点拷贝数的检测引物，检测结果更准确。
对比例2
为进一步证明本发明中筛选到的LAC13引物对和UCR2引物对检测Flp-In宿主细胞系中FRT位点拷贝数的可靠性，将LAC基因和UCR基因分别连接T载体后获得连接有LAC基因的质粒和连接有UCR基因的质粒，将两种质粒混合，获得这两个基因的相同拷贝数的T载体混合质粒标准品模板，进行荧光定量PCR反应，进一步检测两个引物的扩增效率是否一致。
标准曲线制备
制备LAC和UCR两个基因相同拷贝数的混合质粒标准品模板。制备方法：将LAC基因和UCR基因分别连接T载体，命名为：T-LAC和T-UCR；提取T-LAC和T-UCR质粒，并计算两种质粒的拷贝数；将含有相同拷贝数的两种质粒一起混合，进行梯度稀释作为荧光定量PCR的反应模板。质粒标准品的拷贝数分别是：108，107，106，105，104，103，102。分别用LAC13和UCR2为引物进行荧光定量PCR，制备标准曲线，计算引物的扩增效率。
LAC13引物的荧光定量PCR的扩增曲线如图9中的a所示，以质粒拷贝数对数为横坐标，CT值为纵坐标得到的标准曲线为图9中的b所示，标准曲线方程为：Y＝-3.264X+36.84，R2＝0.9998，扩增效率约100％。
UCR2引物的荧光定量PCR的扩增曲线如图9中的c所示，以质粒拷贝数对数为横坐标，CT值为纵坐标得到的标准曲线为图9中的d所示，标准曲线方程为：Y＝-3.235X+36.74，R2＝0.9965，扩增效率约100％。由此可见这两个引物对的扩增效率一致，进一步说明本发明的引物对和方法式具有可靠性。
由上述实施例可知，本发明提供的引物组和方法，不仅操作简单、结果准确，而且具有重复性好、特异性好、成本低、方便灵活的优点。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京鼎成肽源生物技术有限公司
焦顺昌
<120> 一种检测Flp-In宿主细胞系中FRT位点拷贝数的引物组、试剂盒及方法
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
taaatctgaa cgggtgccgc ta 22
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
tcagttcgcc agaagcagtt aga 23
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gctaatcacg acgcgctgta tc 22
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<213> Artificial Sequence
<400> 4
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<400> 5
ccgctacagt caacagcaac tg 22
<210> 6
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cagttgctgt tgactgtagc gg 22
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tcagttcgcc agaagcagtt ag 22
Claims (10)
1.一种检测Flp-In宿主细胞系中FRT位点拷贝数的引物组，其特征在于，包括检测LAC基因的引物对和检测内参基因的引物对；所述内参基因为人类基因SYNCRIP的内含子UCR；所述内参基因在NCBI数据库中的序列号为NG_031848.1。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述检测LAC基因的引物对包括的正向引物LAC13-F和反向引物LAC13-R，核苷酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。
3.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述检测内参基因的引物对包括正向引物UCR2-F和反向引物UCR2-R，核苷酸序列分别如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。
4.一种检测Flp-In宿主细胞系中FRT位点拷贝数的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～3任意一项所述的引物组和PCR试剂。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR试剂包括PCR反应缓冲液、热启动TaqDNA聚合酶、dNTP、MgCl2和SYBR Green II荧光染料。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述引物组中每条引物的使用浓度独立为8～12μmol/L。
7.一种检测Flp-In宿主细胞系中FRT位点拷贝数的方法，包括以下步骤：
1)提取Flp-In宿主细胞系基因组DNA；
2)以所述基因组DNA为模板，分别以检测LAC基因的引物对和检测内参基因的引物对为引物，进行实时定量荧光PCR，分别获得LAC基因扩增的溶解曲线、LAC基因的CT值CTlac、内参基因扩增的溶解曲线和内参基因的CT值CT内参；
3)当所述LAC基因扩增的溶解曲线和内参基因扩增的溶解曲线均为单峰，并且所述CT内参小于等于CTlac时，所述LAC基因的拷贝数为1；当所述LAC基因扩增的溶解曲线和内参基因扩增的溶解曲线均为单峰，并且所述CT内参大于CTlac时，根据以下公式计算LAC基因的拷贝数：LAC基因的拷贝数＝内参基因的拷贝数×2n+1，其中n＝(CT内参-CTlac)；所述LAC基因的拷贝数即为Flp-In宿主细胞系中FRT位点拷贝数。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述基因组DNA的浓度为20～80ng/μl。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述实时定量荧光PCR的程序如下：95℃3min；95℃15s，60℃60s，40个循环；95℃15s，60℃60s，95℃15s。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述实时定量荧光PCR的体系以20μl计，包括以下组分：基因组DNA 2μl，正向引物0.4μl，反向引物0.4μl，2×SYBRGreenRealtime PCRMaster 10μl和ddH2O 7.2μl。
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1618955A (zh) * | 2003-11-20 | 2005-05-25 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | 一种CHO/dhfr－细胞定点整合表达系统 |
| CN104911260A (zh) * | 2015-04-28 | 2015-09-16 | 凯杰（苏州）转化医学研究有限公司 | 一种新型成纤维细胞生长因子19(fgf19)基因拷贝数检测试剂盒 |
| CN105112534A (zh) * | 2015-09-15 | 2015-12-02 | 南京农业大学 | 一种荧光定量pcr鉴定菊花内、外源基因拷贝数的引物对及方法 |
-
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1618955A (zh) * | 2003-11-20 | 2005-05-25 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | 一种CHO/dhfr－细胞定点整合表达系统 |
| CN104911260A (zh) * | 2015-04-28 | 2015-09-16 | 凯杰（苏州）转化医学研究有限公司 | 一种新型成纤维细胞生长因子19(fgf19)基因拷贝数检测试剂盒 |
| CN105112534A (zh) * | 2015-09-15 | 2015-12-02 | 南京农业大学 | 一种荧光定量pcr鉴定菊花内、外源基因拷贝数的引物对及方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 刘志刚等: "新型CHO/dhfr-细胞定点整合和表达系统的建立", 《军事医学科学院院刊》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116286982A (zh) * | 2022-09-09 | 2023-06-23 | 广州凯普医药科技有限公司 | 一种hpv基因分型检测阳性参考品及其制备方法和应用 |
| CN116286982B (zh) * | 2022-09-09 | 2024-01-30 | 广州凯普医药科技有限公司 | 一种hpv基因分型检测阳性参考品及其制备方法和应用 |
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