CN112538499A - 一种重组质粒载体、抗体展示细胞系及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种重组质粒载体、抗体展示细胞系及其应用，属于单克隆抗体开发技术领域，所述重组质粒载体，包括初始质粒载体和插入片段，所述初始质粒载体为哺乳动物细胞转座质粒，所述插入片段包括FRT‑LacZeo片段；所述抗体展示细胞系，通过在原始细胞中转染所述重组质粒载体获得。本发明利用转座酶把所需的基因转入基因组，基因敲入的效率更高；带有抗性基因的细胞多，能够更快的进入细胞单克隆阶段；更容易筛选到带有单个整合位点的抗体展示细胞，所述抗体展示细胞能够应用于抗体展示和筛选。

Description

一种重组质粒载体、抗体展示细胞系及其应用

技术领域

本发明属于单克隆抗体开发技术领域，尤其涉及一种重组质粒载体、抗体展示细胞系及其应用。

背景技术

通过展示技术进行抗体开发是目前快速开发单克隆抗体的热门技术之一。噬菌体展示技术在应用过程中存在较多的限制，例如噬菌体展示技术难以展示全抗体或者Fab片段，展示能力弱；又如噬菌体展示筛选到的抗体序列密码子偏好性与人源细胞迥异，转入哺乳动物细胞表达后往往不能表达或者表达量很低，为后续的抗体制备和生产造成了挑战。近年来，采用哺乳动物细胞表面展示系统开发抗体成为发展人源抗体的重要方向。哺乳动物细胞，尤其是人源细胞的蛋白质折叠、翻译、分泌和翻译后修饰过程与人体内过程一致，因此大大加速了抗体开发的过程。

哺乳动物展示系统开发的关键是制备单个整合位点的宿主细胞。整合位点常用的是来自于Flp-In系统的FRT整合位点。目前制备这种宿主细胞是哺乳动物展示系统开发的难点，现有技术是通过携带FRT位点的质粒pFRT/lacZeo进行细胞转染，通过长时间的药物筛选获得基因组中插入FRT位点的细胞，进一步通过大量的制备单克隆，筛选合适的展示宿主细胞。然而质粒转染后自发的同源重组发生率低，加之单抗性基因插入后，细胞抗药性也差，使得总体筛选获得单点整合FRT基因的展示细胞株十分困难。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种重组质粒载体、抗体展示细胞系及其应用，本发明所述的质粒载体通过将FRT-LacZeo片段克隆到哺乳动物细胞转座质粒中获得，本发明借助转座子技术，利用转座酶把所需的基因转入基因组，基因敲入的效率更高；在进行进一步的药物筛选中，带有抗性基因的细胞多，总体活力好，能够更快的进入细胞单克隆阶段；在单克隆挑选阶段由于编辑后的细胞比例高，因此更容易筛选到带有单个整合位点的抗体展示细胞。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种重组质粒载体，包括初始质粒载体和插入片段，所述初始质粒载体为哺乳动物细胞转座质粒，所述插入片段包括FRT-LacZeo片段。

优选的，所述FRT-LacZeo片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

优选的，所述哺乳动物细胞转座质粒为PB713B。

优选的，所述重组质粒载体的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明提供了一种抗体展示细胞系，所述抗体展示细胞系通过在原始细胞中转染所述的重组质粒载体获得。

优选的，所述原始细胞包括K562细胞。

本发明还提供了所述抗体展示细胞系的制备方法，包括以下步骤：

1)将所述的重组质粒载体和表达转座酶的质粒共转染原始细胞获得待筛选细胞系；

2)向所述待筛选细胞系中添加嘌呤毒素进行筛选获得稳定表达细胞系；

3)将所述稳定表达细胞系单克隆化后，筛选仅整合一个重组质粒载体的单克隆细胞系获得抗体展示细胞系获得抗体展示细胞系。

优选的，所述表达转座酶的质粒为Super PB。

优选的，步骤2)中当所述待筛选细胞系的细胞密度为(2～4)×10⁵/ml时，所述嘌呤毒素的终浓度为4～6μg/ml；所述筛选的时间为7～10d。

本发明提供了所述的重组质粒载体、所述的抗体展示细胞系在抗体筛选中的应用。

本发明的有益效果：本发明提供的质粒载体通过将FRT-LacZeo片段克隆到哺乳动物细胞转座质粒中获得，本发明借助转座子技术，利用转座酶把所需的基因转入基因组，基因敲入的效率更高；在进行进一步的药物筛选中，带有抗性基因的细胞多，总体活力好，能够更快的进入细胞单克隆阶段；在单克隆挑选阶段由于编辑后的细胞比例高，因此更容易筛选到带有单个整合位点的宿主细胞。

本发明实施例中制备获得的K562-PB-FRT-39mono细胞，HA标签表达量提高到了87.2％，4D5抗体表达量提高到了53.5％。本发明提供的K562-PB-FRT-39-4D5-PDGFR细胞可以成功展示4D5抗体并表达HA标签；经过对比，本发明提供的重组质粒载体在K562细胞中的整合效率较高，并且每个单克隆细胞系均表达β-半乳糖苷酶；而作为对照的pFRT/LacZeo质粒在K562细胞中的整合效率普遍较低，β-半乳糖苷酶的表达量也低。

附图说明

图1为本发明提供的重组质粒载体的图谱；

图2为单克隆细胞的单点整合效率(Lac基因)的qPCR检测结果，对应表格数据见表1；

图3为单克隆细胞表达β-半乳糖苷酶的检测结果；

图4为mScarlet in pcDNA5-FRT质粒图谱；

图5为mtagBFP2 in pcDNA5-FRT质粒图谱；

图6为K562-PB-FRT单克隆细胞转染48h后mScarlet和mTag BFP2的表达效率；

图7为K562-PB-FRT单克隆细胞转染15d后mScarlet和mTag BFP2的表达效率；

图8为K562-PB-FRT-39-4D5-PDGFR细胞单链抗体(4D5)表达效率的检测结果；

图9为K562-PB-FRT-39-4D5-PDGFR细胞HA表达效率的检测结果；

图10为对比例筛选过程单克隆细胞的单点整合效率(Lac)的qPCR检测结果，对应表格数据见表2；

图11为对比例筛选过程中单克隆细胞表达β-半乳糖苷酶的检测结果。

具体实施方式

本发明提供了一种重组质粒载体，包括初始质粒载体和插入片段，所述初始质粒载体为哺乳动物细胞转座质粒，所述插入片段包括FRT-LacZeo片段。在本发明中，所述FRT-LacZeo片段的核苷酸序列优选的如SEQ ID No.1所示，所述FRT-LacZeo片段的两端优选的分别连接有SpeI和EcoNI酶切位点(加粗部分)；具体序列如下：

actagtggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggctaccatggagaagttactattccgaagttcctattctctagaaagtataggaacttcaagcttggcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgctttgcctggtttccggcaccagaagcggtgccggaaagctggctggagtgcgatcttcctgaggccgatactgtcgtcgtcccctcaaactggcagatgcacggttacgatgcgcccatctacaccaacgtgacctatcccattacggtcaatccgccgtttgttcccacggagaatccgacgggttgttactcgctcacatttaatgttgatgaaagctggctacaggaaggccagacgcgaattatttttgatggcgttaactcggcgtttcatctgtggtgcaacgggcgctgggtcggttacggccaggacagtcgtttgccgtctgaatttgacctgagcgcatttttacgcgccggagaaaaccgcctcgcggtgatggtgctgcgctggagtgacggcagttatctggaagatcaggatatgtggcggatgagcggcattttccgtgacgtctcgttgctgcataaaccgactacacaaatcagcgatttccatgttgccactcgctttaatgatgatttcagccgcgctgtactggaggctgaagttcagatgtgcggcgagttgcgtgactacctacgggtaacagtttctttatggcagggtgaaacgcaggtcgccagcggcaccgcgcctttcggcggtgaaattatcgatgagcgtggtggttatgccgatcgcgtcacactacgtctgaacgtcgaaaacccgaaactgtggagcgccgaaatcccgaatctctatcgtgcggtggttgaactgcacaccgccgacggcacgctgattgaagcagaagcctgcgatgtcggtttccgcgaggtgcggattgaaaatggtctgctgctgctgaacggcaagccgttgctgattcgaggcgttaaccgtcacgagcatcatcctctgcatggtcaggtcatggatgagcagacgatggtgcaggatatcctgctgatgaagcagaacaactttaacgccgtgcgctgttcgcattatccgaaccatccgctgtggtacacgctgtgcgaccgctacggcctgtatgtggtggatgaagccaatattgaaacccacggcatggtgccaatgaatcgtctgaccgatgatccgcgctggctaccggcgatgagcgaacgcgtaacgcgaatggtgcagcgcgatcgtaatcacccgagtgtgatcatctggtcgctggggaatgaatcaggccacggcgctaatcacgacgcgctgtatcgctggatcaaatctgtcgatccttcccgcccggtgcagtatgaaggcggcggagccgacaccacggccaccgatattatttgcccgatgtacgcgcgcgtggatgaagaccagcccttcccggctgtgccgaaatggtccatcaaaaaatggctttcgctacctggagagacgcgcccgctgatcctttgcgaatacgcccacgcgatgggtaacagtcttggcggtttcgctaaatactggcaggcgtttcgtcagtatccccgtttacagggcggcttcgtctgggactgggtggatcagtcgctgattaaatatgatgaaaacggcaacccgtggtcggcttacggcggtgattttggcgatacgccgaacgatcgccagttctgtatgaacggtctggtctttgccgaccgcacgccgcatccagcgctgacggaagcaaaacaccagcagcagtttttccagttccgtttatccgggcaaaccatcgaagtgaccagcgaatacctgttccgtcatagcgataacgagctcctgcactggatggtggcgctggatggtaagccgctggcaagcggtgaagtgcctctggatgtcgctccacaaggtaaacagttgattgaactgcctgaactaccgcagccggagagcgccgggcaactctggctcacagtacgcgtagtgcaaccgaacgcgaccgcatggtcagaagccggccacatcagcgcctggcagcagtggcgtctggcggaaaacctcagtgtgacgctccccgccgcgtcccacgccatcccgcatctgaccaccagcgaaatggatttttgcatcgagctgggtaataagcgttggcaatttaaccgccagtcaggctttctttcacagatgtggattggcgataaaaaacaactgctgacgccgctgcgcgatcagttcacccgtgcaccgctggataacgacattggcgtaagtgaagcgacccgcattgaccctaacgcctgggtcgaacgctggaaggcggcgggccattaccaggccgaagcagcgttgttgcagtgcacggcagatacacttgctgacgcggtgctgattacgaccgctcacgcgtggcagcatcaggggaaaaccttatttatcagccggaaaacctaccggattgatggtagtggtcaaatggcgattaccgttgatgttgaagtggcgagcgatacaccgcatccggcgcggattggcctgaactgccagctggcgcaggtagcagagcgggtaaactggctcggattagggccgcaagaaaactatcccgaccgccttactgccgcctgttttgaccgctgggatctgccattgtcagacatgtataccccgtacgtcttcccgagcgaaaacggtctgcgctgcgggacgcgcgaattgaattatggcccacaccagtggcgcggcgacttccagttcaacatcagccgctacagtcaacagcaactgatggaaaccagccatcgccatctgctgcacgcggaagaaggcacatggctgaatatcgacggtttccatatggggattggtggagacgactcctggagcccgtcagtatcggcggaattacagctgagcgccggtcgctaccattaccagttggtctggtgtcaaaaagcgctttcgaaagatcccaacgaaaagcgtgaccacatggtccttcttgagtttgtaactgctgctgggattacacatggcatggatgccaagttgaccagtgccgttccggtgctcaccgcgcgcgacgtcgccggagcggtcgagttctggaccgaccggctcgggttctcccgggacttcgtggaggacgacttcgccggtgtggtccgggacgacgtgaccctgttcatcagcgcggtccaggaccaggtggtgccggacaacaccctggcctgggtgtgggtgcgcggcctggacgagctgtacgccgagtggtcggaggtcgtgtccacgaacttccgggacgcctccgggccggccatgaccgagatcggcgagcagccgtgggggcgggagttcgccctgcgcgacccggccggcaactgcgtgcacttcgtggccgaggagcaggactgacacccgagcgaaaacggtctgcgctgcgggacgcgcgaattgaattatggcccacaccagtggcgcggcgacttccagttcaacatcagccgctacagtcaacagcaactgatggaaaccagccatcgccatctgctgcacgcggaagaaggcacatggctgaatatcgacggtttccatatggggattggtggcgacgactcctggagcccgtcagtatcggcggaattccagctgagcgccggtcgctaccattaccagttggtctggtgtcaaaaataataataaccgggcaggggggatctgcatggatctttgtgaaggaaccttacttctgtggtgtgacataattggacaaactacctacagagatttaaagctctaaggtaaatataaaatttttaagtgtataatgtgttaaactactgattctaattgtttgtgtattttagattccaacctatggaactgatgaatgggagcagtggtggaatgcctttaatgaggaaaacctgttttgctcagaagaaatgccatctagtgatgatgaggctactgctgactctcaacattctactcctccaaaaaagaagagaaaggtagaagaccccaaggactttccttcagaattgctaagttttttgagtcatgctgtgtttagtaatagaactcttgcttgctttgctatttacaccacaaaggaaaaagctgcactgctatacaagaaaattatggaaaaatattctgtaacctttataagtaggcataacagttataatcataacatactgttttttcttactccacacaggcatagagtgtctgctattaataactatgctcaaaaattgtgtacctttagctttttaatttgtaaaggggttaataaggaatatttgatgtatagtgccttgactagagatcataatcagccataccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaaacataaaatgaatgcaattgttgttgttaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctag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在本发明中，所述哺乳动物细胞转座质粒优选为PB713B；所述PB713B优选的购自SBI公司。PiggyBac(PB)转座子来源于鳞翅目昆虫，最初是在研究杆状病毒(Baculovirus)侵袭粉纹夜蛾细胞系TN-368时首次发现并分离获得[Cary LC,et al.(1989)Transposonmutagenesis ofbaculoviruses:Analysis ofTrichoplusiani transposon IFP2insertions within the FP-locus of nuclear polyhedrosis viruses.Virology 172(1):156–169]。在分类上，PB属于真核生物的第二类转座子，是一个自主因子，长2476bp，有短的末端反向重复序列(ITR)和一个开放编码框(ORF)，ITR长13bp，ORF长2.1kb。PB转座子主要采取“cut-paste”机制发生转座。本发明利用PB转座子制备重组质粒载体，能够解决单点整合FRT基因的抗体展示细胞制备困难的问题。

在本发明中，所述重组质粒载体的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述重组质粒载体包括5’端同源臂序列(SEQ ID No.3所示)、SV40启动子序列(SEQ ID No.4所示)、FRT重组位点(SEQ IDNo.5所示)、β半乳糖苷酶基因(SEQ ID No.6所示)、博莱霉素抗性基因(SEQID No.7所示)、3’端同源臂(SEQ ID No.8所示)和氨苄青霉素抗性基因(SEQ ID No.9所示)；具体如下：

ccctagaaagataatcatattgtgacgtacgttaaagataatcatgtgtaaaattgacgcatgtgttttat(SEQ ID No.3)；

ggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggc(SEQ ID No.4所示)；

gaagttactattccgaagttcctattctctagaaagtataggaacttc(SEQ ID No.5所示)；gccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgctttgcctggtttccggcaccagaagcggtgccggaaagctggctggagtgcgatcttcctgaggccgatactgtcgtcgtcccctcaaactggcagatgcacggttacgatgcgcccatctacaccaacgtgacctatcccattacggtcaatccgccgtttgttcccacggagaatccgacgggttgttactcgctcacatttaatgttgatgaaagctggctacaggaaggccagacgcgaattatttttgatggcgttaactcggcgtttcatctgtggtgcaacgggcgctgggtcggttacggccaggacagtcgtttgccgtctgaatttgacctgagcgcatttttacgcgccggagaaaaccgcctcgcggtgatggtgctgcgctggagtgacggcagttatctggaagatcaggatatgtggcggatgagcggcattttccgtgacgtctcgttgctgcataaaccgactacacaaatcagcgatttccatgttgccactcgctttaatgatgatttcagccgcgctgtactggaggctgaagttcagatgtgcggcgagttgcgtgactacctacgggtaacagtttctttatggcagggtgaaacgcaggtcgccagcggcaccgcgcctttcggcggtgaaattatcgatgagcgtggtggttatgccgatcgcgtcacactacgtctgaacgtcgaaaacccgaaactgtggagcgccgaaatcccgaatctctatcgtgcggtggttgaactgcacaccgccgacggcacgctgattgaagcagaagcctgcgatgtcggtttccgcgaggtgcggattgaaaatggtctgctgctgctgaacggcaagccgttgctgattcgaggcgttaaccgtcacgagcatcatcctctgcatggtcaggtcatggatgagcagacgatggtgcaggatatcctgctgatgaagcagaacaactttaacgccgtgcgctgttcgcattatccgaaccatccgctgtggtacacgctgtgcgaccgctacggcctgtatgtggtggatgaagccaatattgaaacccacggcatggtgccaatgaatcgtctgaccgatgatccgcgctggctaccggcgatgagcgaacgcgtaacgcgaatggtgcagcgcgatcgtaatcacccgagtgtgatcatctggtcgctggggaatgaatcaggccacggcgctaatcacgacgcgctgtatcgctggatcaaatctgtcgatccttcccgcccggtgcagtatgaaggcggcggagccgacaccacggccaccgatattatttgcccgatgtacgcgcgcgtggatgaagaccagcccttcccggctgtgccgaaatggtccatcaaaaaatggctttcgctacctggagagacgcgcccgctgatcctttgcgaatacgcccacgcgatgggtaacagtcttggcggtttcgctaaatactggcaggcgtttcgtcagtatccccgtttacagggcggcttcgtctgggactgggtggatcagtcgctgattaaatatgatgaaaacggcaacccgtggtcggcttacggcggtgattttggcgatacgccgaacgatcgccagttctgtatgaacggtctggtctttgccgaccgcacgccgcatccagcgctgacggaagcaaaacaccagcagcagtttttccagttccgtttatccgggcaaaccatcgaagtgaccagcgaatacctgttccgtcatagcgataacgagctcctgcactggatggtggcgctggatggtaagccgctggcaagcggtgaagtgcctctggatgtcgctccacaaggtaaacagttgattgaactgcctgaactaccgcagccggagagcgccgggcaactctggctcacagtacgcgtagtgcaaccgaacgcgaccgcatggtcagaagccggccacatcagcgcctggcagcagtggcgtctggcggaaaacctcagtgtgacgctccccgccgcgtcccacgccatcccgcatctgaccaccagcgaaatggatttttgcatcgagctgggtaataagcgttggcaatttaaccgccagtcaggctttctttcacagatgtggattggcgataaaaaacaactgctgacgccgctgcgcgatcagttcacccgtgcaccgctggataacgacattggcgtaagtgaagcgacccgcattgaccctaacgcctgggtcgaacgctggaaggcggcgggccattaccaggccgaagcagcgttgttgcagtgcacggcagatacacttgctgacgcggtgctgattacgaccgctcacgcgtggcagcatcaggggaaaaccttatttatcagccggaaaacctaccggattgatggtagtggtcaaatggcgattaccgttgatgttgaagtggcgagcgatacaccgcatccggcgcggattggcctgaactgccagctggcgcaggtagcagagcgggtaaactggctcggattagggccgcaagaaaactatcccgaccgccttactgccgcctgttttgaccgctgggatctgccattgtcagacatgtataccccgtacgtcttcccgagcgaaaacggtctgcgctgcgggacgcgcgaattgaattatggcccacaccagtggcgcggcgacttccagttcaacatcagccgctacagtcaacagcaactgatggaaaccagccatcgccatctgctgcacgcggaagaaggcacatggctgaatatcgacggtttccatatggggattggtggagacgactcctggagcccgtcagtatcggcggaattacagctgagcgccggtcgctaccattaccagttggtctggtgtcaaaaa(SEQ ID No.6)；

atggatgccaagttgaccagtgccgttccggtgctcaccgcgcgcgacgtcgccggagcggtcgagttctggaccgaccggctcgggttctcccgggacttcgtggaggacgacttcgccggtgtggtccgggacgacgtgaccctgttcatcagcgcggtccaggaccaggtggtgccggacaacaccctggcctgggtgtgggtgcgcggcctggacgagctgtacgccgagtggtcggaggtcgtgtccacgaacttccgggacgcctccgggccggccatgaccgagatcggcgagcagccgtgggggcgggagttcgccctgcgcgacccggccggcaactgcgtgcacttcgtggccgaggagcaggactga(SEQ ID No.7所示)；

catgcgtcaattttacgcagactatctttctaggg(SEQ ID No.8所示)；

ccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcat(SEQ IDNo.9所示)。

本发明对所述重组质粒载体的制备方法没有特殊限定，采用本领域常规重组质粒载体的制备方法即可，在本发明具体实施过程中，所述FRT-LacZeo片段优选的通过人工合成获得，委托生物技术公司进行。本发明将所述FRT-LacZeo片段与质粒PB713B分别进行双酶切后、连接获得所述重组质粒载体。在本发明中，所述双酶切用酶优选为SpeI酶和EcoNI酶。在本发明中，所述连接优选的采用T4 DNA连接酶进行，所述T4 DNA连接酶优选的购自Neb公司，具体的连接操作参见T4 DNA连接酶的使用说明书进行。本发明中，所述制备获得的重组质粒载体命名为PB-FRT-LacZeo；本发明在获得所述重组质粒载体PB-FRT-LacZeo后，优选的将所述重组质粒载体PB-FRT-LacZeo导入Stbl3感受态细胞(Thermofisher品牌)中进行扩繁后提取，所述提取优选的通过无内毒素大提试剂盒(购自Qiagen公司)进行，具体步骤参见试剂盒说明书。本发明在获得所述重组质粒载体PB-FRT-LacZeo后，优选的对其进行冷藏保存。

本发明还提供了一种抗体展示细胞系，所述抗体展示细胞系通过在原始细胞中转染所述的重组质粒载体获得。在本发明中，所述原始细胞优选的包括K562细胞。

本发明还提供了所述抗体展示细胞系的制备方法，包括以下步骤：1)将所述的重组质粒载体和表达转座酶的质粒共转染原始细胞获得待筛选细胞系；2)向所述待筛选细胞系中添加嘌呤毒素进行筛选获得稳定表达细胞系；3)将所述稳定表达细胞系单克隆化后，筛选仅整合一个重组质粒载体的单克隆细胞系获得抗体展示细胞系。

在本发明中，将所述的重组质粒载体和表达转座酶的质粒共转染原始细胞获得待筛选细胞系；表达转座酶的质粒优选为Super PB；所述Super PB优选为购自SBI公司的PB200PA-1。在本发明中，所述原始细胞优选为K562细胞；所述K562细胞的密度优选为8.0～8.5×10⁴个/μl，更优选为8.33×10⁴个/μl；所述K562细胞优选的以上述密度置于无血清1640培养基中。在本发明中，将所述重组质粒载体、表达转座酶的质粒与上述K562细胞混合获得电转化体系后，进行电转染。在本发明中，所述重组质粒载体和表达转座酶的质粒的质量比优选为7：(2.5～3)，更优选为7：2.8；在本发明中，每120μl的K562细胞优选的与7μg所述重组质粒载体混合。在本发明中，所述电转化的参数优选如下：电压560V，时间30ms。本发明在所述电转化后，优选的用IMDM完全培养基重悬所述电转化体系，然后进行培养，所述培养的温度优选为36～38℃，更优选为37℃；所述培养的CO₂浓度优选为5％(v/v)；所述培养的时间优选为45～50h，更优选为48h。

本发明在获得所述待筛选细胞系后，向所述待筛选细胞系中添加嘌呤毒素进行筛选获得稳定表达细胞系。在本发明中，所述待筛选细胞系的细胞密度优选为(2～4)×10⁵/ml，更优选为3×10⁵/ml；在本发明具体实施过程中，优选的将上述培养的待筛选细胞离心收集后，用IMDM完全培养基重悬至限定的细胞密度；所述离心的离心力优选为350～450g，更优选为400g；所述离心的时间优选为4～6min，更优选为5min。在本发明中，当所述待筛选细胞系的细胞密度为(2～4)×10⁵/ml时，所述嘌呤毒素的终浓度优选为4～6μg/ml；更优选的5μg/ml。在本发明中，所述筛选的时间优选为7～10d；本发明在所述筛选的过程中优选的间隔48h传代一次。在本发明中，所述嘌呤毒素的作用是筛选能够稳定表达所述重组质粒载体的细胞，当筛选7～10d后，仍能存活并表达所述重组质粒载体的细胞视为稳定表达细胞系。

本发明在获得所述稳定表达细胞系后，将所述稳定表达细胞系单克隆化、筛选仅整合一个重组质粒载体的单克隆细胞系获得抗体展示细胞系。在本发明中，所述单克隆化优选的通过索尼流式分选仪(SH800)实现，具体操作参见说明书。在本发明中，从所述单克隆细胞系中筛选仅整合一个重组质粒载体的单克隆细胞系优选的通过以下方法实现：提取所述单克隆细胞的基因组DNA，检测所述单克隆细胞系中Lac基因在基因组中的数量，挑选Lac基因插入数量相对较少的单克隆细胞为抗体展示细胞系。在本发明中，所述Lac基因插入数量优选的以RQ值表示，所述Lac基因在基因组中的数量优选的委托生物技术公司进行检测；优选的当所述单克隆细胞Lac基因相对拷贝数RQ≤0.5时，认为是仅整合一个重组质粒。

本发明还提供了所述的重组质粒载体、所述的抗体展示细胞系在抗体筛选中的应用。在本发明中，将抗体库质粒转入所述抗体展示细胞系中进行表达筛选；本发明对所述抗体库质粒的种类没有特殊限定，任意抗体库质粒均可，尤其适用于可通过FRT位点进行整合的抗体库质粒。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

基于K562细胞构建K562-PB-PFRT抗体展示细胞系

实验材料

1.细胞：K562细胞

2.培养基：IMDM完全培养基、1640完全培养基

3.质粒：PB-FRT-LacZeo质粒

4.试剂：Galacto-Star^TMSystem试剂盒(购自Applied Biosystems公司，货号：BM300S)

实验方法

双质粒共转：

取1×10⁷个的K562细胞，400g离心5min后弃上清，用120μl的无血清1640培养基重悬K562细胞，加入7μg PB-FRT-LacZeo质粒和2.8μg Super PB(PB200PA-1，购自SBI公司)，充分混匀后将其转移到120μl电击管中，避免产生气泡。设置电转参数为：560V、30ms，电转结束后立即用5ml的IMDM完全培养基重悬电击管里的细胞，然后加入到T25培养瓶中培养获得K562-PB-FRT-LacZeo细胞，培养条件为：37℃，5％CO₂。

药物筛选：

培养48h后，将K562-PB-FRT-LacZeo细胞400g离心5min收集细胞沉淀，用5ml的新鲜的IMDM完全培养基重悬K562-PB-FRT-LacZeo细胞沉淀，取20μl细胞悬液用细胞计数仪计数，然后补加新鲜的IMDM完全培养基调整其细胞密度为3×10⁵个/ml，用5μg/ml的嘌呤霉素对其进行药物筛选，间隔48h传代一次。药物筛选一周以上备用。

单克隆化：

准备10块圆底96孔板，将新鲜的IMDM完全培养基按照150μl/孔的体积加入到圆底96孔板，然后取5×10⁶个K562-PB-FRT-LacZeo细胞通过索尼流式分选仪(SH800)，参考仪器说明书制备10块96孔板单克隆细胞。

单克隆细胞在含5％CO₂的37℃培养箱培养，第4天按照100μl/孔的体积给单克隆补加新鲜的IMDM完全培养基。第7天单克隆换液，每孔先弃去100μl的培养基再加入100μl新鲜的IMDM完全培养基。第十天将在显微镜下观察到的单克隆细胞转移到24孔板进行培养。此后逐步扩大，准备进行细胞株的筛选。

分子生物学鉴定：

单克隆细胞扩大培养后，每个单克隆各取3×10⁶个细胞提取基因组(采用QIAGEN品牌的QIAamp DNA Mini Kit参考说明书制备)将获得的基因组送鼎成肽源生物技术有限公司进行基因整合率检测。计算Lac基因在基因组中的数量，以RQ值表示，选出5个Lac基因插入数量最少的细胞。

插入基因的功能验证：

由于展示细胞构建载体PB-FRT-LacZeo含有β-半乳糖苷酶标签。因此5个单克隆细胞各取1×10⁶个的细胞，使用Galacto-StarTM System试剂盒，参考说明书方法检测其β-半乳糖苷酶的表达，选择有半乳糖苷酶活力的细胞系。

实验结果：

筛选获得的K562-PB-FRT单克隆细胞分别为第39、58、76、86、105次挑选的产物，因此命名为K562-PB-FRT-LacZeo-86mono、K562-PB-FRT-LacZeo-76mono、K562-PB-FRT-LacZeo-105mono、K562-PB-FRT-LacZeo-58mono、K562-PB-FRT-LacZeo-39mono。

如图2所示，K562-PB-FRT-LacZeo单克隆细胞的qPCR检测结果显示：5个单克隆细胞PB-FRT-LacZeo质粒单点整合率由高到低依次为K562-PB-FRT-LacZeo-86mono、K562-PB-FRT-LacZeo-76mono、K562-PB-FRT-LacZeo-105mono、K562-PB-FRT-LacZeo-58mono、K562-PB-FRT-LacZeo-39mono。

表1 K562-PB-FRT-LacZeo单克隆细胞的qPCR检测结果数据

检测K562-PB-FRT-LacZeo的5个单克隆细胞的β-半乳糖苷酶表达结果(图3)表明：与K562对照组相比，以上5个单克隆均可表达β-半乳糖苷酶。由于与一对等位基因的内参基因比较，K562-PB-FRT-LacZeo-86mono单克隆细胞Lac基因相对拷贝数RQ高于0.5，且β-半乳糖苷酶表达量为最高，因此认为K562-PB-FRT-LacZeo-86mono克隆是单点整合细胞的可能性最低，予以淘汰。

进而，保留余下4个K562-PB-FRT-LacZeo：K562-PB-FRT-LacZeo-39mono、K562-PB-FRT-LacZeo-58mono、K562-PB-FRT-LacZeo-76mono、K562-PB-FRT-LacZeo-105mono四个单克隆细胞系，进行单个FRT整合位点的功能鉴定。

实施例2

利用K562-PB-FRT宿主细胞展示双荧光蛋白质粒混合库。

实验材料

1.细胞：

K562-PB-FRT-39mono、K562-PB-FRT-58mono、K562-PB-FRT-76mono、K562-PB-FRT-105mono

2.质粒：

采用全基因合成技术，合成红色荧光蛋白mScarlet和蓝色荧光蛋白mtagBFP2基因分别通过上游NheI和下游NotI构建到pcDNA5-FRT(购自赛默飞生物科技有限公司)，并进行无内毒素的大提制备(委托金唯智生物科技有限公司完成)。得到mScarlet in pcDNA5-FRT和mtagBFP2 in pcDNA5-FRT

mScarlet(带红色荧光，SEQ ID No.10)

atggtgagcaaaggcgaggccgtgatcaaggagttcatgaggttcaaggtgcacatggagggcagcatgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgaaggcagaccctatgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgacaaagggcggccctctgcccttcagctgggatattctgtccccccagttcatgtacggcagcagagccttcaccaagcaccccgccgacatccccgactactataagcagagcttccccgagggctttaagtgggagagggtgatgaacttcgaggatggaggcgccgtgaccgtgacccaagacacatctctggaggacggcacactgatctacaaggtgaagctgaggggcaccaactttcctcccgacggccccgtgatgcagaagaagaccatgggctgggaggcttccaccgagagactgtaccccgaggacggcgtgctgaagggcgacattaagatggctctgagactgaaggacggcggaagatacctcgccgacttcaagaccacctacaaggccaagaagcccgtgcagatgcccggcgcctacaacgtggatagaaagctggacatcacatcccacaacgaggattacaccgtcgtggagcagtacgagagatccgagggcagacactccaccggcggcatggatgaactgtacaagtga

mtagBFP2(带蓝色荧光，SEQ ID No.11)

atggtgagcaaaggcgaggagctgatcaaggagaacatgcacatgaagctgtacatggagggcaccgtcgacaaccaccacttcaagtgcacaagcgagggcgagggcaagccctacgaaggcacccagaccatgagaatcaaggtggtggagggaggccctctgcctttcgctttcgacattctggccacaagctttctgtacggcagcaagaccttcatcaaccacacacaaggcatccccgacttctttaagcagtccttccccgagggcttcacatgggagagggtgaccacctatgaggatggcggcgtgctgaccgccacacaagacacctctctgcaagacggctgtctgatctacaacgtgaagattagaggcgtgaacttcaccagcaacggacccgtgatgcagaagaagacactgggctgggaggccttcaccgagacactgtaccccgccgacggaggactggaaggaagaaatgacatggccctcaagctggtgggcggcagccatctgatcgccaacgccaagaccacctatagatccaagaagcccgccaagaatctgaagatgcccggcgtgtactacgtggactatagactggagagaatcaaggaggccaacaacgagacctacgtggagcagcatgaggtggccgtggccagatactgcgatctgccctccaagctgggccataagctgaattga

3.培养基：

IMDM培养基、1640培养基

实验方法：

1.将实例1中获得的4个K562-PB-FRT单克隆细胞扩增培养至细胞数大于1×10⁷时，每个单克隆细胞各取1×10⁷细胞数400g离心5min收集细胞沉淀，然后分别加入5ml1640培养基(无FBS、无双抗)清洗一遍细胞，去除残留血清。

2.用120μl的1640培养基(无FBS、无双抗)分别重悬每个单克隆细胞，每个单克隆细胞均加入2.2μg的mScarlet in pcDNA5-FRT质粒、4.4μg的mtagBFP2 in pcDNA5-FRT质粒和13.3μg的pOG44质粒(Thermofisher品牌辅助质粒，货号V600520表达Flp重组酶。mScarlet：mTag BFP2：pOG44三种质粒质量比为1：2：6，设置电转参数为：560V、30ms，电转结束后立即用5ml的IMDM完全培养基重悬电击后的细胞后加入到T25培养瓶中培养，培养条件为：37℃，5％CO₂。

3.电转48h后，每个克隆细胞各取1×10⁶个细胞400g离心5min后弃上清，再用300μl的PBS重悬细胞后将其转移到对应标记的流式管内，通过BD LSRFortessa流式分析仪检测mScarlet和mTag BFP2的表达效率。剩余的细胞补加适量体积新鲜的IMDM完全培养基调整其细胞培养密度为3×10⁵/ml，用100μg/ml的潮霉素对其进行药物筛选，间隔48h传代一次。细胞传代时根据细胞状态缓慢增加潮霉素的作用浓度至500μg/ml。

4.药物筛选15天后，每个克隆细胞各取1×10⁶细胞数400g离心5min后弃上清，用300μl的PBS重悬细胞后将其转移到对应标记的流式管内，再次通过BD LSRFortessa流式分析仪检测mScarlet和mTagBFP2的表达效率。

如图6所示：K562-PB-FRT-39mono、K562-PB-FRT-58mono、K562-PB-FRT-76mono、K562-PB-FRT-105mono等4个单克隆细胞电转mScarlet in pcDNA5-FRT和mtagBFP2 inpcDNA5-FRT质粒48h后，均可以有效的表达mScarlet和mTag BFP2。流式细胞术图表现为两种荧光蛋白同时表达，为瞬时转染后两种质粒同时进入细胞的标志。

经过潮霉素药物筛选15天后，细胞中质粒已消耗殆尽，宿主细胞仅表达由pcDNA5-FRT引入的基因。如果宿主细胞只有一个FRT整合位点，则只能在流式细胞术上表现为单阳性群。也就是说只有蓝色荧光或者红色荧光，而双阳性区域(右上象限)应无明显细胞群。

潮霉素药物筛选15天后的细胞流式结果如图7所示，4个单克隆细胞均出现了明显的分群，其中K562-PB-FRT-39mono细胞分群效果最佳。K562-PB-FRT-58mono、K562-PB-FRT-76mono、K562-PB-FRT-105mono三个单克隆在双阳区有极少数细胞存在，可以证明以上4个单克隆细胞均成功具备了Flp-In整合系统，且只存在单个FRT整合位点。

实施例3

基于K562-PB-FRT-LacZeo-39单克隆细胞构建4D5-PDGFR抗体文库。

实验材料

1.细胞：

K562-PB-FRT-39mono细胞

2.培养基：

IMDM完全培养基

3.质粒：

pOG44(购自Thermofisher)、4D5-PDGFR in pcDNA5-FRT

4D5-PDGFR in pcDNA5-FRT构建方法为：

采用全基因合成技术，合成针对人类表皮生长因子受体2(HER2)的单链抗体4D5基因，融合血小板衍生生长因子受体(platelet-derived growth factor receptor，PDGFR)的跨膜区。分别通过上游NheI和下游PmeI构建到pcDNA5-FRT(购自赛默飞生物科技有限公司)，并进行无内毒素的大提制备(委托金唯智生物科技有限公司完成)。4D5-PDGFR inpcDNA5-FRT的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；其中NheI的酶切位点如SEQ ID No.13所示，4D5基因的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；PDGFR跨膜区的核苷酸序列如SEQ IDNo.15所示；PmeI的酶切位点如SEQ ID No.16所示。

Gctagctccaccatggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgactatccatatgatgttccagattatgctgaacaaaaactcatctcagaagaggatctgggggcccaggcggccgatatccagatgacccagtccccgagctccctgtccgcctctgtgggcgatagggtcaccatcacctgccgtgccagtcaggatgtgaatactgctgtagcctggtatcaacagaaaccaggaaaagctccgaaactactgatttactcggcatccttcctttattctggagtcccttctcgcttctctggatctagatctgggacggatttcactctgaccatcagcagtctgcagccggaagacttcgcaacttattactgtcagcaacattatactactcctcccacgttcggacagggtaccaaggtggagatcaaacgcactggctccactagcggttccggcaaacctggcagcggagaaggcagcaccaaaggggaggttcagctggtggagtctggcggtggcctggtgcagccagggggctcactccgtttgtcctgtgcagcttctggcttcaacattaaagacacctatatacactgggtgcgtcaggccccgggtaagggcctggaatgggttgcaaggatttatcctacgaatggttatactagatatgccgatagcgtcaagggccgtttcactataagcgcagacacatccaaaaacacagcctacctgcagatgaacagcctgcgtgctgaggacactgccgtctattattgttctagatggggaggggacggcttctatgctatggacgtgtggggtcaaggaaccctggtcaccgtctcctcgggccaggccggccagaatgctgtgggccaggacacgcaggaggtcatcgtggtgccacactccttgccctttaaggtggtggtgatctcagccatcctggccctggtggtgctcaccatcatctcccttatcatcctcatcatgctttggcagaagaagccacgttaggggcccgtttaaac(SEQ ID No.12)。

4.流式抗体：

Biotin-HER2蛋白(购自ARCO公司)

Brilliant Violet421^TM Streptavidin(购自Biolegend公司)

Brilliant Violet421^TMHA(购自Biolegend公司)

实验方法

1.取1×10⁸的K562-PB-FRT-39mono细胞400g离心5min收集细胞沉淀，然后加入5ml 1640培养基(无FBS、无双抗)清洗一遍细胞，去除残留血清。

2.用1.20ml的1640培养基(无FBS、无双抗)重悬单克隆细胞，加入40μg的4D5-PDGFR质粒和160μg的pOG44质粒(4D5-PDGFR：pOG44＝1:4)，待细胞与质粒充分混匀后，将其转移到两个600μl电击管中，设置电转参数为：560V、30ms。电击前后分别冰浴5min。冰浴结束后立即用50ml的IMDM完全培养基重悬电击后的细胞后加入到T75培养瓶中培养，培养条件为：37℃，5％CO₂。

3.电转48h后，分别取2×10⁶的K562-PB-FRT-39-4D5-PDGFR细胞和K562-PB-FRT-39细胞，400g离心5min后弃上清，各自加入1ml的PBS清洗一遍细胞，并将每种细胞平均分成两份，分别标记为①K562-PB-FRT-39HA Control、②K562-PB-FRT-39-4D5-PDGFR HA、③K562-PB-FRT-39 HER2Control、④K562-PB-FRT-39-4D5-PDGFR HER2。在④号管中加入1μg的Biotin-HER2蛋白，混匀后室温孵育40min，然后加入1ml的PBS清洗一次。40min后在①号管和②号管中分别加入3μl的HA流式抗体，在③号管和④号管中分别加入3μl的BrilliantViolet421^TMStreptavidin，轻弹混匀后室温避光染色30min。染色结束后每个流式管中各加入1ml的PBS清洗一遍细胞去除抗体残留，再用300μl的PBS重悬细胞，通过BD LSRFortessa流式分析仪检测K562-PB-FRT-39-4D5-PDGFR细胞HA标签和4D5抗体的表达效率。剩余的细胞补加新鲜的IMDM完全培养基调整其细胞培养密度为3×10⁵/ml，用100μg/ml的潮霉素对其进行药物筛选，间隔48h传代一次。细胞传代时根据细胞状态缓慢增加潮霉素的作用浓度至500μg/ml。

4.药物筛选10天后，将K562-PB-FRT-39-4D5-PDGFR细胞和K562-PB-FRT-39细胞再次分别取2×10⁶的细胞数，与上一步同样的流式方法染色后，再次利用BD LSRFortessa流式分析仪检测K562-PB-FRT-39-4D5-PDGFR抗体库细胞HA标签和4D5抗体的表达效率。

如图8和9所示，K562-PB-FRT-39mono细胞在转染4D5-PDGFR质粒48h后HA标签表达效率仅为3.23％，4D5抗体的表达效率仅为11.3％。经过潮霉素药物筛选10天后，其HA标签和4D5抗体的表达量明显增加，HA标签表达量提高到了87.2％，4D5抗体表达量提高到了53.5％。结果表明：K562-PB-FRT-39-4D5-PDGFR细胞具备潮霉素抗性，因此4D5-PDGFR质粒结构已经整合入K562-PB-FRT-39细胞基因组。K562-PB-FRT-39-4D5-PDGFR细胞可以通过流式细胞术方法通过抗原直接检出4D5抗体和并表达HA标签，证明K562-PB-FRT-39宿主细胞具有展示抗性蛋白于细胞表面的能力。

对比例

比较PFRT和PB-FRT两种构建方法的整合效率。

实验材料

1.细胞：K562细胞

2.培养基：IMDM完全培养基

3.质粒：PFRT和PB-FRT-LacZeo

4.试剂：Galacto-Star System试剂盒(Applied Biosystems公司，货号：BM300S)

实验方法

1.取2×10⁷的K562细胞，400g离心5min后弃上清，用240μl的无血清1640培养基重悬细胞后平均分成两组：第一组加入10μg的pFRT/LacZeo质粒，第二组加入7μg PB-FRT-LacZeo质粒和2.8μg SuperPB。将两组细胞与质粒混合物充分混匀后将其转移到120μl电击管中，避免产生气泡，设置电转参数为：560V、30ms。电转结束后分别用5ml的IMDM完全培养基重悬两组细胞，然后将其转移到T25培养瓶中培养，培养条件为：37℃，5％CO₂。

2.电转48h后，将K562-PFRT细胞和K562-PB-FRT细胞分别400g离心5min收集细胞沉淀，用5ml的新鲜的IMDM完全培养基重悬各自的细胞沉淀，各取20μl细胞悬液用细胞计数仪计数，分别补加新鲜的IMDM完全培养基调整其细胞培养密度为3×10⁵/ml，K562-PFRT细胞用500μg/ml的Zeocin进行药物筛选，K562-PB-FRT细胞用5μg/ml的嘌呤霉素对其进行药物筛选，间隔48h传代一次。

3.药物筛选一周后，准备20块圆底96孔板，将IMDM完全培养基按照150μl/孔的体积加入到圆底96孔板，将K562-PFRT细胞和K562-PB-FRT细胞各取5×10⁶的细胞通过索尼流式分选仪制备单克隆细胞，每种细胞各打10块96孔板。

4.单克隆培养第4天按照100μl/孔的体积给单克隆补加新鲜的IMDM完全培养基。第7天单克隆换液，每孔先弃去100μl的培养基再加入100μl新鲜的IMDM完全培养基。第10天将在显微镜下观察到的单克隆细胞转移到24孔板进行培养。待单克隆细胞扩繁后，每个单克隆各取3×10⁶的细胞数提取RNA再进行反转录获得每个单克隆的cDNA。

5.根据qPCR结果剔除了质粒中Lac基因插入数显著高于内参基因的单克隆细胞，结果如图10所示(详细数据见表2)，可见通过pFRT/lacZeo进行细胞转染，Lac基因整合效率较低，校正后各单克隆细胞的RQ值均小于0.5。因此qPCR实验符合条件的有10个K562-PFRT单克隆细胞和4个K562-PB-FRT单克隆细胞。而其中K562-PB-FRT-LacZeo-86mono单克隆细胞Lac基因相对拷贝数RQ高于0.5，故认为含有多于1条FRT整合位点。

表2β-半乳糖苷酶的表达结果测定

6.将保留的15个单克隆细胞各取1×10⁶的细胞根据Galacto-Star System试剂盒方法检测其β-半乳糖苷酶的表达，结果如图11所示，K562-PFRT单克隆细胞均无β-半乳糖苷酶的表达，而K562-PB-FRT单克隆细胞有两个克隆有β-半乳糖苷酶的表达，对这两个克隆进行保留。

7.由于K562-PB-FRT-LacZeo-86mono克隆β-半乳糖苷酶表达量为最高，因此认为K562-PB-FRT-LacZeo-86mono克隆半乳糖苷酶基因整合率高于其他克隆，可能整合了多于1个PB-FRT-LacZeo。

实验结果

综合分析以上15个单克隆细胞的qPCR结果和β-半乳糖苷酶的检测结果表明：⑴PB-FRT-LacZeo质粒在K562细胞中的整合效率较高，并且K562-PB-FRT细胞的每个单克隆均表达β-半乳糖苷酶；⑵pFRT/LacZeo质粒在K562细胞中的整合效率普遍较低，其β-半乳糖苷酶的表达量均低。

由上述实施例可知，本发明提供的重组质粒载体能够更快速的制备获得抗体展示细胞系，所述抗体展示细胞系能够成功的展示各种蛋白质，应用于抗体筛选。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 北京鼎成肽源生物技术有限公司

焦顺昌

<120> 一种重组质粒载体、抗体展示细胞系及其应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5316

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

actagtggtg tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc 60

tcaattagtc agcaaccagg tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc 120

aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca tagtcccgcc cctaactccg cccatcccgc 180

ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt 240

atgcagaggc cgaggccgcc tcggcctctg agctattcca gaagtagtga ggaggctttt 300

ttggaggcta ccatggagaa gttactattc cgaagttcct attctctaga aagtatagga 360

acttcaagct tggcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa ccctggcgtt 420

acccaactta atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca gctggcgtaa tagcgaagag 480

gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg gcgctttgcc 540

tggtttccgg caccagaagc ggtgccggaa agctggctgg agtgcgatct tcctgaggcc 600

gatactgtcg tcgtcccctc aaactggcag atgcacggtt acgatgcgcc catctacacc 660

aacgtgacct atcccattac ggtcaatccg ccgtttgttc ccacggagaa tccgacgggt 720

tgttactcgc tcacatttaa tgttgatgaa agctggctac aggaaggcca gacgcgaatt 780

atttttgatg gcgttaactc ggcgtttcat ctgtggtgca acgggcgctg ggtcggttac 840

ggccaggaca gtcgtttgcc gtctgaattt gacctgagcg catttttacg cgccggagaa 900

aaccgcctcg cggtgatggt gctgcgctgg agtgacggca gttatctgga agatcaggat 960

atgtggcgga tgagcggcat tttccgtgac gtctcgttgc tgcataaacc gactacacaa 1020

atcagcgatt tccatgttgc cactcgcttt aatgatgatt tcagccgcgc tgtactggag 1080

gctgaagttc agatgtgcgg cgagttgcgt gactacctac gggtaacagt ttctttatgg 1140

cagggtgaaa cgcaggtcgc cagcggcacc gcgcctttcg gcggtgaaat tatcgatgag 1200

cgtggtggtt atgccgatcg cgtcacacta cgtctgaacg tcgaaaaccc gaaactgtgg 1260

agcgccgaaa tcccgaatct ctatcgtgcg gtggttgaac tgcacaccgc cgacggcacg 1320

ctgattgaag cagaagcctg cgatgtcggt ttccgcgagg tgcggattga aaatggtctg 1380

ctgctgctga acggcaagcc gttgctgatt cgaggcgtta accgtcacga gcatcatcct 1440

ctgcatggtc aggtcatgga tgagcagacg atggtgcagg atatcctgct gatgaagcag 1500

aacaacttta acgccgtgcg ctgttcgcat tatccgaacc atccgctgtg gtacacgctg 1560

tgcgaccgct acggcctgta tgtggtggat gaagccaata ttgaaaccca cggcatggtg 1620

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<210> 2

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<400> 6

gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt 60

gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct 120

tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tggcgctttg cctggtttcc ggcaccagaa 180

gcggtgccgg aaagctggct ggagtgcgat cttcctgagg ccgatactgt cgtcgtcccc 240

tcaaactggc agatgcacgg ttacgatgcg cccatctaca ccaacgtgac ctatcccatt 300

acggtcaatc cgccgtttgt tcccacggag aatccgacgg gttgttactc gctcacattt 360

aatgttgatg aaagctggct acaggaaggc cagacgcgaa ttatttttga tggcgttaac 420

tcggcgtttc atctgtggtg caacgggcgc tgggtcggtt acggccagga cagtcgtttg 480

ccgtctgaat ttgacctgag cgcattttta cgcgccggag aaaaccgcct cgcggtgatg 540

gtgctgcgct ggagtgacgg cagttatctg gaagatcagg atatgtggcg gatgagcggc 600

attttccgtg acgtctcgtt gctgcataaa ccgactacac aaatcagcga tttccatgtt 660

gccactcgct ttaatgatga tttcagccgc gctgtactgg aggctgaagt tcagatgtgc 720

ggcgagttgc gtgactacct acgggtaaca gtttctttat ggcagggtga aacgcaggtc 780

gccagcggca ccgcgccttt cggcggtgaa attatcgatg agcgtggtgg ttatgccgat 840

cgcgtcacac tacgtctgaa cgtcgaaaac ccgaaactgt ggagcgccga aatcccgaat 900

ctctatcgtg cggtggttga actgcacacc gccgacggca cgctgattga agcagaagcc 960

tgcgatgtcg gtttccgcga ggtgcggatt gaaaatggtc tgctgctgct gaacggcaag 1020

ccgttgctga ttcgaggcgt taaccgtcac gagcatcatc ctctgcatgg tcaggtcatg 1080

gatgagcaga cgatggtgca ggatatcctg ctgatgaagc agaacaactt taacgccgtg 1140

cgctgttcgc attatccgaa ccatccgctg tggtacacgc tgtgcgaccg ctacggcctg 1200

tatgtggtgg atgaagccaa tattgaaacc cacggcatgg tgccaatgaa tcgtctgacc 1260

gatgatccgc gctggctacc ggcgatgagc gaacgcgtaa cgcgaatggt gcagcgcgat 1320

cgtaatcacc cgagtgtgat catctggtcg ctggggaatg aatcaggcca cggcgctaat 1380

cacgacgcgc tgtatcgctg gatcaaatct gtcgatcctt cccgcccggt gcagtatgaa 1440

ggcggcggag ccgacaccac ggccaccgat attatttgcc cgatgtacgc gcgcgtggat 1500

gaagaccagc ccttcccggc tgtgccgaaa tggtccatca aaaaatggct ttcgctacct 1560

ggagagacgc gcccgctgat cctttgcgaa tacgcccacg cgatgggtaa cagtcttggc 1620

ggtttcgcta aatactggca ggcgtttcgt cagtatcccc gtttacaggg cggcttcgtc 1680

tgggactggg tggatcagtc gctgattaaa tatgatgaaa acggcaaccc gtggtcggct 1740

tacggcggtg attttggcga tacgccgaac gatcgccagt tctgtatgaa cggtctggtc 1800

tttgccgacc gcacgccgca tccagcgctg acggaagcaa aacaccagca gcagtttttc 1860

cagttccgtt tatccgggca aaccatcgaa gtgaccagcg aatacctgtt ccgtcatagc 1920

gataacgagc tcctgcactg gatggtggcg ctggatggta agccgctggc aagcggtgaa 1980

gtgcctctgg atgtcgctcc acaaggtaaa cagttgattg aactgcctga actaccgcag 2040

ccggagagcg ccgggcaact ctggctcaca gtacgcgtag tgcaaccgaa cgcgaccgca 2100

tggtcagaag ccggccacat cagcgcctgg cagcagtggc gtctggcgga aaacctcagt 2160

gtgacgctcc ccgccgcgtc ccacgccatc ccgcatctga ccaccagcga aatggatttt 2220

tgcatcgagc tgggtaataa gcgttggcaa tttaaccgcc agtcaggctt tctttcacag 2280

atgtggattg gcgataaaaa acaactgctg acgccgctgc gcgatcagtt cacccgtgca 2340

ccgctggata acgacattgg cgtaagtgaa gcgacccgca ttgaccctaa cgcctgggtc 2400

gaacgctgga aggcggcggg ccattaccag gccgaagcag cgttgttgca gtgcacggca 2460

gatacacttg ctgacgcggt gctgattacg accgctcacg cgtggcagca tcaggggaaa 2520

accttattta tcagccggaa aacctaccgg attgatggta gtggtcaaat ggcgattacc 2580

gttgatgttg aagtggcgag cgatacaccg catccggcgc ggattggcct gaactgccag 2640

ctggcgcagg tagcagagcg ggtaaactgg ctcggattag ggccgcaaga aaactatccc 2700

gaccgcctta ctgccgcctg ttttgaccgc tgggatctgc cattgtcaga catgtatacc 2760

ccgtacgtct tcccgagcga aaacggtctg cgctgcggga cgcgcgaatt gaattatggc 2820

ccacaccagt ggcgcggcga cttccagttc aacatcagcc gctacagtca acagcaactg 2880

atggaaacca gccatcgcca tctgctgcac gcggaagaag gcacatggct gaatatcgac 2940

ggtttccata tggggattgg tggagacgac tcctggagcc cgtcagtatc ggcggaatta 3000

cagctgagcg ccggtcgcta ccattaccag ttggtctggt gtcaaaaa 3048

<210> 7

<211> 378

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

atggatgcca agttgaccag tgccgttccg gtgctcaccg cgcgcgacgt cgccggagcg 60

gtcgagttct ggaccgaccg gctcgggttc tcccgggact tcgtggagga cgacttcgcc 120

ggtgtggtcc gggacgacgt gaccctgttc atcagcgcgg tccaggacca ggtggtgccg 180

gacaacaccc tggcctgggt gtgggtgcgc ggcctggacg agctgtacgc cgagtggtcg 240

gaggtcgtgt ccacgaactt ccgggacgcc tccgggccgg ccatgaccga gatcggcgag 300

cagccgtggg ggcgggagtt cgccctgcgc gacccggccg gcaactgcgt gcacttcgtg 360

gccgaggagc aggactga 378

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

catgcgtcaa ttttacgcag actatctttc taggg 35

<210> 9

<211> 858

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt 60

tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag 120

tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca 180

gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc 240

tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt 300

tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag 360

ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt 420

tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat 480

ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt 540

gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc 600

ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat 660

cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag 720

ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt 780

ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg 840

gaaatgttga atactcat 858

<210> 10

<211> 699

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

atggtgagca aaggcgaggc cgtgatcaag gagttcatga ggttcaaggt gcacatggag 60

ggcagcatga acggccacga gttcgagatc gagggcgagg gcgaaggcag accctatgag 120

ggcacccaga ccgccaagct gaaggtgaca aagggcggcc ctctgccctt cagctgggat 180

attctgtccc cccagttcat gtacggcagc agagccttca ccaagcaccc cgccgacatc 240

cccgactact ataagcagag cttccccgag ggctttaagt gggagagggt gatgaacttc 300

gaggatggag gcgccgtgac cgtgacccaa gacacatctc tggaggacgg cacactgatc 360

tacaaggtga agctgagggg caccaacttt cctcccgacg gccccgtgat gcagaagaag 420

accatgggct gggaggcttc caccgagaga ctgtaccccg aggacggcgt gctgaagggc 480

gacattaaga tggctctgag actgaaggac ggcggaagat acctcgccga cttcaagacc 540

acctacaagg ccaagaagcc cgtgcagatg cccggcgcct acaacgtgga tagaaagctg 600

gacatcacat cccacaacga ggattacacc gtcgtggagc agtacgagag atccgagggc 660

agacactcca ccggcggcat ggatgaactg tacaagtga 699

<210> 11

<211> 714

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

atggtgagca aaggcgagga gctgatcaag gagaacatgc acatgaagct gtacatggag 60

ggcaccgtcg acaaccacca cttcaagtgc acaagcgagg gcgagggcaa gccctacgaa 120

ggcacccaga ccatgagaat caaggtggtg gagggaggcc ctctgccttt cgctttcgac 180

attctggcca caagctttct gtacggcagc aagaccttca tcaaccacac acaaggcatc 240

cccgacttct ttaagcagtc cttccccgag ggcttcacat gggagagggt gaccacctat 300

gaggatggcg gcgtgctgac cgccacacaa gacacctctc tgcaagacgg ctgtctgatc 360

tacaacgtga agattagagg cgtgaacttc accagcaacg gacccgtgat gcagaagaag 420

acactgggct gggaggcctt caccgagaca ctgtaccccg ccgacggagg actggaagga 480

agaaatgaca tggccctcaa gctggtgggc ggcagccatc tgatcgccaa cgccaagacc 540

acctatagat ccaagaagcc cgccaagaat ctgaagatgc ccggcgtgta ctacgtggac 600

tatagactgg agagaatcaa ggaggccaac aacgagacct acgtggagca gcatgaggtg 660

gccgtggcca gatactgcga tctgccctcc aagctgggcc ataagctgaa ttga 714

<210> 12

<211> 1070

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

gctagctcca ccatggagac agacacactc ctgctatggg tactgctgct ctgggttcca 60

ggttccactg gtgactatcc atatgatgtt ccagattatg ctgaacaaaa actcatctca 120

gaagaggatc tgggggccca ggcggccgat atccagatga cccagtcccc gagctccctg 180

tccgcctctg tgggcgatag ggtcaccatc acctgccgtg ccagtcagga tgtgaatact 240

gctgtagcct ggtatcaaca gaaaccagga aaagctccga aactactgat ttactcggca 300

tccttccttt attctggagt cccttctcgc ttctctggat ctagatctgg gacggatttc 360

actctgacca tcagcagtct gcagccggaa gacttcgcaa cttattactg tcagcaacat 420

tatactactc ctcccacgtt cggacagggt accaaggtgg agatcaaacg cactggctcc 480

actagcggtt ccggcaaacc tggcagcgga gaaggcagca ccaaagggga ggttcagctg 540

gtggagtctg gcggtggcct ggtgcagcca gggggctcac tccgtttgtc ctgtgcagct 600

tctggcttca acattaaaga cacctatata cactgggtgc gtcaggcccc gggtaagggc 660

ctggaatggg ttgcaaggat ttatcctacg aatggttata ctagatatgc cgatagcgtc 720

aagggccgtt tcactataag cgcagacaca tccaaaaaca cagcctacct gcagatgaac 780

agcctgcgtg ctgaggacac tgccgtctat tattgttcta gatggggagg ggacggcttc 840

tatgctatgg acgtgtgggg tcaaggaacc ctggtcaccg tctcctcggg ccaggccggc 900

cagaatgctg tgggccagga cacgcaggag gtcatcgtgg tgccacactc cttgcccttt 960

aaggtggtgg tgatctcagc catcctggcc ctggtggtgc tcaccatcat ctcccttatc 1020

atcctcatca tgctttggca gaagaagcca cgttaggggc ccgtttaaac 1070

<210> 13

<211> 6

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

gctagc 6

<210> 14

<211> 735

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

cagatgaccc agtccccgag ctccctgtcc gcctctgtgg gcgatagggt caccatcacc 60

tgccgtgcca gtcaggatgt gaatactgct gtagcctggt atcaacagaa accaggaaaa 120

gctccgaaac tactgattta ctcggcatcc ttcctttatt ctggagtccc ttctcgcttc 180

tctggatcta gatctgggac ggatttcact ctgaccatca gcagtctgca gccggaagac 240

ttcgcaactt attactgtca gcaacattat actactcctc ccacgttcgg acagggtacc 300

aaggtggaga tcaaacgcac tggctccact agcggttccg gcaaacctgg cagcggagaa 360

ggcagcacca aaggggaggt tcagctggtg gagtctggcg gtggcctggt gcagccaggg 420

ggctcactcc gtttgtcctg tgcagcttct ggcttcaaca ttaaagacac ctatatacac 480

tgggtgcgtc aggccccggg taagggcctg gaatgggttg caaggattta tcctacgaat 540

ggttatacta gatatgccga tagcgtcaag ggccgtttca ctataagcgc agacacatcc 600

aaaaacacag cctacctgca gatgaacagc ctgcgtgctg aggacactgc cgtctattat 660

tgttctagat ggggagggga cggcttctat gctatggacg tgtggggtca aggaaccctg 720

gtcaccgtct cctcg 735

<210> 15

<211> 147

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

gctgtgggcc aggacacgca ggaggtcatc gtggtgccac actccttgcc ctttaaggtg 60

gtggtgatct cagccatcct ggccctggtg gtgctcacca tcatctccct tatcatcctc 120

atcatgcttt ggcagaagaa gccacgt 147

<210> 16

<211> 14

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

gggcccgttt aaac 14

Claims (10)

1.一种重组质粒载体，其特征在于，包括初始质粒载体和插入片段，所述初始质粒载体为哺乳动物细胞转座质粒，所述插入片段包括FRT-LacZeo片段。

2.根据权利要求1所述的重组质粒载体，其特征在于，所述FRT-LacZeo片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.根据权利要求1所述的重组质粒载体，其特征在于，所述哺乳动物细胞转座质粒为PB713B。

4.根据权利要求1～3任意一项所述重组质粒载体，其特征在于，所述重组质粒载体的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

5.一种抗体展示细胞系，其特征在于，所述抗体展示细胞系通过在原始细胞中转染权利要求1～4任意一项所述的重组质粒载体获得。

6.根据权利要求5所述的抗体展示细胞系，其特征在于，所述原始细胞包括K562细胞。

7.权利要求5或6所述抗体展示细胞系的制备方法，包括以下步骤：

1)将权利要求1～4任意一项所述的重组质粒载体和表达转座酶的质粒共转染原始细胞获得待筛选细胞系；

2)向所述待筛选细胞系中添加嘌呤毒素进行筛选获得稳定表达细胞系；

3)将所述稳定表达细胞系单克隆化后，筛选仅整合一个重组质粒载体的单克隆细胞系获得抗体展示细胞系。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述表达转座酶的质粒为Super PB。

9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中当所述待筛选细胞系的细胞密度为(2～4)×10⁵/ml时，所述嘌呤毒素的终浓度为4～6μg/ml；所述筛选的时间为7～10d。

10.权利要求1～4任意一项所述的重组质粒载体、权利要求5或6所述的抗体展示细胞系在抗体筛选中的应用。

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