KR20110058861A - 조류 유래 항체의 클로닝 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 특정 표면 항원 마커가 풍부한 조류 세포 개체군으로부터의 VH 및 VL 엔코딩 서열의 동족쌍의 연결방법에 관한 것이다. 상기 연결방법은 증폭과 연계하여 대상 뉴클레오티드 서열을 연결시킬 수 있는 멀티플렉스 분자 증폭 절차(멀티플렉스 PCR)를 포함한다. 상기 방법은 닭 또는 다른 새로부터의 항체 가변 영역 엔코딩 서열의 동족쌍 라이브러리뿐 아니라 조합 라이브러리의 생성에 특히 유익하다. 본 발명은 또한 키메라 인간/조류 항체의 생성방법 및 이들 방법에 의해 생성되는 발현 라이브러리를 제공한다.
Description
본 발명은 특정 표면 항원 마커가 풍부한(enriched) 조류 유래 세포의 개체군으로부터의 항체 중쇄 및 경쇄 엔코딩 서열의 동족쌍(cognate pair)의 연결방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 증폭, 특히 중합효소 연쇄 반응(멀티플렉스(multiplex) PCR)과 연계하여 대상 뉴클레오티드 서열을 연결시킬 수 있는 멀티플렉스 분자 증폭 절차를 포함한다. 이러한 방법은 면역글로불린으로부터의 가변 영역 엔코딩 서열의 동족쌍 라이브러리뿐 아니라 조합 라이브러리(combinatorial library)의 생성에 특히 유리하다. 본 발명은 또한 키메라 인간/조류 항체의 생성 방법 및 그러한 방법에 의해 생성되는 발현 라이브러리에 관한 것이다.
제WO 2005/042774호는 멀티플렉스 분자 절차를 이용하여 대상 뉴클레오티드 서열, 특히 항체 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역(VH 및 VL) 엔코딩 서열의 동족쌍을 연결하는 방법을 개시하고 있다. 대상 서열은 바람직하게는 제한 희석(limiting dilution) 또는 다른 세포 분리 기술 이후에 분리된 단일 세포로부터 증폭되고 연결된다. 상기 참고문헌은 멀티플렉스 분자 증폭 절차에 특히 적합한 항체 생성/엔코딩 세포, 예를 들어, 혈장 세포의 개체군을 수득하기 위해 림프구-함유 세포 개체군을 농축하는 다양한 방법을 개시하고 있다.
제WO 2008/104184호는 표면 항원 CD43 및 CD138 또는 MHCII 및 B220가 풍부한 분리된 단일 세포의 개체군 상에서 수행되는 멀티플렉스 증폭 절차를 이용하여, 마우스 또는 다른 설치류로부터 면역글로불린 엔코딩 서열의 라이브러리를 생성하는 방법을 개시하고 있다.
이들 문헌에 기재된 방법은 일반적으로 심플렉스(Symplex™) 기술로 지칭되며, 이 방법은 특히, 인간 세포로부터, 또는 마우스 또는 다른 설치류의 세포로부터 유래된 가변 영역 엔코딩 서열의 동족쌍의 라이브러리의 생성에 적용된다. 그러나, 이들 문헌은 닭 또는 다른 새의 세포로부터 동족쌍의 라이브러리 또는 조합 라이브러리를 생성하는 이슈를 제기하지 않았다. 조류 항체 또는 바람직하게는 키메라 인간/조류 항체를 생성하기 위한 목적을 위한, 이러한 접근법은 한편으로는 인간 및 다른 한편으로는 닭 또는 다른 새 사이의 계통발생적 차이를 고려해 볼 때 흥미로운 것이다. 이는 마우스와 인간이 상대적으로 말해 밀접하게 관련된 종이기 때문에, 다양한 인간 질환 및 증상의 치료를 위한 치료 항체가 종종 마우스로부터 생성되나, 인간 항원에 대한 최적의 항체가 마우스 또는 기타 포유동물 종에서 생성될 수 없는 인간 질환 및 증상이 있을 수 있다는 사실 때문이다. 이는 특히 암 또는 자가면역 질환의 치료를 목적으로 하는 인간 자가-항원을 표적으로 하는 항체에 대한 경우일 수 있다. 이들 경우에 있어서, 닭 또는 다른 새와 같은 인간과 계통발생적으로 먼 종으로부터 대상 항체를 분리할 수 있는 것이 유익할 수 있다. 본 발명은 궁극적으로 신규하고 유용한 항체 치료를 동정할 수 있도록 인간 치료제로서 사용하기 위한 유력한 대상의 항체를 생성하는 조류 세포를 분리하는 방법의 문제를 제기한다.
발명의 요약
본 발명은 새로부터 면역글로불린 엔코딩 서열의 라이브러리를 생성하는 방법, 및 인간 불변 영역 및 조류 가변 영역을 포함하는 키메라 항체를 코딩하는 벡터의 라이브러리를 생성하는 방법에 초점을 맞추고 있다. 본 발명의 방법은 상대적으로 적은 단계들을 수반하며, 고효율(high throughput) 스크리닝 및 클로닝에 적합하다.
제1면에서, 본 발명은
a) 조류 기원의 공여체로부터의 림프구-함유 세포 분획을 제공하는 단계;
b) 상기 세포 분획으로부터의 세포를 개별적으로 다수의 용기 내로 분배시켜, 분리된 단일 세포 개체군을 수득하는 단계로서, 적어도 상기 세포의 하위개체군(subpopulation)이 면역글로불린 유전자, 바람직하게는 IgY 및 임의로 임의의 조류 B 세포 마커 항원을 발현하는 단계; 및
c) 멀티플렉스 분자 증폭 절차로, 분리된 단일 세포 또는 동질유전자(isogenic) 세포 개체군으로부터 유래된 주형을 사용하여 대상 뉴클레오티드 서열을 증폭시키고, 상기 증폭된 대상 뉴클레오티드 서열의 연결을 달성함으로써, 상기 분리된 단일 세포 개체군 내에 포함된 가변 영역 엔코딩 서열을 증폭시키고 상기 서열의 연결을 달성하는 단계를 포함하여, 연결된 가변 영역 엔코딩 서열을 포함하는 동족쌍의 라이브러리를 생성하는 방법에 관한 것이다.
이 방법은 동족쌍 항체 또는 항체 단편의 라이브러리를 제공한다.
또 다른 면에서, 본 발명은
a) 멀티플렉스 분자 증폭 절차로, 유전적으로 다양한 세포 개체군으로부터 유래된 주형을 사용하여 대상 뉴클레오티드 서열을 증폭시키는 단계로서, 상기 유전적으로 다양한 세포는 조류 기원의 림프구-함유 세포 분획으로부터 유래되며, 적어도 상기 세포의 하위개체군은 면역글로불린 유전자, 바람직하게는 IgY 및 임의로 임의의 조류 B 세포 마커 항원을 발현하는 단계; 및
b) 단계 a)에서 증폭된 상기 대상 뉴클레오티드 서열의 연결을 달성하는 단계를 포함하여, 대상이 되는 다수의 비-연속(non-contiguous) 뉴클레오티드 서열을 무작위적으로 연결하는 방법에 관한 것이다.
이 방법은 무작위적으로 조합된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 엔코딩 도메인의 조합 라이브러리를 제공한다.
본 발명의 세포의 면역글로불린-발현 하위개체군은 특히 다음 중 임의의 것을 특징으로 할 수 있고, 이에 대해 평가 및/또는 농축될 수 있다:
IgY의 발현(IgY+),
IgY의 발현 및 CD3 음성(IgY+ CD3-),
IgY의 발현, Bu-1의 미발현 또는 낮은 발현, 및 CD3 음성(IgY+ Bu-1- CD3-),
Bu-1 및 IgY의 발현(Bu-1+ IgY+),
Bu-1 및 IgY의 발현, 및 CD3 음성(Bu-1+ IgY+ CD3-),
Bu-1이 발현되나 어떤 단핵구 마커도 발현되지 않음(Bu-1+, 단핵구-),
Bu-1의 발현 및 IgM이 없거나 낮은 수준(Bu-1+ IgM-), 또는
Bu-1 및 BAFF의 발현(Bu-1+ BAFF+).
상기 세포의 하위개체군은 특히 조류 면역글로불린 IgY의 발현을 특징으로 한다. 이러한 하위개체군은 추가로 임의의 하나 이상의 조류 B 세포 마커 항원의 발현 및/또는 발현의 결여를 특징으로 할 수 있는데, 이는 IgY와 같은 면역글로불린 유전자를 발현하는 세포의 하위개체군이 또한 적어도 하나의 조류 B 세포 마커 항원도 검출가능한 수준으로 발현할 것이라고 예상될 수 있기 때문이다. 따라서, 하위개체군은 임의의 하나 이상의 조류 B 세포 마커 항원의 검출가능한 수준의 발현, 임의로 이의 특정 수준의 발현의 견지에서 및/또는 임의의 하나 이상의 조류 B 세포 마커 항원의 발현의 결여의 견지에서 정의될 수 있으며, 여기서 조류 B 세포 마커 항원은 예를 들어, Bu-1, CD3, IgM 또는 BAFF 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에 있어서, 하위개체군은 IgY의 발현과 CD3 음성(CD3-, 즉 CD3의 발현이 없거나 이의 발현이 무시해도 좋을 정도임)인 것을 특징으로 한다. 추가의 특정 실시형태에 있어서, 하위개체군은 IgY의 발현, Bu-1의 미발현 또는 낮은 발현 및 CD3 음성인 것을 특징으로 한다.
또한, 대상이 되는 다른 마커 항원은 CD19, CD20, CD27, CD38 또는 CD45와 같은 인간 B 세포 마커의 조류 오솔로그(ortholog); 또는 MHCII, B220, CD43 또는 CD138과 같은 뮤린 B 세포 마커의 조류 오솔로그; 또는 이들 마커의 조합을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 제공되는 실험적 데이터는 임의로, Bu-1 및/또는 CD3과 같은 표면 항원의 발현 또는 이의 발현의 결여에 대한 분류와 병용하여, IgY의 발현에 기초하여 닭 유래 비장세포로부터 분리된 세포 개체군이 멀티플렉스 분자 증폭 방법을 사용하여 항체를 엔코딩하는 서열의 클로닝을 위한 우수한 출발 물질을 제공한다는 것을 확립시켰다. 본 발명의 방법은 IgY 및 임의로 다른 조류 B 세포 마커 항원의 오솔로그를 발현하는 다른 종에 용이하게 적용될 수 있다. 이 방법은 특히 다른 조류 종, 예를 들어, 오리, 거위, 비둘기 또는 칠면조에 적용될 수 있다.
또한, 본 발명의 방법은 용이하게 시퀀싱(sequenced)될 수 있고/거나 발현 벡터, 전달 벡터, 디스플레이(display) 벡터 또는 셔틀(shuttle) 벡터와 같은 벡터에 삽입될 수 있는 폴리뉴클레오티드의 라이브러리를 제공하여, 특정 항체가 선택되면, 이것이 클로닝되고, 이의 서열이 결정되고, 이것이 재조합 항체의 생성을 위한 적절한 발현 벡터로 용이하게 전달될 수 있게 한다.
본 명세서에 제공된 프로토콜에 따라 분류된 세포가, 유력하게 피코몰(picomolar) 범위의 친화도를 지니는, 고 친화력 항체의 공급원을 제공할 수 있을 것으로 예상된다. 하이브리도마(hybridoma)로부터의 모노클로날 항체는 피코몰 범위의 친화도를 보유하지 않을 수 있으며, 이러한 친화도에 도달하기 위해 합성적으로 친화도가 성숙될 필요가 있을 것이다.
일 실시형태에 있어서, 이들 방법은 멀티플렉스 분자 증폭에 앞서, 림프구-함유 세포 개체군이 조류 면역글로불린 유전자, 특히 IgY의 발현 및 임의로, 하나 이상의 조류 B 세포 표면 마커, 바람직하게는 CD3 및/또는 Bu-1의 발현(존재 또는 부재, 또는 특정 수준의 발현)에 의해 정의되는 세포를 포함하는 것을 상술된 기준에 따라 평가하는 단계를 추가로 포함하며, 예를 들어, 상기 개체군은 검출가능한 수준의 IgY 및/또는 Bu-1을 발현하는 세포를 포함한다. 또한, 상기 방법은 멀티플렉스 분자 증폭에 앞서, IgY의 발현, 및 새 B 세포 표면 마커, 바람직하게는 상술된 바와 같은 CD3 및/또는 Bu-1 중 하나 또는 이의 조합의 발현 및/또는 발현의 결여의 견지에서 정의되는 림프구 개체군에 대해 상기 림프구-함유 세포 분획을 농축하는 단계, 예를 들어, IgY를 발현하며, 예를 들어 Bu-1 및/또는 CD3의 발현 또는 발현의 결여를 특징으로 하는 세포에 대해 농축하는 단계를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에 있어서, 개체군은 IgY를 발현하는 세포에 대해 평가 및/또는 농축된다. 다른 특정 실시형태에 있어서, 개체군은 IgY를 발현하고 CD3 음성이거나, 또는 IgY 및 Bu-1를 발현하거나, 또는 IgY를 발현하고, BU-1을 발현하지 않거나 낮은 수준의 Bu-1을 발현하는 세포에 대해 평가 및/또는 농축될 수 있다.
바람직하게는, 상기 방법은 멀티플렉스 분자 증폭에 앞서, 면역글로불린 유전자 및 조류 B 세포 항원을 발현하는 단일 세포를 상기 림프구-함유 개체군으로부터 분리하는 단계를 추가로 포함한다. 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 분리된 단일 세포 또는 세포의 하위개체군은 양성 또는 음성이거나, 또는 림프구-함유 세포 분획 대비 높은, 중간의, 또는 낮은, 즉 상기에 기재된 기준에 따른 이들의 IgY, Bu-1 및/또는 CD3의 발현 프로파일을 특징으로 한다. 바람직한 실시형태에 있어서, 세포의 하위개체군의 분리된 단일 세포는 IgY+ 및/또는 Bu-1+, 바람직하게는 IgY+, 예를 들어, CD3-/Bu-1-/IgY+이다. 농축 또는 분리는 바람직하게는 자동화된 분류 절차, 예컨대, 유세포 분석, 특히 형광 활성화된 세포 분류(FACS)를 포함한다. 대안적으로, 분류는 자성 비드 세포 분류(magnetic bead cell sorting, MACS)를 사용하여 수행될 수 있다.
추가의 면에서, 본 발명은
a) 조류 기원의 공여체로부터의 림프구-함유 세포 분획을 제공하는 단계;
b) 상기 세포 분획으로부터의 세포를 개별적으로 다수의 용기 내로 분배시켜, 분리된 단일 세포 개체군을 수득하는 단계;
c) 멀티플렉스 분자 증폭 절차로, 분리된 단일 세포 또는 동질유전자 세포 개체군으로부터 유래된 주형을 사용하여 상기 분리된 단일 세포 개체군 내에 포함된 가변 영역 엔코딩 핵산을 증폭시키고; 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 엔코딩하는 증폭된 핵산의 연결을 달성함으로써, 상기 분리된 단일 세포 개체군 내에 포함된 가변 영역 엔코딩 핵산을 증폭시키고 상기 핵산의 연결을 달성하는 단계;
d) 상기 증폭된 가변 영역의 인간 불변 영역으로의 연결을 달성하는 단계; 및
e) 상기 수득된 핵산을 벡터 내로 삽입하는 단계를 포함하여, 인간 불변 영역 및 비-인간 가변 영역을 지니는 키메라 항체를 엔코딩하는 벡터를 생성하는 방법에 관한 것이다.
바람직하게는, 상기 새 종은 닭이다. 본 발명의 방법이 닭/암탉 유래 세포에 적용되는 범위 내에서, 이러한 방법은 닭 Symplex™ 또는 chSymplex™으로 명명된다.
본 발명의 이러한 면에 의해, 키메라 인간/조류 항체의 라이브러리의 신규한 생성방법이 제공된다. 이것은 멀티플렉스 분자 증폭 및 벡터 골격내로의 후속 클로닝과 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인의 라이게이션 및/또는 스플라이싱을 결합시킴으로써 가능해진다. 통상적으로, 키메라 인간/조류 항체를 생성하기 위한 방법에서, 키메라화(chimerisation)는 하이브리도마가 확립되고 스크리닝되고, 엔코딩된 항체가 클로닝된 후 마지막 단계가 되어 왔다. 키메라화는 항체의 결합 특이성 및/또는 친화도에 영향을 미칠 수 있고, 그에 따라, 우수한 모노클로날 닭 항체가, 이것이 인간/닭 항체로 키메라화될 때 이의 효능을 잃게 되는 위험이 존재한다.
키메라 항체의 항체 레퍼토리를 직접적으로 생성하는 방법의 실무(provision)에서, 스크리닝은 예비임상 및 임상 개발에 앞서 추가로 변형될 필요가 없는 생성물에 대해 수행될 수 있다.
불변 인간 영역은 분자 증폭 단계에서 제공될 수 있거나, 이들은 벡터-골격의 일부분으로써 제공될 수 있는데, 가변 영역이 분자 증폭 후에 상기 벡터-골격 내로 클로닝된다. 바람직한 실시형태에 있어서, 이 방법은 추가의 증폭 단계를 포함하는데, 여기서 가변 경쇄에 대한 연결을 제공할 수 있는 중첩부(overlap)를 지니는 인간 불변 경쇄를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편은, 닭 VH 쇄, 링커, 닭 VL 쇄 및 인간 불변 경쇄를 순서대로 포함하는 작제물을 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트와 함께 PCR 혼합물에 첨가된다.
또 다른 실시형태에 있어서, 상기 방법은 추가의 증폭 단계를 포함하는데, 여기서 가변 중쇄에 대한 연결을 제공할 수 있는 중첩부를 지니는 인간 불변 중쇄를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편은, 인간 불변 중쇄, 닭 VH 쇄, 링커 및 닭 VL 쇄를 순서대로 포함하는 작제물을 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트와 함께 PCR 혼합물에 첨가된다.
결과적으로, 또한 각각의 항체 구성원이 조류 면역글로불린 가변 영역 엔코딩 서열 및 인간 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진 키메라 항체를 엔코딩하는 벡터의 라이브러리가 제공된다.
바람직하게는, 상기 벡터는 항원 특이성에 대한 후속 스크리닝을 위해 상기 라이브러리의 항체 구성원의 발현을 가능하게 하는 발현 벡터이다. 더욱 바람직하게는, 상기 발현 벡터는 포유동물 발현용 벡터이다. 상기 라이브러리의 벡터는 본 발명의 방법에 의해 수득될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 상기 경쇄 불변 영역은 인간 람다 또는 카파 불변 영역이다.
상기 조류 서열은 적합한 프라이머의 설계를 가능하게 하기 위해 서열 정보가 입수가능하고, 가변 영역 서열의 동족쌍을 연결시키기 위하여 적합한 세포 분류 기술이 단일 세포 멀티플렉스 분자의 증폭을 위한 항체 생성 또는 엔코딩 세포의 분류를 가능하게 하는 임의의 조류 기원의 공여체로부터의 것일 수 있다.
바람직하게는, 항체의 가변 영역은 동족쌍이다.
또 다른 면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 라이브러리로부터 선택되는, 특정 표적에 대해 유도된 요망되는 결합 특이성을 나타내는 항체를 코딩하는 서브-라이브러리(sub-library)에 관한 것이다.
추가의 면에서, 본 발명은 조류 공여체로부터의 림프구-함유 세포 분획으로부터 유래된 하나의 세포로서, IgY 및/또는 Bu-1 항원을 비롯한 면역글로불린 유전자를 발현하는 세포, 및 mRNA의 역전사를 수행하고, 가변 중쇄 및 경쇄 엔코딩 영역을 증폭시키는 데 필요한 완충액 및 시약이 대부분의 웰에 포함되는 멀티웰(multiwell) 플레이트를 제공한다.
추가의 면에서, 본 발명은
a) 조류 기원의 공여체로부터의 림프구-함유 세포 분획을 제공하는 단계;
b) 상기 세포 분획으로부터의 세포를 개별적으로 다수의 용기 내로 분배시켜, 분리된 단일 세포 개체군을 수득하는 단계로서, 적어도 상기 세포의 하위개체군이 면역글로불린 유전자, 예를 들어 IgY 및 임의로 적어도 하나의 조류 B 세포 마커 항원을 발현하는 단계; 및
c) 멀티플렉스 분자 증폭 절차로, 분리된 단일 세포 또는 동질유전자 세포 개체군으로부터 유래된 주형을 사용하여 대상 뉴클레오티드 서열을 증폭시켜, 상기 분리된 단일 세포 개체군 내에 포함된 가변 영역 엔코딩 서열을 증폭시키는 단계를 포함하는, 조류-유래의 면역글로불린 가변 영역 엔코딩 서열의 라이브러리의 생성방법을 제공한다.
이러한 방법에 의해, 조류-유래의 면역글로불린 가변 영역 엔코딩 서열의 라이브러리는 본 명세서에서 일반적으로 기재된 바와 같은 조류 면역글로불린 유전자를 발현하는 세포의 하위개체군으로부터 수득될 수 있다. 상기 방법은 중쇄 및 경쇄 가변 영역 엔코딩 서열의 연결을 달성하여, 동족쌍의 라이브러리, 즉, 조류-유래의 항체 또는 이의 단편의 라이브러리를 수득하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
도면의 간단한 설명
도 1: 닭 가변 영역의 멀티플렉스 RT-PCR 및 네스티드(nested) 증폭의 원리. 하기의 프라이머 약어를 사용하였다: CH-HCrev: 닭 IgY 중쇄 불변 영역 안티센스 프라이머, CH-VH: 닭 중쇄 가변 영역 5' 센스 프라이머, CH-VL: 닭 경쇄 가변 영역 5' 센스 프라이머, CH-LCrev: 닭 경쇄 불변 영역 안티센스 프라이머, CH-JH: 닭 중쇄 J-영역 안티센스 프라이머, CH-JL: 닭 경쇄 J-영역 안티센스 프라이머.
도 2: 중첩 신장 PCR, 벡터 골격 내로의 클로닝 및 포유동물 프로모터-리더(leader) 단편의 부가에 의한 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역의 부가의 원리. 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 적절한 J-영역에 대한 중첩부와 함께 증폭시켰다. 하기의 프라이머 약어를 사용하였다: hCHC-R: 인간 IgG1 불변 영역 3' 안티센스 프라이머, hL-R: 인간 람다 불변 영역 3' 안티센스 프라이머.
도 3 내지 9는 각종 표면 마커(Bu-1, CD3, IgY 및 TT에 대해 특이적인 IgY)에 대해 염색된 닭 비장세포의 점도표(dot plot)를 도시한 것이다. 닭을 파상풍 톡소이드를 사용하여 면역화시키고, 불완전 프레운트 애주번트(IFA) 중의 TT를 사용한 3차 부스트 10일 후에 비장을 수집하였다. 실시예 1 참고.
도 3: 이러한 비장세포 개체군 내에서 3가지 게이트(gate)가 설정되었다: (1) Bu-1+CD3- 세포(상부 좌측), (2) 중간의 개체군, P2 (Bu-1lowCD3-/ low), (3) Bu-1- CD3- 세포(하부 좌측).
도 4: Bu-1+CD3- 세포 중에, 추가의 IgY+ 게이트가 포함되었다.
도 5: Bu-1+CD3-IgY+ 세포 중에, TT+ 세포가 게이트되었다.
도 6: Bu-1-CD3- 세포 중에, 추가의 IgY+ 게이트가 포함되었다.
도 7: Bu-1-CD3-IgY+ 세포 중에, TT+ 세포가 게이트되었다.
도 8: 중간의 개체군, P2 중에, 새로운 게이트가 IgY+ 세포로 정의되었다(P3).
도 9: Bu-1lowCD3-/ lowIgY+ 세포(P3) 중에, TT+ 세포가 게이트되었다.
도 10은 키메라 닭-인간 항-파상풍 톡소이드 항체 레퍼토리를 클로닝한 실시예 4로부터 예상되는 전기영동 이동을 가지는, 21개의 심플렉스 반응 생성물을 함유하는 아가로오스 겔을 나타낸 것이다. 크기 마커(500, 1000, 1500 등의 염기쌍 밴드)도 또한 나타내었다.
도 11은 정제된 닭 VH-VL, 인간 람다 경쇄 불변 영역 및 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 엔코딩 서열의 혼합물에서의 중첩 신장 PCR 이후의 반응 생성물(대략 2 kb 중첩 밴드)을 나타낸 것이다.
도 12는 심플렉스 PCR에 의한, 파상풍 톡소이드로 면역화된 닭의 비장 B 세포에서 분리된 항체의 10개의 무작위적으로 선별된 클론으로부터의 VH 영역의 정렬을 나타낸 것이다. 짧은 스트레치(stretch)의 프랭킹(flanking) 프레임워크(framework) 및 인간 HC 불변 영역을 갖는 CDR3 영역을 나타내었다. 나타낸 서열은 위에서부터 아래로 서열 번호 13 내지 서열 번호 22의 서브서열(subsequence)이다.
도 13 및 14는 5가지 파상풍 톡소이드-특이적 클론의 VH(도 13) 및 VL(도 14)의 CDR3 영역의 정렬을 나타낸 것이다. 도 13: VH CDR3 정렬; 서열은 위에서부터 아래로, 서열 번호 23 내지 서열 번호 27의 서브서열이다. 도 14: VL CDR3 정렬; 서열은 위에서부터 아래로, 서열 번호 28 내지 서열 번호 32의 서브서열이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 새로부터의 항체 벡터의 집합체(collection)를 제공하기 위한 제WO 2005/042774호에 개시된 일반적인 증폭 및 연결 방법을 사용하기 위한 추가의 가능성을 제공한다. 이러한 개선은 가변 영역의 동족쌍을 지니는 인간/조류 키메라 항체를 엔코딩하는 서열의 클로닝이 고-효율 포맷으로 적합하게 할 수 있다. 이것은 상기 증폭 및 연결 과정을 위한 신규한 출발 물질을 제공함에 의해 그리고 가변 영역의 동족쌍을 지니는 키메라 인간/조류 항체의 라이브러리의 생성방법을 제공함에 의해 달성된다.
본 발명의 일 면은, 멀티플렉스 분자 증폭 절차로, 분리된 단일 세포, 동질유전자 세포 개체군, 또는 유전적으로 다양한 세포 개체군으로부터 유래된 주형을 사용하여 적절한 조류 뉴클레오티드 서열을 증폭시키는 단계 및 상기 증폭된 서열의 후속 연결을 달성하는 단계에 의한, 중쇄 및 경쇄 가변 서열의 연결방법이다.
정의
용어 "동족쌍(cognate pair)"은 단일 세포 내에 함유되거나 이로부터 유래된 대상이 되는 본래의 비인접(non-contiguous) 핵산의 쌍을 기술한 것이다. 바람직한 실시형태에서, 동족쌍은 결합 단백질 가변 도메인을 함께 엔코딩하고 동일한 세포로부터 유래되는 2개의 가변 영역 엔코딩 서열을 포함한다. 따라서, 완전한 결합 단백질로서 또는 이의 안정한 단편으로서 발현되는 경우, 이들은 이러한 세포로부터 본래적으로 발현되는 결합 단백질의 결합 친화도 및 특이성을 보존한다. 동족쌍은, 예를 들어, 동일한 세포로부터의 가변 경쇄 엔코딩 서열과 회합된(associated) 항체 가변 중쇄 엔코딩 서열, 또는 동일한 세포로부터의 β 쇄 엔코딩 서열과 회합된 T 세포 수용체 α 쇄 엔코딩 서열일 수 있다. 동족쌍의 라이브러리는 이러한 동족쌍의 집합체이다.
용어 "세포의 동질유전자 개체군"은 유전적으로 동일한 세포 개체군을 기술한 것이다. 특히, 분리된 단일 세포의 클론 증대(clonal expansion)에 의해 유래된 세포의 동질유전자 개체군이 본 발명에서 관심대상이다.
용어 "분리된 단일 세포"는 "단일 용기 내의 단일 세포"에 상응하는, 세포 개체군으로부터 물리적으로 분리된 세포를 기술한 것이다. 다수의 용기 내에서 세포 개체군을 개별적으로 분배시키는 경우, 분리된 단일 세포 개체군이 수득된다. "주형 공급원" 제목의 섹션에서 특정된 바와 같이, 이를 단일 세포 개체군으로 간주하기 위하여 단일 세포를 지니는 용기의 비율이 반드시 100%일 필요는 없다.
세포의 표면 상의 항원 마커의 발현 수준의 문맥에서, 용어 "높은", "중간의" 및 "낮은"은 임의의 주어진 분석 또는 분류 절차로 분석된 세포의 완전한 개체군과 비교한, 세포의 서브세트(subset)의 상대적 형광 강도에 기초한 상대적인 척도이다. 세포의 "음성" 개체군은 종종 약 103 미만의 평균 형광 유닛의 형광 강도로 규정된다. "낮은"으로 명시된 세포 개체군의 분획은 음성 개체군과 유사할 수 있으나, 또한 "중간의" 세포 개체군의 바로 아래에 있을 수 있고, 여기서, 중간 개체군은 낮은 세포 개체군보다 더 높으나, 가장 높은 형광 강도를 제공하는 세포 분획보다 더 낮은 형광 강도를 가지며, 가장 높은 형광 강도는 종종 약 104 초과의 평균 형광 유닛이다. 높은, 중간의, 낮은 또는 음성의 정의는 개별 분석에 상대적인 것이고, 본 명세서에 기재된 평균 형광 유닛은 예시적이나 반드시 제한적인 것은 아닌 전형적인 값이다. 이는 FACS와 같은 유세포 분석 기술의 분야의 숙련자에게 이해될 것이며, 이들은 임의의 특정 유세포 분석 절차의 결과를 용이하게 특징지을 수 있을 것이다.
증폭과 관련된 용어 "연결하다" 또는 "연결"은 대상 핵산 서열을 엔코딩하는 증폭된 핵산 서열의 단일 세그먼트로의 회합을 기술한 것이다. 동족쌍과 관련하여, 단일의 세그먼트는, 가변 도메인을 엔코딩하는 핵산 서열, 예를 들어, 항체 경쇄 가변 영역 엔코딩 서열과 회합된 항체 중쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 상기 2개의 가변 영역 엔코딩 서열은 동일한 세포로부터 유래된다. 연결은 증폭과 동시에 또는 증폭 이후의 별개의 단계로서 달성될 수 있다. 세그먼트의 형태 또는 작용성에 관한 필요조건은 없으며, 세그먼트는 선형, 원형, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 연결은 반드시 영구적이지 않은데, 이는 대상의 핵산 서열 중 하나가 필요에 따라 세그먼트로부터 분리될 수 있기 때문이다. 가변 영역 엔코딩 서열 중 하나는 예를 들어, 동족쌍 세그먼트로부터 분리될 수 있다. 그러나, 동족쌍을 구성하는 본래의 가변 영역이 다른 가변 영역과 뒤섞이지 않는 한, 이들이 단일 세그먼트로 함께 연결되지 않을지라도 이들은 여전히 동족쌍으로 간주된다. 연결은 바람직하게는 뉴클레오티드 포스포다이에스테르 결합이다. 그러나, 연결은 또한 상이한 화학적 가교 결합 과정에 의해 수득될 수 있다.
용어 "멀티플렉스 분자 증폭"은 동일한 반응에서 2개 이상의 표적 서열의 동시 증폭을 기술한 것이다. 적합한 증폭 방법은 중합효소 연쇄 반응(PCR), 리가아제(ligase) 연쇄 반응(LCR)(문헌[Wu and Wallace, 1989, Genomics 4, 560-9]), 가닥 치환 증폭(SDA) 기술(문헌[Walker et al., 1992, Nucl. Acids Res. 20, 1691-6]), 자가-유지(self-sustained) 서열 복제(문헌[Guatelli et al., 1990, Proc. Nat. Acad. Sci, USA, 87, 1874-8]) 및 핵산 기반의 서열 증폭(NASBA)(문헌[Compton J., 1991, Nature 350, 91-2])을 포함한다. 뒤의 2가지 증폭 방법은 등온 전사를 기초로 한 등온 반응을 포함하는데, 이는 단일 가닥 RNA(ssRNA) 및 이중 가닥 DNA(dsDNA) 둘 모두를 생성한다.
용어 "멀티플렉스 PCR"은 PCR의 변형으로서, 동일한 반응에서 1개 초과의 프라이머 세트, 예를 들어, 동일한 PCR 반응에서 중쇄 가변 영역의 증폭을 위해 적합한 하나의 프라이머 세트 및 조류 경쇄 가변 영역의 증폭을 위해 적합한 하나의 프라이머 세트를 포함함으로써 2개 이상의 표적 서열이 동시에 증폭됨을 기술한 것이다.
용어 "멀티플렉스 RT-PCR"은 멀티플렉스 PCR 반응을 기술한 것으로서, 이는 역전사(RT) 단계에 선행된다. 멀티플렉스 RT-PCR은, 멀티플렉스 PCR 이전에 별개의 RT 단계를 갖는 2-단계 과정으로서 수행되거나, RT 및 멀티플렉스 PCR 둘 모두에 대한 모든 성분이 단일 용기에서 조합되는 단일-단계 과정으로서 수행될 수 있다.
용어 "멀티플렉스 중첩-신장 PCR" 및 "멀티플렉스 중첩-신장 RT-PCR"은 멀티플렉스 PCR 또는 멀티플렉스 RT-PCR이 멀티플렉스 중첩-신장 프라이머 믹스를 사용하여 수행되어 표적 서열을 증폭시키며, 이로 인해 표적 서열의 동시 증폭 및 연결을 가능하게 한다는 것을 의미한다.
용어 "다수의 용기"는 세포 개체군으로부터 단일 세포를 물리적으로 분리시킬 수 있는 임의의 물체(물체의 집합)를 기술한 것이다. 이는 튜브, 멀티웰 플레이트(예를 들어, 96-웰, 384-웰, 마이크로타이터(microtiter) 플레이트 또는 기타 멀티웰 플레이트), 어레이(array), 마이크로어레이, 마이크로칩, 겔, 또는 겔 매트릭스일 수 있다. 바람직하게는 이 물체는 PCR 증폭에 적용가능하다. 용어 "튜브" 또는 "용기"는 본 명세서에서 상호호환적으로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리클로날 단백질" 또는 "폴리클로날성(polyclonality)"은 상이하지만 동종의 단백질 분자, 바람직하게는 면역글로불린 수퍼패밀리로부터 선택되는 단백질 분자를 포함하는 단백질 조성물을 지칭한다. 따라서, 각각의 단백질 분자는 조성물의 다른 분자와 상동성이나, 또한 폴리클로날 단백질의 개별 구성원 간의 아미노산 서열 차이를 특징으로 하는 1개 이상의 가변 폴리펩티드를 함유한다. 이러한 폴리클로날 단백질의 공지된 예로는 항체 또는 면역글로불린 분자, T 세포 수용체 및 B 세포 수용체가 포함된다. 폴리클로날 단백질은 단백질 분자의 규정된 서브세트로 구성될 수 있으며, 이는 요망되는 표적에 대한 공유된 결합 활성과 같은 통상적인 특징에 의해 규정되는 단백질 분자의 규정된 서브세트, 예를 들어, 요망되는 표적 항원에 대한 결합 특이성을 나타내는 폴리클로날 항체로 이루어질 수 있다.
용어 "면역글로불린" 및 "항체"는 본 명세서에서 상호호환적으로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유전적으로 다양한 세포의 개체군"은 개체군 내의 개별 세포가 게놈 수준에서 서로 상이한 세포 개체군을 지칭하는 것이다. 이러한 유전적으로 다양한 세포의 개체군은, 예를 들어, 공여체로부터 유래된 세포 개체군, 또는 이러한 세포의 분획, 예를 들어, B 림프구 또는 T 림프구를 함유하는 세포 분획일 수 있다.
용어 "프라이머 쌍"은 대상 뉴클레오티드 영역의 증폭을 프라이밍(priming)시킬 수 있는 2개의 프라이머를 기술한 것인 반면, 용어 "프라이머 세트"는 대상 뉴클레오티드 서열의 증폭을 함께 프라이밍시킬 수 있는 2개 이상의 프라이머를 기술한 것이다. 따라서, 프라이머 세트는 적어도 하나의 프라이머 쌍을 포함하나, 2개 초과의 프라이머를 포함할 수 있으며, 종종 다수의 프라이머 쌍을 포함할 것이다. 본 발명의 프라이머 세트는 가변 영역 엔코딩 서열을 함유하는 뉴클레오티드 서열의 패밀리를 프라이밍시키도록 고안될 수 있다. 상이한 패밀리의 예는 항체 카파 경쇄, 람다 경쇄 및 중쇄 가변 영역이다. 가변 영역 엔코딩 서열을 함유하는 뉴클레오티드 서열의 패밀리의 증폭을 위한 프라이머 세트는 종종 수개의 프라이머가 축퇴된(degenerate) 프라이머인 다수의 프라이머로 이루어진다.
용어 "서열의 동일성(sequence identity)"은 2개의 서열 중 가장 짧은 길이에 대한 2개의 핵산 서열 사이의 동일성 정도를 나타낸 것으로, 퍼센트로서 표현된다. 이는 (Nref-Ndif)×100%/Nref로서 계산될 수 있으며, 여기서, Nref는 더 짧은 서열 내의 잔기의 수이며, Ndif는 2개의 서열 간의 최적으로 길게 배열된 매치(match)의 Nref 내의 불일치된 잔기의 총 개수이다. 여기서, DNA 서열 AGTCAGTC는 서열 TA A TCA A TC(Ndif = 2 및 Nref = 8)(밑줄은 최적의 정열을 나타내며, 진하게 표시된 부분은 8개 중의 2개의 불일치된 잔기를 나타낸 것임)와 75%의 서열 동일성을 갖을 것이다.
결합과 관련된 용어 "무작위적으로" 또는 "무작위"는 동일한 세포로부터 유래되지 않은 뉴클레오티드 서열의 연결을 지칭한다. 대상 뉴클레오티드 서열이 가변 영역 엔코딩 서열인 경우, 이는 연결된 서열의 조합 라이브러리를 초래할 것이다. 한편, 대상의 뉴클레오티드 서열이 상이하지 않은 헤테로머 단백질을 엔코딩하는 경우, 무작위적으로 연결된 서열은 단일 세포로부터의 연결된 서열과 유사한 것으로 나타날 것이다.
역전사와 관련된 용어 "분리된 단일 세포로부터 유래된 주형"은 이러한 분리된 세포 내의 핵산을 지칭한다. 핵산은, 예를 들어, mRNA 또는 다른 RNA, 게놈(genomic) DNA 또는 다른 DNA의 형태일 수 있다. 핵산은 세포로부터 분리되거나, 또는 온전한 형태이거나 용해된 형태의 세포의 다른 내용물과 함께 존재할 수 있다.
용어 "Bu-1"은 chB6 및 Bu1을 비롯한 동의어로도 알려져 있는 특정 닭 표면 항원을 지칭한다. 2가지의 상이한 고도로 상동성인 닭 Bu-1 단백질이 알려져 있다. 이들은 Bu-1a(Uniprot 수탁 번호 Q90746) 및 Bu-1b(Uniprot 수탁 번호 Q90747)로 지칭된다. 둘 모두는 335개 아미노산 잔기의 길이를 가지며, 둘의 서열은 매우 소수의 잔기를 제외하고 동일하다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "Bu-1"은 Bu-1a 및 Bu-1b 둘 모두를 포함하는 것으로 의도된다.
용어 "IgY"는 동의어 닭 IgG로도 알려져 있는 닭의 주요 혈청 면역글로불린을 지칭한다.
용어 "BAFF"는 동의어 BlyS, TALL-1, THANK 및 zTNF4로도 알려져 있는 B 세포 활성화 인자를 지칭한다.
용어 "조류" 및 "새"는 본 명세서에서 상호호환적으로 사용될 수 있으며, 예를 들어, 닭, 오리, 거위, 비둘기 및 칠면조를 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명에서 사용하기에 바람직한 새는 닭이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "닭"은 일반적으로 종 갈루스 갈루스(Gallus gallus), 특히 아종 갈루스 갈루스 도메스티쿠스(Gallus gallus domesticus)의 사육되는 닭의 구성원을 지칭하며, 암탉 및 수탉(rooster/cock), 즉 암컷 및 수컷 둘 모두를 포함하는 것으로 의도된다.
"chVH"와 같은 용어에서 사용되는 경우, 문자 "ch"는 닭-유래의 서열을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "오솔로그"는 공통의 조상으로부터 발달된 둘 이상의 종에서의 유전자를 지칭한다. 예를 들어, 인간 B 세포 마커의 오솔로그를 엔코딩하는 조류 유전자는 일반적으로 오솔로그 인간 유전자가 엔코딩하는 단백질과 동일하거나 유사한 기능을 갖는 단백질을 엔코딩할 것이다.
용어 "열-개시 중합효소"는 역전사에서 사용되는 온도에서 불활성이거나 매우 낮은 활성을 갖는 중합효소를 기술한 것이다. 이러한 중합효소는 작동하기 위해 고온(90 내지 95℃)에서 활성화될 필요가 있다. 이는, 예를 들어, 단일-단계 RT-PCR 과정에서 유리한데, 이것이 역전사효소 반응에서의 중합효소의 간섭을 방해하기 때문이다.
대상 서열
본 발명에 따라 연결될 수 있는 대상 뉴클레오티드 서열은 발현 생성물이 단백질 또는 단백질의 일부인 다양한 서브유닛 또는 도메인을 엔코딩하는 서열로부터 선택될 수 있다. 특히, 엔코딩된 단백질 또는 이의 부분은 헤테로머 단백질, 즉 2개 이상의 동일하지 않은 서브유닛으로 구성된 단백질이다. 이러한 단백질이 속하는 부류의 일부는, 예를 들어, 효소, 억제제, 구조 단백질, 독소, 채널 단백질, G-단백질, 수용체 단백질, 면역글로불린 수퍼패밀리 단백질, 수송 단백질 등이다. 이러한 헤테로머 단백질을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열은 비연속적이며, 이는, 예를 들어, 이들이 상이한 유전자 또는 상이한 mRNA 분자로부터 기원한다는 것을 의미한다. 그러나, 본 발명의 문맥에서 사용되는 비연속은 또한 동일한 단백질의 도메인(여기서, 도메인은 대상이 아닌 뉴클레오티드 서열에 의해 분리되어 있음)을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 의미할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, 대상 뉴클레오티드 서열은 면역글로불린 수퍼패밀리, 예컨대, 면역글로불린(항체) 또는 B 세포 수용체로부터의 가변 영역 엔코딩 서열을 함유한다. 특히, 면역글로불린으로부터의 가변 영역 엔코딩 서열이 관심대상이다. 이러한 가변 영역 엔코딩 서열은 전장 항체뿐만 아니라 이의 단편, 이를 테면 Fab, Fv, scFv 또는 가변 영역 엔코딩 서열의 단편, 예를 들어 상보성 결정 영역(CDR)의 조합물, 연결 유전자 또는 V-유전자 또는 이들의 조합물을 포함한다. 일반적으로, 본 발명은 가변 영역 엔코딩 서열 및 이의 단편의 임의의 조합물에 적용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 항체 중쇄와 경쇄의 가변 도메인의 연결을 가능하게 하여, Fv 또는 scFv 엔코딩 서열을 생성하거나, 대안적으로 예를 들어, 전체 경쇄와 중쇄 가변 영역 + 불변 영역 도메인 CH1 + 힌지 영역의 부분의 연결을 가능하게 하여, Fab, Fab', 또는 F(ab)2를 생성한다. 또한, 중쇄 불변 영역 도메인의 임의의 영역을 가변 중쇄에 첨가하여, 절단된 항체 엔코딩 서열 또는 전장 항체 엔코딩 서열을 생성시키는 것이 가능하다. 본 발명의 일 면에서, 비-인간, 조류-유래의 가변 서열은 인간 불변 영역에 연결되어 키메라 인간/조류 항체가 생성된다.
주형 공급원
본 발명은 분리된 단일 세포(여기서 각각의 개별 세포는 단일의 웰 또는 다른 용기에 위치함), 동질유전자 세포 개체군 또는 단일 용기로 분리되지 않은 유전적으로 다양한 세포 개체군으로부터 유래된 뉴클레오티드 서열의 연결을 가능하게 한다.
본 발명의 바람직한 특징은 분리된 단일 세포 또는 동질유전자 세포 개체군을 주형 공급원으로서 사용하는 것인데, 이는 대상의 핵산 서열의 뒤섞임(scrambling), 즉 상이한 세포로부터 유래된 서열의 연결이 회피되기 때문이다. 이는, 가변 영역 엔코딩 서열 또는 CDR 엔코딩 서열의 동족쌍을 수득하고자 하는 항체 가변 영역 엔코딩 서열의 경우에 특히 중요하다.
바람직하게는, 본 발명은 림프구, 예를 들어, B 림프구, 혈장 세포 및/또는 다양한 발생 단계의 이들 세포 계통을 포함하는 세포 분획으로부터의 단일 세포 또는 단일 세포 개체군 상에서 수행된다. 면역글로불린 수퍼패밀리로부터의 결합 단백질을 발현하는 세포의 다른 개체군이 또한 단일 세포를 수득하기 위하여 사용될 수 있다. 하이브리도마 세포와 같은 세포주, B 림프구 계통의 세포주, 또는 바이러스 불멸화된 세포주 또는 면역 반응에 참여하는 공여체 유래 세포가 또한 본 발명에 사용될 수 있다. 공여체 유래 림프구-함유 세포 분획은 이러한 세포에 풍부한 천연 조직 또는 유체, 예를 들어, 혈액, 골수, 림프절, 비장 조직, 편도선 조직, 화부리치낭(bursa fabricii), 또는 종양 내 및 종양 주변의 침윤(infiltrations) 또는 염증성 조직 침윤으로부터 수득될 수 있다. 바람직하게는, 비장 조직, 혈액, 화부리치낭 또는 골수가 사용된다. 공여체는 요망되는 표적과 관련하여 미경험(naive)이거나 과면역(hyperimmune) 새 중 하나일 수 있다. 특히 바람직한 실시형태에 있어서, 공여체는 암 또는 염증 질환에 연루되는 인간 단백질과 같은 인간 자가-항원, 예를 들어 EGFR 또는 TNFa로 면역화된 닭 또는 다른 새이다.
공여체는 또한 인간 항체 가변 중쇄 및 경쇄로부터 유래되거나 이와 상당한 유사성을 갖는 면역글로불린을 생성할 수 있는 인간 면역글로불린 서열을 가지는 트랜스제닉 새, 바람직하게는 트랜스제닉 닭일 수 있다. 특정 항원에 대한 인간 항체는 표준 면역화 기술을 사용하여 이들 트랜스제닉 새의 요망되는 항원으로의 면역화에 의해 증가될 수 있다. 이는 예를 들어, 인간에 더 가까이 관련되는 마우스 또는 다른 동물을 사용하는 것에 대하여 항체를 생성하기 어렵거나 항체를 생성할 수 없는 표적에 대해 유도된 항체를 엔코딩하는 라이브러리의 생성을 가능하게 한다. 이러한 접근법은 자연의 인간 항체 반응이 없거나 오직 제한된 반응이 존재하는 인간 항원과 같은 경우에 특히 유용한 것으로 파악된다.
공여체로서, 닭, 특히 트랜스제닉 닭 또는 다른 새를 사용하는 것은 이들이 마우스 및 다른 포유동물으로부터의 항체 반응과 비교하여 대안적인 체액성(humoral) 반응을 제공할 수 있다는 점에서 유익한 것으로 예상된다. 닭/새와 인간 사이의 계통발생적으로 먼 관계는 새보다 인간에 더 가까이 관련된 종, 예를 들어 마우스, 랫트 또는 비-인간 영장류에서는 서열 상동성 때문에 면역원성이 아닐 것인 에피토프에 대한 항체 반응을 가능하게 한다. 닭 항체 반응에 의해 수득가능한 것으로 사료되는 확장된 다양성은 치료적 가능성을 가지는 동정된 항체의 빈도를 증가시키고, 또한 인간과 마우스 항원 오솔로그 사이에 교차-반응성인 항체의 식별을 가능하게 하여, 마우스 질환 모델에서 예비임상 연구를 용이하게 할 수 있는 가능성을 갖는다.
일 실시형태에 있어서, 림프구-함유 세포 분획은 공여체로부터 수득된 전혈, 골수, 단핵구, 또는 백혈구를 포함한다. 단핵구는 혈액, 골수, 림프절, 비장, 화부리치낭, 암세포 주변의 침윤 및 염증성 침윤으로부터 분리될 수 있다. 단핵구는 밀도 원심분리 기술, 예를 들어, 피콜 구배(Ficoll gradient)에 의해 분리될 수 있다. 단핵구가 조직으로 구성된 시료로부터 분리되는 경우에, 조직은 구배 원심분리가 수행되기 전에 해체(disintegration)되어야 한다. 해체는, 예를 들어 분쇄, 일렉트로포레이션(electroporation)과 같은 기계적 방법 및/또는 효소 처리와 같은 화학적 방법에 의해 수행될 수 있다. 림프구를 함유하는, 예를 들어, 골수 또는 조직의 미가공(raw) 제조물이 또한 사용될 수 있다. 이러한 제조물은, 예를 들어, 상기 기재된 바와 같이 단일 세포 분배를 용이하게 하기 위하여 해체될 필요가 있을 것이다.
바람직한 실시형태에 있어서, 림프구-함유 세포 분획, 예를 들어 전혈, 단핵구, 백혈구 또는 골수는 B 림프구 계통으로부터의 세포와 같은 특정 림프구 개체군에 관하여 농축된다. B 림프구의 농축은, 예를 들어, Bu-1과 같은 계통-특이적 세포 표면 마커 단백질 또는 IgY와 같은 다른 조류 B 세포 계통-특이적 마커를 이용하는 자성 비드 세포 분류(MACS) 또는 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 수행될 수 있다. 대안적으로, 공지의 인간 또는 뮤린 B 세포 마커의 닭 오솔로그가 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 특징은 다수의 용기 중에 세포를 개별적으로 분배하기 전에, 혈장 세포를 수득하기 위하여 농축된 B 림프구를 추가로 분류하는 것이다. 혈장 세포의 분리는 IgY, CD3, Bu-1, IgM, 단핵구 마커 및 BAFF와 같은 표면 마커의 발현 프로파일을 사용하여 MACS 분류 또는 FACS 분류에 의해 일반적으로 수행된다. 상술된 바와 같이, 세포의 분류 및 선택은 이들 마커 중 하나 이상의 발현의 부재 또는 존재, 예를 들어, 이들이 선택되거나 분리되는 림프구-함유 세포 개체군에 비해 낮은, 중간의 또는 높은 것으로서 발현을 규정하는 것을 기초로 한다. 또한, 예를 들어 CD138, CD43, CD19 또는 MHC-II의 닭 오솔로그와 같은 다른 혈장 세포 특이적 표면 마커 또는 이들의 조합물을 사용할 수 있다. 마커의 정확한 선택은 혈장 세포 공급원, 예를 들어, 비장, 화부리치낭, 편도선, 혈액 또는 골수뿐만 아니라, 세포가 분리되는 종에 좌우된다.
상술된 바와 같이, 본 발명에 사용하기 위한 바람직한 마커는 IgY이며, 바람직한 실시형태에 있어서, 선택되는 세포는 IgY+이다. IgY+ 세포에 기초한 추가의 특정 실시형태에 있어서, 선택되는 세포는 IgY+, CD3-일 수 있거나; 또는 이들은 IgY+, Bu-1-, CD3-일 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 세포는 부분적으로 Bu-1의 발현(또는 발현의 결여)에 기초하여 선택될 수 있다. Bu-1 발현을 기초로 한 특정 실시형태는 Bu-1+ IgY+; Bu-1+ IgY+ CD3-; Bu-1+ 단핵구-; Bu-1+ IgM-; 또는 Bu-1+ BAFF+인 세포의 선택이다.
혈장 세포는 또한 이러한 공급원 중 임의의 것으로부터 수득된 비농축 림프구-함유 세포 개체군으로부터 수득될 수 있다. 혈액으로부터 분리된 혈장 세포는 때때로 초기 혈장 세포 또는 형질모세포라 불리운다. 본 발명의 문맥에서, 이들 세포는 또한 "혈장 세포"로 간주된다. 혈장 세포는 면역글로불린 엔코딩 서열의 동족쌍의 분리를 위해 요망되는데, 이는 다른 B 림프구에 비하여, 이들 세포의 보다 높은 빈도가 요망되는 항원에 대한 후천적 면역성을 반영하는 항원-특이적 항체를 생성하고 이들 세포의 대부분은 체세포성 과다변이를 거쳤으며 이에 따라 고친화력 항체를 엔코딩하기 때문이다. 또한, 혈장 세포의 mRNA 수준은 남아 있는 B 림프구 개체군에 비하여 상승되고 따라서 역전사 과정이 단일 혈장 세포를 사용할 때 더 효율적이다. 혈장 세포 분리에 대한 대안으로서, 기억 B 세포는 인간 CD27 B 세포 표면 마커의 닭 오솔로그의 발현 수준 또는 IgY와 같은 세포 표면 마커를 사용하여 림프구 함유 세포 분획으로부터 분리될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 다수의 용기 중에 세포를 분배하기 전에 농축된 B 림프구가 항원 특이성에 대해 선택될 수 있다. 항원-특이적 B 림프구의 분리는 농축된 B 림프구를 요망되는 항원(들)과 접촉시켜 항원의 표면 노출된 면역글로불린으로의 결합을 가능하게 하고, 이어서 결합물질을 분리함으로써 수행된다. 이는, 예를 들어, 요망되는 항원(들)의 비오티닐화에 이어서 적합한 세포 분류 기술에 의하여 행해질 수 있다. 혈장 세포뿐 아니라 B 림프구, 비농축 단핵구, 백혈구, 전혈, 골수, 또는 조직 제조물은, 필요에 따라, 항원 특이성과 관련된 분리를 거칠 수 있다.
특정 표면 마커를 발현하는 세포 분류, 즉 양성 선택(positive selection)에 대한 대안으로써, 특정 마커를 발현하지 않는 세포가 세포의 조성으로부터 고갈되고, 사실상 마커를 발현하는 세포만을 남겨두는 것이 생각될 수 있다.
필요에 따라, 상술한 분리된 세포 분획의 임의의 것(예를 들어, B 림프구, 혈장 세포, 기억 세포)이 불멸화될 수 있다. 불멸화는, 예를 들어, 세포 분배 전에 수행될 수 있다. 대안적으로, 분리된 단일 세포는 역전사 전에 불멸화되고 증식될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 요망되는 세포 개체군(예를 들어, 하이브리도마 세포, B 림프구 계통의 세포주, 전혈 세포, 골수 세포, 단핵구, 백혈구, B 림프구, 혈장 세포, 항원-특이적 B 림프구, 기억 B 세포)을 개별적으로 다수의 용기로 분배하여, 분리된 단일 세포의 개체군이 수득된다. 단일 세포의 분리는 단일 용기가 단일 세포를 함유하거나 마이크로 어레이, 칩 또는 겔 매트릭스가 분리된 단일 세포를 야기하는 방식으로 로딩되는 방식의 세포 개체군으로부터의 세포의 물리적 분리를 지칭한다. 세포는 제한 희석에 의하여 단일 용기의 어레이와 같은 다수의 용기로 직접 분배될 수 있다. 본 발명에 사용되는 단일 용기는 바람직하게는 PCR에 적합한 것이다(예를 들어, PCR 튜브 및 96 웰 또는 384 웰 PCR 플레이트, 또는 이보다 큰 용기의 어레이). 그러나, 다른 용기가 또한 사용될 수 있다. 단일 세포를 다수의 단일 용기(예를 들어, 384 웰 플레이트)로 분배하는 경우에, 단일 세포 개체군이 수득된다. 이러한 분배는, 예를 들어, 평균적으로 1, 0.5, 또는 0.3개 세포의 세포 농도를 포함하는 단일 용기로 부피를 분배하고, 그로 인해 대부분 1개 미만의 세포를 함유하는 용기를 수득함으로써 수행될 수 있다. 제한 희석에 의한 세포의 분배는 통계적 사건이기 때문에, 용기의 한 분획은 비워질 것이고, 주요 분획은 단일 세포를 함유할 것이며, 부수 분획은 2개 이상의 세포를 함유할 것이다. 2개 이상의 세포가 용기에 존재하는 경우, 가변 영역 엔코딩 서열의 약간의 뒤섞임이 용기 내에 존재하는 세포 중에서 일어날 수 있다. 그러나, 이는 부차적 사건이기 때문에, 본 발명의 전반적인 활용도에는 영향을 주지 않을 것이다. 추가로, 요망되는 결합 친화도 및 특이성을 지니지 않는 가변 영역 엔코딩 서열의 조합물은 아마도 대부분 선택되지 않을 것이고, 따라서 이들은 스크리닝 과정 중에 아마도 제거될 것이다. 따라서, 뒤섞임과 같은 부차적 사건은 본 발명의 최종 라이브러리에 유의미한 영향을 미치지 못할 것이다.
예를 들어, FACS 장치와 같은 세포 분류기 또는 하나의 세포를 하나의 용기로 정확하게 분배하도록 프로그램화될 수 있는 로보트를 사용하는, 제한 희석에 의한 세포 분배에 대한 대안이 존재한다. 이들 대안은 이들이 노동력이 덜 들고 한 세포의 한 용기로의 분배를 균일하게 획득하는 데에서 더 효율적이기 때문에 바람직하다.
상술된 농축, 분류 및 분리 과정은 대다수의 세포가 온전하게 유지되도록 수행된다. 농축 및 분류 중의 세포의 파괴는 가변 영역 엔코딩 서열의 뒤섞임을 초래할 수 있다. 그러나, 이는 파괴의 빈도가 낮은 것으로 예상되기 때문에 문제가 되지는 않을 것으로 예상된다. 단일 용기로 분배하기에 앞서 세포의 세정 및 가능한 RNAse 처리는 과정 중에 누출되는 임의의 RNA를 제거할 것이다.
또한, 단일 용기의 개체군 내에 단일 세포 개체군을 수득하기 위해서 세포를 분배하는 방법에 대한 상기 기재를 고려할 때, 상술된 바와 같이 용기마다 단일 세포를 함유해야 하는 것이 필수적인 것은 아니다. 오히려, 본 발명이 단일 세포를 함유하는 대다수의 용기 및 1개 초과의 세포를 함유하는 상대적으로 적은 부분의 용기에 의존하며, 예를 들어, 2개 이상의 세포를 가지는 용기의 수는 바람직하게는 분배된 세포 총량의 25% 미만이거나 더 바람직하게는 10% 미만, 이를 테면 5% 미만임이 당업자에게 명백할 것이다.
바람직한 실시형태에 있어서, 역전사(RT)는 다수의 용기 중에 개별적으로 분배된 세포로부터 유래되는 주형을 사용하여 수행된다.
단일 세포의 이들의 단일 용기로의 최종 분배가 수행된 경우, 단일 세포는 역전사 전에 동질유전자 세포 개체군을 수득하기 위하여 증식될 수 있다. 이러한 과정은 주형으로서 사용되는 더 많은 mRNA를 생성하는데, 이것은 드문 표적이 증폭되고 연결되는 경우에 중요할 수 있다. 그러나, 세포는 증식 중에 표적 유전자와 관련하여 유전적으로 동일하게 유지되어야 한다. 분리된 세포 또는 동질유전자 세포 개체군은 역전사를 위한 주형이 분해되지 않는 한 온전하게 유지되거나 용해(lysed)될 수 있다. 바람직하게는, 세포는 후속하는 역전사 및 PCR 증폭을 용이하게 하기 위하여 용해된다.
상이한 실시형태에 있어서, 멀티플렉스 중첩-신장 RT-PCR 또는 라이게이션 또는 재조합에 의한 연결이 후속되는 멀티플렉스 RT-PCR은 또한, 단일 용기로 분리되지 않았지만 세포의 풀(pool)로서 함께 유지되는, 유전적으로 다양한 세포 개체군으로부터 유래된 주형에 이용될 수 있다. 이 방법은 조합 라이브러리의 생성에 사용될 수 있다. 이러한 접근법은 단일 세포의 분배를 필요로 하지 않을 것이다. 그러나, 이러한 접근법에 사용될 수 있는 세포는 단일 세포 접근법을 위해 기술된 것들, 예를 들어, 분류된 B 림프구의 개체군(풀)과 동일하다. 단일-단계 멀티플렉스 중첩-신장 RT-PCR 또는 라이게이션 또는 재조합에 의한 연결이 후속되는 단일-단계 멀티플렉스 RT-PCR을 이러한 세포 개체군에서 수행하는 경우, 반응 전에 세포를 용해하는 것이 바람직하고, 필요에 따라, 전체 RNA 또는 mRNA가 용해물로부터 분리될 수 있다.
본 발명의 단일-단계 멀티플렉스 중첩-신장 RT-PCR의 감도는 매우 적은 양의 주형, 예를 들어, 단일 세포의 용해물에 상응하는 소정량의 주형을 사용하는 것을 가능하게 한다.
증폭 및 연결
본 발명은 한 세트 초과의 프라이머, 예를 들어, 가변 영역 엔코딩 서열을 증폭시키기 위해 필요한 모든 프라이머를 동일한 반응에 포함시킴으로써, 2개 이상의 표적 서열이 동일한 용기 내에서 동시에 증폭되는 PCR의 변형법을 이용한다. 일반적으로, 이러한 접근법은 멀티플레스 중합효소 연쇄 반응(멀티플렉스 PCR)으로서 공지되어 있다. 본 발명에 따른 멀티플렉스 PCR에 의해 증폭되는 표적 서열은 예를 들어, 중첩 신장 PCR에 의해 증폭 과정에 근접하여 연결된다. 특히, 항체 가변 영역 엔코딩 서열의 동족쌍은 이러한 과정에 의해 연결된다.
본 발명의 일 실시형태는 멀티플렉스 프라이머 믹스가 중첩-신장 PCR 절차에서 작용하도록 설계되어, 대상 뉴클레오티드 서열의 증폭 및 결합을 동시에 야기시킬 수 있는 사실을 이용한다. 이러한 멀티플렉스 중첩-신장 PCR 기술은 대상 뉴클레오티드 서열, 특히 연결된 가변 영역 엔코딩 서열의 동족쌍을 분리하고 연결하는 데에 필요한 반응의 수를 감소시키는 역할을 한다.
본 발명의 다른 실시형태는 멀티플렉스 중첩-신장 PCR에 의한 연결에 대한 대안으로서 라이게이션 또는 재조합에 의한 연결을 적용한다. 이들 절차에서, 연결은 멀티플레스 PCR 증폭과 동시에 수행되는 것이 아니라 증폭 이후의 별개의 단계로서 수행된다. 그러나, 연결은 여전히 멀티플렉스 PCR이 수행되었던 용기와 동일한 용기에서 수행될 수 있다.
멀티플레스 중첩-신장 PCR은 각각의 세트 중 하나 이상의 프라이머에 중첩-신장 테일(tail)이 구비되어 있는 2개 이상의 프라이머 세트(멀티플렉스 프라이머 믹스)가 존재할 필요가 있다. 중첩-신장 테일은 증폭 중에 각각의 프라이머 세트에 의해 생성된 생성물의 연결을 가능하게 한다. 멀티플렉스 중첩-신장 PCR은 연결시키려는 서열이 동일한 용기에서 동시에 생성되어, 임의의 중간체 정제 없이, 증폭 중에 표적 서열의 직접적 연결을 제공한다는 점에서 통상적인 중첩-신장 PCR과 상이하다.
바람직한 실시형태에 있어서, 분리된 단일 세포 또는 동질유전자 세포 개체군으로부터 유래된 주형을 이용하는 역전사(RT) 단계는 멀티플레스 PCR 또는 멀티플레스 중첩-신장 PCR 증폭에 선행한다.
바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명은 멀티플렉스 PCR 증폭을 위한 주형으로서 분리된 단일 세포 또는 동질유전자 세포 개체군으로부터 유래된 뉴클레오티드 서열을 사용한다. 바람직하게는, 단일 세포로부터의 RNA는 멀티플렉스 PCR 이전에 cDNA로 역전사된다. 대상의 일부 핵산 서열의 증폭을 위해, 게놈 DNA가 mRNA에 대한 대안으로 사용될 수 있다. 주형 공급원으로서 분리된 단일 세포의 클론 증식에 의해 유래된 동질유전자 세포 개체군 또는 분리된 단일 세포를 사용함으로써, 세포 개체군 내의 상이한 세포로부터 유래된 뉴클레오티드 서열의 뒤섞임을 방지하는 것이 가능하다. 이는 대상 서열의 원래의 조성을 유지하고자 하는 경우에 중요하다. 특히, 항체 가변 영역 엔코딩 서열의 동족쌍의 생성을 위해, 분리된 단일 세포 또는 동질유전자 세포 개체군을 주형 공급원으로서 사용하는 것이 본 발명의 중요한 특징이다.
또한, 본 발명은 대상이 되는 연결된 핵산 서열의 라이브러리, 특히, 조합 라이브러리 및 가변 영역 동족쌍의 라이브러리의 생성을 용이하게 한다.
본 명세서의 다른 부분에 기재된 바와 같이, 본 발명의 일 실시형태는 임의로 림프구 함유 세포 분획으로부터 특정 림프구 개체군에 대해 농축되거나, 특정 림프구 개체군이 림프구 함유 세포 분획으로부터 분리되는, 조류 공여체로부터의 림프구-함유 세포 분획을 제공하는 단계, 및 림프구-함유 세포 분획 또는 농축된 세포 분획으로부터 세포를 다수의 용기 중에 개별적으로 분배시킴으로써, 분리된 단일 세포 개체군을 수득하는 단계에 의한, 연결된 가변 영역 엔코딩 서열을 포함하는 동족쌍의 라이브러리의 생성방법을 포함한다. 분리된 단일 세포 개체군 내에 포함된 가변 영역 엔코딩 서열의 멀티플렉스 분자 증폭(멀티플렉스 RT-PCR 증폭)이 수행되고, 가변 영역 엔코딩 서열의 쌍의 연결이 달성되며, 여기서 가변 영역 서열의 개별 쌍은 상기 개체군으로부터의 단일 세포에서 유래된다. 이러한 기술은 2가지 임의의 추가 단계를 포함할 수 있다: 제1단계에서는 개별의 분리된 단일 세포가 멀티플렉스 RT-PCR 증폭을 수행하기 전에 동질유전자 세포 개체군으로 증식되어, 동질유전자 세포의 다양한 개체군을 함유하는 다수의 용기가 수득된다(용기당 하나의 동질유전자 세포 개체군). 임의의 제2단계는 연결된 가변 영역 엔코딩 서열의 추가 증폭을 수행하는 것을 포함한다.
본 명세서의 다른 부분에 기재된 바와 같이, 본 발명의 또 다른 실시형태는 멀티플렉스 PCR 또는 멀티플렉스 RT-PCR 증폭 절차에서 분리된 단일 세포 또는 동질유전자 세포 개체군으로부터 유래된 주형을 사용하여, 대상 뉴클레오티드 서열을 증폭시키고, 대상이 되는 증폭된 뉴클레오티드 서열의 연결을 달성함으로써, 대상이 되는 다수의 비연속 뉴클레오티드 서열을 연결하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 연결된 생성물의 추가의 증폭을 수행하는 임의의 단계를 포함할 수 있다.
바람직한 실시형태에 있어서, 면역글로불린 경쇄 가변 영역 엔코딩 서열을 포함하는 상기 동족쌍의 라이브러리의 개별 구성원은 동일한 세포로부터 기원하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역 엔코딩 서열과 회합된다.
본 발명의 멀티플렉스 RT-PCR 증폭은 역전사(RT)가 멀티플렉스 PCR 증폭(또는 대안적으로 멀티플렉스 분자 증폭)과 별개로 수행되는 2-단계 과정으로서 또는 RT 및 멀티플렉스 PCR 증폭 단계가 단일의 용기 내에서 동일한 프라이머를 사용하여 수행되는 단일-단계 과정으로서 수행될 수 있다.
역전사(RT)는 역전사효소 활성을 갖는 효소로 수행되어, 분리된 단일 세포로부터의 전체 RNA, mRNA 또는 표적 특이적 RNA로부터의 cDNA의 생성을 야기한다. 역전사를 위해 사용될 수 있는 프라이머는, 예를 들어, 올리고-dT 프라이머, 무작위 헥사머, 무작위 데카머, 그 밖의 무작위 프라이머, 또는 대상 뉴클레오티드 서열에 대해 특이적인 프라이머이다.
2-단계 멀티플렉스 RT-PCR 증폭 절차는 RT 단계에서 생성되는 cDNA가 1개 초과의 용기에 분배될 수 있게 하여, 증폭이 진행되기 전에 주형 분획의 저장을 가능하게 한다. 또한, 1개 초과의 용기로의 cDNA의 분배는 동일한 주형으로부터 유래된 핵산의 1회 초과의 멀티플렉스 PCR 증폭의 수행을 가능하게 한다. 비록, 이것이 개별 반응 횟수의 증가를 초래하기는 하지만, 이는 이것이 필요에 따라 멀티플렉스 프라이머 믹스의 복잡성을 감소시킬 수 있게 한다.
단일-단계 멀티플렉스 RT-PCR 절차에서, 역전사 및 멀티플렉스 PCR 증폭이 동일한 용기 내에서 수행된다. 역전사 및 멀티플렉스 PCR 둘 모두를 수행하는 데에 필요한 모든 성분이 처음에 용기 내로 첨가되고, 반응이 수행된다. 일반적으로, 반응이 개시되면, 추가의 성분을 첨가할 필요가 없다. 단일-단계 멀티플렉스 RT-PCR 증폭의 이점은 이것이 본 발명의 연결된 뉴클레오티드 서열을 생성시키는 데에 필요한 단계의 수를 감소시킨다는 점이다. 이는 동일한 반응이 다수의 용기에서 수행될 필요가 있는 단일 세포의 어레이 상에서 멀티플렉스 RT-PCR을 수행하는 경우에 특히 유용하다. 단일-단계 멀티플렉스 RT-PCR은 멀티플렉스 PCR 증폭을 위해 필요한 멀티플렉스 프라이머 믹스에 존재하는 역방향 프라이머를 또한 역전사를 위한 프라이머로서 사용함으로써 수행된다. 일반적으로, 단일-단계 멀티플렉스 RT-PCR을 위해 필요한 조성물은 핵산 주형, 역전사효소 활성을 지닌 효소, DNA 중합효소 활성을 지닌 효소, 데옥시뉴클레오시드 트라이포스페이트 믹스(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 포함하는 dNTP 믹스) 및 멀티플렉스 프라이머 믹스를 포함한다. 핵산 주형은 바람직하게는 분리된 단일 세포로부터 정제된 형태로, 세포의 용해물로서 또는 여전히 온전한 세포 내로부터 유래된 전체 RNA 또는 mRNA이다. 일반적으로, 반응 혼합물의 정확한 조성은 본 발명에서 사용하려는 각각의 멀티플렉스 프라어머 혼합물에 대해 어느 정도의 최적화를 필요로 한다. 이는 2-단계 및 단일-단계 멀티플렉스 RT-PCR 절차 둘 모두에 대해 적용된다.
일부 단일-단계 멀티플렉스 RT-PCR 반응의 경우, 반응 중에 추가 성분을 첨가하는 것은, 예를 들어, RT 단계 이후의 중합효소의 첨가가 유리할 수 있다. 다른 성분은 예를 들어, dNTP 혼합물 또는 가능하게는 상이한 프라이머 조성을 지닌 멀티플렉스 프라이머 믹스일 수 있다. 이것은 1-튜브(one-tube) 멀티플렉스 RT-PCR로서 간주될 수 있는데, 이는 일반적으로, 이것이 또한 요망되는 연결된 생성물을 수득하는 데에 필요한 튜브의 수를 제한하기 때문에, 단일-단계 멀티플렉스 RT-PCR과 동일한 이점을 갖는다.
멀티플렉스 RT-PCR 절차에 의해 증폭되는 대상 뉴클레오티드 서열은 다양한 멀티플렉스 프라이머 믹스를 사용하는 몇몇의 방법, 예를 들어, 멀티플렉스 중첩-신장 RT-PCR, 라이게이션 또는 재조합에 의해 서로에 대해 연결될 수 있다. 바람직하게는, 멀티플렉스 RT-PCR 증폭 및 연결 과정은 단일-단계 또는 2-단계 과정이다. 그러나, 연결 과정은 또한 PCR, 라이게이션 또는 재조합과 함께, 예를 들어, 대상의 핵산 서열을 연결시키기 위해 스터퍼(stuffer) 단편을 사용하는 다단계 과정으로 수행될 수 있다. 이러한 스터퍼 단편은 시스-엘리먼트, 프로모터 엘리먼트 또는 관련 코딩 서열 또는 인식 서열을 함유할 수 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, 연결 과정은 멀티플렉스 RT-PCR 증폭과 동일한 용기에서 수행된다.
일 실시형태에 있어서, 대상이 되는 다수의 비연속 뉴클레오티드 서열의 연결은 멀티플렉스 중첩-신장 프라이머 믹스를 사용하는 멀티플렉스 PCR 증폭과 함께 수행된다. 이는 표적 서열의 병행되는 증폭 및 연결을 야기한다. 일반적으로, 멀티플렉스 중첩-신장 PCR을 위해 필요한 조성물은 핵산 주형, DNA 중합효소 활성을 지닌 효소, 데옥시뉴클레오시드 트라이포스페이트 믹스(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 포함하는 dNTP 믹스) 및 멀티플렉스 중첩-신장 프라이머 믹스를 포함한다.
본 발명의 특정 실시형태에 있어서, 대상이 되는 다수의 비연속 뉴클레오티드 서열의 연결은 분리된 단일 세포 또는 동종유전자 세포 개체군으로부터 유래된 주형을 사용하여, 임의로 연결된 생성물의 추가의 분자 증폭을 수행하는 단계와 함께, 멀티플렉스 중첩-신장 RT-PCR에 의해 수행된다. 바람직하게는, 멀티플렉스 중첩-신장 RT-PCR은 단일-단계/1-튜브 반응으로서 수행된다.
본 발명의 멀티플렉스 중첩-신장 프라이머 믹스는 2개 이상의 가변 영역 엔코딩 서열의 증폭 및 연결, 예를 들어, 면역글로불린 중쇄 가변 영역 패밀리와 카파 또는 람다 경쇄 가변 영역 패밀리로부터의 서열의 증폭 및 연결을 프라이밍시킬 수 있는 2개 이상의 프라이머 세트를 포함한다.
또 다른 실시형태에 있어서, 멀티플렉스 RT-PCR에 의해 증폭되는, 대상이 되는 다수의 뉴클레오티드 서열이 라이게이션에 의해 연결된다. 이를 달성하기 위해, 멀티플렉스 RT-PCR에 사용되는 멀티플렉스 프라이머 믹스는 증폭된 표적 서열이 적합한 제한 효소에 의해 절단되고, DNA 라이게이션에 의한 공유 결합이 수행될 수 있도록 설계된다(프라이머 설계는 "프라이머 혼합물 및 설계" 섹션에 기재되어 있음). 이러한 멀티플렉스 프라이머 믹스를 사용한 멀티플렉스 RT-PCR 증폭에 이어, 표적 서열의 호환가능한(compatible) 말단을 형성하는데 필요한 제한 효소가 리가아제와 함께 혼합물에 첨가된다. PCR 생성물의 정제는 이러한 단계 전에 필요하지 않지만, 정제가 수행될 수 있다. 제한효소 절단 및 라이게이션 병행을 위한 반응 온도는 약 0 내지 40℃이다. 그러나, 멀티플렉스 PCR 반응으로부터의 중합효소가 여전히 혼합물에 존재하는 경우, 실온 미만의 인큐베이션 온도가 바람직하며, 온도가 4 내지 16℃인 것이 가장 바람직하다.
또 다른 실시형태에 있어서, 멀티플렉스 RT-PCR에 의해 증폭되는, 대상이 되는 다수의 뉴클레오티드 서열은 재조합에 의해 연결된다. 이러한 접근법에서, 증폭된 표적 서열은 동일한 재조합 부위를 사용하여 연결될 수 있다. 그 후, 연결이 재조합을 촉진하는 재조합효소를 첨가함으로써 수행된다. 적합한 재조합효소 시스템으로는 예를 들어 다양한 FRT 부위를 지닌 Flp 재조합효소, 다양한 lox 부위를 지닌 Cre 재조합효소, attP 부위와 attB 부위 간의 재조합을 수행하는 인테그라제(integrase) ΦC31, β-재조합효소-식스(six) 시스템 및 Gin-gix 시스템이 있다. 재조합에 의한 연결은 2개의 항체-엔코딩 뉴클레오티드 서열(VL과 연결된 VH)에 대해 예증되었다(문헌[Chapal, N. et al. 1997 Bio Techniques 23, 518-524]).
바람직한 실시형태에 있어서, 대상 뉴클레오티드 서열은 가변 영역 엔코딩 서열을 포함하고, 연결은 가변 영역 엔코딩 서열의 동족쌍을 생성시킨다. 이러한 동족쌍은 가변 영역 이외에 하나 이상의 불변 영역 엔코딩 서열을 포함할 수 있다. 후자의 경우에, 불변 영역은 인간 기원의 것일 수 있고, 조류 기원의 가변 영역 동족쌍 또는 가변 영역은 트랜스제닉 닭 또는 다른 트랜스제닉 새로부터 유래된 인간 서열일 수 있다. 본 발명의 문맥 내에서, 트랜스제닉 닭으로부터 유래된 이러한 인간 서열은 "조류-유래"인 것으로 간주된다.
더욱 바람직하게는, 대상 뉴클레오티드 서열은 면역글로불린 가변 영역 엔코딩 서열을 포함하고, 연결은 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역 엔코딩 서열의 동족쌍을 생성시킨다. 이러한 동족쌍은 가변 영역 이외에 하나 이상의 불변 영역 엔코딩 서열을 포함할 수 있으며, 이러한 동족쌍은 상술된 바와 같이, 림프구 함유 세포 분획, 예를 들어, 전혈, 단핵구 또는 백혈구로부터 농축된 B-림프구 계통의 세포로부터 분리될 수 있다.
또 다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 주형 공급원으로서 유전적으로 다양한 세포 개체군과 함께 멀티플렉스 RT-PCR을 사용한다. 대다수의 헤테로머 단백질 엔코딩 서열은 항체와 같은 결합 단백질로부터의 가변 영역 엔코딩 서열의 경우와는 달리 세포마다 달라지지 않는다. 따라서, 이러한 비가변성 헤테로머 단백질 엔코딩 서열의 클로닝을 위해 본 발명을 이용하는 경우, 단일 세포의 초기 분리를 수행할 필요가 없다.
이러한 실시형태에 있어서, 대상이 되는 다수의 비연속 뉴클레오티드 서열은, 유전적으로 다양한 세포의 개체군으로부터 유래된 주형을 사용하여 대상 뉴클레오티드 서열의 멀티플렉스 RT-PCR 증폭을 수행하는 단계 및 증폭된 대상 뉴클레오티드 서열의 연결을 달성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 무작위적으로 연결된다. 또한, 상기 방법은 연결된 생성물의 추가의 증폭을 수행하는 임의의 단계를 포함할 수 있다. 단일 세포 접근법에서와 같이, 연결은 증폭을 위한 멀티플렉스 중첩-신장 프라이머 믹스를 사용하여 수행되거나, 대안적으로 라이게이션 또는 재조합에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는, 세포 개체군으로부터 유래된 주형은 엄격하게 세포 내에 함유되어 있지 않다. 세포 개체군은, 예를 들어, 용해될 수 있다.
가변성 결합 단백질을 발현하는 세포 개체군 상에서의 무작위 연결 과정의 적용은 가변 영역 엔코딩 서열의 조합 라이브러리의 단순화된 생성을 가능하게 한다. 바람직하게는, 세포 개체군은 가변 영역 결합 단백질을 발현하는 세포, 예를 들어, B 림프구, 비장세포, 화부리치낭으로부터 분리된 세포, 하이브리도마 세포, 혈장 세포, 형질모세포 또는 이들 세포의 혼합물을 구성한다.
상기 언급된 실시형태에서 세포의 개체군은, 예를 들어, 추가의 정제없이 투과 또는 용해되거나, 주형 핵산은 표준 절차에 의해 세포로부터 분리될 수 있다. 단일-단계 멀티플렉스 RT-PCR 절차가 바람직하다. 그러나, 2-단계 절차가 또한 본 실시형태에서 이용될 수 있다.
멀티플렉스 RT-PCR 연결 과정의 특이성, 감도 및 수율을 증가시키기 위한 효율적인 방법은 멀티플렉스 RT-PCR로부터 수득된 연결된 뉴클레오티드 서열의 추가의 분자 증폭에 이어 라이게이션 또는 재조합에 의한 연결을 수행하거나, 또는 멀티플렉스 중첩-신장 RT-PCR에 의한 것이다. 바람직하게는, 이러한 추가의 증폭은 대상이 되는 연결된 핵산 서열을 증폭시키기 위해 적합한 프라이머 믹스를 사용하여 PCR 증폭으로 수행된다. 사용된 프라이머 믹스는 멀티플렉스 프라이머 믹스 또는 멀티플렉스 중첩-신장 프라이머 믹스의 외측(outer) 프라이머일 수 있으며, 이는 연결된 가변 영역 엔코딩 서열의 센스 가닥의 최외측 5' 말단 및 3' 말단에 대해 어닐링되어 연결된 전체 생성물의 증폭을 가능하게 하는 프라이머를 의미한다. 또한, 외측 프라이머는 중첩 신장 테일을 함유하지 않는 멀티플렉스 중첩-신장 프라이머 혼합물의 프라이머로서 설명될 수 있다. 대안적으로, 네스티드 또는 반-네스티드(semi-nested) 프라이머 세트가 연결된 뉴클레오티드 서열의 추가 증폭을 위해 사용될 수 있다. 이러한 네스티드 PCR은 특히 연결된 생성물의 양을 증가시키는 것 뿐만 아니라 방법의 특이성을 증가시키는 역할을 한다. 본 발명의 경우, 반-네스티드 PCR('프라이머 혼합물 및 설계' 제목의 섹션에 기재되어 있음)이 또한 네스티드 PCR과 마찬가지로 기능하는 것으로 간주된다. 따라서, 비록 반드시 필요한 것은 아니지만, 본 발명은 바람직하게는 네스티드 PCR 또는 반-네스티드 PCR을 사용하는, 멀티플렉스 중첩-신장 RT-PCR로부터의 연결된 생성물 또는 라이게이션 또는 재조합에 의해 연결된 생성물에 대한 추가의 PCR 증폭을 수행하는 것이 요망된다.
추가의 증폭은, 멀티플렉스 중첩-신장 RT-PCR, 라이게이션 또는 재조합의 반응 생성물 전체 또는 이의 분획을 직접 사용하거나, 예를 들어, 연결된 생성물의 아가로오스 겔 전기영동을 수행하고, 연결된 가변 영역 엔코딩 서열의 예상 크기에 상응하는 단편을 절개함으로써, 이들 반응 중 어느 하나로부터의 부분적으로 정제된 연결된 생성물을 사용하여 직접적으로 수행될 수 있다. 멀티플렉스 중첩-신장 RT-PCR에 의해 연결된 생성물의 경우, 추가의 증폭은 바람직하게는 멀티플렉스 중첩-신장 RT-PCR 반응으로부터의 분획 상에서 직접 수행되는데, 이는 이것이 첫번째 반응에서 연결되지 않을 수 있는 개별 표적 서열의 결합을 보조할 것이기 때문이다.
프라이머
혼합물 및 설계
본 발명의 프라이머 혼합물은 2개씩 프라이머 세트를 형성하는 4개 이상의 프라이머를 포함하며, 이 프라이머는 대상이 되는 2개 이상의 상이한 표적 서열을 증폭시킬 수 있다. 프라이머 세트는 유전자 패밀리 변이체를 증폭시키기 위하여 설계된 1개 이상의 프라이머 쌍을 포함한다. 2개 이상의 이러한 프라이머 쌍 또는 프라이머 세트의 혼합물은 멀티플렉스 프라이머 믹스를 구성한다. 닭 내의 항체 다양성은 유전자 전환을 통해 달성되며, 이 유전자 전환은 중쇄(HC) 및 경쇄(LC) 가변 영역에 대한 업스트림 슈도유전자(pseudogene)가 상동성 재조합에 의해 단일의 VH 및 VL 유전자에 삽입되는 서열의 공여체로서 기능하는 과정이다. 이는 모든 가변 영역이 원칙적으로 VH를 위해 단일의 프라이머 쌍, 그리고 VL을 위해 단일의 프라이머 쌍에 의해 증폭될 수 있는 것을 의미한다. 바람직한 실시형태에 있어서, 멀티플렉스 반응에서, 단일의 VH 및 VL 5' 프라이머는 하나 이상의 3' 불변 영역 프라이머와 함께 사용되는 한편, 네스티드 PCR 반응은 단일의 JH 프라이머 및 단일의 JL 프라이머와 함께 수행된다. 바람직하게는, 멀티플렉스 프라이머 믹스는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 이상의 프라이머 쌍, 예를 들어, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 또는 150개 이상의 프라이머 쌍을 포함한다. 특히 가변 영역 엔코딩 서열의 증폭을 위해서는, 멀티플렉스 프라이머 믹스 내의 개별 프라이머 세트가 2개 이상의 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 개별 프라이머 세트가 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280 또는 300개 이상의 프라이머를 포함한다. 바람직하게는 멀티플렉스 프라이머 믹스 중의 프라이머의 총수는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150 또는 200개 이상이고, 프라이머 수는 많아야 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 또는 400개이다.
본 발명의 모든 프라이머는 유전자-특이적 영역을 포함하고, 일부 프라이머는 추가적으로 프라이머의 5' 말단에 프라이머 테일, 즉, 유전자-특이적 프라이머 부분의 3'-말단에 융합되는 5' 비-코딩 서열을 구비한다. 이러한 프라이머 테일은 대략 6 내지 50개 뉴클레오티드 길이이지만, 또한 필요에 따라 더 길 수 있다. 증폭시 프라이머 테일은 표적 서열에 첨가된다.
본 발명의 프라이머 테일은, 예를 들어, 클로닝 테일, 연결 테일, 예컨대, 라이게이션에 의한 연결에 적합한 테일, 재조합에 의한 연결에 적합한 테일 또는 중첩-신장 테일이다.
클로닝 테일은 6 내지 20개 이상의 뉴클레오티드 길이일 수 있고, 제한 위치 및/또는 재조합 위치를 포함하는데, 이는 연결된 생성물을 적절한 벡터로 삽입하는데 유용하다.
라이게이션에 의한 연결을 가능하게 하기 위하여, 멀티플렉스 프라이머 믹스의 프라이머 세트는 제1 프라이머 세트의 한 부분(정방향 또는 역방향 프라이머(들))이 절단시에 제2 프라이머 세트의 한 부분의 연결 테일에 위치한 제한 위치와 호환가능할 제한 부위를 함유하는 연결-테일을 구비하도록 설계된다. 2개 초과의 표적 서열의 연결을 위해, 제2 프라이머 세트의 제2 부분은 절단시에 제3 프라이머 세트의 한 부분에 위치한 제한 위치와 호환가능할 제한 위치가 구비된다. 제2 프라이머 세트에 위치한 이러한 제2 제한 위치는 제1 프라이머 세트의 제한 위치와 호환가능하지 않아야 한다. 상당한 수의 표적 서열이 이러한 방식으로 프라이머 세트를 설계함으로써 연결될 수 있다. 표적 서열에서, 적은 빈도로 나타나거나 나타나지 않는 제한 위치가 선택되어야 한다. 또한, 라이게이션 위치가 사용된 특정 제한 효소에 대한 절단-저항성을 가지게 되도록 호환가능한 제한 위치가 동일하지 않은 것이 바람직하다. 이는 반응이 제1 표적 서열을 제2 표적 서열과 연결하는 방향으로 진행되게 할 것인데, 이는 동일한 표적 서열 사이의 연결이 제한 효소에 의해 절단가능할 것이기 때문이다. 적합한 쌍의 제한 위치는, 예를 들어, SpeI과 XbaI(대안적으로 NheI 또는 AvrII가 이들의 하나 또는 둘 모두를 대체할 수 있음), NcoI과 BspHI, EcoRI과 MfeI 또는 PstI와 NsiI이다. 연결을 위해, SpeI은, 예를 들어, 제1 표적 서열에 위치할 수 있고, XbaI은 제2 표적 서열에 위치할 수 있고, NcoI은 제2 표적 서열의 다른 말단에 위치될 수 있고, BspHI은 제3 표적 서열 3에 위치할 수 있으며, 이외의 것도 가능하다. 과정을 추가로 단순화하기 위하여, 제한 효소가 동일한 완충액 중에서 기능한다면 유익하다.
재조합에 의한 연결을 가능하게 하기 위해, 멀티플렉스 프라이머 믹스의 프라이머 세트는 예를 들어 문헌[Chapal et al., 1997, BioTechniques 23, 518-524]에 예시되어 있는 바와 같이 설계될 수 있고, 이 문헌은 본 명세서에 참조로 포함된다.
멀티플렉스 PCR 증폭과 동일한 단계에서 대상 뉴클레오티드 서열의 연결을 가능하게 하기 위하여 중첩-신장 PCR에 적합한 테일을 멀티플렉스 프라이머 믹스의 각 프라이머 세트의 1개 이상의 프라이머에 첨가하여 멀티플렉스 중첩-신장 프라이머 혼합물을 생성한다.
중첩-신장 테일은 통상 더 긴, 8개 내지 75개 뉴클레오티드 길이이며, 프로모터, 리보솜 결합 부위, 종결 서열, 또는 링커 서열, 이를 테면 scFv와 같은 조절 엘리먼트의 후속 삽입을 가능하게 하는 제한 위치 또는 재조합 위치를 함유할 수 있다. 중첩-신장 테일은 또한 필요에 따라 정지 코돈을 함유할 수 있다. 일반적으로, 제WO 2005/042774호의 도 1에 도시된 바와 같이, 3가지 유형의 중첩-신장 테일이 있다. 유형 I에서, 2개의 프라이머 세트의 중첩-신장 테일은 단독으로 서로 중첩된다. 2개의 중첩-신장 테일의 뉴클레오티드는 모두가 반드시 서로 상보적일 필요는 없다. 일 실시형태에 있어서, 상보적인 뉴클레오티드는 중첩-신장 테일의 60 내지 85%로 나타난다. 유형 II에서, 중첩-신장 테일, 5' 뉴클레오티드의 4 내지 6은 인접한 표적 서열의 유전자-특이적 영역에 상보적이다. 유형 III 중첩-신장 테일에서, 전체 중첩부는 인접한 표적 서열에 상보적이다. 유형 I 및 II 중첩-신장 테일은 조절 엘리먼트 등이 후에 연결된 표적 서열 사이에 삽입되는 경우에 바람직하다. 유형 II 중첩-신장 테일은 표적 서열이 scFv로 제시된 바와 같이 정의된 링커에 의해 연결되는 경우에 바람직하다. 유형 III 중첩-신장 테일은 표적 서열이 서로에 인-프레임(in-frame)으로 연결되는 경우에 바람직하다.
중첩-신장 테일의 설계는 길이, 상대적 GC 함량(GC%), 제한 위치의 존재, 팔린드롬(palindrome), 융점, 이들이 커플링되어 있는 유전자-특이적 부분과 같은 서열 특성에 의해 좌우된다. 중첩-신장 테일의 길이는 8 내지 75개 뉴클레오티드 길이여야 하며, 바람직하게는 이들은 15 내지 40개 뉴클레오티드 길이이다. 보다 바람직하게는 이들은 22 내지 28개 뉴클레오티드 길이이다. 아주 긴 중첩-신장 테일(50 내지 75개 뉴클레오티드)의 사용은 각 프라이머 세트에 의해 생성되는 생성물의 연결을 유리하게 할 수 있다. 그러나, 중첩-신장 테일의 길이와 유전자-특이적 영역 간의 비율은 아마도 아주 긴 중첩-신장 테일을 사용하는 경우에 조절될 필요가 있을 것이다. GC% 선호도는 중첩-신장 테일의 길이에 따라 다르다. 더 짧은 테일은 이들이 상보적인, 보다 짧은 스트레치(stretch)를 가지기 때문에, 이들은 더 긴 테일보다 상호작용을 강하게 하기 위하여 더 높은 GC%를 필요로 한다. 프라이머 설계의 다른 원칙은 마찬가지로 준수되어야 하는데, 예를 들어, 프라이머 이합체화 및 헤어핀 형성은 최소화되어야 하며, 잘못된 프라이밍도 최소화되어야 한다. 또한, Taq DNA 중합효소는 종종 새롭게 합성된 DNA 가닥의 3' 말단에서 아데노신(A)을 첨가하고, 이는 중첩-신장 테일이 3' 비-주형 A 첨가를 수용할 수 있게 함으로써, 중첩-신장 테일 설계에서 수용될 수 있다.
중첩-신장 테일, 또는 라이게이션에 의한 연결 또는 재조합에 의한 연결에 적합한 테일인, 연결 테일을 지니고 있는 프라이머의 선택은 표적 서열의 연결 순서 및 방향을 정의한다. 연결 테일이 구비되는 것이 프라이머 세트 중 정방향 프라이머(들)인지 역방향 프라이머(들)인지, 또는 가능하게는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 둘 모두 인지가 본 발명에 필수적인 것은 아니다. 그러나, 이는 어느 정도는 감안되어야 하는데, 이는 최종 생성물 내의 표적 서열의 순서 및 방향이, 예를 들어, 프로모터 및 말단 서열과 같은 조절 엘리먼트의 삽입에 대해, 또는 개별 표적 서열의 인-프레임 연결에 대해 관련성이 있을 수 있기 때문이다.
대상이 되는 2개의 뉴클레오티드 서열의 연결을 위해, 연결 테일이 각 표적 서열의 PCR 증폭에 사용되는 각각의 프라이머 세트의 역방향 프라이머(들) 또는 정방향 프라이머(들) 중 어느 하나에 첨가될 수 있다.
본 발명은 각각의 세트의 중첩-신장 테일, 및 닭 VH 및 닭 VK 정방향 프라이머에 라이게이션에 의한 연결을 위해 적합한 테일의 첨가를 예시한다. 이것은 5'에서 5'(헤드-투-헤드 및 양방향)의 생성물의 연결 방향을 야기시킨다. 그러나, 연결 테일은 또한 각각의 세트의 역방향 프라이머(들)에 첨가될 수 있다. 이것은 3'에서 3'(테일-투-테일 및 양방향)의 생성물의 연결 방향을 야기시킨다. 제3 옵션은 연결 테일을 제1 프라이머 세트의 역방향 프라이머(들) 및 제2 프라이머 세트의 정방향 프라이머(들)에 첨가하거나 상기와 반대로 첨가하는 것이다. 이것은 3'에서 5' 방향으로(헤드-투-테일 및 단일방향) 야기시킨다.
2개 초과의 대상 뉴클레오티드 서열을 연결시킬 때, 프라이머 세트의 일부는 정방향 및 역방향 프라이머 둘 모두 상에 연결 테일을 가져서, 한 테일은 선행 프라이머 세트의 테일에 상보적이고 다른 테일은 후속 프라이머 세트의 프라이머 중 하나에 상보적이다. 이러한 원리는 2개의 다른 표적 서열 간에 연결되어야 하는 표적 서열을 증폭시키는 모든 프라이머 세트에 대해 고수된다.
유전자 특이적 프라이머 부분의 설계는 일반적으로 프라이머 이합체화, 헤어핀 형성 및 비특이적 어닐링을 최소화시키는 것과 같은 공지된 프라이머 설계 규정을 준수해야 한다. 추가로, 3' 염기로서 다수의 G 또는 C 뉴클레오티드는 가능한한 회피되어야 한다. 프라이머 세트 내 유전자 특이적 영역의 융점(Tm)은 바람직하게는 서로 동일하거나 +/- 5℃이어야 한다. 본 발명에서, 45 내지 75℃의 Tm 값이 바람직하며, 약 60℃의 Tm 값이 대부분의 적용에 적합하다. 유리하게는, 초기의 프라이머 설계는 이러한 과제를 위해 개발된 컴퓨터 프로그램에 의해 보조될 수 있다. 그러나, 프라이머 설계는 일반적으로 실험실 시험 및 통상적인 최적화를 필요로 한다. 이는, 예를 들어, 크기, 제한효소 단편 길이 다형성(RFLP) 및 프라이머 세트를 사용하여 수득된 증폭 생성물의 시퀀싱을 분석함으로써 수행될 수 있다. 프라이머 내의 축퇴 위치의 사용은 가변 영역을 갖는 서열을 증폭시키는 경우, 또는 특정류의 단백질에 속하는 새로운 패밀리 구성원을 찾는 경우에 유용한 접근법이다. 축퇴 위치의 수는 또한 최적화를 필요로 할 수 있다.
본 발명의 특징 중 하나는 대상이 되는 2개 이상의 뉴클레오티드 서열의 증폭을 프라이밍시킬 수 있고, 이들의 연결을 촉진시킬 수 있는 2개 이상의 프라이머 세트로 구성된 프라이머 믹스에 있다. 본 발명의 프라이머 믹스는, 예를 들어, 효소, 억제제, 구조 단백질, 독소, 채널 단백질, G-단백질, 수용체 단백질, 면역글로불린 수퍼패밀리 단백질, 수송 단백질 등, 바람직하게는 면역글로불린의 부류에 속하는 헤테로머 단백질로부터의 2개 이상의 서브유닛 또는 도메인의 증폭을 프라이밍시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징은, 각 프라이머 세트의 하나 이상의 프라이머 세트 구성원이 제2 프라이머 세트의 프라이머 세트 구성원의 중첩-신장 테일에 혼성화할 수 있는 중첩-신장 테일을 포함하는, 프라이머 세트를 포함하는 멀티플렉스 중첩-신장 프라이머 믹스의 사용에 있다.
중첩-신장 테일은, 인접하는 생성물에 상보적인 테일을 갖는 프라이머 세트로부터 발생하는 각각의 개별 생성물을 구비함으로써 멀티플렉스 중첩-신장 PCR 증폭 중에 대상의 뉴클레오티드를 즉시 연결시킬 수 있다. 그러나, 이것은 연결이 제1 PCR 증폭 중에 반드시 일어나야 함을 의미하는 것은 아니다. 반응 설정(setup)에 의존하여, 대다수의 실제 연결은 제1 PCR 증폭의 외측 프라이머에 의한 추가 증폭(멀티플렉스 PCR 증폭) 중에 수행될 수 있다.
단일의 프라이머는 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 5' 말단에 사용될 수 있다. 중쇄 및 경쇄 불변 영역에 상응하는 단일의 프라이머는 3' 프라이머로 사용될 수 있다. 대안적으로, 경쇄 결합 영역 프라이머는 불변 영역 프라이머 대신에 역방향 프라이머로 사용될 수 있다. 대안적으로, 가변 경쇄 및 중쇄의 리더 서열에 선행하는 UTR 영역에서 어닐링되는 정방향 프라이머가 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시형태는 가변 영역 엔코딩 서열에 선행하는 리더 엔코딩 서열의 3' 말단에서 어닐링되는 프라이머, 및 가변 영역 엔코딩 서열의 증폭을 위한 이들의 용도를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 멀티플렉스 중첩-신장 PCR 및 아마도 역전사 단계에도 사용되는 멀티플렉스 중첩-신장 프라이머 믹스는 다음을 포함한다:
a) 하나 이상의 닭 경쇄 불변 영역 프라이머, 또는 면역글로불린 경쇄 영역 엔코딩 서열의 센스 가닥에 상보적인 하나의 닭 경쇄 J-영역 프라이머;
b) 면역글로불린 경쇄 가변 영역 엔코딩 서열 또는 경쇄 가변 영역 리더 서열의 안티센스 가닥에 상보적이며, a)의 상기 프라이머(들)와 프라이머 세트를 형성할 수 있는 하나의 경쇄 V-영역 프라이머;
c) 하나 이상의 닭 중쇄 불변 영역 프라이머, mRNA의 3' 비-코딩 영역에 상보적인 하나의 닭 중쇄 프라이머, 또는 면역글로불린 중쇄 도메인 엔코딩 서열의 센스 가닥에 상보적인 하나의 중쇄 J-영역 프라이머;
d) 면역글로불린 중쇄 가변 영역 엔코딩 서열 또는 중쇄 가변 영역 리더 서열의 안티센스 가닥에 상보적이며, c)의 상기 프라이머(들)와 프라이머 세트를 형성할 수 있는 하나의 닭 중쇄 V-영역 프라이머.
추가의 실시형태에 있어서, 면역글로불린 경쇄 V-영역 및 중쇄 V-영역 프라이머는 연결 테일, 바람직하게는 상보적인 중첩-신장 테일의 형태로 연결 테일을 지닌다. 이것은 헤드-투-헤드 방식으로 연결된 가변 영역 엔코딩 서열을 생성시킨다. 헤드-투-테일 방식의 가변 영역 엔코딩 서열의 연결을 위해, 닭 경쇄 불변 영역 또는 닭 경쇄 J 영역 중 어느 하나 및 닭 중쇄 V 영역 프라이머 또는 둘 모두는 연결 테일을 함유하거나, 닭 경쇄 V 영역 프라이머 및 mRNA의 3' 비-코딩 영역에 상보적인 닭 중쇄 프라이머, 중쇄 불변 영역에 상보적인 닭 중쇄 프라이머, 또는 닭 중쇄 J 영역 프라이머 상보적인 프라이머는 연결 테일을 함유하거나 둘 모두이며, 바람직하게는 상보적인 중첩-신장 테일의 형태로 연결 테일을 함유한다. 테일-투-테일 방식의 가변 영역 엔코딩 서열의 연결을 위해, 닭 경쇄 불변 또는 J 영역에 상보적인 프라이머 및 닭 중쇄 불변 또는 J 영역 프라이머에 상보적인 프라이머는 연결 테일을 함유하며, 바람직하게는 상보적인 중첩-신장 테일 형태로 연결 테일을 함유한다.
본 발명은 또한, 멀티플렉스 RT-PCR 이후 라이게이션 또는 재조합에 의한 연결에 의해, 또는 멀티플렉스 중첩-신장 RT-PCR에 의해 수득된 연결된 생성물의 추가의 PCR 증폭을 위한 프라이머를 포함한다. 이러한 추가의 PCR 증폭은 연결된 표적 서열을 증폭시키기에 적합한 프라이머 믹스를 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 프라이머 믹스는, 연결된 뉴클레오티드 서열의 센스 가닥의 최외측 5' 말단 및 3' 말단에 어닐링되어, 전체 연결된 생성물을 선택적으로 증폭시킬 수 있는 프라이머를 의미하는, 멀티플렉스 프라이머 믹스 또는 멀티플렉스 중첩-신장 프라이머 믹스의 외측 프라이머를 포함할 수 있다. 이러한 과정은 일반적으로 멀티플렉스 RT-PCR에 후속하여 라이게이션 또는 재조합에 의한 연결로부터 수득되거나, 멀티플렉스 중첩-신장 RT-PCR로부터 수득되는 연결된 생성물의 양을 증대시키는 역할을 한다.
대안적으로, 일차적인 멀티플렉스 RT-PCR 또는 멀티플렉스 중첩-신장 RT-PCR 반응에 사용되는 외측 프라이머와 비교하여 네스티드인 프라이머 세트가 연결된 뉴클레오티드 서열의 추가 증폭에 사용될 수 있다. 이러한 프라이머 세트는 네스티드 프라이머 세트로 명명된다. 네스티드 프라이머의 설계는, 이들이 부분적으로 또는 완전히 3'을 멀티플렉스 RT-PCR 또는 멀티플렉스 중첩-신장 RT-PCR에 사용되는 외측 프라이머의 어닐링 위치로 프라이밍한다는 것을 제외하고, 일반적으로 상기 기술된 유전자 특이적 프라이머에 대해서와 동일한 설계 규칙을 준수한다. 그러므로, 네스티드 PCR로부터 형성되는 생성물은, 멀티플렉스 RT-PCR 이후의 라이게이션 또는 재조합에 의한 연결에 의해 수득되거나, 멀티플렉스 중첩-신장 RT-PCR에 의해 수득되는 연결된 생성물보다 길이가 더 짧을 수 있다. 연결된 생성물의 양을 증가시키는 것 이외에, 네스티드 PCR은 추가로 특히 멀티플렉스 중첩-신장 RT-PCR 기술의 전체 특이성을 증가시키는 역할을 한다. 그러나, 이미 기술된 멀티플렉스 프라이머 믹스/멀티플렉스 중첩-신장 프라이머 믹스 모두가 추가의 증폭을 수행하는 경우 네스티드 프라이머 세트와 병용하기에 적합한 것은 아님을 유의해야 한다. 이러한 경우, 멀티플렉스 프라이머 믹스/멀티플렉스 중첩-신장 프라이머 믹스의 외측 프라이머가 추가의 증폭에 사용되거나, 반-네스티드 PCR이 사용될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, JL 프라이머 및 JH 프라이머는 연결된 면역글로불린 가변 영역 엔코딩 서열의 추가의 증폭을 위한 네스티드 프라이머로서 사용된다.
또한, 본 발명의 네스티드 프라이머 세트는 제1 멀티렉스 프라이머 믹스/멀티플렉스 중첩-신장 프라이머 믹스로부터의 1개 이상의 역방향(또는 정방향) 외측 프라이머(들) 및 제1 멀티플렉스 프라이머 믹스/멀티플렉스 중첩-신장 프라이머 믹스의 정방향(또는 역방향) 외측 프라이머(들)의 어닐링 위치에 대해 3'을 프라이밍하는 제2 네스티드 프라이머를 포함할 수 있다. 추가 PCR 증폭을 위한 이러한 프라이머 세트의 사용은 일반적으로 반-네스티드 PCR로서 공지되어 있다. 반-네스티드 PCR은 예를 들어, 어느 한 특정 영역, 예를 들어 가변 영역 서열에 대한 네스티드 프라이머를 설계하기 어려운 경우에 적용될 수 있는 데, 왜냐하면 이러한 프라이머는 상보성 결정 영역(CDR)에서 어닐링해야 하기 때문이다. 또한, 반-네스티드 PCR은 손상되지 않은 연결된 서열의 한 말단을 유지시키는 것이 바람직한 경우, 예를 들어, 클로닝의 목적으로 사용될 수 있다.
멀티플렉스 중첩-신장
PCR
의 최적화
2-단계 및 단일-단계 절차 양자 모두의 멀티플렉스 중첩-신장 PCR 단계에 대한 파라미터가 수개의 파라미터에 대해 최적화될 수 있다(예를 들어, 문헌[Henegariu, O. et al. 1997. BioTechniques 23, 504-511; Markoulatos, P. et al. 2002. J. Clin. Lab. Anal. 16, 46-51] 참조). 외측 프라이머와 내측 프라이머 간의 비가 이러한 반응에 대해 덜 중요하기는 하지만, 멀티플렉스 RT-PCR에 대해 일반적으로 동일한 최적화 파라미터가 적용된다.
a.
프라이머
농도
중첩-신장 테일을 지닌 프라이머(예를 들어, VH 및 VL 프라이머)의 농도는 바람직하게는 중첩-신장 테일을 갖지 않는 외측 프라이머(예를 들어, JH 및 경쇄 프라이머)의 농도보다 낮다.
표적 서열 중 하나가, 예를 들어, 보다 높은 GC% 결과로서 다른 것들에 비해 낮은 효율로 증폭되는 경우, 증폭 효율을 동등하게 하는 것이 가능할 수 있다. 이는 낮은 효율을 갖는 증폭을 매개하는 프라이머 세트를 높은 농도로 사용하거나, 다른 프라이머의 농도를 낮춤으로써 행해질 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 영역을 엔코딩하는 서열은 보다 높은 GC%를 갖는 경향이 있으며, 이에 따라 경쇄 가변 영역보다 증폭 효율이 보다 낮다. 이는 VH 프라이머보다 더 낮은 농도로 VL 프라이머를 사용하는 것을 지시한다.
또한, 다수의 프라이머를 사용하는 경우, 프라이머의 전체 농도가 문제시될 수 있다. 상한은 적정 실험에 의해 실험적으로 결정될 수 있다. 어플라이드 바이오시스템즈(Applied biosystems)로부터의 앰플리타크 골드(AmpliTaq Gold®) PCR 시스템에 있어서, 상한은 1.1 μM의 전체 올리뉴클레오티드 농도인 것으로 밝혀졌으나, 다른 시스템에 있어서는 약 2.4 μM 만큼 높을 수도 있다. 이러한 전체 올리고뉴클레오티드 농도의 상한은 개별 프라이머의 최대 농도에 영향을 준다. 개별 프라이머 농도가 지나치게 낮을 경우, 불량한 PCR 감도를 유발할 수 있다.
올리고뉴클레오티드 프라이머의 질이 멀티플렉스 중첩-신장 PCR에 중요한 것으로 밝혀졌다. HPLC로 정제된 올리고뉴클레오티드는 최상의 결과를 생성하였다.
b.
PCR
사이클링 조건:
바람직하게는, 사이클링 조건은 30-80회 PCR 사이클과 함께, 하기와 같다:
주석:
(1) 어닐링 온도는 프라이머의 Tm보다 대략 5℃ 아래이다.
(2) EPL은 예상된 생성물 길이(kb)이다.
단일 단계 멀티플렉스 중첩-신장 RT-PCR에 있어서, 하기 단계가 위에 약술된 증폭 사이클링 이전에 사이클링 프로그램으로 도입되었다:
주석:
(1) 이들 조건은 또한 개별 역전사가 수행되는 경우에 사용된다.
(2) 고온 개시 중합효소가 단일-단계 RT-PCR에 유리하다. 제조업자에 따른 활성화.
이들 모든 파라미터를 최적화시키는 것이 가능하다. 특히, 어닐링 온도가 중요하다. 따라서, 최종 프라이머 믹스를 구성하기 위한 것인 모든 개별 프라이머 세트가 먼저, 최적의 어닐링 온도 및 시간, 뿐만 아니라 신장 및 변성 시간을 확인하기 위해 따로 시험되어야 한다. 이는 이들 파라미터가 멀티플렉스 중첩-신장 프라이머 믹스에 대해 최적화될 수 있는 시기(window)에 관한 좋은 아이디어를 제공할 것이다.
예를 들어, 낮은 프라이머 농도 또는 낮은 주형 농도로 인한 불량한 PCR 감도에 의한 문제점은 약 35 내지 80회 사이클, 바람직하게는 약 40회 사이클을 의미하는 다수의 열 사이클을 사용함으로써 극복될 수 있다. 또한, 보다 긴 신장 시간, 즉 표준 1분 신장과 비교하여 약 1.5 내지 5분 x EPL의 신장 시간은 멀티플렉스 중첩-신장 PCR 과정을 개선시킬 수 있다.
c.
애주번트의
사용
멀티플렉스 PCR 반응은 DMSO, 글리세롤, 포름아미드, 또는 베타인과 같은 PCR 첨가제를 사용하여 현저하게 개선될 수 있는데, 이러한 첨가제는 DNA를 릴렉싱(relaxing)시켜 주형 변성을 보다 용이하게 한다.
d.
dNTP
및
MgCl
2
데옥시뉴클레오시드 트라이포스페이트(dNTP) 질 및 농도가 멀티플렉스 중첩-신장 PCR에 중요하다. 최상의 dNTP 농도는 각각의 dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP)에 대해 200 내지 400 μM이며, 이보다 높은 농도에서 증폭이 빠르게 억제된다. 더 낮은 dNTP 농도(100 μM의 각 dNTP)가 PCR 증폭을 달성하기에 충분하다. dNTP 스톡(stock)은 해동/동결 사이클에 민감하다. 3 내지 5회의 이러한 사이클 이후, 멀티플렉스 PCR은 종종 잘 작동되지 않는다. 이러한 문제를 피하기 위해, dNTP의 소량 분취액(aliquots)을 만들어 -20℃에서 동결시켜 유지할 수 있다.
Mg2 + 농도 최적화는, 대부분의 DNA 중합효소가 마그네슘 의존성 효소이기 때문에 중요하다. DNA 중합효소 이외에, 주형 DNA 프라이머 및 dNTP가 Mg2 +에 결합한다. 그러므로, 최적의 Mg2 + 농도는 dNTP 농도, 주형 DNA 및 샘플 완충액 조성에 좌우될 것이다. 프라이머 및/또는 주형 DNA 완충액이 EDTA 또는 EGTA와 같은 킬레이터를 함유하는 경우, 겉보기 Mg2 + 최적 농도가 변화될 수 있다. 과잉의 Mg2 + 농도는 DNA 이중 가닥을 안정화시키고, DNA의 완전 변성을 억제하여, 수율을 감소시킨다. 과잉의 Mg2 +는 또한 부정확한 주형 부위에 대해 프라이머의 거짓(spurious) 어닐링을 안정화시키고, 이에 따라 특이성을 감소시킬 수 있다. 다른 한편, 불충분한 Mg2+ 농도는 생성물의 양을 감소시킨다.
dNTP와 MgCl2 간의 양호한 균형은 1.5 내지 3 mM MgCl2에 대해 약 200 내지 400 μM dNTP(각각)이다.
e.
PCR
완충액
조성
일반적으로, KCl 기반의 완충액은 멀티플렉스 중첩-신장 PCR에 충분하다. 그러나, (NH4)2SO4, MgSO4, 트리스-HCl, 또는 이들의 조합물과 같은 다른 성분을 기제로 하는 완충액은 멀티플렉스 중첩-신장 PCR에 기능하도록 최적화될 수 있다. 보다 긴 생성물의 증폭과 관련된 프라이머 쌍은 낮은 염 농도(예를 들어, 20 내지 50mM KCl)에서 더 잘 작동하는 반면, 짧은 생성물의 증폭과 관련된 프라이머 쌍은 보다 높은 염 농도(예를 들어, 80 내지 100mM KCl)에서 더 잘 작동한다. 완충액 농도를 1배 대신에 2배로 상승시킴으로써 멀티플렉스 반응의 효율을 개선시킬 수 있다.
f.
DNA
중합효소
본 발명은 Taq 중합효소로 예시된다. 다르게는, 예를 들어, Pfu, 퓨전(Phusion), Pwo, Tgo, Tth, 벤트(Vent), 딥-벤트(Deep-vent)를 비롯한 열저항성 DNA 중합효소의 다른 유형이 사용될 수 있다. 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖거나 갖지 않는 중합효소가 단독으로 또는 다른 것과 조합되어 사용될 수 있다.
벡터 및 라이브러리
본 발명에 따른 대상 뉴클레오티드 서열의 연결은 면역글로불린의 가변 영역을 코딩하는 연결된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 세그먼트를 생성한다. 또한, 그러한 연결된 핵산 서열의 라이브러리, 특히 인간 불변 영역(중쇄 및 경쇄) 서열에 연결되거나 스플라이싱된 비-인간 가변 영역 엔코딩 서열의 라이브러리 또는 인간 불변 영역 서열에 연결된 트랜스제닉 닭 또는 다른 트랜스제닉 새로부터 유래되는 인간 가변 영역 엔코딩 서열의 라이브러리는 본 발명의 방법에 의해서 생성된다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 방법에 의해서 생성된 대상이 되는 연결된 뉴클레오티드 서열을 함유하는 세그먼트는 적합한 벡터 내로 삽입된다. 라이브러리는 가변 영역 엔코딩 서열의 동족쌍의 조합 라이브러리 또는 더욱 바람직하게는 라이브러리일 수 있다. 외측 프라이머, 네스티드 프라이머 또는 반-네스티드 프라이머에 의해서 생성된 제한 부위는 바람직하게는 선택 벡터의 적절한 제한 부위와 부합되도록 설계된다. 반-네스티드, 네스티드 프라이머 또는 외측 프라이머 중의 하나에 적합한 재조합 부위가 구비되고 선택 벡터가 또한 적합한 재조합 부위를 함유하면, 대상이 되는 연결된 핵산 서열은 또한 제조합에 의해서 벡터 내로 삽입될 수 있다.
본 발명의 멀티플렉스 RT-PCR-연결 방법 중 한 방법에 의해서 생성된 생성물의 캐리어로서 사용될 수 있는 벡터에 대한 제한은 없다. 선택 벡터는, 예를 들어, 박테리아, 효모, 다른 진균, 곤충 세포, 식물 세포, 또는 포유동물 세포를 포함하는 세포에서의 증폭 및 발현에 적합한 벡터일 수 있다. 그러한 벡터는 추가의 클로닝 단계, 벡터 시스템 사이의 셔틀링, 벡터 내로 삽입된 생성물의 디스플레이, 삽입된 생성물의 발현 및/또는 숙주 세포의 게놈 내로의 통합을 촉진시키는데 사용될 수 있다.
클로닝 및 셔틀 벡터는 바람직하게는 박테리아 벡터이다. 그러나, 그 밖의 형태의 벡터가 또한 클로닝 및 셔틀 과정에 적용될 수 있다.
디스플레이 벡터는, 예를 들어, fd, M13, 또는 fl 필라멘트성 박테리오파아지류로부터 유래되는 파아지 벡터 또는 파지미드 벡터일 수 있다. 그러한 벡터는 필라멘트성 박테리오파아지의 표면상에서, 예를 들어, 결합 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 단백질의 디스플레이를 촉진할 수 있다. 리보좀, DNA, 효모 세포 또는 포유동물 세포 상의 디스플레이에 적합한 디스플레이 벡터는 본 기술 분야에 공지되어 있다. 이들은, 예를 들어, 키메라 단백질을 엔코딩하는 벡터 또는 바이러스성 벡터를 포함한다.
발현 벡터는 언급된 모든 종에 대해서 존재하며 임의의 주어진 상황에 적합한 벡터는 발현되는 단백질에 좌우된다. 일부 발현 벡터는 추가적으로 적절한 재조합 부위를 이용하는 무작위 통합, 또는 위치-특이적 통합에 의해서 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있다. 발현 벡터는 추가의 엔코딩 서열을 제공하도록 설계될 수 있으며, 그러한 추가의 엔코딩 서열은 적절한 숙주 세포에 도입될 때 연결된 생성물이 추가의 엔코딩 서열에 인-프레임으로 삽입되는 경우에 더 큰 단백질, 예를 들어, 전장 모노클로날 항체의 발현을 가능하게 한다. 이러한 인-프레임 삽입은 또한 필라멘트성 박테리오파아지 또는 세포의 표면 상에 디스플레이되는 키메라 단백질의 발현을 촉진할 수 있다. 박테리오파아지 디스플레이 시스템에서, 대상이 되는 연결된 뉴클레오티드 서열은 pIII 또는 pVIII과 같은 코트(coat) 단백질을 엔코딩하는 서열에 인-프레임으로 삽입될 수 있다(문헌[Barbas, C.F. et al.1991. Proc. Natl. Acad. Sci. USA88, 7978-7982; Kang, A. S. et al. 1991. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4363-4366]).
일 실시형태에 있어서, 대상이 되는 연결된 뉴클레오티드 서열의 개별 세그먼트는, 하나 이상의 인간 면역글로불린 불변 도메인, 바람직하게는 인간 경쇄 및 중쇄 불변 영역 둘 모두를 엔코딩하는 서열(들)을 함유하는 벡터 내로 삽입되는, 조류 종의 경쇄 가변 영역 엔코딩 서열과 회합된 면역글로불린 중쇄 가변 영역 엔코딩 서열을 포함한다. 삽입은 연결된 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역 엔코딩 서열이 불변 영역 엔코딩 서열에 인-프레임으로 삽입되도록 조작된다. 그러한 삽입은, 예를 들어, Fab 또는 F(ab')2 발현 벡터, 전장 항체 발현 벡터 또는 전장 항체의 단편을 엔코딩하는 발현 벡터를 생성시킬 수 있다. 바람직하게는, 그러한 벡터는 발현에 적합한 발현 벡터(예를 들어, 에스케리키아 콜라이(E. coli), 파아지미드 또는 포유동물 벡터)이고 불변 영역 중쇄 엔코딩 서열은 인간 면역글로불린류, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD, 또는 IgE로부터 선택되어, Fab 또는 전장 재조합 항체의 발현을 가능하게 한다. 불변 중쇄 엔코딩 서열 이외에, 벡터는 또한 인간 람다 또는 카파 쇄로부터 선택된 불변 경쇄 엔코딩 서열을 함유할 수 있다. 이것은 이들 경우에서 연결된 뉴클레오티드 서열이 조류 종으로부터의 면역글로불린 가변 영역 엔코딩 서열(Fv's)만을 엔코딩함에 따라 키메라 항체의 생성에 바람직하다.
대안적인 실시형태에 있어서, 인간 불변 영역 엔코딩 서열(들)은, 조류 서열과의 중첩부를 갖는 인간 불변 영역 엔코딩 서열 및 인-프레임으로 두 가변 영역 및 불변 영역(들)의 증폭을 보장하는 적절한 프라이머를 용기에 첨가함으로써, 분자 증폭의 단계에서 조류 가변 영역에 스플라이싱되거나 연결된다. 이러한 방식에서, 인간 불변 카파 또는 람다 쇄가 첨가되고/거나 인간 불변 중쇄가 첨가될 수 있다. 이러한 절차를 사용함으로써, 코딩 서열 내부의 제한 부위를 제공할 필요가 없는데, 이것이 이점이다.
일 실시형태에 있어서, 이중 프로모터 카세트는 발현 작제물에 삽입될 수 있으며, 이중 프로모터 카세트는 중쇄 및 경쇄의 동시 발현을 유도할 수 있고, 예를 들어, 양방향 이중 프로모터 카세트이다. 이중 프로모터 카세트는 추가로 중쇄 및 경쇄에 대한 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 발현 벡터 골격은 키메라 조류/인간 항체를 생성하기 위하여 인간 불변 경쇄 엔코딩 서열 또는 이의 단편 및/또는 인간 불변 중쇄 엔코딩 서열 또는 이의 단편을 포함할 수 있다.
본 발명의 동족쌍의 라이브러리는 두 가지의 상이한 접근법에 의해서 벡터 내로 도입될 수 있다. 첫 번째 접근법으로, 단일 동족쌍은 적합한 벡터 내로 개별적으로 삽입된다. 이러한 벡터 라이브러리는 별도로 유지되거나 풀링(pooling)될 수 있다. 두 번째 접근법으로, 모든 동족쌍을 벡터 삽입 전에 풀링하고, 이어서 적합한 벡터 내로 대량 삽입하여, 풀링된 벡터 라이브러리를 생성한다. 그러한 벡터의 라이브러리는 가변 영역 엔코딩 서열의 아주 다양한 쌍을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명은 연결된 가변 영역 엔코딩 서열의 동족쌍을 지니는 항체의 라이브러리를 제공한다. 바람직하게는, 라이브러리의 개별 항체는 한 조류 종으로부터의 중쇄 가변 영역 엔코딩 서열과 회합된 면역글로불린 경쇄 가변 영역 엔코딩 서열 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가의 실시형태는 본 명세서에 기재된 바와 같은 가변 영역 엔코딩 서열의 동족쌍의 모(parent) 라이브러리로부터 선택되는 서브-라이브러리이다. 본 발명의 바람직한 실시형태는 인간 면역글로불린류, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 또는 IgM으로부터 선택되는 전장 키메라 면역글로불린의 동족쌍을 엔코딩하는 라이브러리 또는 서브-라이브러리이다. 라이브러리는 5, 10, 20, 50, 100, 1000, 104, 105 또는 106 개 이상의 상이한 동족쌍 항체를 포함할 수 있다.
본 발명의 추가의 실시형태에서, 연결된 가변 영역 엔코딩 서열의 동족쌍의 라이브러리는 본 명세서에 기재된 단계를 포함하는 방법에 의해서 얻을 수 있다. 이러한 라이브러리는 또한 모 라이브러리라 칭한다.
스크리닝 및 선택
본 발명의 방법 중 한 방법을 이용하는, 공여체로부터 분리된 연결된 가변 영역 엔코딩 서열쌍의 모 라이브러리는 다양한 결합 단백질을 나타내는 것으로 예측되는데, 이들 중 일부는 관련성이 없을 수 있으며, 즉, 특히 조합 라이브러리에 대하여 요구되는 표적에 대한 결합이 없다. 따라서, 본 발명은 특정의 표적에 대해서 유도된 다양한 결합 특이성의 서브세트를 엔코딩하는 서브-라이브러리에 대한 농축(enrichment) 및 스크리닝을 포함한다.
동족쌍의 라이브러리의 경우, 라이브러리의 다양성은 단지 소수의 무작위적으로 연결된 가변 영역과 함께 공여체 물질에 존재하는 다양성을 나타내는 것으로 예상된다. 따라서, 농축 단계는 동족쌍으로 구성된 라이브러리에서의 표적 특이적 결합 친화도에 대한 스크리닝 이전에 필요하지 않을 수 있다.
추가의 실시형태에서, 연결된 가변 영역 엔코딩 서열쌍의 라이브러리를 생성시키는 방법은 요구되는 표적 특이성을 지니는 결합 단백질을 엔코딩하는 연결된 가변 영역 서열쌍의 서브세트를 선택함으로써 서브-라이브러리를 생성시키는 것을 추가로 포함한다. 연결된 가변 영역 엔코딩 서열의 그러한 선택은 또한 표적 특이적 동족쌍의 라이브러리로 지칭된다.
바람직한 실시형태에서, 가변 영역 엔코딩 서열의 표적-특이적 동족쌍의 라이브러리가 발현 벡터로 전달된다. 발현 벡터는 포유동물 발현 벡터, 곤충 세포 발현 벡터, 효모 발현 벡터, 진균 발현 벡터, 식물 발현 벡터, 또는 박테리아 발현 벡터일 수 있으며 스크리닝에 사용되는 세포 유형에 좌우된다. 바람직하게는, 발현 벡터는 포유동물 벡터이다.
면역학적 분석이 일반적으로 표적-특이적 면역글로불린 가변 영역 엔코딩 서열의 선택에 적합하다. 그러한 분석은 본 기술 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, FMAT, FLISA, ELISPOT, ELISA, 멤브레인 분석(예, 웨스턴 블랏), 필터상의 어레이, 또는 FACS로 구성된다. 그러한 분석은 면역글로불린 가변 영역 엔코딩 서열로부터 생성된 폴리펩티드를 이용하여, 직접적인 방법으로 수행되거나, 대안적으로, 면역 분석은 파아지 디스플레이, 리보좀 디스플레이, 박테리아 표면 디스플레이, 효모 디스플레이, 진핵생물 바이러스 디스플레이, RNA 디스플레이 또는 공유(covalent) 디스플레이와 같은 농축 방법과 병용하여 또는 그 후에 수행될 수 있다(문헌[FitzGerald, K., 2000. Drug Discov. Today 5, 253-258]). 동족 Fab 발현 라이브러리와 동족 전장 항체 발현 라이브러리 둘 모두는 스크리닝을 거칠 수 있으며, 그로 인해 양성 클론의 서브-라이브러리가 생성될 수 있다. 그러한 스크리닝 분석 및 농축 과정이 또한 연결된 가변 영역의 조합 라이브러리 또는 Fv 또는 scFv 단편에 적합하다.
면역학적 스크리닝 이외에, 본 발명의 특별한 특징은 요망되는 특성을 지니는 항체 분비 클론을 선별하기 위한 다양한 유형의 기능적 스크리닝의 사용을 가능하게 한다는 것이다. 그러한 스크리닝 분석은, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 증식 분석, 바이러스 불활성화 분석, 세포 사멸 분석 등을 포함한다. 바람직하게는, 기능 분석이 본 발명의 발현 벡터로 트랜스펙션된 세포로부터의 상층액을 사용하여 고효율(high throughput) 포맷으로 수행된다.
바람직한 실시형태에서, 가변 영역 엔코딩 서열의 표적 특이적 동족쌍 또는 조합쌍의 서브-라이브러리의 선택은 고효율 스크리닝 분석을 이용함으로써 수행된다. 고효율 스크리닝 분석은 반-자동화 또는 완전 자동화 장치로 수행되는 ELISA 분석을 포함할 수 있으나, 이로만 국한되는 것은 아니다.
항원-결합 클론의 동족쌍 또는 조합쌍의 서브-라이브러리가 적절한 기술에 의해서 선택되는 경우, 연결된 면역글로불린 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역 엔코딩 서열의 DNA 시퀀싱에 의해서 추가의 분석을 수행하는 것이 가능하다. 우선, 그러한 DNA 시퀀싱이 라이브러리 다양성 및 CDR 영역 내의 성숙화에 대한 정보를 제공하며, 광범위한 다양성을 나타내는 클론의 선택을 가능하게 하며, 반복된 클론을 남겨둔다. DNA 시퀀싱은 분리과정 중에 도입된 돌연변이를 밝힐 것이다.
돌연변이는 Taq DNA 폴리머라제에 의해서 생성될 수 있고, 이들은 불변 영역 엔코딩 서열에서 대부분 용이하게 식별되며 용이하게 제거될 수 있다. 그러나, Taq 유도된 돌연변이는 가변 영역 엔코딩 서열에도 존재할 것이여, 여기서 이들은 자연 발생 체세포 돌연변이와 구별이 불가능한데, 상기 체세포 돌연변이는 또한 가변 영역 엔코딩 서열에서의 무작위 돌연변이의 결과이다. 돌연변이가 비체계적이고 단지 독특한 방식으로 특정의 쌍에만 영향을 주는 것을 고려할 때, 그러한 변화를 무시하는 것이 합리적인 것으로 보인다.
추가의 실시형태에서, 연결된 면역글로불린 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역 엔코딩 서열의 표적 특이적 및 아마도 서열 분석된 쌍의 서브-라이브러리는 포유동물 발현 벡터에 전달된다. 그러한 전달은 상기 단락에 기재된 벡터중 임의의 벡터 내로 수행되어, 전장 재조합 항체의 발현을 가능하게 할 수 있다. 스크리닝이 포유동물 동족 전장 항체 발현 라이브러리로 수행되면, 그러한 전달은 필요하지 않을 수 있다.
숙주 세포 및 발현
본 발명의 라이브러리는 대상이 되는 연결된 핵산 서열로부터 엔코딩된 단백질, 특히, 가변 영역 함유 결합 단백질 또는 이의 단편의 발현 및 생성에 적합한 벡터에 전달될 수 있다. 그러한 벡터는 "벡터 및 라이브러리" 섹션에 기재되어 있으며, 예를 들어, 선택된 종의 전장 항체, Fab 단편, Fv 단편, scFv, 멤브레인 결합된 또는 가용성 TcR 또는 TcR 단편의 발현을 위해 제공된다.
본 발명의 한 특징은 증폭 및/또는 발현을 위해서 연결된 가변 영역 엔코딩 서열의 동족쌍의 벡터 또는 연결된 가변 영역 엔코딩 서열의 동족쌍을 엔코딩하는 단일 클론의 라이브러리 또는 서브-라이브러리를 숙주 세포 내로 도입하는 것이다. 숙주 세포는 박테리아, 효모, 그 밖의 진균, 곤충 세포, 식물 세포 또는 포유동물 세포로부터 선택될 수 있다. 발현을 위해, 포유동물 세포, 예컨대, 차이니스 햄스터 난소(CHO) 세포, COS 세포, BHK 세포, 골수종 세포(예를 들어, Sp2/0 세포, NSO), NIH 3T3, 섬유아세포 또는 불멸화된 인간 세포, 예컨대, 헬라 세포(HeLa cell), HEK 293 세포, 또는 PER.C6 세포가 바람직하다.
벡터를 숙주 세포내로 도입하는 것은, 인산칼슘 침전법, 일렉트로포레이션, 리포펙틴, 미세주입, 리포좀 융합, RBC 고스트 융합, 원형질체 융합, 바이러스 감염 등과 같은 다양한 화학적 방법을 포함하는, 본 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 다수의 형질전환 또는 트랜스펙션 방법에 의해서 달성될 수 있다. 모노클로날 전장 항체, Fab 단편, Fv 단편 및 scFv 단편의 생성법은 공지되어 있다.
재조합 폴리클로날 항체 또는 다른 재조합 폴리클로날 단백질의 생성을 위한 제조 기술은 제WO2004/061104호 및 제WO2008/145133호에 기재되어 있다. 제WO2004/061104호에 기재된 기술은 예를 들어 항체 중쇄 및 경쇄의 동족쌍을 엔코딩하는 핵산 서열의 부위-특이적 통합에 의한 제조 세포주로서 적합한 세포의 집합체의 생성을 포함한다. 제WO 2008/145133호는 대상이 되는 개별 유전자의 숙주 세포로의 무작위적 통합과, 바람직하게는 그에 이어서 요망되는 특징을 갖는 단일 세포의 클로닝에 기초한 재조합 폴리클로날 항체 또는 다른 폴리클로날 단백질의 제조를 위한 상이한 접근법을 기재한다. 그 다음, 각각 개별의 폴리클로날 단백질의 구성원을 생성하는 개별 세포 클론은 폴리클로날 단백질의 생성을 위한 폴리클로날 제조 세포주를 생성하기 위하여 혼합된다. 제WO 2008/145133호의 무작위적 통합 접근법은 제WO 2004/061104호의 부위-특이적 통합 접근법에 비해, 더 큰 순응성을 제공하며, 더 높은 단백질 발현 수준을 야기할 수 있다. 그러나, 두 접근법 모두는 이들이 단일 뱃치에서 시간이 지남에 따라 그리고 뱃치 간에 균일한 성장 속도와 발현 수준을 가지고, 폴리클로날 항체의 안정한 생성을 가능하게 하는 것으로 관찰되는 점에서 유익하다.
이러한 세포주로부터의 폴리클로날 제조 세포주의 생성 및 재조합 폴리클로날 단백질의 생성은 더 일반적으로 예를 들어 제WO 2004/061104호에 기재된 바와 같은 몇몇의 상이한 트랜스펙션 및 제조 전략에 의해 수득될 수 있다.
한 방법은 숙주 세포주를 세포당 단일 통합 부위로 트랜스펙션시키기 위해서 단일 조성물로 같이 혼합된 벡터의 라이브러리를 사용하는 것이다. 이러한 방법은 벌크 트랜스펙션 또는 벌크상 트랜스펙션이라 칭한다. 일반적으로 벡터 및 숙주 세포 설계는 비편향된 성장을 가능하게 하는 폴리클로날 세포주가 적절하게 선택될 때 수득될 것임을 보장할 것이다. 폴리클로날 세포주의 동결된 스톡은 재조합 폴리클로날 단백질 제조의 개시 전에 생성될 것이다.
또 다른 방법은, 트랜스펙션을 위해서, 조성물 중의 라이브러리의 약 5 내지 50개의 개별 벡터를 함유하는 분획으로 분할된 벡터의 라이브러리를 사용하는 것이다. 바람직하게는, 라이브러리의 분획은 10 내지 20개의 개별 벡터로 구성된다. 각각의 조성물은 이어서 숙주 세포의 분취액 내로 트랜스펙션된다. 이러한 방법은 반-벌크 트랜스펙션이라 지칭된다. 트랜스펙션된 분취액의 수는 라이브러리의 크기 및 각각의 분획 중의 개별의 벡터의 수에 좌우된다. 라이브러리가, 예를 들어, 조성물중에 20개의 구별되는 구성원을 함유하는 분획으로 분할되는 100개의 구별되는 동족쌍으로 구성되면, 5개의 숙주 세포의 분취액이 최초 라이브러리의 구별되는 분획을 구성하는 라이브러리 조성물로 트랜스펙션될 필요가 있다. 숙주 세포의 분취액은 위치-특이적 통합을 위해서 선택된다. 바람직하게는, 구별되는 분취액은 별도로 선택된다. 그러나, 이들은 선택전에 풀링될 수 있다. 분취액은 이들의 클론성 다양성에 대해서 분석되고 충분한 다양성을 지니는 분취액만이 폴리클로날 동족쌍 라이브러리 스톡(stock)을 생성시키는데 사용될 것이다. 제조를 위해 요망되는 폴리클로날 세포주를 얻기 위해서, 분취액은 동결 스톡을 생성시키기 전에, 이들이 동결 스톡으로부터 회수된 직후에, 또는 짧은 증식 및 적응 시간 후에 혼합될 수 있다. 임의로, 세포 분취액은 생성과정 전체에 걸쳐서 별도로 유지되고, 폴리클로날 단백질 조성물은 생성 전에 세포 분취액 보다는 각각의 분취액의 생성물을 합함으로써 구성된다.
세 번째 방법은 숙주 세포가 동족쌍의 라이브러리를 구성하는 개별의 벡터를 사용함으로써 개별적으로 트랜스펙션되는 고효율 방법이다. 이러한 방법은 개별 트랜스펙션이라 지칭된다. 개별적으로 트랜스펙션된 숙주 세포는 바람직하게는 위치 특이적 인테그레이션을 위해서 별도로 선택된다. 선택시에 생성된 개별의 세포 클론은 증식 시간에 대해서 분석될 수 있고, 바람직하게는 유사한 성장 속도를 지니는 클론이 폴리클로날 동족쌍 라이브러리 스톡을 생성시키는데 사용된다. 이러한 개별의 세포 클론은 스톡을 생성시키기 전에, 이들이 동결 스톡으로부터 회수된 직후에, 또는 짧은 증식 및 적응 시간 후에 요구된 폴리클로날 세포주를 얻도록 혼합될 수 있다. 이러한 방법은 트랜스펙션, 통합 및 선택 중에 임의의 가능한 잔류 서열 편향을 제거시킬 수 있다. 대안적으로, 개별적으로 트랜스펙션된 숙주 세포는 선택이 수행되기 전에 혼합되며; 이러한 혼합은 트랜스펙션으로 인한 서열 편향의 조절을 가능하게 할 것이다.
위에 개략적으로 기재된 제조 전략에서의 공통된 특징은 재조합 폴리클로날 단백질을 구성하는 모든 개별 동족쌍이 하나의 생물반응기 또는 제한된 수의 생물반응기에서 생성될 수 있다는 것이다. 유일한 차이는 폴리클로날 제조 세포주를 구성하는 세포의 집합체를 생성하도록 선택하는 단계이다.
일 실시형태에서, 본 발명은 가변 영역 엔코딩 서열의 연결쌍의 동족 라이브러리 또는 서브-라이브러리를 포함하는 숙주 세포 개체군을 제공한다. 추가의 실시형태에서, 숙주 세포 개체군은, 멀티플레스 RT-PCR 증폭에 이어서 라이게이션 또는 재조합, 또는 동족쌍을 연결시키기 위한 본 발명의 멀티플렉스 중첩-신장 RT-PCR 기술을 사용하여, 분리된 단일 림프구 개체군으로부터 수득한 라이브러리를 포함한다.
또 다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 가변 영역 엔코딩 서열의 연결된 쌍의 조합 라이브러리 또는 서브-라이브러리를 포함하는 숙주 세포 개체군을 제공한다. 본 발명에 따른 숙주 세포 개체군은 세포가 형질전환/트랜스펙션되는 라이브러리의 다양성에 대응하는 세포의 다양한 개체군을 포함할 것이다. 바람직하게는, 세포 개체군의 각각의 세포는 단지 동족쌍의 전체 라이브러리의 한 동족쌍 만을 구성하며 동족쌍 라이브러리의 개별의 구성원은 숙주 세포 개체군으로부터 발현된 개별 구성원의 총수의 50%, 더욱 바람직하게는 25%, 가장 바람직하게는 10%를 초과하지 않는다.
상기 숙주 세포는 바람직하게는 포유동물 세포이다.
상기한 바와 같은 숙주 세포 개체군은 재조합 폴리클로날 결합 단백질의 발현에 사용될 수 있는데, 그 이유는 개체군의 개별 세포가 상이한 다양성의 가변 영역 엔코딩 서열을 포함하기 때문이다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명은 연결된 가변 영역 엔코딩 서열의 다양한 동족쌍을 엔코딩하는 벡터의 라이브러리를 포함하는 숙주 세포 개체군으로부터 발현된 재조합 폴리클로날 단백질을 제공하고, 여기서, 그러한 라이브러리는 본 발명의 방법에 의해서 획득될 수 있다. 전형적으로는, 본 발명의 재조합 폴리클로날 단백질은 상이한 동족쌍으로 이루어진 2, 5, 10, 20, 또는 50개 이상의 단백질을 포함한다.
본 발명은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 엔코딩 서열의 다양한 동족쌍을 엔코딩하는 벡터의 라이브러리를 포함하는 숙주 세포 개체군으로부터의 재조합 폴리클로날 항체의 발현을 가능하게 한다.
본 발명의 방법에 따라 수득되는 숙주 세포는 또한 모노클로날 단백질, 특히 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역의 동족쌍을 포함하는 모노클로날 항체의 생성에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 그러한 모노클로날 생성 세포주는 하이브리도마 세포주가 아니다. 이와 같은 모노클로날 항체는 하기 단계를 대상이 되는 다수의 비연속 뉴클레오티드 서열을 연결하는 방법에 추가함으로써 생성될 수 있다: a) 연결된 핵산 서열을 벡터에 삽입하는 단계; b) 상기 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; c) 상기 숙주 세포를 발현에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계; 및 d) 숙주 세포 내로 삽입된 벡터로부터 발현되는 단백질 생성물을 수득하는 단계. 바람직하게는, 숙주 세포 내로 도입된 벡터는 가변 영역 엔코딩 서열의 개별 동족쌍을 엔코딩한다.
본 발명의 적용
진단, 치료 및 예방에서 재조합 모노클로날 항체의 사용이 잘 알려져 있다. 본 발명에 의해 생성되는 재조합 모노클로날 및 폴리클로날 항체는 기존의 기술에 의해 생성되는 항체 생성물과 동일한 방식으로 사용될 수 있을 것이다. 특히, 활성 성분으로서 폴리클로날 재조합 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 특히 폴리클로날 재조합 항체가 가변 영역 엔코딩 서열의 동족쌍을 포함하는 경우에, 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 부형제와 병용하여, 본 발명의 수단에 의해 생성될 수 있다. 폴리클로날 재조합 항체 조성물은 사전결정된 질환 표적에 대해 특이적이거나 이에 대해 반응성일 수 있고, 이에 따라 조성물은 인간, 가축 또는 애완동물과 같은 포유동물에서 암, 감염, 염증성 질환, 알러지, 천식 및 다른 호흡기 질환, 자가면역 질환, 면역학적 기능장애, 심혈관 질환, 중추신경계 내의 질환, 대사 및 내분비 질환, 이식 거부 또는 원치않는 임신과 같은 질환의 치료, 경감 또는 예방을 위해 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 모든 특허 및 비특허 참고문헌은 본 명세서에 그들 전문이 참고로 포함된다.
본 발명은 하기의 비제한적인 실시예에서 추가로 기재될 것이다.
실시예
실시예
1
본 실시예는 림프구 특이적 세포 표면 마커의 조합물을 사용하여 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하는, 하기에서 단순하게 닭(갈루스 갈루스; 아이사 바렌(Isa Warren) 스트레인)으로 언급되는 닭 또는 암탉으로부터의 항체-생성 B 세포의 분리를 위한 상이한 게이팅 및 분류 전략을 설명한다. Bu-1은 항체 생성 세포에 대한 성숙 중에 B 세포 상에 존재하는, 공지된 특이적인 닭 B 세포 표면 항원이며, 혈장 세포로의 분화 중에 소실된다(문헌[Rothwell et al. (1996) Vet. Immunology Immunopathology 55:225-34]). 또한, 항체-분비 세포를 세포 표면에서 IgY의 존재에 기초하여 검출하였다. IgY의 세포 표면 존재가 혈장 세포로의 분화 중에 소실된다는 사실에도 불구하고, 항체 발현에 대한 이러한 직접적인 마커는 IgY의 막 수준이 포유동물 IgG 발현 시스템에 대해 관찰되는 단일 세포 분류를 가능하게 한다는 가정에 기초하여, 분류 전략에 포함시켰다(문헌[Wiberg et al. (2006) Biotechnol. Bioeng. 94(2):396-405]). CD3 항원의 존재에 의하여, 분류된 개체군으로부터 T 세포를 검출하고 제거하였다. 본 연구에서 사용되는 닭을 파상풍 톡소이드(TT) 항원으로 면역화시켰다. 결과적으로, 비오티닐화된 파상풍 톡소이드는 또한 형광색소 표지된 스트렙트아비딘과 병용하여 사용하여, TT-특이적인 세포의 증가된 개체군을 염색하고 선택하였다. ELISpot 분석에 의하여 항체-생성 B 세포 및 특이적인 항-TT 항체 생성 세포 둘 모두를 위해, 선택된 B 세포 개체군을 분석하였다. 세포 개체군의 공급원으로 사용되는 비장은 대부분 분화된 B-세포를 포함하여, 높은 함량의 항체 분비 세포를 포함한다(문헌[Mansikka et al., 1989, Scand.J. Immunol. 29(3):325-331]).
면역화:
6마리의 23주령 암컷 닭인 로만 브로운 라이트(Lohmann Brown Lite) 스트레인을 완전 프레운트 애주번트(CFA) 중의 0.5 mg의 파상풍 톡소이드(TT)의 피하 주사로 면역화시키고, 일차 면역화 후 14일, 21일 및 28일에 불완전 프레운트 애주번트 중의 0.5 mg TT로 반복하여 부스팅하였다. 면역화된 닭으로부터의 비장을 최종 부스트 면역화 이후 2일, 7일 및 10일에 취하고, 비장세포를 즉시 회수하였다.
닭
비장세포의
정제:
닭을 안락사시키고, 비장을 즉시 제거하였다. 비장을 간단히 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S)(Invitrogen, CA, US)이 있는 4℃의 RPMI 1640(Invitrogen, CA, US) 10 ㎖ 중에 보관하고, 얼음에 두었다. 비장 조직을 50 ㎖ 튜브 내의 70㎛ 세포 여과기(BD Falcon™ 352350)로 옮겼다. 10 ㎖ 주사기 플런저(syringe plunger)의 뒷면을 사용하여 세포를 필터를 통해 불리고, 필터를 과정 중에 규칙적인 간격으로 4 ℃의 완전 배지(10% 우태아혈청(FCS) 및 1% P/S가 있는 RPMI 1640)를 사용하여 헹구었다. 4 ℃에서 5분 동안 300 x g에서 원심분리함으로써 현탁액 중의 세포를 수집하고, 이어서, 4 ℃의 FACS 완충액(인산염 완충 염수(PBS) 중의 2% FCS) 50 ㎖ 중의 현탁액으로 세정하고, 이전에 기재된 바와 같이 원심분리하였다. 마지막으로, 세포를 4 ℃의 FACS 완충액으로 희석하고, FACS를 위해 사용하기 전에 50㎛ FACS 필터(BD 340603)를 통해 여과하고, -140 ℃에서 동결 배지(10% DMSO, 90% 우태아혈청) 중에 보관하였다.
항체 생성 B 세포를 동정하기 위하여, 관련
마커를
갖는
비장세포의
염색:
하기의 목록에 나타낸 바와 같은 각각의 뮤린 항-닭 항체 50 ㎕를 4 ℃ FACS 완충액 1 ㎖ 중의 1 x 108개 세포에 첨가하고, 4 ℃에서 암 중에 20분 동안 인큐베이션하고, 1차 염색 후에 2회 세정하고, 2차 염색 후에 3회 세정하였다.
1차 염색:
Bu-1-FITC(Southern Biotech 8395-02)
CD3-PECy5(Abcam ab25537)
IgY-PE(Southern Biotech 8320-09)
비오티닐화된 파상풍 톡소이드
2차 염색:
스트렙트아비딘-APC-CY7
샘플을 상술된 항체와 함께 항-마우스 Igk CompBeads(BD 51-90-9001229) 상의 보충을 사용하여 FACSAria™ 세포 분류기 상에서 분석하였다. 항체-생성 B 세포 개체군을 다양한 분류 게이트를 설정함으로써 동정하고, 이후에 분류된 개체군을 ELIspot 분석(실시예 2)으로, 그리고 심플렉스(Symplex™) PCR 반응(실시예 3)을 위한 주형으로서 시험하였다.
적용된 분류 게이트는 다음과 같았다:
1. Bu-1+ CD3-
2. Bu-1+ CD3- IgY+
3. Bu-1+ CD3- IgY+ TT+
4. 중간 개체군, P2
5. P2 IgY+ (P3)
6. P2 IgY+ TT+ (P4)
7. Bu-1- CD3-
8. Bu-1- CD3- IgY+
9. Bu-1- CD3- IgY+ TT+
분류 게이트 1-3을 도 3에 나타내었으며, 분류 게이트 4-9를 도 4-9에 각각 나타내었다.
실시예
2
본 실시예는 IgY-특이적 및 TT-특이적 ELISpot 분석의 사용에 의하여, 항체-생성 B 세포 개체군이 실시예 1에서 분류된 B 세포 개체군 중에 식별될 수 있음을 나타낸다.
용액:
세정 완충액(1 x PBS, 0.05% Tween):
블로킹(Blocking) 완충액: (RPMI, 2% 스킴 밀크(skim milk))
완전 RPMI: (RPMI, 10% 불활성화된 FCS, 1% P/S)
ELISpot
분석:
PVDF-바닥의 플레이트(멀티스크린(Multiscreen)-HTS, Millipore, MSIP S45 10)를 PBS 중에 희석한 항-IgY 항체(Abcam ab 6872) 또는 파상풍 톡소이드(둘 모두 10 ㎍/㎖) 10 ㎕로 코팅하고, 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. PBS 만으로 코팅된 웰을 음성 대조군으로 사용하였다. 플레이트를 PBS 중에 3회 세정하고, 이어서, 200 ㎕의 블로킹 완충액으로 4 ℃에서 적어도 2시간 동안 블로킹하였다. 그 다음, 완충액을 제거하고, 50 ㎕의 완전 RPMI로 교체하였다.
개체군 1, 4 및 7(실시예 1)로부터의 1만 개 세포를 ELISpot 플레이트의 IgY, TT 또는 PBS 코팅된 웰로 두벌로 분류하였다. 개체군 2, 5 및 8로부터의 2천 개의 IgY-양성 세포 및 개체군 3, 6 및 9로부터의 500개 TT-양성 세포를 이와 같이 ELISpot 웰로 분류하였다. ELISpot 플레이트를 표준 세포 인큐베이션 조건 하에 밤새 두어, 항체 분비를 가능하게 하였다.
밤샘 인큐베이션 후에, 플레이트를 세포 및 미결합 항체의 제거를 위해 6회; 세정 완충액 중에 3회 및 PBS 중에 3회 세정하였다. 분비되고 캡쳐된(captured) IgY 또는 TT-특이적 IgY를 검출하기 위하여, 블로킹 완충액 중에 10,000배로 희석한, 100 ㎕/웰의 호스 래디시 퍼옥시다아제(horse radish peroxidase, HRP)-컨쥬게이트된 항-IgY 항체(Abcam ab6877)를 첨가하고, 이어서 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 0.015% H2O2 및 0.1 M 소듐 아세테이트 0.1 M 아세트산(pH 5.1) 중의 0.3 ㎎/㎖의 3-아미노-9-에틸카바졸로 이루어진 새로 만든 발색 기질 100 ㎕를 첨가하기 전에, 세정 절차를 반복하였다. 4분의 디벨롭먼트(development) 후에 H2O로의 세정에 의해 반응을 중단시켰다. 입체 현미경을 사용하여 스폿의 수를 결정하고, 결과를 표 1에 나타내었다.
ELIspot 데이터는 2개의 독립적인 웰로부터의 평균이다.
ND: 결정되지 않음.
(1): 총 96개 반응으로부터의 양성 심플렉스 PCR 반응의 수(상세사항에 대해서는 실시예 3 참조).
ELISpot 분석 데이터로부터, 항체-생성 세포의 빈도가 Bu-1- CD3- IgY+ 세포 중에서 최적임으로 결론지어질 수 있다. 단일-세포 심플렉스 PCR 반응으로부터의 결과는 이러한 관찰을 확증하는 것이다.
실시예
3
키메라 닭-인간 항-파상풍 톡소이드 항체 레퍼토리의 클로닝
실시예 1에 기재된 바와 같은 닭 비장 B 세포 개체군 P2 및 P3은 상술된 바와 같이 분류된 단일 세포이다. 심플렉스 PCR에서의 이용을 위하여, 10 ㎕ 완충액(Qiagen OneStep RT-PCR 키트)을 함유하는 4개의 96-웰 PCR 플레이트에 직접 세포를 분류하고, RT-PCR 반응이 수행될 때까지 -80 ℃에서 보관하였다.
닭 심플렉스 PCR 증폭을 4개의 96-웰 플레이트 상에서 수행하였다. 반응의 기본 원리는 다음과 같다(도 1 및 도 2):
· 첫째, 중쇄 및 경쇄 cDNA 합성이 특이적인 불변 영역 프라이머로 프라이밍되는 RT 반응을 수행한다.
· 둘째, 중첩 신장에 의하여 연결된 VH 및 VL의 형성을 촉진시키는 상보적인 오버행(overhang)을 구비한 VH 및 VL 5' 영역 프라이머를 사용하여 멀티플렉스 반응을 수행한다. 3' 프라이머는 중쇄 및 경쇄 서열의 불변 영역 내에 위치한다.
· 인간 람다 경쇄 및 IgG1 중쇄 불변 영역의 중첩 신장에 의한 이후의 첨가를 위하여 오버행을 구비한 JH 및 JL 프라이머를 사용하여 단지 컨쥬게이트된 VH 및 VK를 증폭시키는 네스티드 PCR 반응을 수행한다. 심플렉스 PCR 생성물은 CDR의 크기에 따라 대략 700개 뉴클레오티드로 구성된다.
· 인간 IgG1 및 람다 불변 영역을 중첩 신장에 의해 덧붙인다(appended).
· 최종 반응 생성물을 링커로 연결되고, 5' 말단에서 5' 말단으로 컨쥬게이트되는, 인간 IgG1 불변 영역에 커플링된 닭 VH 및 인간 람다 불변 영역에 커플링된 닭 VL으로 구성한다. 링커 영역은 포유동물 세포 프로모터-리더 단편의 삽입을 위한 RE 부위를 함유하며, 프랭킹 부위는 클로닝을 용이하게 한다.
· 연결된 키메라 LC-HC 단편을 벡터 골격으로 클로닝하고, 포류동물 세포 프로모터-리더 단편을 삽입한다.
병용된 멀티플렉스 RT-PCR 반응을 위하여, 본질적으로 제조업자의 사용설명서에 따라 Qiagen OneStep RT-PCR 키트를 사용하여, 표 2에 기재된 프라이머 세트를 사용하였다. 분류된 세포가 있는 PCR 플레이트를 얼음 상에서 해동시켰다. 효소, 반응 완충액, dNTP 및 프라이머를 첨가하여, 20 ㎕의 총 반응 부피를 얻었다. 멀티플렉스 PCR 반응을 위한 사이클링 조건은 다음과 같았다:
농도는 반응 중의 최종 농도를 나타낸다.
네스티드 PCR을 본질적으로 제조업자의 사용설명서에 따라서 FastStart 중합효소(Roche) 및 시약을 사용하여 표 3에 도시된 프라이머 세트로 수행하였다. 1㎕의 멀티플렉스 심플렉스 PCR 생성물을 20㎕의 총 부피에서의 네스티드 반응마다 주형으로 사용하였다. 반응 조건은 다음과 같다:
농도는 반응 중의 최종 농도를 나타낸다.
마지막으로, 10 ㎕의 각 최종 반응 생성물을 1% 아가로스 겔 상에서 분석하였다. 도 10은 예상되는 전기영동 이동성을 갖는 21개의 반응 생성물이 있는 96-웰 플레이트로부터의 예를 나타낸 것이다. 총 90개의 밴드가 4개의 플레이트에서 야기되었다. 다양한 게이트로 정의되는 실시예 1에 기재된 B 세포 개체군 모두로부터의 96개의 단일 세포 상에서 유사한 분석을 수행하였다. 각각의 하위개체군으로부터의 VH 및 VL 중첩 생성물을 생성하는 심플렉스 PCR 반응의 수를 상기 표 1에 제공하였다.
96-웰 PCR 플레이트 내의 모든 웰로부터의 분취액을 풀링하고, 약 700 bp의 VH-VL 밴드를 1% 아가로스 겔 상에서 정제하였다. 인간 람다 경쇄 및 IgG1 중쇄 불변 영역을 중첩 신장 PCR에 의해 첨가하였다:
· 인간 IgG1 불변 중쇄 영역 cDNA 단편(발현을 개선하기 위해 최적화된 코돈)을 퓨젼(Phusion®) 중합효소(Finnzymes)를 사용하여, 프라이머 hCHC-F 및 hCHC-R(표 4)과 함께 항체 발현 플라스미드로부터 증폭시켰다. hCHC-F 프라이머는 네스티드 반응에 사용되는 프라이머 CH-JH에 상보적인 5' 부분을 함유한다. 프라이머 hCHC-R은 중첩 밴드의 클로닝을 위해 사용되는 프랭킹 PacI 부위를 도입한다. 약 1000 kb의 불변 영역 단편을 1% 아가로스 겔 상에서 정제하였다.
· 인간 람다 경쇄 불변 영역 단편을 프라이머 hL-F 및 hL-R(표 4), 및 항체 발현 플라스미드를 주형으로 사용하여 증폭시켰다. hL-F 프라이머는 네스티드 반응에 사용되는 프라이머 CH-JL에 상보적인 5' 부분을 함유한다. hL-R 프라이머는 중첩 밴드의 클로닝을 위해 사용되는 프랭킹 NotI 부위를 도입시킨다. 약 350 kb 불변 영역 단편을 1% 아가로스 겔 상에서 정제하였다.
· 정제된 VH-VL, 인간 람다 및 인간 IgG1 불변 영역 밴드를 혼합하고(각각, 25:12.5:25 ng), 중첩 신장 PCR을 프라이머 hCHC-R 및 hL-R(표 4)을 사용하여 퓨젼 중합효소로 수행하였다. 반응 생성물(대략 2 kb 중첩 밴드를 가짐)을 도 11에 나타내었다.
농도는 반응 중의 최종 농도를 나타낸다.
단편을 NotI 및 PacI으로 분해하고, 라이게이션에 의하여, 중쇄에 3' 커플링된 IRES-DHFR (내부 리보좀 도입 부위-다이하이드로폴레이트 환원효소) 및 LC 및 HC-IRES-DHFR을 위한 적절한 폴리아데닐화 신호를 가지는 플라스미드로 삽입하였다. 에스케리키아 콜라이 TOP10(Invitrogen) 컴피턴트(competent) 세포를 전기영동시키고, 형질전환체를 100 ㎍/㎖의 카르베니실린이 있는 대형(35 x 35 cm) LB-아가 플레이트에 씨딩하였다. 생성된 콜로니를 플레이트로부터 긁어내고, 박테리아 펠렛을 맥시-프렙(Maxi-Prep) 키트(컴팩트 프렙(Compact Prep), Qiagen)를 사용하여 DNA의 정제에 사용하였다. 분류된 세포로부터 항체 레퍼토리를 나타내는 정제된 DNA를 AscI 및 NheI로 분해하고, 포유동물 세포에서의 발현을 위한 신호 서열-엔코딩 영역과 함께 양방향성 프로모터 단편을 라이게이션에 의하여 삽입하였다. 에스케리키아 콜라이 TOP10 세포를 일렉트로포레이션에 의해 라이게이션 믹스로 형질전환시키고, 상술된 바와 같이 LB-아가 플레이트 상에 씨딩하였다.
실시예
5
클로닝된
레퍼토리에서 특이적인 항-파상풍
톡소이드
항체에 대한 발현 및 스크리닝
실시예 4로부터의 단일의 에스케리키아 콜라이를 100 ㎍/㎖의 카르베니실린을 갖는 LB 브로쓰(broth)를 함유하는 5개의 96-깊은 웰 플레이트의 단일 웰에 피킹(picking)하고, 쉐이커 인큐베이터에서 37 ℃에서 밤새 성장시켰다. DNA를 96 터보 미니프렙(Turbo Miniprep) 키트(Qiagen)를 사용하여 5개의 플레이트로부터 제조하고, VH-LC 삽입물의 존재를 콜로니 PCR에 의해 입증하였다. 일시적 트랜스펙션을 프리스타일(FreeStyle®) 293 세포 발현 시스템(Invitrogen)을 사용하여 수행하였다. 프리스타일 배지 중의 100 ㎕의 세포(106/ml)를 5개의 96-웰 플레이트에 씨딩하였다. 세포를 5개의 96-웰 플레이트로부터 미니프렙 DNA로 트랜스펙션하였다: 1 ㎕ 293fectin™(Invitrogen)을 52 ㎕ OptiMEM® 배지(Invitrogen) 중에 희석하였다. 평균 0.75 ㎍의 미니프렙(miniprep) 정제된 플라스미드 DNA를 첨가하고, 혼합물을 20분 동안 인큐베이션하였다. 웰당 7 ㎕의 믹스를 첨가하고, 96-웰 플레이트를 37 ℃, 5% CO2에서 쉐이킹(150 rpm)하면서 4일 동안 인큐베이션하였다.
맥시소르프(Maxisorp™)(Nunc) 플레이트를 5 ㎍/㎖ 농도의 파상풍 톡소이드(State Serum Institute, Copenhagen)로 밤새 코팅하였다. 플레이트를 스킴 밀크로 블로킹하고, 웰에 첨가하기 전에, 일시적인 트랜스펙션으로부터의 항체-함유 상층액을 완충액(Tween-20 및 스킴 밀크를 갖는 PBS) 중에 1:5 희석하였다. 항체의 결합을 과산화효소-컨쥬게이트된 염소 항-람다 경쇄 항체(Serotec)로의 인큐베이션 및 TMB Plus (KemEnTec)를 사용한 과산화효소 반응에 의해 검출하고, A450을 측정하였다.
백그라운드의 2배의 임의의 컷-오프(cut-off) 값을 사용하여, 11개 상층액이 항-파상풍 반응성에 대하여 양성인 것으로 간주될 수 있다. 이를 추가로 입증하기 위하여, 11개의 상층액 중 7개를 파상풍 톡소이드-코팅된 플레이트를 사용하여 본질적으로 상술된 바와 같은 새로운 ELISA에서 시험하였다. 동일한 7개의 상층액을 음성 대조군으로서 코팅되지 않고, 스킴 밀크로만 블로킹된 플레이트에 대하여 병행하여 시험하였다. 결과를 표 5에 도시하였다. 파상풍 톡소이드-코팅된 웰에 대한 명확한 결합이 있었으나, 코팅되지 않은 웰에 대한 결합은 없었다.
단일의 96-웰 플레이트 내의 모든 웰로부터의 상층액을 인간 Fc에 대한 캣칭(catching) 항체 및 인간 람다 쇄에 대한 과산화효소-컨쥬게이트된 검출 항체를 사용하여, ELISA로 IgG의 존재에 대하여 시험하였다. 백그라운드의 10배의 컷-오프 값을 사용하여, 80% 초과의 웰이 IgG 람다 반응성을 함유하였으며, 이는 닭-인 키메라 항체의 발현을 확인시켜준다.
실시예
6
서열 분석
실시예 5에서 플레이트 1로부터의 12개의 항체 클론을 무작위적으로 선별하고, VH 및 VL 영역을 시퀀싱하였다. 결국, 시퀀싱된 플라스미드의 유전자 구조는 의도된 바와 같이 정확하게 덧붙여진 인간 불변 영역 사이에 및 그 내에 프로모터 단편과 함께 헤드-투-헤드로 놓인 닭 유래의 VH 및 VL이 있는 것으로 드러났다. 도 12는 이들 클론 중 10개의 클론의 짧은 스트레치의 프랭킹 프레임워크 및 인간 HC 불변 영역을 갖는 VH CDR3 영역의 정렬을 도시한 것이다. 상기의 정렬은 높은 다양성 정도가 있음을 예시한다. 유사한 결과가 닭 VL 영역에 대하여 수득되었으며, 이는 또한 높은 다양성 정도를 나타내었다(미도시).
첨부된 서열 목록에서 각각의 서열 번호 13 내지 22는 도 12에 위에서부터 아래로 도시한 10개의 서열을 함유하는 전체 VH 서열이다. 서열 번호 13 내지 22는 AscI 부위(신호 펩티드-엔코딩 서열의 마지막 부분)와 XhoI 부위(닭 VH 와 인간 IgG1 불변 영역 cDNA를 연결) 사이의 각 서열을 포함한다.
실시예 5로부터의 7개의 파상풍 톡소이드-양성 클론을 시퀀싱하고, 이들 중 5개는 신뢰성 높은 서열 데이터를 생성하였다. VH 및 VL의 DNA 서열을 다음의 결과와 함께 정렬하였다:
· 3개의 항체의 VH 영역(도 13에서 위에서부터 1, 2 및 5번)은 1개의 뉴클레오티드 차이를 제외하고 동일하나, 다른 2개는 매우 상이하다.
· 이들 항체의 VL 영역(도 14에서 위에서부터 1, 2 및 3번)은 2개의 뉴클레오티드 염기를 제외하고(이는 PCR에 의해 도입된 돌연변이 때문일 수 있음) 대부분의 서열에 대하여 동일하였으나(프레임워크, CDR1 및 CDR2), 1개의 클론(도 14에서 위에서부터 1번)은 CDR3 서열이 다른 2개의 것과 상이하였으며, 이는 이 영역에서의 유전자 전환에 의한 추가의 분화를 나타낸다. 남아있는 클론의 VL 영역(도 14에서 위에서부터 4 및 5번)은 VH 영역에 대한 경우에서와 같이, 매우 상이하였다.
병행된 ELISA 및 서열 분석으로, 클로닝 이후의 90개의 심플렉스 PCR 밴드가 적어도 3개의 전체적으로 상이한 파상풍-특이적 항체를 제공하여, 본 발명의 방법이 항원-특이적 닭-유래의 항체의 동정에 적합한 것을 확증시켜주는 것으로 나타났다.
실시예
7
결론
종합하여, 실시예 1 내지 6은 본 발명자들이 항체를 분비하는 B 세포에 대해 농축된, 단일 세포로 분류된 B 세포 개체군의 생성을 위한 FACS 기반의 방법을 확립하였고, 발현된 항체 유전자가 본 명세서에 기재된 chSymplex™ PCR 기술에 의해 단일 세포로부터 회수될 수 있음을 증명하였다. 닭 B 림프구의 개체군(CD3-)은 세포 표면에서의 Bu-1 및 IgY의 양을 기준으로 하위개체군으로 나뉠 수 있으며, 이는 IgY 및 TT 특이적 ELIspot 분석 둘 모두에 의해 수득된 결과가 나타내는 바와 같이, 항체를 분비하는 세포의 상당한 농축을 가능하게 한다. ELIspot 결과는 표 1에 나타낸 바와 같은 양성의 심플렉스 PCR 반응의 빈도의 증가와 관련하여 추가로 뒷받침된다. 또한, TT-특이적인 항체가 90개의 심플렉스 PCR 생성물로 구성된 파일럿 규모 항체 레퍼토리로부터 동정된 사실은 항원-특이적 닭 항체의 분리가 본 발명의 방법에 의해 용이하게 달성될 수 있음을 입증한다.
SEQUENCE LISTING
<110> Symphogen A/S
Nielsen, Lars Soegaard
Jensen, Allan
Pyke, Charles
Jensen, Anne Marie Valentin
Koefoed, Klaus
Thorn, Mette
<120> Method for cloning avian-derived antibodies
<130> P123PC00
<150> DK PA 2008 01190
<151> 2008-08-29
<150> US 61/136,390
<151> 2008-09-02
<160> 32
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 1
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
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<211> 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 5
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 6
aagtcgttta tcaggcacac 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 7
ctaggacggt cagggttgtc c 21
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<212> DNA
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<220>
<223> Primer
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ggaggcgctc gagacgatga cttcggtcc 29
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<220>
<223> Primer
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
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<223> Primer
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<212> DNA
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<220>
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ggtttaaacg cggccgctta ttatgaacat tctgtaggg 39
<210> 13
<211> 362
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 13
gccgtgacgt tggacgagtc cgggggcggc ctccagacgc ccggaggagc gctcagcctc 60
gtctgcaagg gctccgggtt caccttcagt gattacagcg tgcagtgggt gcgccaggtg 120
cccggcaagg ggctagagtg ggtcgctggt attagcaaca ctgctattga gacaacatac 180
ggggcggcgg tgcagggccg tgccaccatc tcgagggaca acgggcagag cacagtgagg 240
ctgcagctga acaacctcag ggctgaggac accgccatct acttctgcgc cagaagtggt 300
ggtacttgga gttatgctgc tgataatatc gacgcatggg gccacgggac cgaagtcatc 360
gt 362
<210> 14
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<212> DNA
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tacggggcgg cggtgaaggg ccgtgccacc atctcgaggg acgatgggca gagcacagtg 240
aggctgcagc tgaacaacct cagggctgag gacaccgcca cctactactg cgccaaaact 300
aattgtgctg gtgctggttg tgctgaagat atcgacgcat ggggccacgg gaccgaagtc 360
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<212> DNA
<213> Gallus gallus
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cccggcaagg ggctggagta tgtcgcgggt attagaaaca ctggtagtag gacatggtac 180
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cccggcaagg ggctggaata cgtcgctgct attgagaatg atggtagtga cacatggtac 180
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<212> DNA
<213> Gallus gallus
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<211> 377
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 20
gccgtgacgt tggacgagtc cgggggcggc ctccagacgc ccggaggagg gctcagcctc 60
gtctgcaagg cctccggatt ctctattggc gcttacgaca tgctctgggt gcgacagacg 120
cccggcaagg ggctggaata tgtcgcgggt attagcgaca gtggtaaata cacatactac 180
gcgccggcgg tgcagggccg tgccaccatc tcgagggaca acgggcagag cacagtgagg 240
ctgcagctga acaacctcag ggctgaggac accgccacct acttctgcgc cagaagtcct 300
gctctttatg gttgtcctta tggttgttat aatgtagcta ctatcgacgc atggggccac 360
gggaccgaag tcatcgt 377
<210> 21
<211> 368
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 21
gccgtgacgt tggacgagtc cgggggcggc ctccagacgc ccggaggagc gctcagcctc 60
gtctgcaagg cctccgggtt cgacttcagt ggttacgcca tgggttgggt gcgacaggcg 120
cccggcaagg gcctggaata cgtcggtgtt attaacaata gtggtagtgt catagactat 180
gggtcggcgg tgcagggccg tgccaccatc tcgagggaca acgggcagag cacagtgagg 240
ctgcagctga acaacctcag ggctgaggac accgccacct actactgcgc caaaagtatt 300
acccctcatt gttgttcacg acttgttgga gagatcgaca catggggcca cgggaccgaa 360
gtcatcgt 368
<210> 22
<211> 383
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 22
gccgtgacgt tggacgagtc cgggggcggc ctccagacgc ccggaggagc gctcagcctc 60
gtctgcaagg cctccgggtt caccttcagc acttatggca tgatgtgggt gcgacaggcg 120
cccggcaagg gactggagtg ggtcggaagt attatcaatg atggtagttg gacaggctac 180
gggtcggcgg tgaagggccg tgccaccatc tcgagggaca acgggcagag cacagtgagg 240
ctgcagctga acaacctcag ggctgaggac accggcacct atttctgcgc caaacagtct 300
aatagtggtt gcagtagtag tggtacttgt tatgctggtg ttgattctat cgacgcatgg 360
ggccacggga ccgaagtcat cgt 383
<210> 23
<211> 377
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 23
gccgtgacgt tggacgagtc cgggggcggc ctccagacgc ccggaggagc gctcagcctc 60
gtttgcaagg cctccgggct ctctatcggc agatacgaca tggtctgggt gcggcaggcg 120
cccggcaagg ggctggagtg ggtcgctggt attagcaata gtggtagtag cacaggatat 180
gggccggcgg tgaagggccg tgccaccatc tcgagggaca acgggcagag cacagtgagg 240
ctgcacctga acaacctcag ggctgaggac accggcacct actactgcgc caaagctgct 300
ggtagtggtt ggtgtggtag tggttattgt tatgttggta gcatcgacgc atggggccac 360
gggaccgaag tcatcgt 377
<210> 24
<211> 377
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 24
gccgtgacgt tggacgagtc cgggggcggc ctccagacgc ccggaggagc gctcagcctc 60
gtttgcaagg cctccgggct ctctatcggc agatacgaca tggtctgggt gcgacaggcg 120
cccggcaagg ggctggagtg ggtcgctggt attagcaata gtggtagtag cacaggatat 180
gggccggcgg tgaagggccg tgccaccatc tcgagggaca acgggcagag cacagtgagg 240
ctgcacctga acaacctcag ggctgaggac accggcacct actactgcgc caaagctgct 300
ggtagtggtt ggtgtggtag tggttattgt tatgttggta gcatcgacgc atggggccac 360
gggaccgaag tcatcgt 377
<210> 25
<211> 359
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 25
gtgacgttgg acgagtccgg gggcggcctc cagacgcccg gaagagcgct cagcctcgtc 60
tgcaaggcct ccgggttcac cttcagtgat tatggcatgg gctgggtgcg acaggcgccc 120
ggcaaagggc tggagtgggt cgctggtatt gatgatgatg gtagttggac atcatatggg 180
ccggcggtgc agggccgtgc caccatctcg agggacgacg ggcagagcac agtgaggctg 240
cagctgaaca acctcagggc tgaggacacc ggcacctact actgcgccag aagtcattac 300
agtagtggtt gtgatggtag tgagatcgac tcatggggcc acgggaccga agtcatcgt 359
<210> 26
<211> 368
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 26
gccgtgacgt tggacgagtc cgggggcggc ctccagacgc ccggaggagc gctcagcctc 60
gtctgcaagg gctccgggtt caccttcagc agttacagca tgcagtgggt gcgacaggcg 120
cccggcaacg ggctggaatg ggtcgcaact attagcagca gtggtagtag cacgtggtat 180
gcggcggcgg tgaagggccg tgccaccatc tcgagggaca acgggcagag cacagtgagg 240
ctgcagctga acaacctcag ggctgaggac accggcacct acttctgtac gagaggtggt 300
gattctaata gttgtaatat ttgcattgct agaatcgacg catggggcca cgggaccgaa 360
gtcatcgt 368
<210> 27
<211> 377
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 27
gccgtgacgt tggacgagtc cgggggcggc ctccagacgc ccggaggagc gctcagcctc 60
gtttgcaagg cctccgggct ctctatcggc agatacgaca tggtctgggt gcgacaggcg 120
cccggcaagg ggctggagtg ggtcgctggt attagcaata gtggtagtag cacaggatat 180
gggccggcgg tgaagggccg tgccaccatc tcgagggaca acgggcagag cacagtgagg 240
ctgcacctga acaacctcag ggctgaggac accggcacct actactgcgc caaagctgct 300
ggtagtggtt ggtgtggtag tggttattgt tatgttggta gcatcgacgc atggggccac 360
gggaccgaag tcatcgt 377
<210> 28
<211> 642
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 28
gcgctgactc agccgtcctc ggtgtcagcg aacccgggag aaaccgtcaa gatcacctgc 60
tctggggatg acagctatgg ttatggctgg ttccagcaga agtctcctgg cagtgcccct 120
gtcactgtga tctatcacaa caacaacaga ccctcggaca tcccttcacg attctccggt 180
tccaaatccg gctccacagc cacattaacc atcactgggg tccaagtcga ggacgaggct 240
gtctattact gtgggaccta cgacggcagt cctgattatg ctgctatatt tggggccggg 300
acaaccctga ccgtcctagg tcagcccaag gccaacccca ctgtcactct gttcccgccc 360
tcctctgagg agctccaagc caacaaggcc acactagtgt gtctgatcag tgacttctac 420
ccgggagctg tgacagtggc ctggaaggca gatggcagcc ccgtcaaggc gggagtggag 480
accaccaaac cctccaaaca gagcaacaac aagtacgcgg ccagcagcta cctgagcctg 540
acgcccgagc agtggaagtc ccacagaagc tacagctgcc aggtcacgca tgaagggagc 600
accgtggaga agacagtggc ccctacagaa tgttcataat aa 642
<210> 29
<211> 630
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 29
gcgctgactc agccgtcctc ggtgtcagcg aacccgggag aaaccgtcaa gatcacctgc 60
tcttgggatg acagctatgg ttatggctgg ttccagcaga agtctcctgg cagtgcccct 120
gtcactgtga tctatcacaa caacaacaga ccctcggaca tcccttcacg attctccggt 180
tccaaatccg gctccacagc cacattaacc atcactgggg tccaagtcga ggacgaggct 240
gtctattact gtgggagcta cgacagcact actccttttg gggccgggac aaccctgacc 300
gtcctaggtc agcccaaggc caaccccact gtcactctgt tcccgccctc ctctgaggag 360
ctccaagcca acaaggccac actagtgtgt ctgatcagtg acttctaccc gggagctgtg 420
acagtggcct ggaaggcaga tggcagcccc gtcaaggcgg gagtggagac caccaaaccc 480
tccaaacaga gcaacaacaa gtacgcggcc agcagctacc tgagcctgac gcccgagcag 540
tggaagtccc acagaagcta cagctgccag gtcacgcatg aagggagcac cgtggagaag 600
acagtggccc ctacagaatg ttcataataa 630
<210> 30
<211> 630
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 30
gcgctgactc agccgtcctc ggtgtcagcg aacccgggag aaaccgtcaa gatcacctgc 60
tctggggatg acagctatgg ttatggctgg ttccagcaga agtctcctgg cagtgcccct 120
gtcactgtgg tctatcacaa caacaacaga ccctcggaca tcccttcacg attctccggt 180
tccaaatccg gctccacagc cacattaacc atcactgggg tccaagtcga ggacgaggct 240
gtctattact gtgggagcta cgacagcact actccttttg gggccgggac aaccctgacc 300
gtcctaggtc agcccaaggc caaccccact gtcactctgt tcccgccctc ctctgaggag 360
ctccaagcca acaaggccac actagtgtgt ctgatcagtg acttctaccc gggagctgtg 420
acagtggcct ggaaggcaga tggcagcccc gtcaaggcgg gagtggagac caccaaaccc 480
tccaaacaga gcaacaacaa gtacgcggcc agcagctacc tgagcctgac gcccgagcag 540
tggaagtccc acagaagcta cagctgccag gtcacgcatg aagggagcac cgtggagaag 600
acagtggccc ctacagaatg ttcataataa 630
<210> 31
<211> 648
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 31
gcgctgactc agccgtcctc agtgtcagcg aacccaggag aaaccgtcaa gatcacctgc 60
tccgggggtg gcagctatgc tggaagttac tattatggct ggtaccagca gaaggcacct 120
ggcagtgccc ctgtcactct gatctatctg aacaacaaca gaccctcaaa catcccttcg 180
cgattctccg gttccaaatc cggctccaca gccacattaa ccatcactgg ggtccaagcc 240
gacgacgagg ctgtctattt ctgtgggagc atagacagca gcaacgttgg tatatttggg 300
gccgggacaa ccctgaccgt cctaggtcag cccaaggcca accccactgt cactctgttc 360
ccgccctcct ctgaggagct ccaagccaac aaggccacac tagtgtgtct gatcagtgac 420
ttctacccgg gagctgtgac agtggcctgg aaggcagatg gcagccccgt caaggcggga 480
gtggagacca ccaaaccctc caaacagagc aacaacaagt acgcggccag cagctacctg 540
agcctgacgc ccgagcagtg gaagtcccac agaagctaca gctgccaggt cacgcatgaa 600
gggagcaccg tggagaagac agtggcccct acagaatgtt cataataa 648
<210> 32
<211> 636
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 32
gcgctgactc agccgtcctc ggtgtcagcg aacccaggag aaaccgtcaa gatcacctgc 60
cctgggggca actataatta tggttggttc caacagaagt ctcctggcag tgcccctgtc 120
actgtgatct ataatggcaa taacagaccc tcgaacatcc cttcacgatt ctccggttcc 180
acatccggct ccacaaacac attaaccatc actggggtcc aagccgacga cgaggctgtc 240
tatttctgtg ggagcttcga cagcagcggt actgatgcta tatttggggc cgggacaacc 300
ctgaccgtcc taggtcagcc caaggccaac cccactgtca ctctgttccc gccctcctct 360
gaggagctcc aagccaacaa ggccacacta gtgtgtctga tcagtgactt ctacccggga 420
gctgtgacag tggcctggaa ggcagatggc agccccgtca aggcgggagt ggagaccacc 480
aaaccctcca aacagagcaa caacaagtac gcggccagca gctacctgag cctgacgccc 540
gagcagtgga agtcccacag aagctacagc tgccaggtca cgcatgaagg gagcaccgtg 600
gagaagacag tggcccctac agaatgttca taataa 636
Claims (64)
- a) 조류 기원의 공여체로부터의 림프구-함유 세포 분획을 제공하는 단계;
b) 상기 세포 분획으로부터의 세포를 개별적으로 다수의 용기 내로 분배시켜, 분리된 단일 세포 개체군을 수득하는 단계로서, 적어도 상기 세포의 하위개체군(subpopulation)이 면역글로불린 유전자 및 임의로 임의의 조류 B 세포 마커 항원을 발현하는 단계; 및
c) 멀티플렉스(multiplex) 분자 증폭 절차로, 분리된 단일 세포 또는 동질유전자(isogenic) 세포 개체군으로부터 유래된 주형을 사용하여 대상 뉴클레오티드 서열을 증폭시키고, 상기 증폭된 대상 뉴클레오티드 서열의 연결을 달성함으로써, 상기 분리된 단일 세포 개체군 내에 포함된 가변 영역 엔코딩 서열을 증폭시키고 상기 서열의 연결을 달성하는 단계를 포함하여, 연결된 가변 영역 엔코딩 서열을 포함하는 동족쌍의 라이브러리를 생성하는 방법. - 제1항에 있어서, 상기 세포의 하위개체군이 다음 중 임의의 것을 특징으로 하는, 방법:
· IgY의 발현(IgY+),
· IgY의 발현 및 CD3 음성(IgY+ CD3-),
· IgY의 발현, Bu-1의 미발현 또는 낮은 발현, 및 CD3 음성(IgY+ Bu-1- CD3-),
· Bu-1 및 IgY의 발현(Bu-1+ IgY+),
· Bu-1 및 IgY의 발현, 및 CD3 음성(Bu-1+ IgY+ CD3-),
· Bu-1이 발현되나 어떤 단핵구 마커도 발현되지 않음(Bu-1+, 단핵구-),
· Bu-1의 발현 및 IgM이 없거나 낮은 수준(Bu-1+ IgM-), 또는
· Bu-1 및 BAFF의 발현(Bu-1+ BAFF+). - 제2항에 있어서, 상기 세포의 하위개체군이 IgY+인, 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 세포의 하위개체군이 IgY+ CD3-, 예를 들어, IgY+ CD3- Bu-1-인, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 세포 개체군 내의 개별의 분리된 단일 세포가 증폭 및 연결을 수행하기 전에 동질유전자 세포의 개체군으로 증식되는(expanded), 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 림프구-함유 세포 분획이 비장세포, 전혈, 골수, 단핵구, 또는 백혈구, 바람직하게는 비장세포 또는 골수, 더욱 바람직하게는 비장세포를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 림프구-함유 세포 분획 또는 B 림프구 계통이 혈장 세포, 형질모세포(plasmablast) 또는 기억 B 세포에 대해 농축되는, 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상 뉴클레오티드 서열이 면역글로불린 가변 영역 엔코딩 서열을 포함하며, 상기 연결이 중쇄 가변 영역 엔코딩 서열과 회합된 경쇄 가변 영역 엔코딩 서열의 동족쌍을 생성하는, 방법.
- a) 멀티플렉스 분자 증폭 절차로, 유전적으로 다양한 세포 개체군으로부터 유래된 주형을 사용하여 대상 뉴클레오티드 서열을 증폭시키는 단계로서, 여기서 상기 유전적으로 다양한 세포는 조류 기원의 공여체로부터의 림프구-함유 세포 분획에서 유래되며, 적어도 상기 세포의 하위개체군은 면역글로불린 유전자 및 임의로 임의의 조류 B 세포 마커 항원을 발현하는, 단계; 및
b) 단계 a)에서 증폭된 상기 대상 뉴클레오티드 서열의 연결을 달성하는 단계를 포함하는, 대상이 되는 다수의 비연속(non-contiguous) 뉴클레오티드 서열을 무작위적으로 연결하는 방법. - 제9항에 있어서, 상기 세포의 하위개체군이 다음 중 임의의 것을 특징으로 하는, 방법:
· IgY의 발현(IgY+),
· IgY의 발현 및 CD3 음성(IgY+ CD3-),
· IgY의 발현, Bu-1의 미발현 또는 낮은 발현, 및 CD3 음성(IgY+ Bu-1- CD3-),
· Bu-1 및 IgY의 발현(Bu-1+ IgY+),
· Bu-1 및 IgY의 발현, 및 CD3 음성(Bu-1+ IgY+ CD3-),
· Bu-1이 발현되나 어떤 단핵구 마커도 발현되지 않음(Bu-1+, 단핵구-),
· Bu-1의 발현 및 IgM이 없거나 낮은 수준(Bu-1+ IgM-), 또는
· Bu-1 및 BAFF의 발현(Bu-1+ BAFF+). - 제10항에 있어서, 상기 세포의 하위개체군이 IgY+, 바람직하게는 IgY+ CD3-, 예를 들어, IgY+ CD3- Bu-1-인, 방법.
- 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포의 개체군이 용해되는(lysed), 방법.
- 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상 뉴클레오티드 서열이 가변 영역 엔코딩 서열을 포함하며, 상기 연결이 가변 영역 엔코딩 서열의 쌍의 조합 라이브러리를 생성하는, 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 대상 뉴클레오티드 서열이 면역글로불린 가변 영역 엔코딩 서열을 포함하며, 상기 연결이 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역 엔코딩 서열의 쌍의 조합 라이브러리를 생성하는, 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 멀티플렉스 분자 증폭 이전에, 림프구-함유 세포의 개체군이 검출가능한 수준의 IgY, 및 임의로 검출가능한 수준의 IgY 및 Bu-1을 발현하는 세포를 포함하는 것을 평가하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 멀티플렉스 분자 증폭 이전에, 상기 림프구-함유 세포 분획을 IgY, 및 임의로 IgY 및 Bu-1을 발현하는 림프구 개체군에 대하여 농축하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 멀티플렉스 분자 증폭 이전에, 상기 림프구-함유 개체군으로부터 면역글로불린 유전자, 바람직하게는 IgY 및 임의로 IgY 및 Bu-1을 발현하는 세포를 분리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 농축 또는 분리가 자동화된 분류 절차를 포함하는, 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 자동화된 분류 절차가 MACS 또는 FACS인, 방법.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조류가 닭인, 방법.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조류가 오리, 거위, 비둘기 또는 칠면조인, 방법.
- 제20항에 있어서, 상기 닭이 트랜스제닉(transgenic)이며, 인간 면역글로불린 서열을 발현하는, 방법.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 멀티플렉스 분자 증폭 절차가 멀티플렉스 RT-PCR 증폭인, 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 멀티플렉스 RT-PCR 증폭이 멀티플렉스 PCR 증폭 이전에, 별개의 역전사(RT) 단계를 포함하는 2 단계 과정인, 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 멀티플렉스 RT-PCR 증폭이 역전사(RT) 및 멀티플렉스 PCR 증폭 둘 모두를 수행하는 데 필요한 모든 성분을 처음에 단일의 용기 내로 첨가하는 단계를 포함하는 단일 단계로 수행되는, 방법.
- 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상 뉴클레오티드 서열의 연결이 멀티플렉스 분자 증폭과 동일한 용기 내에서 수행되는, 방법.
- 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상 뉴클레오티드 서열의 연결이 멀티플렉스 중첩-신장 프라이머 믹스를 사용하여, 멀티플렉스 PCR 증폭과 연계하여 달성되는, 방법.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상 뉴클레오티드 서열의 연결이 라이게이션(ligation)에 의해 달성되는, 방법.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 대상이 되는 연결된 핵산 서열을 증폭시키는데 적합한 프라이머 믹스를 사용하여, 추가의 분자 증폭이 수행되는, 방법.
- 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연결된 뉴클레오티드 서열 또는 동족쌍의 라이브러리를 벡터 내로 삽입하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제30항에 있어서, 상기 벡터가 클로닝 벡터, 셔틀 벡터, 디스플레이(display) 벡터 및 발현 벡터로부터 선택되는, 방법.
- 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 연결된 뉴클레오티드 서열 또는 동족쌍의 라이브러리의 개별 구성원이 경쇄 가변 영역 엔코딩 서열과 회합된 면역글로불린 중쇄 가변 영역 엔코딩 서열을 포함하며, 상기 서열이 하나 이상의 면역글로불린 불변 도메인 또는 이의 단편을 엔코딩하는 서열을 함유하는 벡터 내로 인-프레임(in-frame)으로 삽입되는, 방법.
- 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 요망되는 표적 특이성을 갖는 결합 단백질을 엔코딩하는 연결된 가변 영역 서열의 동족쌍의 서브세트(subset)를 선택하여, 가변 영역 엔코딩 서열의 표적-특이적 동족쌍의 라이브러리를 생성함으로써, 서브-라이브러리(sub-library)를 생산하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제32항 및 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 가변 영역 엔코딩 서열의 표적-특이적 동족쌍의 라이브러리 또는 상기 동족쌍을 포유동물 발현 벡터로 전달하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제34항에 있어서, 상기 포유동물 발현 벡터가 인간 면역글로불린류 IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, 카파 경쇄 및 람다 경쇄로부터 선택되는 하나 이상의 불변 영역 도메인을 엔코딩하는, 방법.
- 제30항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
a) 연결된 뉴클레오티드 서열의 세그먼트(segment)를 엔코딩하는 벡터를 숙주 세포 내로 도입하는 단계;
b) 발현에 적합한 조건 하에서 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
c) 상기 숙주 세포로 삽입된 벡터로부터 발현되는 단백질 생성물을 수득하는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 제36항에 있어서, 상기 단백질 생성물이 중쇄 가변 영역과 회합된 경쇄 가변 영역의 동족쌍을 포함하는 항체인, 방법.
- 대부분의 웰(well) 내에,
· 조류 공여체로부터의 림프구-함유 세포 분획에서 유래된 하나의 세포로서, IgY 및/또는 Bu-1 항원을 비롯한 면역글로불린 유전자를 발현하는 세포, 및
· mRNA의 역전사를 수행하고, 중쇄 및 경쇄 가변 엔코딩 영역을 증폭시키는 데 필요한 완충액 및 시약을 포함하는, 멀티웰(multiwell) 플레이트. - a) 조류 기원의 공여체로부터의 림프구-함유 세포 분획을 제공하는 단계;
b) 상기 세포 분획으로부터의 세포를 개별적으로 다수의 용기 내로 분배시켜, 분리된 단일 세포 개체군을 수득하는 단계;
c) 멀티플렉스 분자 증폭 절차로, 분리된 단일 세포 또는 동질유전자 세포 개체군으로부터 유래된 주형을 사용하여 상기 분리된 단일 세포 개체군 내에 포함된 가변 영역 엔코딩 핵산을 증폭시키고; 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 엔코딩하는 상기 증폭된 핵산의 연결을 달성함으로써, 상기 분리된 단일 세포 개체군 내에 포함된 가변 영역 엔코딩 핵산을 증폭시키고, 상기 서열의 연결을 달성하는 단계;
d) 상기 증폭된 가변 영역의 인간 불변 영역으로의 연결을 달성하는 단계; 및
e) 상기 수득된 핵산을 벡터에 삽입하는 단계를 포함하여, 인간 불변 영역 및 비-인간 가변 영역을 갖는 키메라 항체를 엔코딩하는 벡터를 생성하는 방법. - 제39항에 있어서, 상기 공여체가 인간 항체 가변 중쇄 및 경쇄로부터 유래되거나 이와 상당한 유사성을 갖는 면역글로불린을 생성할 수 있는 인간 면역글로불린 서열을 지니는 트랜스제닉 닭인, 방법.
- 제30항 또는 제40항에 있어서, 상기 멀티플렉스 분자 증폭 절차가 멀티플렉스 RT-PCR 증폭인, 방법.
- 제41항에 있어서, 상기 멀티플렉스 RT-PCR 증폭이 멀티플렉스 PCR 증폭 이전에, 별개의 역전사(RT) 단계를 포함하는 2 단계 과정인, 방법.
- 제41항에 있어서, 상기 멀티플렉스 RT-PCR 증폭이 역전사(RT) 및 멀티플렉스 PCR 증폭 둘 모두를 수행하는 데 필요한 모든 성분을 처음에 단일의 용기 내로 첨가하는 단계를 포함하는 단일 단계로 수행되는, 방법.
- 제39항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상 뉴클레오티드 서열의 연결이 멀티플렉스 분자 증폭과 동일한 용기 내에서 수행되는, 방법.
- 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상 뉴클레오티드 서열의 연결이 멀티플렉스 중첩-신장 프라이머 믹스를 사용하여, 멀티플렉스 PCR 증폭과 연계하여 달성되는, 방법.
- 제39항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상 뉴클레오티드 서열의 연결이 라이게이션에 의해 달성되는, 방법.
- 제39항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 대상이 되는 연결된 핵산 서열을 증폭시키는데 적합한 프라이머 믹스를 사용하여, 추가의 분자 증폭이 수행되는, 방법.
- 제41항에 있어서, 상기 PCR 생성물이 발현 벡터로 삽입되는, 방법.
- 제48항에 있어서, 이중 프로모터 카세트가 발현 작제물에 삽입되며, 상기 이중 프로모터 카세트가 중쇄 및 경쇄의 동시 발현을 유도할 수 있고, 바람직하게는 상기 이중 프로모터 카세트가 양방향성인, 방법.
- 제49항에 있어서, 상기 이중 프로모터 카세트가 이중 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 방법.
- 제48항에 있어서, 상기 발현 벡터가 인간 불변 경쇄 엔코딩 서열 또는 이의 단편 및/또는 인간 불변 중쇄 엔코딩 서열 또는 이의 단편을 포함하는 골격을 포함하는, 방법.
- 제39항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 가변 경쇄로의 연결을 제공할 수 있는 중첩부(overlap)를 갖는, 인간 불변 경쇄 또는 이의 단편을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 닭 VH 쇄, 링커, 닭 VL 쇄 및 인간 불변 경쇄를 순서대로 포함하는 작제물을 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트와 함께 PCR 혼합물에 첨가하는 추가의 증폭 단계를 포함하는, 방법.
- 제39항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 가변 중쇄로의 연결을 제공할 수 있는 중첩부를 갖는, 인간 불변 중쇄 또는 이의 단편을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 인간 불변 중쇄, 닭 VH 쇄, 링커 및 닭 VL 쇄를 순서대로 포함하는 작제물을 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트와 함께 PCR 혼합물에 첨가하는 추가의 증폭 단계를 포함하는, 방법.
- 키메라 항체를 엔코딩하는 벡터의 라이브러리로서,
상기 각각의 키메라 항체가 닭 면역글로불린 가변 영역 엔코딩 서열 및 인간 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진, 라이브러리. - 제54항에 있어서, 상기 벡터가 제1항 내지 제37항 또는 제39항 내지 제53항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득되는, 라이브러리.
- 제54항에 있어서, 상기 닭 면역글로불린 가변 영역 엔코딩 서열이 인간 항체 가변 중쇄 및 경쇄로부터 유래되거나 이와 상당한 유사성을 갖는 면역글로불린을 생성할 수 있는 인간 면역글로불린 서열을 지니는 트랜스제닉 닭으로부터 유래되는, 라이브러리.
- 제54항에 있어서, 상기 경쇄 불변 영역이 카파 또는 람다 불변 영역인, 라이브러리.
- 제54항에 있어서, 상기 벡터가 발현 벡터인, 라이브러리.
- 제54항에 있어서, 상기 가변 영역이 가변 중쇄 및 경쇄의 동족쌍인, 라이브러리.
- 제54항에 있어서, 상기 인간 면역글로불린 불변 영역이 인간 면역글로불린류 IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 및 IgM으로부터 선택되는, 라이브러리.
- 제60항에 있어서, 상기 불변 영역이 IgG1 및 IgG2로부터 선택되는, 라이브러리.
- 제54항 내지 제61항 중 어느 한 항에 따른 라이브러리로부터 선택되는, 특정 표적에 대해 유도된 요망되는 결합 특이성을 나타내는 항체를 코딩하는, 서브-라이브러리.
- a) 조류 기원의 공여체로부터의 림프구-함유 세포 분획을 제공하는 단계;
b) 상기 세포 분획으로부터의 세포를 개별적으로 다수의 용기 내로 분배시켜, 분리된 단일 세포 개체군을 수득하는 단계로서, 적어도 상기 세포의 하위개체군이 면역글로불린 유전자, 예를 들어 IgY 및 임의로 1개 이상의 조류 B 세포 마커 항원을 발현하는, 단계; 및
c) 멀티플렉스 분자 증폭 절차로, 분리된 단일 세포 또는 동질유전자 세포 개체군으로부터 유래된 주형을 사용하여 대상 뉴클레오티드 서열을 증폭시켜, 상기 분리된 단일 세포 개체군 내에 포함된 가변 영역 엔코딩 서열을 증폭시키는 단계를 포함하여, 조류 유래 면역글로불린 가변 영역 엔코딩 서열의 라이브러리를 생성하는 방법. - 제63항에 있어서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 엔코딩 서열의 연결을 달성하여, 동족쌍의 라이브러리를 수득하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
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