CN104056251B - 与腹部疾病有关的表位 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及与腹部疾病有关的表位。此处公开的本发明涉及在诊断、治疗和预防腹部疾病的方法中使用的表位。提供了包含至少一种表位的治疗组合物。

Description

与腹部疾病有关的表位
本申请是国际申请日为2005年4月28日的国际申请PCT/GB2005/001621进入中国、申请号为200580021704.6的题为“与腹部疾病有关的表位”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及在腹部疾病的诊断和治疗中有用的表位，包括诊断剂、治疗剂、试剂盒和使用前述的方法。
背景技术
腹部疾病由免疫介导的对饮食谷蛋白的超敏反应造成。小麦、黑麦、大麦和有些情况下燕麦中的谷蛋白，在腹部疾病中是毒性的。谷蛋白由小麦中的α/β、γ和ω麦醇溶蛋白和低和高分子量(LMW和HMW)麦谷蛋白，大麦中的大麦醇溶蛋白，黑麦中的黑麦醇溶蛋白，和燕麦中的燕麦蛋白组成。大麦醇溶蛋白和黑麦醇溶蛋白与小麦中的γ和ω麦醇溶蛋白和低和高分子量麦谷蛋白是同源的。燕麦蛋白在种系发生上比大麦醇溶蛋白和黑麦醇溶蛋白离小麦谷蛋白更远。
研究腹部疾病的目的是，通过定义刺激谷蛋白-特异性的T-细胞的肽来定义谷蛋白的有毒组分。谷蛋白表位的准确定义，允许开发新的诊断、治疗、食物中的谷蛋白污染的测试和保留传统谷蛋白的烹饪/烘烤质量的无毒谷物。许多这样的应用，需要全面理解谷蛋白中的全部而不是最常见的有毒肽。
与大约35％一般高加索人口相比，编码HLA-DQ2和/或HLA-DQ8的基因存在于超过99％患有腹部疾病的个体中。谷蛋白-衍生的结合HLA-DQ2或HLA-DQ8的肽(表位)刺激特定的T-细胞。HLA-DQ2和DQ8-限制的表位包括“核心”9氨基酸序列，其直接与HLA-DQ2或DQ8的肽结合沟和同源的T-细胞受体相互作用。通常，含有抗原中的所有独特的10或12聚体肽的重叠肽(通常15-20聚体)文库，已经用于绘制HLA II类-限制的T-细胞表位的图谱。
已知一系列的谷蛋白肽在腹部疾病中激活谷蛋白特异性的T-细胞。以前的研究已经从选择的谷蛋白或谷蛋白消化物中鉴别出了谷蛋白肽。从肠活组织检查分离的T-细胞克隆和系，已经用于筛选这些谷蛋白组分。
酶(存在于肠组织中的组织转谷氨酰胺酶(tTG))对谷蛋白的修饰相当大地增加谷蛋白对谷蛋白特异性的T-细胞的刺激能力。谷蛋白-特异性的T-细胞的大多数已知表位，对应着tTG-脱酰胺的谷蛋白肽。转谷氨酰胺酶介导谷蛋白中的特定谷氨酰胺残基的脱酰胺作用(生成谷氨酸)。对tTG的脱酰胺作用易感的含有谷氨酰胺的序列通常符合基序：QXPX或QXX(FYMILVW)，(见Vader W.等2002J.Exp.Med.195：643-649，PCT WO03/066079和Fleckenstein B.2002.J Biol Chem277：34109-16)。结合HLA-DQ2且对tTG的脱酰胺作用易感的肽的基序，已经用于预测某些谷蛋白表位(Vader等J Exp Med2002J.Exp.Med.195：643-649，PCT WO03/066079)。
但是，其它组已经使用一系列11种重组α/β(11)和5种γ麦醇溶蛋白(Arentz-Hansen H.2000.J.Exp.Med.191：603-612，Arentz-Hansen H.2002.Gastroenterology123：803-809，PCT WO02/083722)和纯化的谷蛋白蛋白的裂解物(Sjostrom H.等1998.Scand.J.Immunol.48，111-115；van de Wal，Y.等1998.J.Immunol.161(4)：1585-1588；van de Wal，Y.等1999.Eur.J.Immunol.29：3133-3139；Vader W.等2002.Gastroenterology122：1729-1737.)，鉴别出了谷蛋白-特异性的肠T-细胞克隆和系的表位。
我们的工作已利用了下述发现，即谷蛋白体内攻击诱导外周血中表达肠-归巢的整联蛋白(α4β7)的HLA-DQ2限制的CD4+谷蛋白-特异性的T-细胞。该技术允许对A-麦醇溶蛋白(57-73QE65)中的优势表位绘制图谱(Anderson，RP等2000.Nat.Med.6：337-342.，WO01/25793)。A-麦醇溶蛋白57-73QE65对应着使用肠T-细胞克隆鉴别出的2种重叠表位(Arentz-Hansen H.等2000.J.Exp.Med.191：603-612，Arentz-Hansen H.等2002.Gastroenterology123：803-809)。体内谷蛋白攻击诱导谷蛋白特异性的T-细胞的优点是，可以消耗任意的食物，且得到的在血液中诱导的T-细胞(使用简单的过夜干扰素γELISPOT测定，在外周血中定量的)，会受到内源地存在的表位的体内刺激，而不是由合成的或纯化的抗原体外预处理。新鲜的多克隆的外周血T-细胞的过夜测定，也会避免与T-细胞克隆的非常长的纯化有关的假象的可能性。
有趣地，对几种γ-麦醇溶蛋白表位特异性的T-细胞克隆和系(Arentz-HansenH.2002.Gastroenterology123：803-809，PCT WO02/083722)与最初定义的A-麦醇溶蛋白表位57-73QE65交叉反应。
尽管在α/β麦醇溶蛋白中存在相当大的同源性，但早期的工作(见WO03/104273)已经表明，在HLA-DQ2-相关的腹部疾病中识别出的优势表位“A-麦醇溶蛋白57-73QE65”，是由Genbank中存在的少数α/β麦醇溶蛋白编码的。
发明内容
本研究的目的是开发一种方法，其允许对谷蛋白中的所有T-细胞表位绘制图谱。使用小麦面包(每天200g，持续3天)或燕麦(每天100g，持续3天)的消耗，诱导外周血中的谷蛋白或燕麦蛋白-特异性的T-细胞(在开始攻击后6天收集)。使用谷蛋白和燕麦蛋白肽文库，包括在小麦谷蛋白和/或燕麦的燕麦蛋白的每个Genbank登记项中包含的所有独特的12聚体序列，在过夜干扰素γELISPOT测定中评价外周血单核细胞(PBMC)。通过确立一种算法，以设计跨过Genbank中的谷蛋白的所有潜在表位的肽(2922个20聚体包括所有14 964独特的9聚体-潜在的T-细胞表位)，将干扰素-γELISPOT测定修改成能用单一个体血液筛选超过1000种肽的高通量测定，并开发用于分析和解释产生的数据的生物信息学工具，可以实现该目的。
将小麦谷蛋白肽的一系列的41个“超家族”鉴别为推定的T-细胞表位。超家族共有基序，其中允许有限水平的冗余。许多最有效的家族包括已知的T-细胞表位，其中包括以前描述的优势表位A-麦醇溶蛋白57-73。
通过使用谷蛋白攻击后的PBMC，对谷蛋白表位详尽地绘制图谱，发明人已经发现了与HLA-DQ2和HLA-DQ8有关的腹部疾病的一系列新的麦醇溶蛋白、LMW和HMW麦谷蛋白和燕麦蛋白表位。为HLA-DQ2和HLA-DQ8-相关的腹部疾病，鉴别了新表位。在识别的T-细胞表位的范围方面，HLA-DQ2和HLA-DQ8相关的腹部疾病在遗传上和功能上是不同的。另外，在HLA-DQ2+腹部疾病受试者中进行燕麦攻击后，存在于燕麦的燕麦蛋白中的3种肽也会激活外周血单核细胞(PBMC)，首次定义了燕麦表位。体内燕麦攻击后由T-细胞识别的燕麦蛋白肽的鉴别，提供了观察到的燕麦暴露后腹部疾病的偶然复发的分子基础(Lundin KEA等2003Gut52：1649-52)，并可以提供燕麦的预测性诊断或遗传解毒作用的基础。
这里显示的数据会提供详尽的基础，用于定义腹部疾病中常见的“优势的”和偶然的“较弱的”T-细胞表位。该信息是诸如诊断、食品测试、免疫治疗和预防的功能应用的平台，和用于设计在改良的谷物中有用的无毒的谷蛋白的平台。
具体地，通过谷蛋白T细胞表位的详尽绘图，发明人已经发现了具有类似的核心序列(例如，SEQ ID NO：1-199)和类似的延伸序列(例如，SEQ ID NO：200-1554、1555-1655、1656-1671和1830-1903)的小麦麦醇溶蛋白和麦谷蛋白中的在HLA-DQ2+患者的腹部疾病中有生物活性的表位。发明人还已经发现了下述物质中的在HLA-DQ2+患者的腹部疾病中有生物活性的表位：具有类似的核心序列(例如，SEQ ID NO：1684-1695)和类似的延伸序列(例如，SEQ ID NO：1672-1683、1696-1698和1764-1768)的燕麦的燕麦蛋白；黑麦的黑麦醇溶蛋白(SEQ ID NO：1769-1786)；和大麦的大麦醇溶蛋白(SEQ ID NO：1787-1829)。另外，在具有类似的核心序列(例如，SEQ ID NO：1699-1721)和类似的延伸序列(例如，SEQ ID NO：1722-1763和1908-1927)的小麦麦醇溶蛋白中已经鉴别出了在HLA-DQ8+患者的腹部疾病中有生物活性的表位。因而，该详尽的绘图提供了腹部疾病患者中由T细胞识别的优势表位。因而使用这些鉴别出的表位、其类似物和等价物中的任一种，可以实现本文所述的本发明的方法。也就是说，本发明的试剂包括这些表位。另外，已经表明，表位的组合即“combitope”或包含2个或更多个表位的单个肽诱导与单独的表位等价的反应，从而表明几个表位可以用于本发明的治疗、诊断和其它用途。这样的combitope可以是例如SEQ ID NO：1906的形式。优选地，本发明的试剂包括一个或多个具有在SEQ ID NO：1578-1579、1582-1583、1587-1593、1600-1620、1623-1655、1656-1671、1672-1698、1699-1763、1764-1768、1769-1786、1787-1829、1895-1903、1906和1908-1927中列出的序列的表位，如本文定义的其类似物和等价物。
优选的在HLA-DQ8+患者的腹部疾病中有生物活性的试剂在序列中具有谷氨酰胺，其指示着对脱酰胺作用的易感性，其与也对脱酰胺作用易感的第二个谷氨酰胺由7个残基隔开(例如，如在QGSFQPSQQ中发现的)，其中在tTG的脱酰胺作用后，脱酰胺的序列是HLA-DQ8的高亲和力结合剂(HLA-DQ8的结合基序偏好在位置1和9处的谷氨酸)。在一个次优选的实施方案中，试剂具有对脱酰胺作用易感的谷氨酰胺残基，但是与对tTG-介导的脱酰胺作用易感的第二个谷氨酰胺之间没有被7个残基隔开。
因而，本发明提供了诊断个体中的腹部疾病或对腹部疾病的易感性的方法，其包含下述步骤：(a)使来自宿主的样品接触选自下述的试剂：(i)表位，其包含选自SEQ ID NO：1-1927，优选选自SEQ ID NO：1578-1579、1582-1583、1587-1593、1600-1620、1623-1655、1656-1671、1672-1698、1699-1763、1764-1768、1769-1786、1787-1829、1895-1903、1906和1908-1927的氨基酸序列，或来自天然产生的谷蛋白的等价序列，(ii)(i)的类似物，其能被识别(i)的T细胞受体识别，在肽类似物的情况下，它的长度不超过50个氨基酸，或(iii)产物，其包含两种或更多种如(i)或(ii)中所定义的试剂；和(b)体外测定样品中的T细胞是否识别该试剂，其中T细胞的识别指示着该个体患有或易感腹部疾病。
术语“谷蛋白”包括小麦中的α/β、γ和ω麦醇溶蛋白，和低和高分子量(LMW和HMW)麦谷蛋白，大麦中的大麦醇溶蛋白，黑麦中的黑麦醇溶蛋白，和燕麦中的燕麦蛋白。本发明特别地涉及麦醇溶蛋白和燕麦蛋白。
本发明也提供了试剂在制备用于诊断个体中的腹部疾病或对腹部疾病的易感性的方法中的诊断工具中的用途，所述方法包含，测定个体的T细胞是否识别该试剂，其中T细胞的识别指示着该个体患有或易感腹部疾病。
被转谷氨酰胺酶修饰的表位的发现，也允许基于测定是否存在针对这些表位的其它类型的免疫反应来诊断腹部疾病。因而，本发明也提供了诊断个体中的腹部疾病或对腹部疾病的易感性的方法，其包含测定来自个体的样品中能结合表位的抗体的存在，其中抗体的存在指示着该个体患有或易感腹部疾病。
本发明提供了测定组合物是否能造成腹部疾病的方法，其包含测定组合物中是否存在能被转谷氨酰胺酶修饰成如上定义的寡肽序列的蛋白，其中所述蛋白的存在指示着该组合物能造成腹部疾病。
本发明也提供了突变的谷蛋白，其野生型序列可被转谷氨酰胺酶修饰成包含表位的序列，所述表位包含如上定义的序列，但是该突变的谷蛋白已经被修饰，该修饰方式使它不合有可以被转谷氨酰胺酶修饰成包含这样的包含所述序列的表位的序列的序列；或这样的突变的谷蛋白的片段，其长度为至少7个氨基酸(例如，至少7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸长)，且其包含已经以所述方式修饰的序列。
本发明也提供了蛋白，其包含能结合T细胞受体的序列，该T细胞受体识别试剂，且该序列能造成携带这样的T细胞受体的T细胞的拮抗作用。
另外，本发明提供了包含如上定义的蛋白的食物。
另外，本发明提供了试剂，其任选地与载体相结合，用于通过使识别试剂的T细胞耐受来治疗或预防腹部疾病的方法中。还提供了具有识别(i)的T细胞受体的T细胞的拮抗剂，其任选地与载体相结合，用于通过拮抗这样的T细胞来治疗或预防腹部疾病的方法中。另外，提供了结合抗体(其结合试剂)的试剂或类似物，其用于通过使个体耐受以预防这样的抗体的生成来治疗或预防腹部疾病的方法中。
本发明也提供了预防或治疗腹部疾病的方法，其包含给个体施用至少一种选自下述的试剂：a)肽，其包含至少一个表位，所述表位包含选自SEQ ID NO：1-1927，优选地选自SEQ ID NO：1578-1579、1582-1583、1587-1593、1600-1620、1623-1655、1656-1671、1672-1698、1699-1763、1764-1768、1769-1786、1787-1829、1895-1903、1906和1908-1927的序列，和其等价物；和b)a)的类似物，其能被识别a)的肽的T细胞受体识别，且其长度不超过50个氨基酸。在有些实施方案中，试剂是HLA-DQ2-限制的、HLA-DQ8-限制的，或一种试剂是HLA-DQ2-限制的，且第二种试剂是HLA-DQ8-限制的。在有些实施方案中，试剂包含小麦表位、燕麦表位、黑麦表位、大麦表位或其任意组合，或者是作为单一试剂或者是作为复合试剂。
本发明也提供了预防或治疗腹部疾病的方法，其包含给个体施用药物组合物，所述组合物包含如上定义的试剂和药学上可接受的载体或稀释剂。
本发明也提供了预防或治疗腹部疾病的方法，其包含给个体施用药物组合物，所述组合物包含具有如上定义的T细胞受体的T细胞的拮抗剂，和药学上可接受的载体或稀释剂。
本发明也提供了预防或治疗腹部疾病的方法，其包含给个体施用组合物，以用于使个体耐受谷蛋白，以抑制生成对如上定义的试剂的T细胞或抗体反应，该组合物包含如上定义的试剂。
本发明也提供了预防或治疗腹部疾病的方法，这通过下述来实现：1)诊断个体的腹部疾病，这通过下述来实现：a)使来自宿主的样品接触至少一种选自下述的试剂：i)肽，其包含至少一个表位，所述表位包含选自SEQ ID NO：1-1927，优选地选自SEQ ID NO：1578-1579、1582-1583、1587-1593、1600-1620、1623-1655、1656-1671、1672-1698、1699-1763、1764-1768、1769-1786、1787-1829、1895-1903、1906和1908-1927的序列，和其等价物；和ii)i)的类似物，其能被识别i)的T细胞受体识别，且其长度不超过50个氨基酸；和体外测定样品中的T细胞是否识别该试剂；T细胞的识别指示着个体患有或易感腹部疾病；或b)施用如上定义的试剂，和体内测定个体中的T细胞是否识别该试剂，其中试剂的识别指示着个体患有或易感腹部疾病；和2)给诊断为患有或易感腹部疾病的个体，施用用于预防或治疗腹部疾病的治疗剂。
本发明也提供了如上定义的试剂，其任选地与载体相结合，以用于通过使识别试剂的T细胞耐受来治疗或预防腹部疾病的方法中。
本发明也提供了具有如上定义的T细胞受体的T细胞的拮抗剂，其任选地与载体相结合，以用于通过拮抗这样的T细胞来治疗或预防腹部疾病的方法中。
本发明也提供了蛋白，其包含能结合T细胞受体的序列，该T细胞受体识别如上定义的试剂，且该序列能造成携带这样的T细胞受体的T细胞的拮抗作用。
本发明也提供了药物组合物，其包含如上定义的试剂或拮抗剂，和药学上可接受的载体或稀释剂。
本发明也提供了组合物，其用于使个体耐受谷蛋白，以抑制生成对如上定义的试剂的T细胞或抗体反应，该组合物包含如上定义的试剂。
本发明也提供了组合物，其用于拮抗对如上定义的试剂的T细胞反应，该组合物包含如上定义的拮抗剂。
本发明也提供了突变的谷蛋白，其野生型序列可以被转谷氨酰胺酶修饰成作为如上定义的试剂的序列，该突变的谷蛋白包含一个突变，所述突变可以预防它被转谷氨酰胺酶修饰成作为如上定义的试剂的序列；或这样的突变的谷蛋白的片段，其长度为至少7个氨基酸(例如，至少7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸长)，且其包含该突变。
本发明也提供了多核苷酸，其包含编码如上定义的蛋白或片段的编码序列。
本发明也提供了细胞，其包含如上定义的多核苷酸，或其已经被这样的多核苷酸转化。
本发明也提供了哺乳动物，其表达如上定义的T细胞受体。
本发明也提供了诊断个体中的腹部疾病或对腹部疾病的易感性的方法，其包含：a)使来自宿主的样品接触至少一种选自下述的试剂i)肽，其包含至少一个表位，所述表位包含选自SEQ ID NO：1-1927，优选地选自SEQ ID NO：SEQ ID NO：1578-1579、1582-1583、1587-1593、1600-1620、1623-1655、1656-1671、1672-1698、1699-1763、1764-1768、1769-1786、1787-1829、1895-1903、1906和1908-1927的序列，和其等价物；和ii)i)的类似物，其能被识别i)的T细胞受体识别，且其长度不超过50个氨基酸；和b)体外测定样品中的T细胞是否识别该试剂；T细胞的识别指示着该个体患有或易感腹部疾病。
本发明也提供了测定该组合物是否能造成腹部疾病的方法，其包含测定组合物中是否存在能被转谷氨酰胺酶修饰成寡肽序列的蛋白，其中蛋白的存在指示着该组合物能造成腹部疾病。
本发明也提供了鉴别T细胞的拮抗剂的方法，该T细胞识别如上定义的试剂，所述方法包含使候选物质接触T细胞，和检测该物质是否造成T细胞经历抗原特异性的反应的能力的降低，其中所述能力的任何这样的降低的检测，指示着所述物质是拮抗剂。
本发明也提供了用于实施上述的任一种方法的试剂盒，其包含如上定义的试剂和用于检测T细胞对肽的识别的工具。
本发明也提供了鉴别作为腹部疾病的治疗剂的产物的方法，其包含给如上定义的患有或易感腹部疾病的哺乳动物施用候选物质，并测定该物质是否预防或治疗哺乳动物中的腹部疾病，其中腹部疾病的预防或治疗指示着该物质是治疗产物。
本发明也提供了生产由如上定义的编码序列编码的蛋白的方法，该方法包含：a)在允许表达蛋白的条件下，培养上述的细胞；和任选地b)回收表达的蛋白。
本发明也提供了得到转基因的植物细胞的方法，其包含用如上所述的载体转化植物细胞，以生产转基因的植物细胞。
本发明也提供了得到第一代转基因植物的方法，其包含再生用如上所述的载体转化的转基因的植物细胞，以生产转基因植物。
本发明也提供了得到转基因植物种子的方法，其包含从可如上得到的转基因植物得到转基因种子。
本发明也提供了得到转基因后代植物的方法，其包含从可由如上所述的方法得到的第一代转基因植物，得到第二代转基因后代植物，并任选地从由此得到的第二代后代植物，得到再后一代或多代的转基因植物。
本发明也提供了可由任一种上述的方法得到的转基因的植物细胞、植物、植物种子或后代植物。
本发明也提供了转基因植物或植物种子，其包含如上所述的植物细胞。
本发明也提供了转基因的植物细胞愈伤组织，其包含如上所述的可从如上定义的转基因的植物细胞、第一代植物、植物种子或后代得到的植物细胞。
本发明也提供了得到作物产物的方法，其包含从根据任一种上述的方法的植物收获作物产物，和任选地进一步加工收获的产物。
本发明也提供了食物，其包含如上定义的蛋白。
附图说明
图1显示了从一组蛋白产生所有可能的肽表位的方法。
图2显示了在2003年6月16日的Genbank数据库中存在的谷蛋白基因产物的Genbank登记号。
图3A显示了分析来自ELISpot的数据的期望最大化(EM)算法。
图3B显示了对腹部疾病患者的数据集的测试。
图4显示了发现反应性表位的最小集的迭代过程。
图5显示了麦醇溶蛋白和麦谷蛋白序列(SEQ ID NO：1-1554)。在“一致”列中，小写字母使用标准的单字母氨基酸代码，但是大写字母具有不同的含义：E＝[e或q]，F＝[f或y或w]，I＝[i或l或v]，S＝[s或t]，R＝[r或k或h]。“序列”列使用标准的单字母氨基酸代码。
图6显示了在HLA-DQ2+腹部疾病志愿者中谷蛋白攻击后6天收集的PBMC中，刺激γ干扰素的谷蛋白肽(SEQ ID NO：1555-1655)。标示的9聚体是200组生物活性的“结构上”有关的20聚体肽共有的。根据受试者反应的生物活性X比例，排列谷蛋白序列。
图7显示了小麦攻击实验的结果(SEQ ID NO：1656-1671)。在小麦攻击后，这些肽在10位受试者(A-J)中产生高质量反应(标示‘Y’)。
图8显示了在HLA-DQ2+腹部疾病志愿者中谷蛋白攻击后6天收集的PBMC中，刺激干扰素-γ的燕麦蛋白肽(+/-tTG的脱酰胺作用)(SEQ ID NO：1672-1698)。标有＊的那些是燕麦攻击后诱导IFN-γ的最佳的独特的20聚体。
图9显示了在2位根据共有的核心序列分组的HLA-DQ8(不是HLA-DQ2)受试者中最有效的40种20聚体(SEQ ID NO：1699-1763)。组6的核心序列(QGSFQPSQQ)对应着van deWal等(J.Immunol.1998，161(4)：1585-1588)所述的α-麦醇溶蛋白表位。受试者A中的最大反应是271SFC(单独的介质，没有肽反应：4SFC)，且在B中，是26SFC(单独的介质，没有肽反应：1SFC)。
图10显示了基于氨基酸测序的A-麦醇溶蛋白(SEQ ID NO：1928)的氨基酸序列。
具体实施方式
术语“腹部疾病”包括通过改变谷蛋白敏感度的程度造成的多种状况，其包括特征在于扁平小肠粘膜(增生性绒毛萎缩)的严重形式和特征在于轻症状的其它形式。
上面(在诊断或治疗的上下文中)提及的个体是人。他们可能患有或被怀疑患有腹部疾病(有症状的或无症状的)。他们可能采用无谷蛋白的饮食。他们可能是在急性期反应中(例如，他们可能患有腹部疾病，但是在最近的24小时，仅仅摄入谷蛋白，然后他们采用无谷蛋白的饮食14-28天)。
个体可能易感腹部疾病，例如遗传易感性(例如通过有患有腹部疾病的亲戚或具有会造成对腹部疾病的素因的基因的个体来确定)。
试剂
试剂一般地是肽，例如长为7-50个氨基酸，例如长为10-40、12-35或15-30个氨基酸。
试剂可以是由SEQ ID NO：1-1927中的任一个代表的肽，或包含序列的表位，所述序列包含SEQ ID NO：1-1927中的任一个，其是分离的源自谷蛋白蛋白的寡肽；或来自天然产生的谷蛋白蛋白的这些序列的等价物。在本发明的另一组实施方案中，试剂是燕麦谷蛋白的任意肽表位(例如，燕麦蛋白的任意T细胞表位)。
优选地，试剂是由SEQ ID NO：1578-1579、1582-1583、1587-1593、1600-1620、1623-1655、1656-1671、1672-1698、1699-1763、1764-1768、1769-1786、1787-1829、1895-1903、1906和1908-1927中的任一个代表的肽，或包含序列的表位，所述序列包含SEQ IDNO：1578-1579、1582-1583、1587-1593、1600-1620、1623-1655、1656-1671、1672-1698、1699-1763、1764-1768、1769-1786、1787-1829、1895-1903、1906和1908-1927中的任一个，其是分离的源自谷蛋白的寡肽；或来自天然产生的谷蛋白的这些序列的等价物。
因而，表位可以是天然产生的谷蛋白的衍生物，尤其是来自小麦或燕麦谷蛋白。这样的衍生物一般地是谷蛋白的片段，或整个蛋白或片段的突变的衍生物。因此，本发明的表位不包括天然产生的整个谷蛋白，且不包括其它的整个的天然产生的谷蛋白。
一般地，这样的片段长为至少7个氨基酸(例如，至少7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸长)。
一般地，在本文所述的使用来自腹部疾病患者的样品的任意测定中，T细胞会以至少与识别片段所来源的试剂相同的程度识别这样的片段。
试剂可以是由SEQ ID NO：1-1927中的任一个代表的肽，优选地由SEQ ID NO：1578-1579、1582-1583、1587-1593、1600-1620、1623-1655、1656-1671、1672-1698、1699-1763、1764-1768、1769-1786、1787-1829、1895-1903、1906和1908-1927中的任一个代表的肽，或蛋白，所述蛋白包含与SEQ ID NO：1-1927中的任一个相对应的序列，优选地包含与SEQ ID NO：1578-1579、1582-1583、1587-1593、1600-1620、1623-1655、1656-1671、1672-1698、1699-1763、1764-1768、1769-1786、1787-1829、1895-1903、1906和1908-1927中的任一个相对应的序列(例如包含SEQ ID NO：1-1927中的任一个，优选地包含SEQ ID NO：1578-1579、1582-1583、1587-1593、1600-1620、1623-1655、1656-1671、1672-1698、1699-1763、1764-1768、1769-1786、1787-1829、1895-1903、1906和1908-1927中的任一个的谷蛋白片段，例如，在已经用转谷氨酰胺酶处理谷蛋白后)。这样的序列的生物活性的片段，也是本发明的试剂。一般地，这样的片段长为至少7个氨基酸(例如，至少7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸长)。与SEQ ID NO：1-1927中的任一个等价的序列或这些序列的类似物，也是本发明的试剂。
在表位包含与来自另一种谷蛋白(例如，任一种本文提及的谷蛋白或任一种会造成腹部疾病的谷蛋白)的上述表位(包括片段)等价的序列的情况下，这样的等价序列对应着一般地用转谷氨酰胺酶(部分地或完全地)处理的谷蛋白的片段。通过比对其它谷蛋白和原始表位所来源的谷蛋白的序列(例如，使用任一种本文提及的程序)，可以确定这样的等价肽。转谷氨酰胺酶是可商业上得到的(例如，Sigma T-5398)。
作为类似物的试剂能被识别(i)的TCR识别。因此，通常当在存在(i)的情况下，且一般地，也在抗原呈递细胞(APC)(例如本文提及的APC中的任一种)存在的情况下，将类似物添加给T细胞时，类似物抑制(i)的识别，即类似物能在这样的系统中与(i)竞争。
类似物可以是能结合识别(i)的TCR的一种类似物。通过标准的技术，可以检测这样的结合。从已经表明能识别(i)的T细胞，可以分离这样的TCR(例如，使用本发明的方法)。然后，通过测定TCR是否抑制类似物与结合类似物的物质(例如，类似物的抗体)的结合，可以证实类似物与TCR的结合，一般地，在这样的结合测定的抑制中，类似物结合于II类MHC分子(例如HLA-DQ2)。
一般地，类似物抑制(i)与TCR的结合。在该情况下，在有类似物存在下，可以结合TCR的(i)的量会减少。这是因为，类似物能结合TCR，并因此与(i)竞争结合TCR。
从腹部疾病患者中，可以分离出在上面的结合实验中使用的T细胞，例如，在本发明的方法的辅助下。类似物的其它结合特征也可以与(i)相同，并且因而一般地，类似物结合与肽结合的相同的MHC II类分子(HLA-DQ2或-DQ8)。一般地，类似物结合对(i)特异性的抗体，并从而抑制(i)与这样的抗体的结合。
一般地，类似物是肽。它可以与(i)具有同源性，一般地，与(i)具有至少70％同源性，优选地至少80、90％、95％、97％或99％同源性，例如，在至少7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个邻接氨基酸的区域内(例如类似物和/或(i)的整个长度，或跨过接触TCR或结合MHC分子的区域)。测量蛋白同源性的方法是本领域众所周知的，且本领域的技术人员能理解，在上下文中，在氨基酸同一性(有时称作“硬同源性(hard homology)”)的基础上，计算同源性。
例如，UWGCG包提供了BESTFIT程序，其可以用于计算同源性(例如，在它的缺省设置下使用)(Devereux等(1984)Nucleic Acids Research12，p387-395)。PILEUP和BLAST算法可以用于计算同源性或比对序列(一般地，在它的缺省设置下)，例如，如Altschul S.F.(1993)J Mol Evol36：290-300；Altschul，S，F等(1990)J Mol Biol215：403-10所述。
在环球网上，通过因特网在例如“www.ncbi.nlm.nih.gov/”，可以从国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开地得到进行BLAST分析的软件。该算法包含，首先通过鉴别查询序列中长为W的短字，其在与数据库序列中相同长度的字比对时，会匹配或满足一些正值阈分数T，来鉴别高分序列对(HSP)。T被称作相邻字分数阈(Altschul等，同上)。这些初步的相邻字命中值(hit)作为开始搜索的种子，以发现含有它们的HSP。字命中值沿着每个序列向两方尽可能远地延伸，只要可以增加累积比对分数。在下述情况下，终止字命中值在每个方向的延伸：累积比对分数从它达到的最大值下降量X；由于一个或多个负分数残基比对的积累，累积分数达到0或以下；或达到任一个序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定着比对的敏感度和速度。BLAST程序使用下述缺省值：字长度(W)为11，BLOSUM62评分矩阵(见Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915-10919)比对(B)为50，期望(E)为10，M＝5，N＝4，且对比两条链。
BLAST算法进行两个序列之间的相似性的统计学分析；见例如，Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5873-5787。BLAST算法提供的相似性的一种度量是最小总和概率(P(N))，其指示着两个核苷酸或氨基酸序列偶然发生匹配的概率。例如，如果在将第一个序列与另一个序列相比较时，最小总和概率小于约1，优选地小于约0.1，更优选地小于约0.01，且最优选地小于约0.001，则认为序列与另一个序列类似。
一般地，同源的肽类似物与(i)的差异在于1、2、3、4、5、6、7、8或更多个突变(其可以是取代、缺失或插入)。关于计算同源性，可以跨过上述区域中的任一个，测量这些突变。取代优选地是“保守的”。根据下表，定义它们。在第二列的相同单元中的氨基酸，且优选地在第三列的相同行中的氨基酸，可以彼此取代。
一般地，在与(i)中的氨基酸等价位置处的类似物中的氨基酸，是相同的或保守的，其有助于结合MHC分子或负责被TCR识别。
一般地，类似物肽包含一个或多个修饰，其可以是天然的翻译后修饰或人工修饰。修饰可以提供化学部分(一般地，通过氢、例如C-H键中的氢的取代)，例如氨基、乙酰基、羟基或卤素(例如，氟)基团或碳水化合物基团。一般地，修饰存在于N或C末端。
类似物可以包含一个或多个非天然的氨基酸，例如具有与天然氨基酸不同的侧链的氨基酸。通常，非天然的氨基酸具有N末端和/或C末端。非天然的氨基酸可以是L-或D-氨基酸。
一般地，类似物具有与(i)基本上类似的形状、大小、柔性或电子构型。一般地，它是(i)的衍生物。在一个实施方案中，类似物是融合蛋白，其包含SEQ ID NO：1-1927中的任一个的序列和非-谷蛋白序列。优选地，根据该实施方案的类似物是融合蛋白，其包含SEQID NO：1578-1579、1582-1583、1587-1593、1600-1620、1623-1655、1656-1671、1672-1698、1699-1763、1764-1768、1769-1786、1787-1829、1895-1903、1906和1908-1927中的任一个的序列和非-谷蛋白序列。
在一个实施方案中，类似物是或模仿结合MHC II类分子的(i)。2、3、4或更多个这样的复合物可以彼此缔合或结合，例如，使用基于生物素/链霉抗生物素蛋白的系统，一般地，其中2、3或4个生物素标记的MHC分子结合一个链霉抗生物素蛋白部分。一般地，该类似物抑制(i)/MHC II类复合物与对该复合物特异性的TCR或抗体的结合。
一般地，类似物是抗体或抗体的片段，例如Fab或F(ab′)2片段。可以将类似物固定化到固体支持物上，尤其是模仿结合MHC分子的肽的类似物。
一般地，通过计算机方法设计类似物，并然后使用本领域已知的方法合成。或者，可以从化合物文库中选择类似物。该文库可以是组合文库或展示文库，例如噬菌体展示文库。化合物文库可以以结合到MHC II类分子(例如HLA-DQ2或-DQ8)上的形式，在展示文库中表达。通常，基于它们模仿(i)的结合特征的能力，从文库中选择类似物。因而，可以基于结合能识别(i)的TCR或抗体的能力，来选择它们。
一般地，类似物将以与试剂(i)中的任一种相同的程度被T细胞识别，例如，以至少与在本文所述的任一种测定中等价表位被识别的程度相同的程度，其中一般使用来自腹部疾病患者的T细胞。类似物可以在体内被识别至这样的程度，并从而能诱导腹部疾病症状至至少与本文提及的试剂中的任一种相同的程度(例如，在人患者或动物模型中)。
可以在包含下述步骤的方法中鉴别类似物：测定候选物质是否能被识别本发明的表位的T细胞受体识别，其中该物质的识别指示着该物质是类似物。这样的TCR可以是本文提及的TCR中的任一种，且可以存在于T细胞上。可以使用本文提及的任一种合适的测定来鉴别类似物。在一个实施方案中，体内地实施该方法。如上所述，优选的类似物被以至少与等价表位相同的程度识别，所以该方法可以用于鉴别以该程度被识别的类似物。
在一个实施方案中，该方法包含，测定候选物质是否能抑制本发明的表位的识别，其中识别的抑制指示着该物质是类似物。
试剂可以是包含至少2、5、10或20种由(i)或(ii)定义的试剂的产物。一般地，组合物包含来自不同谷蛋白的本发明的表位(或等价类似物)，例如本文提及的任何物种或种类或类型的谷蛋白。优选的组合物包含至少一种本发明的表位，或等价类似物，其来自存在于本文提及的任何物种或种类中的所有谷蛋白，或来自本文提及的物种中的2、3、4或更多种(例如来自由小麦、黑麦、大麦、燕麦和黑小麦组成的物种系列)。因而，试剂可以是单价的或多价的。
根据本发明的某些实施方案，试剂不具有或不是基于WO02/083722和/或WO01/25793和/或WO03/104273中公开的序列，和/或SEQ ID NO：1555-1577、1580-1581、1584-1586、1594-1599、1621-1622中的任一个所述的序列，和/或不是源自其序列如图10所示的A-麦醇溶蛋白的试剂。
在SEQ ID NO：1-1927中，优选的子集是SEQ ID NO：1-1763。在SEQ ID NO：1764-1927中，优选的子集是：(a)燕麦序列1764-1768，(b)黑麦序列1769-1786，(c)大麦序列1787-1829，(d)小麦序列1895-1903，(e)小麦DQ8序列1908-1927，和(f)combitope序列1906。其它优选的子集是：(a)1764-1768，(b)1769-1773，(c)1774-1786，(d)1787-1792，(e)1793-1829，(f)1830-1894，(g)1895-1903，(h)1830-1903，(i)1904-1906，(j)1908-1916，(k)1917-1927，和(l)1908-1913、1915-1923和1925-1927。
在SEQ ID NO：1578-1579、1582-1583、1587-1593、1600-1620、1623-1655、1656-1671、1672-1698、1699-1763和1764-1927中，特别优选的小麦表位是SEQ ID NO：1656-1671、1830-1903和1907-1927。
在SEQ ID NO：1830-1894(表1)中，一些序列具有N-末端和C-末端甘氨酸。本发明扩展至省略C-末端甘氨酸和/或N-末端甘氨酸的这些序列。优选地，省略C-末端甘氨酸和N-末端甘氨酸两者。
诊断
如上所述，本发明的诊断方法可以基于能结合试剂的T细胞的检测，或能识别试剂的抗体的检测。
能在本方法(其包括上述的用途)中识别试剂的T细胞通常是已经体内地对一种或多种谷蛋白预敏化的T细胞。如上所述，已经发现这样的抗原-处理的(antigen-experienced)T细胞存在于外周血中。
在本方法中，T细胞可以体外或体内地接触试剂，并可以体外或体内地测定T细胞是否识别试剂。因而，本发明提供了在人体上实践的诊断方法中使用的试剂。提供了不同的试剂，用于在这样的方法中同时、分开或先后地使用。
一般地，在加入了试剂的水溶液中实施体外方法。溶液也可以包含T细胞(以及在某些实施方案中，下面讨论的APC)。如本文使用的术语“接触”包括向溶液中加入特定的物质。
通常，通过检测在有试剂存在下T细胞状态的变化，或测定T细胞是否结合试剂，来完成T细胞是否能识别试剂的测定。通常，状态的变化是由TCR结合试剂后T细胞的抗原特异性的功能活性造成的。可以在T细胞内(例如，蛋白的细胞内表达的变化)或外(例如，检测分泌的物质)测量状态的变化。
T细胞状态的变化，可能是T细胞分泌物质的开始或增加，例如细胞因子，尤其是IFN-γ、IL-2或TNF-α。IFN-γ分泌的测定是特别优选的。一般地，通过允许它结合特异性的结合剂，然后测量特异性的结合剂/物质复合物的存在，可以检测物质。一般地，特异性的结合剂是抗体，例如多克隆或单克隆抗体。细胞因子的抗体是商业上可得到的，或可以使用标准技术制备。
一般地，将特异性的结合剂固定化到固体支持物上。允许物质结合后，固体支持物可以任选地被洗涤，以去除未特异性地结合试剂的物质。使用结合复合物的第二种结合剂，可以检测试剂/物质复合物。一般地，第二种试剂在与结合第一种试剂的位点不同的位点结合该物质。第二种试剂优选地是抗体，且用检测标记直接或间接地进行标记。
因而，第二种试剂可以被第三种试剂检测到，所述第三种试剂一般地用检测标记直接或间接地标记。例如，第二种试剂可以包含生物素部分，从而允许被包含链霉抗生物素蛋白部分的第三种试剂检测到，且一般地，碱性磷酸酶作为检测标记。
在一个实施方案中，使用的检测系统是WO98/23960所述的离体(ex-vivo)ELISPOT测定。在该测定中，T细胞分泌的IFN-γ被固定化到固体支持物上的第一种IFN-γ特异性的抗体结合。然后，使用用检测标记标记的第二种IFN-γ特异性的抗体，检测结合的IFN-γ。这样的标记的抗体可以从MABTECH(斯德哥尔摩，瑞典)得到。下面讨论了可以使用的其它检测标记。
可以测量的T细胞状态的变化可以是，T细胞对物质的摄入的增加，例如胸苷的摄入。状态的变化可以是，T细胞大小的增加，或T细胞的增殖，或T细胞上的细胞表面标记的变化。
在一个实施方案中，通过测量蛋白的细胞内表达中的变化，例如，任一种上述的细胞因子的细胞内表达的增加，来检测状态的变化。通过使T细胞的内部接触能以特异性的方式结合表达的蛋白，且其允许通过流式细胞仪分选T细胞的部分，可以检测这样的细胞内的变化。
在一个实施方案中，当结合TCR时，试剂结合MHC II类分子(一般地，HLA-DQ2或-DQ8)，所述分子一般地存在于抗原呈递细胞(APC)的表面上。但是，如本文所述，其它试剂可以结合TCR，而不需要也结合MHC分子。
通常，在本方法中接触的T细胞取自个体的血液样品，尽管可以使用含有T细胞的其它类型的样品。可以将样品直接加入测定中，或可以首先进行处理。一般地，处理可以包含，例如用水或缓冲液稀释样品。一般地，将样品稀释1.5-100倍，例如，2-50或5-10倍。
处理可以包含样品组分的分离。一般地，从样品分离单核的细胞(MC)。MC包含T细胞和APC。因而，在本方法中，存在于分离的MC中的APC，可以将肽呈递给T细胞。在另一个实施方案中，从样品中仅仅纯化T细胞，例如仅仅CD4T细胞。使用本领域已知的技术，例如Lalvani等(1997)J.Exp.Med.186，p859-865中所述的那些，可以从样品分离PBMC、MC和T细胞。
在一个实施方案中，在测定中使用的T细胞是未处理的或稀释的样品的形式，或是新分离的T细胞(例如新分离的MC或PBMC的形式)，其可以直接离体使用，即它们在用于本方法之前未经培养。因而，没有以抗原特异性的方式，体外重新刺激T细胞。但是，可以在使用前培养T细胞，例如，在有一种或多种试剂存在下，且通常也存在外源的生长促进细胞因子。在培养过程中，试剂一般地存在于APC表面上，例如在本方法中使用的APC。T细胞的预培养，可能导致本方法的敏感度的增加。因而，可以将T细胞转化成细胞系，例如短期细胞系(例如，如Ota等(1990)Nature346，p183-187所述)。
一般地存在于本方法中的APC，可以来自与T细胞相同的个体或来自不同的宿主。APC可以是天然产生的APC或人造的APC。APC是能将肽呈递给T细胞的细胞。一般地，它是B细胞、树突细胞或巨噬细胞。一般地，它和T细胞分离自相同的样品，且一般地，与T细胞共同纯化。因而，APC可能存在于MC或PBMC中。一般地，APC是新分离的离体细胞或培养的细胞。它可以是细胞系的形式，例如短期或无限增殖化的细胞系。APC可以在它的表面表达空的MHC II类分子。
在本方法中，可以使用一种或多种(不同的)试剂。一般地，可以将源自样品的T细胞与所有待测试剂一起置于测定中，或者可以分开T细胞，并置于各自含有一种或多种试剂的分开的测定中。
本发明也提供了试剂，例如上述试剂中的任一种的两种或更多种(例如存在于上面讨论的组合物试剂中的试剂的组合)，其用于同时的分开的或先后的用途(例如，体内用途)。
在一个实施方案中，将试剂本身直接加入包含T细胞和APC的测定中。如上面所讨论的，这样的测定中的T细胞和APC可以是MC的形式。当使用能被T细胞识别、且不需要由APC呈递的试剂时，则不需要APC。模仿结合到MHC分子上的原始(i)的类似物，是这样的试剂的实例。
在一个实施方案中，在没有T细胞存在下，将试剂提供给APC。然后，将APC提供给T细胞，一般地，在允许将试剂呈递到它的表面之后。肽可能已经被摄入到APC的内部，且被呈递，或被简单地摄取到表面上，而没有进入APC的内部。
试剂接触T细胞的持续时间依赖于用于测定肽的识别的方法而变化。一般地，向每个测定中，加入105-107，优选地5x105-106PBMC。在将试剂直接加入测定的情况下，它的浓度是10-1-103μg/ml，优选地0.5-50μg/ml或1-10μg/ml。
一般地，将T细胞与试剂一起温育的时间长度是4-24小时，优选地6-16小时。当使用离体PBMC时，已经发现可以在37℃将0.3x106PBMC在10μg/ml的肽中温育12小时。
通过测量试剂与T细胞的结合(这可以使用本文讨论的任何合适的结合测定格式来实现)，可以测定T细胞对试剂的识别。一般地，可以基于该结合，例如，使用FACS机器，来分选结合试剂的T细胞。如果使用试剂分选的细胞的频率在“对照”值之上，则认为存在能识别试剂的T细胞。抗原-处理的T细胞的频率通常是1/106至1/103，且因此，可以确定分选的细胞是否是抗原-处理的T细胞。
可以体内测定T细胞对试剂的识别。一般地，将试剂施用给宿主，且然后可以测量指示着试剂的识别的反应。一般地，皮内地或表皮地施用试剂。一般地，通过接触皮肤的外面来施用试剂，或者可以在药膏或敷料的辅助下，保留在该部位。或者，可以通过针，例如通过注射，来施用试剂，但是也可以通过其它方法例如冲击(ballistics)(例如，已经用于送递核酸的冲击技术)来施用。EP-A-0693119描述了可以一般地用于施用试剂的技术。一般地，施用0.001-1000μg，例如，0.01-100μg或0.1-10μg试剂。
在一个实施方案中，可以施用能体内提供试剂的产物。因而，可以施用能表达试剂的多核苷酸，一般地，以上述的施用试剂的任意一种方式。多核苷酸一般地具有下面讨论的本发明提供的多核苷酸的特征的任一种。试剂由多核苷酸体内地表达。一般地，施用0.001-1000μg，例如，0.01-100μg或0.1-10μg多核苷酸。
一般地，通过在施用部位发生炎症(例如，硬结、红斑或水肿)，指示着施用给皮肤的试剂的识别。这通常通过该部位的视觉检查来测量。
一般地，通过使来自个体的样品(例如本文提及的任何样品，其任选地以本文提及的任何方式处理过)接触试剂，并测定样品中的抗体是否结合试剂，这样的结合指示着个体患有或易感腹部疾病，来实现基于检测能结合试剂的抗体的诊断方法。可以使用任何合适的结合测定格式，例如，本文提及的任何这样的格式。
治疗
优势免疫表位和本文描述的其它表位的鉴别，允许制备治疗产物，其靶向识别该表位的T细胞(这样的T细胞是参与针对谷蛋白的免疫反应的细胞)。这些发现也允许通过抑制(通过耐受)针对表位的抗体或T细胞反应，来预防或治疗腹部疾病。
本发明的某些试剂结合识别本发明的表位(如使用上面讨论的任一种结合测定所测量的)的TCR，并造成携带TCR的T细胞的耐受。这样的试剂，其任选地与载体相结合，因此可以用于预防或治疗腹部疾病。
通常，耐受可以由相同的肽造成，所述肽可以(在被TCR识别后)造成T细胞的抗原特异性的功能活性(例如本文提及的任何这样的活性，例如细胞因子的分泌)。当在“耐受”上下文中，它们被呈递给免疫系统时，这样的试剂会造成耐受。
耐受导致免疫系统对T细胞或抗体表位的识别的降低。在T细胞表位的情况下，这是由识别表位的T细胞的缺失或无反应造成的。因此，降低由表位引起的T细胞活性(例如，如在本文提及的合适的测定中所测量的)。抗体反应的耐受，意味着当施用表位时，产生减少量的针对表位的特异性的抗体。
在这样的上下文中，将抗原呈递给免疫系统的方法是已知的，且记载在例如Yoshida等Clin.Immunol.Immunopathol.82，207-215(1997)，Thurau等Clin.Exp.Immunol.109，370-6(1997)和Weiner等Res.Immunol.148，528-33(1997)。在特定的某些施用途径中，可以造成耐受，例如经口的、经鼻的或腹膜内的。也可以通过呈递肽的树突细胞和四聚体来实现耐受。可以给个体施用造成耐受的特定产物(例如，在也包含试剂的组合物中)。这样的产物包括细胞因子，例如偏好Th2反应的细胞因子(例如，IL-4、TGF-β或IL-10)。可以以造成耐受的剂量，施用产物或试剂。
本发明提供了蛋白，其包含能作为T细胞(该T细胞识别试剂)的拮抗剂的序列。这样的蛋白和这样的拮抗剂也可以用于预防或治疗腹部疾病。拮抗剂会造成T细胞反应的降低。在一个实施方案中，拮抗剂结合T细胞的TCR(通常以与HLA-DQ2或-DQ8的复合物的形式)，但是不会造成正常的功能激活，所述功能激活会使正常的信号通过TCR细胞内的信号传导级联进行传递，这会使T细胞具有降低的功能活性(例如，对表位的识别的响应，一般地，如通过本文所述的任何合适的测定所测量的)。
在一个实施方案中，拮抗剂与表位竞争结合MHC加工和呈递途径的组分，例如MHC分子(一般地，HLA-DQ2或-DQ8)。因而，拮抗剂可以结合HLA-DQ2或-DQ8(且因而是由该MHC分子呈递的肽)或其同源物。
造成拮抗作用的方法是本领域已知的。在一个实施方案中，拮抗剂是上面提及的表位的同源物，且可以具有试剂(尤其是类似物)的任一种序列、结合或其它性质。一般地，拮抗剂与任一种上述表位(其能在T细胞中造成正常的抗原特异性的功能)的区别在于1、2、3、4或更多个突变(其中的每一个可以是取代、插入或缺失)。这样的拮抗剂在本领域中称作“改变的肽配体”或“APL”。一般地，突变是在接触TCR的氨基酸位置。
例如，拮抗剂与表位的区别可以在于序列中的取代，所述序列与A-麦醇溶蛋白的氨基酸64-67代表的序列(图10所示的A-麦醇溶蛋白的序列)等价。因而优选地，拮抗剂具有在位置64、65或67的等价物处的取代。优选地，取代是64W、67W、67M或65T。
由于个体中针对本发明的表位的T细胞免疫反应是多克隆的，所以可能需要施用超过一种拮抗剂，来造成具有不同TCR的反应的T细胞的拮抗作用。因此，可以在组合物中施用拮抗剂，所述组合物包含至少2、4、6或更多种不同的拮抗剂，所述拮抗剂各自拮抗不同的T细胞。
本发明也提供了鉴别T细胞(其能识别试剂)的拮抗剂的方法，其包含使候选物质接触T细胞，和检测该物质是否造成T细胞经历抗原特异性的反应的能力的降低(例如，使用本文提及的任何合适的测定)，其中所述能力的任何这样的降低的检测，指示着物质是拮抗剂。
在一个实施方案中，组合物中存在拮抗剂(包括特定表位的拮抗剂的组合)或耐受(T细胞和抗体耐受)试剂，所述组合物包含至少2、4、6或更多种拮抗剂或拮抗或耐受本发明的不同表位(例如，上面关于试剂讨论的表位的组合，所述试剂是包含超过一种物质的产物)的试剂。
测试组合物是否能造成腹部疾病
如上所述，本发明提供了测定组合物是否能造成腹部疾病的方法，其包含检测是否存在能被转谷氨酰胺酶修饰成包含本发明的试剂或表位的序列的蛋白序列(这样的转谷氨酰胺酶活性可以是人肠转谷氨酰胺酶活性)。一般地，这通过如下实现：使用结合测定，其中使以特异性的方式结合序列的部分接触组合物，并检测序列/部分复合物的形成，并将所述复合物用于确定试剂的存在。这样的部分可以是本文提及的任何合适的物质(或物质类型)，且一般地，是特异性的抗体。可以使用任何合适格式的结合测定(例如本文提及的那些)。
在一个实施方案中，使组合物接触至少2、5、10或更多种抗体，所述抗体对来自不同谷蛋白的本发明的表位是特异性的，例如，一系列抗体，其能识别关于本发明的试剂在上面讨论的表位的组合，所述试剂是包含超过一种物质的产物。
一般地，组合物包含来自表达能造成腹部疾病的谷蛋白的植物的材料(例如，本文提及的任一种谷蛋白或植物)。这样的材料可以是植物部分，例如收获的产物(例如，种子)。该材料可以是植物材料的加工产物(例如任何本文提及的这样的产物)，例如包含谷蛋白的面粉或食物。食物材料的加工和在合适的结合测定中的测试是常规的，例如，如Kricka LJ，J.Biolumin.Chemilumin.13，189-93(1998)中所提及的。
结合测定
通过测量结合后改变的一种或两种物质的特征，例如光谱变化，可以测定本文提及的任意两种物质的结合。
结合测定格式可以是“条带位移(band shift)”系统。这包含测定一种物质(例如候选物质)的存在是否会促进或延迟凝胶电泳过程中其它物质的前进。
格式可以是竞争结合方法，其测定一种物质是否能抑制其它物质与试剂的结合，已知所述试剂结合其它物质，例如特异性的抗体。
突变的谷蛋白
本发明提供了谷蛋白，其中已经突变了本发明的表位序列，或可以被转谷氨酰胺酶修饰以提供这样的序列的序列，从而使它不再造成能识别该表位的T细胞反应，或被其识别。在上下文中，术语识别指TCR以发生T细胞的正常的(非拮抗的)抗原-特异性的功能活性的方式结合表位。
上面讨论了鉴别其它谷蛋白中的等价表位的方法。突变的谷蛋白的野生型是会造成腹部疾病的蛋白。这样的突变的谷蛋白可以在它的整个序列或它的序列的15、30、60、100或200个邻接氨基酸内与突变的谷蛋白的野生型具有同源性，例如，达到上述的程度(关于类似物)。其它天然谷蛋白的序列是本领域已知的。
突变的谷蛋白不会造成腹部疾病，或会造成减轻的腹部疾病的症状。一般地，突变减少表位诱导T细胞反应的能力。突变的表位可以具有减小的与HLA-DQ2或-DQ8的结合，减小的被APC呈递的能力，或减小的结合识别试剂的T细胞或被其识别的能力(即造成抗原-特异性的功能活性)。因此，关于本发明的诊断方面，突变的谷蛋白或表位会在本文提及的任何测定中不表现或表现出减少的识别。
突变可以是表位中的一个或多个长为1-3、4-6、6-10、11-15或更多的缺失、添加或取代，例如，在SEQ ID NO：1-1927中的任一个中；或在其等价物中。优选地，突变的谷蛋白在SEQ ID NO：1-1927中的任一个序列中具有至少一个突变。优选的突变是在与A-麦醇溶蛋白的位置65等价的位置处(见图10)。优选地，天然产生的谷氨酰胺被取代为组氨酸、酪氨酸、色氨酸、赖氨酸、脯氨酸或精氨酸。
本发明从而也提供了谷蛋白的表位中的突变(例如本文讨论的任意序列中的任意突变)减少谷蛋白的造成腹部疾病的能力的用途，该表位是本发明的表位。
在一个实施方案中，突变的序列能起拮抗剂的作用。因而，本发明提供了包含能结合T细胞受体的序列的蛋白，该T细胞受体识别本发明的试剂，且该序列能造成携带这样的T细胞受体的T细胞的拮抗作用。
本发明也提供了蛋白，其是上面的突变的谷蛋白的片段，所述蛋白是至少7个氨基酸长(例如，至少8、9、10、11、12、13、14、15、30、60、100、150、200或250个氨基酸长)，且其包含上面讨论的减少谷蛋白被识别的能力的突变。本文提及的任一种突变蛋白(包括片段)也可以以与例如其它谷蛋白或非-谷蛋白的融合蛋白的形式存在。
与突变的谷蛋白等价的野生型蛋白一般地来自禾本科单子叶植物，例如选自下列属的植物：小麦属(Triticum)、黑麦属(Secale)、大麦属(Hordeum)、黑小麦(Triticale)或燕麦属(Avena)(例如，小麦、黑麦、大麦、燕麦或黑小麦)。例如，蛋白可以是α、αβ、β、γ或ω麦醇溶蛋白或燕麦蛋白。
试剂盒
本发明也提供了用于实现本方法的试剂盒，其包含一种或多种试剂，和任选的检测T细胞对试剂的识别的工具。一般地，为同时的、分开的或先后的应用，提供不同的试剂。一般地，检测识别的工具允许或辅助基于上面讨论的技术的检测。
因而，工具可能允许检测T细胞在识别后分泌的物质。试剂盒因而可以另外包含物质的特异性的结合部分，例如抗体。一般地，部分是对IFN-γ特异性的。一般地，将部分固定化到固体支持物上。这意味着，在结合部分后，物质会保留在分泌它的T细胞的附近。因而，在支持物上形成物质/部分复合物的“斑点”，每个斑点代表着一个分泌物质的T细胞。对斑点定量，并一般地，与对照相对比，允许测定试剂的识别。
试剂盒也可以包含检测物质/部分复合物的工具。在结合物质后，可能在部分自身发生可检测的变化，例如颜色变化。或者，可以允许直接或间接标记的用于检测的第二种部分结合物质/部分复合物，以允许斑点的测定。如上面所讨论的，第二种部分可以是对物质特异性的，但是结合物质上与第一种部分不同的位置。
固定化的支持物可以是有孔的平板，例如微量滴定板。因此，可以在平板的分开的孔中，进行每个测定。
试剂盒可以另外包含T细胞的培养基，要在检测步骤中使用的检测部分或洗涤缓冲液。试剂盒可以另外包含适用于从样品分离的试剂，例如从样品分离PBMC或T细胞。可以将试剂盒设计成允许在样品中直接检测T细胞，而不需要分离样品中的任何组分。
试剂盒可以包含允许施用试剂的工具，例如皮内的或表皮的施用。一般地，这样的工具包含药膏、敷料或一种或多种针。工具可以允许试剂的冲击送递。试剂盒中的试剂可以是药物组合物的形式。
试剂盒也可以包含对照，例如阳性或阴性对照。阳性对照可以允许测试检测系统。因而，阳性对照一般地在任一种上述的方法中模仿试剂的识别。一般地，在设计用于体外测定识别的试剂盒中，阳性对照是细胞因子。在设计用于体内检测试剂的识别的试剂盒中，阳性对照可以是大多数个体会起反应的抗原。
试剂盒也可以包含采集样品的工具，所述样品含有来自宿主的T细胞，例如血液样品。试剂盒可以包含从来自宿主的样品分离单核的细胞或T细胞的工具。
多核苷酸、细胞、转基因哺乳动物和抗体
本发明也提供了多核苷酸，其能表达，以提供试剂或突变的谷蛋白。一般地，多核苷酸是DNA或RNA，且是单链的或双链的。多核苷酸优选地包含至少50个碱基或碱基对，例如，50-100、100-500、500-1000或1000-2000或更多个碱基或碱基对。因此，多核苷酸包含编码SEQ ID NO：1-1927中的任一个序列或本文提及的任一种其它试剂的序列。在该编码序列的5′和3′，本发明的多核苷酸具有与在对应的谷蛋白基因中的这些序列的5′和3′处的序列或密码子不同的序列或密码子。
在编码肽的序列的5′和/或3′，多核苷酸具有编码或非编码序列。编码序列的5′和/或3′序列可以包含能辅助编码试剂的序列的表达(例如转录和/或翻译)的序列。多核苷酸可以能在原核或真核细胞中表达试剂。在一个实施方案中，多核苷酸能在哺乳动物细胞中表达试剂，例如人、灵长类动物或啮齿类动物(例如，小鼠或大鼠)细胞。
本发明的多核苷酸可以以显著高于背景的水平，选择性地与编码试剂所来源的谷蛋白的多核苷酸杂交。一般地，使用中等至高严格性的条件(例如，0.03M氯化钠和0.03M柠檬酸钠，在约50℃至约60℃)，进行选择性的杂交。但是，可以在本领域已知的任何合适的条件下(见Sambrook等(1989)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，进行这样的杂交。例如，如果需要高严格性，则合适的条件包括0.2x SSC，在60℃。如果需要更低的严格性，则合适的条件包括2x SSC，在60℃。
本发明的试剂或蛋白可以由本文所述的多核苷酸编码。
多核苷酸可以形成或整合进可复制的载体中。这样的载体能在合适的细胞中复制。载体可以是表达载体。在这样的载体中，本发明的多核苷酸可操作地连接到控制序列，所述控制序列能提供多核苷酸的表达。载体可以含有选择标记，例如氨苄青霉素抗性基因。
多核苷酸或载体可以存在于细胞中。这样的细胞可能已经用多核苷酸或载体转化。细胞可以表达试剂。选择细胞，以使其与所述载体相容，且可以是例如原核的(细菌的)、酵母、昆虫或哺乳动物细胞。使用常规技术，包括磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染或电穿孔，可以将多核苷酸或载体导入宿主细胞中。
本发明提供了通过重组方式生产本发明的蛋白的方法。这可以包含：(a)在允许表达蛋白的条件下，培养如上定义的转化的细胞；和优选地(b)回收表达的多肽。任选地，通过本领域已知的技术，可以分离和/或纯化多肽。
本发明也提供了TCR，其识别(或结合)试剂或它的能实现这样的识别(或结合)的片段。它们可以以本文关于本发明的蛋白所讨论的在本文提及的任何形式(例如，纯度)存在。本发明也提供了表达这样的TCR的T细胞，其可以本文中关于本发明的细胞所讨论的任何形式(例如，纯度)存在。
本发明也提供了单克隆的或多克隆的抗体，其能特异性地识别试剂(例如本发明的任一种表位)，且其能识别本发明的突变的谷蛋白(且一般地，其不能识别等价的野生型谷蛋白)，和制备这样的抗体的方法。本发明的抗体能特异性地结合本发明的这些物质。
为了本发明的目的，术语“抗体”包括抗体片段，例如Fv、F(ab)和F(ab′)2片段以及单链抗体。
生产多克隆抗体的方法包含，用免疫原免疫合适的宿主动物，例如，实验动物，并从血清分离免疫球蛋白。因此，可以给动物接种免疫原，随后从动物取出血液，并纯化IgG级分。生产单克隆抗体的方法包含，使生产需要的抗体的细胞无限增殖化。通过将来自接种的实验动物的脾细胞与肿瘤细胞相融合，可以生成杂交瘤细胞(Kohler和Milstein(1975)Nature256，495-497)。
通过常规操作，可以选择生产需要的抗体的无限增殖化的细胞。可以在培养物中培养杂交瘤，或将其腹膜内地注射，以便形成腹水，或注射进异源宿主或无免疫应答的宿主的血流中。通过人淋巴细胞的体外免疫，随后用EB病毒转化淋巴细胞，可以制备出人抗体。
为了生产单克隆的和多克隆的抗体，合适的实验动物是山羊、兔、大鼠或小鼠。如果需要，可以将免疫原作为缀合物施用，其中免疫原偶联到合适的载体上，例如，通过氨基酸残基之一的侧链。一般地，载体分子是生理上可接受的载体。可以分离得到的抗体，且如果需要，进行纯化。
本发明的多核苷酸、试剂、蛋白或抗体可以携带检测标记。允许通过视觉检查检测分泌的物质的检测标记，任选地在光学放大装置的辅助下，是优选的。一般地，这样的系统基于造成底物的颜色变化的酶标记，例如，造成底物的颜色变化的碱性磷酸酶。这样的底物是市场上可得到的，例如从BioRad。其它合适的标记包括其它酶，例如过氧化物酶，或蛋白标记，例如生物素；或放射性同位元素，例如32P或35S。使用已知的技术，可以检测上面的标记。
本发明的多核苷酸、试剂、蛋白、抗体或细胞可以是基本上纯化的形式。它们可以是基本上分离的形式，在该情况下，它们通常在制剂中包含至少80％(例如，至少90、95、97或99％)多核苷酸、肽、抗体、细胞或干物质。一般地，多核苷酸、试剂、蛋白或抗体基本上不含有其它细胞组分。在本方法中，可以以这样的基本上分离的、纯化的或游离的形式，使用多核苷酸、试剂、蛋白或抗体，或其以这样的形式存在于试剂盒中。
本发明也提供了转基因的非-人哺乳动物，其表达本发明的TCR。这可以是本文讨论的任意的哺乳动物(例如，关于抗体的生产)。优选地，哺乳动物患有或易感腹部疾病。哺乳动物也可以表达HLA-DQ2或-DQ8或HLA-DR3-DQ2，和/或可以给它饲喂包含造成腹部疾病的谷蛋白(例如，本文提及的任一种谷蛋白)的饮食。因而，该哺乳动物可以作为腹部疾病的动物模型。
本发明也提供了鉴别作为腹部疾病的治疗剂的产物的方法，其包含将候选物质施用给本发明的患有或易感腹部疾病的哺乳动物，并测定该物质是否预防或治疗哺乳动物中的腹部疾病，其中腹部疾病的预防或治疗指示着该物质是治疗产物。这样的产物可以用于治疗或预防腹部疾病。
本发明提供了治疗(包括预防性的)试剂或诊断物质(本发明的试剂、蛋白和多核苷酸)。通过将它们与药学上可接受的载体或稀释剂相混合，可以配制这些物质，用于临床施用。例如，可以配制它们，用于局部的、肠胃外的、静脉内的、肌内的、皮下的、眼内的、皮内的、表皮的或经皮的施用。可以将物质与药学上可接受的且适用于所需施用途径的载体相混合。药学上注射用的载体或稀释剂可以是例如无菌的或等渗的溶液，例如注射用水或生理盐水，或用于冲击送递的载体颗粒。
根据各种参数，尤其是根据使用的试剂，要治疗的患者的年龄、体重和状况，使用的施用模式，要治疗的状况的严重性，和需要的临床方案，可以调节物质的剂量。作为指导，通过注射施用的物质的量，合适地为0.01mg/kg-30mg/kg，优选地为0.1mg/kg-10mg/kg。
所述的施用途径和剂量仅仅作为指导，因为熟练的执业医生能容易地确定任何特定患者和状况的最佳施用途径和剂量。
因而，本发明的物质可以用在治疗人或动物身体的方法中，或在人体上实现的诊断方法中。具体地，它们可以用在治疗或预防腹部疾病的方法中。本发明也提供了试剂，其用在生产用于治疗或预防腹部疾病的药物的方法中。因而，本发明提供了预防或治疗腹部疾病的方法，其包含给需要它的人施用本发明的物质(一般地，其无毒的有效量的)。
使用标准的合成化学技术，例如通过使用自动合成仪，可以制备本发明的试剂。可以从更长的多肽例如融合蛋白制备试剂，该多肽一般地包含该肽的序列。通过例如水解多肽，例如使用蛋白酶；或通过物理地断裂多肽，可以从多肽衍生出肽。使用标准技术，例如通过使用合成仪，可以制备本发明的多核苷酸。
表达突变的谷蛋白或表达包含可以作为拮抗剂的序列的蛋白的植物细胞和植物
本发明的细胞可以是植物细胞，例如禾本科单子叶植物物种的细胞。该物种可以是其野生型形式表达谷蛋白的物种，例如本文提及的任一种谷蛋白。这样的谷蛋白可以造成人的腹部疾病。细胞可以是小麦、玉米、燕麦、黑麦、稻、大麦、黑小麦、高梁或甘蔗的。一般地，细胞是小麦属的，例如普通小麦(aestivum)、斯佩尔特小麦(spelta)、波兰小麦(polonicum)或一粒小麦(monococcum)。
一般地，本发明的植物细胞是这样的，其不表达一种或多种野生型谷蛋白(例如可以造成腹部疾病的本文提及的任一种谷蛋白)，或不表达一种或多种包含可以被识别试剂的T细胞识别的序列的谷蛋白。因而，如果野生型植物细胞不表达这样的谷蛋白，则可以改造它，来预防或减少这样的谷蛋白的表达，或改变谷蛋白的氨基酸序列，从而使它不再造成腹部疾病(一般地，通过不再表达本发明的表位)。
这可以如下实现，例如，通过将突变导入细胞中的1、2、3或更多个或所有这样的谷蛋白基因，例如，导入编码或非编码(例如，启动子)区域。这样的突变可以是本文(例如，关于同源蛋白)讨论的任意类型或长度的突变。可以以定向的方式(例如，使用定点诱变或同源重组技术)或随机的方式(例如，使用诱变剂，然后一般地，选择诱变的不再表达谷蛋白(或会造成腹部疾病的谷蛋白序列)的细胞)，来导入突变。
在表达包含能作为拮抗剂的序列的蛋白的植物或植物细胞的情况下，这样的植物或植物细胞可以表达野生型谷蛋白(例如会造成腹部疾病的那些)。优选地，通过拮抗剂序列的存在，会在摄入包含来自植物或植物细胞的蛋白的食物的个体中，造成减少的腹部疾病症状(例如无症状)。
存在于(或转化进)植物细胞中的多核苷酸通常包含能在植物细胞中表达突变的谷蛋白的启动子。依赖于所需的表达模式，启动子可以是组成型的、组织-或阶段-特异性的和/或诱导型的。例如，用CAMV35S、核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(Rubisco)ssu或组蛋白启动子，可以在植物中得到强组成型表达。同样，组织-特异性的或阶段-特异性的启动子，可以用于将本发明的蛋白的表达靶向转基因植物中的特定组织或它发育中的特定阶段。因而，例如，可以使用种子-特异性的、根-特异性的、叶-特异性的、花-特异性的等启动子。种子-特异性的启动子包括Dalta等(Biotechnology Ann.Rev.(1997)，3，PP.269-296)所述的那些。种子-特异性的启动子的特定实例是napin启动子(EP-A-0 255,378)、菜豆蛋白启动子、麦谷蛋白启动子、helianthenine启动子(WO92/17580)、清蛋白启动子(WO98/45460)、油质蛋白启动子(WO98/45461)和ATS1和ATS3启动子(WO99/20775)。
细胞可以是任意形式。例如，它可以是分离的细胞，例如原生质体，或它可以是植物组织的一部分，例如，愈伤组织，或从植物切离的组织，或它可以是整个植物的一部分。细胞可以是任意类型(例如，任意类型的植物部分)。例如，未分化的细胞，例如愈伤组织细胞；或分化的细胞，例如在胚、花粉、根、茎干或叶中发现的细胞类型。植物部分包括根；芽；叶；和参与生殖的部分，例如花粉、卵、雄蕊、花药、花瓣、萼片和其它花部分。
本发明提供了得到转基因的植物细胞的方法，其包含用本发明的多核苷酸或载体转化植物细胞，以生产转基因的植物细胞。可以使用任何合适的转化方法(在小麦的情况下，可以使用Vasil V等，Biotechnology10，667-674(1992)公开的技术)。优选的转化技术包括植物原生质体的电穿孔和粒子轰击。转化从而可以产生嵌合的组织或植物，其中一些细胞是转基因的，而一些不是。
通过本领域已知的技术，可以将本发明的细胞或由此得到的细胞再生成转基因植物。这包括使用植物生长物质例如生长素、赤霉素(giberellins)和/或细胞分裂素，以刺激转基因细胞的生长和/或分裂。类似地，可以使用诸如体细胞胚胎发生和分生组织培养的技术。再生技术是本领域众所周知的，且实例见例如，US4,459,355、US4,536,475、US5,464,763、US5,177,010、US5,187,073、EP267,159、EP604,662、EP672,752、US4,945,050、US5,036,006、US5,100,792、US5,371,014、US5,478,744、US5,179,022、US5,565,346、US5,484,956、US5,508,468、US5,538,877、US5,554,798、US5,489,520、US5,510,318、US5,204,253、US5,405,765、EP442,174、EP486,233、EP486,234、EP539,563、EP674,725、WO91/02071和WO95/06128。
在许多这样的技术中，一个步骤是形成愈伤组织，即包括扩增和/或分裂细胞的植物组织。这样的愈伤组织是本发明的另一个方面，其它类型的植物细胞培养物和植物部分也如此。因而，例如，本发明提供了转基因植物组织和部分，包括胚、分生组织、种子、茎干、根、茎、叶和花部分。它们可以是嵌合的，即它们的细胞中的一些是本发明的细胞，且一些不是。本发明的转基因植物部分和组织、植物和种子，可以是本文提及的任何植物物种。
一般地，再生操作包含借助于标记基因，选择转化的细胞。
再生步骤会产生第一代转基因植物。本发明也提供了从该第一代植物得到其它代的转基因植物的方法。它们称作后代转基因植物。通过本领域已知的任何方式，可以从第一代转基因植物得到第二代、第三代、第四代、第五代、第六代和其它代的后代植物。
因而，本发明提供了得到转基因后代植物的方法，其包含从本发明的第一代转基因植物得到第二代转基因后代植物，并任选地从这样得到的第二代后代植物得到再后一代或多代的转基因植物。
通过任何已知的技术，可以从它们的前代祖先生成后代植物。具体地，可以如下生成后代植物：(a)从属于前代的本发明的转基因植物得到转基因种子，然后通过培养转基因种子，得到属于新代的本发明的转基因后代植物；和/或(b)克隆繁殖属于前代的本发明的转基因植物，以生产属于新代的本发明的转基因后代植物；和/或(c)使属于前代的本发明的第一代转基因植物与另一种相容的植物杂交，以生产属于新代的本发明的转基因后代植物；和任选地(d)从这样得到的后代植物得到再后一代或多代的转基因后代植物。
可以以任意的组合使用这些技术。例如，可以在生成适于培养的转基因植物的过程中的不同点使用克隆繁殖和有性繁殖。具体地，可以重复回交具有农艺学上需要的特征的植物分类单位。也可以采取从植物取出细胞并从其再生新植物的其它步骤。
另外，通过在上述过程中的任何合适的阶段，转化细胞、植物组织、植物或种子，以导入需要的除本发明的多核苷酸以外的编码序列，可以导入其它需要的特征。这可以通过本文所述的导入本发明的多核苷酸的技术来实现。
例如，可以从编码其它除草剂抗性性状的转基因中，选择其它转基因，例如对下述物质的耐受性：草甘磷(例如，使用EPSP合酶基因(例如，EP-A-0,293,358)或草甘磷氧化还原酶(WO92/00377)基因)；或对fosametin的耐受性；二卤苄腈；草铵磷，例如，使用膦丝菌素(phosphinothrycin)乙酰基转移酶(PAT)或谷氨酰胺合酶基因(参见EP-A-0,242,236)；黄草灵，例如使用二氢蝶酸(dihydropteroate)合酶基因(EP-A-0,369,367)；或磺酰脲(sulphonylurea)，例如，使用ALS基因)；二苯醚例如氟锁草醚或氟硝草醚，例如，使用protoporphyrogen氧化酶基因)；二唑例如恶草灵；环状亚胺例如chlorophthalim；苯基吡唑例如TNP，或其phenopylate或氨基甲酸酯类似物。
类似地，可以导入除草剂耐受性以外的有益性质的基因。例如，可以导入昆虫抗性基因，特别地，编码苏芸金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)(Bt)毒素的基因。同样地，可以导入疾病抗性基因，例如如WO91/02701或WO95/06128所述。
一般地，在本发明的植物中表达本发明的蛋白。依赖于使用的启动子，该表达可以是组成型的或诱导型的。类似地，它可以是组织-或阶段-特异性的，即指向植物发育中的特定植物组织(例如本文提及的任一种组织)或阶段。
本发明也提供了通过收获本发明的转基因植物，并任选地进一步加工，来得到作物产物的方法。作物产物指任何可从作物植物得到的有用的产物。
含有突变的谷蛋白或包含能作为拮抗剂的序列的蛋白的产物
本发明提供了产物，其包含突变的谷蛋白或包含能作为拮抗剂的序列的蛋白。一般地，它源自或包含来自本文提及的表达这样的蛋白的植物的植物部分。这样的产物可以通过收获本发明的植物来直接得到，或通过收获并进一步加工本发明的植物来间接得到。可直接得到的产物包括谷物。或者，这样的产物可以通过收获并进一步加工来间接得到。可通过进一步加工得到的产物的实例是面粉或蒸馏的酒精饮料；用直接得到的或进一步加工的材料制作的食物产物，例如，用面粉制作的烘烤产物(例如，面包)。一般地，这样的食物产物是人个体可摄入的和可消化的(即无毒且有营养价值)。
在包含蛋白(其包含拮抗剂序列)的食物产物的情况下，食物产物也可以包含野生型谷蛋白，但是优选地，拮抗剂能在摄入这样的食物后，减少(例如，完全地)腹部疾病症状。
脱酰胺作用
当本文所述的序列包括Gln残基时，本发明也提供了这样的序列，其中Gln残基已经被脱酰胺成Glu残基。可以脱酰胺一个或多个(例如，1、2、3、4、5等)Gln残基/序列，但是当存在超过一个Gln残基时，不是必须将它们全部脱酰胺。优选地，被脱酰胺的Gln残基是对转谷氨酰胺酶的脱酰胺作用易感的那些。
在序列表中，给出了其中可以脱酰胺Gln的实例。例如，SEQ ID NO：1的残基4可以是Gln残基或Glu残基，SEQ IDNO：2的残基6可以是Gln残基或Glu残基，SEQ ID NO：6的残基4和7可以彼此独立地是Gln或Glu残基，等。对脱酰胺作用易感的Gln残基，和它们的脱酰胺的Glu副本，称作“Glx”残基。
当试剂包含超过一个Glx残基时，它们可以以任意的构型排列。例如，Glx残基可以是连续的残基，和/或可以被一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8等)其它残基隔开。如上所述，对于HLA-DQ8表位，试剂优选地包含Glx残基，其与另一个Glx残基由7个残基隔开。
优选的本发明的试剂是脱酰胺的试剂，即试剂包含一个或多个Glu形式的Glx残基。这可以通过各种方式来实现，例如通过在生产过程中包含Glu残基，或通过脱酰胺作用将Gln残基转变成Glu。通过用脱酰胺试剂处理含有对脱酰胺作用易感的Gln残基的试剂，可以实现Gln向Glu的转变。一个或多个Gln残基优选地被转谷氨酰胺酶脱酰胺成Glu，例如，如实施例中所述。
熟练的技术人员能确定试剂中的哪个特定Gln残基是对脱酰胺作用易感的，从而能确定哪个残基是由Gln残基的脱酰胺作用生成的Glu残基。例如，对转谷氨酰胺酶的脱酰胺作用易感的含有Gln的序列通常符合基序：例如，QXPX、QXPF(Y)、QXX(FYMILVW)、QXPF、QXX(FY)、PQ(QL)P(FY)P。例如，序列PQ(QL)P(FY)P促进转谷氨酰胺酶对位置2处的标有下划线的Q的脱酰胺作用。
具体地，包含SEQ ID NO：1-1927的脱酰胺的形式的试剂是优选的(其中这样的序列不是已经脱酰胺的)。最优选地，本发明的试剂包含SEQ ID NO：1-1927的转谷氨酰胺酶-脱酰胺的形式(同样，不是已经脱酰胺的)。如本文所定义的，这些试剂的类似物和等价物，也被包括在本发明的范围内。
实施例
下面的非限制性的实施例解释了本发明：
初步的麦醇溶蛋白表位筛选文库
在初步的包含长期无谷蛋白饮食的患有腹部疾病的29个HLA-DQ2+个体的实验中，使用干扰素-γELISPOT测定来初步筛选以前的Pepset(如WO03/104273所述，其在本文中引作参考)，作为肽库，且然后在15位受试者中，作为含有和没有tTG的脱酰胺作用的单个肽。该Pepset文库由652种20聚体麦醇溶蛋白肽组成，所述肽跨过在2001年9月发现的描述为小麦麦醇溶蛋白的所有Genbank条目中包含的所有独特的12聚体。从使用ClustalW软件(MegAlign)比对的排列成种系发生分组的基因-衍生的蛋白序列，“手工”设计该Pepset文库。
提供了大约0.6微摩尔652种之一的20聚体。将2种标记20聚体肽包含在每个96个的组(VLQQHNIAHGSSQVLQESTY-肽161和IKDFHVYFRESRDALWKGPG)，并通过反相-HPLC和氨基酸序列分析进行表征。这些标记肽的平均纯度分别是19％和50％。最初，将肽在乙腈(10％)和Hepes100mM中溶解至10mg/ml。在IFNγELISpot测定中与PBMC一起温育的单个肽的终浓度是20mcg/ml。通过以100：32mcg/ml的比率，与豚鼠组织tTG(Sigma T5398)一起在37℃温育2小时，将这些肽脱酰胺。在-20℃保藏肽溶液，并在使用前新解冻。在英国Oxford进行这些研究。如关于在澳大利亚Melbourne进行的实验(本文所述的所有其它研究)所述的，进行ELIspot测定。用“Melbourne”数据汇集关于受试者对单个肽的反应的“Oxford”数据，以用于随后的“EM算法”中的“最小”表位分析(见下面)。
第2轮麦醇溶蛋白表位筛选文库
根据从652种20聚体的初步的麦醇溶蛋白表位筛选文库中鉴别出的生物活性的序列，设计第2轮麦醇溶蛋白表位文库。定义了在用所有652种脱酰胺的20聚体评价的15位HLA-DQ2+受试者中，具有相当于大于最有效的麦醇溶蛋白20聚体(91：PQPFPPQLPYPQPQLPYPQP)的5％的平均生物活性的麦醇溶蛋白20聚体。由于早期的研究(见WO03/104273)表明，该Pepset的脱酰胺的库比没有脱酰胺作用更有效，所以根据基序QXPX、QXZ(FYWILVM)，其中X是脯氨酸以外的任意氨基酸，且P是脯氨酸，Z是任意的氨基酸，且FYWILVM代表着疏水氨基酸(与Vader W.等J Exp Med2002J.Exp.Med.195：643-649，PCTWO03/066079和Fleckenstein B.2002.J Biol Chem277：34109-16公开的tTG-介导的脱酰胺作用的基序一致)，鉴别出了在潜在地被tTG脱酰胺的生物活性的20聚体内的谷氨酰胺残基。
然后鉴别了12聚体肽，其中每个潜在的脱酰胺作用位点可能在位于HLA-DQ2结合沟中的9聚体的位置4、6或7(HLA-DQ2锚在这些位置，证实了对谷氨酸的偏好)。然后，用甘氨酸侧接候选物12聚体核心表位序列，随后是存在于亲本麦醇溶蛋白多肽中的N-末端残基，且在C-末端，是存在于亲本麦醇溶蛋白多肽中的C-末端残基，随后是甘氨酸(即GXXXXXXXQXXXXXXG)。
合成在位置9为谷氨酰胺或谷氨酸的肽。然后，使用来自谷蛋白攻击后的15位HLA-DQ2+腹部疾病志愿者的PBMC，在干扰素γELISPOT测定中评价肽(100mcg/ml)(+/-tTG的脱酰胺作用)。根据EM算法(见下面)，分析这些测定的结果。另外，合成了最有效的独特的肽，并纯化至＞80％(Mimotopes)，并使用来自小麦谷蛋白攻击后的15位HLA-DQ2+腹部疾病志愿者的PBMC，在干扰素γELISPOT测定中评价。
完全的谷蛋白表位筛选文库
为了使跨过所有小麦麦醇溶蛋白和麦谷蛋白、黑麦、大麦和燕麦谷蛋白-样蛋白(谷醇溶蛋白)的基本上更大的肽文库的设计可行，且为了证实来自以前的麦醇溶蛋白肽文库的数据，开发了迭代算法，以自动设计20聚体的最小集，其包括谷蛋白中的所有独特的12聚体(除信号肽序列以外)。图1显示了ScanSet算法。
该方法测试来自一组蛋白的所有可能的肽表位是否是一定范围的患者的潜在抗原。T-细胞表位的大小为9至15AA。为了测试一组蛋白中所有可能的12聚体，由于大数目迅速变得不可行。
在这里，我们使用下述事实，例如，20聚体肽可以覆盖最高达9种不同的12聚体。因此，我们开发了组合方案，以覆盖在一个蛋白家族中代表的所有可能的12聚体。
产生了20个氨基酸(20聚体)长的肽，将它们作为抗原进行测试，且其覆盖存在于蛋白组中的所有12聚体肽序列。我们将要产生的肽的长度定义为L(例如，20)，将要覆盖的表位的长度定义为S。我们开发了计算机程序，其能从一组蛋白产生所有独特地发生的L聚体。而且，我们从该组蛋白生产了所有独特地发生的S聚体。接着，我们选择了一组N个L聚体，其含有L聚体的所有序列。图1描绘了该算法如何工作。
在2003年6月16日，Genbank包含了下述物质的登记号：来自普通小麦(T.aestivum)的53α/β、53γ和2ω麦醇溶蛋白，和77LMW和55HMW麦谷蛋白，59大麦醇溶蛋白，14黑麦醇溶蛋白，和20燕麦蛋白(见图2)。共计，ScanSet鉴别了在225种谷蛋白基因产物中含有的18117种独特的12聚体。
所有独特的谷蛋白12聚体都可以被包含在2922种20聚体中。在Pepset肽文库(Mimotopes Inc.，Melbourne，澳大利亚)中合成了这些20聚体。在96个的批中(MimotopesInc.，Melbourne，澳大利亚)，合成了Pepset肽。提供了大约0.7-1.3微摩尔2922种中的每一种20聚体。在每个96个的组中，包含2种标记20聚体肽(来自每个特定平板上的94种其它肽的一种代表性的肽，和IKDFHVYFRESRDALWKGPG)，并通过反相-HPLC和质谱法进行表征。这些标记肽的平均纯度分别是36％(范围：5-68％)和64％(范围：55-71％)。
最初，将肽溶解在含水的乙腈(50％)中。将溶于含水的乙腈中的肽转移到无菌的96-孔平板，并在含有1mM钙(250mcg/ml)的无菌PBS中稀释，且然后与tTG(25mcg/ml)(SigmaT5398)一起在37℃温育6小时，再冷冻保藏(-20℃)备用。
受试者都具有活组织检查-证实的腹部疾病，且已经接受了至少6个月严格的无谷蛋白的饮食。所有受试者都具有单独的HLA-DQB01＊02(HLA-DQ2)(n＝100)或单独的HLA-DQA1＊03和HLA-DQB1＊0302(HLA-DQ8)(n＝5)。在所有情况下，在谷蛋白攻击前评价tTG-IgA，且其在正常范围内(发现30％最初的志愿者具有升高的tTG-IgA，且将其排除，因为慢性的谷蛋白暴露与不能通过短期谷蛋白攻击诱导外周血谷蛋白-特异性的T-细胞有关)。志愿者消耗Baker′s Delight“白面包块(white bread block loaf)”(每天200g，持续3天)或Uncle Toby′s燕麦(每天100g，持续3天)。除了3位受试者以外的所有人都完成了3天攻击(一位在吃了一口面包后退出，另两位在吃了最初的两片面包后呕吐。来自后两位的数据包含在随后的分析中)。在开始谷蛋白攻击后6天，抽取血液(300ml)。在我们以前的研究中，没有发现谷蛋白肽-特异性的IFNγELISpot反应，所以在该组实验中没有评价“攻击前(pre-challenge)”血液(Anderson，RP等2000.Nat.Med.6：337-342.，WO01/25793，WO03/104273)。
在96-孔平板(MAIP S-45，Millipore)中，进行IFNγELISpot测定(Mabtech，瑞典)，其中每个孔含有25mcl肽溶液和100mcl PBMC(2-8x105/孔)，所述PBMC溶于含有10％热灭活的人AB血清的RPMI中。显色并干燥后，使用MAIP自动化的ELISpot平板计数器，评价IFNγELISpot平板。然后，根据新的算法(期望最大化：EM)分析数据，以定义和定量对包含在肽文库中的9聚体序列的干扰素-γ反应(见图3和下面)。然后，根据假定T-细胞识别冗余的算法，“迭代串(Iterative Cluster)”算法(见图4和下面)，通过允许在9聚体中的任意一个位置处有具有类似化学性质的氨基酸组，或允许谷氨酸替代在任何位置处的谷氨酰胺(假定已经发生了脱酰胺作用)，合理解释9聚体肽。
由于存在来自仅仅两个HLA-DQ8+个体(其也不是HLA-DQ2+)的数据集，且它们仅仅利用来自“完全的谷蛋白表位筛选文库”的721种小麦麦醇溶蛋白20聚体，所以通过2位受试者的肽-特异性的IFNγELISPOT反应的平均排列，鉴别了生物活性的肽。对于预测可能的HLA-DQ8-限制的麦醇溶蛋白表位，假定对tTG-介导的脱酰胺作用易感的谷氨酰胺残基，占据表位的潜在9聚体核心区的位置1或9，这与HLA-DQ8结合基序和van de Wal等(van deWal，Y.等1998.J.Immunol.161(4)：1585-1588)的发现一致。
分析来自ELISpot的数据的期望最大化(EM)算法：
图3显示了分析来自使用ELISpot的测定的数据的算法。使用T-细胞测定，在96孔平板中测量了对不同肽的T-细胞反应。使用许多不同的肽抗原，在许多患者上进行测定。可以将T-细胞测定的结果总结在表中，其中行代表着肽，且列代表着患者，且单个测量值(计数)在表中(例如，见图3B)。EM算法的目的是，区分患者对肽的反应和不反应，以及估计反应的平均速度和对每种肽反应的人的比例。
对于许多不同的患者(i用于指患者)和许多不同的肽(j用于指肽)，测量了反应。每个测量值(yij)代表着来自对肽j起反应的患者i的T-细胞的计数。为了估计患者中对某种肽的测量值是否可以称作反应，或它是否更可能来自背景分布，我们为不完全数据问题提出了模型，其中yij是观察到的斑点计数，zij是未观察到的指示符，无论人i是否对肽j起反应。
将观察到的计数yij的数目建模，以符合独立的泊松分布：泊松(αi，λj)，如果患者i对肽j起反应，即zij＝1，且泊松(αi，λ0)，如果患者i对肽j无反应，即zij＝0。
·完全的数据：yij(观察到的计数)，zij(反应指示符，未观察到)。
·参数：θ＝(αi，λj，λ0，pj)
·αi：患者总体反应性
·λj：肽诱导的反应速度
·λ0：背景反应速度
·pj：对肽j起反应的人的比例
EM算法：
·最初将变量设定为随机值
·E-步骤：计算似然
·M-步骤：最大化似然函数
·迭代E-和M-步骤
发现反应性表位的最小集的迭代过程
开发了基于在EM算法中估计的T-细胞反应计算用于疫苗中的肽的最小集的程序。我们测量了对来自一组蛋白的L聚体的T-细胞反应。产生了覆盖所有可能的S聚体的肽。通过EM算法，我们为反应估计了下面的参数：反应速度、起反应的人数、起反应的人的比例。将起反应的人的比例乘以估计的反应速度，用作定义是好抗原的表位的标准。许多测量的L聚体含有相同的S聚体表位。为了发现可以解释L聚体中的所有反应的表位(S聚体)，我们选择包含在具有最高平均反应的L聚体中的S聚体。然后，我们从我们的测量中，去除含有该S聚体的所有L聚体。接着，我们在剩余的L聚体中，选择具有最高反应的S聚体。我们迭代该过程，直到不存在具有高于特定截止值的反应的S聚体。我们使用几种具有不同截止值的迭代。图4概述了该方法。可以使用这样定义的成串的L聚体的列表作为基础，以定义最佳表位，并选择起好抗原作用的肽。
小麦谷蛋白中的HLA-DQ2表位
使用在共76位HLA-DQ2+个体中在γ-干扰素ELISPOT测定中开始谷蛋白攻击后第6天收集的PBMC，鉴别小麦麦醇溶蛋白和麦谷蛋白中的HLA-DQ2表位(初步的麦醇溶蛋白表位文库：n＝15，第2轮麦醇溶蛋白表位筛选文库：n＝15，完全的谷蛋白表位筛选文库：n＝46)。汇集与腹部疾病患者中的单个肽反应有关的所有数据，并通过EM算法进行分析。
根据γ-干扰素反应的强度和起反应的个体的比例，鉴别了一系列的9聚体序列，并整理(见图5)。可以将许多鉴别的序列归入“超家族”，从而允许具有类似化学性质的几种不同的氨基酸存在于推定的表位中的任意一个位置处(见图6)。例如，在图6的“序列1”(SEQID NO：1555)P(QR)P(QE)LP(FY)PQ中，谷氨酰胺(Q)或精氨酸(R)都可在位置2，只是除了Q产生实质上更有生物活性的表位以外。
通过检查通过EM算法鉴别出的110种最“有活性的”9聚体序列，可以将9聚体基序的“列表”精简成41种9聚体，其中的许多是重叠的(例如，“序列1”和“2”(分别是SEQ ID NO：1555和1558)重叠了7个残基，且都存在于A-麦醇溶蛋白57-73QE65中)。在选择的情况下，合成了高级肽，并证实了通过EM算法鉴别的肽的生物活性(见图7)。
燕麦的燕麦蛋白中的HLA-DQ2表位
用燕麦(n＝30受试者)或小麦面包(n＝8)在HLA-DQ2+腹部疾病患者中攻击后，评价了燕麦蛋白肽。图8给出了发现的对肽的ELISPOT反应。一种反应性的燕麦蛋白肽与小麦谷蛋白的序列(SEQ ID NO：1590)是同源的。
燕麦(燕麦蛋白)高质量肽研究
结束用纯的无小麦的燕麦进行的燕麦攻击(100g/d，3天)后3天，评价高级燕麦蛋白肽(“第6天”PBMC干扰素γELISPOT反应)。根据以前使用筛选级(“第1轮”)燕麦蛋白肽文库定义的肽和潜在的脱酰胺位点，设计这些肽。存在25种肽(作为16聚体)，通过HPLC证实其纯度＞80％，并通过质谱法证实其序列。
在患有DQ2+腹部疾病的18位受试者中，对比了tTG的脱酰胺作用后对高级燕麦蛋白肽的干扰素γELISPOT反应。
燕麦攻击后优势的(＞70％最大反应)肽包括：EQQFGQNIFSGFSVQL(SEQ ID NO：1764)(11/18受试者)、QLRCPAIHSVVQAIIL(SEQ ID NO：1765)(4/18受试者)和QYQPYPEQEQPILQQQ(SEQ ID NO：1766)(3/18受试者)。2/18受试者不具有燕麦蛋白特异性的反应(通过SFU(斑点形成单位)＞3X空白来定义)，且6/18受试者的平均最大SFU小于10。两种另外的肽引起了阳性反应：QIPEQLRCPAIHSVVQ(SEQ ID NO：1767)(3/18受试者)和EQYQPEQQPFMQPL(SEQ ID NO：1768)(5/18受试者＞40％最大肽反应)。25种肽的系列包括几种与Arentz-Hansen，PLoS Medicine(Oct.2004，vol.1，issue1(84-92)中报道的肽1490(SEQYQPYPEQQEPFVQ)类似的肽，但是，该肽仅仅在1位受试者中诱导强阳性反应，而在5位受试者中是远远更弱的反应。
对高级燕麦蛋白肽的干扰素γELISPOT反应，在谷蛋白攻击之前不存在，且会受到含有抗-HLA DQ而不是抗-HLA DR抗体的PBMC的预处理的封闭。
黑麦和大麦筛选肽文库
结束黑麦(面包，100g/d，3天)或大麦(煮沸的，100g/d，3天)攻击后3天，评价黑麦醇溶蛋白和大麦醇溶蛋白20聚体第1轮肽文库(“第6天”PBMC干扰素γELISPOT反应)。尽管尚未进行使用定义表位的第2轮和第3轮肽文库的迭代分析，但发现用tTG预处理的20聚体诱导“有效的”反应，所述20聚体与小麦攻击后鉴别的生物活性肽具有相当大的结构相似性。但是，黑麦或大麦攻击后优势的肽序列不包括具有PQPQLPY序列(在小麦攻击后，发现其是优势的)的肽。在黑麦攻击后优势的(＞70％最大反应)20聚体通常是PQQLFPLPQQPFPQPQQPFP(SEQ ID NO：1769)(8/14受试者)，或偶尔的QPFPQPQQPTPIQPQQPFPQ(SEQ ID NO：1770)(4/14)、QQPQQLFPQTQQSSPQQPQQ(SEQ ID NO：1771)(1/14)、PQTQQPQQPFPQPQQPQQLF(SEQ ID NO：1772)(1/14)和/或QEQREGVQILLPQSHQQLVG(SEQ IDNO：1773)(1/14)。在至少1位受试者中观察到的大于40％最大反应的其它肽包括：
FPQQPQQPFPQPQQQLPLQP(SEQ ID NO：1774)(3/14，2＞70％)
PQQPFPQQPEQIIPQQPQQP(SEQ ID NO：1775)(5/14，3＞70％)
QQLPLQPQQPFPQPQQPIPQ(SEQ ID NO：1776)(6/14，2＞70％)
QQPQQPFPLQPQQPVPQQPQ(SEQ ID NO：1777)(3/14，1＞70％)
SIPQPQQPFPQPQQPFPQSQ(SEQ ID NO：1778)(4/14，1＞70％)
QTQQSIPQPQQPFPQPQQPF(SEQ ID NO：1779)(3/14，1＞70％)
NMQVGPSGQVEWPQQQPLPQ(SEQ ID NO：1780)(2/14，1＞70％)
VGPSGQVSWPQQQPLPQPQQ(SEQ ID NO：1781)(2/14，2＞70％)
QQPFLLQPQQPFSQPQQPFL(SEQ ID NO：1782)(1/14，1＞70％)
FPLQPQQPFPQQPEQIISQQ(SEQ ID NO：1783)(5/14，1＞70％)
PQQPQRPFAQQPEQIISQQP(SEQ ID NO：1784)(3/14，1＞70％)
SPQQPQLPFPQPQQPFVVVV(SEQ ID NO：1785)(4/14，1＞70％)
QQPSIQLSLQQQLNPCKNVL(SEQ ID NO：1786)(1/14，1＞70％)
一般地，大麦攻击后优势的肽包括6个肽基序之一，或是在大麦攻击后仅仅在17位受试者之一中是“优势的”的8种其它的单个的20聚体之一。鉴别的6个基序是：
QQPIPQQPQPY(SEQ ID NO：1787)
PFPQPQQPFPW(SEQ ID NO：1788)
LQPQQPFPQ(SEQ ID NO：1789)
PQPQQASPL(SEQ ID NO：1790)
IIPQQPQQPF(SEQ IDNO：1791)
YPEQPQQPF(SEQ ID NO：1792)
在至少1位受试者中表现出至少40％最大肽反应的大麦的大麦醇溶蛋白肽包括下面的，其中星号指示着在单个个体中表现出最大反应的8种单个的肽：
QQQPFPQQPIPQQPQPYPQQ(SEQ ID NO：1793)(8/17，2＞70％)
QQPQPFSQQPIPQQPQPYPQ(SEQ ID NO：1794)(9/17，8＞70％)
PQQPVPQQPQPYPQQPQPFP(SEQ ID NO：1795)(5/17，1＞70％)
PQPFPQQPIPQQPQPYPQQP(SEQ IDNO：1796)(6/17，2＞70％)
YPQQPQPFPQQPIPQQPQPY(SEQ ID NO：1797)(6/17，2＞70％)
QPQPYPQQPQPYPQQPFQPQ(SEQ ID NO：1798)(7/17，2＞70％)
QPQQPQPFPQQPVPQQPQPY(SEQ ID NO：1799)(5/17，2＞70％)
PQPYPQQPQPFPQQPPFCQQ(SEQ ID NO：1800)(1/17，1＞70％)*
QPFPQPQQPFPWQPQQPFPQ(SEQ ID NO：1801)(10/17，2＞70％)
PFPQQPQQPFPQPQQPFRQQ(SEQ ID NO：1802)(6/17，3＞70％)
WQPQQPFPQPQQPFPLQPQQ(SEQ ID NO：1803)(9/17，5＞70％)*
PWQPQQPFPQPQEPIPQQPQ(SEQ ID NO：1804)(1/17，1＞70％)
QQPFPQPQQPIPYQPQQPFN(SEQ ID NO：1805)(5/17，1＞70％)
PQQPQQPFPQPQQPFSWQPQ(SEQ ID NO：1806)(6/17，2＞70％)*
QPQQPFPQPQQPIPYQPQQP(SEQ ID NO：1807)(4/17，1＞70％)*
QSQQQFPQPQQPFPQQPQQP(SEQ ID NO：1808)(1/17，0＞70％)
PFPQPQQPFSWQPQQPFLQP(SEQ ID NO：1809)(1/17，0＞70％)
FPQPQEPFPQQPQQPFPLQP(SEQ ID NO：1810)(1/17，0＞70％)
PFPQPQQPFPWQPQQPFPQP(SEQ ID NO：1811)(6/17，0＞70％)
FPQYQIPTPLQPQQPFPQQP(SEQ ID NO：1812)(2/17，1＞70％)
FPLQPQQPFPQQPQQPFPQQ(SEQ ID NO：1813)(1/17，0＞70％)
QQPFPLQPQQPFPQPQPFPQ(SEQ ID NO：1814)(1/17，0＞70％)
SPLQPQQPFPQGSEQIIPQQ(SEQ ID NO：1815)(1/17，0＞70％)
PQQASPLQPQPQQASPLQPQ(SEQ ID NO：1816)(1/17，1＞70％)
PQQPPFWPQQPFPQQPPFGL(SEQ ID NO：1817)(1/17，1＞70％)*
PVLSQQQPCTQDQTPLLQEQ(SEQ ID NO：1818)(1/17，1＞70％)
RQLPKYIIPQQPQQPFLLQP(SEQ ID NO：1819)(1/17，1＞70％)
QGSEQIIPQQPQQPFPLQPH(SEQ ID NO：1820)(7/17，3＞70％)*
PQGSEQIIPQQPFPLQPQPF(SEQ ID NO：1821)(2/17，1＞70％)
QPFPTPQQFFPYLPQQTFPP(SEQ ID NO：1822)(4/17，1＞70％)
PFPQPPQQKYPEQPQQPFPW(SEQ ID NO：1823)(1/17，1＞70％)
QKYPEQPQQPFPWQQPTIQL(SEQ ID NO：1824)(1/17，1＞70％)
FQQPQQSYPVQPQQPFPQPQ(SEQ ID NO：1825)(3/17，1＞7D％)
QIPYVHPSILQQLNPCKVFL(SEQ ID NO：1826)(1/17，1＞70％)
LAAQLPAMCRLEGGGGLLAS(SEQ ID NO：1827)(1/17，1＞70％)
PYLPEELSPQYQIPTPLQPQ(SEQ ID NO：1828)(1/17，1＞70％)*
VSPHPGQQTTVSPHQGQQTT(SEQ ID NO：1829)(1/17，1＞70％)*
第2轮和第3轮小麦麦谷蛋白和麦醇溶蛋白肽文库
根据在任何受试者中诱导至少5％反应(干扰素γELISPOT)的20聚体小麦麦醇溶蛋白和麦谷蛋白肽的序列，所述反应由最有活性的转谷氨酰胺酶(tTG)预处理的(酶促脱酰胺的)20聚体肽刺激，设计第2轮小麦麦醇溶蛋白和麦谷蛋白库。在至少18位受试者中，评价所有第2轮16聚体肽。已经在10位受试者中评价了从“Oxford”麦醇溶蛋白20聚体文库产生的第2轮文库，将该数据与从用于评价新的第2轮(扩展的)麦醇溶蛋白/麦谷蛋白文库的18位受试者产生的数据合并。因此，在18位(基于“Melbourne”20聚体文库的新麦醇溶蛋白/麦谷蛋白序列)或28位受试者(基于“Oxford”20聚体文库的麦醇溶蛋白序列)中，评价了用转谷氨酰胺酶预处理的单个16聚体肽。从第2轮Oxford文库鉴别的所有16聚体，也都满足Melbourne第2轮文库的选择标准。
根据各位受试者的干扰素γELISPOT中的肽反应的“优势”，即针对个体的最大肽诱导的反应标准化的个体的PBMC对特定肽的反应百分比，分析第2轮肽文库数据。下面的表1中显示了在至少1位受试者中刺激至少40％的最大肽-特异性的反应的肽的序列。该数据集支持了与用第1轮20聚体肽文库(其使用上述的期望最大化(EM)算法)鉴别的序列一致的肽的一致性和“优势”。
表1：在第2轮文库中证实的、在任何一位受试者中具有最大活性的肽的至少40％活性的肽：根据肽家族的效力排列
肽 SEQ ID NO： ＞70％ 40-70％ 10-40％ ＜10％
G-QLPYPQP<u>Q</u>LPYPQP-G 1830 18/28 4/28 3/28 3/28
G-LQPFPQPQLPYPQP-G 1831 14/28 8/28 无 6/28
G-LQPFPQPQLPFPQP-G 1832 4/28 8/28 5/28 10/28
G-LQPFPQPQLPYLQP-G 1833 1/28 1/28 12/28 14/28
G-LQPFPQPQLPYSQP-G 1834 2/28 3/28 12/28 11/28
G-LQPFPQPQLSYSQP-G 1835 无 1/28 2/28 25/28
G-QQPFPQP<u>Q</u>QPFPWQ-G 1837 9/28 8/28 5/28 6/28
G-QQPFPQPQQPIPVQ-G 1838 8/28 5/28 7/28 8/28
G-QQPFPQPQQPFSQQ-G 1839 4/28 7/28 8/28 9/28
G-QQPFPQPQQPFCQQ-G 1840 2/28 2/28 13/28 11/28
G-GLERPWQ<u>Q</u>QPLPPQ-G 1841 2/18 1/18 无 15/18
G-QTFPHQP<u>Q</u>QAFPQP-G 1842 1/28 2/28 无 25/28
LQQQCSPVAMPQRLAR 1843 1/28 1/28 11/28 15/28
QGQQGYYPISPQQSGQ 1844 1/18 1/18 1/18 15/18
PGQGQSGYYPTSPQQS 1845 1/18 1/18 无 16/18
QGQPGYYPTSPQQIGQ 1846 1/18 1/18 1/18 15/18
GQGQSGYYPTSPQQSG 1847 1/18 无 2/18 15/18
QQGYYPTSPQQSGQGQ 1848 无 1/18 无 17/
QGQQGYYPTSPQQPPQ 1849 无 1/18 无 无
QQGYYPISPQQLGQGQ 1850 无 1/18 无 无
YVPPDCSTINVPYANI 1851 1/18 1/18 1/18 15/18
IIMQQEQQEQRQGVQI 1852 1/28 无 8/28 19/28
VAHAIIMHQQQQQQQE 1853 无 1/28 2/28 25/28
G-QPIP<u>Q</u>QPQQPFPLQ-G 1854 1/28 无 5/28
G-FPQLQQP<u>Q</u>QPFPQQ-G 1855 1/28 无 1/28 26/28
G-FPQTQQPQQPFPQQ-G 1856 无 1/28 2/28 25/28
G-QPLSQQPQQTFPQQ-G 1857 无 1/28 无 27/28
G-QQPQQQPQQPFPQQ-G 1858 无 1/28 5/28 22/28
G-FPQPQQPQQPFPQQ-G 1859 无 1/28 3/28 25/28
G-FPQPQQPQQSFPQQ-G 1860 无 1/28 1/28 26/28
G-QPQQTFP<u>Q</u>QPQLPF-G 1861 1/18 无 2/18 15/18
G-MQVDPSG<u>Q</u>VQWPQQ-G 1862 1/18 无 无 17/18
G-IQVDPSGQVQWPQQ-G 1863 1/18 无 无 17/18
G-MQADPSGQVQWPQQ-G 1864 1/18 无 无 17/18
G-MQVDPSSQVQWPQQ-G 1865 1/18 无 无 17/18
G-QQEQQIL<u>Q</u>QILQQQ-G 1866 1/18 无 无 17/18
VPLYRTTTSVPFGVGT 1867 1/18 无 无 17/18
LQTLPSMCNVYIPPYC 1868 1/18 无 无 17/18
LALQTLPAMCNVYIPP 1869 1/18 无 无 17/18
DAIRAIIYSIVLQEQQ 1870 1/18 无 无 17/18
G-QQQFSQP<u>Q</u>Q<u>Q</u>FPQP-G 1871 无 5/28 7/28 16/28
G-FFPQPQQQFPQPQQ-G 1872 无 1/28 10/28 17/28
G-FPQQPQQQFPQPQQ-G 1873 无 1/28 无 27/28
G-QQPFPQPQQQFPQP-G 1874 无 1/28 12/28 15/28
G-QPQPFLP<u>Q</u>LPYPQP-G 1875 无 4/28 9/28 15/28
G-QQPFPQP<u>Q</u>QQLPQP-G 1876 无 3/28 6/28 19/28
G-LPFPQQP<u>Q</u>QPLPQP-G 1877 无 2/18 4/18 12/18
G-QQAFPQP<u>Q</u>QTFPHQ-G 1878 无 3/28 8/28 17/28
G-QQPFTQPQQPTPIQ-G 1879 无 1/28 4/28 23/28
G-QQIFPQPQQTFPHQ-G 1880 无 1/28 10/28 17/28
G-QQQFIQP<u>Q</u>QPFPQQ-G 1881 无 2/28 11/28 15/28
G-QPFPLQPQQPFFQQ-G 1882 无 2/28 7/28 19/28
G-QPFPWQPQQPFPQQ-G 1883 无 2/28 8/28 18/28
G-QPTPIQPQQPFPQQ-G 1884 无 2/28 5/28 21/28
G-QVSFQQP<u>Q</u>Q<u>Q</u>YPSP-G 1885 无 2/28 4/28 22/28
G-FFQQPQQQYPSSQQ-G 1886 无 1/28 1/28 26/28
G-GKSQVLQ<u>Q</u>STYQLL-G 1887 无 2/18 1/18 15/18
GQVVNNHGQTVFNDIG 1888 无 1/18 4/18
G-QPQLPFP<u>Q</u>QPQQQF-G 1889 无 1/28 2/28 25/28
G-QPFPQPQQAQLPFP-G 1890 无 1/28 2/28 25/28
G-HQQPGQR<u>Q</u>QGYYPT-G 1891 无 1/18 1/18 16/18
G-HQQFP<u>Q</u>Q<u>Q</u>IPVVQP-G 1892 无 1/18 1/18 16/18
LEAVTSIALRTLPTMC 1893 无 1/18 1/18
G-QQPQFSQ<u>Q</u>Q<u>Q</u>IPVI-G 1894 无 1/18 无 17/18
由74种肽组成的第3轮肽文库，基于第2轮文库中发现在任意的受试者中诱导对任意肽的最大反应的至少10％结构上不同的序列。这些肽对应着野生型(未脱酰胺的)序列，后者实际上与在第2轮文库中使用的那些相同。该文库的独特的特征是，它由通过HPLC证实纯度＞80％、并通过质谱法证实了序列的肽组成。
在14位受试者中，对比了对tTG的脱酰胺作用后第3轮文库肽的干扰素γELSIPOT反应。再次，在9/14位受试者中，包含PQPQLPY基序的序列是“优势的”。但是，PFPQPQQPFPW(SEQ ID NO：1895)在1/14受试者中，PFPQQPQQPFPQ(SEQ ID NO：1896)在1/14中，PQPFLPQLPYPQP(SEQ ID NO：1897)在1/14中，QPFPQPQQPQQP(SEQ ID NO：1898)在4/14中(包括PQPQLPY肽在其中不是有效的表位的3位受试者)SGQGVSQSQQQSQQQ(SEQ ID NO：1899)在2/14中(包括PQPQLPY肽在其中不是有效的一位)，QYEVIRSLVLRTLPNM(SEQ ID NO：1900)和GLARSQMLQQSICHVG(SEQ ID NO：1901)各自在PQPQLPY肽在其中不是有效的表位的一位(相同的)受试者中，RTTTSVPFGVGTGVGA(SEQ ID NO：1902)在1/14受试者中，且AIHTVIHSIIMQQEQQ(SEQ ID NO：1903)在1/14受试者中，刺激＞70％的最大反应。
许多在第3轮中测试的序列在结构上是相关的，且根据某些序列的“相关性”，存在或不存在单个受试者的反应，暗示着由体内谷蛋白攻击诱导的谷蛋白特异性的T细胞识别的肽的冗余。
对第3轮肽的干扰素γELISPOT反应，在谷蛋白攻击之前不存在，且受到含有抗-HLA DQ而不是HLA DR抗体的PBMC的预处理的封闭。
Combitopes
通过对比小麦(n＝16HLA DQ2腹部疾病受试者)、黑麦(n＝17)或大麦(n＝13)攻击后对下述序列的干扰素γELISPOT反应，解决了表位冗余的问题和在设计用于结合“独特的”优势表位的肽的诊断和治疗中的潜在应用：QLQPFPQPELPYPQPQL(SEQ ID NO：1904)(“P04724E”)、QPEQPFPQPEQPFPWQP(SEQ ID NO：1905)(“626fEE”)和QLQPFPQPELPYPQPFPQQPEQPFPQPEQPFPWQP(SEQ ID NO：1906)(“Combitope”)。黑麦和大麦攻击后，对P04724E和626fEE的中值ELISPOT反应(斑点形成单位)的总和，几乎与对类似的(最佳的)浓度的Combitope的反应相同(分别是99％和102％)。但是，小麦攻击(n＝16受试者)后，中值P04724E反应是对Combitope的反应的89％，且中值626fEE反应是对Combitope的反应的70％。这些发现与小麦攻击后而不是黑麦或大麦攻击后这些有关的表位序列P04724E和626fEE的相当大冗余相一致，且结合更长的肽中的优势表位序列，不会减少它们的生物利用度。因此，源自选择的有效表位的combitope，可以是基于T细胞表位的腹部疾病的治疗剂和诊断剂的有效送递装置。
与HLA-DQ8+腹部疾病有关的小麦谷蛋白中的表位
使用谷蛋白攻击后2个个体(一个是HLA-DQ8纯合的，而一个是HLA-DQ8杂合子)的PBMC，鉴别了小麦麦醇溶蛋白中的表位。其它HLA-DQ8(不是DQ2)腹部疾病个体中诱导的T-细胞反应，对谷蛋白攻击较弱地反应，且它们的数据不允许详细的分析。
包含核心序列QGSFQPSQQ(SEQ ID NO：1907)的脱酰胺的20聚体，其与已知的HLA-DQ8-限制的α-麦醇溶蛋白表位(其中为了最佳的活性，Q1和Q9是由tTG脱酰胺的)相对应，适当地诱导强肽反应。但是，一系列的“核心”肽与源自γ和ω麦醇溶蛋白的20聚体中的更有效的反应有关(见图9)。最有效的肽在序列中具有暗示着对脱酰胺作用的易感性的谷氨酰胺，其与也对脱酰胺作用易感的第二个谷氨酰胺由7个残基(如在QGSFQPSQQ(SEQ ID NO：1907)中发现的)隔开，表明在由tTG脱酰胺后，这些脱酰胺的序列会变成HLA-DQ8的高亲和力结合剂(HLA-DQ8的结合基序偏好位置1和9处的谷氨酸)。另一组20聚体具有对脱酰胺作用易感的谷氨酰胺残基，但是其与对tTG-介导的脱酰胺作用易感的第二个谷氨酰胺未由7个残基隔开。
HLA DQ8腹部疾病麦醇溶蛋白和麦谷蛋白表位
具有HLA DQ2和HLA DQ8等位基因的5位腹部疾病受试者经历了小麦谷蛋白攻击。使用来自2位初始攻击的受试者的PBMC，筛选第1轮“Melbourne”小麦麦醇溶蛋白20聚体文库。通过在包括2位最初的受试者的5位HLA DQ8+DQ2-CD受试者中，筛选基于第1轮文库中的反应性的20聚体的第2轮文库，进一步仔细分析使用来自这两位HLA DQ8CD受试者的PBMC鉴别的20聚体序列。第2轮文库由筛选级重叠16聚体和预期与tTG-介导的表位的脱酰胺产物的13聚体组成，所述表位具有位置1和/或位置9处的谷氨酰胺的脱酰胺潜力(与HLA DQ8肽结合基序相一致)。另外，在这5位受试者中，也筛选了“Melbourne”小麦谷蛋白文库中的1400种麦谷蛋白(HMW和LMW)tTG-预处理的20聚体。
最有效的和始终如一地优势的麦醇溶蛋白16聚体是有关的序列VYIPPYCTIAPFGIFG(SEQ ID NO：1908)(3/5受试者对最大麦醇溶蛋白16聚体＞70％反应)和也在3/5受试者中优势的AMCNVYIPPYCAMAPF(SEQ ID NO：1908)(4/5受试者生成了对这些肽中的一种或两种的优势反应)。另外，鉴别了源自以前鉴别的生物活性的20聚体的一系列肽，其在ELISPOT中的反应被增强，或对特定的脱酰胺的谷氨酰胺残基是允许的：(QE)QPTPIQP(QE)(SEQ ID NO：1909)、(QE)QPFPLQP(QE)(SEQ ID NO：1910)、(QE)QPIPVQP(QE)(SEQ ID NO：1911)、(QE)QPQQPFP(QE)(SEQ ID NO：1912)、(QE)QP(QE)LPFP(QE)(SEQ IDNO：1913)、(QE)GSFQPSQ(QE)(SEQ ID NO：1914)(以前公布的HLA DQ8表位，van derWal1998)、(QE)LPFP(QE)QP(QE)(SEQ ID NO：1915)和(QE)QPFP(QE)QP(QE)(SEQ ID NO：1916)。
筛选麦谷蛋白20聚体文库，鉴别出了另一系列的序列，其在5位受试者中的至少一位中是优势的。优势的20聚体肽共有基序，且具有序列：PQQQQQQLVQQQ(SEQ ID NO：1917)、QGIFLQPH(LQ)I(AS)QLEV(SEQ ID NO：1918)、QPGQGQQG(HY)Y(SEQ ID NO：1919)、QSRYEAIRAII(FY)S(SEQ ID NO：1920)、RTTTSVPFD(SEQ ID NO：1921)、QPPFWRQQP(SEQ IDNO：1922)、Q(PS)(PS)(FI)(PS)QQQQ(SEQ ID NO：1923)、(QPLR)GYYPTSPQ(SEQ ID NO：1924)(以前鉴别的HLA DQ8表位，van der Wal2001)、QGSYYPGQASPQ(SEQ ID NO：1925)、GYYPTSSLQPEQGQQGYYPT(SEQ ID NO：1926)和QGQQLAQGQQGQQPAQVQQG(SEQ ID NO：1927)。在用转谷氨酰胺酶预处理后，评价了麦谷蛋白肽。由此，不知道对这些表位的脱酰胺作用的需要。
在开始体内谷蛋白攻击后6天，已使用来自HLA DQ2+(且在一些情况中为HLA DQ8+)腹部疾病志愿者的T细胞，评价了“未表征的”筛选级肽的详尽文库，所述文库包括由存在于Genbank中的基因编码的所有独特的12聚体序列，所述序列定义为(制备面包的)小麦(普通小麦(Triticum aestivum))、黑麦、大麦或燕麦谷蛋白，麦醇溶蛋白，麦谷蛋白，黑麦醇溶蛋白，大麦醇溶蛋白，或燕麦蛋白。已经在HLA DQ2腹部疾病中鉴别出了相对一致模式的表位级系，所述级系类似于在腹部疾病中消耗其它有毒的谷物后的级系但与其不相同。小麦攻击后，具有序列PQPQLPY的肽，在至少三分之二HLA DQ2+腹部疾病中是优势的，但是其它表位偶尔是优势的，而PQLPY肽在少于1/6的患有腹部疾病的HLA DQ2+受试者中基本上是无活性的。筛选大量(例如，＞30)受试者后，能更好地评价罕见的优势表位的贡献(进行中)。黑麦和大麦消耗后的表位级系类似于小麦消耗后的，不同之处在于，类似于麦醇溶蛋白/大麦醇溶蛋白/黑麦醇溶蛋白序列PQPQQPFP或PFPQQPQQP(而不是PQPQLPY(小麦α-麦醇溶蛋白独有的序列))的脱酰胺的肽，通常是优势的。包含一系列的和部分重叠的谷蛋白表位的Combitope，与单独的单个表位的活性相同或更高，并提供有效地送递多种用于T细胞识别的谷蛋白表位的工具。因此，这样的combitope可以用于设计和送递腹部疾病中的肽治疗，其靶向多种独特的T细胞表位。
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在本文中引用的或参考的每篇PCT公开物、美国专利、其它专利、期刊和任何其它出版物，均在本文中整体引作参考。

Claims (15)

1.分离的抗原肽，其包含表位，所述表位包含转谷氨酰胺酶-脱酰胺的SEQ ID NO：1787的序列，其中所述肽的长度不超过20个氨基酸。
2.权利要求1的分离的抗原肽，其中所述肽的长度为15个氨基酸。
3.权利要求1或2的分离的抗原肽，其中所述肽进一步包含添加到所述肽的N-末端和/或C-末端的非天然的氨基酸。
4.权利要求3的分离的抗原肽，其中所述非天然的氨基酸添加到所述肽的N-末端。
5.权利要求3的分离的抗原肽，其中所述非天然的氨基酸添加到所述肽的C-末端。
6.权利要求3的分离的抗原肽，其中所述非天然的氨基酸添加到所述肽的N-末端和C-末端两者。
7.权利要求1或2的分离的抗原肽，其是HLA-DQ2-限制的。
8.权利要求1或2的分离的抗原肽，其是HLA-DQ8-限制的。
9.权利要求1或2的分离的抗原肽，其中所述肽包含小麦表位。
10.权利要求1或2的分离的抗原肽，其中所述肽包含燕麦表位。
11.权利要求1或2的分离的抗原肽，其结合到HLA分子或能结合所述肽的HLA分子的片段上。
12.组合物，其包含权利要求1-11任一项的分离的抗原肽和药学上可接受的载体或稀释剂。
13.权利要求12的组合物，其进一步包含另一种分离的抗原肽，其中所述组合物的一种肽是HLA-DQ2-限制的，且另一种是HLA-DQ8-限制的。
14.权利要求12的组合物，其进一步包含另一种分离的抗原肽，其中一种肽包含小麦表位，且另一种包含大麦表位。
15.权利要求12-14任一项的组合物，其为适合注射的形式。
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