KR101736744B1 - 셀리악병 진단용 프라이머 세트와 이를 이용한 셀리악병 진단방법 - Google Patents

셀리악병 진단용 프라이머 세트와 이를 이용한 셀리악병 진단방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 글루텐(gluten) 성분에 민감한 셀리악병(celiac disease) 진단용 프라이머 세트와 이를 이용한 셀리악병 진단방법에 관한 것으로, 셀리악병과 관련된 HLA-DQ2(DQA1*0501/0505, DQB1*0201/0202), HLA-DQ8(DQA1*0301/DQB1*0302) 및 DR4(DRB1*04)에 존재하는 대립유전자(allele)를 PCR-SSP 기법을 사용하여 글루텐 성분에 민감한 셀리악병을 진단하는 것을 특징으로 한다.
따라서, 기존의 검사법인 알러지 피부검사, 혈청학적 특이 면역검사 및 점막조직검사에 비해 민감도와 특이도가 높고, 검체로부터 짧은 시간내에 간편하고 신속하게 DNA를 검출할 수 있다는 장점이 있다.

Description

셀리악병 진단용 프라이머 세트와 이를 이용한 셀리악병 진단방법 {Diagnosis primer set for celiac disease and detecting methods using it}
본 발명은 글루텐(gluten) 성분에 민감한 셀리악병(celiac disease) 진단용 프라이머 세트와 이를 이용한 셀리악병 진단방법에 관한 것으로, 더 구체적으로 셀리악병과 관련된 HLA-DQ2(DQA1*0501/0505, DQB1*0201/0202)와 HLA-DQ8(DQA1*0301/DQB1*0302) 및 DR4(DRB1*04)에 존재하는 대립유전자(allele)를 PCR-SSP 기법을 사용하여 HLA 유전자의 변이 유무를 분석함으로써 글루텐 성분에 민감한 셀리악병을 진단할 수 있는 프라이머 세트와 이를 이용한 셀리악병 진단방법에 관한 것이다.
셀리악병(celiac diseasece)은 밀, 보리, 호밀, 귀리 등의 곡물에 많이 함유되어 있는 글루텐(gluten) 성분의 소화장애로 발생하는 소화기관의 장질환이다. 대부분의 사람들은 아무런 문제없이 글루텐을 소화하고 흡수시키지만, 글루텐 소화에 문제가 있는 사람들은 위장관에서 면역반응을 유발하여 소화기관의 점막세포에 염증과 융모를 손상시켜 영양분을 쉽게 흡수할 수 없는 상태가 되어 성장지연, 식욕저하, 만성설사, 복부팽창, 포진성 피부염, 철분결핍으로 인한 빈혈 등 다양한 증상을 일으키고, 이로 인한 영양분의 흡수불량은 결국 심각한 질병을 유발시키는 원인으로 작용한다(Luis Rodrigo. World J. Gastroenterol., 2006;7(12):6585-6593., Husby, A et al., JPGN. 2012;54: 136-160).
즉, 글루텐을 분해하는 효소가 선천적으로 없거나 부족한 사람이 섭취하게 되면 글루텐이 덩어리진 상태로 장에 흡수되는데 이때 장기능의 저하로 점막 융모가 위축되고 손상이 일어나 흡수장애가 생겨 알러지 반응이나 호르몬 교란 등을 일으키기 때문이다(Bana Jabri and Ludvig M. Sollid. Nature Reviews Immunology. 2009 Vol.9:858-870., Hadi Peyman et al. Clinical & Translational Allergy. 2011:P27).
셀리악병 유병율은 미국의 경우 약 3 백만명 이상, 캐나다는 약 30 만명 그리고 유럽도 88∼262 명 중에서 1 명 정도가 셀리악병을 앓고 있으며, 세계인구의 평균 유병율은 약 1%로 보고되어 있으나, Naiyana Gujral 등(World J. Gastroenterol. 2012,14;18:6036-6059)이 HLA-DQ2와 HLA-DQ8 아형(subtype)의 출현빈도를 근거로 자료에 의하면, 한국, 일본, 인도네시아, 중국, 필리핀 등은 약 5% 에서 많게는 20% 까지 그리고 미국, 캐나다 및 유럽 등은 약 20% 정도가 나타난다고 보고함에 따라 실제 셀리악병 유병율은 훨씬 더 높을 것으로 조사되고 있다.
셀리악병은 모든 연령에서 발병할 수 있으나 생후 10∼11개월 정도의 어린이가 밀가루 등에 함유되어 있는 글루텐을 섭취하기 시작하면서 증상이 나타나기 시작한다. 특히, 유전적 소인이 있는 영아의 경우는 글루텐이 포함된 곡분을 3개월 이전이나 7개월 이후에 처음 먹으면 셀리악병에 걸릴 위험이 더 증가하며, 이후 성장기 및 성인이 된 이후에도 표 1과 같이 다양한 증상을 나타난다. 특히, 고위험군의 경우 발병율은 더 증가하는 것으로 보고되어 있다(Muralidhar Jatla & Ritu Verma., Practical Gasroenterology. 2008(4):18-34., Husby, A et al., JPGN. 2012;54:136-160).
성장기 성 인 고위험군
피로
(fatigue)
복통
(abdominal pain)
다운, 터너증후군
(down’s & turner syndrome)
복부팽만
(bloating)
체중저하
(weight loss)
윌리엄 증후군
(williams syndrome)
변비
(constipation)
만성설사
(chronic diarrhea)
자가면역 갑상선질환
(autoimmune thyroid disease)
복통
(abdominal pain)
불임, 유산
(infertility & abortion)
만성활동간염
(chronic active hepatitis)
만성설사
(chronic diarrhea)
빈혈, 우울증
(anemia & depression)
제1형 당뇨병
(type 1 diabetes mellitus)
과민성
(irritability)
포진피부염
(dermatitis herpetiformis)
림프구성 대장염
(lymphocytic colitis)
성장지연
(growth failure)
관절염, 골다공증
(arthritis & osteoporosis)
만성피로 증후군
(chronic fatigue syndrome)
골감소증
(osteopenia)
피로, 불쾌감
(fatigue & malaise)
면역글로불린 a결핍증
(IgA deficiency)
치아이상
(dental anomalies)
아프타 구내염
(aphthous stomatitis)
쇼그렌 증후군
(sjogren’s syndrome)
사춘기 지연
(delayed puberty)
탈모
(alopecia)
확장형 심근증
(dilated cardiomyopathy)
그러나 문제는 대부분의 사람들이 셀리악병이 있다는 사실을 모르거나 혹은 셀리악병이 있더라도 증상이 경미해 진단하지 못하거나 또는 다른 소화기관의 질병으로 오인하기도 하는 경향이 있다는 것이다.
여러 질환에 있어서 질병감수성과 연관된 유전적 인자로 가장 널리 알려진 것은 사람의 주조직적합복합체(major histocompatibility complex, MHC) 유전자 산물인 인간백혈구항원(human leukocyte antigen, HLA)이다. HLA는 펩타이드 항원을 T-림프구의 T 세포 수용체에 전달하는 당단백 물질로서 class I과 class II의 2군으로 분류되며, 세포매개성 면역반응 유도에 중요한 역할을 담당하여 각종 질환에 대한 유전적 연관성을 연구하는데 널리 사용되고 있는 분야이다.
셀리악병은 HLA의 상호작용과 여러 환경요인들에 의해 복합적으로 일어나지만, 특히, class I에 위치하고 있는 DQ2와 DQ8 좌위가 직접적으로 연관되어 있어 HLA-DQ2에서는 90% 이상 DQ8은 10% 미만 그리고 class II의 DR4에서도 셀리악병과 높은 연관성이 있는 자가면역질환이다(Margarida, Maria, Castro-Antunes et al. Clinics., 2011:66(2) :227-231., Francesca Megiorni et al. Human Immunology. 2009;70:55-59., Husby, A et al., JPGN. 2012;54:136-160).
미국, 캐나다 및 유럽연합 등에서는 식품 알러지와는 별개로 셀리악병에 대한 국민건강과 중요성을 인식하고 DNA 검사를 통해 글루텐 성분에 대한 자가면역성이 있는지 여부를 진단하고 있으며, 셀리악병을 가진 사람을 위한 글루텐 식품의 성분 표시에 관한 규정이 의무적으로 시행되고 있는 추세이다(Husby, S. et al., JPGN. 2012;54:136-160., Nils Reinton. et al., Journal of Immunological Methods. 2006. 316:125-132).
국내의 식품의약품안정청에서도 셀리악병에 대한 문제점을 인식하고 글루텐에 민감한 사람이 식품 섭취시 무글루텐(gluten free) 제품을 선택할 수 있도록 공고(식품의약품안전청 공고 제2011-179호)하였으나, 셀리악병을 체계적으로 검사할 수 있는 방법이 제시되지 못해 효과가 미진한 상태이다.
한국인의 주식은 쌀이지만, 밀이 쌀에 이어 가장 많이 섭취하는 제2의 식량으로 소비량이 증가하면서 이로 인한 부작용 즉, 글루텐 소화장애로 인한 셀리악병 환자가 점차 증가하고 있다. 그러나 아직 국내에서는 세리악병을 구체적으로 검사할 수 있는 방법의 개발이 이루어지지 못해 병원 등 의료기관에서 검사의 필요성이 있음에도 도입하지 못하고 있다. 일부 병원에서 셀리악병 진단을 위해 알러지 피부검사, 혈청학적 특이 면역검사 및 점막조직검사를 제한적이나마 시행하여 왔으나 검사결과의 부정확성과 여러 검사를 병행해야 하고 환자에게 많은 비용적 부담을 줄 수 있다는 단점이 있었다.
그동안 외국의 여러 회사(INNO-LiPA, Dynal, Olerup, SeCore, Biofortuna)에서는 셀리악병, 골수이식, 장기이식, 질병 감수성 등 면역반응 검사를 위해 HLA 유전자 검사법이 연구되어 상업적으로 DNA 키트를 시판하고 있다. 그러나 이들 DNA 키트는 1) 셀리악병과 관련된 HLA 형 이외에 불필요한 유전자가 다수 포함하고 있고, 2) 제한된 사용량에 비해 너무 고가로 판매되며, 3) 검체종류(혈액, 모근, 구강상피세포 등)에 따라 해상도가 낮으며, 4) 검출방법 차이로 인한 결과의 해석 오류, 5) 고가의 장비와 시약이 소모되는 염기서열분석(sequence based typing) 또는 하이브리드 분석(hybridization assay) 방식을 사용해야 하므로 효율성과 실용성이 떨어지고, 6) 해석법이 명확하게 제시되어 있지 않아 사용상 한계점 및 문제점이 지적되었다.
또한 최근에 새로운 셀리악병 검사법으로 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR)을 이용한 검출법(Profaizer. T, Eckels, D & Delgado, J, C. Tissue Antigens. 2011;78(1),31-37., Reinton. N, Helgheim. A, Shegarfi. H, Moghaddam. A. J, of Immun. Methods. 2006:316(1) 125-132; Reinton.N, Helgheim. A, Shegarfi. H, Moghaddam, A.J Immunol Methods. 2006(316):1-2)이 보고되어 있으나, Rea-time PCR 방법은 고가의 장비를 필요로 하고, 형광색이 표지된 프러브(Probe)를 별도로 제작 및 합성해야 하며, HLA 유전자의 변이가 여러 곳에 존재할 경우 여러 번에 걸쳐 분석을 해야 하므로 탐지가 어렵고, 고가의 시약비가 많이 소모된다는 단점이 있었다.
국내의 경우 셀리악병 진단을 목적으로 특허신청 후에 공개된 사항(10-2013-0041477)이 있으나, 이 방법은 HLA-DQ2와 HLA-DQ8 두 좌위에 속한 대립유전자를 분석하여 그 결과를 해석함으로써 다소 정확도가 결여된다는 단점이 있다.
본 발명의 목적은 글루텐 성분이 함유된 곡물과 음식물을 섭취했을 때 민감한 반응을 나타내는 셀리악병을 HLA-DQ2(DQA1*0501/0505, DQB1*0201/0202)와 HLA-DQ8(DQA1*0301/DQB1*0302) 및 DR4(DRB1*04)에 존재하는 대립유전자(allele)를 이용한 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용하여 대립유전자를 검출하고 셀리악병 진단방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 프라이머 세트는, 서열번호 1 내지 2의 염기서열을 갖는 프라이머, 서열번호 3 내지 4의 염기서열을 갖는 프라이머, 서열번호 5 내지 6의 염기서열을 갖는 프라이머, 서열번호 7 내지 8의 염기서열을 갖는 프라이머 및, 서열번호 9 내지 10의 염기서열을 갖는 프라이머을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 셀리악병 진단방법은, HLA-DQ2(DQA1*0501/0505, DQB1*0201/0202), HLA-DQ8(DQA1*0301/DQB1*0302) 및 DR4(DRB1*04)에 존재하는 대립유전자(allele)의 염기서열을 특이적 프라이머 세트에 의해 PCR-SSP 방법으로 동시에 증폭하고 증폭산물의 검출결과를 확인하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 셀리악병 진단방법은, (a) 분석하고자 하는 검체로부터 DNA를 얻는 단계; (b) 상기 프라이머 세트를 설계하고 합성하는 단계; (c) (b)를 이용하여 PCR-SSP 방법으로 멀티플렉스 반응액을 조성하여 DNA 단편을 동시에 증폭하는 단계; (d) 증폭산물을 전기영동하여 각 대립유전자의 DNA 단편을 분리하고 검출하는 단계 및; (e) 각 대립유전자의 증폭산물을 정제하여 염기서열을 분석하는 단계; (f) 검출된 대립유전자의 조합에 의한 셀리악병 위험정도를 해석하는 단계; (g) 본 발병을 사용한 대립유전자의 민감도, 특이도 및 정확도를 분석하는 단계를 포함한다.
상기 (a)단계에서 DNA는 사람의 인체조직에서 얻을 수 있으며, 가장 바람직하게는 모근, 구강상피세포 또는 혈액으로부터 얻는다.
상기 (b)단계에서의 프라이머 세트 선정은, HLA 중에서 DQA1 좌위 49개와 DQB1 좌위 182개 그리고 DR4 좌위 27개 대립유전자의 염기서열을 비교 분석하여 각 대립유전자의 변이 여부에 의해 특이적으로 결합할 수 있는 염기서열을 프라이머로 설계한다.
상기 (c)단계는, 종합적인 증폭조건(시료 DNA 농도, 프라이머 농도, dNTP, 결합반응(annealing) 온도)들을 고려하여 PCR 증폭을 위한 멀티플렉스 반응액을 만든 다음, PCR-SSP 기법으로 증폭한다.
상기 (d)단계는, PCR 증폭산물은 아가로스겔 전기영동으로 각 특이적인 프라이머 세트에 의한 대립유전자를 분리하고 검출한다.
상기 (e)단계에서, 각 대립유전자의 염기서열 분석은 증폭산물의 증폭반응에 의한 검출결과가 정확하게 이루어졌는지를 분별한다.
상기 (f)단계는, 각 대립유전자형의 검출 유무를 조합하여 셀리악병 위험군 해석기준에 의해, 구체적으로 대립유전자의 조합형에 의한 위험정도를 판정한다.
상기 (g)단계의 민감도, 특이도 및 정확도의 검증은 유전자형이 확인되어 있는 표준세트(standard set, UCLA DNA reference panel)와 Olerup SSP(Sweden)사에서 제작된 HLA 키트를 사용하여 비교 분석한다.
본 발명은 HLA-DQ2와 HLA-DQ8 두 좌위 이외에 DR4 좌위를 추가하여 셀리악병과 관련된 대립유전자를 검출하고 해석기준을 세분화하여 기존의 방법에 비해 민감도, 특이도 및 정확도를 더 향상시켰다. 또한 기존에는 PCR-SSP 검출을 위해 단일 프라이머를 반응액으로 사용하였으나, 본 방법은 멀티플렉스(multiplex)로 반응액을 조성하여 검출함으로써 간편성과 효율성을 더 향상시켰다는 장점이 있다.
따라서 본 발명은 자동염기서열분석기(Automatic sequencer)와 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR) 등 고가의 장비와 형광이 부착된 프로브 등이 없이도 셀리악과 관련된 특이적인 프라이머를 멀티플렉스 반응액으로 동시에 증폭한 후 PCR 증폭산물을 아가로스겔(agarose gel) 전기영동만으로도 간단하게 검출하고 해석할 수 있다는 장점이 있다.
본 발명은, HLA-DQ2(DQA1*0501/0505, DQB1*0201/0202)와 HLA-DQ8(DQA1*0301/DQB1*0302) 및 DR4(DRB1*04)에 존재하는 대립유전자(allele)의 변이 여부를 정확히 검출할 수 있으며, 기존의 검사법인 알러지 피부검사, 혈청학적 특이 면역검사 및 점막조직검사에 비해 민감도와 특이도가 높고, 검체로부터 짧은 시간내에 간편하고 신속하게 DNA를 검출할 수 있다는 장점이 있다.
또한, 글루텐 성분이 많이 함유된 곡물이나 음식물을 섭취했을 때 이상반응을 보이는 환자들을 검사하여 그 위험군에 따른 결과를 의사에게 제시해 줌으로써 환자에게 정확한 진단과 처방에 도움을 줄 수 있고, 값비싼 수입제품을 대체할 수 있어 비용 점감 효과가 기대된다.
도 1은 본 발명의 프라이머 세트를 이용해 PCR-SSP법으로 동시에 증폭한 결과를 나타낸 것이다. M: 100bp 래더(ladder), 베타-글로빈(320bp): 1 ~ 12, DQA1*0501/0505(186bp): 7, 10, 12, DQA1*0301/DQB1*0302(122bp): 2, DQB1*0201 /0202(108bp): 3, 6, 9, 10, 11, DRB1*04(217bp) : 1, 8.
도 2는 DQA1*0501/0505의 프라이머 위치 및 염기서열을 나타낸 것이다.
도 3은 DQB1*0201/0202의 프라이머 위치 및 염기서열을 나타낸 것이다.
도 4는 DQA1*0301/DQB1*0302의 프라이머 위치 및 염기서열을 나타낸 것이다.
도 5는 DRB1*04의 프라이머 위치 및 염기서열을 나타낸 것이다.
도 6은 베타글로빈(β-globin) 프라이머 위치 및 염기서열을 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명한다.
< 검체로부터 DNA 샘플을 얻는 단계(S110)>
검체로부터 DNA를 얻는 방법은 모근(머리카락 3∼5 가닥), 면봉(구강상피세포), 혈액을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
모근이 붙은 머리카락은 모근만을 취하고, 면봉으로 채취한 구강상피세포는 면봉 부분만을 취하고, 혈액은 200 ㎕를 취해 1.5 ㎖ 튜브(tube)에 넣는다. 채취한 시료에 H-Prep(Prepgene, Korea) 200 ㎕와 프로테나아제(protenase)K 4 ㎕를 첨가한 후, 잘 섞어주고 63℃ 배양기에서 20분간 반응시켜 세포를 용해한다. 세포의 용해가 완료되면 85℃ 배양기에서 15분간 배양시킨다. 13,000 rpm에서 4분간 원심분리한 후 genomic DNA가 함유된 상층액 약 50∼100㎕ 를 취하여 새로운 1.5㎖ 튜브로 옮긴 후 추출된 DNA 양을 정량하고, 정량된 DNA는 사용할 때까지 냉장 보관한다.
< 셀리악병 염기서열 특이적 프라이머 제작(S120)>
셀리악병과 관련된 대립유전자의 염기서열 특이적 프라이머 설계를 위해 HLA 유전자 중에서 DQA1 좌위 49개와 DQB1 좌위 182개 그리고 DR4 좌위 27개의 염기서열을 EMBL-EBL 얼라인먼트(Alignment) 프로그램을 사용하여 종합적으로 비교 분석한 후 대립유전자형의 변이 여부를 특이적으로 분별할 수 있는 염기서열의 부위를 선정한다. 선정된 대립유전자들의 프라이머 염기서열이 다른 유전자들과 반복되거나 일치되는 부분이 있는지를 프라이머-블라스트(primer-BLAST)로 확인하고, 프라이머의 반응조건 등을 고려하여 길이, DNA 단편의 크기 등 염기서열 특이적 프라이머를 설계하고 합성한다.
셀리악병 진단용 특이적 염기서열 프라이머
대립유전자명 프라이머 방향 프라이머 염기서열
(5‘∼3’)
단편크기
(bp)
서열
번호


DQA1*0501/0505

정방향(forward primer)

ACGGTCCCTCTGGCCAGTA


186

1

역방향(reverse primer)

AGTTGGAGCGTTTAATCAGAC

2


DQA1*0301/
DQB1*0302

정방향(forward primer)

GTGCGTCTTGTGACCAGATA


122

3

역방향(reverse primer)

TGGCTGTTCCAGTACTCGGCGG

4


DQB1*0201/0202

정방향(forward primer)

CGCGTGCGTCTTGTGAGCAGAAG


108

5

역방향(reverse primer)

GGCGGCAGGCAGCCCCAGCA

6


DRB1*04

정방향(forward primer)

GGTTAAACATGAGTGTCATTTCTTAAAC


217

7

역방향(reverse primer)

GTTGTGTCTGCAGTAGGTGTC

8


Internal control
(β-globin)

정방향(forward primer)

GGCTGGGCATAAAAGTCAGGG


320

9

역방향(reverse primer)

ACCAGCAGCCTAAGGGTGGGAA

10
< PCR - SSP 반응액 조성 및 반응조건(S130)>
상기 DNA 시료를 주형으로 하고, 상기 제작된 프라이머를 사용하여 다음과 같은 조건하에서 멀티플렉스 PCR-SSP 증폭을 실시한다(S130). PCR-SSP 증폭을 위한 반응액 조성은 0.2ml 튜브에 주형(template) DNA 20~50ng, 멀티플렉스 반응액(프라이머 각 0.2μM, dNTP 각 250μM, 10X PCR buffer)과 Taq DNA 중합효소 1 unit 를 첨가하여 PCR 반응액을 총 20㎕로 조성한다. PCR-SSP 반응조건은 최초 94℃에서 5분간 예비가열한 후 94℃에서 30초, 60~62℃에서 30초 그리고 72℃에서 30초의 사이클(cycle)을 총 30회 반복한 다음 마지막으로 72℃에서 5분간 가열하여 DNA 증폭과정을 종료한다.
<검출방법 및 염기서열 분석(S140,S150)>
증폭된 PCR 산물 6 ㎕를 2% 아가로스겔(agarose gel)로 전기영동한 후 GelRed로 염색하여 UV 투과조명기에서 각 대립유전자의 DNA 밴드와 내부대조군 DNA(internal control DNA)인 베타-글로빈(β-globin) 밴드를 확인한다. 내부대조군 DNA 밴드를 관찰할 수 있는 결과에서 각 대립유전자의 검출 유무에 따라 양성(+) 및 음성(-)으로 해석한다.
상기 검출방법에 의해 검출된 각 대립유전자들이 실제 염기서열과 일치하는지를 확인하기 위해 PCR 증폭산물을 DNA 씨퀀씽 클린-업 키트(DNA sequencing clean-up kit)로 정제한 후 염기서열분석기(ABI 3130xl Genetic Analyzer; Applilied Biosystems, USA)의 모세관(capillary)을 통해 전기영동을 실시하고, 씨스캡 매니저 5.0(seqscape manager 5.0)과 씨퀀씽 분석 5.2 소프트웨어(sequencing analysis 5.2 software) 프로그램을 사용하여 각 대립유전자의 염기서열을 비교 분석한다.
< 셀리악병 위험군 결과해석(S160)>
상기에서 얻어진 대립유전자의 검출유무에 따라 양성(+)과 음성(-)으로 구분하여 표 3에 제시된 셀리악병 위험정도를 예측한다. 더 구체적으로, 고위험군(high risk)은 3 종류 또는 4 종류의 대립유전자를 가지고 있는 경우, 중위험군(moderate risk)은 1 종류 중에서 3 종류 대립유전자를 가지고 있는 경우, 그리고 저위험군(no risk)은 1개 또는 대립유전자가 검출되지 않은 경우로 결과를 해석한다.
조합된 대립유전자형의 결과에 근거한 셀리악병 위험도 해석기준

대립유전자명


결 과


해석기준
DQA1*0301/DQB1*0302 DQA1*0501/
0505
DQB1*0201/0202 DRB1*04

+

+

+

+
DQB1*0301/DQB1*0302, DQA1*0501/0505, DQB1*0201/0202, DRB1*04 고위험군
(high risk)

-

+

+

+
DQA1*0501/0505, DQB1*0201/0202, DRB1*04 고위험군
(high risk)

+

+

+

_
DQB1*0301/DQB1*0302, DQA1*0501/0505, DQB1*0201/0202 고위험군
(high risk)

-

+

+

_
DQA1*0501/0505, DQB1*0201/0202 고위험군
(high risk)

+

+

-

+
DQA1*0301/DQB1*0302, DQA1*0501/0505, DRB1*04 중위험군
(moderate risk)

+

-

-

+
DQA1*0301/DQB1*0302,
DRB1*04
중위험군
(moderate risk)

+

+

-

-
DQA1*0301/DQB1*0302, DQA1*0501/0505 중위험군
(moderate risk)

+

-

-

-

DQA1*0301/DQB1*0302
중위험군
(moderate risk)

+

-

+

-
DQA1*0301/DQB1*0302, DQB1*0201/0202 중위험군
(moderate risk)

-

-

+

_

DQB1*0201/0202
저위험군
(no risk)

-

+

-

_

DQA1*0501/0505
저위험군
(no risk)

-

-

-

_

Negative
저위험군
(no risk)
< 본 발명 DNA 키트의 유용성 비교 분석(S170)>
본 발명된 진단법의 유용성을 확인하기 위하여 대립유전자형이 확인되어 있는 표준세트(standard set, UCLA DNA reference panel)와 Olerup SSP(Sweden)사에서 제작된 셀리악 DNA 키트를 각각 사용하여 비교 분석한다. 표준세트에서 제공된 검체를 이용해 본 발명에서 개발된 진단법으로 증폭한 후 검출된 대립유전자를 각각 분석하여 비교한다.
본 발명에서 개발된 셀리악병 진단법과 Olerup SSP사에서 제작된 DNA 키트를 비교하기 위해 실시예 3에 따라 총 190건의 검체를 대상으로 민감도, 특이도 및 정확도를 각각 분석하였고, Olerup SSP사의 경우 제조사의 매뉴얼에 따라 분석하였다. 그 결과, 본 발명의 키트는 표 4에서와 같이 Olerup SSP사의 키트와 비교했을 때 99.5%의 민감도와 98.4%의 특이도 및 97.9%의 정확도를 보였다.
본 발명에서 개발된 진단법과 Olerup SSP사에서 제작된 키트간의 비교결과(n=190)
대립유전자명 발명 키트 Olerup SSP 민감도
(%)
특이도
(%)
정확도
(%)
DQB1*0301/DQA1*0302, DQA1*0501/0505,
DQB1*0201/0202, DRB1*04
2 1






99.5







98.4







97.9
DQA1*0501/0505, DQB1*0201/0202, DRB1*04 2 2
DQA1*0301/DQB1*0302, DQA1*0501/0505, DQB1*0201/0202 3 3
DQA1*0501/0505, DQB1*0201/0202 4 4
DQA1*0301/DQB1*0302, DQA1*0501/0505,
DRB1*04
3 2
DQA1*0301/DQB1*0302, DRB1*04 9 9
DQA1*0301/DQB1*0302, DQA1*0501/0505 7 6
DQA1*0301/DQB1*0302 10 10
DQA1*0301/DQB1*0302, DQB1*0201/0202 15 16
DQB1*0201/0202 51 51
DQA1*0501/0505 65 65
Negative 21 21
<110> Korea Gene Information Center Co. Ltd. <120> Diagnosis primer set for celiac disease and detecting methods using it <130> INP14-183 <140> 10-2014-0172453 <141> 2014-12-03 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 acggtccctc tggccagta 19 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 agttggagcg tttaatcaga c 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 gtgcgtcttg tgaccagata 20 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 tggctgttcc agtactcggc gg 22 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 cgcgtgcgtc ttgtgagcag aag 23 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 ggcggcaggc agccccagca 20 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 ggttaaacat gagtgtcatt tcttaaac 28 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 gttgtgtctg cagtaggtgt c 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 ggctgggcat aaaagtcagg g 21 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 accagcagcc taagggtggg aa 22

Claims (10)

  1. 서열번호 1 및 2의 염기서열을 갖는 프라이머, 서열번호 3 및 4의 염기서열을 갖는 프라이머, 서열번호 5 및 6의 염기서열을 갖는 프라이머, 서열번호 7 및 8의 염기서열을 갖는 프라이머 및, 서열번호 9 및 10의 염기서열을 갖는 프라이머을 포함하는 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.
  2. HLA-DQ2(DQA1*0501/0505, DQB1*0201/0202), HLA-DQ8(DQA1*0301/DQB1*0302) 및 DR4(DRB1*04)에 존재하는 대립유전자(allele)의 염기서열을 제1항의 프라이머 세트에 의해 PCR-SSP 방법으로 동시에 증폭하고 증폭산물의 검출결과를 확인하여 셀리악병의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  3. (a) 분석하고자 하는 검체로부터 DNA를 얻는 단계;
    (b) 제1항에 기재된 프라이머 세트를 설계하고 합성하는 단계;
    (c) 상기 (b)를 이용하여 PCR-SSP 방법으로 멀티플렉스 반응액을 조성하여 DNA 단편을 동시에 증폭하는 단계;
    (d) 증폭산물을 전기영동하여 각 대립유전자의 DNA 단편을 분리하고 검출하는 단계;
    (e) 상기 각 대립유전자의 상기 증폭산물을 정제하여 염기서열을 분석하는 단계;
    (f) 검출된 대립유전자의 조합에 의한 셀리악병 위험정도를 해석하는 단계; 및,
    (g) 상기 검출된 대립유전자의 민감도, 특이도 및 정확도를 분석하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 셀리악병 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 (a)단계에서 DNA는 사람의 모근, 구강상피세포 또는 혈액 중 어느 하나로부터 취득하는 것을 특징으로 하는 셀리악병 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  5. 제 3항에 있어서,
    상기 (b)단계에서의 프라이머 세트 선정은, HLA 중에서 DQA1 좌위 49개와 DQB1 좌위 182개 그리고 DR4 좌위 27개 대립유전자의 염기서열을 비교 분석하여 각 대립유전자의 변이 여부에 의해 특이적으로 결합할 수 있는 염기서열을 프라이머로 설계하는 것을 특징으로 하는 셀리악병 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  6. 제 3항에 있어서,
    상기 (c)단계는, 종합적인 증폭조건(시료 DNA 농도, 프라이머 농도, dNTP, 결합반응(annealing) 온도)들을 고려하여 PCR 증폭을 위한 멀티플렉스 반응액을 만든 다음, PCR-SSP 기법으로 증폭하는 것을 특징으로 하는 셀리악병 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  7. 제 3항에 있어서,
    상기 (d)단계는, PCR 증폭산물은 아가로스겔 전기영동으로 각 특이적인 프라이머 세트에 의한 대립유전자를 분리하고 검출하는 것을 특징으로 하는 셀리악병 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  8. 제 3항에 있어서,
    상기 (e)단계에서, 각 대립유전자의 염기서열 분석은 증폭산물의 증폭반응에 의한 검출결과가 정확하게 이루어졌는지를 분별하는 것을 특징으로 하는 셀리악병 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  9. 제 3항에 있어서,
    상기 (f)단계는, 각 대립유전자형의 검출 유무를 조합하여 상기 각 대립유전자의 조합형에 의한 위험정도를 판정하는 것을 특징으로 하는 셀리악병 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  10. 제 3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (g)단계의 민감도, 특이도 및 정확도의 검증은 유전자형이 확인되어 있는 표준세트(standard set, UCLA DNA reference panel)와 Olerup SSP(Sweden)사에서 제작된 HLA 키트를 사용하여 비교 분석하는 것을 특징으로 하는 셀리악병 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
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