JP2000201685A - Ｈｌａ―ｄｑａ１対立遺伝子型の判別のためのプライマ―およびそれを用いる判別方法 - Google Patents
Ｈｌａ―ｄｑａ１対立遺伝子型の判別のためのプライマ―およびそれを用いる判別方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】ＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子のタイピングを容
易に行なうための方法、それに用いるキットおよび試薬
を提供する。 【解決手段】ＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子またはその断
片を含む核酸試料に対して、配列表の配列番号１から配
列番号９、配列番号１１から配列番号２２、配列番号２
４および配列番号２５の核酸配列から選ばれるプライマ
ーの少なくとも１つを用いてＰＣＲ法などの核酸の増幅
反応を行い、電気泳動法などにより該増幅産物を解析す
ることにより、対応する各特定のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立
遺伝子の型および各特定のグループ内のＨＬＡ−ＤＱＡ
１対立遺伝子群の特定の型をグループとして判別する。
なお本発明は、ＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子型の判別の
ために有用な前記プライマーを提供する。
易に行なうための方法、それに用いるキットおよび試薬
を提供する。 【解決手段】ＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子またはその断
片を含む核酸試料に対して、配列表の配列番号１から配
列番号９、配列番号１１から配列番号２２、配列番号２
４および配列番号２５の核酸配列から選ばれるプライマ
ーの少なくとも１つを用いてＰＣＲ法などの核酸の増幅
反応を行い、電気泳動法などにより該増幅産物を解析す
ることにより、対応する各特定のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立
遺伝子の型および各特定のグループ内のＨＬＡ−ＤＱＡ
１対立遺伝子群の特定の型をグループとして判別する。
なお本発明は、ＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子型の判別の
ために有用な前記プライマーを提供する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】ヒトの主要組織適合性抗原である
ＨＬＡ（Human Leukocyte Antigen）は、免疫担当細胞
の膜表面に発現し、抗原処理（antigen processing）さ
れた外因性および内因性抗原由来のぺプチドをＴリンパ
球に提示すると共に、自己・非自己の識別マーカーとし
て機能している。本発明は、ＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝
子型の判別方法、そのキットおよび試薬に関するもので
あり、特に臨床医学領域における臓器移植の際のドナー
・レシピエント間の適合性の判定やＨＬＡ−ＤＱＡ１対
立遺伝子型と各種疾患との相関性の解析などにおいて有
用である。
ＨＬＡ（Human Leukocyte Antigen）は、免疫担当細胞
の膜表面に発現し、抗原処理（antigen processing）さ
れた外因性および内因性抗原由来のぺプチドをＴリンパ
球に提示すると共に、自己・非自己の識別マーカーとし
て機能している。本発明は、ＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝
子型の判別方法、そのキットおよび試薬に関するもので
あり、特に臨床医学領域における臓器移植の際のドナー
・レシピエント間の適合性の判定やＨＬＡ−ＤＱＡ１対
立遺伝子型と各種疾患との相関性の解析などにおいて有
用である。
【０００２】
【従来の技術】ＨＬＡ抗原は、従来から主にヒト同種抗
体を用いた血清学的方法により、型判別が行われてき
た。すなわち臍帯血や頻回輸血者の血清中に含まれる各
ＨＬＡ抗原型に対する特異抗体を用いて抗原抗体反応を
行い、補体依存性の細胞障害を惹起させることで、陽性
細胞は細胞膜の透過性に変化を来しエオジン色素などの
取り込みにより、顕微鏡下で着色され膨化した形態とし
て識別できる。この方法によりＨＬＡクラスＩ抗原であ
るＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ抗原および同クラスＩＩ抗原であ
るＤＲ，ＤＱ抗原の型を識別することが可能であるが、
該方法は特異抗体の採取と品質維持、および供給面に問
題があった。また方法論的には細胞の生存を指標として
判定するため、被検試料の状態の悪化、例えば疾病や採
血後の経時的影響に起因する細胞生存率の低下などが検
査成績の信頼性の低下の誘因になるという問題があっ
た。
体を用いた血清学的方法により、型判別が行われてき
た。すなわち臍帯血や頻回輸血者の血清中に含まれる各
ＨＬＡ抗原型に対する特異抗体を用いて抗原抗体反応を
行い、補体依存性の細胞障害を惹起させることで、陽性
細胞は細胞膜の透過性に変化を来しエオジン色素などの
取り込みにより、顕微鏡下で着色され膨化した形態とし
て識別できる。この方法によりＨＬＡクラスＩ抗原であ
るＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ抗原および同クラスＩＩ抗原であ
るＤＲ，ＤＱ抗原の型を識別することが可能であるが、
該方法は特異抗体の採取と品質維持、および供給面に問
題があった。また方法論的には細胞の生存を指標として
判定するため、被検試料の状態の悪化、例えば疾病や採
血後の経時的影響に起因する細胞生存率の低下などが検
査成績の信頼性の低下の誘因になるという問題があっ
た。
【０００３】近年、分子生物学的技術の発展によってＨ
ＬＡ抗原をコードする遺伝子領域が解析されるに伴い、
各種ＨＬＡ抗原型とその遺伝子の塩基配列の対応性につ
いて知られるようになった。すなわちＨＬＡ遺伝子の特
定の遺伝子配列を調べることで、被検試料のＨＬＡ抗原
型を決定する（遺伝子タイピング）ことが可能となっ
た。特に微細な塩基配列の変化を高感度に検出すること
が可能な技術であるＰＣＲ（Polymerase Chain Reactio
n）法は、ＨＬＡクラスＩＩ抗原遺伝子であるＤＲ、Ｄ
Ｑ、ＤＰ遺伝子のタイピングに関して既に利用されてい
る。また、これらのＰＣＲ法を基盤としたＨＬＡクラス
ＩＩ遺伝子タイピングの技法として、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ
（Sequence-Specific Oligonucleotide Probe）法、Ｐ
ＣＲ−ＲＦＬＰ（Restriction Fragment Length Polymo
rphism）法、ＰＣＲ−ＳＳＰ（Sequence-Specific Prim
er）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（Single Strand Conformati
on Polymorphism）法などが開発されている。これらの
技法は何れも解析の対象となる遺伝子領域をＰＣＲ法で
増幅し、その増幅産物に対しさらに別の技法を用いるこ
とにより塩基配列の可変部位を解析して、遺伝子型を判
別するものである。このＨＬＡクラスＩＩ遺伝子タイピ
ングでは、従来のヒト同種血清を用いた血清学的方法に
よる型分類に留まらず、遺伝子レベルの型分類を可能に
している。すなわち従来の血清学的方法では同一と考え
られていた抗原が、遺伝子配列の違いによりさらに細分
化され、前記検査の臨床的意義の拡大をもたらしてい
る。
ＬＡ抗原をコードする遺伝子領域が解析されるに伴い、
各種ＨＬＡ抗原型とその遺伝子の塩基配列の対応性につ
いて知られるようになった。すなわちＨＬＡ遺伝子の特
定の遺伝子配列を調べることで、被検試料のＨＬＡ抗原
型を決定する（遺伝子タイピング）ことが可能となっ
た。特に微細な塩基配列の変化を高感度に検出すること
が可能な技術であるＰＣＲ（Polymerase Chain Reactio
n）法は、ＨＬＡクラスＩＩ抗原遺伝子であるＤＲ、Ｄ
Ｑ、ＤＰ遺伝子のタイピングに関して既に利用されてい
る。また、これらのＰＣＲ法を基盤としたＨＬＡクラス
ＩＩ遺伝子タイピングの技法として、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ
（Sequence-Specific Oligonucleotide Probe）法、Ｐ
ＣＲ−ＲＦＬＰ（Restriction Fragment Length Polymo
rphism）法、ＰＣＲ−ＳＳＰ（Sequence-Specific Prim
er）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（Single Strand Conformati
on Polymorphism）法などが開発されている。これらの
技法は何れも解析の対象となる遺伝子領域をＰＣＲ法で
増幅し、その増幅産物に対しさらに別の技法を用いるこ
とにより塩基配列の可変部位を解析して、遺伝子型を判
別するものである。このＨＬＡクラスＩＩ遺伝子タイピ
ングでは、従来のヒト同種血清を用いた血清学的方法に
よる型分類に留まらず、遺伝子レベルの型分類を可能に
している。すなわち従来の血清学的方法では同一と考え
られていた抗原が、遺伝子配列の違いによりさらに細分
化され、前記検査の臨床的意義の拡大をもたらしてい
る。
【０００４】ＨＬＡクラスＩＩ抗原はα鎖とβ鎖が非共
有結合してヘテロ２量体を形成することからなる構造で
あるが、いわゆる抗原特異性（antigenic specificit
y）は抗原ぺプチド結合部位であるβ鎖のβ１ドメイン
のアミノ酸残基の置換によることが知られている（Mars
h, S.G. et al., Immunol. Today 1989 : 10: 305-31
2）。従ってＨＬＡクラスＩＩ遺伝子のタイピングは、
一般的に、著しい多型性を示すβ鎖のβ１ドメインをコ
ードする遺伝子（ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＤＱＢ１およびＤ
ＰＢ１）の第２エクソンが対象領域とされている。とこ
ろがα鎖においても、ＨＬＡ−ＤＱβ鎖と結合するＤＱ
α鎖は他のクラスＩＩ抗原のα鎖と比較して顕著な多型
性が認められている（Marsh, S.G., Tissue Antigens 1
998 : 51: 467-507）。そこで現在ではクラスＩＩβ鎖
遺伝子と同様に、前記ＤＱα鎖の遺伝子であるＨＬＡ−
ＤＱＡ１の第２エクソンを対象領域とする遺伝子タイピ
ングも行われている。
有結合してヘテロ２量体を形成することからなる構造で
あるが、いわゆる抗原特異性（antigenic specificit
y）は抗原ぺプチド結合部位であるβ鎖のβ１ドメイン
のアミノ酸残基の置換によることが知られている（Mars
h, S.G. et al., Immunol. Today 1989 : 10: 305-31
2）。従ってＨＬＡクラスＩＩ遺伝子のタイピングは、
一般的に、著しい多型性を示すβ鎖のβ１ドメインをコ
ードする遺伝子（ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＤＱＢ１およびＤ
ＰＢ１）の第２エクソンが対象領域とされている。とこ
ろがα鎖においても、ＨＬＡ−ＤＱβ鎖と結合するＤＱ
α鎖は他のクラスＩＩ抗原のα鎖と比較して顕著な多型
性が認められている（Marsh, S.G., Tissue Antigens 1
998 : 51: 467-507）。そこで現在ではクラスＩＩβ鎖
遺伝子と同様に、前記ＤＱα鎖の遺伝子であるＨＬＡ−
ＤＱＡ１の第２エクソンを対象領域とする遺伝子タイピ
ングも行われている。
【０００５】しかしながら近年のＨＬＡ抗原遺伝子の解
析において、ＨＬＡ−ＤＱＡ１の第２エクソン以外の領
域内でも核酸塩基の置換が次々と発見されており、この
変異に基づいた新規の対立遺伝子がＷＨＯ（世界保健機
構）命名委員会で認定されている（Bodmer, J.G. et a
l., Tissue Antigens 1997 : 49: 297-321）。すなわ
ち、第２エクソン領域のみを対象としたＨＬＡ−ＤＱＡ
１遺伝子タイピングでは全てのＤＱＡ１対立遺伝子の区
別が不可能となっている。実際には１９９８年１１月現
在で１６種類のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子の存在が知
られているが（但し同義置換の区別無し）、第２エクソ
ン領域のみを対象としたＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子タイピ
ングでは８種類にしか大別できない。
析において、ＨＬＡ−ＤＱＡ１の第２エクソン以外の領
域内でも核酸塩基の置換が次々と発見されており、この
変異に基づいた新規の対立遺伝子がＷＨＯ（世界保健機
構）命名委員会で認定されている（Bodmer, J.G. et a
l., Tissue Antigens 1997 : 49: 297-321）。すなわ
ち、第２エクソン領域のみを対象としたＨＬＡ−ＤＱＡ
１遺伝子タイピングでは全てのＤＱＡ１対立遺伝子の区
別が不可能となっている。実際には１９９８年１１月現
在で１６種類のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子の存在が知
られているが（但し同義置換の区別無し）、第２エクソ
ン領域のみを対象としたＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子タイピ
ングでは８種類にしか大別できない。
【０００６】本発明者らは上記ＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺
伝子の第２エクソン以外の領域内の核酸塩基の置換に着
目し研究を重ねた結果、第３エクソン領域の遺伝子によ
りコードされるα２ドメイン内の第１６０番目のアミノ
酸残基のみが異なるＤＱＡ１*０３および*０５のサブタ
イプ間においては、連鎖不平衡を示すＨＬＡハプロタイ
プが異なることから、この形成は進化系統学的に自然淘
汰されたものであることを証明した（Kaneshige, T. et
al., Tissue Antigens 1997 : 49: 46-52）。これは第
３エクソン領域の遺伝子の変異が、例えばその遺伝子産
物であるＨＬＡ−ＤＱα鎖がＤＱβ鎖と会合する際に構
造的差異を引き起こすことにより、生物的機能に影響し
ている可能性を支持するものである。事実、他の研究者
らのインビトロ・ミュータジェネシス（in vitro mutag
enesis）解析の結果でも、該領域がコードするアミノ酸
配列はＣＤ４結合部位に対応すると考えられており、そ
の部位のアミノ酸残基の置換によりその結合様式に変化
を来すことが報告されている（Konig, R. et al., J. E
xp. Med. 1995 : 182: 779-787およびPaliakasis,K. et
al., J. Struct. Biol. 1996 : 117: 145-163）。
伝子の第２エクソン以外の領域内の核酸塩基の置換に着
目し研究を重ねた結果、第３エクソン領域の遺伝子によ
りコードされるα２ドメイン内の第１６０番目のアミノ
酸残基のみが異なるＤＱＡ１*０３および*０５のサブタ
イプ間においては、連鎖不平衡を示すＨＬＡハプロタイ
プが異なることから、この形成は進化系統学的に自然淘
汰されたものであることを証明した（Kaneshige, T. et
al., Tissue Antigens 1997 : 49: 46-52）。これは第
３エクソン領域の遺伝子の変異が、例えばその遺伝子産
物であるＨＬＡ−ＤＱα鎖がＤＱβ鎖と会合する際に構
造的差異を引き起こすことにより、生物的機能に影響し
ている可能性を支持するものである。事実、他の研究者
らのインビトロ・ミュータジェネシス（in vitro mutag
enesis）解析の結果でも、該領域がコードするアミノ酸
配列はＣＤ４結合部位に対応すると考えられており、そ
の部位のアミノ酸残基の置換によりその結合様式に変化
を来すことが報告されている（Konig, R. et al., J. E
xp. Med. 1995 : 182: 779-787およびPaliakasis,K. et
al., J. Struct. Biol. 1996 : 117: 145-163）。
【０００７】またリーダーペプチド（および一部のα１
ドメイン）をコードする第１エクソンにおいてもアミノ
酸残基の置換が観察され、さらにこの置換のみで区別さ
れる対立遺伝子（サブタイプ）間でも異なるＨＬＡハプ
ロタイプを形成することから（Yasunaga, S. et al., T
issue Antigens 1996 : 47: 37-48）、上記同様、第１
エクソン領域の遺伝子の変異が何らかの生物学的機能の
相違に影響している可能性が示唆される。
ドメイン）をコードする第１エクソンにおいてもアミノ
酸残基の置換が観察され、さらにこの置換のみで区別さ
れる対立遺伝子（サブタイプ）間でも異なるＨＬＡハプ
ロタイプを形成することから（Yasunaga, S. et al., T
issue Antigens 1996 : 47: 37-48）、上記同様、第１
エクソン領域の遺伝子の変異が何らかの生物学的機能の
相違に影響している可能性が示唆される。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】上述の事実から判断し
て、ＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子の第２エクソン以外の
遺伝子領域の解析はＨＬＡ−ＤＱ分子の詳細な解析や、
またその応用として各種疾患の病因若しくは病態の診断
などの臨床適用に有用であると考えられる。本発明の目
的は、ＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子の全遺伝子領域を解
析対象として、全てのＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子のタ
イピングを容易に行なうための方法、それに用いるキッ
トおよび試薬を提供することである。
て、ＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子の第２エクソン以外の
遺伝子領域の解析はＨＬＡ−ＤＱ分子の詳細な解析や、
またその応用として各種疾患の病因若しくは病態の診断
などの臨床適用に有用であると考えられる。本発明の目
的は、ＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子の全遺伝子領域を解
析対象として、全てのＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子のタ
イピングを容易に行なうための方法、それに用いるキッ
トおよび試薬を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記の課題
に鑑み、鋭意研究した結果、染色体ＤＮＡ中に存在する
少なくとも１つの特定のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子の
塩基配列に特異的なＰＣＲ増幅用プライマー、および特
定のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子群からなる少なくとも
１つの特定のグループ内の各遺伝子に共通の塩基配列に
特異的なＰＣＲ増幅用プライマーを創意工夫して設定す
ることができた。その中でも特に、第１エクソン内に存
在する可変部位をＰＣＲ増幅するのに有用な、ＨＬＡ−
ＤＱＡ１グループ特異的な第1イントロン内のプライマ
ーを設定することができた。さらに、ＨＬＡ−ＤＱＡ１
対立遺伝子またはその断片を含む核酸試料に対して前記
プライマーを用いてＰＣＲ法を行い、該増幅産物を電気
泳動法により展開して特定のサイズのＤＮＡバンドの存
在の有無を確認することにより、対応する各特定のＨＬ
Ａ−ＤＱＡ１対立遺伝子の型および各特定のグループ内
のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子群の特定の型をグループ
として判別することが可能であることを見出し、本発明
を完成するに至った。
に鑑み、鋭意研究した結果、染色体ＤＮＡ中に存在する
少なくとも１つの特定のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子の
塩基配列に特異的なＰＣＲ増幅用プライマー、および特
定のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子群からなる少なくとも
１つの特定のグループ内の各遺伝子に共通の塩基配列に
特異的なＰＣＲ増幅用プライマーを創意工夫して設定す
ることができた。その中でも特に、第１エクソン内に存
在する可変部位をＰＣＲ増幅するのに有用な、ＨＬＡ−
ＤＱＡ１グループ特異的な第1イントロン内のプライマ
ーを設定することができた。さらに、ＨＬＡ−ＤＱＡ１
対立遺伝子またはその断片を含む核酸試料に対して前記
プライマーを用いてＰＣＲ法を行い、該増幅産物を電気
泳動法により展開して特定のサイズのＤＮＡバンドの存
在の有無を確認することにより、対応する各特定のＨＬ
Ａ−ＤＱＡ１対立遺伝子の型および各特定のグループ内
のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子群の特定の型をグループ
として判別することが可能であることを見出し、本発明
を完成するに至った。
【００１０】すなわち本発明は、ＨＬＡ−ＤＱＡ１対立
遺伝子またはその断片を含む核酸を鋳型として、少なく
とも１つの特定のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子の塩基配
列に特異的なプライマーおよび／または特定のＨＬＡ−
ＤＱＡ１対立遺伝子群からなる少なくとも１つの特定の
グループ内の各遺伝子に共通の塩基配列に特異的なプラ
イマーを用いて核酸の増幅反応を行うことを主旨とする
ＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子型の判別方法である。
遺伝子またはその断片を含む核酸を鋳型として、少なく
とも１つの特定のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子の塩基配
列に特異的なプライマーおよび／または特定のＨＬＡ−
ＤＱＡ１対立遺伝子群からなる少なくとも１つの特定の
グループ内の各遺伝子に共通の塩基配列に特異的なプラ
イマーを用いて核酸の増幅反応を行うことを主旨とする
ＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子型の判別方法である。
【００１１】ここで上記ＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子型
の判別方法において、少なくとも１つの特定のＨＬＡ−
ＤＱＡ１対立遺伝子の塩基配列に特異的なプライマーお
よび／または特定のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子群から
なる少なくとも１つの特定のグループ内の各遺伝子に共
通の塩基配列に特異的なプライマーとしては、配列表の
配列番号１から配列番号９、配列番号１１から配列番号
２２、配列番号２４および配列番号２５の核酸配列から
選ばれる。さらに具体的には、前者（allele specifi
c）のプライマーとしては、配列表の配列番号５、配列
番号８から配列番号９、配列番号１１、配列番号１３お
よび配列番号２３の核酸配列から選ばれ、後者（group
specific）のプライマーとしては、配列表の配列番号１
から配列番号４、配列番号６から配列番号７、配列番号
１０、配列番号１２、配列番号１４から配列番号２０、
配列番号２２、配列番号２４および配列番号２５の核酸
配列から選ばれる。また、配列表の配列番号２１の核酸
配列は全てのＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子に共通な塩基
配列に特異的であるよう設定される。なお本発明は、前
記ＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子型の判別のためのプライ
マー、すなわち配列表の配列番号１から配列番号９、配
列番号１１から配列番号２２、配列番号２４および配列
番号２５の核酸配列自身も含むものである。当業者なら
ば容易に理解できるように、前記プライマーは、少なく
とも１つの特定のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子の塩基配
列または特定のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子群からなる
少なくとも１つの特定のグループ内の各遺伝子に共通の
塩基配列に特異的にハイブリダイズ（アニール）するこ
とが可能な範囲、すなわち該プライマーが本来有するハ
イブリダイゼーション（アニーリング）の特異性を維持
する範囲で、その末端配列に対し数塩基の欠失または付
加を行うことができる。従って本発明のプライマーは、
配列表の配列番号１から配列番号９、配列番号１１から
配列番号２２、配列番号２４および配列番号２５の核酸
配列に対し前記範囲で塩基の欠失または付加をした核酸
配列から選ばれるプライマーも含むものである。
の判別方法において、少なくとも１つの特定のＨＬＡ−
ＤＱＡ１対立遺伝子の塩基配列に特異的なプライマーお
よび／または特定のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子群から
なる少なくとも１つの特定のグループ内の各遺伝子に共
通の塩基配列に特異的なプライマーとしては、配列表の
配列番号１から配列番号９、配列番号１１から配列番号
２２、配列番号２４および配列番号２５の核酸配列から
選ばれる。さらに具体的には、前者（allele specifi
c）のプライマーとしては、配列表の配列番号５、配列
番号８から配列番号９、配列番号１１、配列番号１３お
よび配列番号２３の核酸配列から選ばれ、後者（group
specific）のプライマーとしては、配列表の配列番号１
から配列番号４、配列番号６から配列番号７、配列番号
１０、配列番号１２、配列番号１４から配列番号２０、
配列番号２２、配列番号２４および配列番号２５の核酸
配列から選ばれる。また、配列表の配列番号２１の核酸
配列は全てのＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子に共通な塩基
配列に特異的であるよう設定される。なお本発明は、前
記ＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子型の判別のためのプライ
マー、すなわち配列表の配列番号１から配列番号９、配
列番号１１から配列番号２２、配列番号２４および配列
番号２５の核酸配列自身も含むものである。当業者なら
ば容易に理解できるように、前記プライマーは、少なく
とも１つの特定のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子の塩基配
列または特定のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子群からなる
少なくとも１つの特定のグループ内の各遺伝子に共通の
塩基配列に特異的にハイブリダイズ（アニール）するこ
とが可能な範囲、すなわち該プライマーが本来有するハ
イブリダイゼーション（アニーリング）の特異性を維持
する範囲で、その末端配列に対し数塩基の欠失または付
加を行うことができる。従って本発明のプライマーは、
配列表の配列番号１から配列番号９、配列番号１１から
配列番号２２、配列番号２４および配列番号２５の核酸
配列に対し前記範囲で塩基の欠失または付加をした核酸
配列から選ばれるプライマーも含むものである。
【００１２】好ましい実施態様としては、上記ＨＬＡ−
ＤＱＡ１対立遺伝子型の判別方法は以下の工程（ａ）〜
（ｂ）を含む； （ａ）ＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子またはその断片を含
む核酸を鋳型として、（１）プライマー対の少なくとも
一方が配列表の配列番号１から配列番号９、配列番号１
１から配列番号２２、配列番号２４および配列番号２５
の核酸配列（例えば、配列表の配列番号５、配列番号８
から配列番号９、配列番号１１、配列番号１３および配
列番号２３の核酸配列）、並びにそれらの末端に対し数
塩基を欠失または付加した核酸配列のプライマーから選
ばれる、少なくとも１つの特定のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立
遺伝子の塩基配列に特異的なプライマー対を用いて核酸
の増幅反応を行い、各特定のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝
子を選択的に増幅する工程、および／または（２）プラ
イマー対の少なくとも一方が上記配列表の配列番号１か
ら配列番号９、配列番号１１から配列番号２２、配列番
号２４および配列番号２５の核酸配列（例えば、配列表
の配列番号１から配列番号４、配列番号６から配列番号
７、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４から配
列番号２０、配列番号２２、配列番号２４および配列番
号２５の核酸配列）、並びにそれらの末端に対し数塩基
を欠失または付加した核酸配列のプライマーから選ばれ
る、特定のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子群からなる少な
くとも１つの特定のグループ内の各遺伝子に共通の塩基
配列に特異的なプライマー対を用いて核酸の増幅反応を
行い、各特定のグループ内のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝
子群をグループとして選択的に増幅する工程； （ｂ）前記増幅反応により得られた産物の特定のサイ
ズ、特定の分子量または存在の有無を確認する、あるい
は該産物の塩基配列を直接決定することにより、対応す
る各特定のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子の型および／ま
たは各特定のグループ内のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子
群の特定の型をグループとして判別する工程。
ＤＱＡ１対立遺伝子型の判別方法は以下の工程（ａ）〜
（ｂ）を含む； （ａ）ＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子またはその断片を含
む核酸を鋳型として、（１）プライマー対の少なくとも
一方が配列表の配列番号１から配列番号９、配列番号１
１から配列番号２２、配列番号２４および配列番号２５
の核酸配列（例えば、配列表の配列番号５、配列番号８
から配列番号９、配列番号１１、配列番号１３および配
列番号２３の核酸配列）、並びにそれらの末端に対し数
塩基を欠失または付加した核酸配列のプライマーから選
ばれる、少なくとも１つの特定のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立
遺伝子の塩基配列に特異的なプライマー対を用いて核酸
の増幅反応を行い、各特定のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝
子を選択的に増幅する工程、および／または（２）プラ
イマー対の少なくとも一方が上記配列表の配列番号１か
ら配列番号９、配列番号１１から配列番号２２、配列番
号２４および配列番号２５の核酸配列（例えば、配列表
の配列番号１から配列番号４、配列番号６から配列番号
７、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４から配
列番号２０、配列番号２２、配列番号２４および配列番
号２５の核酸配列）、並びにそれらの末端に対し数塩基
を欠失または付加した核酸配列のプライマーから選ばれ
る、特定のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子群からなる少な
くとも１つの特定のグループ内の各遺伝子に共通の塩基
配列に特異的なプライマー対を用いて核酸の増幅反応を
行い、各特定のグループ内のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝
子群をグループとして選択的に増幅する工程； （ｂ）前記増幅反応により得られた産物の特定のサイ
ズ、特定の分子量または存在の有無を確認する、あるい
は該産物の塩基配列を直接決定することにより、対応す
る各特定のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子の型および／ま
たは各特定のグループ内のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子
群の特定の型をグループとして判別する工程。
【００１３】ここで上記工程（ａ）における目的遺伝子
の核酸の増幅反応は２つに分類することができる。一方
は各特定のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子を選択的に増幅
する工程（１）であり、また他の一方は各特定のグルー
プ内のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子群をグループとして
選択的に増幅する工程（２）である。前者の工程では、
プライマーは少なくとも１つの特定のＨＬＡ−ＤＱＡ１
対立遺伝子の塩基配列に特異的であるよう設定し、プラ
イマー対の少なくとも一方は配列表の配列番号１から配
列番号９、配列番号１１から配列番号２２、配列番号２
４および配列番号２５の核酸配列、並びにそれらの末端
に対し数塩基を欠失または付加した核酸配列のプライマ
ーを用いる。複数のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子の存在
下である特定のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子を選択的に
増幅する場合、該特定のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子に
対応するプライマー対としてセンス（Sense）、アンチ
センス（Antisense）の両方に必ずしも該特定のＨＬＡ
−ＤＱＡ１対立遺伝子のみに特異的なプライマーを用い
る必要はなく、一方に該特定のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺
伝子に特異的なプライマーを用い、もう一方に全てのＨ
ＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子に特異的なプライマーを用い
てもよい。後者の工程では、プライマーはＨＬＡ−ＤＱ
Ａ１対立遺伝子群からなる特定のグループを増幅するた
めに、該特定のグループに含まれる全ての各遺伝子に共
通な塩基配列に特異的であるように設定し、前記同様、
プライマー対の少なくとも一方は配列表の配列番号１か
ら配列番号９、配列番号１１から配列番号２２、配列番
号２４および配列番号２５の核酸配列、並びにそれらの
末端に対し数塩基を欠失または付加した核酸配列のプラ
イマーを用いる。複数のグループの存在下である特定の
グループを選択的に増幅する場合、該特定のグループに
対応するプライマー対としてセンス、アンチセンスの両
方に必ずしも該特定のグループのみに特異的なプライマ
ーを用いる必要はなく、一方に該特定のグループに特異
的なプライマーを用い、もう一方に全てのグループに特
異的なプライマーを用いてもよい。なお前記増幅反応の
鋳型として用いるＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子またはそ
の断片を含む核酸は、通常ヒト由来の試料から抽出され
た染色体ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）であるが、その転写産
物である伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはその相補的ＤＮ
Ａ（ｃＤＮＡ）であってもよく、本発明はｍＲＮＡなど
からの核酸の増幅反応も含むものである。但しその場
合、配列表の配列番号１４、配列番号２０および配列番
号２５の核酸配列はイントロンの塩基配列に特異的であ
るよう設定されているので、一般的にはプライマーとし
て用いることができない。
の核酸の増幅反応は２つに分類することができる。一方
は各特定のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子を選択的に増幅
する工程（１）であり、また他の一方は各特定のグルー
プ内のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子群をグループとして
選択的に増幅する工程（２）である。前者の工程では、
プライマーは少なくとも１つの特定のＨＬＡ−ＤＱＡ１
対立遺伝子の塩基配列に特異的であるよう設定し、プラ
イマー対の少なくとも一方は配列表の配列番号１から配
列番号９、配列番号１１から配列番号２２、配列番号２
４および配列番号２５の核酸配列、並びにそれらの末端
に対し数塩基を欠失または付加した核酸配列のプライマ
ーを用いる。複数のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子の存在
下である特定のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子を選択的に
増幅する場合、該特定のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子に
対応するプライマー対としてセンス（Sense）、アンチ
センス（Antisense）の両方に必ずしも該特定のＨＬＡ
−ＤＱＡ１対立遺伝子のみに特異的なプライマーを用い
る必要はなく、一方に該特定のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺
伝子に特異的なプライマーを用い、もう一方に全てのＨ
ＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子に特異的なプライマーを用い
てもよい。後者の工程では、プライマーはＨＬＡ−ＤＱ
Ａ１対立遺伝子群からなる特定のグループを増幅するた
めに、該特定のグループに含まれる全ての各遺伝子に共
通な塩基配列に特異的であるように設定し、前記同様、
プライマー対の少なくとも一方は配列表の配列番号１か
ら配列番号９、配列番号１１から配列番号２２、配列番
号２４および配列番号２５の核酸配列、並びにそれらの
末端に対し数塩基を欠失または付加した核酸配列のプラ
イマーを用いる。複数のグループの存在下である特定の
グループを選択的に増幅する場合、該特定のグループに
対応するプライマー対としてセンス、アンチセンスの両
方に必ずしも該特定のグループのみに特異的なプライマ
ーを用いる必要はなく、一方に該特定のグループに特異
的なプライマーを用い、もう一方に全てのグループに特
異的なプライマーを用いてもよい。なお前記増幅反応の
鋳型として用いるＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子またはそ
の断片を含む核酸は、通常ヒト由来の試料から抽出され
た染色体ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）であるが、その転写産
物である伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはその相補的ＤＮ
Ａ（ｃＤＮＡ）であってもよく、本発明はｍＲＮＡなど
からの核酸の増幅反応も含むものである。但しその場
合、配列表の配列番号１４、配列番号２０および配列番
号２５の核酸配列はイントロンの塩基配列に特異的であ
るよう設定されているので、一般的にはプライマーとし
て用いることができない。
【００１４】上記工程（１）では増幅反応終了後、例え
ば該産物に対して電気泳動法を行い特定のＤＮＡバンド
の存在の有無を確認することで各特定のＨＬＡ−ＤＱＡ
１対立遺伝子の型を判別することできるが、工程（２）
では例えば同様に増幅産物の電気泳動を行った場合、各
特定のグループ内のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子群の特
定の型がグループとして判別されるのみであり、この段
階では各グループ内のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子それ
ぞれの型まで判別できない。従って後者の場合は、ＨＬ
Ａ−ＤＱＡ１対立遺伝子をそのまま特定のグループとし
て判別するか、または該増幅産物に対して塩基配列決定
法（Sequencing）などを適用し各特定のＨＬＡ−ＤＱＡ
１対立遺伝子の型を判別する。例えばＰＣＲ増幅産物に
対する塩基配列決定法としては、近年、サイクルシーク
エンス法（Cycle Sequencing）が多用されており、本発
明の判別方法においても適用することができる。塩基配
列決定法については多くの成書（例えば、Ausubel, F.
et al., Current Protocols in Molecular Biology : J
ohn Wiley & Sons, 1987）に記載されているので、それ
らに従って行うことができる。なお本発明で開示されて
いるプライマーは、前記塩基配列決定法におけるプライ
マーとしての用途にも適用することが可能である。
ば該産物に対して電気泳動法を行い特定のＤＮＡバンド
の存在の有無を確認することで各特定のＨＬＡ−ＤＱＡ
１対立遺伝子の型を判別することできるが、工程（２）
では例えば同様に増幅産物の電気泳動を行った場合、各
特定のグループ内のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子群の特
定の型がグループとして判別されるのみであり、この段
階では各グループ内のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子それ
ぞれの型まで判別できない。従って後者の場合は、ＨＬ
Ａ−ＤＱＡ１対立遺伝子をそのまま特定のグループとし
て判別するか、または該増幅産物に対して塩基配列決定
法（Sequencing）などを適用し各特定のＨＬＡ−ＤＱＡ
１対立遺伝子の型を判別する。例えばＰＣＲ増幅産物に
対する塩基配列決定法としては、近年、サイクルシーク
エンス法（Cycle Sequencing）が多用されており、本発
明の判別方法においても適用することができる。塩基配
列決定法については多くの成書（例えば、Ausubel, F.
et al., Current Protocols in Molecular Biology : J
ohn Wiley & Sons, 1987）に記載されているので、それ
らに従って行うことができる。なお本発明で開示されて
いるプライマーは、前記塩基配列決定法におけるプライ
マーとしての用途にも適用することが可能である。
【００１５】好ましい実施態様としては、上記工程
（ａ）においては、工程（１）の少なくとも１つの特定
のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子の塩基配列に特異的なプ
ライマー対が、配列表の配列番号４と配列番号１６、配
列番号１２と配列番号１５、配列番号５と配列番号１
４、配列番号１２と配列番号１７、配列番号６と配列番
号１８、配列番号８と配列番号２０、配列番号９と配列
番号２１、配列番号１１と配列番号１８、配列番号１２
と配列番号２４および配列番号１３と配列番号２５の核
酸配列の組み合わせから選ばれるものであり、また工程
（２）の特定のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子群からなる
少なくとも１つの特定のグループ内の各遺伝子に共通の
塩基配列に特異的な各グループに対応するプライマー対
が、配列表の配列番号１と配列番号１４、配列番号２と
配列番号１４、配列番号３と配列番号１５、配列番号４
と配列番号１５、配列番号６と配列番号１９、配列番号
７と配列番号２０および配列番号１０と配列番号２２の
核酸配列の組み合わせから選ばれるものである。上述し
たように、前記核酸配列からなるプライマーは該プライ
マーが本来有するハイブリダイゼーション（アニーリン
グ）の特異性を維持する範囲でその末端配列に対し数塩
基の欠失または付加を行うことができるので、本発明の
プライマー対は、前記核酸配列に対し前記範囲で塩基の
欠失または付加をした核酸配列から選ばれるプライマー
の組み合わせも含むものである。
（ａ）においては、工程（１）の少なくとも１つの特定
のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子の塩基配列に特異的なプ
ライマー対が、配列表の配列番号４と配列番号１６、配
列番号１２と配列番号１５、配列番号５と配列番号１
４、配列番号１２と配列番号１７、配列番号６と配列番
号１８、配列番号８と配列番号２０、配列番号９と配列
番号２１、配列番号１１と配列番号１８、配列番号１２
と配列番号２４および配列番号１３と配列番号２５の核
酸配列の組み合わせから選ばれるものであり、また工程
（２）の特定のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子群からなる
少なくとも１つの特定のグループ内の各遺伝子に共通の
塩基配列に特異的な各グループに対応するプライマー対
が、配列表の配列番号１と配列番号１４、配列番号２と
配列番号１４、配列番号３と配列番号１５、配列番号４
と配列番号１５、配列番号６と配列番号１９、配列番号
７と配列番号２０および配列番号１０と配列番号２２の
核酸配列の組み合わせから選ばれるものである。上述し
たように、前記核酸配列からなるプライマーは該プライ
マーが本来有するハイブリダイゼーション（アニーリン
グ）の特異性を維持する範囲でその末端配列に対し数塩
基の欠失または付加を行うことができるので、本発明の
プライマー対は、前記核酸配列に対し前記範囲で塩基の
欠失または付加をした核酸配列から選ばれるプライマー
の組み合わせも含むものである。
【００１６】好ましい実施態様としては、上記ＨＬＡ−
ＤＱＡ１対立遺伝子型の判別方法における核酸の増幅反
応はＰＣＲ法である。従って、上記工程（ａ）における
増幅反応としてＰＣＲ法を適用することができる。
ＤＱＡ１対立遺伝子型の判別方法における核酸の増幅反
応はＰＣＲ法である。従って、上記工程（ａ）における
増幅反応としてＰＣＲ法を適用することができる。
【００１７】近年、ヒト由来のゲノムＤＮＡ若しくはｍ
ＲＮＡから特定の遺伝子を増幅する技法として上記ＰＣ
Ｒ法の他にもＴＭＡ（Transcription Mediated Amplifi
cation）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence Base
d Amplification）法、ＬＣＲ（Ligase Chain Reactio
n）法などが開発されており、上記核酸の増幅反応とし
てこれらの技法を用いることが可能である。すなわち本
発明のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子型の判別方法は、特
定の遺伝子若しくは遺伝子領域に存在する特異的な塩基
配列を利用して核酸の増幅反応を行い該特定の遺伝子若
しくは遺伝子領域を決定するのならば、ＰＣＲ法以外の
技法を適用することができる。従って本発明で開示され
ているプライマーはＰＣＲ法によるＨＬＡ−ＤＱＡ１対
立遺伝子型の判別方法の用途に限定されるものではな
く、前記増幅技法によるＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子タイピ
ングの用途にも適用できる。
ＲＮＡから特定の遺伝子を増幅する技法として上記ＰＣ
Ｒ法の他にもＴＭＡ（Transcription Mediated Amplifi
cation）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence Base
d Amplification）法、ＬＣＲ（Ligase Chain Reactio
n）法などが開発されており、上記核酸の増幅反応とし
てこれらの技法を用いることが可能である。すなわち本
発明のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子型の判別方法は、特
定の遺伝子若しくは遺伝子領域に存在する特異的な塩基
配列を利用して核酸の増幅反応を行い該特定の遺伝子若
しくは遺伝子領域を決定するのならば、ＰＣＲ法以外の
技法を適用することができる。従って本発明で開示され
ているプライマーはＰＣＲ法によるＨＬＡ−ＤＱＡ１対
立遺伝子型の判別方法の用途に限定されるものではな
く、前記増幅技法によるＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子タイピ
ングの用途にも適用できる。
【００１８】例えば上記ＴＭＡ法としては、以下の
（１）から（５）の工程を行えばよい； （１）標的となる核酸（ｍＲＮＡ）の3'末端に、ＲＮＡ
プロモーターを組み込んだ第１のプライマーをアニーリ
ングさせ、ＤＮＡ合成酵素を用いて該プライマーを伸長
させる； （２）ＲＮＡ分解酵素Ｈ（RNaseH）を用いて鋳型のＲＮ
Ａを除去する； （３）該ＤＮＡ伸長産物の3'末端に第２のプライマーを
アニーリングさせ、ＤＮＡ合成酵素を用いて二本鎖ＤＮ
Ａを合成する； （４）ＲＮＡ合成酵素を用いて該二本鎖ＤＮＡからＲＮ
Ａを転写させる； （５）前記ステップを繰り返すことにより目的遺伝子を
ＲＮＡとして増幅する。ここで前記ＴＭＡ法において
は、第１のプライマーまたは第２のプライマーとして本
発明で開示されているプライマーを用いればよい。但し
既に上述しているように、一般的には配列表の配列番号
１４、配列番号２０および配列番号２５の核酸配列はプ
ライマーとして用いることができない。なお上記ＮＡＳ
ＢＡ法は、前記ＴＭＡ法と類似の技術であり、Compton
の文献（Compton, J., NATURE 1991 :350: 91-92）を参
照すればよい。
（１）から（５）の工程を行えばよい； （１）標的となる核酸（ｍＲＮＡ）の3'末端に、ＲＮＡ
プロモーターを組み込んだ第１のプライマーをアニーリ
ングさせ、ＤＮＡ合成酵素を用いて該プライマーを伸長
させる； （２）ＲＮＡ分解酵素Ｈ（RNaseH）を用いて鋳型のＲＮ
Ａを除去する； （３）該ＤＮＡ伸長産物の3'末端に第２のプライマーを
アニーリングさせ、ＤＮＡ合成酵素を用いて二本鎖ＤＮ
Ａを合成する； （４）ＲＮＡ合成酵素を用いて該二本鎖ＤＮＡからＲＮ
Ａを転写させる； （５）前記ステップを繰り返すことにより目的遺伝子を
ＲＮＡとして増幅する。ここで前記ＴＭＡ法において
は、第１のプライマーまたは第２のプライマーとして本
発明で開示されているプライマーを用いればよい。但し
既に上述しているように、一般的には配列表の配列番号
１４、配列番号２０および配列番号２５の核酸配列はプ
ライマーとして用いることができない。なお上記ＮＡＳ
ＢＡ法は、前記ＴＭＡ法と類似の技術であり、Compton
の文献（Compton, J., NATURE 1991 :350: 91-92）を参
照すればよい。
【００１９】また例えば上記ＬＣＲ法としては、以下の
（１）から（４）の工程を行えばよい； （１）標的となる核酸（例えばゲノムＤＮＡ）を一本鎖
ＤＮＡにし、該ＤＮＡに対し第１のプライマーをアニー
リングさせる； （２）さらに前記ＤＮＡの第１のプライマーに隣接する
位置に、第２のプライマーをアニーリングさせる； （３）耐熱性ＤＮＡリガーゼを用いて第１のプライマー
と第２のプライマーを接続する； （４）前記ステップを繰り返すことにより目的遺伝子を
増幅する。 ここで前記ＬＣＲ法においては、第１のプライマーまた
は第２のプライマーとして本発明で開示されているプラ
イマーを用いればよい。
（１）から（４）の工程を行えばよい； （１）標的となる核酸（例えばゲノムＤＮＡ）を一本鎖
ＤＮＡにし、該ＤＮＡに対し第１のプライマーをアニー
リングさせる； （２）さらに前記ＤＮＡの第１のプライマーに隣接する
位置に、第２のプライマーをアニーリングさせる； （３）耐熱性ＤＮＡリガーゼを用いて第１のプライマー
と第２のプライマーを接続する； （４）前記ステップを繰り返すことにより目的遺伝子を
増幅する。 ここで前記ＬＣＲ法においては、第１のプライマーまた
は第２のプライマーとして本発明で開示されているプラ
イマーを用いればよい。
【００２０】好ましい実施態様としては、上記増幅反応
により得られた産物の解析方法は電気泳動法である。す
なわち上記核酸の増幅反応により得られた産物を電気泳
動法により展開し、ＤＮＡバンドの特定のサイズまたは
存在の有無を確認することにより、対応する各特定のＨ
ＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子の型および／または各特定の
グループ内のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子群の特定の型
をグループとして判別する。ここで電気泳動法として
は、一般的にはアガロースゲル電気泳動法、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法など
のゲル電気泳動の技法が利用される。これらの方法は多
くの成書（例えば、Sambrook, J. et al.,Molecular Cl
oning A Laboratory Manual 2nd ed. : COLD SPRING HA
RBOR LABORATORY PRESS, 1989）に記載されているの
で、それらに従って行うことができる。
により得られた産物の解析方法は電気泳動法である。す
なわち上記核酸の増幅反応により得られた産物を電気泳
動法により展開し、ＤＮＡバンドの特定のサイズまたは
存在の有無を確認することにより、対応する各特定のＨ
ＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子の型および／または各特定の
グループ内のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子群の特定の型
をグループとして判別する。ここで電気泳動法として
は、一般的にはアガロースゲル電気泳動法、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法など
のゲル電気泳動の技法が利用される。これらの方法は多
くの成書（例えば、Sambrook, J. et al.,Molecular Cl
oning A Laboratory Manual 2nd ed. : COLD SPRING HA
RBOR LABORATORY PRESS, 1989）に記載されているの
で、それらに従って行うことができる。
【００２１】ＰＣＲ法により得られた産物の解析方法と
しては、従来から上記ゲル電気泳動法および核酸特異染
色が一般的に用いられているが、それ以外にも多数の技
術が開発されている。例えば最近開発されたＴａｑＭａ
ｎプローブシステム（パーキンエルマー社製）は、ＰＣ
Ｒ法による核酸の増幅反応に蛍光プローブを加え、その
蛍光強度の変化を利用することにより、被検試料由来の
特定の遺伝子を容易に検出若しくは定量するものであ
る。従って本発明で開示されているプライマーを前記シ
ステムに適用することで、ＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子タイ
ピングをさらに容易に行なうことが可能である。
しては、従来から上記ゲル電気泳動法および核酸特異染
色が一般的に用いられているが、それ以外にも多数の技
術が開発されている。例えば最近開発されたＴａｑＭａ
ｎプローブシステム（パーキンエルマー社製）は、ＰＣ
Ｒ法による核酸の増幅反応に蛍光プローブを加え、その
蛍光強度の変化を利用することにより、被検試料由来の
特定の遺伝子を容易に検出若しくは定量するものであ
る。従って本発明で開示されているプライマーを前記シ
ステムに適用することで、ＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子タイ
ピングをさらに容易に行なうことが可能である。
【００２２】また本発明は、上記方法においてＨＬＡ−
ＤＱＡ１対立遺伝子群の特定の型がグループとして判別
された場合に、被検試料より得られるゲノムＤＮＡ若し
くは上記増幅産物に対して、さらにＲＦＬＰ法、ＰＣＲ
−ＲＦＬＰ法、ＳＳＯＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法、ＰＣ
Ｒ−ＳＳＰ法またはＰＣＲ−ＳＳＣＰ法の技法を用いて
各特定のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子の型まで判別する
方法を提供する。これらの方法は多くの成書（例えば、
中山広樹著, 細胞工学別冊 新版バイオ実験イラストレ
イテッド vol.3 : 秀潤社, 1998）に記載されているの
で、それらに従って行うことができる。また既に上述し
ているが別法として、ＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子群を
グループとして選択的に増幅する工程で得られた増幅産
物に対して塩基配列決定法を適用することにより、各特
定のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子の型を判別することが
可能である。
ＤＱＡ１対立遺伝子群の特定の型がグループとして判別
された場合に、被検試料より得られるゲノムＤＮＡ若し
くは上記増幅産物に対して、さらにＲＦＬＰ法、ＰＣＲ
−ＲＦＬＰ法、ＳＳＯＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法、ＰＣ
Ｒ−ＳＳＰ法またはＰＣＲ−ＳＳＣＰ法の技法を用いて
各特定のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子の型まで判別する
方法を提供する。これらの方法は多くの成書（例えば、
中山広樹著, 細胞工学別冊 新版バイオ実験イラストレ
イテッド vol.3 : 秀潤社, 1998）に記載されているの
で、それらに従って行うことができる。また既に上述し
ているが別法として、ＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子群を
グループとして選択的に増幅する工程で得られた増幅産
物に対して塩基配列決定法を適用することにより、各特
定のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子の型を判別することが
可能である。
【００２３】例えば上記ＲＦＬＰ法としては、以下の
（１）および（２）の工程を行えばよい； （１）各特定のグループ内のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝
子群の増幅産物を、特異的な切断部位を与える制限酵素
または全く切断部位を与えない制限酵素により処理す
る； （２）前記制限酵素により処理した増幅産物を電気泳動
法により展開し、制限酵素切断の存在の有無を反映する
ＤＮＡ断片サイズを判読し、既知のＨＬＡ−ＤＱＡ１対
立遺伝子型のＤＮＡ断片サイズを記載した判定表に照ら
して該ＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子群の各型を判別す
る。
（１）および（２）の工程を行えばよい； （１）各特定のグループ内のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝
子群の増幅産物を、特異的な切断部位を与える制限酵素
または全く切断部位を与えない制限酵素により処理す
る； （２）前記制限酵素により処理した増幅産物を電気泳動
法により展開し、制限酵素切断の存在の有無を反映する
ＤＮＡ断片サイズを判読し、既知のＨＬＡ−ＤＱＡ１対
立遺伝子型のＤＮＡ断片サイズを記載した判定表に照ら
して該ＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子群の各型を判別す
る。
【００２４】また例えば上記ＳＳＯＰ法としては、以下
の（１）から（３）の工程を行えばよい； （１）各特定のグループ内のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝
子群の増幅産物を、ナイロンまたはニトロセルロースな
どの膜にブロッティングする； （２）ＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子の多型性を示す領域
に相補的なオリゴヌクレオチドプローブを前記膜に対し
てハイブリダイズさせる； （３）前記増幅産物がオリゴヌクレオチドプローブにハ
イブリダイズしているか否かを検出することにより該Ｈ
ＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子群の各型を判別する。なお前
記ＳＳＯＰ法は、その変法である逆ドットブロット（re
verse dot blot）法も含むものである。
の（１）から（３）の工程を行えばよい； （１）各特定のグループ内のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝
子群の増幅産物を、ナイロンまたはニトロセルロースな
どの膜にブロッティングする； （２）ＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子の多型性を示す領域
に相補的なオリゴヌクレオチドプローブを前記膜に対し
てハイブリダイズさせる； （３）前記増幅産物がオリゴヌクレオチドプローブにハ
イブリダイズしているか否かを検出することにより該Ｈ
ＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子群の各型を判別する。なお前
記ＳＳＯＰ法は、その変法である逆ドットブロット（re
verse dot blot）法も含むものである。
【００２５】また本発明は、本明細書記載のＨＬＡ−Ｄ
ＱＡ１対立遺伝子型の判別方法に使用するためのキッ
ト、試薬も提供することが可能である。さらに本発明
は、本明細書記載のプライマーを含むキット、試薬も提
供することが可能である。前記キットは、例えばＰＣＲ
法によるタイピングキットとして、本発明で開示されて
いるプライマー（配列表の配列番号１から配列番号２５
の核酸配列）を含む溶液、ＰＣＲ緩衝液（濃縮溶液でも
よい）、dNTPs、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよび該キ
ットの説明書により構成される。前記プライマーは放射
性または非放射性の物質により標識されていても標識さ
れていなくてもよく、プライマー対の形で構成されてい
てもよい。また該プライマーを含む溶液は凍結乾燥状態
でもよい。さらにゲノムＤＮＡを単離するためのグアニ
ジンチオシアネートバッファーなど、キットの構成は本
発明の実施を促進する程度で任意に追加することができ
る。
ＱＡ１対立遺伝子型の判別方法に使用するためのキッ
ト、試薬も提供することが可能である。さらに本発明
は、本明細書記載のプライマーを含むキット、試薬も提
供することが可能である。前記キットは、例えばＰＣＲ
法によるタイピングキットとして、本発明で開示されて
いるプライマー（配列表の配列番号１から配列番号２５
の核酸配列）を含む溶液、ＰＣＲ緩衝液（濃縮溶液でも
よい）、dNTPs、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよび該キ
ットの説明書により構成される。前記プライマーは放射
性または非放射性の物質により標識されていても標識さ
れていなくてもよく、プライマー対の形で構成されてい
てもよい。また該プライマーを含む溶液は凍結乾燥状態
でもよい。さらにゲノムＤＮＡを単離するためのグアニ
ジンチオシアネートバッファーなど、キットの構成は本
発明の実施を促進する程度で任意に追加することができ
る。
【００２６】上述したようにＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝
子は新規なものが次々と発見され、ＷＨＯのＨＬＡ命名
委員会の報告書では現時点において１６種類のＨＬＡ−
ＤＱＡ１対立遺伝子の存在が明らかされている。本発明
の判別方法はこれら全ての対立遺伝子を識別することが
可能であるが、今後さらに発見・登録される対立遺伝子
の識別についても、本発明で示した方法、キットは上記
以外のプライマーの追加などの容易な改変により対応す
ることが可能である。
子は新規なものが次々と発見され、ＷＨＯのＨＬＡ命名
委員会の報告書では現時点において１６種類のＨＬＡ−
ＤＱＡ１対立遺伝子の存在が明らかされている。本発明
の判別方法はこれら全ての対立遺伝子を識別することが
可能であるが、今後さらに発見・登録される対立遺伝子
の識別についても、本発明で示した方法、キットは上記
以外のプライマーの追加などの容易な改変により対応す
ることが可能である。
【００２７】
【本発明の実施の形態】次に、上記本発明の手順の一つ
をさらに詳細に説明する。
をさらに詳細に説明する。
【００２８】１）染色体（ゲノム）ＤＮＡの抽出 以下にゲノムＤＮＡの調製方法の一例を説明する。採取
した血液より常法に従い白血球を分離し、グアニジンチ
オシアネートバッファーを加えて溶解させた後、フェノ
ール／クロロホルム抽出によりタンパク質を除去する。
これに酢酸ナトリウム（pH 5.2）を添加し攪拌後、冷エ
タノールを添加してゲノムＤＮＡを得る。
した血液より常法に従い白血球を分離し、グアニジンチ
オシアネートバッファーを加えて溶解させた後、フェノ
ール／クロロホルム抽出によりタンパク質を除去する。
これに酢酸ナトリウム（pH 5.2）を添加し攪拌後、冷エ
タノールを添加してゲノムＤＮＡを得る。
【００２９】２）目的遺伝子のＰＣＲ増幅 上記ＤＮＡを鋳型として、ＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子
を含む領域をＰＣＲ法により増幅する。表１に該ＰＣＲ
法に用いるプライマー対（センス、アンチセンスの２種
類のプライマーの組み合わせ）およびそれにより判別さ
れるＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子の一例を示す。なお前
記増幅反応に用いる試薬は市販のものを使用することが
でき、添付の説明書の指示に従って行えばよいが、必要
に応じ反応温度、時間、サイクル数などの条件を変えて
もよい。このとき１反応チューブに１プライマー対を用
いて増幅を行うが、該反応チューブに複数のプライマー
対を入れて増幅させ、操作タスクや経費の削減を実現す
ることができる。
を含む領域をＰＣＲ法により増幅する。表１に該ＰＣＲ
法に用いるプライマー対（センス、アンチセンスの２種
類のプライマーの組み合わせ）およびそれにより判別さ
れるＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子の一例を示す。なお前
記増幅反応に用いる試薬は市販のものを使用することが
でき、添付の説明書の指示に従って行えばよいが、必要
に応じ反応温度、時間、サイクル数などの条件を変えて
もよい。このとき１反応チューブに１プライマー対を用
いて増幅を行うが、該反応チューブに複数のプライマー
対を入れて増幅させ、操作タスクや経費の削減を実現す
ることができる。
【００３０】例えばＨＬＡ−ＤＱＡ１*０３関連アリル
特異的なＰＣＲ法を実施する場合、配列表の配列番号６
と配列番号１８、配列番号６と配列番号１９、配列番号
７と配列番号２０および配列番号８と配列番号２０の核
酸配列の組み合わせからなるそれぞれのプライマー対を
用いてＰＣＲ法を行えばよい。
特異的なＰＣＲ法を実施する場合、配列表の配列番号６
と配列番号１８、配列番号６と配列番号１９、配列番号
７と配列番号２０および配列番号８と配列番号２０の核
酸配列の組み合わせからなるそれぞれのプライマー対を
用いてＰＣＲ法を行えばよい。
【００３１】また例えばＨＬＡ−ＤＱＡ１*０５関連ア
リル特異的なＰＣＲ法を実施する場合、配列表の配列番
号１０と配列番号２２、配列番号１０と配列番号２３、
配列番号１１と配列番号１８および配列番号１３と配列
番号２５の核酸配列の組み合わせからなるそれぞれのプ
ライマー対を用いてＰＣＲ法を行えばよい。なお、前記
配列番号１０と配列番号２３の核酸配列の組み合わせか
らなるプライマー対に関しては本発明者ら自身の文献
（Tissue Antigens 1997、前出）を参照のこと。
リル特異的なＰＣＲ法を実施する場合、配列表の配列番
号１０と配列番号２２、配列番号１０と配列番号２３、
配列番号１１と配列番号１８および配列番号１３と配列
番号２５の核酸配列の組み合わせからなるそれぞれのプ
ライマー対を用いてＰＣＲ法を行えばよい。なお、前記
配列番号１０と配列番号２３の核酸配列の組み合わせか
らなるプライマー対に関しては本発明者ら自身の文献
（Tissue Antigens 1997、前出）を参照のこと。
【００３２】また例えば全てのＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺
伝子のタイピングを実施する場合、配列表の配列番号１
と配列番号１４、配列番号２と配列番号１４、配列番号
３と配列番号１５、配列番号４と配列番号１５、配列番
号４と配列番号１６、配列番号１２と配列番号１５、配
列番号５と配列番号１４、配列番号１２と配列番号１
７、配列番号６と配列番号１８、配列番号６と配列番号
１９、配列番号７と配列番号２０、配列番号８と配列番
号２０、配列番号９と配列番号２１、配列番号１０と配
列番号２２、配列番号１０と配列番号２３、配列番号１
１と配列番号１８、配列番号１２と配列番号２４および
配列番号１３と配列番号２５の核酸配列からなるそれぞ
れのプライマー対を用いてＰＣＲ法を行えばよい。
伝子のタイピングを実施する場合、配列表の配列番号１
と配列番号１４、配列番号２と配列番号１４、配列番号
３と配列番号１５、配列番号４と配列番号１５、配列番
号４と配列番号１６、配列番号１２と配列番号１５、配
列番号５と配列番号１４、配列番号１２と配列番号１
７、配列番号６と配列番号１８、配列番号６と配列番号
１９、配列番号７と配列番号２０、配列番号８と配列番
号２０、配列番号９と配列番号２１、配列番号１０と配
列番号２２、配列番号１０と配列番号２３、配列番号１
１と配列番号１８、配列番号１２と配列番号２４および
配列番号１３と配列番号２５の核酸配列からなるそれぞ
れのプライマー対を用いてＰＣＲ法を行えばよい。
【００３３】３．遺伝子型の判定 ＰＣＲ法による増幅産物は常法に従い、２％程度のアガ
ロースゲルで電気泳動後、該ゲルをエチジウムブロマイ
ド（臭化エチジウム）で染色して紫外線照射下で観察す
ることによりアリル若しくはグループ特異的に増幅した
ＤＮＡバンドを検出する。またゲルはポリアクリルアミ
ドなども用いることができ、ゲル濃度は必要に応じ変え
てもよい。なおこの電気泳動法では、各被検試料がＨＬ
Ａ−ＤＱＡ１対立遺伝子の特定の型をホモ接合体または
ヘテロ接合体で保有することに留意する。
ロースゲルで電気泳動後、該ゲルをエチジウムブロマイ
ド（臭化エチジウム）で染色して紫外線照射下で観察す
ることによりアリル若しくはグループ特異的に増幅した
ＤＮＡバンドを検出する。またゲルはポリアクリルアミ
ドなども用いることができ、ゲル濃度は必要に応じ変え
てもよい。なおこの電気泳動法では、各被検試料がＨＬ
Ａ−ＤＱＡ１対立遺伝子の特定の型をホモ接合体または
ヘテロ接合体で保有することに留意する。
【００３４】
【表１】
【００３５】
【実施例】次に、実際の既知試料を用いた実施例によっ
て本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこ
れらのみに限定されるものではない。
て本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこ
れらのみに限定されるものではない。
【００３６】実施例１ＨＬＡ−ＤＱＡ１*０３関連アリル特異的なＰＣＲ法 正常人より採取した血液（約10ml）より常法に従い白血
球を分離し、これに500μlのグアニジンチオシアネート
バッファー（４Mグアニジンチオシアネート、25mMクエ
ン酸ナトリウム（pH 7.0）、0.5％ Ｎ−ラウロイルサル
コシルナトリウム、1％メルカプトエタノール）を加え
て溶解させた後、2回のフェノール／クロロホルム抽出
によりタンパク質を除去した。これに３M酢酸ナトリウ
ム（pH 5.2）を添加し攪拌後、2倍量の冷エタノールを
添加してゲノムＤＮＡを得た。このＤＮＡを用いて、以
下のようにしてＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子の型判定を行っ
た。
球を分離し、これに500μlのグアニジンチオシアネート
バッファー（４Mグアニジンチオシアネート、25mMクエ
ン酸ナトリウム（pH 7.0）、0.5％ Ｎ−ラウロイルサル
コシルナトリウム、1％メルカプトエタノール）を加え
て溶解させた後、2回のフェノール／クロロホルム抽出
によりタンパク質を除去した。これに３M酢酸ナトリウ
ム（pH 5.2）を添加し攪拌後、2倍量の冷エタノールを
添加してゲノムＤＮＡを得た。このＤＮＡを用いて、以
下のようにしてＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子の型判定を行っ
た。
【００３７】上記の方法で調整したＤＮＡ試料（試料１
〜４）を材料に、配列表の配列番号６と配列番号１８の
核酸配列の組み合わせからなるプライマー対（表１のレ
ーン９）、配列番号６と配列番号１９の核酸配列の組み
合わせからなるプライマー対（同レーン１０）、配列番
号７と配列番号２０の核酸配列の組み合わせからなるプ
ライマー対（同レーン１１）、配列番号８と配列番号２
０の核酸配列の組み合わせからなるプライマー対（同レ
ーン１２）を用いてＰＣＲ法を行なった。反応液はゲノ
ムＤＮＡを0.25μl（20〜50ｎｇ）、あらかじめ等量のT
aq StartTMAntibody（抗Taq DNA polymerase抗体、CLON
TECH社製）と室温で5分間反応させた耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼ（Taq DNA polymerase）を0.17 unit、そして
最終濃度がトリス塩酸（pH 8.8）は67 mM、硫酸アンモ
ニウムは16.6 mM、塩化マグネシウムは1.5 mM、Tween２
０は0.01％、dNTPsは200μM、プライマー対は1.0〜3.0
μMになるように添加した組成液で、全量を10μlとして
反応を行った。なお、それぞれのプライマー対の濃度に
ついては表１に示す。またＰＣＲ反応が良好であるかど
うかを調べるために、内部コントロール（internal con
trol）としてセンスプライマー DRBex9/519-537（配列
番号２６）およびアンチセンスプライマー 3'DRBint3
（配列番号２７）をそれぞれ0.5μＭになるように加
え、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子内の塩基配列がよく保存さ
れた領域（第３エクソン〜第３イントロンの１０３９ｂ
ｐ）の増幅を行った。ＤＮＡ増幅はGeneAmp PCR system
9600（パーキンエルマー社製）のＰＣＲ増幅装置を用
い、変性（９５℃）を２分行った後、変性２５秒、アニ
ーリング（７０℃）４５秒、ＤＮＡ伸長（７２℃）４５
秒の反応を５サイクル繰り返し、さらに変性２５秒、ア
ニーリング（６０℃）５０秒、ＤＮＡ伸長（７２℃）４
５秒の反応を２８サイクル繰り返すことにより行った。
〜４）を材料に、配列表の配列番号６と配列番号１８の
核酸配列の組み合わせからなるプライマー対（表１のレ
ーン９）、配列番号６と配列番号１９の核酸配列の組み
合わせからなるプライマー対（同レーン１０）、配列番
号７と配列番号２０の核酸配列の組み合わせからなるプ
ライマー対（同レーン１１）、配列番号８と配列番号２
０の核酸配列の組み合わせからなるプライマー対（同レ
ーン１２）を用いてＰＣＲ法を行なった。反応液はゲノ
ムＤＮＡを0.25μl（20〜50ｎｇ）、あらかじめ等量のT
aq StartTMAntibody（抗Taq DNA polymerase抗体、CLON
TECH社製）と室温で5分間反応させた耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼ（Taq DNA polymerase）を0.17 unit、そして
最終濃度がトリス塩酸（pH 8.8）は67 mM、硫酸アンモ
ニウムは16.6 mM、塩化マグネシウムは1.5 mM、Tween２
０は0.01％、dNTPsは200μM、プライマー対は1.0〜3.0
μMになるように添加した組成液で、全量を10μlとして
反応を行った。なお、それぞれのプライマー対の濃度に
ついては表１に示す。またＰＣＲ反応が良好であるかど
うかを調べるために、内部コントロール（internal con
trol）としてセンスプライマー DRBex9/519-537（配列
番号２６）およびアンチセンスプライマー 3'DRBint3
（配列番号２７）をそれぞれ0.5μＭになるように加
え、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子内の塩基配列がよく保存さ
れた領域（第３エクソン〜第３イントロンの１０３９ｂ
ｐ）の増幅を行った。ＤＮＡ増幅はGeneAmp PCR system
9600（パーキンエルマー社製）のＰＣＲ増幅装置を用
い、変性（９５℃）を２分行った後、変性２５秒、アニ
ーリング（７０℃）４５秒、ＤＮＡ伸長（７２℃）４５
秒の反応を５サイクル繰り返し、さらに変性２５秒、ア
ニーリング（６０℃）５０秒、ＤＮＡ伸長（７２℃）４
５秒の反応を２８サイクル繰り返すことにより行った。
【００３８】増幅産物は全て常法に従い、２％アガロー
スゲル電気泳動後、エチジウムブロマイド染色し、紫外
線照射下で観察することにより増幅したＤＮＡバンドの
検出を行った。そして、表１に示されるそれぞれのレー
ン番号に対応する断片長（fragment size）のＤＮＡバ
ンドが観察された場合を陽性（＋）、内部コントロール
の１０３９ｂｐのバンドのみが観察された場合を陰性
（−）と判定した。また、いずれのバンドも観察されな
い場合は「判定不可」とし、同一の操作を再度行なっ
た。その結果を図１に示す。
スゲル電気泳動後、エチジウムブロマイド染色し、紫外
線照射下で観察することにより増幅したＤＮＡバンドの
検出を行った。そして、表１に示されるそれぞれのレー
ン番号に対応する断片長（fragment size）のＤＮＡバ
ンドが観察された場合を陽性（＋）、内部コントロール
の１０３９ｂｐのバンドのみが観察された場合を陰性
（−）と判定した。また、いずれのバンドも観察されな
い場合は「判定不可」とし、同一の操作を再度行なっ
た。その結果を図１に示す。
【００３９】表１の「ＤＱＡ１特異性（DQA1-specifici
ties）」の欄を参照にして、上記試料１〜４のＨＬＡ−
ＤＱＡ１*０３関連アリルを判定した。その結果、試料
１はＤＱＡ１*０２０１、試料２はＤＱＡ１*０３０１
１、試料３はＤＱＡ１*０３０２、試料４はＤＱＡ１*０
３０３と判定され、それぞれの試料が該ＨＬＡ−ＤＱＡ
１アリルを少なくとも１種類保有していることが分かっ
た。
ties）」の欄を参照にして、上記試料１〜４のＨＬＡ−
ＤＱＡ１*０３関連アリルを判定した。その結果、試料
１はＤＱＡ１*０２０１、試料２はＤＱＡ１*０３０１
１、試料３はＤＱＡ１*０３０２、試料４はＤＱＡ１*０
３０３と判定され、それぞれの試料が該ＨＬＡ−ＤＱＡ
１アリルを少なくとも１種類保有していることが分かっ
た。
【００４０】実施例２ＨＬＡ−ＤＱＡ１*０５関連アリル特異的なＰＣＲ法 上記実施例１で調整したＤＮＡ試料（試料１〜３）を材
料に、配列表の配列番号１０と配列番号２２の核酸配列
の組み合わせからなるプライマー対（表１のレーン１
４）、配列番号１０と配列番号２３の核酸配列の組み合
わせからなるプライマー対（同レーン１５）、配列番号
１１と配列番号１８の核酸配列の組み合わせからなるプ
ライマー対（同レーン１６）、配列番号１３と配列番号
２５の核酸配列の組み合わせからなるプライマー対（同
レーン１８）を用いてＰＣＲ法を行なった。反応液はゲ
ノムＤＮＡを0.25μl（20〜50ｎｇ）、あらかじめ等量
のTaqStartTMAntibody（抗Taq DNA polymerase抗体、CL
ONTECH社製）と室温で5分間反応させた耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼ（Taq DNA polymerase）0.17 unit、そして
最終濃度がトリス塩酸（pH 8.8）は67 mM、硫酸アンモ
ニウムは16.6 mM、塩化マグネシウムは1.5 mM、Tween２
０は0.01％、dNTPsは200μM、プライマー対は1.0〜3.0
μMになるように添加した組成液で、全量を10μlとして
反応を行った。なお、それぞれのプライマー対の濃度に
ついては表１に示す。また内部コントロールとして、セ
ンスプライマー DRBex9/519-537（配列番号２６）およ
びアンチセンスプライマー 3'DRBint3（配列番号２７）
をそれぞれ0.5μＭになるように加え、ＨＬＡ−ＤＲＢ
１遺伝子内の塩基配列がよく保存された領域（第３エク
ソン〜第３イントロンの１０３９ｂｐ）の増幅を行っ
た。ＤＮＡ増幅はGeneAmp PCRsystem 9600（パーキンエ
ルマー社製）のＰＣＲ増幅装置を用い、変性（９５℃）
を２分行った後、変性２５秒、アニーリング（７０℃）
４５秒、ＤＮＡ伸長（７２℃）４５秒の反応を５サイク
ル繰り返し、さらに変性２５秒、アニーリング（６０
℃）５０秒、ＤＮＡ伸長（７２℃）４５秒の反応を２８
サイクル繰り返すことにより行った。
料に、配列表の配列番号１０と配列番号２２の核酸配列
の組み合わせからなるプライマー対（表１のレーン１
４）、配列番号１０と配列番号２３の核酸配列の組み合
わせからなるプライマー対（同レーン１５）、配列番号
１１と配列番号１８の核酸配列の組み合わせからなるプ
ライマー対（同レーン１６）、配列番号１３と配列番号
２５の核酸配列の組み合わせからなるプライマー対（同
レーン１８）を用いてＰＣＲ法を行なった。反応液はゲ
ノムＤＮＡを0.25μl（20〜50ｎｇ）、あらかじめ等量
のTaqStartTMAntibody（抗Taq DNA polymerase抗体、CL
ONTECH社製）と室温で5分間反応させた耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼ（Taq DNA polymerase）0.17 unit、そして
最終濃度がトリス塩酸（pH 8.8）は67 mM、硫酸アンモ
ニウムは16.6 mM、塩化マグネシウムは1.5 mM、Tween２
０は0.01％、dNTPsは200μM、プライマー対は1.0〜3.0
μMになるように添加した組成液で、全量を10μlとして
反応を行った。なお、それぞれのプライマー対の濃度に
ついては表１に示す。また内部コントロールとして、セ
ンスプライマー DRBex9/519-537（配列番号２６）およ
びアンチセンスプライマー 3'DRBint3（配列番号２７）
をそれぞれ0.5μＭになるように加え、ＨＬＡ−ＤＲＢ
１遺伝子内の塩基配列がよく保存された領域（第３エク
ソン〜第３イントロンの１０３９ｂｐ）の増幅を行っ
た。ＤＮＡ増幅はGeneAmp PCRsystem 9600（パーキンエ
ルマー社製）のＰＣＲ増幅装置を用い、変性（９５℃）
を２分行った後、変性２５秒、アニーリング（７０℃）
４５秒、ＤＮＡ伸長（７２℃）４５秒の反応を５サイク
ル繰り返し、さらに変性２５秒、アニーリング（６０
℃）５０秒、ＤＮＡ伸長（７２℃）４５秒の反応を２８
サイクル繰り返すことにより行った。
【００４１】増幅産物は全て常法に従い、２％アガロー
スゲル電気泳動後、エチジウムブロマイド染色し、紫外
線照射下で観察することにより増幅したＤＮＡバンドの
検出を行った。そして、表１に示されるそれぞれのレー
ン番号に対応する断片長（fragment size）のＤＮＡバ
ンドが観察された場合を陽性（＋）、内部コントロール
の１０３９ｂｐのバンドのみが観察された場合を陰性
（−）と判定した。また、いずれのバンドも観察されな
い場合は「判定不可」とし、同一の操作を再度行なっ
た。その結果を図２に示す。
スゲル電気泳動後、エチジウムブロマイド染色し、紫外
線照射下で観察することにより増幅したＤＮＡバンドの
検出を行った。そして、表１に示されるそれぞれのレー
ン番号に対応する断片長（fragment size）のＤＮＡバ
ンドが観察された場合を陽性（＋）、内部コントロール
の１０３９ｂｐのバンドのみが観察された場合を陰性
（−）と判定した。また、いずれのバンドも観察されな
い場合は「判定不可」とし、同一の操作を再度行なっ
た。その結果を図２に示す。
【００４２】表１の「ＤＱＡ１特異性（DQA1-specifici
ties）」の欄を参照にして、上記試料１〜３のＨＬＡ−
ＤＱＡ１*０５関連アリルを判定した。その結果、試料
１はＤＱＡ１*０５０１１、試料２はＤＱＡ１*０５０
５、試料３はＤＱＡ１*０５０３と判定され、それぞれ
の試料が該ＨＬＡ−ＤＱＡ１アリルを少なくとも１種類
保有していることが分かった。
ties）」の欄を参照にして、上記試料１〜３のＨＬＡ−
ＤＱＡ１*０５関連アリルを判定した。その結果、試料
１はＤＱＡ１*０５０１１、試料２はＤＱＡ１*０５０
５、試料３はＤＱＡ１*０５０３と判定され、それぞれ
の試料が該ＨＬＡ−ＤＱＡ１アリルを少なくとも１種類
保有していることが分かった。
【００４３】実施例３ＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子タイピング 上記実施例１と同様の方法で調整したＤＮＡ試料（試料
１'〜４'および５）を材料に、表１に示す１８種類のプ
ライマー対（レーン１〜１８）を用いてＰＣＲ法を行な
った。反応液はゲノムＤＮＡを0.25μl（20〜50ｎ
ｇ）、あらかじめ等量のTaq StartTMAntibody（抗Taq D
NA polymerase抗体、CLONTECH社製）と室温で5分間反応
させた耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Taq DNA polymeras
e）0.17 unit、そして最終濃度がトリス塩酸（pH 8.8）
は67 mM、硫酸アンモニウムは16.6 mM、塩化マグネシウ
ムは1.5 mM、Tween２０は0.01％、dNTPsは200μM、プラ
イマー対は1.0〜3.0μMになるように添加した組成液
で、全量を10μlとして反応を行った。なお、それぞれ
のプライマー対の濃度については表１に示す。また内部
コントロールとして、センスプライマー DRBex9/519-53
7（配列番号２６）およびアンチセンスプライマー 3'DR
Bint3（配列番号２７）をそれぞれ0.5μＭになるように
加え、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子内の塩基配列がよく保存
された領域（第３エクソン〜第３イントロンの１０３９
ｂｐ）の増幅を行った。ＤＮＡ増幅はGeneAmp PCR syst
em 9600（パーキンエルマー社製）のＰＣＲ増幅装置を
用い、変性（９５℃）を２分行った後、変性２５秒、ア
ニーリング（７０℃）４５秒、ＤＮＡ伸長（７２℃）４
５秒の反応を５サイクル繰り返し、さらに変性２５秒、
アニーリング（６０℃）５０秒、ＤＮＡ伸長（７２℃）
４５秒の反応を２８サイクル繰り返すことにより行っ
た。
１'〜４'および５）を材料に、表１に示す１８種類のプ
ライマー対（レーン１〜１８）を用いてＰＣＲ法を行な
った。反応液はゲノムＤＮＡを0.25μl（20〜50ｎ
ｇ）、あらかじめ等量のTaq StartTMAntibody（抗Taq D
NA polymerase抗体、CLONTECH社製）と室温で5分間反応
させた耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Taq DNA polymeras
e）0.17 unit、そして最終濃度がトリス塩酸（pH 8.8）
は67 mM、硫酸アンモニウムは16.6 mM、塩化マグネシウ
ムは1.5 mM、Tween２０は0.01％、dNTPsは200μM、プラ
イマー対は1.0〜3.0μMになるように添加した組成液
で、全量を10μlとして反応を行った。なお、それぞれ
のプライマー対の濃度については表１に示す。また内部
コントロールとして、センスプライマー DRBex9/519-53
7（配列番号２６）およびアンチセンスプライマー 3'DR
Bint3（配列番号２７）をそれぞれ0.5μＭになるように
加え、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子内の塩基配列がよく保存
された領域（第３エクソン〜第３イントロンの１０３９
ｂｐ）の増幅を行った。ＤＮＡ増幅はGeneAmp PCR syst
em 9600（パーキンエルマー社製）のＰＣＲ増幅装置を
用い、変性（９５℃）を２分行った後、変性２５秒、ア
ニーリング（７０℃）４５秒、ＤＮＡ伸長（７２℃）４
５秒の反応を５サイクル繰り返し、さらに変性２５秒、
アニーリング（６０℃）５０秒、ＤＮＡ伸長（７２℃）
４５秒の反応を２８サイクル繰り返すことにより行っ
た。
【００４４】増幅産物は全て常法に従い、２％アガロー
スゲル電気泳動後、エチジウムブロマイド染色し、紫外
線照射下で観察することにより増幅したＤＮＡバンドの
検出を行った。そして、表１に示されるそれぞれのレー
ン番号に対応する断片長（fragment size）のＤＮＡバ
ンドが観察された場合を陽性（＋）、内部コントロール
の１０３９ｂｐのバンドのみが観察された場合を陰性
（−）と判定した。また、いずれのバンドも観察されな
い場合は「判定不可」とし、同一の操作を再度行なっ
た。その結果を図３に示す。
スゲル電気泳動後、エチジウムブロマイド染色し、紫外
線照射下で観察することにより増幅したＤＮＡバンドの
検出を行った。そして、表１に示されるそれぞれのレー
ン番号に対応する断片長（fragment size）のＤＮＡバ
ンドが観察された場合を陽性（＋）、内部コントロール
の１０３９ｂｐのバンドのみが観察された場合を陰性
（−）と判定した。また、いずれのバンドも観察されな
い場合は「判定不可」とし、同一の操作を再度行なっ
た。その結果を図３に示す。
【００４５】表１の「ＤＱＡ１特異性（DQA1-specifici
ties）」の欄を参照にして、上記試料１'〜４'および５
のＨＬＡ−ＤＱＡ１型を判定した。その結果、試料１'
はＤＱＡ１*０１０２／*０１０４、試料２'はＤＱＡ１*
０２０１／*０５０５、試料３'はＤＱＡ１*０３０２／*
０５０３、試料４'はＤＱＡ１*０４０１／*０６０１、
試料５はＤＱＡ１*０１０２／*０１０５と判定され、そ
れぞれの試料が該ＨＬＡ−ＤＱＡ１アリルを保有してい
ることが分かった。
ties）」の欄を参照にして、上記試料１'〜４'および５
のＨＬＡ−ＤＱＡ１型を判定した。その結果、試料１'
はＤＱＡ１*０１０２／*０１０４、試料２'はＤＱＡ１*
０２０１／*０５０５、試料３'はＤＱＡ１*０３０２／*
０５０３、試料４'はＤＱＡ１*０４０１／*０６０１、
試料５はＤＱＡ１*０１０２／*０１０５と判定され、そ
れぞれの試料が該ＨＬＡ−ＤＱＡ１アリルを保有してい
ることが分かった。
【００４６】
【発明の効果】本発明によれば、ＨＬＡ−ＤＱＡ１対立
遺伝子またはその断片を含む核酸試料に対し本発明で開
示されているプライマーを用いて核酸の増幅反応（例え
ばＰＣＲ法）を行うことにより、現時点において明らか
にされている１６種類のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子の
全てを識別することができるので、ＨＬＡ−ＤＱ分子の
詳細な解析や、その応用として各種疾患の病因若しくは
病態の診断などの臨床適用に有用である。そして本発明
は、全てのＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子のタイピングを
容易に行なう方法や、それに用いるキットおよび試薬を
提供するので、これらは臓器移植の際のドナー・レシピ
エント間の適合性の判定やＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子
型と各種疾患との相関性の解析などにおいて有用であ
る。将来的には、ＤＮＡチップ法などの技術と組み合わ
せることによりさらに簡便かつ迅速に遺伝子タイピング
を実施することが可能となり、ＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺
伝子の検出および型判別の機械化および自動化が期待で
きる。
遺伝子またはその断片を含む核酸試料に対し本発明で開
示されているプライマーを用いて核酸の増幅反応（例え
ばＰＣＲ法）を行うことにより、現時点において明らか
にされている１６種類のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子の
全てを識別することができるので、ＨＬＡ−ＤＱ分子の
詳細な解析や、その応用として各種疾患の病因若しくは
病態の診断などの臨床適用に有用である。そして本発明
は、全てのＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子のタイピングを
容易に行なう方法や、それに用いるキットおよび試薬を
提供するので、これらは臓器移植の際のドナー・レシピ
エント間の適合性の判定やＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子
型と各種疾患との相関性の解析などにおいて有用であ
る。将来的には、ＤＮＡチップ法などの技術と組み合わ
せることによりさらに簡便かつ迅速に遺伝子タイピング
を実施することが可能となり、ＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺
伝子の検出および型判別の機械化および自動化が期待で
きる。
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Shionogi & Co.,LTD. <120> Primers and Methods for typing HLA-DQA1 genes <130> A005961 <140> <141> <160> 27 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DNA primer for HLA-DQA1 gene <400> 1 cccctgtgga ggtgaaga 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DNA primer for HLA-DQA1 gene <400> 2 cccytgtgga ggtgaagg 18 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DNA primer for HLA-DQA1 gene <400> 3 gaatttgatg gagatgagg 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DNA primer for HLA-DQA1 gene <400> 4 gaatttgatg gagatgagc 19 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DNA primer for HLA-DQA1 gene <400> 5 accaccatga tgagccct 18 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DNA primer for HLA-DQA1 gene <400> 6 ctgttccgca gatttagaag a 21 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DNA primer for HLA-DQA1 gene <400> 7 cgccctgacc accgtgat 18 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DNA primer for HLA-DQA1 gene <400> 8 cgccctgacc accgtgac 18 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DNA primer for HLA-DQA1 gene <400> 9 taaacgctcc aactctact 19 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DNA primer for HLA-DQA1 gene <400> 10 cctaaaacat aacttgaaca gt 22 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DNA primer for HLA-DQA1 gene <400> 11 agacaattta gatttgaccg 20 <210> 12 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DNA primer for HLA-DQA1 gene <400> 12 ggtccctctg gccagtt 17 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DNA primer for HLA-DQA1 gene <400> 13 aaagctctga tgctgggga 19 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DNA primer for HLA-DQA1 gene <400> 14 gtcttaatac tgaaagggcc 20 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DNA primer for HLA-DQA1 gene <400> 15 atgtttctca gtgcaccc 18 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DNA primer for HLA-DQA1 gene <400> 16 acaccttctg tgactgac 18 <210> 17 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DNA primer for HLA-DQA1 gene <400> 17 gccctatgct cagccag 17 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DNA primer for HLA-DQA1 gene <400> 18 tgcagtcata aatctcatca g 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DNA primer for HLA-DQA1 gene <400> 19 tgcagtcata aatctcatca t 21 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DNA primer for HLA-DQA1 gene <400> 20 ctcttaatag tgaaaggggt 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DNA primer for HLA-DQA1 gene <400> 21 cccagtgttt cagaagaggc 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DNA primer for HLA-DQA1 gene <400> 22 cagtcataac tctcctcagc 20 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DNA primer for HLA-DQA1 gene <400> 23 agtcataact ctcctcaga 19 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DNA primer for HLA-DQA1 gene <400> 24 tgttcaagtt gtgttttgt 19 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DNA primer for HLA-DQA1 gene <400> 25 atctcttaat actgaaggga c 21 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DNA primer DRBex9/519-537 for HLA-DQB1 gene <400> 26 tgccaagtgg agcacccaa 19 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:DNA primer 3'DRBint3 for HLA-DQB1 gene <400> 27 aaccatgcac tgatgatttc t 21
【図１】 ＨＬＡ−ＤＱＡ１*０３関連アリルをタイピ
ングするために、ＤＮＡ試料をＰＣＲ法で増幅後、該増
幅産物をアガロースゲル電気泳動し、紫外線照射下で写
真撮影した結果を示す図である。ＰＣＲ法で陽性のもの
を「＋」で表わす。
ングするために、ＤＮＡ試料をＰＣＲ法で増幅後、該増
幅産物をアガロースゲル電気泳動し、紫外線照射下で写
真撮影した結果を示す図である。ＰＣＲ法で陽性のもの
を「＋」で表わす。
【図２】 ＨＬＡ−ＤＱＡ１*０５関連アリルをタイピ
ングするために、ＤＮＡ試料をＰＣＲ法で増幅後、該増
幅産物をアガロースゲル電気泳動し、紫外線照射下で写
真撮影した結果を示す図である。ＰＣＲ法で陽性のもの
を「＋」で表わす。
ングするために、ＤＮＡ試料をＰＣＲ法で増幅後、該増
幅産物をアガロースゲル電気泳動し、紫外線照射下で写
真撮影した結果を示す図である。ＰＣＲ法で陽性のもの
を「＋」で表わす。
【図３】 全てのＨＬＡ−ＤＱＡ１アリルをタイピング
するために、表１に示した１８種類のプライマー対を用
いてＤＮＡ試料をＰＣＲ法で増幅後、該増幅産物をアガ
ロースゲル電気泳動し、紫外線照射下で写真撮影した結
果を示す図である。ＰＣＲ法で陽性のものを「＋」で表
わす。
するために、表１に示した１８種類のプライマー対を用
いてＤＮＡ試料をＰＣＲ法で増幅後、該増幅産物をアガ
ロースゲル電気泳動し、紫外線照射下で写真撮影した結
果を示す図である。ＰＣＲ法で陽性のものを「＋」で表
わす。
【図４】 本発明で開示されているＨＬＡ−ＤＱＡ１対
立遺伝子型の判別のためのプライマーの塩基配列を示す
図である。
立遺伝子型の判別のためのプライマーの塩基配列を示す
図である。
Claims (11)
- 【請求項１】 配列表の配列番号１から配列番号９、配
列番号１１から配列番号２２、配列番号２４および配列
番号２５の核酸配列、並びにそれらの末端に対し数塩基
を欠失または付加した核酸配列から選ばれる、ＨＬＡ−
ＤＱＡ１対立遺伝子型の判別のためのプライマー。 - 【請求項２】 ＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子またはその
断片を含む核酸を鋳型として、請求項１記載のプライマ
ーの少なくとも１つを用いて核酸の増幅反応を行うこと
を特徴とする、ＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子型の判別方
法。 - 【請求項３】 以下の工程（ａ）〜（ｂ）を含む、請求
項２記載のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子型の判別方法； （ａ）ＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子またはその断片を含
む核酸を鋳型として、（１）プライマー対の少なくとも
一方が請求項１記載のプライマーから選ばれる、少なく
とも１つの特定のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子の塩基配
列に特異的なプライマー対を用いて核酸の増幅反応を行
い、各特定のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子を選択的に増
幅する工程、および／または（２）プライマー対の少な
くとも一方が請求項１記載のプライマーから選ばれる、
特定のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子群からなる少なくと
も１つの特定のグループ内の各遺伝子に共通の塩基配列
に特異的なプライマー対を用いて核酸の増幅反応を行
い、各特定のグループ内のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子
群をグループとして選択的に増幅する工程； （ｂ）前記増幅反応により得られた産物の特定のサイ
ズ、特定の分子量または存在の有無を確認する、あるい
は該産物の塩基配列を直接決定することにより、対応す
る各特定のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子の型および／ま
たは各特定のグループ内のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子
群の特定の型をグループとして判別する工程。 - 【請求項４】 少なくとも１つの特定のＨＬＡ−ＤＱＡ
１対立遺伝子の塩基配列に特異的なプライマー対が、配
列表の配列番号４と配列番号１６、配列番号１２と配列
番号１５、配列番号５と配列番号１４、配列番号１２と
配列番号１７、配列番号６と配列番号１８、配列番号８
と配列番号２０、配列番号９と配列番号２１、配列番号
１１と配列番号１８、配列番号１２と配列番号２４およ
び配列番号１３と配列番号２５の核酸配列の組み合わ
せ、並びにそれら各々の末端に対し数塩基を欠失または
付加した核酸配列の組み合わせから選ばれるものであ
り、また特定のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子群からなる
少なくとも１つの特定のグループ内の各遺伝子に共通の
塩基配列に特異的な各グループに対応するプライマー対
が、配列表の配列番号１と配列番号１４、配列番号２と
配列番号１４、配列番号３と配列番号１５、配列番号４
と配列番号１５、配列番号６と配列番号１９、配列番号
７と配列番号２０および配列番号１０と配列番号２２の
核酸配列の組み合わせ、並びにそれら各々の末端に対し
数塩基を欠失または付加した核酸配列の組み合わせから
選ばれるものである、請求項３記載のＨＬＡ−ＤＱＡ１
対立遺伝子型の判別方法。 - 【請求項５】 核酸の増幅反応がＰＣＲ法であることを
特徴とする、請求項２から４のいずれかに記載のＨＬＡ
−ＤＱＡ１対立遺伝子型の判別方法。 - 【請求項６】 核酸の増幅反応により得られた産物を電
気泳動法により展開し、ＤＮＡバンドの特定のサイズま
たは存在の有無を確認することにより、対応する各特定
のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子の型および／または各特
定のグループ内のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子群の特定
の型をグループとして判別することを特徴とする、請求
項２から５のいずれかに記載のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺
伝子型の判別方法。 - 【請求項７】 ＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子群の特定の
型がグループとして判別された場合に、ＲＦＬＰ法、Ｐ
ＣＲ−ＲＦＬＰ法、ＳＳＯＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法、
ＰＣＲ−ＳＳＰ法またはＰＣＲ−ＳＳＣＰ法をさらに行
うことを特徴とする、請求項２から６のいずれかに記載
のＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子型の判別方法。 - 【請求項８】 請求項２から７のいずれかに記載の方法
に使用するための、ＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子型の判
別のためのキット。 - 【請求項９】 請求項２から７のいずれかに記載の方法
に使用するための、ＨＬＡ−ＤＱＡ１対立遺伝子型の判
別のための試薬。 - 【請求項１０】 請求項１のプライマーを含む、ＨＬＡ
−ＤＱＡ１対立遺伝子型の判別のためのキット。 - 【請求項１１】 請求項１のプライマーを含む、ＨＬＡ
−ＤＱＡ１対立遺伝子型の判別のための試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11006039A JP2000201685A (ja) | 1999-01-13 | 1999-01-13 | Ｈｌａ―ｄｑａ１対立遺伝子型の判別のためのプライマ―およびそれを用いる判別方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11006039A JP2000201685A (ja) | 1999-01-13 | 1999-01-13 | Ｈｌａ―ｄｑａ１対立遺伝子型の判別のためのプライマ―およびそれを用いる判別方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000201685A true JP2000201685A (ja) | 2000-07-25 |
Family
ID=11627511
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11006039A Pending JP2000201685A (ja) | 1999-01-13 | 1999-01-13 | Ｈｌａ―ｄｑａ１対立遺伝子型の判別のためのプライマ―およびそれを用いる判別方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000201685A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101736744B1 (ko) | 2014-12-03 | 2017-05-17 | 주식회사 한국유전자정보연구원 | 셀리악병 진단용 프라이머 세트와 이를 이용한 셀리악병 진단방법 |
| CN111073964A (zh) * | 2019-12-20 | 2020-04-28 | 江苏伟禾生物科技有限公司 | 用于检测人类白细胞抗原hla-abcdrdq基因分型的试剂盒 |
| CN117265090A (zh) * | 2023-10-20 | 2023-12-22 | 江苏伟禾生物科技有限公司 | 一种用于检测人类白细胞抗原hla-dqa1基因分型的引物组及试剂盒 |
-
1999
- 1999-01-13 JP JP11006039A patent/JP2000201685A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101736744B1 (ko) | 2014-12-03 | 2017-05-17 | 주식회사 한국유전자정보연구원 | 셀리악병 진단용 프라이머 세트와 이를 이용한 셀리악병 진단방법 |
| CN111073964A (zh) * | 2019-12-20 | 2020-04-28 | 江苏伟禾生物科技有限公司 | 用于检测人类白细胞抗原hla-abcdrdq基因分型的试剂盒 |
| CN111073964B (zh) * | 2019-12-20 | 2022-10-04 | 江苏伟禾生物科技有限公司 | 用于检测人类白细胞抗原hla-abcdrdq基因分型的试剂盒 |
| CN117265090A (zh) * | 2023-10-20 | 2023-12-22 | 江苏伟禾生物科技有限公司 | 一种用于检测人类白细胞抗原hla-dqa1基因分型的引物组及试剂盒 |
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