CN116987195B - 小鼠抗鸭IgY单克隆抗体、细胞株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了小鼠抗鸭IgY单克隆抗体、细胞株及其应用。本发明通过免疫小鼠进行融合筛选后，获得两株特异性、稳定性好的单克隆抗体，并建立了基于双抗体夹心法的酶联免疫吸附检测技术，可以检测鸭IgY含量。该方法借助了酶显色放大体系，其特异性好，灵敏度较高，可以检测鸭IgY含量较低的样本。

Description

小鼠抗鸭IgY单克隆抗体、细胞株及其应用

技术领域

本发明属于禽类免疫学技术领域，具体地说，涉及小鼠抗鸭IgY单克隆抗体、细胞株及其应用。

背景技术

我国是养鸭大国，鸭养殖业是我国家禽业的重要支柱产业。鸭肉在我国肉类消费产品中排名第三， 鸭肉营养丰富而且价格相对较低，其含有的脂肪酸主要是不饱和脂肪酸和低碳饱和脂肪酸，容易被人体消化吸收，可以降低机体胆固醇含量，减少患心脏病的概率，此外还含有丰富的B族维生素、维生素E和烟酸。IgG是机体免疫细胞识别抗原后合成并分泌的，在血液及蛋黄中含量很高。免疫球蛋白含量的高低与许多疾病有密切的联系，也能间接反映出机体免疫力的强弱。对鸭群体检测血液中IgG的含量可以用来评价群体的健康状况。由于鸭肉价格便宜，经常有厂家以鸭肉冒充猪肉、羊肉、牛肉等其他肉类，免疫球蛋白（IgG/IgY)在血液和组织中有很高的含量且具有较强的物种特异性，通过检测样品中IgG/IgY的种类，可以进行畜禽肉类掺假的鉴别。

目前鉴别畜禽肉类掺假的方法有感官鉴定技术，主要通过视觉、触觉、味觉、嗅觉进行判定，这种方法主观性强结果容易出现偏差；PCR法，该技术测定分析所需时间较长，容易出现假阳性，对操作人员技术要求也较高；基于免疫学的双向琼脂扩散法便于操作，但灵敏度和特异性较差。基于抗体标记技术开发的相关试剂盒，非常灵敏，但建立时的技术要求较高，通常需要用高纯度抗原分子建立单克隆抗体。亟需开发灵敏度高、特异性强的抗体检测样品中的鸭IgY。

发明内容

本发明的目的是提供一种小鼠抗鸭IgY单克隆抗体及应用。

本发明通过免疫小鼠进行融合筛选后，获得两株特异性、稳定性好的单克隆抗体，并建立了基于双抗体夹心法的酶联免疫吸附检测技术，可以检测鸭IgY含量。该方法借助了酶显色放大体系，其特异性好，灵敏度较高，可以检测鸭IgY含量较低的样本。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种小鼠抗鸭IgY单克隆抗体，所述抗体的重链3个CDR区分别为：GYEISTYW、IYPGDGST和TREGHYGVLFYYFDY，轻链3个CDR区分别为：QDVTTA、SAS和QQHNYTPWT。

进一步地，所述抗体的轻链可变区为：所述抗体的轻链可变区为：SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；或SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的多肽；

所述抗体的重链可变区为：SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；或SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的多肽。

进一步地，本发明的小鼠抗鸭IgY单克隆抗体由保藏编号为CGMCC No. 45645的小鼠抗鸭IgY单抗杂交瘤细胞株13E9分泌产生。

本发明还提供小鼠抗鸭IgY单抗杂交瘤细胞株13E9，分类命名为小鼠抗鸭IgY单抗杂交瘤细胞株，细胞株13E9现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC No. 45645，保藏日期2023年8月2日。

第二方面，本发明提供所述抗体在鸭IgY检测中的应用。

第三方面，本发明提供由所述抗体制备的鸭IgY检测试剂或试剂盒。

第四方面，本发明提供一种鸭IgY酶联免疫检测试剂盒，包括：所述抗体，标记的小鼠抗鸭IgY单抗；任选包括底物显色液，终止液等。

其中，所述小鼠抗鸭IgY单抗的轻链、重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3、4所示，其由保藏编号为CGMCC No. 45644的小鼠抗鸭IgY单抗杂交瘤细胞株1F11分泌产生。

小鼠抗鸭IgY单抗杂交瘤细胞株1F11，分类命名为小鼠抗鸭IgY单抗杂交瘤细胞株，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC No. 45644，保藏日期2023年8月2日。

进一步地，所述抗体固定于固相载体上，所述固相载体可选自酶标板、微球、硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜或尼龙膜等，优选酶标板。

进一步地，所述标记可以是酶标记、生物素标记或荧光素标记等，优选酶标记。

所述酶可选自如下任一种：辣根过氧化酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶等，优选辣根过氧化酶。

常用底物包括：邻苯二胺(O-phenylenediamine，OPD)、四甲基联苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)和ABTS[2,2'-azino-di-(3-ethylbenziazobine sulfonate-6)]等，优选TMB。

进一步地，所述试剂盒还包括清洗缓冲液，如1×PBST，成分为Na₂HPO₄8 mM、NaCl0.136M、KH₂PO₄2 mM、KCL 2.6 mM、Tween-20 0.05%(V/V)。

进一步地，用于包被酶标板的抗体浓度为0.2~2mg/mL。

进一步地，辣根过氧化酶标记的小鼠抗鸭IgY单抗浓度为0.5~20mg/mL。

进一步地，所述终止液为1.5-2.5M（优选2 M）的硫酸溶液。

第五方面，本发明提供所述试剂盒在鸭IgY酶联免疫检测（包括定性和定量检测）中的应用。

第六方面，本发明提供一种组合物，包括所述抗体（杂交瘤细胞株1F11产生）和所述小鼠抗鸭IgY单抗（杂交瘤细胞株13E9产生）。

第七方面，本发明提供由所述组合物制备的鸭IgY酶联免疫检测试剂盒、荧光免疫检测试剂盒或化学发光免疫检测试剂盒。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明提供的小鼠抗鸭IgY单克隆抗体特异性好，稳定性高，灵敏度高。交叉实验结果表明，该抗体不识别鸡、鹅的类似免疫球蛋白和哺乳动物IgG。对建立的鸭IgY酶联免疫检测试剂盒进行37℃加速稳定性实验，10天内试剂盒没有显著变化。试剂盒的鸭IgY检测范围为1-64ng/mL。

本发明利用两种特异性极强的单克隆抗体建立的ELISA法在各种肉质产品及血清血液类样品的鸭IgY鉴别检测中灵敏度高，特异性强。

附图说明

图1为本发明较佳实施例1中制备得到采用Protein G亲和层析纯化抗体的电泳检测结果图。

图2为本发明较佳实施例2中双抗夹心ELISA方法的建立的标准曲线。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1 抗鸭IgY单克隆抗体的制备

1、动物免疫

选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，使用纯化的鸭IgY与等体积弗氏佐剂乳化后进行免疫，免疫周期为两周，免疫3次后取血测效价，融合前三天再次加强免疫。

2、细胞融合

采用断颈处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。 将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇（PEG）。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。具体操作如下：

2.1 骨髓瘤（SP2/0）细胞活化

解冻并复苏商品化SP2/0细胞，随后重悬于营养液(RPMI-1640，添加20%小牛血清)中，置于37℃、5%CO₂条件下培养箱培养;3-5d后进行传代；收集细胞并悬浮于1640基础液中，计数后取0.5×10⁶~1×10⁶个注射于BALB/c小鼠背部皮下，持续培养9~10d。待背部肿瘤体积增大至直径约0.8cm，将小鼠拉颈处死，75%酒精浸泡5 min后无菌操作取瘤。剪下肿瘤块置于灭菌的匀浆器中，添加1640基础液充分研磨后补加10 mL 1640液，静置2 min，吸取上层的细胞悬液置于另一离心管中，再补加10mL1640液，重复研磨两次；将上述取得的细胞悬液于1000 r/min离心10 min去上清，随后重悬于30 mL基础1640液中。于另一离心管中加入15mL淋巴细胞分离液，将上述细胞悬液小心置于分离液之上；随后1200 r/min离心15min，吸管吸取位于界面致密的白色细胞层，使用1640液清洗细胞2遍后重悬于10mL 1640液中，计数后备用。

2.2 免疫脾细胞的制备

取加强免疫的BALB/c鼠一只，眼眶放血处死(收集血清，即为阳性血清)，于75%酒精中浸泡5-10 min消毒，随后将其固定于解剖板上进行解剖，取出脾脏并剪破，置于灭菌的匀浆器中；研磨及细胞悬液制取方法同SP2/0所述，计数后备用。

2.3 饲养细胞的制备

取一只未免疫的BALB/c鼠，眼眶放血，收集血清为阴性血清。向小鼠腹腔内注入2~3 mL 1640基础液，吹打后吸出置于另一离心管中备用，该液中含有腹腔巨噬细胞。同上操作制备脾细胞悬液，并放入腹腔巨噬细胞管中。1000 r/min离心10 min去上清，细胞用HAT培养基悬浮后，置于37℃，5%CO₂培养箱中待用。

2.4 融合

将1×10⁷-2×10⁷个SP2/0与10⁸个免疫细胞于50mL离心管中混匀，1000 r/min离心8 min。弃净上清后将装有细胞混合物的离心管置于37℃水浴中，随后加入预温至37℃的50% PEG 0.8 mL (sigma)，搅拌后静置30s。静置后加入37℃预温的1640基础液10ml。混匀后1000 r/min离心5 min，弃上清于37℃放置5-8min。随后与饲养细胞悬浮液混合，分种于96孔培养板中，250ml/孔，于37℃，5%CO₂培养箱中培养。融合后第4天换HT培养基继续培养。待融合细胞集落长至培养孔1/4，培养基略变黄时，进行抗体检测。

3、杂交瘤阳性克隆的筛选和细胞的克隆化

选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。具体操作如下：

3.1 采用间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞

具体步骤如下：

（1）包被已知抗原：用包被缓冲液将纯化的包被用抗原稀释至1-10mg/ml；向微孔中每孔加100ml，轻轻摇匀，4℃冰箱过夜或37℃ 1h；甩掉孔内液体（尽量拍干空里面的液体）；洗涤3次，每次2～3分钟。

（2）封闭酶标孔中没被抗原包被的位置:向微孔中每孔加200ml封闭液（5%的脱脂奶粉或0.1%的BSA），轻轻摇匀，37℃ 1h；甩掉孔内液体;逐孔加满洗涤缓冲液，静置2～3min，甩掉孔内液体，拍干，用此法先用洗涤缓冲液洗3次。加样:将待测的杂交瘤每孔取50ml上清液按顺序加入酶标孔中，轻轻摇匀。37℃ 1h，洗涤，拍干。

（3）加酶标抗抗体:先用稀释液将酶标第二抗体按说明稀释到适当的工作浓度，每孔加入100ml，轻轻摇匀，置37℃ 1h;然后洗涤，拍干。加显色液：每孔加新鲜配置的显色液100ml，轻轻摇匀，37℃，10min。终止反应：每孔加终止液50ml。

判定结果：酶标仪OD₄₅₀下进行读数，大于阴性孔3倍可判定为阳性。免疫前的小鼠血清做200倍稀释，作为阴性对照孔。

（4）杂交瘤细胞的克隆化(有限稀释法)

克隆前制备小鼠饲养细胞层；将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹下，用血细胞计数板计数活细胞数；将细胞用完全培养基稀释到1个细胞/毫升；将细胞悬液分别加入已制备好的饲养细胞的96孔培养板，100ml/孔，使相应的每孔含1个细胞。培养到第4天补液一滴，第5-6天仔细观察各孔内细胞的生长情况，并记录。

特异性抗体的检测:在克隆后第7~9天，细胞克隆长满1/3-1/2个视野时，即可检测；最终定株12株细胞；阳性孔的细胞可移至24孔培养板，待24孔板中的细胞生长良好时，可腹腔接种小鼠采制腹水。

4、单克隆抗体的大量制备

建株后的杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔，7天左右收集腹水，采用Protein G亲和层析纯化抗体（图1）。图1中1~12泳道对应的克隆号如下：

5、单克隆抗体效价及亲和力测定

用包被缓冲液将鸭IgY稀释至2mg/ml；向微孔中每孔加100ml，4℃冰箱过夜进行包被；甩掉孔内液体向微孔中每孔加200ml封闭液（5%的脱脂奶粉或0.1%的BSA），轻轻摇匀，37℃ 1h；甩掉孔内液体；逐孔加满洗涤缓冲液PBST，静置2～3min，甩掉孔内液体，拍干，用此法先用洗涤缓冲液PBST洗3次。加样:将待测的单克隆抗体稀释至2mg/ml，从200倍开始稀释，每孔取100ml加入酶标孔中，轻轻摇匀.室温2h，洗涤，拍干。用稀释液将HRP标记羊抗小鼠IgG(Solarbio SE131)1:10000稀释，每孔加入100ml，轻轻摇匀，置室温45min；然后洗涤，拍干。加TMB显色液100ml，轻轻摇匀，室温，10min。每孔加终止液50ml。用酶标仪450nm波长下测量OD值。所测抗体效价（OD₄₅₀约等于1）水平在1:20000-100000范围内。实验结果见表1：

表1

用包被缓冲液将鸭IgY稀释至2mg/ml；向微孔中每孔加100ml，4℃冰箱过夜进行包被；甩掉孔内液体向微孔中每孔加200ml封闭液（5%的脱脂奶粉或者0.1%的BSA），轻轻摇匀，37℃ 1h；甩掉孔内液体;逐孔加满洗涤缓冲液PBST，静置2～3min，甩掉孔内液体，拍干，用此法先用洗涤缓冲液PBST洗3次。加样:将待测的单克隆抗体稀释至2mg/ml，每孔取100ml加入酶标孔中，37°孵育1h。PBST洗板后使用不同浓度的硫氰酸钠洗脱，依次加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、0mol/L的溶液60ml/孔，室温静置15min，洗涤缓冲液PBST洗板3次。用稀释液将HRP标记羊抗小鼠IgG(Solarbio SE131)1：10000稀释，每孔加入100ml，轻轻摇匀，置室温45min;然后洗涤，拍干。加TMB显色液100ml，轻轻摇匀，室温，10min。每孔加终止液50ml。用酶标仪450nm波长下测量OD值。结果判定：经洗脱后OD₄₅₀下降至未经洗脱的50%所对应的硫氰酸钠浓度即为该抗体的相对亲和力常数，用mol/l表示。所测抗体亲和力除4号外都能达到3mol/l（表2）。

表2

6、单克隆抗体1F11与13E9可变区序列测定

收集杂交瘤细胞数量大于10⁶个：采用索莱宝科技有限公司总RNA提取试剂盒，并按照说明书操作分别提取两株细胞的总RNA；按照索莱宝反转录试剂盒合成cDNA第一条链；送至擎科生物进行后续构建及测序。得到基因测序结果:1F11细胞株分泌的单克隆抗体的轻链可变区序列长321p，编码107个氨基酸，DNA序列如SEQ ID NO:1所示，蛋白序列如SEQID NO:3所示；重链可变区序列长354bp，编码118个氨基酸，DNA序列如SEQ ID NO:2所示，蛋白序列如SEQ ID NO:4所示。13E9细胞株分泌的单克隆抗体的轻链可变区序列长321bp，编码107个氨基酸，DNA序列如SEQ ID NO:5所示，蛋白序列如SEQ ID NO:7所示；重链可变区序列长366bp，编码122个氨基酸，DNA序列如SEQ ID NO:6所示，蛋白序列如SEQ ID NO:8所示。

实施例2 双抗夹心ELISA检测方法的建立

1、单克隆抗体的HRP标记

取10mg HRP溶于2ml水中，配制新鲜的NaIO₄溶液，加0.4ml于HRP溶液中，混匀，室温避光20min.将HRP溶液加入到透析袋中，浸入NaAc缓冲液中过夜透析；将抗体浸入CB缓冲液中过夜透析。取出过夜透析的抗体，HRP溶液加0.1ml，0.2M pH9.5的碳酸盐缓冲液，然后在HRP溶液中加入已经取出的抗体，室温避光轻轻搅拌2小时，称取0.04g NaBH₄溶于10ml水中，取0.2ml加入反应液中，混匀，4℃放置2小时；取出放于透析袋中，于0.01M PBS中透析，两小时后换一次液，4℃过夜透析。

2、单克隆抗体酶标板的制备

使用96孔平底聚苯乙烯酶标板作为固相载体将Protein G亲和层析纯化的单克隆抗体用抗体包被液稀释至2mg/mL将稀释后的抗体加到酶标板的微孔中，100mL/孔，用封板膜封板后置于4℃包被过夜将包被好的酶标板取出，弃去孔中液体，用ELISA洗涤液洗板3次后，加入含有2%BSA的封闭液，250mL/孔，用封板膜封板后置于室温封闭2h弃去板孔中的液体，置于干房中烘干16~18h。

放入含有干燥剂的铝箔袋中，真空密封，4℃保存。

3、双抗夹心ELISA抗体对的初步筛选

实验前30 min，取出单克隆抗体包被好的酶标板，恢复至室温，洗板3次并甩干。加入100mL不同稀释浓度的鸭IgY标准品，稀释浓度为500ng/ml、50ng/ml并设空白对照。封板后于室温孵育2h，洗板4次并甩干。加入100mL酶标记抗体工作液至反应孔中，封板后于室温孵箱孵育30 min，洗板4次并甩干。加入100mL显色底物TMB至反应孔中，封板后于室温避光显色15 min，加入50mL终止液2M硫酸溶液，即刻用酶标仪450nm波长下测量OD值（5分钟内）。根据结果选取3个抗体对进行下一步测试（包被检测组合为：1和11；9和4；11和2）。

如表3所示：

表3

实验前30 min，取出1、9、11号单克隆抗体包被好的酶标板，恢复至室温，洗板3次并甩干。加入100mL不同稀释浓度的鸭IgY标准品或血清，标准品稀释浓度为100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625ng/ml、并设空白对照，血清选择3种禽类血清各4份。封板后于室温孵育2h，洗板4次并甩干。加入100mL相应的 酶标记抗体工作液至反应孔中，封板后于室温孵箱孵育30 min，洗板4次并甩干。加入100mL显色底物TMB至反应孔中，封板后于室温避光显色15 min，加入50mL终止液2M硫酸溶液，即刻用酶标仪450nm波长下测量OD值。根据检测结果选取包被检测组合为：1和11的抗体对（表4）。

表4

4、双抗夹心ELISA方法的建立

实验前30 min，取出单克隆抗体1F11包被好的酶标板，恢复至室温，洗板3次并甩干。加入100ml不同稀释浓度的鸭IgY标准品，稀释浓度为64ng/ml、32ng/ml、16ng/ml、8ng/ml、4ng/ml、2ng/ml、1ng/ml并设空白对照。封板后于室温孵箱孵育2h，洗板4次并甩干。加入100ml酶标记抗体HRP-13E9工作液至反应孔中，封板后于室温孵箱孵育30 min，洗板4次并甩干。加入100ml显色底物TMB至反应孔中，封板后于室温避光显色15 min，加入50ml终止液2M硫酸溶液，即刻用酶标仪450nm波长下测量OD值（5分钟内）。以不同浓度的标准品为横坐标，以相对应的OD值为纵坐标绘制标准曲线，建立回归方程。结果表明，其检测范围为1-64ng/ml，R²为0.99993（图2）。

5、双抗夹心ELISA特异性检测

实验前30 min，取出单克隆抗体1F11包被好的酶标板，恢复至室温，洗板3次并甩干。加入100ml不同稀释倍数的鸭IgY标准品或高浓度的鸭IgY结构类似蛋白，包括鹅IgY、鸡IgY、兔IgG、牛IgG、山羊IgG、猪IgG，人IgG、小鼠IgG，所有样品做高浓度稀释(200ng/ml)。封板后于室温孵箱孵育2h，洗板4次并甩干。加入100ml酶标记抗体HRP-13E9工作液至反应孔中，封板后于室温孵箱孵育30 min，洗板4次并甩干。加入100ml显色底物TMB至反应孔中，封板后于室温避光显色15 min，加入50ml终止液2M硫酸溶液，即刻用酶标仪450nm波长下测量OD值（5分钟内）。结果显示，该抗体对不与其他类似蛋白反应（表5）。

表5

6、双抗夹心ELISA稳定性检测

将单克隆抗体1F11包被好的酶标板、HRP标记的单克隆抗体13E9、及标准品鸭IgY放于37℃进行加速稳定性实验，放置10天。随后取出检测，检测方法为，取出酶标板洗板3次并甩干。加入100ml不同稀释浓度的标准品，浓度为64ng/ml、32ng/ml、16ng/ml、8ng/ml、4ng/ml、2ng/ml、1ng/ml并设空白对照。封板后于室温孵箱孵育2h，洗板4次并甩干。加入100ml酶标记抗体HRP-13E9工作液至反应孔中，封板后于室温孵箱孵育30 min，洗板4次并甩干。加入100ml显色底物TMB至反应孔中，封板后于室温避光显色15 min，加入50ml终止液2M硫酸溶液，即刻用酶标仪450nm波长下测量OD值（5分钟内）。以不同浓度的标准品为横坐标，以相对应的OD值为纵坐标绘制标准曲线，建立回归方程。结果表明，试剂盒稳定性良好（表6）。

表6

实施例3 鸭、鸡、鹅血清中IgY含量测定

实验前30 min，取出单克隆抗体1F11包被好的酶标板，恢复至室温，洗板3次并甩干。选择鸡、鸭、鹅血清各4份，做不同稀释倍数的血清样本及标准品，每孔加入100ml。封板后于室温孵箱孵育2h，洗板4次并甩干。加HRP-13F9工作液至反应孔中，封板后于室温孵箱孵育30 min，洗板4次并甩干。加入100ml显色底物TMB至反应孔中，封板后于室温避光显色15 min，加入50ml终止液2M硫酸溶液，即刻用酶标仪450nm波长下测量OD值（5分钟内）。检测结果表明该方法能准确测定鸭血清IgY的含量，几乎不与鸡和鹅的血清有反应（表4）。

实施例4 不同肉产品中鸭IgY含量的测定

1、样本制备

分别称取100mg样品（生猪肉、生牛肉、生羊肉、生鸭肉，及相应熟肉）组织放入预冷的EP管中，加入1ml组织裂解液，组织裂解液为索莱宝“高效RIPA组织/细胞裂解液”，货号为R0010，蛋白酶抑制剂货号为P6730，蛋白磷酸酶抑制剂货号为P1260。根据使用量，取每1ml裂解液加入10ml蛋白酶抑制剂、10ml PMSF，使其最终浓度均为1mM。将装有组织的EP管放在冰上，用剪刀把组织剪碎。样本裂解在冰上或低温操作，裂解时间20-30分钟。然后把剪碎的组织用组织破碎仪破碎2分钟。将裂解后的样品组织4℃ 12000rpm离心10分钟，取上清，使用BCA法对蛋白浓度定量，将各样品蛋白浓度调至一致（3mg/ml），即可进行后续ELISA检测。

2、鸭IgY含量测定

实验前30 min，取出单克隆抗体1F11包被好的酶标板，恢复至室温，洗板3次并甩干。将不同稀释倍数的血清样本及标准品，每孔加入100ml。封板后于室温孵箱孵育2h，洗板4次并甩干。加HRP-13F9工作液至反应孔中，封板后于室温孵箱孵育30 min，洗板4次并甩干。加入100ml显色底物TMB至反应孔中，封板后于室温避光显色15 min，加入50ml终止液2M硫酸溶液，即刻用酶标仪450nm波长下测量OD值（5分钟内）。从表7可以看出，试剂盒可以特异性识别高度稀释的（10000倍稀释）鸭组织中的IgY，即使在煮熟的情况下也能有效识别鸭IgY(100倍稀释)，而与其他物种的蛋白没有反应。

表7

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.小鼠抗鸭IgY单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的重链3个CDR区分别为：GYEISTYW、IYPGDGST和TREGHYGVLFYYFDY，轻链3个CDR区分别为：QDVTTA、SAS和QQHNYTPWT。

2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的轻链可变区为SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；所述抗体的重链可变区为SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

3.小鼠抗鸭IgY单抗杂交瘤细胞株13E9，其保藏编号为CGMCC No. 45645。

4.由权利要求3所述小鼠抗鸭IgY单抗杂交瘤细胞株13E9分泌产生的抗体。

5.由权利要求1、2或4所述抗体制备的鸭IgY检测试剂或试剂盒。

6.鸭IgY酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，包括：权利要求1、2或4所述抗体，标记的小鼠抗鸭IgY单抗，底物显色液，封闭液和终止液；

其中，所述小鼠抗鸭IgY单抗的轻链、重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3、4所示。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，权利要求1、2或4所述抗体固定于固相载体上，所述固相载体选自酶标板、微球、硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜或尼龙膜；

所述标记为酶标记、生物素标记或荧光素标记；

所述酶标记的酶选自如下任一种：辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶。

8.权利要求6或7所述试剂盒在鸭IgY酶联免疫检测中的应用；

所述应用包括定性和定量检测，所述应用为非疾病诊断和治疗目的。

9.一种组合物，其特征在于，包括权利要求1、2或4所述抗体和小鼠抗鸭IgY单抗；

其中，所述小鼠抗鸭IgY单抗的轻链、重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3、4所示。

10.由权利要求9所述组合物制备的鸭IgY酶联免疫检测试剂盒、荧光免疫检测试剂盒或化学发光免疫检测试剂盒。