CN102282266A - 高复杂度哺乳动物展示文库及其筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了利用哺乳动物展示文库筛选来分离出编码具有所需性质的多肽例如抗体的多核苷酸的方法以及产生编码多肽例如抗体的多核苷酸文库的方法，其中多核苷酸总计编码至少10⁹种不同多肽。还提供了用于执行本发明描述的方法的试剂盒、通过本发明描述的方法分离到的多核苷酸、编码不同物种包括人、小鼠、兔的抗体库的文库，以及由所述多核苷酸编码的多肽。

Description

高复杂度哺乳动物展示文库及其筛选方法

相关申请

本申请要求2008年11月21日提交的美国临时专利申请No.61/117,028和2009年9月18日提交的美国临时专利申请No.61/276,956的优先权益，所述申请每个的内容在此以其全文引为参考。

技术领域

本申请涉及哺乳动物多肽展示文库、特别是哺乳动物的全长抗体展示文库的构建和筛选。

背景技术

通过细胞表面展示技术，包括噬菌体展示、核糖体/mRNA展示和酵母展示，有可能进行特异性结合靶抗原的抗体的高通量筛选。(Hoogenboom等，Nature Biotechnology(2005)，23(9)：1105-1116)。尽管这些筛选平台各自具有其特殊的优点，但它们都基于抗体在不同于哺乳动物细胞的环境中的表达。在那些系统中产生的蛋白质，与哺乳动物细胞中产生的相比，蛋白质折叠、糖基化、二硫键形成和/或修饰可能不同。

为了避免这些问题，已经开发了基于抗体在其自然环境、即哺乳动物细胞中表达的筛选平台。例如，通过研究，已开发了允许在哺乳动物细胞表面上展示免疫球蛋白小型文库的抗体展示技术。参见例如Higuchi等，J.Immun.Methods(1997)202：193-204。在哺乳动物细胞中执行抗体筛选的一个主要缺点是能够筛选的抗体的数量受限。因为每个哺乳动物细胞在转染过程中能够摄取编码不同抗体的大量不同多核苷酸，从产生抗体的哺乳动物细胞分离出编码抗体的多核苷酸既困难又繁琐。因此，在哺乳动物展示领域的尝试集中于建立的哺乳动物展示系统在每个哺乳动物细胞中存在较少量不同多核苷酸。例如，WO05/063817公开了一种筛选全长抗体小型文库的方法。在将单基因拷贝均匀整合到每个细胞中之后，将群体通过流式细胞术进行分拣，以获得表达具有高结合亲和性抗体的细胞。也参见US2005/0059082和WO08/070367。大多数目前可用的哺乳动物展示技术不能用于筛选编码大量不同抗体的多核苷酸的高度复杂的文库。尽管噬菌体展示技术允许在单次淘选循环中筛选10¹⁰至甚至10¹⁵个克隆，但现有方法中的哺乳动物展示筛选程序的通量限于同时分析约10⁶至10⁷个克隆。因此，对于允许高复杂度哺乳动物展示文库筛选的筛选方法和系统，存在着需求。

在本文中提到的所有出版物、专利、专利申请和公布的专利申请的公开内容，在此以其全文引为参考。

发明概述

本发明提供了筛选哺乳动物展示文库的方法，其包括编码具有所需性质的多肽的多核苷酸的筛选方法、编码具有所需性质的多肽的多核苷酸的富集方法、含有编码具有所需性质的多肽的多核苷酸的哺乳动物细胞的分离方法、含有编码具有所需性质的多肽的多核苷酸的哺乳动物细胞的筛选方法、具有所需性质的多肽的鉴定方法以及获得具有所需性质的多肽的方法。

在某些实施方案中，方法包含：a)从用多核苷酸的初级文库转染(例如瞬时转染)的哺乳动物细胞的初始群体中筛选出展示具有所需性质的多肽的细胞，并回收哺乳动物细胞亚群；b)将从所述哺乳动物细胞亚群提取的mRNA反转录成cDNA并扩增所述cDNA，以产生多核苷酸的子文库；c)从用多核苷酸的子文库转染的哺乳动物细胞群体中筛选出展示具有所需性质的多肽的细胞，并回收哺乳动物细胞的第二个亚群。在某些实施方案中，将步骤b)和c)重复一次以上。在某些实施方案中，方法还包含：a)将从哺乳动物细胞亚群提取的mRNA反转录成cDNA并扩增所述cDNA，以产生多核苷酸子文库，其中细胞亚群通过从用多核苷酸的初级文库转染(例如瞬时转染)的哺乳动物细胞初始群体中筛选出展示具有所需性质的多肽的细胞来获得；b)从用多核苷酸子文库转染的哺乳动物细胞群体中筛选出展示具有所需性质的多肽的细胞，并回收哺乳动物细胞的第二个亚群。在某些实施方案中，方法包含从用多核苷酸子文库转染的哺乳动物细胞群体中筛选出展示具有所需性质的多肽的细胞，并回收哺乳动物细胞亚群，其中子文库通过将从哺乳动物细胞的中间群体提取的mRNA反转录成cDNA并扩增所述cDNA以产生多核苷酸子文库来产生，其中细胞的中间群体通过从用多核苷酸的初级文库转染(例如瞬时转染)的哺乳动物细胞初始群体中筛选出展示具有所需性质的多肽的细胞来获得。在某些实施方案中，多肽是异聚蛋白。在某些实施方案中，多肽是抗体。

在某些实施方案中，提供了编码具有所需性质的多肽的多核苷酸的分离方法，所述方法包含：a)从用多核苷酸的初级文库转染(例如瞬时转染)的哺乳动物细胞的初始群体中筛选出展示具有所需性质的多肽的细胞，并回收哺乳动物细胞亚群；b)将从所述哺乳动物细胞亚群提取的mRNA反转录成cDNA并扩增所述cDNA，以产生多核苷酸的子文库；c)从用多核苷酸的子文库转染的哺乳动物细胞群体中筛选出展示具有所需性质的多肽的细胞，并回收哺乳动物细胞的第二个亚群；以及d)从所述哺乳动物细胞的第二个亚群分离出编码具有所需性质的多肽的多核苷酸。

在某些实施方案中，初级文库中的多核苷酸编码至少10⁹种(包括例如约10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³、10¹⁴、10¹⁵和10¹⁶种中的任一个数量)不同多肽。在某些实施方案中，哺乳动物细胞的初始群体在群体中的各个哺乳动物细胞能够摄取约100个以上、例如约10³、10⁴、10⁵或10⁶个中的任一个数量以上的不同多核苷酸拷贝的条件下，用初级文库进行瞬时转染。在某些实施方案中，步骤c)中的筛选条件比步骤a)的条件更严紧。

在某些实施方案中，提供了编码具有所需性质的异聚蛋白的多核苷酸的分离方法，所述方法包含：a)从哺乳动物细胞的初始群体中筛选出展示具有所需性质的异聚蛋白的细胞，并回收哺乳动物细胞亚群，其中哺乳动物细胞的初始群体用编码第一种多肽和第二种多肽的多核苷酸的初级文库进行转染(例如瞬时转染)，并且其中第一种多肽和第二种多肽在细胞表面上形成异聚蛋白；b)将从所述哺乳动物细胞亚群提取的mRNA反转录成cDNA并扩增所述cDNA，以产生多核苷酸的子文库；c)从随后的哺乳动物细胞群体筛选出展示具有所需性质的异聚蛋白的细胞，并回收哺乳动物细胞的第二个亚群，其中所述随后的哺乳动物细胞群体用编码第一种多肽和第二种多肽的多核苷酸的子文库进行转染，并且其中第一种多肽和第二种多肽形成异聚蛋白；以及d)从所述哺乳动物细胞的第二个亚群分离出编码具有所需性质的多肽的多核苷酸。

在某些实施方案中，提供了编码特异性识别抗原的抗体的多核苷酸的分离方法，所述方法包含：a)从用编码抗体的多核苷酸的初级文库转染(例如瞬时转染)的哺乳动物细胞的初始群体中筛选出展示特异性识别抗原的抗体的细胞，并回收哺乳动物细胞亚群；b)将从所述哺乳动物细胞亚群提取的mRNA反转录成cDNA并扩增所述cDNA，以产生多核苷酸的子文库；c)从用多核苷酸子文库转染的哺乳动物细胞群体中筛选出展示特异性识别抗原的抗体的细胞，并回收哺乳动物细胞的第二个亚群；以及d)从所述哺乳动物细胞的第二个亚群分离出编码特异性识别抗原的抗体的多核苷酸。在某些实施方案中，初级文库中的多核苷酸编码至少10⁹种不同抗体。在某些实施方案中，步骤a)包含：(i)将哺乳动物细胞的初始群体在适当的结合条件下与抗原相接触；以及(ii)回收与抗原结合的哺乳动物细胞亚群。在某些实施方案中，步骤c)包含：(i)将富集的哺乳动物展示文库在适当的结合条件下与抗原相接触；以及(ii)回收与抗原结合的哺乳动物细胞亚群。在某些实施方案中，步骤d)包含：i)从细胞亚群分离mRNA，ii)将mRNA扩增成cDNA；iii)将cDNA克隆到克隆载体中；以及iv)测定DNA的序列。

在某些实施方案中，提供了编码特异性识别特定抗原的抗体的多核苷酸的分离方法，所述方法包含：a)筛选出用编码轻链的第一个多核苷酸初级文库和编码重链的第二个初级文库瞬时转染、并在细胞表面上展示由所述多核苷酸编码的抗体的哺乳动物细胞的初始群体，以获得哺乳动物细胞的亚群；b)将从所述哺乳动物细胞亚群提取的mRNA反转录成cDNA并扩增所述cDNA，以产生多核苷酸的子文库；c)筛选出用多核苷酸子文库转染并在细胞表面上展示由所述多核苷酸编码的抗体的哺乳动物细胞群体，以获得哺乳动物细胞的第二个亚群；以及d)从所述哺乳动物细胞的第二个亚群分离出编码特异性识别特定抗原的抗体的多核苷酸。在某些实施方案中，在步骤d)之前将步骤b)和c)重复至少一次。在某些实施方案中，在步骤d)之前将步骤b)和c)重复不超过约3次。在某些实施方案中，初级文库中的多核苷酸编码至少10⁹种不同抗体。在某些实施方案中，步骤a)包含：(i)将哺乳动物细胞的初始群体在适当的结合条件下与抗原相接触；以及(ii)回收与抗原结合的哺乳动物细胞亚群。在某些实施方案中，步骤c)包含：(i)将富集的哺乳动物展示文库在适当的结合条件下与抗原相接触；以及(ii)回收与抗原结合的哺乳动物细胞亚群。在某些实施方案中，步骤d)包含：i)从细胞亚群分离mRNA，ii)将mRNA扩增成cDNA；iii)将cDNA克隆到克隆载体中；以及iv)测定DNA的序列。在某些实施方案中，哺乳动物细胞的初始群体在群体中的各个哺乳动物细胞能够摄取约100个以上、例如约10³、10⁴、10⁵或10⁶个中的任一个数量以上的不同多核苷酸拷贝的条件下，用初级文库进行瞬时转染。在某些实施方案中，方法还包含将多核苷酸的初级文库瞬时转染到哺乳动物细胞的初始群体中。

在某些实施方案中，提供了编码特异性识别抗原的抗体的多核苷酸的分离方法，所述方法包含：a)从用编码轻链的第一个多核苷酸初级文库和编码重链的第二个多核苷酸初级文库转染的哺乳动物细胞的初始群体中筛选出展示特异性识别抗原的抗体的细胞，并回收哺乳动物细胞亚群；b)将从所述哺乳动物细胞亚群提取的mRNA反转录成cDNA并扩增所述cDNA，以产生编码轻链的第一个多核苷酸子文库和编码重链的第二个多核苷酸子文库；c)从用第一个多核苷酸子文库和第二个多核苷酸子文库转染的哺乳动物细胞群体中筛选出展示特异性识别抗原的抗体的细胞，并回收哺乳动物细胞的第二个亚群；d)将从所述哺乳动物细胞的第二个亚群提取的mRNA反转录成cDNA并扩增所述cDNA，以产生编码轻链和重链的第三个多核苷酸子文库；e)从用第三个多核苷酸子文库转染的哺乳动物细胞群体中筛选出展示特异性识别抗原的抗体的细胞，并回收哺乳动物细胞的第三个亚群；以及f)从所述哺乳动物细胞的第三个亚群分离编码特异性识别抗原的抗体的多核苷酸。

另一方面，提供了用编码抗体的多核苷酸瞬时转染的哺乳动物细胞群体，其中多核苷酸总计编码至少约10⁹种不同重组抗体。

还提供了用于执行本文描述的方法的文库和试剂盒。还提供了在筛选过程中产生的子文库和从本文描述的方法获得的多核苷酸/多肽。

附图简述

图1提供了示意图，其显示了本文描述的示例性筛选方法。

图2提供了示意图，其显示了示例性的单盒表达载体。酶1-3是指能够被不同限制性酶识别(例如识别非回文序列的限制性酶)的限制性酶切割位点，其中用所述限制性酶切割所产生的每个片段的末端不自连。

图3提供了构建单盒表达载体pDGB-HC-TM的程序的示意图。HC-TM片段通过RT-PCR扩增和PCR装配产生。在PCR反应过程中将限制性酶识别序列合并到片段中。将片段插入到载体pcDNA5-FRT中以形成过渡载体。然后从过渡载体删除潮霉素表达盒，以形成载体pDGB-HC-TM。

图4显示了载体pDGBHC-TM的限制性酶消化结果。将载体用5种限制性酶以四种方式进行消化，并通过在1％琼脂糖凝胶中电泳来分析。M：1kb以上DNA分子量梯(Invitrogen)；A：Nhel+Xhol；B：Sfil；C：BsmBI；D：BstXI。

图5A提供了构建双盒表达载体的程序的示意图。通过PCR扩增4个片段，并通过四路(4-way)连接将它们连接在一起，以形成载体pDGB4。然后将FCS插入到载体中以形成载体pDGB4-FCS。

图5B显示了载体pDGB4的限制性酶消化结果。将pDGB4的16号克隆的纯化质粒DNA用3种限制性酶以5种方式进行消化，并在1％琼脂糖-TBE凝胶中进行电泳分析。M：DNA分子量梯；1：SfiI I；2：BstX I；3：BsmB I；4：BstX I+Sfi I；5：BsmB I+Sfi I。

发明详述

本发明提供了从哺乳动物展示文库筛选出具有所需性质的多肽的高效方法。方法是基于下述事实，即尽管用外来DNA质粒转染的每个哺乳动物细胞能够含有多达10⁶个质粒拷贝，但只有一小部分(例如约10²-10³个拷贝)质粒被转录成mRNA并表达成多肽。因此，来自从哺乳动物展示文库筛选中获得的阳性细胞的mRNA，与那些细胞中的DNA相比，复杂度明显更低(例如复杂度低至少1000倍)。本发明的方法利用了这种复杂度的降低。

在从原始哺乳动物展示文库中对展示具有所需性质的多肽的细胞进行初始筛选并获得富集有那些细胞的哺乳动物细胞亚群后，从哺乳动物细胞的富集亚群分离mRNA并通过方法例如RT-PCR(反转录酶PCR)进行扩增，以产生多核苷酸的合并物(子文库)。将该多核苷酸合并物继而导入哺乳动物细胞并进行另一轮文库筛选。第二轮筛选过程可以重复例如一次、两次或多次。本文描述的方法允许对哺乳动物展示文库进行高效筛选，使得能够以至少10⁹的多样性筛选哺乳动物展示文库。

本文提供的方法特别适合于筛选异聚蛋白。例如，提供了筛选抗体的方法。在一个示例性方法中，将抗体轻链的初级文库和抗体重链的初级文库共转染到哺乳动物细胞中，允许在细胞表面上展示抗体。在对哺乳动物细胞进行初始筛选以获得富集有表达所需抗体的细胞的哺乳动物细胞亚群后，从所述哺乳动物细胞亚群提取mRNA，通过RT-PCR扩增并克隆到适合的载体中，以产生重链的子文库和轻链的子文库。将重链和轻链的子文库继而导入哺乳动物细胞中，并进行另一轮文库筛选。第二轮筛选可以重复例如一次、两次或多次。在筛选方法的最后阶段，将抗体轻链和重链克隆到双表达盒载体中，以产生单一抗体文库(与两个不同文库相反)。然后将单一文库进行最后一轮筛选，以获得编码所需抗体的多核苷酸。图1进一步提供了示意图，其显示了筛选抗体展示文库的示例性方法。

因此，一方面，本发明提供了筛选哺乳动物展示文库的方法或利用哺乳动物展示文库筛选来分离编码具有所需性质的多肽(例如抗体)的多核苷酸的方法。

另一方面，提供了用编码多肽(例如抗体)的多核苷酸瞬时转染的哺乳动物细胞群体，其中所述多核苷酸在哺乳动物细胞表面上总计编码至少10⁹种不同的重组多肽。

另一方面，提供了产生用于哺乳动物展示筛选的多核苷酸文库的方法，其中所述多核苷酸总计编码至少10⁹种不同的重组多肽(例如抗体)。

还提供了用于执行本文描述的方法的试剂盒。还提供了通过本文描述的方法分离的多核苷酸和由所述多核苷酸编码的多肽。

应该理解，前面的一般性描述和下面的详细描述都仅仅是实例性和解释性的，并且不对本文描述的组合物和方法构成限制。在本申请中，除非另外特别指明，否则单数形式的使用包括了复数形式。此外，“或”的使用意味着“和/或”，除非指明不是如此。同样地，“包含”和“包括”不打算是限制性的。

应该理解，本文描述的本发明的方面和实施方案包括“由方面和实施方案构成”和/或“基本上由方面和实施方案构成”。

定义

当在本文中使用时，下列术语和词组打算具有下列含义：

“展示”或“哺乳动物展示”是指在哺乳动物宿主细胞表面上呈递不同的重组多肽。

本文中使用的“文库”是指多核苷酸的多样化集合体或混合物，其包含编码不同重组多肽的多核苷酸。在某些实施方案中，多核苷酸文库可以在给定的多核苷酸集合体内包含至少10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³、10¹⁴、10¹⁵种或更多的不同多核苷酸。典型地，文库中的不同多核苷酸是相关的，例如它们源自于单一动物物种(例如人、小鼠、兔、山羊、马)、组织类型、器官或细胞类型。“文库”可以包含共同属类的多核苷酸。例如，属类可以是编码某一型和类的免疫球蛋白亚基多肽的多核苷酸，例如，文库可以编码抗体μ、γ1、γ2、γ3、γ4、α1、α2、ε或δ重链，或抗体κ或λ轻链。尽管本文描述的任一文库的每个成员可能编码相同的重链或轻链恒定区，但文库可以总计包含至少10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³、10¹⁴或10¹⁵种不同的可变区，即与共同恒定区相伴的“多种”可变区。

“哺乳动物展示文库”是指包含编码能够展示在哺乳动物细胞上的不同重组多肽的多核苷酸的文库。在某些情形中，术语还通常用于包括用多核苷酸文库转染的哺乳动物细胞。

文库的“多样性”是指文库中由多核苷酸编码的不同重组多肽的数量。

本文中使用的“筛选”是指对包含所需物质的合并物进行可以检测到所需物质的测定、然后回收或获得其中所需物质被检测到并任选被富集的合并物的等份试样的方法。

本文中使用的“回收”是指将所需物质与合并物的不需要的其余部分粗略分离。

筛选条件的“严紧性”是指用于筛选方法的测定条件。例如，当执行与特定结合配偶体的结合测定时，筛选条件的严紧性是指结合测定条件的严紧性。

“哺乳动物细胞群体”是指其中可以导入并展示多核苷酸文库的哺乳动物细胞群。尽管优选情况下细胞群体是单一培养物，即群体中的每个细胞是相同细胞类型的，但也设想了细胞的混合培养物。细胞可以是黏附的，即附着于固相基质生长的细胞，或供选地，细胞可以处于悬浮状态。哺乳动物细胞可以是源自于原发肿瘤的细胞、源自于转移肿瘤的细胞、初级细胞、已经失去接触抑制的细胞、转化的初级细胞、永生化的初级细胞、可以经历凋亡的细胞，以及从它们衍生的细胞系。

“抗体”是免疫球蛋白分子，其能够通过位于所述免疫球蛋白分子可变区中的至少一个抗原识别位点与靶例如糖类、多核苷酸、脂类、多肽等结合。当在本文中使用时，该术语不仅涵盖完整的多克隆或单克隆抗体，而且包含其片段(例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、单链(ScFv)、其突变体、天然存在的变体、包含具有所需特异性的抗原识别位点的抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体，以及包含具有所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰构型。

“人源化”抗体是指这样的分子，其具有基本上源自于非人类物种免疫球蛋白的抗原结合位点，并且分子的其余免疫球蛋白结构是基于人类免疫球蛋白的结构和/或序列。抗原结合位点可以包含融合到恒定结构域上的完整可变结构域，或只含有嫁接到可变结构域中适合的构架区上的互补决定区(CDR)。抗原结合位点可以是野生型，或可以通过一个或多个氨基酸取代加以修饰，例如被修饰成与人类免疫球蛋白更类似。某些形式的人源化抗体保留了所有CDR序列(例如包含来自于小鼠抗体的所有6个CDR的人源化小鼠抗体)。其他形式的人源化抗体具有相对于原始抗体来说改变的一个或多个CDR(1、2、3、4、5、6个)，其也被称为“源自于”一个或多个CDR的一个或多个CDR。

“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中重链和轻链的每个氨基酸序列的一部分与源自于特定物种或属于特定类型的抗体的相应序列同源，而链的其余区段与与另一种抗体的相应序列同源。典型地，在这些嵌合抗体中，轻链和重链两者的可变区都模拟源自于一个哺乳动物物种的抗体的可变区，而恒定区部分与源自于另一物种的抗体中的序列同源。这种嵌合形式的一个明显优点是，例如，可以使用来自非人类宿主生物的容易获得的杂交瘤或B细胞，从当前已知的来源方便地产生可变区，并与源自于例如人类细胞制备物的恒定区组合。在可变区具有容易制备的优点、并且特异性不受其来源影响的同时，当注射抗体时，人类的恒定区与来自于非人类来源的恒定区相比，引发人类对象的免疫应答的可能性更低。然而，定义不限于该具体实例。

抗体的“可变区”是指单独或组合的抗体轻链可变区或抗体重链可变区。重链和轻链可变区各由四个构架区(FR)构成，所述架构区通过三个互补决定区(CDR)、也称为超变区相连。每条链中的CDR由FR保持紧邻在一起，并且与来自另一条链的CDR共同促成抗体的抗原结合位点的形成。至少存在两种确定CDR的技术：(1)基于物种交叉序列变异性的方法(即Kabat等，《免疫重要的蛋白质的序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)(第五版，1991，National Institutes of Health，Bethesda MD))；以及(2)基于抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法(Al-lazikani等，(1997)J.Molec.Biol.273：927-948)。当在本文中使用时，CDR可以是指由任一种方法或两种方法的组合定义的CDR。

抗体的“恒定区“是指单独或组合的抗体轻链恒定区或抗体重链恒定区。

抗体或多肽与抗原或靶“特异性结合”或“优先结合”，是指它的结合与它对其他物质的结合相比亲和性、亲合力更高、更容易结合和/或持续时间更长。通过阅读本定义，应该理解，与第一个靶特异性或优先结合的抗体或多肽，可以或不可以与第二个靶特异性或优先结合。因此，“特异性结合”或“优先结合”不是必定要求(尽管可以包括)排他性结合。一般来说，但不是必需的，结合是指优先结合。

术语“全长抗体”、“完整抗体”或“整个抗体”在本文中可互换使用，是指抗体处于其基本上完整的形式而不是抗体片段。具体来说，该术语是指具有包含Fc区的重链的抗体。全长抗体可以是天然序列的抗体或抗体变体。

“抗体片段“只包含完整抗体的一部分，一般包括完整抗体的抗原结合位点，从而保留了结合抗原的能力。本定义涵盖的抗体片段的实例包括：(i)Fab片段，其具有VL、CL、VH和CH1结构域；(ii)Fab′片段，其是在CH1结构域的C-端具有一个或多个半胱氨酸残基的Fab片段；(iii)Fd片段，其具有VH和CH1结构域；(iv)Fd′片段，其具有VH和CH1结构域并在CH1结构域的C-端具有一个或多个半胱氨酸残基；(v)Fv片段，其具有单个抗体的VL和VH结构域；(vi)dAb片段，其由VH结构域构成；(vii)分离的CDR区；(viii)F(ab′)₂片段，其是二价片段，包含在铰链区由二硫桥相连的两个Fab′片段；(ix)单链抗体分子(例如单链Fv；scFv)；(x)具有两个抗原结合位点的“双抗体(diabodies)”，其包含连接在同一个多肽链中的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)；(xi)“线性抗体“，其包含一对串联的Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，与互补的轻链多肽一起形成了一对抗原结合区。

当在本文中使用时，术语“重链”是指较大的免疫球蛋白亚基，其通过氨基端区域与免疫球蛋白轻链结合。重链包含可变结构域和恒定结构域。恒定结构域还包含CH1、铰链、CH2和CH3结构域。在IgE、IgM和IgY的情况下，重链包含CH4结构域但是不具有铰链结构域。词组“免疫球蛋白重链恒定结构域”是指CH1、铰链、CH2、CH3、CH4结构域或其任何组合。

本文中使用的术语“轻链”是指较小的免疫球蛋白亚基，其与重链的氨基端区域结合。与重链相同，轻链包含可变区和恒定区。存在两种不同类型的轻链，κ和λ，其在本文中被称为“免疫球蛋白轻链恒定结构域”。一对轻链可以与一对任一种的各种重链结合，形成免疫球蛋白分子。在轻链的意义中还涵盖了具有与κ恒定区(C-κ)相连的λ可变区(V-λ)或与λ恒定区(C-λ)相连的κ可变区(V-κ)的轻链。

术语“抗体变体”当在本文中使用时，是指在重链和/或轻链中具有单个或多个突变的抗体。在某些实施方案中，突变存在于可变区中。在某些实施方案中，突变存在于恒定区中。

当在本文中使用时，“核酸”或“多核苷酸”或语法等价物是指共价连接在一起的至少两个核苷酸。核酸和多核苷酸是任何长度的聚合物，包括例如200、300、500、1000、2000、3000、5000、7000、10,000等。本文描述的核酸一般含有磷酸二酯键，尽管在某些情况下包括了可以具有至少一个不同键例如氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或O-甲基氨基磷酸酯键以及肽核酸骨架和键的核酸类似物。可以制造天然存在的核酸和类似物的混合物；或者，可以制造不同核酸类似物的混合物以及天然存在的核酸和类似物的混合物。

当在本文中使用时，术语“多肽”是指氨基酸残基的聚合物。当在本文中使用时，术语“多肽”包含蛋白、肽和异聚蛋白。术语多肽还适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在氨基酸的人造化学模拟物的聚合物，以及含有修饰残基的天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。在本发明的情形中，术语“多肽”涵盖异聚蛋白，例如抗体(例如全长抗体)。

本文中使用的“异聚蛋白”是指具有至少两个多肽链的蛋白，其中至少两个多肽链彼此不同。例如，异聚蛋白可以是具有轻链和重链的抗体。在某些实施方案中，异聚蛋白是T细胞受体。在某些实施方案中，异聚蛋白是本文所述的抗体样肽体(peptibody)。

本文中使用的“肽体”是指其中多肽与抗体的重链或轻链恒定区的N-端融合的嵌合分子。例如，多肽可以融合到抗体重链的Fc区。或者，多肽可以融合到重链的全长恒定区。多肽也可以融合到抗体轻链的CL区。

本文中的术语“重组”多核苷酸是指正常情况下在其天然环境中不能发现的多核苷酸。应该理解，当重组多核苷酸被制造并重新导入宿主细胞或生物体后，它将非重组地复制，即使用宿主细胞的体内细胞机制而不是体外操作；然而，这种核酸一旦重组产生后，尽管随后非重组地复制，但出于本发明的目的仍被当作是重组的。

术语“重组多肽”是使用重组技术、例如通过如上所述的重组核酸的表达所制造的多肽。

术语“异源的”当用于指称核酸的部分时，表示核酸包含两个或多个正常情况下彼此不能发现相同的关系的子序列。例如，核酸典型通过重组产生，使得两个或多个来自于例如不相关基因的序列、例如来自一个来源的启动子和来自另一个来源的编码区进行排列以制造新功能性核酸。同样地，异源蛋白经常是指两个或多个彼此不能发现相同关系的子序列，例如融合蛋白。

“启动子”典型是一批指导核酸转录的核酸控制序列。当在本文中使用时，启动子包括转录起始位点附近的必需核酸序列，例如II型聚合酶启动子情况下的TATA元件。启动子还任选包括远处的增强子或阻遏子元件，其可位于距转录起始位点多达几千碱基对的位置。“组成型”启动子是在大多数环境和发育条件下有活性的启动子。“诱导型”启动子是在环境或发育调控下有活性的启动子。

“可操作连接的”是指两个或多个组分的并置，其中所描述的组分处于允许它们以所打算的方式起作用的关系下。例如，启动子和/或增强子如果以顺式起作用控制或调节相连编码序列的转录，则其与编码序列是可操作连接的。一般来说，但不是必需地，“可操作连接的”DNA序列是邻接的，在需要连接两个蛋白编码区时或在分泌前导区的情况下，是邻接并且同阅读框的。然而，尽管可操作连接的启动子一般位于编码序列的上游，但它不是必需与其邻接的。聚腺苷化位点如果位于编码序列的下游末端，使得转录经过编码序列进入聚腺苷化序列，则聚腺苷化位点与编码序列可操作连接。连接通过本技术领域已知的重组方法实现，例如使用PCR方法、通过退火、或通过在方便的限制性位点连接。如果不存在方便的限制性位点，那么按照常规实践使用合成的寡核苷酸适配体或接头。

当在本文中使用时，术语“转染”或“转化”或“转导”是指将外源核酸转移或导入到宿主细胞中的过程。转化的细胞包括对象的初级细胞及其后代。宿主细胞可以是细菌、酵母、哺乳动物细胞和植物细胞。

当在本文中使用时，“细胞表面束缚结构域(tether domain)”是指赋予多肽与宿主细胞外膜相连的能力的氨基酸序列，并且其有时不总是天然存在于目标蛋白中。正如在本文中所述，细胞表面束缚结构域包括例如跨膜结构域或糖基化磷脂酰肌醇(GPI)信号序列。

当在本文中使用时，术语“表达载体”是指自我复制的多核苷酸，并且在本发明中，包含表达构建物。表达载体将包含至少一个复制原点(也称为“复制起点”)。复制原点赋予在宿主中复制的能力，并可以是病毒、真核或原核生物的。表达载体可用于稳定或瞬时转染真核细胞系，或可用于原核细胞的转化。表达载体可以存在于瞬时转染体中的染色体之外。在稳定转染体中，表达载体可以作为游离体载体繁殖，或者可以整合到宿主细胞染色体中。本发明的表达载体可以进一步包含至少一个选择性标记基因，以便于原核或真核转染体的识别。当在本文中使用时，表达载体可以包括真核和原核的复制起点。

当在本文中使用时，术语“信号肽”是指介导蛋白通过包围ER的膜插入的疏水序列。I型跨膜蛋白也包含信号序列。当在本文中使用时，“信号序列”是氨基端疏水序列，其通常在一部分或整个蛋白通过ER膜插入到ER腔中之后被酶切除。因此，在本技术领域中已知序列的信号前体形式可以作为蛋白前体形式的一部分存在，但是在蛋白的成熟形式中一般不存在。当蛋白被称为包含信号序列时，应该理解为尽管蛋白的前体形式包含信号序列，但蛋白的成熟形式将可能不包含信号序列。在哺乳动物细胞中有功能的信号肽或序列的实例包括下列：美国专利No.4,965,195中描述的白介素-7(IL-7)的信号序列；Cosman等((1984)，Nature 312：768)中描述的白介素-2受体的信号序列；欧洲专利No.0 367 566中描述的白介素-4受体的信号肽；美国专利No.4,968,607中描述的I型白介素-1受体的信号序列；欧洲专利No.0 460 846中描述的II型白介素-1受体的信号肽；人类IgG的信号序列(其是METDTLLLWVLLLWVPGSTG)；以及人类生长激素的信号序列(MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA)。许多其他信号序列在本技术领域中是已知的。在某些实施方案中，信号肽可以是目标蛋白的天然存在的信号肽，或者它可以是异源信号肽。

术语“结合配偶体”在本文中以其最广的含义使用，是指两个或多个在体外/体内条件下能够互相结合的多肽序列。这种结合配偶体的实例包括但不限于抗体与抗原、配体与受体、酶与底物。

当在本文中使用时，除非另有指明，否则不带具体数量指称的名词可以是指单数或复数(即可以是指一个或多个)。

本发明的方法

本发明提供了筛选哺乳动物展示文库的方法，其包括编码具有所需性质的多肽的多核苷酸的筛选方法、编码具有所需性质的多肽的多核苷酸的富集方法、含有编码具有所需性质的多肽的多核苷酸的哺乳动物细胞的分离方法、含有编码具有所需性质的多肽的多核苷酸的哺乳动物细胞的筛选方法、具有所需性质的多肽的鉴定方法以及获得具有所需性质的多肽的方法。方法一般需要将从以前的文库筛选中回收的哺乳动物细胞亚群提取的mRNA反转录成cDNA并扩增所述cDNA，以产生多核苷酸的子文库。该步骤可以重复一次或多次。

在某些实施方案中，本发明提供的方法包含：a)从用多核苷酸的初级文库转染(例如瞬时转染)的哺乳动物细胞的初始群体中筛选出展示具有所需性质的多肽的细胞，并回收哺乳动物细胞亚群；b)将从所述哺乳动物细胞亚群提取的mRNA反转录成cDNA并扩增所述cDNA，以产生多核苷酸的子文库；c)从用多核苷酸的子文库转染的哺乳动物细胞群体中筛选出展示具有所需性质的多肽的细胞，并回收哺乳动物细胞的第二个亚群。在某些实施方案中，将步骤b)和c)重复一次以上。在某些实施方案中，方法包含：a)将从哺乳动物细胞亚群提取的mRNA反转录成cDNA并扩增所述cDNA，以产生多核苷酸子文库，其中细胞亚群通过从用多核苷酸的初级文库转染(例如瞬时转染)的哺乳动物细胞初始群体中筛选出展示具有所需性质的多肽的细胞来获得；b)从用多核苷酸子文库转染的哺乳动物细胞群体中筛选出展示具有所需性质的多肽的细胞，并回收哺乳动物细胞的第二个亚群。在某些实施方案中，方法包含从用多核苷酸子文库转染的哺乳动物细胞群体中筛选出展示具有所需性质的多肽的细胞，并回收哺乳动物细胞亚群，其中子文库通过将从哺乳动物细胞的中间群体提取的mRNA反转录成cDNA并扩增所述cDNA以产生多核苷酸子文库来产生，其中细胞的中间群体通过从用多核苷酸的初级文库转染(例如瞬时转染)的哺乳动物细胞初始群体中筛选出展示具有所需性质的多肽的细胞来获得。在某些实施方案中，多肽是异聚蛋白。在某些实施方案中，多肽是抗体。

在某些实施方案中，本发明提供了编码具有所需性质的多肽的多核苷酸的分离方法，所述方法包含：a)从用多核苷酸的初级文库转染(例如瞬时转染)的哺乳动物细胞的初始群体中筛选出展示具有所需性质的多肽的细胞，并回收哺乳动物细胞亚群；b)将从所述哺乳动物细胞亚群提取的mRNA反转录成cDNA并扩增所述cDNA，以产生多核苷酸的子文库；c)从用多核苷酸的子文库转染的哺乳动物细胞群体中筛选出展示具有所需性质的多肽的细胞，并回收哺乳动物细胞的第二个亚群；以及d)从所述哺乳动物细胞的第二个亚群分离出编码具有所需性质的多肽的多核苷酸。在某些实施方案中，初级文库中的多核苷酸编码至少10⁹种不同多肽。在某些实施方案中，哺乳动物细胞的初始群体在群体中的各个哺乳动物细胞能够摄取约100个以上、例如约10³、10⁴、10⁵或10⁶个中的任一个数量以上的不同多核苷酸拷贝的条件下，用初级文库进行瞬时转染。在某些实施方案中，步骤c)中的筛选条件比步骤a)的条件更严紧。

在某些实施方案中，在步骤d)之前将步骤b)和c)重复至少一次。在某些实施方案中，在步骤d)之前将步骤b)和c)重复不超过约3次。在某些实施方案中，方法还包含将多核苷酸的初级文库转染(例如瞬时转染)到哺乳动物细胞的初始群体中。在某些实施方案中，步骤b)还包含将所述多核苷酸子文库转染(例如瞬时转染)到哺乳动物细胞中。在某些实施方案中，步骤b)中cDNA的扩增通过PCR执行。在某些实施方案中，cDNA使用一组引物通过PCR扩增。

在步骤b)和c)被重复至少一次的某些实施方案中，后面步骤中的测定条件可以比前面步骤中的条件更严紧。在方法的后面步骤中高严紧性的筛选条件允许多核苷酸在后来的哺乳动物细胞亚群中进一步富集并便于分离。

在某些实施方案中，提供了编码具有所需性质的多肽的多核苷酸的分离方法，所述方法包含：a)将从哺乳动物细胞亚群提取的mRNA反转录成cDNA并扩增所述cDNA，以产生多核苷酸的子文库，其中细胞亚群通过从用多核苷酸的初级文库转染(例如瞬时转染)的哺乳动物细胞初始群体中筛选出展示具有所需性质的多肽的细胞来获得；b)从用多核苷酸子文库转染的哺乳动物细胞群体中筛选出展示具有所需性质的多肽的细胞，并回收哺乳动物细胞的第二个亚群；以及c)从所述哺乳动物细胞的第二个亚群分离出编码具有所需性质的多肽的多核苷酸。

在某些实施方案中，提供了编码具有所需性质的多肽的多核苷酸的分离方法，所述方法包含：a)从用多核苷酸子文库转染的哺乳动物细胞群体中筛选出展示具有所需性质的多肽的细胞，并回收哺乳动物细胞的亚群，其中子文库通过将从哺乳动物细胞的中间群体提取的mRNA反转录成cDNA并扩增所述cDNA以产生多核苷酸子文库来产生，其中细胞的中间群体通过从用多核苷酸的初级文库转染(例如瞬时转染)的哺乳动物细胞初始群体中筛选出展示具有所需性质的多肽的细胞来获得；以及b)从所述哺乳动物细胞亚群分离出编码具有所需性质的多肽的多核苷酸。

在某些实施方案中，提供了筛选哺乳动物展示文库的方法，其中方法包含：a)从用多核苷酸的初级文库转染(例如瞬时转染)的哺乳动物细胞的初始群体中筛选出展示具有所需性质的多肽的细胞，并回收哺乳动物细胞亚群；b)将从所述哺乳动物细胞亚群提取的mRNA反转录成cDNA并扩增所述cDNA，以产生多核苷酸的子文库；c)从用多核苷酸的子文库转染的哺乳动物细胞群体中筛选出展示具有所需性质的多肽的细胞，并回收哺乳动物细胞的第二个亚群。在某些实施方案中，提供了筛选哺乳动物展示文库的方法，其中方法包含：a)将从哺乳动物细胞亚群提取的mRNA反转录成cDNA并扩增所述cDNA，以产生多核苷酸子文库，其中细胞亚群通过从用多核苷酸的初级文库转染(例如瞬时转染)的哺乳动物细胞初始群体中筛选出展示具有所需性质的多肽的细胞来获得；b)从用多核苷酸子文库转染的哺乳动物细胞群体中筛选出展示具有所需性质的多肽的细胞，并回收哺乳动物细胞的第二个亚群。在某些实施方案中，提供了筛选哺乳动物展示文库的方法，其中方法包含从用多核苷酸子文库转染的哺乳动物细胞群体中筛选出展示具有所需性质的多肽的细胞，并回收哺乳动物细胞亚群，其中子文库通过将从哺乳动物细胞的中间群体提取的mRNA反转录成cDNA并扩增所述cDNA以产生多核苷酸子文库来产生，其中细胞的中间群体通过从用多核苷酸的初级文库转染(例如瞬时转染)的哺乳动物细胞初始群体中筛选出展示具有所需性质的多肽的细胞来获得。

在某些实施方案中，所需性质是与结合配偶体的特异性结合。例如，在某些实施方案中，提供了编码识别结合配偶体的多肽的多核苷酸的分离方法，所述方法包含：a)从用多核苷酸的初级文库转染(例如瞬时转染)的哺乳动物细胞的初始群体中筛选出展示识别结合配偶体的多肽的细胞，并回收哺乳动物细胞的亚群；b)将从所述哺乳动物细胞亚群提取的mRNA反转录成cDNA并扩增所述cDNA，以产生多核苷酸的子文库；c)从用多核苷酸的子文库转染的哺乳动物细胞群体中筛选出展示识别结合配偶体的多肽的细胞，并回收哺乳动物细胞的第二个亚群；以及d)从所述哺乳动物细胞的第二个亚群分离编码具有所需性质的多肽的多核苷酸。在某些实施方案中，步骤a)包含：i)将哺乳动物细胞的初始群体与结合配偶体相接触；以及ii)回收与结合配偶体结合的哺乳动物细胞亚群。在某些实施方案中，步骤c)包含：i)将哺乳动物细胞群体与结合配偶体相接触；以及ii)回收与结合配偶体结合的哺乳动物细胞亚群。在某些实施方案中，步骤c)中的结合条件比步骤a)中的更严紧。在步骤b)和c)被重复至少一次的某些实施方案中，后面步骤中的结合条件比前面步骤中的条件更严紧。

在某些实施方案中，方法被用于分离编码异聚蛋白的多核苷酸。例如，在某些实施方案中，提供了编码具有所需性质的异聚蛋白的多核苷酸的分离方法，所述方法包含：a)从哺乳动物细胞的初始群体中筛选出展示具有所需性质的异聚蛋白的细胞，并回收哺乳动物细胞的亚群，其中将哺乳动物细胞的初始群体用编码第一种多肽和第二种多种的多核苷酸的初级文库进行转染(例如瞬时转染)，并且其中第一种多肽与第二种多肽在细胞表面上形成异聚蛋白；b)将从所述哺乳动物细胞亚群提取的mRNA反转录成cDNA并扩增所述cDNA，以产生多核苷酸的子文库；c)从随后的哺乳动物细胞群体中筛选出展示具有所需性质的异聚蛋白的细胞，并回收哺乳动物细胞的第二个亚群，其中将所述随后的哺乳动物细胞群体用编码第一种多肽和第二种多肽的多核苷酸的子文库进行转染，并且其中第一种多肽与第二种多肽形成异聚蛋白；以及d)从所述哺乳动物细胞的第二个亚群分离出编码具有所需性质的多肽的多核苷酸。

编码异聚蛋白中不同多肽的多核苷酸可以存在于单一载体中(例如双盒表达载体)或分开的载体上。因此，在某些实施方案中，上面描述的方法中的步骤a)包含对用编码第一种多肽的第一个多核苷酸初级文库和编码第二种多肽的第二个初级文库转染的哺乳动物细胞初始群体进行筛选。在某些实施方案中，方法还包含将编码第一种多肽的第一个初级文库和编码第二种多肽的第二个初级文库转染到哺乳动物细胞的初始群体中，其中第一种多肽和第二种多肽在细胞表面上形成异聚蛋白。在某些实施方案中，第一个初级文库和第二个初级文库一起编码了至少10⁹种不同的异聚蛋白。在某些实施方案中，上面描述的方法中的步骤b)包含扩增所述cDNA以产生编码第一种多肽的第一个多核苷酸子文库和编码第二种多肽的第二个多核苷酸子文库。在某些实施方案中，步骤b)还包含将两个多核苷酸子文库转染到哺乳动物细胞群体中。在某些实施方案中，步骤a)和步骤c)都涉及用两种(或多种)不同的多核苷酸文库转染的哺乳动物细胞。正如在下面更详细讨论的，可以使用两个不同的引物组来分别扩增编码第一种多肽的多核苷酸和编码第二种多肽的多核苷酸，从而允许将这些多核苷酸克隆到不同载体中。

在不同水平的筛选循环中使用不同的多核苷酸文库，增加了展示在哺乳动物细胞上的异聚蛋白的多样性。例如，通过使用多样性为10⁴的第一个初级文库和多样性为10⁵的第二个初级文库，可以呈递在哺乳动物细胞表面上的不同异聚蛋白的总数将为至少10⁹。如果异聚蛋白可以具有两种以上不同的多肽链，多样性可能甚至更高。同样地，使用第一个子文库和第二个子文库允许进行改组。例如，通过将第一个子文库与第二个子文库相组合，可以在异聚蛋白中产生多肽的新组合。这可以允许产生具有更好的所需性质的异聚蛋白。

本技术领域的普通专业人员可以理解，当步骤b)和c)被重复至少一次时，一轮RT-PCR能够产生两个或多个多核苷酸子文库，而另一轮RT-PCR能够产生多核苷酸的单一子文库。例如，尽管在筛选的早期阶段期间适宜使用不同的载体以增加多样性，但在后面轮的筛选中有时优选使用编码第一种多肽和第二种多肽两者的单一载体，以便最终分离到的多核苷酸将能编码这两种所需多肽。例如，在某些实施方案中，提供了编码具有所需性质的异聚蛋白的多核苷酸的分离方法，所述方法包含：a)从哺乳动物细胞的初始群体中筛选出展示具有所需性质的异聚蛋白的细胞并获得哺乳动物细胞的亚群，其中将哺乳动物细胞的初始群体用编码第一种多肽和第二种多肽的多核苷酸的初级文库进行转染(例如瞬时转染)，并且其中第一种多肽和第二种多肽在细胞表面上形成异聚蛋白；b)将从所述哺乳动物细胞亚群提取的mRNA反转录成cDNA并扩增所述cDNA，以产生编码第一种多肽的第一个多核苷酸子文库和编码第二种多肽的第二个多核苷酸子文库；c)从随后的哺乳动物细胞群体中筛选出展示具有所需性质的异聚蛋白的细胞并回收哺乳动物细胞的第二个亚群，其中将所述随后的哺乳动物细胞群体用编码第一种多肽的第一个多核苷酸子文库和编码第二种多肽的第二个多核苷酸子文库进行转染，其中第一种多肽和第二种多肽形成异聚蛋白；d)将从所述哺乳动物细胞的第二个亚群提取的mRNA反转录成cDNA并扩增所述cDNA，以产生编码第一种多肽和第二种多肽的第三个多核苷酸子文库；e)从用第三个子文库转染的哺乳动物细胞群体中筛选出展示具有所需性质的异聚蛋白的细胞，并回收哺乳动物细胞的第三个亚群；以及f)从所述哺乳动物细胞的第三个亚群分离出编码具有所需性质的异聚蛋白的多核苷酸。

正如在本文中进一步讨论的，在某些实施方案中，展示在哺乳动物细胞表面上的多肽可以部分或完全从哺乳动物细胞释放。这允许在功能研究中对多肽进行进一步分析。

本文中描述的方法可应用于任何种类的多肽的筛选，并且特别适合于筛选异聚蛋白。方法特别适合于例如生产蛋白复合物，例如抗体、T-细胞受体、I类和II类MHC分子、整合蛋白、CD8、CD28和VIII因子分子。

还设想了筛选具有所需性质的新异聚蛋白的系统和方法。在某些实施方案中，将不同多肽与二聚化结构域融合，并允许配成对以形成异聚蛋白。通过按照本文描述的方法，可以鉴定具有所需性质的异聚蛋白。因此，在某些实施方案中，提供了包含异源多肽与二聚化结构域融合的融合蛋白。在某些实施方案中，融合蛋白还包含膜束缚结构域。二聚化结构域可以是抗体恒定区。例如，在某些实施方案中，提供了抗体样肽体，即包含多肽与轻链恒定区融合和多肽与重链恒定区融合的多聚体肽体，其中重链和轻链恒定区二聚化以产生抗体样分子。例如，在某些实施方案中，抗体样肽体含有两个多肽与轻链恒定区融合的和两个多肽与重链恒定区融合。抗体样肽体中的多肽可以是不同或相同的。

在下面的部分中，提供了对抗体的详细描述。然而，本技术领域的普通专业人员应该理解，该描述同样适用于其他类型的多肽。因此，例如，关于抗体轻链和重链的讨论同等地适用于T细胞受体的α和β链，或抗体样肽体的不同多肽链。还应该理解，在某些实施方案中，下面的描述也可以适用于抗体片段(包括Fab、Fab′、Fd、Fd′、Fv、dAb、分离的CDR区；F(ab′)₂、scFv)、双抗体、线性抗体和嵌合抗体。

同样地，尽管下面提供的描述聚焦于分离编码特异性识别抗原的抗体的多核苷酸，但方法同等地适用于分离编码具有其他所需性质的多肽(例如抗体)的多核苷酸，所述的其他所需性质包括例如与配偶体特异性结合、对结合配偶体更高的结合亲和性、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)、激动剂或拮抗剂功能、凋亡的诱导或抑制、血管发生、增殖、信号传导途径抑制的活化。多种性质可以同时或独立地进行筛选。用于这些所需性质的测定方法在本技术领域中是已知的。

筛选抗体的方法

本部分更详细描述了筛选哺乳动物抗体展示文库的方法。方法包括但不限于编码具有所需性质(例如与抗原特异性结合)的抗体的多核苷酸的筛选方法、编码具有所需性质(例如与抗原特异性结合)的抗体的多核苷酸的富集方法、含有编码具有所需性质(例如与抗原特异性结合)的抗体的多核苷酸的哺乳动物细胞的分离方法、含有编码具有所需性质(例如与抗原特异性结合)的抗体的多核苷酸的哺乳动物细胞的筛选方法、具有所需性质(例如与抗原特异性结合)的抗体的鉴定方法、以及获得具有所需性质(例如与抗原特异性结合)的抗体的方法。

在某些实施方案中，方法包含：a)从用抗体的初级文库转染(例如瞬时转染)的哺乳动物细胞初始群体中筛选出展示具有所需性质(例如与抗原特异性结合)的抗体的细胞，并回收哺乳动物细胞亚群；b)将从所述哺乳动物细胞亚群提取的mRNA反转录成cDNA并扩增所述cDNA，以产生抗体的子文库；c)从用所述多核苷酸子文库转染的哺乳动物细胞群体中筛选出展示具有所需性质(例如与抗原特异性结合)的抗体的细胞，并回收哺乳动物细胞的第二个亚群。在某些实施方案中，步骤b)和c)重复一次以上。在某些实施方案中，方法包含：a)将从哺乳动物细胞亚群提取的mRNA反转录成cDNA并扩增所述cDNA，以产生抗体的子文库，其中所述细胞亚群通过从用多核苷酸初级文库转染(例如瞬时转染)的哺乳动物细胞原始群体中筛选出展示具有所需性质(例如与抗原特异性结合)的抗体的细胞来获得；b)从用多核苷酸子文库转染的哺乳动物细胞群体中筛选出展示具有所需性质(例如与抗原特异性结合)的抗体的细胞，并回收哺乳动物细胞的第二个亚群。在某些实施方案中，方法包含从用多核苷酸子文库转染的哺乳动物细胞群体中筛选出展示具有所需性质(例如与抗原特异性结合)的抗体的细胞，并回收哺乳动物细胞亚群，其中子文库通过将从哺乳动物细胞的中间群体提取的mRNA反转录成cDNA并扩增所述cDNA以产生多核苷酸的子文库来产生，其中细胞的中间群体通过从用多核苷酸初级文库转染(例如瞬时转染)的哺乳动物细胞原始群体中筛选出展示具有所需性质(例如与抗原特异性结合)的抗体的细胞来获得。在某些实施方案中，多肽是全长抗体。

在某些实施方案中，提供了编码特异性识别抗原的抗体的多核苷酸的分离方法，所述方法包含：a)从用编码抗体的多核苷酸的初级文库转染(例如瞬时转染)的哺乳动物细胞原始群体中筛选出展示特异性识别抗原的抗体的细胞，并回收哺乳动物细胞亚群；b)将从所述哺乳动物细胞亚群提取的mRNA反转录成cDNA并扩增所述cDNA，以产生多核苷酸的子文库；c)从用所述多核苷酸子文库转染的哺乳动物细胞群体中筛选出展示特异性识别抗原的抗体的细胞，并回收哺乳动物细胞的第二个亚群；以及d)从所述哺乳动物细胞的第二个亚群分离出编码特异性识别抗原的抗体的多核苷酸。在某些实施方案中，初级文库中的多核苷酸编码至少10⁹种不同抗体。

在某些实施方案中，在步骤d)之前将步骤b)和c)重复至少一次。在某些实施方案中，在步骤d)之前将步骤b)和c)重复不超过约3次。在某些实施方案中，方法还包含将多核苷酸初级文库转染到哺乳动物细胞的原始群体中。在某些实施方案中，步骤b)还包含将所述多核苷酸子文库转染到哺乳动物细胞中。

在某些实施方案中，步骤a)包含：i)将哺乳动物细胞的原始群体与抗原相接触，以及ii)回收与抗原结合的哺乳动物细胞亚群。在某些实施方案中，步骤c)包含：i)将哺乳动物细胞群体与抗原相接触，以及ii)回收与抗原结合的哺乳动物细胞亚群。在某些实施方案中，步骤c)中用于抗原结合的条件比步骤a)中的更严紧。在某些实施方案中，当步骤b)和c)被重复至少一次时，在后面步骤中用于结合的条件比前面步骤中的更严紧。

在某些实施方案中，提供了分离特异性识别抗原的抗体的方法，所述方法包含：a)将从哺乳动物细胞亚群提取的mRNA反转录成cDNA并扩增所述cDNA，以产生多核苷酸的子文库，其中细胞亚群通过从用多核苷酸初级文库转染(例如瞬时转染)的哺乳动物细胞原始群体中筛选出展示特异性识别抗原的抗体的细胞来获得；b)从用多核苷酸子文库转染的哺乳动物细胞群体中筛选出展示特异性识别抗原的抗体的细胞，并回收哺乳动物细胞的第二个亚群；以及c)从所述哺乳动物细胞的第二个亚群分离出编码特异性识别抗原的抗体的多核苷酸。

在某些实施方案中，提供了编码特异性识别抗原的抗体的多核苷酸的分离方法，所述方法包含a)从用多核苷酸子文库转染的哺乳动物细胞群体中筛选出展示特异性识别抗原的抗体的细胞，并回收哺乳动物细胞亚群，其中子文库通过将从哺乳动物细胞的中间群体提取的mRNA反转录成cDNA并扩增所述cDNA以产生多核苷酸的子文库来产生，其中细胞的中间群体通过从用多核苷酸初级文库转染(例如瞬时转染)的哺乳动物细胞原始群体中筛选出展示特异性识别抗原的抗体的细胞来获得，以及b)从所述哺乳动物细胞亚群分离出编码特异性识别抗原的抗体的多核苷酸。

在某些实施方案中，提供了筛选哺乳动物展示文库的方法，其中方法包含：a)从用抗体的初级文库转染(例如瞬时转染)的哺乳动物细胞原始群体中筛选出展示特异性识别抗原的抗体的细胞，并回收哺乳动物细胞亚群；b)将从所述哺乳动物细胞亚群提取的mRNA反转录成cDNA并扩增所述cDNA，以产生多核苷酸的子文库；c)从用所述多核苷酸子文库转染的哺乳动物细胞群体中筛选出展示特异性识别抗原的抗体的细胞，并回收哺乳动物细胞的第二个亚群。在某些实施方案中，提供了筛选哺乳动物展示文库的方法，其中方法包含：a)将从哺乳动物细胞亚群提取的mRNA反转录成cDNA并扩增所述cDNA，以产生多核苷酸的子文库，其中细胞亚群通过从用多核苷酸初级文库转染(例如瞬时转染)的哺乳动物细胞原始群体中筛选出展示特异性识别抗原的抗体的细胞来获得；b)从用多核苷酸子文库转染的哺乳动物细胞群体中筛选出展示特异性识别抗原的抗体的细胞，并回收哺乳动物细胞的第二个亚群。在某些实施方案中，提供了筛选哺乳动物展示文库的方法，其中方法包含从用多核苷酸子文库转染的哺乳动物细胞群体中筛选出展示特异性识别抗原的抗体的细胞，并回收哺乳动物细胞亚群，其中子文库通过将从哺乳动物细胞的中间群体提取的mRNA反转录成cDNA并扩增所述cDNA以产生多核苷酸的子文库来产生，其中细胞的中间群体通过从用多核苷酸初级文库转染(例如瞬时转染)的哺乳动物细胞原始群体中筛选出展示特异性识别抗原的抗体的细胞来获得。

在某些实施方案中，提供了编码特异性识别抗原的抗体的多核苷酸的分离方法，所述方法包含：a)从用编码轻链和重链的多核苷酸初级文库转染(例如瞬时转染)的哺乳动物细胞原始群体中筛选出展示特异性识别抗原的抗体的细胞，并回收哺乳动物细胞亚群；b)将从所述哺乳动物细胞亚群提取的mRNA反转录成cDNA并扩增所述cDNA，以产生多核苷酸的子文库；c)从用编码轻链和重链的多核苷酸子文库转染的哺乳动物细胞群体中筛选出展示特异性识别抗原的抗体的细胞，并回收哺乳动物细胞的第二个亚群；以及d)从所述哺乳动物细胞的第二个亚群分离出编码特异性识别抗原的抗体的多核苷酸。

在某些实施方案中，提供了编码特异性识别抗原的抗体的多核苷酸的分离方法，所述方法包含：a)从用编码轻链的第一个多核苷酸初级文库和编码重链的第二个多核苷酸初级文库转染(例如瞬时转染)的哺乳动物细胞原始群体中筛选出展示特异性识别抗原的抗体的细胞，并回收哺乳动物细胞亚群；b)将从所述哺乳动物细胞亚群提取的mRNA反转录成cDNA并扩增所述cDNA，以产生多核苷酸的子文库；c)从用编码轻链和重链的多核苷酸子文库转染的哺乳动物细胞群体中筛选出展示特异性识别抗原的抗体的细胞，并回收哺乳动物细胞的第二个亚群；以及d)从所述哺乳动物细胞的第二个亚群分离出编码特异性识别抗原的抗体的多核苷酸。在某些实施方案中，第一个初级文库和第二个初级文库允许在细胞表面上表达和展示至少10⁹种不同抗体。

在某些实施方案中，提供了编码特异性识别抗原的抗体的多核苷酸的分离方法，所述方法包含：a)从用编码轻链的第一个多核苷酸初级文库和编码重链的第二个多核苷酸初级文库转染的哺乳动物细胞原始群体中筛选出展示特异性识别抗原的抗体的细胞，并回收哺乳动物细胞亚群；b)将从所述哺乳动物细胞亚群提取的mRNA反转录成cDNA并扩增所述cDNA，以产生编码轻链的第一个多核苷酸子文库和编码重链的第二个多核苷酸子文库；c)从用第一个多核苷酸子文库和第二个多核苷酸子文库转染的哺乳动物细胞群体中筛选出展示特异性识别抗原的抗体的细胞，并回收哺乳动物细胞亚群；以及d)从所述哺乳动物细胞的第二个亚群分离出编码特异性识别抗原的抗体的多核苷酸。

在某些实施方案中，提供了编码特异性识别抗原的抗体的多核苷酸的分离方法，所述方法包含：a)从用编码轻链的第一个多核苷酸初级文库和编码重链的第二个多核苷酸初级文库转染(例如瞬时转染)的哺乳动物细胞原始群体中筛选出展示特异性识别抗原的抗体的细胞，并回收哺乳动物细胞亚群；b)将从所述哺乳动物细胞亚群提取的mRNA反转录成cDNA并扩增所述cDNA，以产生编码轻链的第一个多核苷酸子文库和编码重链的第二个多核苷酸子文库；c)从用第一个多核苷酸子文库和第二个多核苷酸子文库转染(例如瞬时转染)的哺乳动物细胞群体中筛选出展示特异性识别抗原的抗体的细胞，并回收哺乳动物细胞的第二个亚群；d)将从所述哺乳动物细胞的第二个亚群提取的mRNA反转录成cDNA并扩增所述cDNA，以产生编码轻链和重链的第三个多核苷酸子文库；e)从用第三个多核苷酸子文库转染(例如瞬时转染)的哺乳动物细胞群体中筛选出展示特异性识别抗原的抗体的细胞，并回收哺乳动物细胞的第三个亚群；以及f)从所述哺乳动物细胞的第三个亚群分离出编码特异性识别抗原的抗体的多核苷酸。

编码抗体的多核苷酸初级文库

本文提供的方法适合于本技术领域已知的任何哺乳动物展示文库。或者，可以使用本文描述的方法构建初级文库(特别是高复杂度初级文库)。在某些实施方案中，初级文库是未接触过抗原的抗体文库。在某些实施方案中，初级文库是从用抗原免疫接种的个体产生的抗体文库。在某些实施方案中，初级文库是人类抗体文库。在某些实施方案中，初级文库是编码人源化抗体的多核苷酸的文库。在某些实施方案中，初级文库是嵌合抗体文库。在某些实施方案中，初级文库是来自其他哺乳动物物种、包括但不限于小鼠、兔、山羊和马的抗体文库。在某些实施方案中，初级文库从任何免疫组织产生，所述组织包括例如骨髓、脾脏、淋巴结、淋巴细胞。在某些实施方案中，初级文库是合成的。

在某些实施方案中，初级文库包含编码抗体轻链的第一个多核苷酸初级文库和编码抗体重链的第二个多核苷酸初级文库。在某些实施方案中，由多核苷酸编码的重链的3’末端与细胞表面束缚结构域融合。细胞表面束缚结构域可以是任何跨膜结构域或膜连接序列。适合的细胞表面束缚结构域包括但不限于PDGFR跨膜结构域、B7-1跨膜结构域、唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)跨膜结构域。在某些实施方案中，细胞表面束缚结构域是GPI信号序列，其引导免疫球蛋白通过GPI接头锚定到细胞表面上。在某些实施方案中，GPI信号序列来自于人类DAF。在某些实施方案中，十四烷基化序列可以用作细胞表面束缚结构域。

本技术领域中已知的大多数抗体文库含有scFV片段，或使用单一载体在双盒中表达重链和轻链两者。建立如同在噬菌体展示中那样多样性为10⁹的scFV文库是可行的。按照使用噬菌体展示所显示的，有可能建立多样性为10⁹的scFV文库以在细菌中表达Fab，尽管更加困难和耗时。能够做到建立多样性为10⁷的双盒表达文库以在哺乳动物细胞中表达全长抗体，尽管与噬菌体展示文库相比要更加困难得多。然而，由于筛选哺乳动物细胞展示文库的难度，多样性为10⁹或更大的哺乳动物展示文库还没有市售的。

本发明的方法使得筛选多样性等于或高于10⁹的哺乳动物展示文库成为可能，从而提供了制造具有这样的高多样性哺乳动物展示文库的理由。因此，本发明还提供了构建编码抗体的多核苷酸文库的方法，其中多核苷酸总计编码至少约10⁹、包括例如至少约10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³、10¹⁴或10¹⁵种不同重组抗体。文库中的每个多核苷酸可以编码轻链和重链两者。或者，可以将编码轻链的第一个多核苷酸文库与编码重链的第二个多核苷酸文库相组合。一旦转染到哺乳动物细胞中之后，重链和轻链可以在细胞内配对，从而产生高度多样性的不同抗体。因此，在某些实施方案中，提供了构建编码抗体的多核苷酸文库的方法，所述方法包含将轻链文库与重链文库相组合，以使多核苷酸总计编码至少约10⁹种不同重组抗体。

在某些实施方案中，初级文库源自于单一个体。因此，在某些实施方案中，提供了编码来自单一个体的抗体的多核苷酸文库的构建方法，其中多核苷酸总计编码至少约10⁹、包括例如至少约10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³、10¹⁴或10¹⁵种不同重组抗体。因此，在某些实施方案中，提供了编码来自单一个体的抗体的多核苷酸文库的构建方法，所述方法包含将个体的轻链文库与个体的重链文库相组合，以使多核苷酸总计编码至少约10⁹种不同重组抗体。

在某些实施方案中，多核苷酸存在于质粒载体中。在某些实施方案中，提供了在表面上展示至少约10⁹、包括例如至少约10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³、10¹⁴或10¹⁵种不同重组抗体的哺乳动物细胞群体。在某些实施方案中，提供了用多核苷酸文库瞬时转染的哺乳动物细胞群体，其中多核苷酸总计编码至少约10⁹、包括例如至少约10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³、10¹⁴或10¹⁵种不同重组抗体。在某些实施方案中，提供了用编码抗体轻链的第一个多核苷酸文库和编码抗体重链的第二个多核苷酸文库瞬时转染的哺乳动物细胞群体，其中多核苷酸总计编码至少约10⁹、包括例如至少约10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³、10¹⁴或10¹⁵种不同重组抗体。在某些实施方案中，提供了从上述哺乳动物细胞群体中筛选出编码具有所需性质(例如与抗原特异性结合)的抗体的多核苷酸。

此外，在本发明中提供了编码抗体样肽体的多核苷酸文库的构建方法，其中多核苷酸总计编码至少约10⁹、包括例如至少约10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³、10¹⁴或10¹⁵种不同重组肽体。在某些实施方案中，提供了在表面上展示至少约10⁹、包括例如至少约10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³、10¹⁴或10¹⁵种不同的重组抗体类肽体的哺乳动物细胞群体。在某些实施方案中，提供了用多核苷酸文库瞬时转染的哺乳动物细胞群体，其中多核苷酸总计编码至少约10⁹、包括例如至少约10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³、10¹⁴或10¹⁵种不同的重组抗体样肽体。正如上面所讨论的，尽管本文中的讨论主要聚焦于抗体，但该描述在适合时也适用于抗体样肽体。本申请还涵盖了本文中所述的抗体样肽体文库的筛选方法。

有各种各样的技术可用于有效产生免疫球蛋白文库，包括在下列文献中描述或提到的技术：《分子克隆实验室指南》(MolecularCloning；A Laboratory Manual)第三版(Maniatis，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York，2001)、《分子生物学现代方法》(CurrentProtocols in Molecular Biology)(John Wiley &amp；Sons)、美国专利No.6.403,312、美国专利申请序号09/782,004、美国专利申请序号09/927,790、美国专利申请序号10/218,102、PCT WO 01/40091和PCTWO 02/25588，其每个在此以其全文引为参考。

这样的方法包括但不限于基因装配方法、基于PCR的方法和使用PCR的变化形式的方法、基于连接酶链反应的方法、合并的寡核苷酸方法例如在合成改组中使用的方法、易错扩增方法和使用具有随机突变的寡核苷酸的方法、经典的位点定向诱变方法、盒式诱变方法以及其他扩增和基因合成方法。各种可商购的用于基因装配、诱变、载体亚克隆等的试剂盒和方法，可用于产生编码免疫球蛋白氨基酸序列的核酸。

用于在哺乳动物细胞表面上表达抗体(特别是全长抗体)的载体，可以按照本技术领域已知的方法来制备。在某些实施方案中，将编码免疫球蛋白重链恒定区的多核苷酸以其3’末端融合到编码细胞表面束缚结构域的多核苷酸上，允许将所表达的免疫球蛋白展示在哺乳动物细胞表面上。在某些实施方案中，在重链恒定区与膜束缚结构域之间存在酶切割位点，其切割允许将免疫球蛋白酶法除去，从而能够将表达的免疫球蛋白从膜结合形式转变成可溶形式。被切的抗体可以直接用于进一步功能分析，从而免去了将膜锚定形式转变成可溶形式的步骤。

在某些实施方案中，在重链恒定区与细胞表面束缚结构域之间存在弗林蛋白酶切割位点。弗林蛋白酶是一种存在于真核细胞的高尔基反面网络中的蛋白酶。它的功能是刚好在将蛋白递送到其最终细胞目的地之前的步骤中切割蛋白。弗林蛋白酶识别共有氨基酸序列RXRR(SEQ ID NO：1)、RXRK(SEQ ID NO：2)或KXKR(SEQ ID NO：3)(其中X是任何氨基酸)，并在含有这些序列的蛋白到达反面高尔基网时切开它们。参见美国专利No.7,223,390；Poole等，J.Biol.Chem.2003，Vol.278(38)：36183-36190；Chen等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.，vol.98(13)：7218-7223。所表达的含有弗林蛋白酶切割位点的蛋白典型地经历其正常的折叠和装配加工，以获得其天然构型。在从内质网输出后，蛋白沿着分泌途径移动，达到细胞表面。当蛋白到达高尔基反面网络时，它被弗林蛋白酶切割。因为弗林蛋白酶切割是部分完成的，一部分抗体将释放到介质中，而其余部分抗体将保持附着在细胞膜上。这种构型允许对被切抗体进行功能测定，同时维持抗体与表达抗体的细胞之间的连接。

适合用于在哺乳动物细胞中表达重组多肽的启动子包括但不限于SV40启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒启动子、人类HIV长末端重复序列启动子、莫洛尼病毒启动子、鸟白血病病毒启动子、Epstein-Barr病毒立即早期启动子、劳氏(Rous)肉瘤病毒启动子、人类肌动蛋白启动子、人类血红蛋白启动子、CMV启动子、人类EF-1α启动子或人类肌肉肌氨酸启动子。

在某些实施方案中，载体包含与编码免疫球蛋白重链的第一种多核苷酸操作性连接的第一个启动子以及与编码免疫球蛋白轻链的第二种多核苷酸操作性连接的第二个启动子。在某些实施方案中，免疫球蛋白轻链和重链存在于两种不同的载体中，所述载体各自具有与免疫球蛋白轻链和重链可操作连接的不同启动子。

哺乳动物细胞

用于文库筛选的哺乳动物细胞可源自于任何真核物种，包括但不限于来自大鼠、小鼠、牛、猪、绵羊、山羊和人类的细胞。细胞可以按照本技术领域的专业人员熟知的标准方法来维持。

适合的哺乳动物细胞的实例包括HeLa细胞(HeLa S3细胞，ATCCCCL2.2)、Jurkat细胞、Raji细胞、Daudi细胞、人类胚胎肾细胞(293-HEK；ATCC 293cl8，ATCC CRL 1573)、非洲绿猴肾细胞(CV-I；Vero；ATCC CRL 1587)、SV40转化的猴肾细胞(COS-I；ATCC CRL1650)、狗肾细胞(MDCK；ATCC CCL 34)、幼仓鼠肾细胞(BHK-21，BHK-570；ATCC CRL 8544，ATCC CRL 10314)、中华仓鼠卵巢细胞(CHO-K1；ATCC CCL61；CHO DG44(Chasin等，1986，Som CellMolec Genet，12，555))以及其他啮齿动物细胞系例如NSO、SP2/O、GH1(ATCC CCL82)、H-4-II-E(ATCC CRL 1548)、NIH-3T3(ATCCCRL 1658)。在某些实施方案中，哺乳动物细胞选自293-HEK、Hela、Jurkat、Raji、Daudi、COS或CV-1细胞。在某些实施方案中，哺乳动物细胞是上面描述的细胞的衍生物。

可以使用适合的手段将哺乳动物细胞用多核苷酸转化，并将所述哺乳动物细胞培养在根据适合于诱导启动子而修改的常规营养培养基中。这类方法的代表性实例包括使用磷酸钙沉淀进行转染、脂类介导的转染、将多核苷酸直接微注射到完整靶细胞中、以及电穿孔。在某些实施方案中，哺乳动物细胞被瞬时转染。

用于细胞的适合培养条件例如温度和pH，是公知的。在本文描述的方法的不同步骤中使用的哺乳动物细胞可以相同或不同。应该指出，尽管在传统的筛选方法中应当(并且有时是关键的)控制细胞所摄取的载体的拷贝，但在本发明的方法的初始步骤中，优选每个哺乳动物细胞可以摄取尽可能多的载体拷贝。例如，转染条件可以被优化成使得每个哺乳动物细胞摄取至少约20个、例如至少约50、100、200、300、400、500、1000个或更多的质粒直到每个细胞10⁶、10⁷个质粒中的任一种数量。可以通过调整参数例如细胞密度、载体DNA的浓度、不同初级文库(当可用时)的比率、转染试剂和转染程序，来优化转染条件。

因此，一方面，本发明提供了哺乳动物细胞群体，其至少某些(例如50％、60％、70％、80％、90％、99％)在每个细胞中包含至少约20个、例如至少约50、100、200、300、400、500、1000个或更多直到10⁶或10⁷个...不同多核苷酸中的任一种数量。在某些实施方案中，哺乳动物细胞被瞬时转染。

初始筛选

在将多核苷酸文库导入细胞中之后，允许抗体展示在哺乳动物细胞的细胞表面上。“允许展示”是指允许已被导入到细胞中的载体经历多肽的转录和翻译，并将抗体运输到膜表面上。允许表达所需的条件和时间将随着宿主细胞的选择和载体的选择而变，正如本技术领域的普通专业人员所公知的。

在某些实施方案中，随后将在表面上表达抗体的细胞通过允许抗原与所需抗体结合的方法与抗原相接触，由此允许将表达抗体的细胞与不结合抗原的细胞区分开。初始筛选步骤允许回收到哺乳动物细胞的第一个亚群。

“回收”是指将所需组分与不需要的组分分离。本技术领域的普通专业人员应该理解，尽管哺乳动物细胞亚群富集有展示特异性识别抗原的抗体的细胞，但亚群中的大多数细胞可能是非特异性结合细胞。在某些实施方案中，初始筛选在低严紧条件下进行，以最大化捕获到展示特异性识别抗原的抗体的细胞的可能性。

初始筛选可以使用下列方法中的任一种执行：荧光活化细胞分拣(FACS)、基于珠子的分拣例如基于磁珠的分拣(MACS)、其组合或其他固相淘选技术。其他可以使用的技术也是本技术领域已知的。例如，如果细胞处于悬液中并且抗原附着于固相基质，那么特异性结合抗原的细胞将被捕获在固相基质上，允许不结合抗原的细胞被洗掉，并且随后能够回收结合的细胞。或者，如果细胞附着于固相基质，并且通过与抗原特异性结合而导致从基质上释放，则可以从细胞上清液回收它们。

抗原可以直接或间接附着于固相基质(例如磁珠)。例如，在某些实施方案中，固相基质可以用链亲和素包被，其允许与生物素相连的抗原通过链亲和素与生物素的相互作用附着到固相基质上。也可以使用其他结合对。

在某些实施方案中，抗原可以表达并呈递在细胞表面。抗原呈递细胞与结合抗原的细胞之间的相互作用允许分离出结合抗原的细胞(例如表达所需抗体的细胞)。例如，可以利用FACS分离细胞复合物。在某些实施方案中，抗原呈递细胞与结合抗原的细胞之间的相互作用能够诱导可检测的信号(在抗原呈递细胞或结合抗原的细胞内)，其允许分离出结合抗原的细胞。

在某些实施方案中，将细胞与用荧光标记物(例如荧光素-5-异硫氰酸酯(FITC))直接或间接标记的抗原温育。与带荧光标签的抗原结合的抗体表达细胞可以通过荧光活化细胞分拣(FACS)来选择，从而允许将特异性结合抗原的细胞与不结合抗原的细胞区分开。

在某些实施方案中，可以将一种或多种上述技术进行组合。例如，固相淘选可以与FACS的使用组合，反之亦然。

在某些实施方案中，当使用所需亲和性作为筛选基础时，可以使用ELISA测定法来确定分离的免疫球蛋白对靶抗原的结合亲和性。

正如上面讨论的，在某些实施方案中，抗体可以从融合的束缚结构域上部分或完全切下，并可用于进一步测定和/或验证所需性质。

子文库的产生和筛选

本文描述的方法涵盖了产生和筛选本文中所述的子文库的方法。在回收哺乳动物细胞的初始亚群后，从细胞提取总mRNA。将mRNA转录成cDNA，并扩增(例如通过PCR)抗体基因或抗体基因的部分(例如抗体基因的VH和VL区)。

与其中需要引物混合物来扩增抗体可变区的产生初级抗体文库的传统方法不同，用于子文库中多核苷酸的引物可以基于初级文库的载体序列。例如，可以基于载体中的序列设计引物，以扩增轻链和重链序列二者。

在某些实施方案中，将抗体序列的VH和VL区克隆到分别含有CH和CL区的骨架载体中，以构建两个子文库——重链和轻链子文库。随后将两个子文库转染到哺乳动物细胞中。该步骤允许在细胞中进行重链和轻链的改组，其可以增加具有较高表达以及较高亲和性的抗体的分离机会。在这样的实施方案中，至少一个用于扩增轻链的引物与用于扩增重链的引物不同，以便可以将轻链和重链分别克隆到不同载体中，并分成不同子文库。

可以将扩增的抗体序列(例如VH和VL序列)返回克隆到在初级文库中使用的相同载体中或克隆到不同载体中。例如，在某些实施方案中，初级文库包含初级轻链文库和不同的第二个初级重链文库，其中轻链和重链在不同载体上(例如质粒载体)。在初始筛选后，将扩增的轻链和重链序列克隆到单一双盒载体中。在某些实施方案中，载体与在Higuchi等，J.Immun.Methods(1997)202：193-204中使用的载体类似。在某些实施方案中，使用不同的文库进行几轮筛选，然后将轻链和重链克隆在单一双重表达载体中。在筛选的最后阶段克隆双重表达载体，允许同时鉴定具有所需性质(例如与抗原特异性结合)的抗体的成对抗体轻链和重链。

在随后的筛选步骤中使用的哺乳动物细胞可以与第一轮筛选中使用的类型相同，或者可以是不同的细胞，只要它们能够在细胞表面上表达多肽即可。筛选可以使用任何上面对初始筛选所描述的任何方法来进行。

本文中描述的RT-PCR和筛选步骤可以重复至少1、2、3、4、5、6或7次。在某些实施方案中，步骤被重复不超过约3次。不同筛选循环的严紧性可以相同或不同，以便于分离多核苷酸。例如，在接近筛选循环结束中使用较高严紧性的条件，以减少从富集的亚群获得的多核苷酸的多样性。在方法的各个步骤过程中可以评估子文库的多样性。如果多样性低于约1000至10000个信号，则可以按照下面的描述执行分离步骤。

编码特异性识别抗原的抗体的多核苷酸的分离

为了分离抗体序列，从最终的子细胞合并物分离总mRNA。将相关的区域进行RT-PCR扩增、限制性酶消化，并克隆到稳定的表达载体中。然后在大多数哺乳动物细胞仅具有每个细胞一个表达载体的条件下，将DNA稳定转染到哺乳动物细胞中。例如，可以使用滴定步骤稀释用于细胞转染的质粒的浓度，以减少在同一个细胞中表达多个编码不同免疫球蛋白的载体的概率。或者，可以使用flip-in系统，例如FLP-in^TM系统(Invitrogen，Inc.)。

可以通过例如上面描述的方法来分离表达所需抗体的细胞。可以分离并测序编码所需抗体的多核苷酸。

单盒表达载体和双盒表达载体

本发明还提供了在本文描述的方法中使用的特定表达载体。这些表达载体提供了高的克隆效率，并特别适用于构建高复杂度蛋白质文库例如本文中描述的高复杂度抗体文库，并供在筛选文库的方法、例如本文所描述的方法中使用。

本文提供的载体可用于快速构建任何抗体文库、重链、轻链、嵌合和甚至融合蛋白，并用于这些抗体蛋白在哺乳动物细胞表面上的高表达，以有效筛选和选择(例如当与FACS偶联时)。可以在载体中掺入两个或多个独特的核酸内切酶识别序列，用于插入和取出目标基因。使用这样的载体，可以容易地构建大小为至少10⁶复杂度的载体。CMV启动子，一种常用于蛋白在各种哺乳动物细胞中的高表达的启动子，可用于驱动所插入基因(例如抗体基因)的表达。为了将表达的抗体锚定在哺乳动物细胞表面上，可以将来自于PDGFR的跨膜结构域与重链一致区的C-端同框融合。

本文还提供了双盒表达载体。这样的载体可以包含双重哺乳动物表达盒，用于一步插入重链和轻链基因两者，以在哺乳动物细胞表面上展示全长二价抗体。这可以通过将来自PDGFR的跨膜结构域融合到重链恒定区的C-端来实现。我们也可以在恒定区与PDGFR跨膜结构域之间掺入弗林蛋白酶切割位点，以获得分泌抗体。结果，抗体可以同时以膜锚定形式表达在细胞表面上以用于通过FACS分析进行筛选和选择，以及以分泌形式表达在条件培养基中以用于功能分析。使用该程序，我们能够在仅仅几天内快速构建大小为10⁶的抗体文库。这种新的一步式双表达哺乳动物展示系统对于快速筛选具有高亲和性的生物活性的人类单克隆抗体来说，特别有用。

因此，在某些实施方案中，提供了包含侧翼带有一对可以被限制性酶(例如识别非回文序列的限制性酶)识别的切割位点的开放阅读框的表达载体，其中用所述限制性酶切割所产生的每个片段的末端不自连。在某些实施方案中，开放阅读框编码抗体重链。在某些实施方案中，抗体重链与跨膜结构域融合。在某些实施方案中，在抗体重链与跨膜结构域之间存在酶切割位点(例如弗林蛋白酶切割位点)。在某些实施方案中，开放阅读框编码抗体轻链。

在某些实施方案中，载体还包含可以被不同限制性酶(例如识别非回文序列的限制性酶)识别的第二对切割位点，其中用所述第二种限制性酶切割所产生的每个片段的末端不自连。在某些实施方案中，第二对切割位点位于开放阅读框侧翼。在某些实施方案中，第二对切割位点中的一个位于开放阅读框侧翼，其中第二对切割位点中的另一个位于开放阅读框内。例如，在某些实施方案中，开放阅读框包含抗体重链，并且第二对切割位点中的一个位于可变区与恒定区之间。这样的载体可能适合于例如克隆抗体可变区。同样地，在某些实施方案中，开放阅读框包含抗体轻链，并且第二对切割位点中的一个位于可变区与恒定区之间。这样的载体可能适合于例如克隆抗体可变区。

在某些实施方案中，限制性酶选自SfiI、BstXI和BsmB1。应该理解，也可以使用具有类似性质的其他酶。在某些实施方案中，载体还包含与所述开放阅读框可操作连接的启动子。在某些实施方案中，载体具有图2中显示的限制性图谱。在某些实施方案中，载体具有图3中所显示的限制性图谱。

在某些实施方案中，表达载体包含第二个开放阅读框。因此，例如，在某些实施方案中，提供了双表达盒载体，其包含：1)侧翼带有可以被限制性酶(例如识别非回文序列的限制性酶)识别的第一对切割位点的第一个开放阅读框，其中用所述限制性酶切割所产生的每个片段的末端不自连；以及2)侧翼带有可以被限制性酶(例如识别非回文序列的限制性酶)识别的第二对切割位点的第二个开放阅读框，其中用所述第二种限制性酶切割所产生的每个片段的末端不自连。在某些实施方案中，一个开放阅读框编码抗体重链。在某些实施方案中，将抗体重链与跨膜结构域融合。在某些实施方案中，在抗体重链与跨膜结构域之间存在酶切割位点(例如弗林蛋白酶切割位点)。在某些实施方案中，一个开放阅读框编码抗体轻链。因此，例如，在某些实施方案中，提供了双表达盒载体，其包含：1)编码抗体重链的第一个开放阅读框，其侧翼带有可以被限制性酶(例如识别非回文序列的限制性酶)识别的第一对切割位点，其中用所述限制性酶切割所产生的每个片段的末端不自连；以及2)表达抗体轻链的第二个开放阅读框，其侧翼带有可以被限制性酶(例如识别非回文序列的限制性酶)识别的第二对切割位点，其中用所述第二种限制性酶切割所产生的每个片段的末端不自连。还提供了从所述切割产生的片段，其可用于通过四路连接来克隆所需序列(例如抗体序列)。还提供了使用双盒表达载体表达全长抗体以及使用所述载体克隆所需序列的方法。

在某些实施方案中，双盒表达载体还包含能够被第三种限制性酶(例如识别非回文序列的第三种限制性酶)识别的第三对限制性酶切割位点，其中用所述第三种限制性酶切割所产生的每个片段的末端不自连。在某些实施方案中，第三对切割位点中的一个位于载体上一个开放阅读框的侧翼，并且其中第三对切割位点中的另一个位于同一个开放阅读框内。例如，在某些实施方案中，一个开放阅读框包含抗体重链，并且第三对切割位点中的一个位于可变区与恒定区之间。同样地，在某些实施方案中，一个开放阅读框包含抗体轻链，并且第三对切割位点中的一个位于可变区与恒定区之间。

在某些实施方案中，双盒表达载体还包含可以被第三种限制性酶(例如识别非回文序列的第三种限制性酶)识别的第四对限制性酶切割位点，其中用所述第三种限制性酶切割所产生的每个片段的末端不自连。在某些实施方案中，第四对切割位点中的一个位于载体上一个开放阅读框的侧翼，并且其中第四对切割位点中的另一个位于同一开放阅读框内部。设想了第三对切割位点和第四对切割位点可以各自位于双盒表达载体中不同开放阅读框的侧翼(或位于内部)。例如，在某些实施方案中，一个开放阅读框包含抗体重链，并且第三对切割位点中的一个位于可变区与恒定区之间，而另一个开放阅读框包含抗体轻链，并且第四对切割位点中的一个位于可变区与恒定区之间。

在某些实施方案中，限制性酶选自SfiI、BstXI和BsmB1。在某些实施方案中，载体还包含与所述第一个开放阅读框可操作连接的第一个启动子以及与所述第二个开放阅读框可操作连接的第二个启动子。在某些实施方案中，载体具有如图5A中显示的限制性图谱。

试剂盒、文库、子文库、多核苷酸和多肽

还提供了用于执行本文描述的方法的文库和试剂盒。此外，提供了在筛选过程中产生的子文库和从本文描述的方法获得的多核苷酸/多肽。

在某些实施方案中，提供了编码抗体轻链的多核苷酸文库和编码抗体重链的多核苷酸文库，其中两个文库允许表达至少10⁹、包括例如10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³、10¹⁴、10¹⁵、10¹⁶、10¹⁷种或更多种中至少任一数量的不同抗体。在某些实施方案中，抗体轻链包含：(i)轻链恒定区，(ii)免疫球蛋白轻链可变区和(iii)信号肽。在某些实施方案中，抗体重链包含：(i)至少一个抗体重链恒定区，(ii)免疫球蛋白重链可变区，以及(iii)信号肽。在某些实施方案中，抗体重链还包含位于重链恒定区C-末端的细胞表面束缚结构域。在某些实施方案中，抗体重链还包含重链恒定区与细胞表面束缚结构域之间的弗林蛋白酶切割位点。

在某些实施方案中，在试剂盒中提供了两个文库，其存在于分开的容器或同一个容器中。在某些实施方案中，试剂盒还包含引物、试剂、细胞和用于执行本文描述的方法的说明书。例如，在某些实施方案中，提供了试剂盒，其包含：1)编码多种免疫球蛋白重链的多核苷酸的第一个质粒文库，2)编码多种免疫球蛋白轻链的多核苷酸的第二个质粒文库。在某些实施方案中，试剂盒还包含能够表达免疫球蛋白分子的细胞群体。在某些实施方案中，试剂盒还包含用于RT-PCR的酶和引物。在某些实施方案中，第一和第二个质粒文库包含在分开的容器中。在某些实施方案中，试剂盒还提供了用于执行本文描述的一种或多种方法的说明书。

在某些实施方案中，提供了试剂盒，其包含：1)用于产生初级文库(例如抗体初级文库)的引物组，2)用于瞬时和/或稳定转染哺乳动物细胞的载体组；以及3)用于产生子文库(例如抗体子文库)的引物组。在某些实施方案中，试剂盒还提供了用于执行本文描述的方法的说明书。

还提供了本文描述的方法所获得的多核苷酸以及由这些多核苷酸编码的多肽。多核苷酸和多肽可用作例如研究试剂、诊断试剂和用于治疗疾病的治疗剂。

还提供了通过本文描述的RT-PCR方法产生的子文库。例如，在某些实施方案中，提供了编码多种多肽的多核苷酸子文库，其中子文库通过将从哺乳动物细胞群体提取的mRNA反转录成cDNA并扩增所述cDNA来产生，其中细胞群体通过从用多核苷酸初级文库转染(例如瞬时转染)的哺乳动物细胞原始群体中筛选出展示具有所需性质的多肽的细胞来获得。

还提供了包含表达载体、例如本文中描述的单盒和双盒表达载体的试剂盒。试剂盒可以包含整个载体或载体可直接用于连接(例如四路连接)的线性片段。

下面的实施例为本发明提供了说明而不是限制。

实施例1

本实施例显示了可以在哺乳动物细胞中同时表达表面锚定形式和分泌形式的抗体的载体的构建。

为了从哺乳动物细胞表达抗体用于筛选，重要的是设计和构建特定的表达载体，其能够：

1.以足够供检测和分析的高水平在哺乳动物细胞中表达抗体；

2.同时将抗体分子表达在哺乳动物细胞表面上和表达成分泌形式；

3.容易在细菌中扩增并从细菌纯化；

4.以高效率递送到哺乳动物细胞中。

为此目的，使用来自Invitrogen的载体pcDNA 3.1作为起始材料。载体尺寸为5.4kb，含有用于在哺乳动物细胞中表达蛋白的大多数必需组分。为了增加转染效率(从每个细胞来看的拷贝数)，将1.8kb Neo基因表达盒删除以减小载体尺寸。为了便于插入目的基因，对MCS(多克隆位点)进行了修改以包含BstX I和Sal I。适合的载体形式具有约3.2kb的大小。

将该3.2kb载体用作骨架载体，用来构建抗体表达文库。当目的基因被插入到该载体的MCS中时，在载体被递送到哺乳动物细胞中时，基因表达。

为了表达被展示的重链，对载体进一步修改，以将PDGFR编码序列插入在重链恒定区的3’-末端。

为了同时表达展示和分泌形式的抗体，将弗林蛋白酶切割位点(FCS)插入到重链与PDGFR之间。

下面的图显示了表达载体中重链中的组分的关系：

启动子----V-------C--------FCS--PDGFR

实施例2

本实施例描述了用于在哺乳动物细胞中同时稳定表达表面锚定形式和分泌形式的抗体的载体的构建。

为了从单一载体表达重链和轻链两者，构建了双重表达载体。将另一个表达盒插入到载体pcDNA3.1中。将Ch和Cl基因序列插入到该载体中不同的表达盒处。这两个表达盒的关系显示如下，其中启动子1和启动子2是相同或不同的。

启动子1---Ch或Cl---PolyA----启动子2---Cl或Ch---PolyA----选择标记

为了表达细胞表面展示的抗体，对载体进一步修改以将PDGFR编码序列插入到重链恒定区的3’-末端。

为了同时表达展示和分泌形式的抗体，将弗林蛋白酶切割位点(FCS)插入到重链与PDGFR之间。

实施例3

本实施例描述了全长人类抗体哺乳动物展示文库的构建。

本实施例显示了具有10⁹或更大多样性的全长人类抗体哺乳动物展示文库的建造。使用在实施例1中构建的载体作为骨架用于构建文库。

使用在书籍《噬菌体展示》(Phage Display(Carles等，Cold SpringHarbor Laboratory Pr.))中描述的引物，通过PCR从人类免疫组织(骨髓、脾脏和外周血淋巴细胞)的即用cDNA(BioChain，South SanFrancisco，CA USA)扩增了人类抗体重链和轻链的可变结构域基因(Vh和V1)。对PCR条件进行优化，以确保Vh和Vl的有效准确的扩增。将PCR产物用与克隆载体匹配的适合的限制性酶消化。在消化后使用PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化产物。

对于重链表达来说，将IgG1的重链恒定区(Ch)、FCS和PDGFR序列克隆到实施例1的载体的MCS中。然后使用T4连接酶将Vh混合物同框插入到载体中Ch区之前。在将连接混合物进行转化后，通过测量转化体数量来计算转化效率和文库大小，以确保文库大小为10e5以上。通过对100个以上个体克隆进行序列分析，对文库的多样性进行更精确的分析和计算。如果只需要在细胞表面上表达抗体，FCS区不必包含在载体中。

对于轻链表达来说，将κ(或λ)链恒定区(Cl)克隆到实施例1的载体的MCS中。然后使用T4连接酶将Vl混合物同框插入到载体中Cl区之前。在将连接混合物进行转化后，通过测量转化体数量来计算转化效率和文库大小，以确保文库大小为10e4以上。通过对100个以上个体克隆进行序列分析，对文库的多样性进行更精确的分析和计算。

重链和轻链文库载体两者可以容易地在细菌中扩增，并安全地储存在-20℃下。

该文库是初级的、未接触过抗原的全长人类抗体文库，其潜在多样性＞＝10e9。从该文库表达的抗体可以锚定在哺乳动物细胞表面上，直接用于亲和性和功能筛选和选择。同时，一部分抗体作为可溶分子表达在条件培养基中，其可以直接用于抗体的进一步功能分析和特征分析，而不用将抗体从膜锚定形式转变成可溶形式，加快了筛选和选择。

实施例4

本实施例描述了哺乳动物细胞表面展示的抗体文库的表达和筛选以及选择抗体候选物。

从实施例3构建的文库是载体DNA并可以被扩增。为了扩增载体文库，将载体DNA转化到细菌感受态细胞中。收集抗生素抗性菌落，并使用max-prep试剂盒(Qiagen)从细菌纯化载体DNA。

将293细胞培养在增补有10％FBS并且不含抗生素的DMEM培养基(Invitrogen)中。使用转染优化试剂盒(Biocompare，S.San Francisco，CA)，在细胞密度、载体DNA剂量、重链和轻链文库的比率、转染试剂和转染步骤方面对转染条件进行优化。

为了制备用于转染的细胞，根据需要将293细胞分开，并接种到包被有1％聚赖氨酸的T225培养瓶中。

使用优化条件，将DNA文库混合物转染到T225培养瓶中的293细胞中。在转染后48-72小时，使用解离缓冲液(Invitrogen)将细胞解离，并将其以1e6-1e7/ml的密度悬浮在染色缓冲液中(含有2％FBS的PBS)。将细胞用PE-标记的小鼠抗人IgG1重链和FITC-标记的抗人κ链恒定区抗体(1ug/ml)进行双重染色。然后通过FACS分析细胞表面上抗体的表达。通常，与阴性对照相比，90％以上的细胞被阳性染色。这是初级细胞文库。

为了从文库筛选特定抗体，将选定的抗原(针对特异性，参见其他实施例)用生物素标记，然后用于对符合如上所述的抗体阳性细胞群体进行染色。

将链亲和素结合的磁珠(Dynal/Invitrogen)与抗原染色的细胞群体混合。特异性抗体阳性细胞被磁珠捕获，并按照产品手册中的描述通过磁场进行收集。

因为特异性抗体基因的百分率非常低，在细胞合并物中表达特异性抗体的细胞数量稀少。在该步骤中，施加低严紧性结合条件以确保所有与抗原的结合物都可以被捕获。这里，目的是富集结合物，而纯度可以忽略。在一个富集循环中，即使纯度仅仅为万分之一(1/10e4)，与＝＞10e9的文库多样性相比，已经富集了至少10e5倍。

下面的步骤对于从高度多样性的文库成功分离抗原特异性抗体来说是重要的，因为即使上面的富集可能已经高达10e5倍，但合并物中的大多数细胞仍表达非特异性抗体。

1.为了进一步富集特异性结合物，从上述富集步骤的细胞子合并物提取总mRNA。通过RT-PCR扩增总mRNA中抗体基因的Vh和Vl区，并将其分别克隆到含有Ch和Cl区的骨架载体中，以构建两个子文库——重链和轻链子文库。

2.将这些子文库的混合物转染到新鲜的293细胞中，并分析细胞表面上的抗体表达。

3.如同对初级细胞文库所做的，富集特异性抗原结合物。

将上述步骤1至3重复所需的循环数。每个循环使用的结合条件的严紧性越来越高，以分离亲和性越来越高的结合物。细胞合并物的纯度变得越来越高，在2-4个富集循环后，大多数细胞应该为特异性抗原染色阳性。

这种重复的筛选不仅富集了结合物，而且改组了细胞中的重链和轻链，其可以增加分离到具有较高表达以及较高亲和性的抗体的机会。

为了使用FACS分析细胞合并物，将细胞用FITC结合的抗轻链抗体或PE结合的特异性抗原或两者进行染色。

对初级细胞合并物和细胞子合并物进行FACS分析，以计算富集效率。

为了分离抗体基因，从最终的细胞子合并物提取总mRNA。对Vh和Vl区进行RT-PCR扩增、限制性酶消化和纯化。

将获得的Ch和Cl插入到实施例2的稳定表达载体中并与其恒定配偶体同框，以形成全长重链基因和全长轻链基因，构建稳定表达的子文库。在该载体中，重链和轻链对是固定的，并且如果只有一个载体被整合在基因组中，那么只表达一种类型的抗体。

将稳定表达的子文库转染到CHO细胞中。为了确保每个细胞基因组中整合一个载体，对转染条件的多个参数包括DNA剂量、与不同量的非表达载体混合以及转染程序进行优化。

通过FACS分析抗体的表达水平和特异性结合亲和性。通过单细胞FACS分拣分离出表现出高表达和高亲和性的单个细胞。

在扩增后，对这些单细胞群体进一步进行下列分析：

1.细胞表面上的抗原竞争分析。

2.抗体与其他物种抗原的交叉反应。

3.使用条件培养基的功能分析。

4.使用纯化抗体的功能分析。

从这些单细胞群体中通过RT-PCR克隆特异性抗体基因，并测序验证它们是单一克隆。可以将选定的抗体基因进行大规模表达用于进一步分析。

实施例5

本实施例描述了全长小鼠-人类嵌合抗体哺乳动物展示文库的构建。

为了构建文库，使用了与实施例3中描述的相同的策略。

使用在书籍《噬菌体展示》(Phage Display(Carles等，Cold SpringHarbor Laboratory Pr.))中描述的引物，通过PCR从小鼠免疫组织(骨髓、脾脏和外周血淋巴细胞)的即用cDNA(BioChain，South SanFrancisco，CA USA)扩增了小鼠抗体重链和轻链的可变结构域基因(Vh和Vl)。对PCR条件进行优化，以确保Vh和Vl的有效准确的扩增。将PCR产物用与克隆载体匹配的适合的限制性酶消化。在消化后使用PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化产物。

对于小鼠-人类嵌合重链表达来说，将人类IgG1的重链恒定区(Ch)、FCS和PDGFR序列克隆到实施例1的载体的MCS中。然后使用T4连接酶将小鼠Vh混合物同框插入到载体中Ch区之前。在将连接混合物进行转化后，通过测量转化体数量来计算转化效率和文库大小，以确保文库大小为10e5以上。通过对100个以上个体克隆进行序列分析，对文库的多样性进行更精确的分析和计算。如果只需要在细胞表面上表达抗体，FCS区不必包含在载体中。

对于小鼠-人类嵌合轻链表达来说，将人类κ(或λ)链恒定区(Cl)克隆到实施例1的载体的MCS中。然后使用T4连接酶将小鼠Vl混合物同框插入到载体中Cl区之前。在将连接混合物进行转化后，通过测量转化体数量来计算转化效率和文库大小，以确保文库大小为10e4以上。通过对100个以上个体克隆进行序列分析，对文库的多样性进行更精确的分析和计算。

重链和轻链文库载体两者可以容易地在细菌中扩增，并安全地储存在-20℃下。

该文库是初级的、未接触过抗原的全长小鼠-人类嵌合抗体文库，其潜在多样性＞＝10e9。从该文库表达的抗体可以锚定在哺乳动物细胞表面上，直接用于亲和性和功能筛选和选择。同时，一部分抗体作为可溶分子表达在条件培养基中，其可以直接用于抗体的进一步功能分析和特征分析，而不用将抗体从膜锚定形式转变成可溶形式，加快了筛选和选择。

为了构建全长小鼠抗体展示文库，使用小鼠的重链和轻链恒定区代替载体中的人类对应部分。

实施例6

本实施例描述了抗体样二价肽体哺乳动物展示文库的构建。

使用在上面实施例中描述的方法，构建了抗体样、二价的、可以哺乳动物展示的肽体文库。在体外合成了多肽基因文库。文库的DNA序列具有36-72个核苷酸的大小，侧翼在两端带有限制性酶识别序列，用于将文库克隆到表达载体中。

构建了两个不同的肽体文库。在一个文库中，多肽与人类Ch融合，在另一个文库中，多肽与人类Cl融合。两个文库的大小都＝＞10e5。

将这两个DNA文库以等量的分子混合，并转染到哺乳动物细胞(CHO细胞)中。因为在细胞中离体配对，潜在的文库大小能够达到10e5以上。通过实施例4中描述的方法筛选出选定抗原的特异性结合物。在该抗体样肽体中可能存在多达4种不同的多肽，两种来自于重链融合，两种来自于轻链融合。进一步的筛选和下游开发例如在带有双表达盒的载体中配对，能够最终鉴定到带有成对多肽、具有所需功能的候选物。

实施例7

本实施例显示了用于快速构建抗体文库和在哺乳动物细胞表面表达抗体蛋白的单表达盒载体的构建。

表达载体的设计和构建

限制性酶SfiI识别非回文序列并形成3个碱基的突出末端。因为末端这三个位置中的每个可以是四种核苷酸G、A、T、C的任一种，因此末端序列总共可以具有64种不同可能性。因此有可能在片段的两端设计不同切割序列，其在连接过程中将不自连。这种特点在文库构建中对于增加连接和转化效率来说是非常有用的。BstXI和BsmBI具有类似特点，并且各自能够形成256种可能的末端。为了灵活插入抗体重链、轻链或重链的可变结构域，设计了一种通用载体，并且已经将上面列出的三种酶导入到载体中。选择了CMV启动子驱动该载体中插入基因的表达。

表1、用于载体构建的引物

名称	序列
		P1-172	TGGCCACATAGGCCGTCTCTAGTCCACCATGGACTGGACCTGGAGGATC
P2-087	GTCCACCTTGGTGTTGCTGGGCTT
		P3-101	AAGCTGGCTAGCCACCTGATTGGCCACATAGGCCGTCTCTAGTCCACCACCATG
P4-145	CCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGACC
		P5-144	GGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGG
P6-142	GCGTGTCCTGGCCCACAGCATTGGATCCTTTACCCGGAGACAGAGAGAGG
		P7-143	GCCTCTCTCTGTCTCCGGGTAAAGGATCCAATGCTGTGGGCCAGGACACGC
P8-104	TGGCCGTGCAGGCCTTATCAACGTGGCTTCTTCTGCC
		P9-103	GTCGACCTCGAGCCAGAGTCATGGCCGTGCAGGCCTTATCA

构建的载体含有全长人类重链，其在3’末端与血小板衍生生长因子受体(PDGFR)的跨膜结构域(TM)融合。为了减小尺寸，我们设计的载体不含通常在哺乳动物细胞中用于选择的选择基因表达盒。为了获得与PDGFR-TM融合的全长人类抗体重链(HC-TM)并将所列的酶切位点引入载体，设计了9个引物(表1)。通过5次PCR获得了HC-TM。使用从人类PBMC分离的总RNA作为模板，首先通过引物P1和P2经RT-PCR扩增了重链的可变结构域(PCR-1)。然后使用引物P3和P4以及来自PCR-1的产物作为模板进行了PCR-2，以在可变结构域的起始密码子之前引入NheI/BstxI/SfiI/BsmBI酶识别序列，而在3’末端同框引入第二个BsmBI识别序列。通过P5和P6从人类PBMC分离的总RNA中RT-PCR扩增了人类IgG-1恒定区(PCR-3)，以在5’末端引入第二个BsmBI识别序列并在3’末端引入BamHI识别序列。第4个PCR使用P7和P8进行，以扩增PDGFR-TM。在TM的5’末端掺入了BamHI切割位点。最后的PCR(PCR-5)使用了来自PCR 2、3和4的片段作为模板以及引物P3和P9，以在该融合蛋白的3’末端引入SfiI/BstXI/XhoI识别序列。最终的PCR产物(片段5)含有全长人类重链和PDGFR-TM。在用NheI和XhoI消化后，将片段插入载体pcDNA5/FRT中多克隆位点处的NheI与XhoI之间，以形成过渡载体。

为了减小载体的总尺寸，从过渡载体中删除了潮霉素B选择基因表达盒。通过这种方式，在转染中使用的同样量的载体DNA将含有更多的质粒分子拷贝，有希望增加每次被筛选的多样性。因此，设计了引物P201(5’-ctaactgacacacattccacagaagcttcaccctaatcaagttttttgggg-3’)和P202(5’-tgtatcttatcatgtctgtataccgaagcttcctctagctagagcttggcg-3’)，以包含HindIII识别序列并与过渡载体互补。使用这两个引物，从过渡载体经PCR扩增了5.2kb片段，其含有用于载体在细菌中复制和抗体基因在哺乳动物细胞中表达的所有组分。在用HindIII消化后，将片段通过自连环化，形成最终的表达载体pDGB-HC-TM(图3)。

载体的酶消化验证以及连接与转化效率的分析

为了证实pDGB-HC-TM含有所有正确的限制性酶识别序列并可以被有效消化以形成大小正确的片段，通过适合的酶消化对大量制备的载体DNA进行分析。结果(图4)显示，用5种不同的酶以4种组合对载体进行的消化产生了预期的DNA片段。该结果表明，载体pDGB-HC-TM在正确位置含有所有导入的酶切割位点。为了测试所有这些片段可以重新连接以形成正确载体，将所有这些片段各自纯化。如图4中所示在四个组中执行连接。在每个组中，载体片段与插入片段以1∶1的比例混合。转化后，对效率进行计算。结果显示，使用效率为3×10⁷的感受态细胞，1ug DNA的连接-转化效率能够达到最高3.2×10⁶(表2)。载体用NheI和XhoI消化的第1组的转化效率为效率0.94×10⁶，低于其他三个组。来自NheI和XhoI消化的载体片段可以不含插入片段自连。来自其他三个组的载体片段没有显示出自连。合理地说，这种载体自连在真实的连接中减少了载体片段与插入片段之间的有效连接，降低了转化效率并增加背景(8.6％，表2-A)。为了证实片段正确连接形成全长载体，从每个组随机挑取4个菌落进行分析，所有16个克隆(每种连接4个)显示出正确大小的片段。

表2

表2：连接和转化效率的分析^*

^*转化培养物的总体积为285μl。

^**V+I：载体片段+插入片段；V：仅仅载体片段。

细胞表面上抗体表达的FACS分析

载体pDGB-HC-TM只含有HC-TM融合蛋白，但是全长抗体需要在单个细胞中同时表达重链和轻链。通过两步RT-PCR，使用引物P182(5’-AGCCACCTGATTGGCCACATAGGCCTGAACCACCATGGTGTTGCAGACCCAGGTC-3’)和P 108(5’-ccagagtcatggccgtgcaggccTTATCAAGACTCTCCCCTGTTGAAGCTC-3’)扩增了全长人类κ链。在SfiI消化后，将基因插入到载体中SfiI切割位点之间代替pDGB-HC-TM中的HC-TM，以形成人类κ链表达载体pDGB-huKappa。通过测序分析验证κ基因的序列。将载体pDGB-HC-TM和pDGB-huKappa共转染到293-T细胞中。在转染后60小时，通过FACS分析抗体在细胞表面上的瞬时表达。当用PE结合的小鼠抗人κ链抗体和FITC结合的小鼠抗人IgG抗体染色时，亲代293-T细胞没有在细胞表面上显示抗体表达。用pDGB-HC-TM转染的细胞在细胞表面上显示出重链表达，但是没有检测到κ链表达。用pDGB-huKappa转染的细胞在细胞表面上既没有检测到重链也没有检测到轻链。当细胞用pDGB-HC-TM和pDGB-huKappa共转染而被转染时，重链和轻链可以分别和同时检测到。这些结果表明，如果能够在细胞表面上检测到轻链，细胞也将含有重链。只有当重链和轻链在细胞中共表达时，才能在细胞表面上检测到全长抗体。

为了观察该载体是否能够用于有效地构建抗体文库，我们使用两步RT-PCR扩增了全长κ链文库(P182和P108)和重链可变结构域(Vh)文库(P149，5’-TGGCCACATAGGCCGTCTCTAGTCCACCATGGACTGGACCTGGAGGATC-3’和P150，，5’-GCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCC-3’)，并将这两个文库分别插入到载体中。在将这两个文库共转染到293-T细胞中后，通过FACS分析抗体表达。轻链和重链两者都能在细胞表面上检测到，表明该载体不仅能够用于单个基因的克隆，而且可用于文库。

讨论

通过将抗体基因插入到适合的载体中以形成重组质粒DNA，构建了抗体文库。在导入到适合的宿主细胞中后，被表达抗体用于筛选和选择。在抗体文库的构建中，一个关键步骤是载体片段与插入片段的有效连接。常用的限制性酶在消化后形成回文末端，允许发生自连并降低了连接效率。科学家们通常使用两种不同方法来防止片段的自连。第一种方式是使用两种不同的酶消化靶DNA。载体片段或插入片段的单一拷贝将不会自连，但多个载体片段或插入片段仍然能够连接。该方法不能阻止载体或插入片段的自连。另一种方式是将载体片段去磷酸化。因为只有一个片段去磷酸化，另一个片段不论是插入片段还是载体片段，仍然能够自连。因此第二种方法也不能完全阻止自连。在这里，我们报道了三种识别并切割以形成非回文末端的限制性酶的使用。理论上说，SfiI能够识别和切割靶DNA以形成64种不同末端。BsmBI和BstXI能够形成265种不同末端。该特点使得能够较容易地设计两个识别和切割末端，所述末端可以正确地被酶消化但是不允许自连。表3列出了载体中使用的被三种酶所识别的6个序列。结果证实，这些末端不自连，且只有匹配的两个末端能够黏在一起被连接，极大地增加了文库构建中的连接和转化效率。使用效率为3×10⁷的感受态细胞，转化效率可达到高达3×10⁶/毫克连接的DNA。目前，可以商购到转化效率高达10⁹的感受态细胞。可以合理地说，如果使用这些高转染效率的感受态细胞，本实验的连接混合物的转化效率可能高得多。值得提到的是，本报告中的连接本底是1.2％至4.3％，比使用NheI和XhoI的组低得多(8.6％)。这将不仅增加文库数量而且增加文库质量。应该注意的是，在第4组中，在被克隆的基因中存在两个额外的BstXI位点，连接实际上是四路连接。幸运的是，序列分析表明，由BstXI消化产生的所有这四对末端将不形成自连，其已被BstXI消化组的高转化效率和低本底所证明(表2)。

表3：pDGB-HC-TM中被三种限制性酶识别的核苷酸序列

载体pDGB-HC-TM含有IgG1重链恒定区和跨膜结构域。使用BsmBI切割位点，可以容易地将Vh文库插入到载体中。使用BstXI或SfiI，可以替换HC-TM。使用CH和TM之间的BamHI切割位点以及下游的XhoI位点，可以容易地将TM删除以表达可溶性抗体。这些特点使该载体可通用于全长重链、全长轻链或重链可变结构域的抗体文库的构建。

当重链和轻链基因两者被共转染到细胞中时，可以清楚地在细胞表面上检测到重链和轻链。值得提到的是，当只有重链表达载体被导入细胞时，仍然能够在细胞表面上检测到重链而不存在轻链。该结果表明在瞬时转染中，重链能够单独展示在细胞表面上。当只用轻链表达载体转染时，在细胞表面上不能检测到轻链。从共转染可以知道，轻链应该已经表达，但仅仅是没有展示在细胞表面上，因为在轻链末端没有融合TM。因此，在细胞表面上检测到轻链，意味着在细胞表面上存在重链，并且使用抗轻链抗体能够定量分析细胞表面上的全长抗体。使用瞬时转染和低浓度的荧光结合的特异性抗体(制造商建议剂量的七分之一至四分之一)，50至60％的细胞显示出细胞表面上的抗体表达。该结果表明构建的载体能够有效表达所携带的抗体基因。

通过将PCR扩增的Vh文库和全长κ链文库分别插入载体以建立全长重链文库和全长轻链文库，我们进一步研究了载体在抗体文库构建中的应用。在将这两个文库共转染到293T-细胞中后，FACS能够检测到40％的细胞展示抗体。不是每个插入到载体中的基因都具有正确的阅读框并能有效表达。40％的阳性细胞应该代表了文库中正确抗体基因的有效表达。考虑到当用序列验证过的单个重链和单个轻链共转染时只有60％的细胞为阳性，40％的阳性率表明每个文库中可表达的抗体基因可能在60-80％的范围内。

总而言之，我们构建了通用的哺乳动物表达载体，其能够用于快速构建抗体文库并以高效率表达所包含的抗体基因。

实施例8

一步式双表达盒载体的设计、构建和分析

实施例7显示了利用识别并切开独特序列以防止自连的限制性酶BstXI、BsmBI和SfiI，成功构建了通用的单表达盒载体，并证明了HC或LC的高插入效率。通过使用载体和插入片段1∶1的分子比例，不需进一步优化，该单表达盒载体的连接和转化效率能够容易地达到10⁷个克隆/μg连接的DNA。然而，该载体只能插入单一重链或轻链。基于载体的结构，我们设计了新的载体：pDGB4用于通过四路连接同时插入HC(或VH)和LC两者，以及pDGB4-FCS用于同时表达膜锚定形式和可溶形式的抗体，如图5A中所示。

为了构建载体，合成了8条引物(表4)以将适当的限制性酶识别序列导入载体中所需位置处，并在PCR扩增后产生四种片段——P1和P2用于5.0kb的框架片段，P3和P4用于1.6kb的HC-TM(与跨膜结构域融合的重链)片段，P5和P6用于1.8kb的框架片段，P7和P8用于0.7kb的轻链片段。在用适合的限制性酶消化片段并纯化后，将四种片段以1∶1∶1∶1的摩尔比例混合，总量为10μl总连接混合物中91ng。然后在转化中使用1μl连接混合物。在265个菌落中，通过用酶BstXI消化对16个菌落进行了分析，16个中的9个显示出了尺寸正确的片段。为了证实构建的载体含有所有所需的限制性酶切割位点并能表达重链和轻链两者，选择了16号克隆进行进一步分析。

表4：在pDGB4构建中使用的引物

引物号	引物名称	引物序列(5’----3’)
			P1	5.0kb-F	AGTCTTGATAAGGCCTGCACGGCCCTCGAGTCTAGAGGGCCCG
P2	5.0kb-R	ACTGAGACGCCAATCAGGTGGCTAGCCAGCTTGGGTCTCC
			P3	1.6kb-F	AAGCTGGCTAGCCACCTGATTGGCGTCTCTAGTCCACCATGGAC
P4	1.6kb-R	TTCCCATGGTCCAGAGTCATGGTTATCAACGTGGCTTCTTCTGCC
			P5	1.8kb-F	ACGTTGATAACCATGACTCTGGACCATGGGAAATGTCAGAGTGGAG
P6	1.8kb-R	TGGTGGTTCAGGCCTATGTGGCCTAGCCAGCTTGGGTCTCCC
			P7	0.7kb-F	AAGCTGGCTAGGCCACATAGGCCTGAACCACCATGGTGTTGCAG
P8	0.7kb-R	TAGACTCGAGGGCCGTGCAGGCCTTATCAAGACTCTCCCCTGTTG

将16号克隆的大量制备的DNA用5种不同方式进行消化(图5B)。结果显示，所有5种不同的消化产生了尺寸正确的片段，表明载体在正确位置包含所有设计的酶切割位点。然而，片段来自于PCR扩增，不能保证表达；因此，为了证实载体中包含的重链和轻链能够恰当地表达，将DNA瞬时转染到293-T细胞中，并通过FACS分析重链和轻链二者的表达。与对照相比，重链和轻链两者可以分别和同时被检测到。这些结果证明了我们的载体pDGB4能够成功地在细胞表面上表达全长抗体。

四路连接效率分析

构建该载体的目的是便于同时和有效地克隆重链和轻链。为了分析连接和转化效率能够达到多高，将16号克隆的载体DNA用BstXI加SfiI(图5B第4道)和BsmBI加SfiI(图5B第5道)消化，并在电泳分离后分别纯化片段。执行了两个四路连接和转化，并计算了连接和转化效率。

表5：四路连接的克隆效率

注：i)转化混合物的终体积是500μl。将50μl铺板用于随后的菌落分析。阳性对照pUC19的转化效率是107000/ng DNA。阴性对照是没有载体转化的DH5α感受态细胞，并且菌落数为0(未显示)。ii)每个转化使用1μl连接混合物(9ng总DNA)。

为了证实用于计算效率的克隆真正含有正确的载体，选择了16个菌落(8个来自连接1，8个来自连接2)进行分析。将16个克隆的质粒DNA用适合的限制性酶消化，所有16个克隆都含有尺寸正确的片段，进一步支持了我们的四路连接的显著高的效率。结果还显示，只有V的本底在0.9-3.6％的范围内。这无可置疑地证明了我们的四路连接方法确保了高数量和高质量(表5)。

为了模拟药物文库构建中的现实条件，在四路连接中使用PCR扩增的人类κ链文库和人类重链可变结构域文库代替从16号克隆的消化获得的基因片段。连接和转化效率为1x10⁵/μg连接的DNA。

弗林蛋白酶切割位点(FCS)在载体中的插入和序列验证

使用载体pDGB4，我们可以通过转染单一载体将HC和LC二者导入到细胞中，以在细胞表面上表达全长抗体。尽管膜结合抗体可用于FACS分析和抗体选择，但分泌抗体对于真实功能测定来说是必需的。如果抗体能够同时以膜锚定形式和可溶形式表达，将是理想的。弗林蛋白酶是一种细胞蛋白酶，它识别共有氨基酸序列RXRR，并在含有该序列的蛋白到达高尔基体反面网络时在紧邻第四个R后切开蛋白。在病毒膜蛋白基因中插入弗林蛋白酶切割序列能够表达可溶形式的蛋白。因为弗林蛋白酶是部分切割的，因此将弗林蛋白酶切割位点(FCS)插入到pDGB4中重链恒定结构域(Ch)与PDGFR跨膜结构域(TM)之间，可意味着一部分抗体将被释放到培养基中，而其他部分的抗体将保持附着于细胞膜。

将FCS序列插入到载体pDGB4中以形成载体pDGB4-FCS，并对3号克隆进行测序，验证了它在HC与TM之间含有同框的FCS(图5A)。

通过含FCS载体分析抗体表达

为了比较带有和不带有FCS的抗体在细胞表面上的表达，使用了Flip-In系统(Invitrogen)。Flip-in系统包含载体pcDNA^TM 5/FRT、载体pOG44、Flip-in中华仓鼠卵巢(FCHO)细胞系和相关的细胞维持培养基。在Flp-In系统中，只有被转染载体的单个拷贝将通过重组酶介导的DNA重组被整合到一个细胞基因组的指定位置中。通过这种方式，来自不同载体的相同抗体的表达将只取决于该载体的特征，并且我们将不必考虑潜在的变量例如整合载体的拷贝数或整合的位置。

将载体pDGB4-FCS的3号克隆以及pDGB4的16号和78号克隆的质粒DNA，通过与含有重组酶基因的pOG44一起共转染，稳定转染到FCHO细胞中。所有三个克隆都含有相同的抗体基因。3号克隆含有TM和FCS区域两者；16号克隆含有TM但不含FCS序列，并且所有表达的抗体都将是膜锚定的。78号克隆在HC的末端既不含TM也不含FCS，并且所有表达的抗体都将分泌到培养基中。因此，细胞表面上和条件培养基中抗体的量和比例，将只取决于FCS和TM的功能。

将来自于3号、16号和78号克隆的三种所选细胞合并物通过PE结合的小鼠抗人κ链抗体进行染色，并通过FACS进行分析。正如所预期的，90％的来自16号克隆的细胞被检测到在细胞表面上表达抗体，而在78号的细胞表面上没有检测到抗体表达。与16号和78号克隆相反，30％的来自3号克隆的细胞具有表达在细胞表面上的抗体，表明某些抗体可能已被切割并分泌到条件培养基中。

为了证实这种推断，进行了Western印迹。结果显示，在来自FCHO和16号克隆的条件培养基中没有检测到抗体。与来自78号克隆的信号相比，来自3号克隆的信号弱得多。条件培养基中估算的浓度，对于3号克隆来说是每μl 1-2ng，对于78号克隆来说是每μl 4-5ng。这与我们FACS分析的结果完全相符。这些结果证明FCS的插入已经成功有效地操纵了双盒载体，使得它能够表达用于FACS分析的膜结合形式和用于功能测定的分泌形式两种抗体。

讨论

抗体文库构建和抗体药物应用的未来很大程度上取决于筛选和选择平台。尽管过去的展示技术已能有效使用在广泛的各种应用中，但所构建的文库的数量和质量还不能满足当前对抗体药物的更有效开发的需要。随着对用于治疗人类疾病的治疗性抗体的需求的增加，平台将更多地向哺乳动物细胞展示转变，并需要在文库构建的所有方面取得进步。我们的载体通过将过去的展示技术的主要优点进行组合并克服它们的缺点，提供了迈向这种转变的一步。因为我们的平台在哺乳动物细胞上展示全长抗体，它天然包含超过噬菌体和酵母展示的优点。此外，因为我们的平台是人类哺乳动物细胞中的载体系统，它也避开了依赖于动物细胞的杂交瘤技术。

代替经典的酶例如HindIII或BamHI，我们在我们的载体中使用了三种不同的限制性酶：BstXI、BsmBI和SfiI。使用这些酶对于增加我们载体的连接效率以及在仅仅一步中插入重链和轻链两者来说，是至关重要的。因为酶被设计成切开非回文序列，所有自连方式将变得不可能。每个单一载体片段的每个单独边缘是独特的，并且在连接期间只能与其互补边缘相连。因为我们能够控制将要结合的边缘，因此不需要担心自连成为阻碍变量。因此，我们能够一次将所有四个片段连接在载体中。尽我们所知，这种一步四路连接在文库构建中的革新性使用到目前为止还未报道过。我们的结果证明了这种方法的效率确实超过了其他展示平台的报告。使用我们的一步载体系统并消除自连，不仅减少了文库构建过程中的时间消耗，而且增加了抗体文库的总体质量。

除了减少时间消耗和增加文库构建的效率之外，我们的展示系统能够产生用于筛选的膜结合抗体和用于功能测定的可溶抗体两者。细胞表面上的人类抗体可以由极低浓度的PE结合的抗人κ链抗体(制造商建议的剂量的七分之一)检测，并且条件培养基中人类抗体的浓度据估计为每ml 1-2ug。因此，将FCS插入到载体pDGB4中，允许通过FACS选择高亲和性抗体，并直接使用来自细胞的培养基用于功能测定。使用弗林蛋白酶的固有切割活性与跨膜结构域的锚定能力相组合，同时表达分泌的和膜结合抗体，以前还未报道过。

因为抗体基因通过酶消化插入，因此任何其他基因也能插入，只要它们具有正确的末端即可。因此，我们的载体平台的未来应用可以容易地超出抗体表达，并成为任何蛋白表达实验中的枢纽。例如，它能用于克隆其他成对基因例如受体和配体或T-细胞受体的两个亚基。这些分子通过单一载体的共表达甚至能够帮助定量分析分子之间的关系。

总而言之，我们开发了一种新的全长抗体哺乳动物展示系统。该系统的独特特征包括通过四路连接快速构建全长人类抗体展示文库，并同时将抗体表达成膜结合形式和可溶形式两者，用于具有高表达和亲和性的全长单克隆抗体的功能性筛选和选择。

实施例9

本实施例显示了具有超过10¹¹的组合多样性的全长人类抗体哺乳动物展示文库的构建。

从80位以上的供体分离了10⁹个外周血单核细胞(PBMC)。使用RNA Easy试剂盒(Qiagen)从PBMC分离总RNA。通过两步RT-PCR扩增了人类IgG1重链(Vh)的可变结构域和κ轻链(LC)的基因。将PCR产物用与克隆载体匹配的适合的限制性酶消化。在消化后，通过凝胶提取试剂盒(Axygen，Union City，CA)纯化产物。

使用T4DNA连接酶，将Vh文库同框插入到实施例1的载体中人类免疫球蛋白恒定区(Ch)之前。在将连接混合物转化后，通过对转化体的数量进行计数，计算了转化效率和文库大小，并且人类IgG1重链文库的大小是1.32x10⁶。对10个菌落的Vh区进行了序列分析。10个中的8个具有正确的编码序列。

将全长κ链文库克隆到实施例1的载体中。文库大小是6.21x10⁵。对10个菌落的κ基因进行序列分析。10个中的8个具有正确的编码序列。

为了测量文库可表达的百分率，将10个重链克隆的质粒DNA与已测试过能以高水平表达κ链的单一κ链克隆共转染，并将10个κ链克隆的质粒DNA与也已测试过能以高水平表达重链的单一重链克隆共转染。抗体在被转染细胞的表面上的表达通过FACS进行分析。10个重链克隆中的6个和10个κ链克隆中的5个以不同水平表达。

文库的组合多样性分别为在理论上8.2x10¹¹，DNA水平上5.25x10¹¹，表达水平上2.46x10¹¹。

该文库是初级的、通用的全长人类抗体(免疫球蛋白G1/κ)文库。从该文库表达的抗体锚定在哺乳动物细胞表面上，直接用于亲和性和功能筛选和选择。

使用同样策略，构建了几个特异性人类抗体展示文库，其具有10⁹至10¹¹之间的多样性。文库包括人类HBV特异性文库、人类肾癌特异性文库、人类自体免疫疾病特异性文库和个人特异性文库。

使用同样策略，通过使用从用人类肿瘤细胞(肝癌7721、肺癌A549和结肠癌DLD-1)免疫的Kuanming小鼠的脾脏细胞分离的RNA，构建了人类肿瘤特异性的小鼠-人类嵌合抗体(免疫球蛋白G1/κ)哺乳动物展示文库。文库的组合多样性在理论上为1.11x10¹⁰，在DNA水平上为1.78x10⁹。

使用同样策略，还构建了另外两个嵌合抗体展示文库。一个是使用从正常Kuanming小鼠脾脏分离的RNA构建的未免疫的小鼠-人类嵌合抗体文库，组合文库的大小为7.99x10¹⁰。另一个是使用来自正常xingxilang兔的RNA构建的未免疫的兔-人类嵌合抗体文库，组合文库的大小为7.57x10¹⁰。

实施例10

本实施例描述了抗体样二价肽体(ALBP)哺乳动物展示文库的构建。

肽文库使用装配型PCR构建，其在基因的5’-末端具有同框的小鼠信号肽，并在两个末端侧翼带有适合的限制性酶切割序列。肽文库的DNA序列具有36个核苷酸的尺寸，编码12个氨基酸的肽。

构建了两个不同的肽体文库。在一个文库中，多肽与人类IgG1恒定区融合(PepG文库)，而在另一个中，与人类κ链的恒定区融合(PepK文库)。PepG和PepK文库的大小分别为3.96x10⁵和1.19x10⁶对10个pepG克隆和9个pepK克隆进行了序列分析。10个pepG中的7个给出了序列结果，并且7个中的4个具有正确的编码序列。10个pepK克隆中的6个具有正确的编码序列。

文库的组合多样性分别在理论上为4.7x10¹¹，在DNA水平上为1.6x10¹¹。

FACS分析使用FITC结合的TNF、HBsAg和来自人类结肠肿瘤DLD-1细胞的蛋白进行，并且证实了这些抗原与ALBP文库转染的293-T细胞的结合。

实施例11

本实施例显示了HIV特异性人类抗体文库的构建以及从文库分离HIV gp120特异性抗体。

从HIV感染的长期存活供体分离PBMC，并使用RNA Easy试剂盒(Qiagen)从PBMC分离总RNA。通过两步RT-PCR扩增人类免疫球蛋白重链可变结构域(Vh)的基因。人类κ链的扩增没有成功。将Vh的PCR产物用与克隆载体匹配的适合的限制性酶消化。在消化后通过凝胶提取试剂盒(Axygen，Union City，CA)纯化产物。

使用T4DNA连接酶，将Vh文库同框插入到实施例1的载体中IgG1恒定区(Ch)之前，重链文库的大小为1.16x10⁵(HIV-Vh-Lib)。

也通过四路连接将HIV Vh文库插入到实施例2的载体中。在该构建中，使用单一κ链基因CZR1代替κ链文库。文库大小为7.8x10⁴(HIV-CZR-Lib)。

为了分析抗体的表达，将HIV-CZR-Lib转染到FCHO细胞中，并在潮霉素(500ug/ml)下进行筛选。将稳定的筛选细胞合并物用FITC结合的HIV包膜蛋白gp120(FITC-gp120)染色，并通过FACS进行分析。约3％的细胞显示出特异性抗原结合，表明在细胞表面上存在gp120特异性抗体。通过FACS分离这部分细胞，并通过PCR扩增编码该特异性抗体的Vh基因，通过标准的分子生物学技术对其进行分析。一个克隆显示出与FITC-gp120的特异性结合。

实施例12

本实施例显示了人类抗体文库构建试剂盒的组成和使用该试剂盒快速构建个人化的人类抗体文库。

核心试剂盒包含：1)单表达盒载体；2)双表达盒载体；3)人类重链引物组1、2和3(HGP1、HGP2和KGP3)，以及4)人类κ链引物组1、2和3(HKP1、HKP2和HKP3)。

从单一供体获得6ml外周血，并从血液分离到3x10⁶个PBMC。从PBMC纯化到1500ng总RNA，并通过RT-PCR扩增了Vh和κ链的基因。

将扩增的抗体基因纯化，用适合的限制性酶消化，并插入到单表达盒载体中。重链和κ链文库的大小分别为9.4x10⁴和8.4x10⁴。组合文库的大小为7.9x10⁹。

用重链和轻链文库共转染的293T细胞的FACS分析证实了抗体在细胞表面上的表达。

尽管出于清楚地理解的目的，上述发明已经通过图示和实施例在某些细节上进行了描述，但对于本技术领域的专业人员来说，显然可以进行某些少量改变和修改。因此，说明书和实施例不应该被解释为限制本发明的范围。

Claims (20)

1.一种编码特异性识别特定抗原的抗体的多核苷酸的分离方法，所述方法包含：

a)筛选用编码轻链的第一个多核苷酸初级文库和编码重链的第二个初级文库瞬时转染、并在细胞表面上展示由所述多核苷酸编码的抗体的哺乳动物细胞初始群体，以获得哺乳动物细胞的亚群；

b)将从所述哺乳动物细胞亚群提取的mRNA反转录成cDNA并扩增所述cDNA，以产生多核苷酸的子文库；

c)筛选用所述多核苷酸子文库转染、并在细胞表面上展示由所述多核苷酸编码的抗体的哺乳动物细胞群体，以获得哺乳动物细胞的第二个亚群；以及

d)从所述哺乳动物细胞的第二个亚群分离编码特异性识别特定抗原的抗体的多核苷酸。

2.权利要求1的方法，其中在步骤d)之前将步骤b)和c)重复至少一次。

3.权利要求2的方法，其中在步骤d)之前将步骤b)和c)重复不超过约3次。

4.权利要求1的方法，其中初级文库中的多核苷酸编码至少10⁹种不同抗体。

5.权利要求1的方法，其中将哺乳动物细胞的初始群体在群体中的各个哺乳动物细胞能够摄取约1000以上个多核苷酸拷贝的条件下用初级文库进行瞬时转染。

6.权利要求1的方法，其还包含将多核苷酸的初级文库瞬时转染到哺乳动物细胞的初始群体中。

7.权利要求1的方法，其中步骤a)包含：

(i)将哺乳动物细胞的初始群体在适当的结合条件下与抗原相接触；以及

(ii)回收与抗原结合的哺乳动物细胞亚群。

8.权利要求7的方法，其中回收通过FACS、磁珠或其组合来进行。

9.权利要求1的方法，其中步骤c)包含：

(i)将富集的哺乳动物展示文库在适当的结合条件下与抗原相接触；以及

(ii)回收与抗原结合的哺乳动物细胞亚群。

10.权利要求9的方法，其中步骤(i)中的结合条件比权利要求7中步骤(i)的结合条件更严紧。

11.权利要求1的方法，其中步骤d)包含：

i)从细胞亚群分离mRNA；

ii)将mRNA扩增成cDNA；

iii)将cDNA克隆到克隆载体中；以及

iv)测定DNA的序列。

12.权利要求1的方法，其中初始哺乳动物展示文库从骨髓、脾脏、淋巴结和淋巴细胞的任一种产生。

13.权利要求1的方法，其中初始哺乳动物展示文库从人产生。

14.权利要求1的方法，其中抗体是全长抗体。

15.权利要求14的方法，其中步骤a)包含筛选用编码轻链的第一个多核苷酸初级文库和编码重链的第二个初级文库转染、并在细胞表面上展示全长抗体的哺乳动物细胞的初始群体。

16.一种编码特异性识别抗原的抗体的多核苷酸的分离方法，所述方法包含：

a)从用编码轻链的第一个多核苷酸初级文库和编码重链的第二个多核苷酸初级文库转染的哺乳动物细胞初始群体中筛选出展示特异性识别抗原的抗体的细胞，并回收哺乳动物细胞亚群；

b)将从所述哺乳动物细胞亚群提取的mRNA反转录成cDNA并扩增所述cDNA，以产生编码轻链的第一个多核苷酸子文库和编码重链的第二个多核苷酸子文库；

c)从用第一个多核苷酸子文库和第二个多核苷酸子文库转染的哺乳动物细胞群体中筛选出展示特异性识别抗原的抗体的细胞，并回收哺乳动物细胞的第二个亚群；

d)将从所述哺乳动物细胞的第二个亚群提取的mRNA反转录成cDNA并扩增所述cDNA，以产生编码轻链和重链的第三个多核苷酸子文库；

e)从用第三个多核苷酸子文库转染的哺乳动物细胞群体中筛选出展示特异性识别抗原的抗体的细胞，并回收哺乳动物细胞的第三个亚群；以及

f)从所述哺乳动物细胞的第三个亚群分离出编码特异性识别抗原的抗体的多核苷酸。

17.一种构建编码抗体的多核苷酸文库的方法，其中多核苷酸总计编码至少约10⁹种不同的重组抗体。

18.一种用编码抗体的多核苷酸瞬时转染的哺乳动物细胞群体，其中多核苷酸总计编码至少约10⁹种不同的重组抗体。

19.一种表达载体，其包含侧翼带有一对可被限制性酶识别的切割位点的开放阅读框，其中用所述限制性酶切割所产生的每个片段的末端不自连。

20.一种双表达盒载体，所述载体包含：1)侧翼带有可被限制性酶识别的第一对切割位点的第一个开放阅读框，其中用所述限制性酶切割所产生的每个片段的末端不自连；以及2)侧翼带有可被限制性酶识别的第二对切割位点的第二个开放阅读框，其中用所述第二种限制性酶切割所产生的每个片段的末端不自连。

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