CN106432488A - 一种小麦醇溶蛋白TaWG05多克隆抗体的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种小麦醇溶蛋白TaWG05多克隆抗体的制备方法。该方法包括提取小麦品种郑麦004的基因组DNA、设计引物、PCR扩增、构建重组质粒pET‑32a‑TaWG05、原核表达、免疫接种、制备多克隆抗体等步骤。利用所制备多克隆抗体，可建立可靠、定量的过敏原检测方法，从而为确保食品标签的一致性和消费者的安全性提供保障。进一步地，利用该多克隆抗体，对小麦醇溶蛋白TaWG05在其它小麦品种中的分布表达情况进行了检测鉴定，从而为小麦品质的改良奠定了理论基础。

Description

一种小麦醇溶蛋白TaWG05多克隆抗体的制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种小麦醇溶蛋白TaWG05多克隆抗体的制备方法。
背景技术
小麦是我国重要的粮食作物之一，以小麦粉为主的原料可以制成许多食品，如面包、油条、煎饼、水饺、面条等等，它在人们的食物结构和食品消费方面占有重要的地位。小麦中的醇溶蛋白对胃具有保养功能，能够在表面形成保护膜，有效防止被氧化，能够提高胃粘膜蛋白纯度，可一定程度防止胃酸侵蚀，而且醇溶蛋白具有消炎作用，是胃粘膜的抵抗能力增加。
然而，小麦应用中存在一个严重的问题，即小麦过敏。小麦过敏是指特定的人群对面粉的一些蛋白质产生的不良反应。由于小麦及面粉作为原料和添加物，被广泛的应用到许多食品中，使得所有的食物过敏中，几乎30%左右与小麦过敏相关（甄宇江，食物致敏原与食品安全[M]，北京：中国标准出版社，2011）。因此，小麦被联合国粮食及农业组织认定为八大类食物过敏原之一，小麦过敏是一个不可忽视的食品安全问题。小麦过敏原涉及的范围很广，如ω5-醇溶蛋白是引发小麦依赖运动激发性过敏症和荨麻疹的主要过敏原（MoritaE et al. Food-dependent exercise-induced anaphylaxis: a report of two casesand determination of wheat-gamma-gliadin as the presumptive allergen[J]，Br JDermatol，2000，143(5):1059-1063)，γ-醇溶蛋白被推测是乳糜泻和小麦依赖运动的主要过敏原（小麦蛋白过敏原的研究进展，食品安全质量检测学报，2015，(7)：2783-2788），清蛋白和球蛋白是法国儿童小麦过敏性皮炎的主要致敏源(Battais F et al，Food allergyto wheat: differences in immunobulin E-binding proteins as a function of ageor symptoms[J]，J Nutr Sci Vitamin，2004，50(5): 367-370)。近年来，小麦过敏已经威胁到特定的过敏人群的健康，主要引发的疾病有乳糜泻、过敏性皮炎、荨麻疹、职业哮喘、依赖运动激发过敏症等等。
小麦醇溶蛋白是乳糜泻和依赖运动激发过敏症的主要致病抗原，它主要以多肽单链的形式存在，富含谷氨酰胺和脯氨酸，有α/β、γ、ω三种类型，它对粘膜损害大。其小麦过敏原的表位目前已经被证实含有QQIPQQQ，QQFPQQQ，PQQSFPQQ，QQPPQQ等模体（Q：谷氨酰胺，I：异量氨酸，P：脯氨酸，F：苯丙氨酸，S：丝氨酸）（小麦过敏研究进展，食品科学，2007，28(8)：559-562），随着食品贸易国际化，食品过敏问题具有更大的潜在危险性。因此，建立可靠、定量的过敏原检测方法对确保食品标签的一致性和消费者的安全性十分必要。目前，小麦致敏原的主要检测技术有酶联免疫吸附法（ELISA）、免疫印迹法、免疫层析法等（食物中过敏原检测技术研究进展，食品科学，2010，31(21)：417-421）。
发明内容
本发明目的在于通过体外原核表达小麦醇溶蛋白TaWG05，并通过生物免疫方法制备多克隆抗体，从而为相关过敏原的检测奠定基础。
本发明的技术方案简述如下。
一种小麦醇溶蛋白TaWG05多克隆抗体的制备方法，具体包括如下步骤：
（1）提取小麦品种郑麦004的基因组DNA；
（2）设计引物，以上述基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得目的基因TaWG05，引物序列设计如下：
上游引物：TCGACCCTCGCATCCATGACCAA，
下游引物：TCATTGTCCACCATTGTAGGCG；
（3）构建重组质粒pET-32a-TaWG05，具体为：
将步骤（2）中的PCR扩增产物与pET-32a表达载体分别采用BamHI和HindIII进行双酶切，分别回收酶切产物，并将酶切产物进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选、鉴定，获得构建正确的重组质粒pET-32a-TaWG05；
（4）TaWG05蛋白的原核表达和纯化，具体为：
将步骤（3）中所构建的重组质粒pET-32a-TaWG05转化大肠杆菌Rosetta（DE3）细胞，筛选阳性克隆，培养至对数生长期时，加入终浓度为0.8mM的IPTG 进行诱导表达，诱导培养4h左右；
培养结束后，菌液离心，收集菌体，超声裂解细胞，离心收集沉淀，用洗涤剂洗涤沉淀后，得粗TaWG05目的蛋白，进一步经超滤管离心超滤脱去脲素得纯化的TaWG05目的蛋白；
所述洗涤剂配方为：50mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，8mol/ L尿素，5mmol/L β-巯基乙醇，pH=8.0；
（5）制备多克隆抗体，具体为：
将步骤（4）所得TaWG05目的蛋白免疫新西兰大耳兔，分离血清，最终得到TaWG05蛋白多克隆抗体；
免疫新西兰大耳兔时，具体免疫程序为：
首次免疫：将步骤（4）所得TaWG05目的蛋白用PBS（pH=7.4）溶解，调整浓度为4mg/mL；再以1 ：1 的体积比与弗氏完全佐剂混合均匀，免疫新西兰大耳兔1 次，单只兔子的免疫剂量为0.6mg；
第二至第四次免疫：将步骤（4）所得TaWG05目的蛋白用PBS（pH=7.4）溶解，调整浓度为4mg/mL；再以1 ：1 的体积比与弗氏不完全佐剂(FIA) 混合混合均匀，免疫大耳兔3次，每次单只兔子的免疫剂量为0.3mg。
利用上述小麦醇溶蛋白TaWG05多克隆抗体的制备方法所制备的小麦醇溶蛋白TaWG05多克隆抗体，ELISA检测表明，所制备的小麦醇溶蛋白TaWG05多克隆抗体的效价可达1:32000。
所述小麦醇溶蛋白TaWG05多克隆抗体在小麦致敏原检测中的应用，用于检测小麦醇溶蛋白TaWG05。
本申请中所述小麦醇溶蛋白TaWG05基因，其碱基序列如SEQ ID No.1所示，
所述小麦醇溶蛋白TaWG05基因所编码的小麦醇溶蛋白TaWG05，其氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。
所述小麦醇溶蛋白TaWG05，其33-40处氨基酸（即：PQQSFPQQ）为IgE抗体结合表位区段。
需要解释的是，因语言习惯问题，本申请中未特殊说明时，小麦醇溶蛋白TaWG05、TaWG05蛋白等均指小麦γ-醇溶蛋白TaWG05，相关描述尽管不够统一，但对本领域技术人员理解本申请的技术方案并不构成必然的障碍。
小麦过敏是指特定的人群对面粉的一些蛋白质产生的不良反应，而醇溶蛋白主要是乳糜泻和小麦依赖运动激发过敏症的重要过敏原。而现有过敏原检测技术中，检测食物成品中潜在过敏原的最直接的方法是检测过敏原（蛋白质）。通过信息生物学的方法，发明人对小麦γ-醇溶蛋白TaWG05的结构域预测发现，其氨基酸33-40位置存在IgE抗体结合表位区段（PQQSFPQQ），推测其可能与小麦依赖运动激发过敏症有关。基于此特点，发明人通过小麦醇溶蛋白TaWG05的原核表达、多克隆抗体制备，制备了特定的小麦醇溶蛋白TaWG05多克隆抗体。利用该抗体，可建立可靠、定量的过敏原检测方法，从而为确保食品标签的一致性和消费者的安全性提供保障。进一步地，利用该多克隆抗体，对小麦醇溶蛋白TaWG05在其它小麦品种中的分布表达情况进行了检测鉴定，从而为小麦品质的改良奠定了理论基础。
总之，本申请针对特定小麦γ-醇溶蛋白TaWG05多克隆抗体的制备，其不仅针对单一的小麦γ-醇溶蛋白TaWG05，同时也为其他过敏原的快速检测提供了参考和借鉴，更为小麦品种改良提供了较好的指导，因而对于面粉过敏人群的健康指导具有较为重要的应用意义。
附图说明
图1为对小麦γ-醇溶蛋白 TaWG05编码基因信号肽的序列预测；
图2 为小麦γ-醇溶蛋白TaWG05编码基因的PCR扩增图，扩增片段为TaWG05编码区22aa-324aa的氨基酸序列，图中M为DNA分子量标准；
图3为小麦γ-醇溶蛋白 TaWG05的诱导表达的检测结果，其中A图为小麦γ-醇溶蛋白TaWG05的表达检测，1：空载体诱导表达，2：pET-32a-TaWG05诱导表达；B图为小麦γ-醇溶蛋白 TaWG05重组蛋白的SDS-PAGE分析，1：0.4mg/mL BSA，2：超声波破碎后的蛋白上清，3：包涵体稀释2倍，4：包涵体稀释5倍，5：包涵体稀释10倍；C图为纯化后的SDS-PAGE分析，1：pET-32a-TaWG05稀释5倍，2：pET-32a-TaWG05稀释10倍；M为蛋白分子量标准；
图4为小麦γ-醇溶蛋白TaWG05多克隆抗体的ELISA效价检测图，其中分别设置有：空白对照、阴性对照和抗体不同稀释浓度（阳性组），酶标仪分别测定各个孔在450nm的吸光度（A），计算时，计算阳性血清（P）与阴性血清（N）A值之比（P/N），P/N>2.1为阳性；结果显示该抗体的效价为1：32K；
图5为抗原蛋白印迹检测，其中1：抗原上样量为10ng，2：抗原上样量为5ng，3：抗原上样量为1ng，4：抗原上样量为0.5ng；M为蛋白分子量标准；抗体稀释比为1:1000；
图6 为小麦γ-醇溶蛋白TaWG05多克隆抗体在小麦品种中的鉴定结果，其中1：新麦26，2：郑麦366，3：郑麦9023，4：矮抗58，5：郑麦004，6：豫麦18，7：偃展4110；M为蛋白分子量标准；抗体稀释比为1:1000。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍如下。
生物材料：
新麦26，郑麦366，郑麦9023，矮抗58，郑麦004，豫麦18，偃展4110等，均为商品化小麦品种；
质粒pET-32a，由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室涂金星教授赠予；
E.coli DH5α、E.coli Rosetta (DE3)购买自全式金公司；
新西兰大耳兔，月龄3个月，体重1.8kg左右；由ABclonal公司提供。
主要试剂：
蛋白胨、牛肉膏和酵母粉抽提物购买自Oxoid 公司 ；
质粒小提试剂盒、胶回试剂盒、RNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；
IPTG、Amp霉素、高保真酶Phusion、T4 DNA 连接酶、限制性内切酶BamHI、HindIII 及其配套缓冲液购自TaKaRa公司；
HRP 标记的羊抗兔IgG与PVDF 膜为Millipore 公司产品；
Protease Inhibitor蛋白酶抑制剂购自Roche公司；
弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自Sigma 公司。
主要实验设备：
SDS-PAGE蛋白电泳仪、PCR仪、凝胶成像系统Gel Doc 2000TM，均为美国BIO-RAD公司产品；
台式低温离心机，Thermo Scientific公司产品；
超声波细胞破碎仪，美国BRANSON公司产品；
蛋白纯化系统，Profinia公司产品；
酶标仪，美国Molecular Devices公司产品。
实施例1
本申请所提供的小麦γ-醇溶蛋白TaWG05多克隆抗体，通过如下步骤制备而成。
（1）提取小麦品种郑麦004的基因组DNA；
利用天根公司的植物基因组DNA提取试剂盒，参考其说明书，提取小麦品种郑麦004基因组DNA。
（2）设计引物：引物序列设计时，基于生物信息学软件SignalP 4.1 server的预测，小麦γ-醇溶蛋白TaWG05的N端22个氨基酸残基为转运肽（预测结果如图1所示），因此在扩增小麦γ-醇溶蛋白TaWG05对应的目的基因时，去除其转运肽的PCR扩增引物设计如下：
上游引物：TCGACCCTCGCATCCATGACCAA，
下游引物：TCATTGTCCACCATTGTAGGCG；
以步骤（1）中所提取基因组DNA为模板，利用上述引物序列进行PCR扩增，获得目的基因：小麦γ-醇溶蛋白TaWG05编码基因；
PCR扩增反应程序为：98℃预变性30S；98℃变性10S，56℃退火20S，72℃延伸30S，共32个循环；72℃延伸5min。
对PCR扩增产物进行1.2%琼脂糖电泳检测，电泳结果见图2。从图中可以看出，小麦γ-醇溶蛋白TaWG05编码基因片段约900bp，符合897bp的理论大小。对此扩增产物进一步送上海生工公司进行测序验证。结果表明，扩增片段序列正确，与预期符合。
进一步的，根据测序结果，利用BioEdit软件对TaWG05基因编码的氨基酸序列进行分析，发现其在33-40位置存在IgE抗体结合表位区段（PQQSFPQQ），因而可推测其可能与小麦依赖运动激发过敏症有关。
（3）构建重组质粒pET-32a-TaWG05，具体为：
按照现有技术构建重组质粒pET-32a-TaWG05，简要描述如下。
将步骤（2）中的PCR扩增产物采用BamHI和HindIII进行双酶切，并回收酶切产物；
同时将表达载体pET-32a采用BamHI和HindIII进行双酶切，并回收酶切产物；
将所回收酶切产物在PCR仪中采用T4 DNA 连接酶进行连接，22℃连接2h后，4℃放入展示柜过夜。
酶切时的体系设计为：
10×Fast Digest buffer，6μL；
pET-32a载体（或TaWG05基因PCR扩增产物），20μL；
BamHI，1U/L、2μL；
HindIII，1U/L、2μL；
ddH2O，30 μL。
T4 DNA连接酶连接时的连接体系设计如下：
10×T4 DNA 连接缓冲液，1μL；
TaWG05基因PCR扩增产物，7μL；
pET-32a载体，1μL；
T4 DNA 连接酶，1μL。
将连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5α 细胞，具体操作过程如下：
（1）取连接产物5μL，加到100μL E.coli DH5α细胞悬液中，轻轻混匀，冰上放置30min；
（2）42℃水浴热激90s，迅速取出置冰上冷却5min；
（3）加入500μL 无抗生素的LB液体培养基，混匀后放入37℃摇床1h，使细菌恢复正常生长状态；
（4）吸取步骤3中的菌液200μL均匀涂布于含有Amp霉素的LB 固体培养基平板上，放入37℃培养箱中培养14h。
最后将筛选、鉴定正确的阳性克隆送上海生工进行测序验证，测序验证正确的重组质粒命名为pET-32a-TaWG05。
（4）小麦γ-醇溶蛋白TaWG05的原核表达和纯化，具体为：
将步骤（3）中所构建重组质粒pET-32a-TaWG05转化大肠杆菌Rosetta（DE3）细胞，筛选阳性克隆，进行PCR扩增鉴定。
对鉴定正确的阳性克隆菌株接种至LB 培养基（含50mg/mL氨苄霉素），37℃摇床培养至对数生长期；然后加入终浓度为0.8mM的IPTG， 37℃、220rpm 摇床培养4h进行诱导表达。
培养结束后，菌液离心（12000 rpm、15min），收集菌体，菌体经pH=7.4 的PBS 重悬并重复洗涤三次。
超声裂解细胞，离心收集沉淀，用洗涤剂洗涤沉淀，洗涤时每次转速6000rpm，得粗TaWG05目的蛋白，
所述洗涤剂配方为：50mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，8mol/ L尿素，5mmol/L β-巯基乙醇，pH=8.0。
将粗TaWG05 目的蛋白再经超滤管离心超滤脱去脲素，得纯化的γ-醇溶蛋白TaWG05，具体操作方法为：
将粗TaWG05目的蛋白溶液经pH=7.4的PBS溶液10 倍稀释后，与pH=7.4 的PBS溶液1:1混合， 4℃下离心10min，得到的蛋白溶液继续以1:1 比例与pH=7.4 的PBS溶液混合，经相同条件超滤，重复此操作，直至最后剩余的蛋白溶液体积为1mL左右，即得纯化的γ-醇溶蛋白TaWG05。
图3A为蛋白提纯前菌液的电泳图，粗TaWG05 目的蛋白的SDS-PAGE 结果如图3B所示，从图中可以看出经纯化后的粗TaWG05目的蛋白已经获得较好的纯化效果；纯化后的γ-醇溶蛋白TaWG05的电泳结果如图3C所示。从图中可以看出，经过诱导表达并纯化后，所获得的γ-醇溶蛋白TaWG05纯度较高，可以用于后续实验。
（5）制备多克隆抗体
将步骤（4）所得的提纯后的γ-醇溶蛋白TaWG05目免疫新西兰大耳兔，分离血清，最终得到TaWG05蛋白多克隆抗体，具体为：
选择月龄在3个月，体重1.8kg左右的健康大耳兔，共免疫四次，注射在双腋下和腹股沟位置，具体免疫程序为：
第一次免疫：将步骤（4）所得TaWG05目的蛋白用PBS（pH=7.4）溶解，调整浓度为4mg/mL；再以1 ：1 的体积比与弗氏完全佐剂混合均匀，免疫新西兰大耳兔1次，单只兔子的免疫剂量为0.6mg；
第二次免疫：间隔12天，把弗氏完全佐剂换用不完全弗氏不完全佐剂，单只兔子的疫剂量为0.3mg，其余同操作第一次免疫；
第三次免疫：间隔22天，其余操作同第二次免疫；
第四次免疫：间隔20天，其余操作同第二次免疫；
第四次免疫后，间隔12天采血（所采血液中加有抗凝血剂），所采集血液37℃静置1小时后，1000rpm离心15分钟后分离血清，血清中即含有所制备的γ-醇溶蛋白TaWG05多克隆抗体。
（6）ELISA检测血清效价
进一步地，对步骤（5）中所获得的含有多克隆抗体血清进行效价检测，可判定其是否具有应用前景，具体检测过程为：
A、抗原包被：用步骤（5）中所制备纯化后的γ-醇溶蛋白TaWG05作抗原，用磷酸缓冲液（PBS）稀释至10μg/mL，以25ng/孔量加入聚苯乙烯反应板中，4℃放置过夜；
B、洗涤：次日倾去凹孔内的液体，洗涤液洗3次；
C、封闭：按l00μL/孔量加入封闭液，室温放置1h；
D、洗涤：用洗涤液洗3次；
E、加待测血清样品：将阴性血清（没有被免疫的兔子血清）和待测血清（即步骤（5）中所制备含多克隆抗体的血清）按倍比法用稀释液稀释（1:1K，1:4K等），各取l00μL加入相应的凹孔内，加盖37℃恒温箱温育2h；
F、洗涤：用洗涤液洗3次；
G、加酶标抗抗体：按100μL／孔量加入酶标抗体，加盖，37℃恒温箱温育1h；
H、洗涤：用洗涤液洗5次，蒸馏水洗2次；
I、显色：按100μL/孔量，各孔加入新鲜配制的底物溶液，室温暗处放置5～30min进行显色，此时显示为蓝色；
J、终止反应、比色：按50μL/孔量，每孔加入终止液；此时颜色变黄；用酶标仪测定450nm处各孔的吸光值（A），阳性反应的最大稀释度为待测样品的效价，计算阳性血清（P）与阴性血清（N）吸光值A值之比（P/N），P/N>2.1为阳性；P/N<2.1而大于1.5为可疑，P/N<1.5为阴性。结果如图4所示，从图中可以看出，步骤（5）中所制备的含γ-醇溶蛋白TaWG05含多克隆抗体的血清其效价可达1:32000。
进一步地，利用Western-blot技术，对所制备的含γ-醇溶蛋白TaWG05多克隆抗体的血清进行Western-blot分析，结果如图5所示。从图中可以看出，目的条带在50kD左右，而γ-醇溶蛋白TaWG05多克隆抗体在稀释为1:1000时，仍可检测到0.5ng抗原，表现出较好地灵敏度。
实施例2
利用实施例1所制备的γ-醇溶蛋白TaWG05多克隆抗体，可对其他小麦品种（或含小麦的蛋白制品）中是否含有γ-醇溶蛋白TaWG05进行有效检测，从而为对γ-醇溶蛋白TaWG05过敏人群提供有效的健康指导，也可为小麦品种的改进提供指导方向。具体而言，本实施例以部分小麦品种（新麦26，郑麦366，郑麦9023，矮抗58，郑麦004，豫麦18，偃展4110）为例，对其是否含有γ-醇溶蛋白TaWG05蛋白进行了检测，依据此检测结果，即可为小麦改良或者抗敏原检测奠定基础。具体实验过程如下。
（1）提取小麦种子蛋白，具体步骤如下：
（A）取200μL总蛋白抽提缓冲液加入到1.5ml离心管中，放在冰上待用；
所述总蛋白抽提缓冲液配方为：
；
（B）液氮研磨小麦种子，取大约0.1g粉末，加入到步骤（A）的200μL总蛋白抽提缓冲液中，充分混匀；
（C）4℃、12000rpm离心10分钟；
（D）取上清，以3:1的体积比例加入4×Laemmli buffer，混匀后95℃以上变性10min，再冰上冷却5min；
（E）室温、12000rpm离心5min，取上清进行 SDS-PAGE检测。
（2）利用实施例1中所制备的γ-醇溶蛋白TaWG05多克隆抗体，分别对步骤（1）中所提取的不同小麦品种的蛋白进行检测，具体检测步骤简述如下。
（A）对步骤（1）中的SDS-PAGE检测的蛋白胶，切掉多余的浓缩胶，将分离胶小心的用清水洗2次，转移至冰上的转膜缓冲液中平衡10min；
（B）按照阳极、硝酸纤维素膜、凝胶、阴极顺序放好，200mA恒流100min；
（C）转膜后将膜小心放入封闭液（含2%BSA或3%脱脂奶粉的PBST）中，摇床上轻微摇晃，室温下封闭 1个小时；
（D）按照和封闭液一样的配方配制3%（m/V）脱脂牛奶的TBST溶液，加入对应比例的一抗（实施例1所制备的γ-醇溶蛋白TaWG05多克隆抗体）（一抗稀释倍数：1：1000）混匀后，将封闭液中的膜迅速转移至含一抗混合液中，摇床上轻微摇晃， 4℃ 杂交过夜；
（E）洗膜：将膜快速的从一抗混合液中取出，以TBST溶液洗膜， 5min/次、4次；
（F）加入辣根过氧化物酶偶联的二抗，向TBST溶液加入对应比例（1：10000）的二抗，混匀，立即将洗好的膜加入到二抗溶液中，摇床上轻微摇晃，室温下杂交 1.5小时；
（G）洗膜：将膜快速的从二抗中取出，以TBST溶液洗膜，5min/次、5次；
（H）显影：ECL显色法。
结果如图6所示。结果表明，在强新麦26、郑麦366、郑麦9023中，γ-醇溶蛋白TaWG05几乎无表达；而在矮抗58、郑麦004、豫麦18、偃展4110品种中，γ-醇溶蛋白TaWG05表达量很高，依据此结果，显然可为对γ-醇溶蛋白TaWG05过敏人群提供较好的健康指导，也为小麦品种的有针对性改进提供了指导方向。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南省农业科学院小麦研究所
<120> 一种小麦醇溶蛋白TaWG05多克隆抗体的制备方法
<130> none
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 960
<212> DNA
<213> Triticum aestivum
<400> 1
atgaagatct tcttggtctt tgccctcctc gttgtatcaa tgatcatcac caccgcgacc 60
gcgcagctcg atcctagcat ccatgtacaa gaaaggccac aacaatcgtt tccgcagcag 120
caaccactta cccaacaaca accattcccg ccgcaagagc cacaacaacc actattccag 180
caacaacaac cgcatccaca tcagtcactt ccccaacaac aacttcccca gcaacattta 240
tttccacagc aaccgccgca acaacaattt ccacagcaga tgccacttcc tcatcaacaa 300
caaatattcc cgcaacaaca aatattcccg caacaacaac aacccccaca acaacaacca 360
ttttaccaat atcaacaacc attaacacaa caaccatacc cgcaagagca accattgcca 420
caacaacaac cttctgtgga ggaaaaccaa caattgaact tgtgcaagga gttcctgctg 480
cagcagtgca acccggagga gaaactatca ttactgcagt cagtgatccc gttcctccga 540
ccaaagacct cgcaacagaa caactgccag ttgaagcggc aacaatgttg tcgacaactt 600
gcacatatca gcgagccgtc ccgatgcccg gccatccaca acattgtgca cgccatcatc 660
atgcaacaac aacaacaaca acaacaacaa caacaacaac aacaacaaca acaacaacaa 720
catgtggata gaggtttcgt ccagcctcaa ccacaacagt tgggccaggg aatgcccatg 780
cagcctcaac atcaattggg ccagggctta agcctacctc aacaactagc ccagttcaag 840
ttggttaggt tacttgtgat tcagaccttg cctatgttat gcaatgtgca tgtcccatct 900
gattgctaca ccattagtgc accatttggt ggcatcactg cctacaacgg tggacaatga 960
<210> 2
<211> 319
<212> PRT
<213> Triticum aestivum
<400> 2
Met Lys Ile Phe Leu Val Phe Ala Leu Leu Val Val Ser Met Ile Ile
1 5 10 15
Thr Thr Ala Thr Ala Gln Leu Asp Pro Ser Ile His Val Gln Glu Arg
20 25 30
Pro Gln Gln Ser Phe Pro Gln Gln Gln Pro Leu Thr Gln Gln Gln Pro
35 40 45
Phe Pro Pro Gln Glu Pro Gln Gln Pro Leu Phe Gln Gln Gln Gln Pro
50 55 60
His Pro His Gln Ser Leu Pro Gln Gln Gln Leu Pro Gln Gln His Leu
65 70 75 80
Phe Pro Gln Gln Pro Pro Gln Gln Gln Phe Pro Gln Gln Met Pro Leu
85 90 95
Pro His Gln Gln Gln Ile Phe Pro Gln Gln Gln Ile Phe Pro Gln Gln
100 105 110
Gln Gln Pro Pro Gln Gln Gln Pro Phe Tyr Gln Tyr Gln Gln Pro Leu
115 120 125
Thr Gln Gln Pro Tyr Pro Gln Glu Gln Pro Leu Pro Gln Gln Gln Pro
130 135 140
Ser Val Glu Glu Asn Gln Gln Leu Asn Leu Cys Lys Glu Phe Leu Leu
145 150 155 160
Gln Gln Cys Asn Pro Glu Glu Lys Leu Ser Leu Leu Gln Ser Val Ile
165 170 175
Pro Phe Leu Arg Pro Lys Thr Ser Gln Gln Asn Asn Cys Gln Leu Lys
180 185 190
Arg Gln Gln Cys Cys Arg Gln Leu Ala His Ile Ser Glu Pro Ser Arg
195 200 205
Cys Pro Ala Ile His Asn Ile Val His Ala Ile Ile Met Gln Gln Gln
210 215 220
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
225 230 235 240
His Val Asp Arg Gly Phe Val Gln Pro Gln Pro Gln Gln Leu Gly Gln
245 250 255
Gly Met Pro Met Gln Pro Gln His Gln Leu Gly Gln Gly Leu Ser Leu
260 265 270
Pro Gln Gln Leu Ala Gln Phe Lys Leu Val Arg Leu Leu Val Ile Gln
275 280 285
Thr Leu Pro Met Leu Cys Asn Val His Val Pro Ser Asp Cys Tyr Thr
290 295 300
Ile Ser Ala Pro Phe Gly Gly Ile Thr Ala Tyr Asn Gly Gly Gln
305 310 315

Claims (4)

1.一种小麦醇溶蛋白TaWG05多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述小麦醇溶蛋白TaWG05基因，其碱基序列如SEQ ID No.1所示，
所述小麦醇溶蛋白TaWG05基因所编码的小麦醇溶蛋白TaWG05，其氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示；所述小麦醇溶蛋白TaWG05，其33~40处氨基酸为IgE抗体结合表位区段；
所述多克隆抗体的制备方法具体包括如下步骤：
（1）提取小麦品种郑麦004的基因组DNA；
（2）设计引物，以上述基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得目的基因TaWG05，引物序列设计如下：
上游引物：TCGACCCTCGCATCCATGACCAA，
下游引物：TCATTGTCCACCATTGTAGGCG；
（3）构建重组质粒pET-32a-TaWG05，具体为：
将步骤（2）中的PCR扩增产物与pET-32a表达载体进行连接，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选、鉴定，获得构建正确的重组质粒pET-32a-TaWG05；
（4）TaWG05蛋白的原核表达和纯化，具体为：
将步骤（3）中所构建的重组质粒pET-32a-TaWG05转化大肠杆菌Rosetta细胞，筛选阳性克隆，进行培养并加入IPTG诱导表达；
培养结束后，离心收集菌体，裂解细胞、收集沉淀，洗涤沉淀后，得粗TaWG05目的蛋白，进一步超滤得纯化的TaWG05目的蛋白；
（5）制备多克隆抗体，具体为：
将步骤（4）所得TaWG05目的蛋白免疫新西兰大耳兔，分离血清，最终得到TaWG05蛋白多克隆抗体。
2.如权利要求1所述小麦醇溶蛋白TaWG05多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤（5）中，免疫新西兰大耳兔时，具体免疫程序为：
首次免疫：将步骤（4）所得TaWG05目的蛋白用PBS溶解，调整浓度为4mg/mL；再以1 ：1的体积比与弗氏完全佐剂混合均匀，免疫新西兰大耳兔1 次，单只兔子的疫剂量为0.6mg；
第二至第四次免疫：将步骤（4）所得TaWG05目的蛋白用PBS溶解，调整浓度为4mg/mL；再以1 ：1 的体积比与弗氏不完全佐剂混合混合均匀，免疫大耳兔3次，每次单只兔子的免疫剂量为0.3mg。
3.利用权利要求1或2所述小麦醇溶蛋白TaWG05多克隆抗体的制备方法所制备的小麦醇溶蛋白TaWG05多克隆抗体。
4.权利要求3所述小麦醇溶蛋白TaWG05多克隆抗体在小麦致敏原检测中的应用，其特征在于，用于检测小麦醇溶蛋白TaWG05。
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