JP2019089770A - セリアック病に関連するエピトープ - Google Patents

セリアック病に関連するエピトープ Download PDF

Info

Publication number
JP2019089770A
JP2019089770A JP2018244398A JP2018244398A JP2019089770A JP 2019089770 A JP2019089770 A JP 2019089770A JP 2018244398 A JP2018244398 A JP 2018244398A JP 2018244398 A JP2018244398 A JP 2018244398A JP 2019089770 A JP2019089770 A JP 2019089770A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
agent
celiac disease
cells
cell
individual
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2018244398A
Other languages
English (en)
Inventor
アンダーソン，ロバート
Robert Anderson
バイスバト，ティム
Beissbath Tim
ディン，ジェイソン・タイ
Jason Tye Din
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BTG International Ltd
Original Assignee
BTG International Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from AU2004201774A external-priority patent/AU2004201774A1/en
Priority claimed from AU2005900650A external-priority patent/AU2005900650A0/en
Application filed by BTG International Ltd filed Critical BTG International Ltd
Publication of JP2019089770A publication Critical patent/JP2019089770A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/168—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Cereal-Derived Products (AREA)

Abstract

【課題】セリアック病を予防または治療する方法の提供。【解決手段】（ａ）特定の配列を含んでなる少なくとも一つのエピトープを含んでなるペプチド、及びその同等物；ならびに、（ｂ）（ａ）のペプチドを認識するＴ細胞受容体により認識されることが可能であって、かつ５０アミノ酸長を超えない、（ａ）のアナログ；から選択される少なくとも一つの剤を個体に投与することを含んでなる、セリアック病を予防または治療する方法。【選択図】なし

Description

発明の詳細な説明
本発明は、診断学、治療学、キット、及び前記のものの使用方法を含む、セリアック病の診断及び療法に有用なエピトープに関する。
セリアック病は、食物のグルテンに対する免疫を介した過敏性に起因する。小麦、ライ麦及び大麦、ならびに場合によってはオーツ麦中のグルテンタンパク質は、セリアック病において毒性である。グルテンは、α／β、γ及びωグリアジン、ならびに低分子量及び高分子量（ＬＭＷ及びＨＭＷ）のグルテニン（小麦中）、ホルデイン（大麦中）、セカリン（ライ麦中）及びアベニン（オーツ麦中）から構成される。ホルデイン及びセカリンは、γ及びωグリアジンならびに低分子量及び高分子量グルテニン（小麦中）と相同性である。アベニンは、ホルデイン及びセカリンよりも、系統学的に小麦グルテンから遠い。
セリアック病研究の目的は、グルテン特異的Ｔ細胞を刺激するペプチドを定義付けることにより、グルテンの毒性成分を定義付けることである。グルテンエピトープの正確な定義付けにより、新たな診断学、治療学、食物中のグルテン混入検査、及び従来のグルテンのクッキング／ベーキングの質を保持する非毒性穀粒の開発が、可能となる。これらの応用の多くは、グルテン中の最も一般的な毒性ペプチドよりむしろすべての毒性ペプチドを包括的に理解することを必要とする。
ＨＬＡ−ＤＱ２及び／またはＨＬＡ−ＤＱ８をコードする遺伝子は、一般的な白人集団のおよそ３５％に比して、セリアック病を有する個体の９９％超に存在する。ＨＬＡ−ＤＱ２またはＨＬＡ−ＤＱ８と結合したグルテン由来ペプチド（エピトープ）は、特異的なＴ細胞を刺激する。ＨＬＡ−ＤＱ２及びＤＱ８拘束性エピトープは、ペプチドが結合するＨＬＡ−ＤＱ２もしくはＤＱ８の溝ならびにコグネイトＴ細胞受容体と直接的に相互作用する、「コア」の９アミノ酸配列を含む。一般には、抗原中のすべてのユニークな１０〜１２ｍｅｒペプチドを含有する重複ペプチド（通常、１５〜２０ｍｅｒ）ライブラリが、ＨＬＡクラスＩＩ拘束性Ｔ細胞エピトープをマッピングするために用いられている。
一連のグルテンペプチドは、セリアック病においてグルテン特異的Ｔ細胞を活性化することが知られている。先の研究では、選択されたグルテンタンパク質またはグルテン食物から、グルテンペプチドが同定された。腸生検より単離されたＴ細胞のクローン及び株は、これらのグルテン成分をスクリーニングするために用いられている。
腸組織中に存在する酵素である組織トランスグルタミナーゼ（ｔＴＧ）によるグルテンの修飾は、グルテン特異的Ｔ細胞へのグルテンの刺激能を実質的に増加させる。グルテン特異的Ｔ細胞に対する公知のエピトープのほとんどは、ｔＴＧによりアミド分解されたグルテンペプチドと一致する。トランスグルタミナーゼは、グルテン中の特定のグルタミン残基の（グルタミン酸への）アミド分解を媒介する。ｔＴＧによるアミド分解に感受性のグルタミン含有配列は、概して、モチーフ：QXPXまたはQXX (FYMILVW)に一致する（Vader
W.ら、2002年、J. Exp. Med. 195:643-649、PCT WO 03/066079、及びFleckenstein B.、2002年、J Biol Chem 277:34109-16を参照されたい）。ＨＬＡ−ＤＱ２と結合し、かつｔＴＧによるアミド分解に感受性のペプチドに関するモチーフは、特定のグルテンエピトープを予測するために用いられている（Vaderら、J Exp Med、2002年、J. Exp. Med. 195:643-649、PCT WO 03/066079）。
しかしながら、他のグループは、グルテン特異的な腸のＴ細胞クローン及び株に対するエピトープを、１１個の組換えα／β（１１）及び５個のγグリアジンのパネル（Arentz-Hansen H.、2000年、J. Exp. Med. 191:603-612、Arentz-Hansen H.、2002年、Gastroen
terology 123:803-809、PCT WO 02/083722）、ならびに精製グルテンタンパク質のライセート（Sjostrom H.ら、1998年、Scand. J. Immunol. 48,111-115；van de Wal, Y.ら、1998年、J. Immunol. 161(4):1585-1588；van de Wal, Y.ら、1999年、Eur. J. Immunol. 29:3133-3139；Vader W.ら、2002年、Gastroenterology 122:1729-1737）を用いて、同定
した。
我々の研究は、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるグルテン攻撃（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）が、腸管ホーミングのためのインテグリン（α４β７）を発現している末梢血においてＨＬＡ−ＤＱ２拘束性ＣＤ４＋グルテン特異的Ｔ細胞を誘導するとの観測を、引き出した。この技術は、Ａ−グリアジンにおけるドミナントエピトープのマッピングを可能にした（Anderson, RPら、2000年、Nat. Med. 6:337-342、WO 01/25793）。Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５は、腸Ｔ細胞クローンを用いて同定された二つの重複エピトープと一致する（Arentz-Hansen H.ら、2000年、J. Exp. Med. 191:603-612、Arentz-Hansen H.ら、2002年、Gastroenterology 123:803-809）。グルテン特異的Ｔ細胞を誘導するためのｉｎ ｖｉｖｏにおけるグルテン攻撃の利点は、いかなる食物も消費されることが可能であって、そして結果として血中にて誘導されるＴ細胞（単純な一晩のインターフェロンγＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて、末梢血中にて定量）が、合成もしくは精製抗原によりｉｎ ｖｉｔｒｏで抗原刺激されるよりもむしろ、内因的に提示されたエピトープによりｉｎ ｖｉｖｏで刺激されているであろうということである。新鮮ポリクローナル末梢血Ｔ細胞の一晩アッセイはまた、Ｔ細胞クローンの長期にわたる精製に伴う人為産物の可能性を避ける。
興味深いことに、いくつかのγ−グリアジンエピトープ（Arentz-Hansen H.、2002年、Gastroenterology 123:803-809、PCT WO 02/083722）に特異的なＴ細胞クローン及び株は、最初に定義されたＡ−グリアジンエピトープ５７−７３ ＱＥ６５と交差反応する。
α／βグリアジン内で実質的な相同性があるにもかかわらず、初期の研究（WO 03/104273を参照されたい）は、ＨＬＡ−ＤＱ２に関連するセリアック病において認識されるドミナントエピトープである「Ａ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５」がＧｅｎｂａｎｋに存在する少数のα／βグリアジンによりコードされることを、示している。
発明の概要
現在の研究は、グルテン中のすべてのＴ細胞エピトープのマッピングを可能にするであろう方法を開発するために開始された。小麦パン（１日２００ｇを３日間）またはオーツ麦（１日１００ｇを３日間）の消費を、末梢血においてグルテンもしくはアベニン特異的Ｔ細胞を誘導するために用いた。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、小麦グルテン及び／またはオーツ麦アベニンに関するすべてのＧｅｎｂａｎｋ登録に含まれるすべてのユニークな１２ｍｅｒ配列を含むグルテン及びアベニンペプチドライブラリを用いた一晩のインターフェロンγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにて、評価した。本目的を、Ｇｅｎｂａｎｋにおけるグルテンタンパク質中のすべての潜在的なエピトープに及ぶペプチド（２９２２個の２０ｍｅｒは、すべての１４９６４個のユニークな９ｍｅｒの潜在的なＴ細胞エピトープを含んだ）を設計するためのアルゴリズムを確立し、インターフェロン−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを、一個体の血液を用いて１０００個を超えるペプチドをスクリーニング可能なハイスループットアッセイに適合させ、そして得られたデータを解析及び解釈するためのバイオインフォマティクスツールを開発することにより、成し遂げた。
小麦グルテンペプチドの一連の４１個の「スーパーファミリー」を、推定Ｔ細胞エピトープとして同定した。スーパーファミリーは、限られたレベルの重複性が可能とされるモチーフを共有した。最も強力なファミリーの多くには、先に記載したドミナントエピトープＡ−グリアジン５７−７３を含む公知のＴ細胞エピトープが、含まれる。
グルテン攻撃後のＰＢＭＣを用いたグルテンエピトープの包括的なマッピングにより、本発明者は、ＨＬＡ−ＤＱ２及びＨＬＡ−ＤＱ８に関連するセリアック病に対する一連の新規グリアジン、ＬＭＷ及びＨＭＷグルテニンならびにアベニンのエピトープを発見した。新規エピトープは、ＨＬＡ−ＤＱ２及びＨＬＡ−ＤＱ８に関連するセリアック病に関して同定された。ＨＬＡ−ＤＱ２とＨＬＡ−ＤＱ８に関連するセリアック病は、認識されるＴ細胞エピトープの範囲の点で、遺伝的かつ機能的に相異なる。加えて、オーツ麦のエピトープが初めて定義付けられたとき、オーツ麦のアベニンタンパク質中に存在する三つのペプチドは、ＨＬＡ−ＤＱ２＋セリアック被験者におけるオーツ麦攻撃後に、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）もまた活性化した。ｉｎ ｖｉｖｏでのオーツ麦攻撃後にＴ細胞により認識されるアベニンペプチドの同定は、オーツ麦攻撃後に観察されるセリアックの時折の再発の分子的根拠を提供し（Lundin KEAら、2003年、Gut 52:1649-52）、そして予測診断的または遺伝学的なオーツ麦の無毒化の根拠を提供しうる。
本明細書に示されるデータは、セリアック病における一般的な「ドミナント」Ｔ細胞エピトープと時折の「弱い」Ｔ細胞エピトープの双方の定義の包括的な根拠を提供するであろう。本情報は、診断学、食物検査、免疫治療学及び予防学などの機能的応用の、ならびに修飾された穀粒において有用な非毒性グルテンタンパク質設計の、基盤である。
具体的には、グルテンＴ細胞エピトープの包括的なマッピングにより、本発明者は、ＨＬＡ−ＤＱ２＋患者のセリアック病において生物活性のエピトープを、類似したコア配列（例えば、配列番号１〜１９９）及び類似した延長配列（例えば、配列番号：２００〜１５５４、１５５５〜１６５５、１６５６〜１６７１及び１８３０〜１９０３）を有する小麦グリアジン及びグルテニン中に発見した。本発明者はまた、ＨＬＡ−ＤＱ２＋患者のセリアック病において生物活性のエピトープを、類似したコア配列（例えば、配列番号１６８４〜１６９５）及び類似した延長配列（例えば、配列番号：１６７２〜１６８３、１６９６〜１６９８及び１７６４〜１７６８）を有するオーツ麦アベニン；ライ麦セカリン（配列番号１７６９〜１７８６）；及び大麦ホルデイン（配列番号１７８７〜１８２９）中に発見した。加えて、ＨＬＡ−ＤＱ８＋患者のセリアック病において生物活性のエピトープが、類似したコア配列（例えば、配列番号１６９９〜１７２１）及び類似した延長配列（例えば、配列番号：１７２２〜１７６３及び１９０８〜１９２７）を有する小麦グリアジン中に同定された。このように、この包括的なマッピングは、セリアック患者のＴ細胞により認識されるドミナントエピトープを提供する。このように、本明細書に記載される本発明の方法を、これらの同定されたエピトープ、ならびにそのアナログ（ａｎａｌｏｇｕｅｓ）及び同等物（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ）のいずれかを用いて行ってもよい。すなわち、本発明の剤は、これらのエピトープを含む。加えて、エピトープの組み合わせ、すなわち「コンビトープ」、または２もしくはそれより多くのエピトープを含んでなる単一ペプチドは、個々のエピトープとして同等の応答を誘導することが示されており、いくつかのエピトープを本発明の治療学的、診断学的及びその他の使用のために利用してもよいことを示している。このようなコンビトープは、例えば配列番号１９０６などの形態であってもよい。好ましくは、本発明の剤には、配列番号：１５７８〜１５７９、１５８２〜１５８３、１５８７〜１５９３、１６００〜１６２０、１６２３〜１６５５、１６５６〜１６７１、１６７２〜１６９８、１６９９〜１７６３、１７６４〜１７６８、１７６９〜１７８６、１７８７〜１８２９、１８９５〜１９０３、１９０６、及び１９０８〜１９２７に列挙掲載した配列を有するエピトープ、ならびに本明細書に定義されるようなその類似物及び同等物の、１またはそれより多くが、含まれる。
ＨＬＡ−ＤＱ８＋患者のセリアック病において生物活性である好ましい剤は、アミド分解に対する感受性を示唆する配列中に、アミド分解に対して同様に感受性の第二のグルタミンと７個の残基により分離されているグルタミンを有し（例えば、ＱＧＳＦＱＰＳＱＱに見つけられるように）、ここで、ｔＴＧによるアミド分解後に、アミド分解された配列
はＨＬＡ−ＤＱ８に対して高親和性の結合体である（ＨＬＡ−ＤＱ８に対する結合モチーフは、１位及び９位がグルタミン酸であることが好ましい）。より好ましくない実施態様において、剤は、アミド分解に対して感受性であるが、ただしｔＴＧを介したアミド分解に対して感受性の第二のグルタミンと７個の残基により分離されていないグルタミン残基を、有する。
このように、本発明は、以下の工程を含んでなる、個体においてセリアック病、またはセリアック病に対する感受性を診断する方法を、提供する：（ａ） 宿主から得た試料を、（ｉ） 配列番号１〜１９２７から選択される、好ましくは配列番号１５７８〜１５７９、１５８２〜１５８３、１５８７〜１５９３、１６００〜１６２０、１６２３〜１６５５、１６５６〜１６７１、１６７２〜１６９８、１６９９〜１７６３、１７６４〜１７６８、１７６９〜１７８６、１７８７〜１８２９、１８９５〜１９０３、１９０６、及び１９０８〜１９２７から選択されるアミノ酸配列、または自然発生グルテンタンパク質由来の同等配列を含んでなる、エピトープ、（ｉｉ） （ｉ）を認識するＴ細胞受容体により認識されることが可能な（ｉ）のアナログ、あるいは（ｉｉｉ） （ｉ）または（ｉｉ）にて定義されるような２またはそれより多くの剤を含んでなる産物（ｐｒｏｄｕｃｔ）：から選択される剤と接触させること；ならびに、（ｂ） 該試料中のＴ細胞が該剤を認識するかどうかを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで判定すること、ここで、Ｔ細胞による認識は、該個体がセリアック病を有するかまたはそれに感受性であることを示す。
「グルテンタンパク質」の語は、α／β、γ及びωグリアジン、ならびに低分子量及び高分子量（ＬＭＷ及びＨＭＷ）のグルテニン（小麦中）、ホルデイン（大麦中）、セカリン（ライ麦中）及びアベニン（オーツ麦中）を包含する。本発明は、具体的には、グリアジン及びアベニンに関する。
本発明はまた、個体においてセリアック病、またはセリアック病に対する感受性を診断する方法であって、個体のＴ細胞が該剤を認識するかどうかを判定すること、ここで、Ｔ細胞による認識は、該個体がセリアック病を有するかまたはそれに感受性であることを示す、を含んでなる前記方法における使用のための、診断手段の調製のための剤の使用を提供する。
トランスグルタミナーゼによって修飾されるエピトープの発見はまた、これらのエピトープに対する他のタイプの免疫応答が存在するかどうかの判定に基づいたセリアック病の診断も可能にする。このように、本発明はまた、個体におけるセリアック病、またはセリアック病に対する感受性の診断方法であって、個体から得た試料中におけるエピトープと結合する抗体の存在を判定すること、ここで、抗体の存在は、該個体がセリアック病を有するかまたはそれに感受性であることを示す、を含んでなる上記方法も、提供する。
本発明は、組成物がセリアック病を引き起こすことが可能かどうかを判定する方法であって、トランスグルタミナーゼによって上記に定義されるようなオリゴペプチド配列へと修飾されることが可能なタンパク質が組成物中に存在するかどうかを判定すること、ここで、タンパク質の存在は、該組成物がセリアック病を引き起こすことが可能なことを示す、を含んでなる上記方法を、提供する。
本発明はまた変異グルテンタンパク質であって、その野生型配列はトランスグルタミナーゼによって上記に定義されるような配列を含んでなるエピトープを含んでなる配列へと修飾されることが可能であるが、しかし、その変異グルテンタンパク質は、このようなエピトープを含んでなる配列へと、トランスグルタミナーゼによって修飾されることが可能な配列を、含有しないように修飾されている、前記変異グルテン蛋白質を提供する；あるいは、このような変異グルテンタンパク質のフラグメントであって、少なくとも７アミノ酸長（例えば、少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸長）であって、かつ前記のように修飾されている配列を含んでなる、前記フラグメントを提供する。
本発明はまた、Ｔ細胞受容体と結合可能な配列を含有するタンパク質であって、Ｔ細胞受容体が剤を認識し、かつ配列がこのようなＴ細胞受容体を保有するＴ細胞のアンタゴニズムを引き起こすことが可能な上記タンパク質も、提供する。
加えて、本発明は、上記に定義されるタンパク質を含んでなる食物を、提供する。
加えて、本発明は、キャリアーと会合していてもよい剤であって、当該剤を認識するＴ細胞を寛容化することによりセリアック病を治療または予防する方法における使用のための、前記剤を提供する。同様に提供されるのは、（ｉ）を認識するＴ細胞受容体を有する、キャリアーと会合していてもよいＴ細胞のアンタゴニストであって、そのようなＴ細胞をアンタゴナイズすることによりセリアック病を治療または予防する方法における使用のための、前記アンタゴニストである。加えて提供されるのは、剤と結合する抗体と、結合する剤またはアナログであって、個体を寛容化してこのような抗体の産生を防ぐことにより、個体においてセリアック病を治療または予防する方法における使用のための、前記剤又はアナログである。
本発明はまた、以下から選択される少なくとも一つの剤を個体に投与することを含んでなる、セリアック病を予防または治療する方法も、提供する：ａ） 配列番号１〜１９２７からなる群、好ましくは配列番号１５７８〜１５７９、１５８２〜１５８３、１５８７〜１５９３、１６００〜１６２０、１６２３〜１６５５、１６５６〜１６７１、１６７２〜１６９８、１６９９〜１７６３、１７６４〜１７６８、１７６９〜１７８６、１７８７〜１８２９、１８９５〜１９０３、１９０６、及び１９０８〜１９２７からなる群より選択される配列を含んでなる少なくとも一つのエピトープを含んでなるペプチド、及びその同等物（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ）；ならびに、ｂ） ａ）のペプチドを認識するＴ細胞受容体により認識されることが可能であって、かつ５０アミノ酸長を超えない、ａ）のアナログ。いくつかの実施態様では、剤は、ＨＬＡ−ＤＱ２拘束性、ＨＬＡ−ＤＱ８拘束性であるか、あるいは一つの剤がＨＬＡ−ＤＱ２拘束性で、そして第二の剤がＨＬＡ−ＤＱ８拘束性である。いくつかの実施態様では、剤は、小麦エピトープ、オーツ麦エピトープ、ライ麦エピトープ、大麦エピトープ、あるいは単一の剤または複数の剤としてのその任意の組み合わせを、含んでなる。
本発明はまた、上述のような剤及び医薬的に許容可能なキャリアーまたは希釈剤を含んでなる医薬組成物を個体に投与することを含んでなる、セリアック病を予防または治療する方法も、提供する。
本発明はまた、上記に定義されるようなＴ細胞受容体を有するＴ細胞のアンタゴニスト、及び医薬的に許容可能なキャリアーまたは希釈剤を含んでなる医薬組成物を個体に投与することを含んでなる、セリアック病を予防または治療する方法も、提供する。
本発明はまた、セリアック病を予防または治療する方法であって、グルテンタンパク質に対して個体を寛容化するための組成物を個体に投与して、Ｔ細胞の産生または上記に定義されるような剤に対する抗体応答を抑制することを含んでなる、ここにおいて、上記に定義されるような剤を含んでなる、前記方法も提供する。
本発明はまた、１） ａ）宿主から得た試料を、ｉ） 配列番号１〜１９２７からなる群より選択される配列、好ましくは配列番号１５７８〜１５７９、１５８２〜１５８３、１５８７〜１５９３、１６００〜１６２０、１６２３〜１６５５、１６５６〜１６７１、
１６７２〜１６９８、１６９９〜１７６３、１７６４〜１７６８、１７６９〜１７８６、１７８７〜１８２９、１８９５〜１９０３、１９０６、及び１９０８〜１９２７からなる群より選択される配列を含んでなる少なくとも一つのエピトープを含んでなるペプチド、及びその同等物；ならびにｉｉ） ｉ）を認識するＴ細胞受容体により認識されることが可能であって、かつ５０アミノ酸長を超えない、ｉ）のアナログ；から選択される少なくとも一つの剤と接触させ；そして、試料中のＴ細胞が剤を認識するかどうかをｉｎ ｖｉｔｒｏで判定すること；ここで、Ｔ細胞による認識は、該個体がセリアック病を有するかまたはそれに感受性であることを示す；あるいは、ｂ） 上記に定義されるような剤を投与し、そして個体のＴ細胞が剤を認識するかどうかをｉｎ ｖｉｖｏにて判定すること、ここで、剤の認識は、該個体がセリアック病を有するかまたはそれに感受性であることを示す；のいずれかにより、個体においてセリアック病を診断すること；ならびに、２） セリアック病を有するかまたはそれに感受性であると診断された個体に、セリアック病を予防または治療するための治療剤を投与すること；によってセリアック病を予防または治療する方法も、提供する。
本発明はまた、キャリアーと会合していてもよい上記に定義されるような剤であって、剤を認識するＴ細胞を寛容化することによりセリアック病を治療または予防する方法における使用のための、前記剤も提供する。
本発明はまた、上記に定義されるようなＴ細胞受容体を有するＴ細胞の、キャリアーと会合していてもよいアンタゴニストであって、このようなＴ細胞をアンタゴナイズすることによりセリアック病を治療または予防する方法における使用のための、前記アンタゴニスト、も提供する。
本発明はまた、Ｔ細胞受容体と結合可能な配列を含んでなるタンパク質であって、Ｔ細胞受容体が上記に定義されるような剤を認識し、そしてその配列がこのようなＴ細胞受容体を保有するＴ細胞のアンタゴニズムを引き起こすことが可能な上記タンパク質も、提供する。
本発明はまた、定義されるような剤またはアンタゴニスト、及び医薬的に許容可能なキャリアーまたは希釈剤を含んでなる医薬組成物も、提供する。
本発明はまた、グルテンタンパク質に対して個体を寛容化して、Ｔ細胞の産生または上記に定義されるような剤に対する抗体応答を抑制するための、上記に定義されるような剤を含んでなる組成物も、提供する。
本発明はまた、上記に定義されるような剤に対するＴ細胞応答をアンタゴナイズするための、上記に定義されるようなアンタゴニストを含んでなる組成物も、提供する。
本発明はまた、変異グルテンタンパク質であって、その野生型配列がトランスグルタミナーゼによって上記に定義されるような剤である配列へと修飾されることが可能であり、変異グルテンタンパク質は、上記に定義されるような剤である配列へのトランスグルタミナーゼによるその修飾を防ぐ変異を含んでなる、変異グルテンタンパク質も提供する；あるいは、このような変異グルテンタンパク質のフラグメントであって、少なくとも７アミノ酸長（例えば、少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸長）であって、かつ変異を含んでなる、前記フラグメントを提供する。
本発明はまた、上記に定義されるようなタンパク質またはフラグメントをコードするコード配列を含んでなるポリヌクレオチドも、提供する。
本発明はまた、上記に定義されるようなポリヌクレオチドを含んでなる細胞、またはこのようなポリヌクレオチドで形質転換されている細胞も、提供する。
本発明はまた、上記に定義されるようなＴ細胞受容体を発現する哺乳動物も、提供する。
本発明はまた、ａ） 宿主から得た試料を、ｉ） 配列番号１〜１９２７からなる群より選択される、好ましくは配列番号１５７８〜１５７９、１５８２〜１５８３、１５８７〜１５９３、１６００〜１６２０、１６２３〜１６５５、１６５６〜１６７１、１６７２〜１６９８、１６９９〜１７６３、１７６４〜１７６８、１７６９〜１７８６、１７８７〜１８２９、１８９５〜１９０３、１９０６、及び１９０８〜１９２７からなる群より選択される配列を含んでなる少なくとも一つのエピトープを含んでなるペプチド、及びその同等物；ならびにｉｉ） ｉ）を認識するＴ細胞受容体により認識されることが可能であって、かつ５０アミノ酸長を超えない、ｉ）のアナログ；から選択される少なくとも一つの剤と接触させること；ならびに、ｂ） 該試料中のＴ細胞が剤を認識するかどうかを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで判定すること；ここで、Ｔ細胞による認識は、該個体がセリアック病を有するかまたはそれに感受性であることを示す；を含んでなる、個体においてセリアック病またはセリアック病に対する感受性を診断する方法も、提供する。
本発明はまた、組成物がセリアック病を引き起こすことが可能かどうかを判定する方法であって、トランスグルタミナーゼによってオリゴペプチド配列へと修飾されることが可能なタンパク質が組成物中に存在するかどうかを判定すること、ここで、タンパク質の存在は、該組成物がセリアック病を引き起こすことが可能なことを示す、を含んでなる上記方法も、提供する。
本発明はまた、上記に定義されるような剤を認識する、Ｔ細胞のアンタゴニストを同定する方法であって、候補の基質をＴ細胞と接触させ、そして該物質がＴ細胞の抗原特異的応答を起こす能の減少を引き起こすかどうかを検出すること、ここで、（前記能力の任意のこのような減少の検出は、該物質がアンタゴニストであることを示す、を含んでなる上記方法も、提供する。
本発明はまた、上記に定義されるような剤、及びＴ細胞によるペプチドの認識を検出する手段を含んでなる、上述の方法のいずれかを実行するためのキットも、提供する。
本発明はまた、セリアック病治療剤である産物を同定する方法であって、候補の基質を、セリアック病を有するかまたはそれに感受性である上記に定義されるような哺乳動物に投与し、そして該物質が哺乳動物においてセリアック病を予防または治療するかどうかを判定すること、ここで、セリアック病の予防または治療は、該物質が治療用産物であることを示す、を含んでなる上記方法も、提供する。
本発明はまた、ａ） 上述の細胞を、タンパク質の発現を可能とする条件下で培養すること；及び、所望により、ｂ） 発現したタンパク質を回収すること；を含んでなる、上記に定義されるようなコード配列によりコードされるタンパク質の産生のためのプロセスも、提供する。
本発明はまた、植物細胞を上述のようなベクターで形質転換してトランスジェニック植物細胞を得ることを含んでなる、トランスジェニック植物細胞を得る方法も、提供する。
本発明はまた、上述のようなベクターで形質転換されたトランスジェニック植物細胞を再生してトランスジェニック植物を得ることを含んでなる、第一世代トランスジェニック植物を得る方法も、提供する。
本発明はまた、上述のように得ることが可能なトランスジェニック植物からトランスジェニック種子を得ることを含んでなる、トランスジェニック植物種子を得る方法も、提供する。
本発明はまた、トランスジェニック後代植物を得る方法であって、上述のような方法により得ることが可能な第一世代トランスジェニック植物から、第二世代のトランスジェニック後代植物を得て、そして所望により、このように得られた第二世代の後代植物から１またはそれより多くのさらなる世代のトランスジェニック植物を得ることを含んでなる上記方法も、提供する。
本発明はまた、上述の方法のいずれかによって得ることが可能なトランスジェニック植物細胞、植物、植物種子または後代植物も、提供する。
本発明はまた、上述のような植物細胞を含んでなるトランスジェニック植物または植物種子も、提供する。
本発明はまた、上記に定義されるようなトランスジェニック植物細胞、第一世代植物、植物種子または後代から得ることが可能な上述のような植物細胞を含んでなる、トランスジェニック植物細胞カルスも、提供する。
本発明はまた、上述の任意の方法にしたがって植物から穀物を収穫し、そして所望により収穫された産物をさらに加工することを含んでなる、穀物を得る方法も、提供する。
本発明はまた、上記に定義されるようなタンパク質を含んでなる食物も提供する。
発明の詳細な説明
「セリアック病」の語は、扁平な小腸粘膜（肥厚性の絨毛萎縮）により特徴付けられる重度の形態、及びより軽度の症状により特徴付けられる他の形態を含む、様々な程度のグルテン感受性により引き起こされる状態のスペクトラムを、包含する。
（診断または療法の文脈における）上記の個体は、ヒトである。彼らは、（症候性または無症候性の）セリアック病を有するか、またはそれを有する疑いがあってもよい。彼らは、グルテンを含まない食事を取っていてもよい。彼らは、急性期の応答中であってもよい（例えば、彼らはセリアック病を有してもよいが、ただし、１４〜２８日間グルテンを含まない食事を取る直前の２４時間にのみ、グルテンを摂取してもよい）。
個体は、（例えば、セリアック病を有する親族を持つか、またはセリアック病に対する素因に起因する遺伝子を有する個体により決定される）遺伝学的感受性など、セリアック病に対して感受性であってもよい。
剤（ａｅｇｅｎｔ）
剤は、典型的には、１０〜４０、１２〜３５または１５〜３０アミノ酸長などの、例えば７〜５０アミノ酸長のペプチドである。
剤は、配列番号１〜１９２７のいずれかにより表されるペプチド、または配列番号１〜１９２７のいずれかを含んでなる配列を含んでなる、グルテンタンパク質由来の単離オリゴペプチドであるエピトープ；あるいは、自然発生グルテンタンパク質由来のこれらの配列の同等物であってもよい。本発明のさらなる一連の実施態様において、剤は、オーツ麦グルテンの任意のペプチドエピトープである（例えば、アベニンの任意のＴ細胞エピトープ）。
好ましくは、剤は、配列番号１５７８〜１５７９、１５８２〜１５８３、１５８７〜１５９３、１６００〜１６２０、１６２３〜１６５５、１６５６〜１６７１、１６７２〜１６９８、１６９９〜１７６３、１７６４〜１７６８、１７６９〜１７８６、１７８７〜１８２９、１８９５〜１９０３、１９０６、及び１９０８〜１９２７のいずれかにより表されるペプチドであるか、または配列番号１５７８〜１５７９、１５８２〜１５８３、１５８７〜１５９３、１６００〜１６２０、１６２３〜１６５５、１６５６〜１６７１、１６７２〜１６９８、１６９９〜１７６３、１７６４〜１７６８、１７６９〜１７８６、１７８７〜１８２９、１８９５〜１９０３、１９０６、及び１９０８〜１９２７のいずれかを含んでなる配列を含んでなる、グルテンタンパク質由来の単離オリゴペプチドであるエピトープ；あるいは、自然発生グルテンタンパク質由来のこれらの配列の同等物である。
このように、エピトープは、具体的には小麦もしくはオーツ麦グルテン由来の、自然発生グルテンタンパク質の誘導体であってもよい。このような誘導体は、典型的には、グルテンタンパク質のフラグメント、あるいは全タンパク質またはフラグメントの変異誘導体である。したがって、本発明のエピトープは、自然発生全グルテンタンパク質を含まず、かつ他の全自然発生グルテンタンパク質を含まない。
典型的には、このようなフラグメントは、少なくとも７アミノ酸長（例えば、少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸長）であろう。
典型的には、このようなフラグメントは、それらが由来する剤がセリアック病患者から得た試料を用いた本明細書に記載されるアッセイのいずれかにおいて認識されるのと少なくとも同程度に、Ｔ細胞によって認識されるであろう。
剤は、配列番号１〜１９２７のいずれかにより表されるペプチド、好ましくは、配列番号１５７８〜１５７９、１５８２〜１５８３、１５８７〜１５９３、１６００〜１６２０、１６２３〜１６５５、１６５６〜１６７１、１６７２〜１６９８、１６９９〜１７６３、１７６４〜１７６８、１７６９〜１７８６、１７８７〜１８２９、１８９５〜１９０３、１９０６、及び１９０８〜１９２７のいずれかにより表されるペプチドであってもよく、あるいは、配列番号１〜１９２７のいずれかに一致する配列を含んでなるタンパク質、好ましくは、配列番号１５７８〜１５７９、１５８２〜１５８３、１５８７〜１５９３、１６００〜１６２０、１６２３〜１６５５、１６５６〜１６７１、１６７２〜１６９８、１６９９〜１７６３、１７６４〜１７６８、１７６９〜１７８６、１７８７〜１８２９、１８９５〜１９０３、１９０６、及び１９０８〜１９２７からのいずれかに一致する配列を含んでなるタンパク質であってもよい（例えば、グルテンタンパク質をトランスグルタミナーゼで処理した後の、配列番号１〜１９２７のいずれか、ならびに好ましくは配列番号１５７８〜１５７９、１５８２〜１５８３、１５８７〜１５９３、１６００〜１６２０、１６２３〜１６５５、１６５６〜１６７１、１６７２〜１６９８、１６９９〜１７６３、１７６４〜１７６８、１７６９〜１７８６、１７８７〜１８２９、１８９５〜１９０３、１９０６、及び１９０８〜１９２７からのいずれかを含んでなるグルテンタンパク質のフラグメントなど）。このような配列の生物活性フラグメントもまた、本発明の剤である。典型的には、このようなフラグメントは、少なくとも７アミノ酸長（例えば、少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸長）であろう。配列番号１〜１９２７のいずれかと同等の配列、またはこれらの配列のアナログもまた、本発明の剤である。
エピトープが、別のグルテンタンパク質（例えば、本明細書に記述されるグルテンタンパク質のいずれか、またはセリアック病を引き起こす任意のグルテンタンパク質）に由来する上記のエピトープ（フラグメントを含む）と同等の配列を含んでなる場合、このような同等配列は、トランスグルタミナーゼで典型的に（部分または完全）処理されるグルテンタンパク質のフラグメントに対応するであろう。このような同等のペプチドは、他のグルテンタンパク質の配列を、元のエピトープが由来するグルテンタンパク質と配列比較することにより、例えば、本明細書に記述されるプログラムのいずれかを用いて、判定されることが可能である。トランスグルタミナーゼは、市販されている（例えば、シグマＴ−５３９８）。
アナログである剤は、（ｉ）を認識するＴＣＲによって認識されることが可能である。したがって、一般には、アナログを（ｉ）の存在下で（典型的には、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（本明細書に記述されるＡＰＣのいずれかなど）の存在下でも）Ｔ細胞に加える場合に、アナログは（ｉ）の認識を阻害する、すなわち、アナログはこのような系において（ｉ）と競合することが可能である。
アナログは、（ｉ）を認識するＴＣＲと結合可能なものであってもよい。このような結合を、標準的な技術により試験することが可能である。このようなＴＣＲを、（ｉ）を認識することが示されているＴ細胞から、（例えば、本発明の方法を用いて）単離することが可能である。次いで、アナログのＴＣＲへの結合の実証を、ＴＣＲがアナログのアナログと結合する物質、例えば、アナログに対する抗体、への結合を阻害するかどうかを測定することにより、示すことが可能である。典型的には、結合アッセイのこのような阻害において、アナログを、クラスＩＩ ＭＨＣ分子（例えば、ＨＬＡ−ＤＱ２）と結合させる。
典型的には、アナログは、（ｉ）のＴＣＲへの結合を阻害する。この場合、アナログの存在下でＴＣＲと結合することが可能な（ｉ）の量は、減少する。これは、アナログがＴＣＲと結合可能であり、そしてそれゆえにＴＣＲへの結合に関して（ｉ）と競合するためである。
上記の結合実験における使用のためのＴ細胞を、例えば本発明の方法を用いて、セリアック病を有する患者から単離することが可能である。アナログの他の結合特徴は、（ｉ）と同じであってもよく、したがって典型的にはアナログは、ペプチドが結合する同じＭＨＣクラスＩＩ分子（ＨＬＡ−ＤＱ２または−ＤＱ８）と結合する。アナログは、典型的には、（ｉ）に特異的な抗体と結合し、したがって（ｉ）のこのような抗体への結合を阻害する。
該アナログは、典型的にはペプチドである。これは、例えば、少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれより多くの連続的なアミノ酸の領域にわたって（アナログの全長及び／または（ｉ）など、あるいはＴＣＲと接触するかまたはＭＨＣ分子と結合する領域にわたって）、（ｉ）との相同性、典型的には少なくとも７０％の相同性、好ましくは少なくとも８０、９０％、９５％、９７％または９９％の（ｉ）との相同性を有してもよい。タンパク質の相同性を測定する方法は、当該技術分野において周知であり、そして、本文脈において、相同性がアミノ酸の一致（時には、「完全相同性」と称される）に基づき算出されることが、当業者により理解されるであろう。
例えば、ＵＷＧＣＧパッケージは、相同性を算出するのに用いられることが可能なＢＥＳＴＦＩＴプログラム（例えば、そのデフォルト設定で用いられる）を提供する（Devereuxら（1984年）Nucleic Acids Research 12、387〜395頁）。ＰＩＬＥＵＰ及びＢＬＡＳＴアルゴリズムを、例えばAltschul S. F.（1993年）J Mol Evol 36:290-300；Altschul, S, Fら（1990年）J Mol Biol 215:403-10に記載されるように、相同性を算出するかまたは配列比較を行うために（典型的には、そのデフォルト設定で）用いることが可能である。
ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウエアは、例えば「www.ncbi.nlm.nih.gov/」など
のインターネットを介したワールドワイドウェブ上で、国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Inion）を介して公的に利用可能である。こ
のアルゴリズムは、データベース配列における同じ長さの語と配列比較した場合に、いくつかのプラス値の閾値スコアＴと一致するかまたはこれを満たすクエリー配列における長さＷの短い語を同定することにより、高スコアの配列対（ＨＳＰ）をまず同定することを
、伴う。Ｔは、近隣語（neighbourhood word）スコア閾値と称される（Altschulら、同上）。これらの初期の近隣語のヒットは、それらを含有するＨＳＰを見つけるための探索を開始するための源として働く。該語のヒットは、累積の配列比較スコアが増加可能である限り、各配列で両方向に伸長する。各方向における該語のヒットの伸長は、累積の配列比較スコアが、量Ｘによりその最大到達値から下落する場合；累積スコアが、１またはそれより多くのマイナススコア残基の配列比較の蓄積により、０またはそれより下となる場合；あるいは、いずれかの配列の末端に達する場合に、停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータであるＷ、Ｔ及びＸは、配列比較の感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、語の長さ（Ｗ）を１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリックス（Henikoff及びHenikoff（1992年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919を参照されたい）の配列比較（Ｂ）を５０、期待（Ｅ）を１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両鎖の比較を、デフォルトとして用いる。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、二つの配列間の類似性の統計学的解析を行う；例えば、Karlin及びAltschul（1993年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787を参照されたい。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより供される類似性のある基準は、smallest sum probability（Ｐ（Ｎ））により供され、これは、二つのヌクレオチドもしくはアミノ酸配列間での一致が偶然起こるであろう確率の指標を供する。例えば、第一配列と第二配列との比較におけるsmallest sum probabilityが約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、そして最も好ましくは約０．００１未満であるならば、配列は、別の配列と類似すると考えられる。
相同性のペプチドアナログは、典型的には（ｉ）と、１、２、３、４、５、６、７、８またはそれより多くの変異（置換、欠失または挿入であってもよい）により異なる。これらの変異を、相同性の算出に関して、上記の領域のいずれかにわたって測定してもよい。置換は、好ましくは「保存的」である。これらは、以下の表にしたがって定義される。第二列の同じブロックの、好ましくは第三列の同じ行のアミノ酸を、互いに置換してもよい：
Figure 2019089770
典型的には、ＭＨＣ分子との結合に寄与するか、またはＴＣＲによる認識に関与する（ｉ）中のアミノ酸と同等の位置にあるアナログ中のアミノ酸は、同じか、または保存的である。
典型的には、アナログペプチドは１またはそれより多くの修飾を含んでなり、これは天
然の翻訳後修飾であっても、または人為的な修飾であってもよい。修飾は、アミノ、アセチル、ヒドロキシもしくはハロゲン（例えば、フッ素）基または炭水化物基などの化学的部分を、（典型的には、例えばＣ−Ｈ結合などの水素の置換により）供してもよい。典型的には、修飾は、ＮまたはＣ末端に存在する。
アナログは、１またはそれより多くの天然でないアミノ酸（例えば、天然アミノ酸と側鎖が異なるアミノ酸）を含んでなってもよい。一般に、天然でないアミノ酸は、Ｎ末端及び／またはＣ末端にあるであろう。天然でないアミノ酸は、Ｌ−またはＤ−アミノ酸であってもよい。
アナログは、典型的には、（ｉ）と実質的に類似する形、サイズ、可動性または電気的立体配置を有する。これは、典型的には、（ｉ）の誘導体である。一実施態様において、アナログは、配列番号１〜１９２７のいずれかの配列とグルテンでない配列とを含んでなる融合タンパク質である。好ましくは、本実施態様にしたがったアナログは、配列番号１５７８〜１５７９、１５８２〜１５８３、１５８７〜１５９３、１６００〜１６２０、１６２３〜１６５５、１６５６〜１６７１、１６７２〜１６９８、１６９９〜１７６３、１７６４〜１７６８、１７６９〜１７８６、１７８７〜１８２９、１８９５〜１９０３、１９０６、及び１９０８〜１９２７のいずれかとグルテンでない配列とを含んでなる、融合タンパク質である。
一実施態様において、アナログは、ＭＨＣクラスＩＩ分子と結合している（ｉ）であるか、またはそれを模倣している。このような複合体の２、３、４またはそれより多くが、例えばビオチン／ストレプトアビジンに基づく系を用いて、互いに会合または結合してもよく、典型的には、２、３または４個のビオチン標識ＭＨＣ分子がストレプトアビジン部分と結合する。このアナログは、典型的には、（ｉ）／ＭＨＣクラスＩＩ複合体の、該複合体に特異的なＴＣＲまたは抗体への結合を、阻害する。
アナログは、典型的には、ＦａｂもしくはＦ（ａｂ’）２フラグメントなどの、抗体または抗体フラグメントである。アナログは、固体担体上に固定化されてもよく、具体的には、ＭＨＣ分子と結合しているペプチドを模倣するアナログであってもよい。
アナログを、典型的には、コンピュータ手段により設計し、次いで、当該技術分野において公知の方法を用いて合成する。あるいは、アナログを、化合物のライブラリから選択することが可能である。ライブラリは、コンビナトリアルライブラリであっても、またはファージディスプレイライブラリなどのディスプレイライブラリであってもよい。化合物のライブラリを、ＨＬＡ−ＤＱ２または−ＤＱ８などのＭＨＣクラスＩＩ分子と結合している形態で、ディスプレイライブラリにおいて発現させてもよい。アナログを、一般には、結合特徴（ｉ）を模倣するその能に基づいたライブラリから選択する。このように、これらを、（ｉ）を認識するＴＣＲまたは抗体との結合能に基づいて選択してもよい。
典型的には、アナログは、典型的にはセリアック病患者由来のＴ細胞を用いて、剤（ｉ）のいずれかと少なくとも同程度に、例えば、同等のエピトープが本明細書に記載されるアッセイのいずれかにおいて認識されるのと少なくとも同程度に、Ｔ細胞により認識されるであろう。アナログは、ｉｎ ｖｉｖｏにてこのような程度に認識されてもよく、したがって本明細書に記述される剤のいずれかと少なくとも同程度に、例えば、ヒト患者または動物モデルにおいて、セリアック病の症状を誘導することが可能であってもよい。
アナログを、候補の物質が本発明のエピトープを認識するＴ細胞受容体により認識されるかどうかを判定すること、ここにおいて、物質の認識は、該物質がアナログであることを示す、を含んでなる方法にて、同定してもよい。このようなＴＣＲは本明細書に記述さ
れるＴＣＲのいずれであってもよく、かつＴ細胞上に存在してもよい。本明細書に記述される任意の適切なアッセイを用いて、アナログを同定することが可能である。一実施態様において、この方法をｉｎ ｖｉｖｏにて行う。上記のように、好ましいアナログは、同等のエピトープと少なくとも同程度に認識され、そこで、該方法を用いて、このような程度に認識されるアナログを同定してもよい。
一実施態様において、該方法は、候補の物質が本発明のエピトープの認識を阻害可能かどうかを判定すること、ここにおいて、認識の阻害は、該物質がアナログであることを示す、を含んでなる。
剤は、（ｉ）または（ｉｉ）により定義されるような少なくとも２、５、１０または２０個の剤を含んでなる産物であってもよい。典型的には、該組成物は、任意の種、変種または型の本明細書に記述されるグルテンタンパク質などの、異なるグルテンタンパク質に由来する本発明のエピトープ（または同等のアナログ）を含んでなる。好ましい組成物は、本明細書に記載される任意の種または変種に存在するすべてのグルテンに由来する、あるいは本明細書に記述される２、３、４またはそれより多くの種に由来する（小麦、ライ麦、大麦、オーツ麦またはライ小麦からなる種のパネルに由来するなど）、本発明の少なくとも一つのエピトープまたは同等のアナログを、含んでなる。このように、剤は、一価であっても、または多価であってもよい。
本発明の特定の実施態様によると、剤は、WO 02/083722及び／もしくはWO 01/25793及
び／もしくはWO03/104273において開示されているか、かつ／または配列番号１５５５〜
１５７７、１５８０〜１５８１、１５８４〜１５８６、１５９４〜１５９９、１６２１〜１６２２のいずれかに列挙されている配列を有していないか、またはそれに基づいておらず、かつ／あるいはＡ−グリアジン由来の剤（この配列を、図１０に示す）ではない。
配列番号１〜１９２７のうち、好ましいサブセットは、配列番号１〜１７６３である。配列番号１７６４〜１９２７内で、好ましいサブセットは：（ａ） オーツ麦配列１７６４〜１７６８、（ｂ） ライ麦配列１７６９〜１７８６、（ｃ） 大麦配列１７８７〜１８２９、（ｄ） 小麦配列１８９５〜１９０３、（ｅ） 小麦ＤＱ８配列１９０８〜１９２７、及び（ｆ） コンビトープ配列１９０６である。他の好ましいサブセットは：（ａ） １７６４〜１７６８、（ｂ） １７６９〜１７７３、（ｃ） １７７４〜１７８６、（ｄ） １７８７〜１７９２、（ｅ） １７９３〜１８２９、（ｆ） １８３０〜１８９４、（ｇ） １８９５〜１９０３、（ｈ） １８３０〜１９０３、（ｉ） １９０４〜１９０６、（ｊ） １９０８〜１９１６、（ｋ） １９１７〜１９２７、ならびに（ｌ） １９０８〜１９１３、１９１５〜１９２３及び１９２５〜１９２７である。
配列番号１５７８〜１５７９、１５８２〜１５８３、１５８７〜１５９３、１６００〜１６２０、１６２３〜１６５５、１６５６〜１６７１、１６７２〜１６９８、１６９９〜１７６３、及び１７６４〜１９２７のうち、特に好ましい小麦エピトープは、配列番号１６５６〜１６７１、１８３０〜１９０３、及び１９０７〜１９２７である。
配列番号１８３０〜１８９４（表１）のうち、いくつかの配列は、Ｎ末端及びＣ末端にグリシンを有する。本発明は、Ｃ末端グリシン及び／またはＮ末端グリシンを除外したこれらの配列にまで及ぶ。好ましくは、Ｃ末端グリシンとＮ末端グリシンの双方は、除外される。
診断
上記のように、本発明の診断方法は、剤と結合するＴ細胞の検出、または剤を認識する抗体の検出に基づいてもよい。
（上記の使用を含む）該方法にて剤を認識するＴ細胞は、一般には、１またはそれより多くのグルテンタンパク質に対してｉｎ ｖｉｖｏで前感作されているＴ細胞である。上記のように、このような抗原を経験したＴ細胞は、末梢血中に存在することが見いだされている。
該方法において、Ｔ細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで剤と接触させることが可能であり、そしてＴ細胞が剤を認識するかどうかの判定を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで行うことが可能である。このように、本発明は、ヒトの体で行われる診断の方法における使用のための剤を、提供する。異なる剤が、このような方法における同時、別々または連続的な使用のために提供される。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法は、剤が加えられる水溶液において、典型的には行われる。該溶液はまた、Ｔ細胞（及び、特定の実施態様では以下に論じるＡＰＣ）も含んでなるであろう。本明細書で用いられるような「接触させる」の語には、特定の物質を溶液に加えることが含まれる。
Ｔ細胞が剤を認識するかどうかの判定は、一般には、剤の存在下でＴ細胞の状態の変化を検出するか、またはＴ細胞が剤と結合するかどうかを判定することにより、成し遂げられる。状態の変化は、一般には、ＴＣＲが剤と結合した後に、Ｔ細胞の抗原特異的な機能活性によって引き起こされる。状態の変化を、Ｔ細胞の内側（例えば、タンパク質の細胞内発現の変化）または外側（例えば、分泌される物質の検出）で測定してもよい。
Ｔ細胞の状態の変化は、サイトカイン（特に、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２またはＴＮＦ−αなど）などのＴ細胞由来物質の分泌の開始または増加であってもよい。ＩＦＮ−γ分泌の測定が、特に好ましい。該物質は、典型的には、特異的な結合剤と結合させ、次いで特異的な結合剤／物質複合体の存在を測定することによって、検出可能である。特異的な結合剤は、典型的には、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体などの抗体である。サイトカインに対する抗体は、市販されているか、または標準的な技術を用いて作製可能である。
典型的には、特異的な結合剤を、固体担体上に固定化する。物質を結合させた後に、所望により、固体担体を洗浄して、該剤と特異的に結合していない材料を除去してもよい。該剤／物質複合体を、複合体と結合するであろう第二の結合剤を用いることによって検出してもよい。典型的には、第二の剤は、第一の剤が結合する部位とは異なる部位にて物質と結合する。第二の剤は、好ましくは抗体であり、そして検出可能な標識によって直接的または間接的に標識される。
よって、第二の剤は、典型的には検出可能な標識により直接的または間接的に標識されている第三の剤によって検出されてもよい。例えば、第二の剤は、ビオチン部分を含んでなってもよく、ストレプトアビジン部分及び典型的には検出可能な標識としてのアルカリホスファターゼを含んでなる第三の剤による検出を可能にする。
一実施態様において、用いられる検出システムは、WO 98/23960に記載されるｅｘ ｖ
ｉｖｏ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイである。このアッセイにおいて、Ｔ細胞から分泌されるＩＦＮ−γは、固体担体上に固定化されているＩＦＮ−γに特異的な第一抗体と結合する。次いで、結合したＩＦＮ−γを、検出可能な標識で標識されているＩＦＮ−γに特異的な第二抗体を用いて検出する。このような標識された抗体は、ＭＡＢＴＥＣＨ（ストックホルム、スウェーデン）から入手可能である。用いられることが可能な他の検出可能な標識については、以下に論じる。
測定されることが可能なＴ細胞の状態の変化は、チミジン取り込みなどの、Ｔ細胞による物質の取り込みの増加であってもよい。状態の変化は、Ｔ細胞のサイズの増加、またはＴ細胞の増殖であってもよく、あるいはＴ細胞上の細胞表面マーカーの変化であってもよい。
一実施態様において、状態の変化を、タンパク質の細胞内発現の変化（例えば、上記のサイトカインのいずれかの細胞内発現の増加）を測定することにより検出する。このような細胞内変化を、Ｔ細胞の内側を、発現したタンパク質と特異的に結合し、そしてフローサイトメトリーによるＴ細胞の選別を可能にする部分と接触させることによって、検出してもよい。
一実施態様において、ＴＣＲと結合する際に、剤は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に典型的には存在するＭＨＣクラスＩＩ分子（典型的には、ＨＬＡ−ＤＱ２または−ＤＱ８）と結合する。しかしながら、本明細書に記述のように、他の剤は、ＭＨＣ分子とも結合する必要なく、ＴＣＲと結合することが可能である。
一般には、該方法において接触させるＴ細胞を、Ｔ細胞を含有する他のタイプの試料を用いることが可能ではあるものの、血液試料中に個体から採取する。試料を直接的にアッセイに加えてもよく、または最初に処理してもよい。典型的には、処理は、例えば水またはバッファーを用いた試料の希釈を含んでなってもよい。典型的には、試料を、１．５〜１００倍、例えば、２〜５０、または５〜１０倍、に希釈する。
処理は、試料の成分の分離を含んでなってもよい。典型的には、単核球（ＭＣ）を試料から分離する。ＭＣは、Ｔ細胞及びＡＰＣを含んでなるであろう。このように、該方法において、分離されたＭＣ中に存在するＡＰＣは、ペプチドをＴ細胞に提示することが可能である。別の実施態様において、ＣＤ４ Ｔ細胞のみなどのＴ細胞のみを、試料から精製することが可能である。ＰＢＭＣ、ＭＣ及びＴ細胞を、Lalvaniら（1997年）J. Exp. Med. 186, 859〜865頁に記載されるものなどの当該技術分野において公知の技術を用いて、試料から分離することが可能である。
一実施態様において、アッセイに用いられるＴ細胞は、処理されていないかまたは希釈された試料の形態であるか、あるいはｅｘ ｖｉｖｏで直接的に用いられる単離されたばかりのＴ細胞（単離されたばかりのＭＣまたはＰＢＭＣの形態でなど）であり、すなわち、これらは該方法にて用いられる前に培養されていない。このように、Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで抗原特異性に再刺激されていない。しかしながら、Ｔ細胞を、使用前に、例えば１またはそれより多くの剤の存在下で培養することは可能であり、そして一般には、外因的な増殖もまたサイトカインを促進する。培養中、剤（群）は、典型的には、該方法において用いられるＡＰＣなどのＡＰＣの表面に存在する。Ｔ細胞の前培養は、該方法の感度の増加をもたらしてもよい。このように、Ｔ細胞を、（例えば、Otaら（1990年）Nature 346, 183〜187頁に記載されるような）短期細胞株などの細胞株に変換することが可能である。
該方法において典型的に存在するＡＰＣは、Ｔ細胞と同じ個体由来であっても、または異なる宿主由来であってもよい。ＡＰＣは、自然発生的なＡＰＣであっても、または人工的なＡＰＣであってもよい。ＡＰＣは、ペプチドをＴ細胞に提示することが可能な細胞である。これは、典型的には、Ｂ細胞、樹状細胞またはマクロファージである。これは、典型的には、Ｔ細胞と同じ試料から分離され、そして典型的には、Ｔ細胞と同時精製される。このように、ＡＰＣは、ＭＣまたはＰＢＭＣ中に存在してもよい。ＡＰＣは、典型的には、ｅｘ ｖｉｖｏで単離されたばかりの細胞、または培養された細胞である。これは、短期もしくは不死化細胞株などの細胞株の形態であってもよい。ＡＰＣは、空のＭＨＣクラスＩＩ分子をその表面に発現してもよい。
該方法において、１またはそれより多くの（異なる）剤を用いてもよい。典型的には、試料由来のＴ細胞を、試験する予定のすべての剤とともにアッセイに入れるか、あるいは、Ｔ細胞を分けて、それぞれが１またはそれより多くの剤を含有する別々のアッセイに入れることが可能である。
本発明はまた、同時、別々または連続的な使用のための（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでの使用のための）、２またはそれより多くの本明細書に記述される剤のいずれか（例えば、上記に論じた組成物の剤において存在する剤の組み合わせ）などの剤も、提供する。
一実施態様において、剤自体を、Ｔ細胞及びＡＰＣを含んでなるアッセイに直接的に加える。上記に論じるように、このようなアッセイにおけるＴ細胞及びＡＰＣは、ＭＣの形態であることが可能である。ＡＰＣによる提示の必要なしにＴ細胞により認識されることが可能な剤を用いる場合、ＡＰＣは必要とされない。ＭＨＣ分子と結合している元来の（ｉ）を模倣するアナログは、このような剤の一例である。
一実施態様において、剤を、Ｔ細胞の非存在下でＡＰＣに供する。次いで、剤をその表面に提示することが可能となった後に、ＡＰＣをＴ細胞に供する。ペプチドは、ＡＰＣの内部に取り込まれていてもよく、あるいはＡＰＣの内部に入らずに表面に単に取り込まれていてもよい。
剤をＴ細胞と接触させる期間は、ペプチドの認識を判定するために用いられる方法に依存して変わるであろう。典型的には１０５〜１０７個、好ましくは５ｘ１０５〜１０６個のＰＢＭＣを、各アッセイに加える。剤をアッセイに直接的に加える場合、その濃度は１０−１〜１０−３μｇ／ｍｌ、好ましくは０．５〜５０μｇ／ｍｌまたは１〜１０μｇ／ｍｌである。
典型的には、Ｔ細胞を剤とインキュベートする時間の長さは、４〜２４時間、好ましくは６〜１６時間である。ｅｘ ｖｉｖｏでＰＢＭＣを用いる場合、０．３ｘ１０６個のＰＢＭＣを、３７℃にて１２時間、１０μｇ／ｍｌのペプチド中でインキュベート可能なことが見いだされている。
Ｔ細胞による剤の認識の判定を、剤のＴ細胞への結合を測定することにより行ってもよい（本明細書に論じる任意の適切な結合アッセイ形式を用いて、これを行うことが可能である）。典型的には、剤と結合するＴ細胞を、例えばＦＡＣＳ機器を用いて、この結合に基づいて選別することが可能である。剤を認識するＴ細胞の存在は、剤を用いて選別された細胞の頻度が「対照」値を超えるならば、生じると考えられるであろう。抗原を経験したＴ細胞の頻度は、一般には１０６個中１個〜１０３個中１個であり、それゆえに選別された細胞が抗原を経験したＴ細胞であるかどうかを判定することが可能である。
Ｔ細胞による剤の認識の判定を、ｉｎ ｖｉｖｏにて測定してもよい。典型的には、剤を宿主に投与し、次いで剤の認識を示す応答を測定してもよい。剤を、典型的には、皮内または表皮に投与する。剤を、典型的には、皮膚の外側と接触させることにより投与し、そして硬膏剤または包帯剤を用いて当該部位に保持してもよい。あるいは、剤を、注射など、針により投与してもよいが、しかし弾道（ｂａｌｌｉｓｔｉｃｓ）（例えば、核酸を送達するために用いられている弾道技術）などの他の方法により投与することもまた可能である。EP-A-0693119は、剤を投与するために典型的に用いられることが可能な技術について記載している。典型的には０．００１〜１０００μｇ（例えば、０．０１〜１００μ
ｇまたは０．１〜１０μｇ）の剤を、投与する。
一実施態様において、ｉｎ ｖｉｖｏで剤を供することが可能な産物（ｐｒｏｄｕｃｔ）を、投与することが可能である。このように、剤を発現可能なポリヌクレオチドを、典型的には剤の投与に関して上述の方法のいずれかにより投与することが可能である。ポリヌクレオチドは、典型的には、以下に論じる本発明により提供されるポリヌクレオチドの特徴のいずれかを有する。剤を、ｉｎ ｖｉｖｏでポリヌクレオチドから発現させる。典型的には０．００１〜１０００μｇ（例えば、０．０１〜１００μｇまたは０．１〜１０μｇ）のポリヌクレオチドを、投与する。
皮膚に投与された剤の認識は、典型的には、投与部位における炎症の発生（例えば、硬結、紅斑または浮腫）により示される。これは、一般には、該部位の目視検査によって測定される。
剤と結合する抗体の検出に基づいた診断方法を、典型的には、個体から得た試料（本明細書に記述される任意の方法で処理されていてもよい、本明細書に記述される試料のいずれかなど）を剤と接触させ、そして試料中の抗体が剤と結合するかどうかを判定すること、ここにおいて、このような結合は、該個体がセリアック病を有するかまたはそれに感受性であることを示す、により、行う。本明細書に記述される任意のこのような形式などの、任意の適切な形式の結合アッセイを、用いてもよい。
療法
免疫ドミナントエピトープ及び本明細書に記載される他のエピトープの同定は、このエピトープを認識するＴ細胞（このようなＴ細胞は、グルテンタンパク質に対する免疫応答に関与するものである）を標的とする治療用産物の作製を可能にする。これらの発見はまた、エピトープに対する抗体またはＴ細胞の応答を（寛容化により）抑制することによってセリアック病の予防または治療を可能にする。
本発明の特定の剤は、（上記に論じる結合アッセイのいずれかを用いて測定されるように）本発明のエピトープを認識するＴＣＲと結合し、そしてＴＣＲを保有するＴ細胞の寛容化を引き起こす。したがって、所望によりキャリアーと会合していてもよいこのような剤を用いて、セリアック病を予防または治療することが可能である。
一般には、寛容化を、Ｔ細胞の抗原特異的な機能活性（例えばサイトカイン分泌などの、本明細書に記述される任意のこのような活性など）を（ＴＣＲにより認識された後に）引き起こすことが可能な同じペプチドにより、引き起こすことが可能である。このような剤は、これらが「寛容化」の文脈において免疫系に提示される場合に、寛容化を引き起こす。
寛容化は、免疫系によるＴ細胞または抗体のエピトープの認識の減少をもたらす。Ｔ細胞のエピトープの場合、これは、エピトープを認識するＴ細胞の除去またはアネルギー化によって引き起こされることが可能である。このように、（例えば、本明細書に記述される適切なアッセイにて測定されるような）エピトープに応答したＴ細胞活性は、減少する。抗体応答の寛容化は、エピトープに対する特異的抗体量の減少が、エピトープが投与されるときにもたらされることを、意味する。
このような文脈において免疫系に抗原を提示する方法は公知であり、そして例えば、Yoshidaら、Clin. Immunol. Immunopathol. 82, 207-215（1997年）、Thurauら、Clin. Exp. Immunol. 109, 370-6（1997年）、及びWeinerら、Res. Immunol. 148, 528-33（1997年）に記載されている。具体的には、経口、経鼻または腹腔内などの特定の投与経路が、寛容化を引き起こすことが可能である。また、寛容化を、ペプチドを提示している樹状細胞及び四量体を介して成し遂げてもよい。寛容化を引き起こす特定の産物を、（例えば、剤もまた含んでなる組成物中に含めて）個体に投与してもよい。このような産物には、Ｔｈ２応答を促すサイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＴＧＦ−βまたはＩＬ−１０）などのサイトカインが含まれる。産物または剤を、寛容化を引き起こす用量にて投与してもよい。
本発明は、Ｔ細胞（該Ｔ細胞が、剤を認識する）のアンタゴニストとして作用することが可能な配列を含んでなるタンパク質を、提供する。このようなタンパク質及びこのようなアンタゴニストを用いても、セリアック病を予防または治療することが可能である。アンタゴニストは、Ｔ細胞応答の減少を引き起こすであろう。一実施態様において、アンタゴニストは、（一般には、ＨＬＡ−ＤＱ２または−ＤＱ８との複合体の形態で）Ｔ細胞のＴＣＲと結合するが、しかし正常な機能活性化引き起こす代わりに、異常なシグナルをＴＣＲの細胞内シグナルカスケードに通し、（例えば、典型的には本明細書に記述される任意の適切なアッセイにより測定されるような、エピトープの認識に応答する）Ｔ細胞の機能活性を減少させる。
一実施態様において、アンタゴニストは、エピトープと競合して、ＭＨＣ分子（典型的には、ＨＬＡ−ＤＱ２または−ＤＱ８）などの、ＭＨＣの加工及び提示経路の成分と結合する。このように、アンタゴニストは、ＨＬＡ−ＤＱ２または−ＤＱ８（及び、このようにこのＭＨＣ分子により提示されるペプチド）、あるいはそのホモログと結合してもよい。
アンタゴニズムを引き起こす方法は、当該技術分野において公知である。一実施態様において、アンタゴニストは、上記のエピトープのホモログであり、そして剤の配列、結合性または他の特性のいずれを有してもよい（具体的には、アナログ）。アンタゴニストは、典型的には、１、２、３、４またはそれより多くの変異（そのそれぞれは、置換、挿入または欠失であってもよい）によって、（Ｔ細胞において正常な抗原特異的機能を引き起こすことが可能な）上記のエピトープのいずれかとは異なる。このようなアンタゴニストは、当該技術分野において「改変ペプチドリガンド」または「ＡＰＬ」と称される。変異は、典型的には、ＴＣＲと接触するアミノ酸位置にある。
例えば、アンタゴニストは、Ａ−グリアジン（Ａ−グリアジンの配列を、図１０に示す）のアミノ酸６４〜６７により表される配列と同等である配列内での置換により、エピトープと異なってもよい。このように、好ましくは、アンタゴニストは、６４、６５または６７位と同等の位置が置換されている。好ましくは、該置換は、６４Ｗ、６７Ｗ、６７Ｍまたは６５Ｔである。
個体における本発明のエピトープに対するＴ細胞免疫応答がポリクローナルであることから、異なるＴＣＲを有するＴ細胞の応答のアンタゴニズムを引き起こすために、１より多くのアンタゴニストを投与することを必要としてもよい。したがって、アンタゴニストを、それぞれが異なるＴ細胞をアンタゴナイズする、少なくとも２、４、６またはそれより多くの異なるアンタゴニストを含んでなる組成物に含めて、投与してもよい。
本発明はまた、（剤を認識する）Ｔ細胞のアンタゴニストを同定する方法であって、候補の物質をＴ細胞と接触させ、そして該物質が抗原特異的応答を起こすＴ細胞の能の減少を起こすかどうかを（例えば、本明細書に記述される任意の適切なアッセイを用いて）検出すること、ここで、前記の能の任意のこのような減少の検出は、該物質がアンタゴニストであることを示す、を含んでなる上記方法も、提供する。
一実施態様において、アンタゴニスト（特定のエピトープに対するアンタゴニストの組
み合わせを含む）、または寛容化する（Ｔ細胞及び抗体を寛容化する）剤は、本発明の異なるエピトープに対して、例えば、１物質よりも多くを含んでなる産物である剤に関連して上記に論じるエピトープの組み合わせに対して、アンタゴナイズするかまたは寛容化する、少なくとも２、４、６もしくはそれより多くのアンタゴニストまたは剤を含んでなる組成物にて、存在する。
組成物がセリアック病を引き起こすことが可能かどうかの検査
上記のように、本発明は、組成物がセリアック病を引き起こすことが可能かどうかを判定する方法であって、本発明の剤またはエピトープを含んでなる配列へとトランスグルタミナーゼにより修飾されることが可能なタンパク質配列の存在を検出すること、ここで、このようなトランスグルタミナーゼ活性は、ヒト腸トランスグルタミナーゼ活性であってもよい、を含んでなる上記方法を、提供する。典型的には、これを、配列と特異的に結合する部分を組成物と接触させ、そして配列／部分複合体の形成を検出し、そしてこれを用いて剤の存在を確かめる、結合アッセイを用いることにより、行う。このような部分は、本明細書に記述される任意の適切な物質（または物質のタイプ）であってもよく、そして典型的には、特異的抗体である。（本明細書に記述されるものなどの）任意の適切な形式の結合アッセイを、用いることが可能である。
一実施態様において、組成物を、異なるグルテンタンパク質に由来する本発明のエピトープに特異的な、少なくとも２、５、１０またはそれより多くの抗体、例えば、１物質よりも多くを含んでなる産物である本発明の剤に関連して上記に論じるエピトープの組み合わせを認識可能な、抗体パネル、と接触させる。
組成物は、典型的には、セリアック病を引き起こすことが可能なグルテンタンパク質を発現する植物由来の材料（例えば、本明細書に記述されるグルテンタンパク質または植物のいずれか）を含んでなる。このような材料は、収穫された産物（例えば、種子）などの植物の一部分であってもよい。該材料は、グルテンタンパク質を含んでなる小麦粉または食物などの、植物材料の加工された産物（例えば、本明細書に記述される任意のこのような産物）であってもよい。植物材料の加工、及び適切な結合アッセイでの検査は、例えばKricka LJ, J. Biolumin. Chemilumin. 13, 189-93（1998年）に記述されるように、ルーチンに行われている。
結合アッセイ
本明細書に記述される任意の二つの物質間の結合の判定を、分光学的変化などの、結合に際して変化する一方または双方の物質の特徴を測定することにより、行ってもよい。
結合アッセイの形式は、「バンド移行」系であってもよい。これは、ゲル電気泳動中に、一方の物質（候補の物質など）の存在が他方の物質の進行を進めるかまたは遅らせるかどうかを判定することを、伴う。
該形式は、一方の物質が、他方の物質の、特異的抗体などの他方の物質と結合することが知られる剤への結合を阻害可能かどうかを判定する、競合的結合法であってもよい。
変異グルテンタンパク質
本発明は、本発明のエピトープ配列、またはこのような配列を供するためにトランスグルタミナーゼによって修飾されることが可能な配列が、エピトープを認識するＴ細胞応答をもはや引き起こさないか、またはそれにより認識されないように変異させているグルテンタンパク質を、提供する。本文脈において、認識の語は、正常な（拮抗的でない）抗原特異的なＴ細胞の機能活性が生じるようにＴＣＲがエピトープと結合することを、指す。
他のグルテンタンパク質において同等のエピトープを同定する方法を、上記に論じている。変異させたグルテンタンパク質の野生型は、セリアック病を引き起こすものである。このような変異させたグルテンタンパク質は、この変異させたグルテンタンパク質の野生型と、その配列のすべてにわたり、あるいはその配列の１５、３０、６０、１００または２００連続アミノ酸にわたり、例えば（アナログに関連して）上記の程度に、相同性を有してもよい。他の天然グルテンタンパク質の配列は、当該技術分野において公知である。
変異させたグルテンタンパク質は、セリアック病を引き起こさないか、または減少したセリアック病の症状を引き起こすであろう。典型的には、変異は、エピトープのＴ細胞応答誘導能を減少させる。変異させたエピトープは、ＨＬＡ−ＤＱ２または−ＤＱ８との結合性が減少しているか、ＡＰＣによる提示能が減少しているか、あるいは剤を認識するＴ細胞と結合するかまたはそれにより認識される（すなわち、抗原特異的な機能活性を引き起こす）能が減少していてもよい。したがって、変異させたグルテンタンパク質もしくはエピトープは、本発明の診断学的側面に関連して本明細書に記述されるアッセイのいずれかにおいて、認識を示さないか、または認識の低下を示すであろう。
変異は、エピトープにおける１〜３、４〜６、６〜１０、１１〜１５またはそれを超える長の、例えば、配列番号１〜１９２７のいずれか；またはその同等物にわたる、１またはそれより多くの欠失、付加あるいは置換であってもよい。好ましくは、変異グルテンタンパク質は、配列番号１〜１９２７のいずれかの配列において、少なくとも一つの変異を有する。好ましい変異は、Ａ−グリアジンにおける６５位と同等の位置にある（図１０を参照されたい）。好ましくは、自然発生グルタミンは、ヒスチジン、チロシン、トリプトファン、リシン、プロリンまたはアルギニンに置換される。
このように、本発明はまた、セリアック病を引き起こすグルテンタンパク質の能を減少させるための、本発明のエピトープであるグルテンタンパク質のエピトープにおける変異（本明細書に論じられる配列のいずれかにおける、このようないずれかの変異）の使用も、提供する。
一実施態様において、変異させた配列は、アンタゴニストとして作用することが可能である。このように、本発明は、Ｔ細胞受容体と結合可能な配列を含んでなるタンパク質であって、Ｔ細胞受容体が本発明の剤を認識し、かつ配列がこのようなＴ細胞受容体を保有するＴ細胞のアンタゴニズムを引き起こすことが可能な、上記タンパク質を、提供する。
本発明はまた、上記の変異グルテンタンパク質のフラグメントであるタンパク質であって、少なくとも７アミノ酸長（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、３０、６０、１００、１５０、２００または２５０アミノ酸長）であり、かつグルテンの認識される能を減少させる上記に論じられる変異を含んでなる上記タンパク質も、提供する。本明細書に記述される（フラグメントを含む）変異タンパク質のいずれもが、例えば他のグルテンタンパク質または非グルテンタンパク質との融合タンパク質の形態にて、存在してもよい。
変異させたグルテンタンパク質と同等の野生型タンパク質は、典型的には、コムギ属（Triticum）、ライムギ属（Secale）、オオムギ属（Hordeum）、ライコムギ属（Triticale）またはカラスムギ属（Avena）（例えば、小麦、ライ麦、大麦、オーツ麦またはライ小麦triticale)から選択される属の植物などの、イネ科単子葉植物由来である。例えば、該タンパク質は、α、αβ、β、γもしくはωグリアジン、またはアベニンである。
キット
本発明はまた、１またはそれより多くの剤、及び所望により、Ｔ細胞による剤の認識を
検出する手段を含んでなる、方法を実行するためのキットも、提供する。典型的には、異なる剤を、同時、別々、または連続的な使用のために提供する。典型的には、認識を検出する手段は、上記に論じる技術に基づいた検出を可能にするか、または補助する。
このように、該手段は、認識後にＴ細胞により分泌される物質の検出を可能にしてもよい。このように、キットは、抗体などの、該物質に特異的に結合する部分をさらに含んでもよい。該部分は、典型的には、ＩＦＮ−γに特異的である。該部分は、典型的には、固体担体上に固定化される。このことは、該物質が、該部分と結合した後に、これを分泌するＴ細胞の近隣に留まり続けるであろうことを、意味する。このように、物質／部分複合体の「スポット」が担体上に形成され、ここで、各スポットは物質を分泌しているＴ細胞を表す。スポットを定量し、そして典型的には対照と比較することにより、剤の認識の判定が可能となる。
キットはまた、物質／部分複合体を検出する手段も含んでなる。色の変化などの検出可能な変化は、物質と結合した後に該部分自体に生じてもよい。あるいは、検出のために直接的または間接的に標識した第二の部分を、スポットの判定を可能にするために、物質／部分複合体と結合させてもよい。上記に論じるように、第二の部分は物質に特異的であってもよいが、しかし第一の部分とは異なる物質上の部位に結合する。
固定化された担体は、マイクロタイタープレートなどの、ウェルを伴うプレートであってもよい。したがって、各アッセイを、プレート中の別々のウェルにおいて行うことが可能である。
キットは、検出工程にて用いるためのＴ細胞用培地、検出用部分または洗浄バッファーをさらに含んでなってもよい。キットは、試料からのＰＢＭＣまたはＴ細胞の分離などの、試料からの分離に適した試薬を、さらに含んでなってもよい。キットは、試料の成分のいかなる分離も必要とせずに、試料中で直接的にＴ細胞の検出を可能にするように、設計されてもよい。
キットは、皮内または表皮投与などの、剤の投与を可能にする器具を、含んでなってもよい。典型的には、このような器具は、硬膏剤、包帯剤または１もしくはそれより多くの針を含んでなる。器具は、剤の弾道（ｂａｌｌｉｓｔｉｃｓ）送達を可能にしてもよい。キット中の剤は、医薬組成物の形態であってもよい。
キットはまた、陽性対照または陰性対照などの対照も含んでよい。陽性対照は、検出系が検査されることを可能にしてもよい。このように、陽性対照は、典型的には、上記方法のいずれかにおける剤の認識を模倣する。典型的には、ｉｎ ｖｉｔｒｏで認識を判定するよう設計されているキットにおいて、陽性対照はサイトカインである。剤のｉｎ ｖｉｖｏ認識を検出するよう設計されているキットにおいて、陽性対照は、ほとんどの個体が応答するはずの抗原であってもよい。
キットはまた、血液試料などのＴ細胞を含有する試料を宿主から採取する手段も含んでなってもよい。キットは、単核球またはＴ細胞を宿主から得た試料より分離する手段を含んでなってもよい。
ポリヌクレオチド、細胞、トランスジェニック哺乳動物及び抗体
本発明はまた、剤または変異グルテンタンパク質を提供するための、発現可能なポリヌクレオチドを、提供する。典型的には、該ポリヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡであり、そして一本鎖または二本鎖である。該ポリヌクレオチドは、好ましくは少なくとも５０塩基もしくは塩基対（例えば、５０〜１００、１００〜５００、５００〜１０００または１０００〜２０００、あるいはそれより多くの塩基または塩基対）を含んでなるであろう。したがって、該ポリヌクレオチドは、配列番号１〜１９２７のいずれかの配列、または本明細書に記述される他の剤のいずれかをコードする配列を含んでなる。このコード配列の５’及び３’に、本発明のポリヌクレオチドは、対応するグルテンタンパク質遺伝子中のこれらの配列の５’及び３’の配列またはコドンとは異なる配列またはコドンを有する。
ペプチドをコードする配列の５’及び／または３’に、ポリヌクレオチドは、コード配列または非コード配列を有する。コード配列の５’及び／または３’の配列は、剤をコードする配列の転写及び／または翻訳などの、発現を補助する配列を含んでなってもよい。該ポリヌクレオチドは、原核細胞または真核細胞において剤を発現することが可能であってもよい。一実施態様において、該ポリヌクレオチドは、ヒト、霊長類またはげっ歯類（例えば、マウスまたはラット）の細胞などの哺乳動物細胞において剤を発現することが可能である。
本発明のポリヌクレオチドを、バックグラウンドを有意に超えるレベルにて、剤が由来するグルテンタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、選択的にハイブリダイズさせてもよい。選択的なハイブリダイゼーションを、典型的には、中等度〜高度にストリンジェントな条件（例えば、約５０℃〜約６０℃にて、０．０３Ｍ塩化ナトリウム及び０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）を用いて成し遂げる。しかしながら、このようなハイブリダイゼーションを、当該技術分野において公知の任意の適切な条件下で行ってもよい（例えば、Sambrookら（1989年）Molecular Cloning: A Laboratory Manualを参照されたい）。例えば、高度のストリンジェンシーが必要とされるならば、適切な条件には、６０℃にて０．２ｘＳＳＣが含まれる。より低度のストリンジェンシーが必要とされるならば、適切な条件には、６０℃にて２ｘＳＳＣが含まれる。
本発明の剤またはタンパク質は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドによってコードされてもよい。
ポリヌクレオチドは、複製可能なベクターを形成するか、またはそれに取り込まれてもよい。このようなベクターは、適切な細胞において複製可能である。ベクターは、発現ベクターであってもよい。このようなベクターにおいて、本発明のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの発現のために供することが可能な制御配列と、機能可能なように連結されている。ベクターは、アンピシリン耐性遺伝子などの選択マーカーを含有してもよい。
ポリヌクレオチドまたはベクターは、細胞内に存在してもよい。このような細胞は、ポリヌクレオチドまたはベクターにより形質転換されていてもよい。該細胞は、剤を発現してもよい。該細胞は、前記ベクターと適合性であるように選択されるであろうし、そして例えば、原核（細菌）、酵母、昆虫または哺乳動物細胞であってもよい。ポリヌクレオチドまたはベクターを、リン酸カルシウム沈降、ＤＥＡＥ−デキストラン・トランスフェクションまたは電気穿孔を含む慣用の技術を用いて、宿主細胞内に導入してもよい。
本発明は、組換え手段による本発明のタンパク質の産生の過程を、提供する。これは、（ａ） 上記に定義されるような形質転換された細胞を、タンパク質の発現を可能にする条件下で培養すること；及び好ましくは、（ｂ） 発現したポリペプチドを回収すること：を含んでなってもよい。所望により、該ポリペプチドを、当該技術分野において公知の技術により、単離及び／または精製してもよい。
本発明はまた、剤を認識（または結合）するＴＣＲ、あるいはこのような認識（または結合）が可能なそのフラグメントも、提供する。これらは、本発明のタンパク質に関連して本明細書に論じられている、本明細書に記述される任意の形態（例えば、純度）にて存
在することが可能である。本発明はまた、本発明の細胞に関して本明細書において論じられている任意の形態（例えば、純度）にて存在することが可能なこのようなＴＣＲを発現するＴ細胞も、提供する。
本発明はまた、（本発明のエピトープのいずれかなどの）剤を特異的に認識し、かつ本発明の変異グルテンタンパク質を認識する（そして典型的には、同等の野生型グルテンタンパク質を認識しない）モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、ならびにこのような抗体の作製方法も、提供する。本発明の抗体は、本発明のこれらの物質と特異的に結合する。
本発明の目的上、「抗体」の語には、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ）及びＦ（ａｂ’）２フラグメントなどの抗体フラグメント、ならびに一本鎖抗体が含まれる。
ポリクローナル抗体を産生するための方法は、適切な宿主動物（例えば、実験動物）を免疫原で免疫し、そして血清から免疫グロブリンを単離することを含んでなる。したがって、動物に免疫原を接種し、続いて血液を動物から取り出し、そしてＩｇＧ画分を精製してもよい。モノクローナル抗体を産生するための方法は、所望の抗体を産生する細胞を不死化することを含んでなる。ハイブリドーマ細胞を、接種された実験動物由来の脾臓細胞を腫瘍細胞と融合させることにより、作製してもよい（Kohler及びMilstein（1975年）Nature 256, 495-497）。
所望の抗体を産生する不死化された細胞を、慣用の手順により選択してもよい。ハイブリドーマを、培養にて増殖させるか、あるいは腹水形成のために腹腔内注射するか、または同種宿主もしくは免疫不全宿主の血流中に注射してもよい。ヒト抗体を、ヒトリンパ球のｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫化と、それに続くEpstein-Barrウイルスによるリンパ球の形質転換によって、調製してもよい。
モノクローナル抗体とポリクローナル抗体の双方を産生するためには、実験動物は、適切にはヤギ、ウサギ、ラットまたはマウスである。所望の場合には、免疫原を、免疫原が例えばアミノ酸残基のうちの一つの側鎖を介して適切なキャリアーと連結している結合体として、投与してもよい。キャリアー分子は、典型的には、生理学的に許容可能なキャリアーである。得られた抗体を単離し、そして所望の場合には精製してもよい。
本発明のポリヌクレオチド、剤、タンパク質または抗体は、検出可能な標識を保有してもよい。所望により光学的に拡大する手段を用いて、分泌された物質の目視検査による検出を可能にする検出可能な標識が、好ましい。このような系は、典型的には、基質の色の変化を引き起こす酵素標識（例えば、基質の色の変化を引き起こすアルカリホスファターゼ）に基づく。このような基質は、例えばバイオ・ラッド社から、市販されている。他の適切な標識には、ペルオキシダーゼなどの他の酵素、またはビオチンなどのタンパク質標識；あるいは、３２Ｐまたは３５Ｓなどのラジオアイソトープが含まれる。上記の標識を、公知の技術を用いて検出してもよい。
本発明のポリヌクレオチド、剤、タンパク質、抗体または細胞は、実質的に精製された形態であってもよい。これらは、実質的に単離された形態であってもよく、この場合、これらは、概して、調製物中に少なくとも８０％（例えば、少なくとも９０、９５、９７または９９％）のポリヌクレオチド、ペプチド、抗体、細胞または乾燥質量を含んでなるであろう。ポリヌクレオチド、剤、タンパク質または抗体は、典型的には、他の細胞成分を実質的に含まない。ポリヌクレオチド、剤、タンパク質または抗体は、該方法において、実質的に単離されているか、精製されているか、または遊離している形態にて用いられてもよく、あるいはキット中でこのような形態にて存在してもよい。
本発明はまた、本発明のＴＣＲを発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物も提供する。これは、（例えば、抗体の産生に関連して）本明細書に論じられる哺乳動物のいずれであってもよい。好ましくは、哺乳動物は、セリアック病を有するか、またはそれに感受性である。哺乳動物は、ＨＬＡ−ＤＱ２もしくは−ＤＱ８、またはＨＬＡ−ＤＱ３−ＤＱ２も発現してよく、かつ／あるいはセリアック病を引き起こすグルテンタンパク質（例えば、本明細書に記述されるグルテンタンパク質のいずれか）を含んでなる食事を与えられてもよい。このように、哺乳動物は、セリアック病の動物モデルとしての役目を果たしてもよい。
本発明はまた、セリアック病治療用剤である産物を同定する方法であって、セリアック病を有するかまたはそれに感受性の本発明の哺乳動物に、候補の物質を投与し、そして物質が哺乳動物においてセリアック病を予防または治療するかどうかを判定すること、ここにおいて、セリアック病の予防または治療は、該物質が治療用産物であることを示す、を含んでなる上記方法も、提供する。このような産物を用いて、セリアック病を治療または予防してもよい。
本発明は、治療（予防も含む）剤、または診断用物質（本発明の剤、タンパク質及びポリヌクレオチド）を提供する。これらの物質は、これらを医薬的に許容可能なキャリアーまたは希釈剤と混合することにより、臨床投与用に処方物化される。例えば、これらは、局所、非経口、静脈内、筋肉内、皮下、眼内、皮内、表皮または経皮投与用に、処方物化されることが可能である。該物質を、医薬的に許容可能であって、かつ所望の投与経路に適切な任意のビヒクルと、混合してもよい。注射用の医薬的に許容可能なキャリアーまたは希釈剤は、例えば、注射用水または生理食塩液などの等張溶液、あるいは弾道送達用のキャリアー粒子であってもよい。
物質の用量を、種々のパラメータ、特に、用いられる剤；治療される患者の年齢、体重及び状態；用いられる投与方法；治療される状態の重症度；ならびに、必要とされる臨床レジメにしたがって、調整してもよい。参考として、注射により投与される物質の量は、適切には、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。
当業者が、任意の特定の患者及び状態に対する至適な投与経路及び投与量を容易に決定可能であろうことから、記載した投与経路及び投与量は参考に過ぎないことが、意図される。
このように、本発明の物質を、ヒトまたは動物の体の治療方法、あるいはヒトの体において実践される診断方法において用いてもよい。具体的には、これらを、セリアック病を治療または予防する方法において用いてもよい。本発明はまた、セリアック病を治療または予防するための薬剤の製造方法における使用のための剤も、提供する。このように、本発明は、本発明の物質（典型的には、その非毒性有効量）をそれを必要とするヒトに投与することを含んでなる、セリアック病を予防または治療する方法を、提供する。
本発明の剤を、自動合成機を用いることによるなどの標準的な合成化学技術を用いて、作製することが可能である。剤を、典型的にはペプチドの配列を含んでなる、より長いポリペプチド（例えば、融合タンパク質）から、作製してもよい。ペプチドは、例えば、プロテアーゼを用いるなどしてポリペプチドを加水分解することにより；または、ポリペプチドを物理的に切断することにより、生じてもよい。本発明のポリヌクレオチドを、合成機を用いることによるなどの標準的な技術を用いて、作製することが可能である。
変異グルテンタンパク質を発現するか、またはアンタゴニストとして働くことが可能な
配列を含んでなるタンパク質を発現する、植物細胞及び植物
本発明の細胞は、イネ科単子葉植物種の細胞などの植物細胞であってもよい。該種は、その野生型が、本明細書に記述されるグルテンタンパク質のいずれかなどのグルテンタンパク質を発現するものであってもよい。このようなグルテンタンパク質は、ヒトにおいてセリアック病を引き起こしうる。該細胞は、小麦、トウモロコシ、オーツ麦、ライ麦、米、大麦、ライ小麦、ソルガムまたはサトウキビのものであってもよい。典型的には、該細胞は、aestivum、spelta、polonicumまたはmonococcumなどのコムギ属のものである。
本発明の植物細胞は、典型的には、１またはそれより多くの野生型グルテンタンパク質（セリアック病を引き起こす可能性のある、本明細書に記述されるグルテンタンパク質のいずれかなど）を発現しないもの、あるいは、剤を認識するＴ細胞により認識されることが可能な配列を含んでなる１またはそれより多くのグルテンタンパク質を発現しないものである。このように、野生型植物細胞がこのようなグルテンタンパク質を発現したならば、これを、このようなグルテンタンパク質の発現を防ぐかまたは低下させるよう、あるいは（典型的には、本発明のエピトープをもはや発現しないことにより）セリアック病をもはや引き起こさないようにグルテンタンパク質のアミノ酸配列を変化させるよう、操作してもよい。
これを、例えば、変異を１、２、３またはそれより多くの、あるいはすべてのこのような細胞中グルテンタンパク質遺伝子に（例えば、コードまたは非コード（例えば、プロモーター領域）に）導入することにより、行うことが可能である。このような変異は、（例えば、相同タンパク質に関連して）本明細書に論じられる変異のいずれの型または長さでもあることが可能である。変異を、定められた様式で（たとえば、部位特異的な変異誘発または相同組換え技術を用いて）、あるいはランダムな様式で（例えば、変異原を用い、そして、典型的には、もはやグルテンタンパク質（またはセリアック病を引き起こすグルテンタンパク質配列）を発現しない変異誘発された細胞を典型的には選択して）導入することが可能である。
アンタゴニストとして働くことが可能な配列を含んでなるタンパク質を発現する植物または植物細胞の場合、このような植物または植物細胞は、野生型グルテンタンパク質（例えば、セリアック病を引き起こすもの）を発現してもよい。好ましくは、アンタゴニストの存在を介して、配列は、植物または植物細胞由来のタンパク質を含んでなる食物を摂取する個体において、セリアック病症状の低下（無症状など）を引き起こすであろう。
植物細胞内に存在する（かまたは形質転換された）ポリヌクレオチドは、概して、植物細胞において変異グルテンタンパク質を発現可能なプロモーターを含んでなるであろう。所望の発現パターンに応じて、プロモーターは、構成的、組織もしくは時期特異的；及び／または誘導的であってもよい。例えば、植物における強い構成的発現を、CAMV 35S、Rubisco ssuまたはヒストンプロモーターを用いて得ることが可能である。同様に、組織特異的もしくは時期特異的プロモーターを、トランスジェニック植物における特定の組織に対して、またはその発生における特定の時期に対して本発明のタンパク質の発現を標的とするために用いてもよい。このように、例えば種子特異的、根特異的、葉特異的、花特異的等のプロモーターを、用いてもよい。種子特異的プロモーターには、Daltaら（Biotechnology Ann. Rev.（1997年）3, 269〜296頁）により記載されたものが含まれる。種子特異的プロモーターの具体例は、ナピンプロモーター（EP-A-0 255, 378）、ファセオリンプロモーター、グルテニンプロモーター、ヘリアンセニンプロモーター（WO92/17580）、アルブミンプロモーター（WO98/45460）、オレオシンプロモーター（WO98/45461）、ならびにＡＴＳ１及びＡＴＳ３プロモーター（WO99/20775）である。
細胞は、いかなる形態であってもよい。例えば、これは単離された細胞（例えば、プロ
トプラスト）であってもよく、またこれは植物組織の一部分（例えば、カルス、または植物から切除した組織）であってもよく、またはこれは全植物の一部分であってもよい。細胞は、任意のタイプ（例えば、任意のタイプの植物の一部分）であってもよい。例えば、カルス細胞などの未分化細胞；あるいは胚芽、花粉、根、芽または葉に見つけられるタイプの細胞などの分化細胞。植物の一部分には、根；芽；葉、ならびに、花粉、卵細胞、雄しべ、葯、花弁、萼片及び他の花の一部分などの生殖に関与する一部分が含まれる。
本発明は、植物細胞を本発明のポリヌクレオチドまたはベクターで形質転換してトランスジェニック植物細胞をもたらすことを含んでなる、トランスジェニック植物細胞を得る方法を、提供する。任意の適切な形質転換方法を用いてもよい（小麦の場合、Vasil Vら
、Biotechnology 10, 667-674（1992年）に開示される技術を用いてもよい）。好ましい
形質転換技術には、植物プロトプラストの電気穿孔、及び粒子衝突が含まれる。このように、形質転換は、一部の細胞がトランスジェニックで、かつ一部はそうでないキメラ組織もしくは植物を生じてもよい。
本発明の細胞、またはこのように得られた細胞を、当該技術分野において公知の技術によりトランスジェニック植物に再生してもよい。これらは、トランスジェニック細胞の増殖及び／または分裂を刺激するための、オーキシン、ジベレリン及び／またはサイトカイニンなどの植物成長物質の使用を、伴ってもよい。同様に、体細胞胚形成及び成長点培養などの技術を用いてもよい。再生技術は、当該技術分野において周知であり、そして例は、例えば、US 4,459,355、US 4,536,475、US 5,464,763、US 5,177,010、US 5,187,073、EP 267,159、EP 604,662、EP 672,752、US 4,945,050、US 5,036,006、US 5,100,792、US 5,371,014、US 5,478,744、US 5,179,022、US 5,565,346、US 5,484,956、US 5,508,468、US 5,538,877、US 5,554,798、US 5,489,520、US 5,510,318、US 5,204,253、US 5,405,765、EP 442,174、EP 486,233、EP 486,234、EP 539,563、EP 674,725、WO91/02071及びWO 95/06128に見つけられることが可能である。
多くのこのような技術において、１つ工程は、カルス、即ち、増殖している及び／または分裂している細胞を含む植物組織、の形成である。このようなカルスは、他のタイプの植物細胞培養物及び植物の一部分のように、本発明のさらなる側面である。このように、例えば、本発明は、胚芽、成長点、種子、芽、根、茎、葉及び花の一部分を含むトランスジェニック植物の組織及び一部分を提供する。これらは、これらの細胞の一部が本発明の細胞であって、かつ一部がそうでないという意味で、キメラであってもよい。本発明のトランスジェニック植物の一部分及び組織、植物ならびに種子は、本明細書に記述される植物種のいずれであってもよい。
再生の手順は、典型的には、マーカー遺伝子を用いた形質転換された細胞の選択を伴うであろう。
再生の工程は、第一世代トランスジェニック植物を生じる。本発明はまた、この第一世代植物からさらなる世代のトランスジェニック植物を得る方法も、提供する。これらは、後代トランスジェニック植物として公知である。第二、第三、第四、第五、第六及びさらなる世代の後代植物を、当該技術分野において公知の任意の手段により、第一世代トランスジェニック植物から得てもよい。
このように、本発明は、トランスジェニック後代植物を得る方法であって、本発明の第一世代トランスジェニック植物から第二世代トランスジェニック後代植物を得ることを含んでなり、そして所望により、このように得られた第二世代後代植物から１またはそれより多くのさらなる世代のトランスジェニック植物を得ることを含んでなる上記方法を、提供する。
後代植物を、任意の公知の技術により、より初期世代のその祖先から作り出してもよい。具体的には、後代植物を、（ａ） 前世代に属する本発明のトランスジェニック植物からトランスジェニック種子を得て、次いで、新しい世代に属する本発明のトランスジェニック後代植物を、トランスジェニック種子を成長させることによって得ること；及び／または、（ｂ） 前世代に属する本発明のトランスジェニック植物をクローン増殖させて、新しい世代に属する本発明のトランスジェニック後代植物を得ること；及び／または、（ｃ） 前世代に属する本発明の第一世代トランスジェニック植物を別の適合する植物と交配させて、新しい世代に属する本発明のトランスジェニック後代植物を得ること；及び所望により、（ｄ） このように得られた後代植物から、１またはそれより多くのさらなる世代のトランスジェニック後代植物を得ること：により、作り出してもよい。
これらの技術を、任意の組み合わせで用いてもよい。例えば、クローン増殖及び実生増殖を、栽培に適したトランスジェニック植物を生じる過程における異なる時点にて用いてもよい。具体的には、農学的に望ましい特徴を伴う植物分類群との反復戻し交配を、行ってもよい。細胞を植物から取り出し、そしてそこから新たな植物を再生させるさらなる工程もまた、行ってよい。
また、さらなる望ましい特徴を、細胞、植物組織、植物または種子を、上記過程における任意の適切な時期に形質転換して、本発明のポリヌクレオチド以外の所望のコード配列を導入することによって、導入してもよい。これは、本発明のポリヌクレオチドの導入に関して本明細書に記載される技術によって行われてもよい。
例えば、さらなる導入遺伝子を、例えば、グリホセート（例えば、ＥＰＳＰ合成酵素遺伝子（EP-A-0,293,358）またはグリホセート酸化還元酵素（WO 92/00377）遺伝子を用い
て）に耐性の；あるいは、ホサメチン；ジハロベンゾニトリル；グルホシネート（例えば、ホスフィノトリシンアセチル転移酵素（ＰＡＴ）またはグルタミン合成酵素遺伝子（EP-A-0,242,236を参照されたい）を用いて）；アスラム（例えば、ジヒドロプテロイン酸合成酵素遺伝子（EP-A-0,369,367）を用いて）；あるいは、スルホニル尿素（例えば、ＡＬＳ遺伝子を用いて）；アシフルオルフェンまたはオキシフルオルフェンなどのジフェニルエーテル（例えば、protoporphyrogen酸化酵素遺伝子を用いて）；オキサジアゾンなどのオキサジアゾール；クロロフタリムなどの環状イミド；ＴＮＰなどのフェニルピラゾール、またはそのフェノピレートもしくはカルバメートアナログ：に耐性の、他の除草剤耐性形質をコードするものから、選択してもよい。
同様に、除草剤耐性以外の有益な特性のための遺伝子を、導入してもよい。例えば、昆虫耐性のための遺伝子（とりわけ、Bacillus thuringiensis（Ｂｔ）毒素をコードする遺伝子）を導入してもよい。同様に、疾患耐性のための遺伝子を、例えばWO91/02701またはWO95/06128におけるように導入してもよい。
典型的には、本発明のタンパク質は、本発明の植物において発現している。用いられるプロモーターに応じて、この発現は、構成的であっても、または誘導的であってもよい。同様に、これは、組織特異的であっても、または時期特異的であってもよい（すなわち、（本明細書に記述される組織のいずれかなどの）特定の植物組織に向けられるか、または特定の植物の発生の時期に向けられてもよい）。
本発明はまた、本発明のトランスジェニック植物を収穫し、そして所望によりさらに加工することによって穀物を得る方法も、提供する。穀物とは、作物から得ることが可能な任意の有用な産物を意味する。
変異グルテンタンパク質、またはアンタゴニストとして働くことが可能な配列を含んで
なるタンパク質を含有する、産物
本発明は、変異グルテンタンパク質、またはアンタゴニストとして働くことが可能な配列を含んでなるタンパク質を含んでなる産物を、提供する。これは、典型的には、このようなタンパク質を発現する本明細書に記述される植物から得た植物の一部分に由来するか、またはそれを含んでなる。このような産物は、収穫することによって直接的に、または本発明の植物を収穫し、そしてさらに加工することによって間接的に、得ることが可能であってもよい。直接的に得ることが可能な産物には、穀粒が含まれる。あるいは、このような産物は、収穫し、そしてさらに加工することによって、間接的に得ることが可能であってもよい。さらに加工することにより得ることが可能な産物の例は、小麦粉、または蒸留アルコール性飲料；直接的に得たかまたはさらに加工した材料から作られる食品（例えば、小麦粉から作られるベイク製品（例えば、パン））である。典型的には、このような食品は、ヒト個体により、摂取可能かつ消化可能である（すなわち、非毒性で、かつ栄養価がある）。
アンタゴニスト配列を含んでなるタンパク質を含んでなる食品の場合、食品はまた、野生型グルテンタンパク質も含んでなってよいが、しかし好ましくは、このような食物を摂取した後に、アンタゴニストがセリアック病の低下を（例えば、完全に）引き起こすことが可能である。
アミド分解
本明細書に記載される配列に、Ｇｌｎ残基が含まれる場合、本発明はまた、Ｇｌｎ残基がＧｌｕ残基へとアミド分解されているその配列も提供する。配列あたり１またはそれより多く（例えば、１、２、３、４、５等）のＧｌｎ残基がアミド分解されてもよいが、しかし１より多くのＧｌｎ残基がある場合は、そのすべてがアミド分解されていなければならないというわけではない。好ましくは、アミド分解されるＧｌｎ残基は、トランスグルタミナーゼによるアミド分解に感受性のものである。
Ｇｌｎがアミド分解されてもよい例を、配列リスト中に示す。例えば、配列番号１の残基４はＧｌｎ残基またはＧｌｕ残基であることが可能であり、配列番号２の残基６はＧｌｎ残基またはＧｌｕ残基であることが可能であり、配列番号６の残基４及び７は、それぞれ独立してＧｌｎ残基またはＧｌｕ残基であることが可能である、等。アミド分解に感受性のＧｌｎ残基、及びアミド分解されたその対応するＧｌｕを、「Ｇｌｘ」残基と称する。
剤に１より多くのＧｌｘ残基が含まれる場合、これらは、任意の配置に配列されてもよい。例えば、Ｇｌｘ残基は、構成的な残基であってもよく、かつ／あるいは１またはそれより多く（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８等）の他の残基によって分離されてもよい。上記のように、ＨＬＡ−ＤＱ８エピトープに関して、剤は、好ましくは、別のＧｌｘ残基と７残基により分離されているＧｌｘ残基を含んでなる。
本発明の好ましい剤は、アミド分解された剤である。すなわち、剤は、Ｇｌｕの形態の１またはそれより多くのＧｌｘ残基を含んでなる。これを、例えば、生成中にＧｌｕ残基を含めることにより、またはＧｌｎ残基をアミド分解によってＧｌｕへ変換することによるなどの、種々の方法にて、成し遂げることが可能である。ＧｌｎのＧｌｕへの変換を、アミド分解に感受性のＧｌｎ残基を含有する剤を、アミド分解剤を用いて処理することによって、成し遂げることが可能である。１またはそれより多くのＧｌｎ残基を、好ましくは、例えば実施例に記載のように、トランスグルタミナーゼによりＧｌｕへとアミド分解する。
当業者は、剤中のどの特定のＧｌｕ残基がアミド分解に感受性であるか、したがってど
の残基がＧｌｎ残基のアミド分解から生じるＧｌｕ残基であるべきかを、判定することが可能であろう。例えば、トランスグルタミナーゼによるアミド分解に感受性のＧｌｎ含有配列は、一般には、モチーフ：例えば、QXPX、QXPF(Y)、QXX(FYMILVW)、QXPF、QXX(FY)、PQ(QL)P(FY)Pと一致する。例えば、配列PQ(QL)P(FY)Pは、下線を引いた２位のＱのトランスグルタミナーゼによるアミド分解を、促進する。
具体的には、配列番号１〜１９２７のアミド分解型を含んでなる剤が、好ましい（このような配列が、まだアミド分解されていない場合）。最も好ましくは、本発明の剤は、配列番号１〜１９２７のトランスグルタミナーゼによるアミド分解型を含んでなる（同じく、まだアミド分解されていない場合）。本明細書に定義されるように、これらの剤のアナログ及び同等物もまた、本発明の範囲内に包含される。
本発明を、以下の非限定的な実施例により、示す：
最初のグリアジンエピトープスクリーニングライブラリ
２９例のセリアック病を有するＨＬＡ−ＤＱ２＋個体を伴う、長期間のグルテンを含まない食事に関する最初の実験において、インターフェロン−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて、最初にペプチドのプールとして、次いで１５例の被験者においてｔＴＧによるアミド分解を伴うかまたは伴わない個々のペプチドとして、先のペプセット（WO 03/104273に記載され、該出願は参照によって本明細書に援用される）をスクリーニングした。このペプセットライブラリは、２００１年９月に発見された小麦グリアジンとして記載された、すべてのＧｅｎｂａｎｋ登録内に含有されるすべてのユニークな１２ｍｅｒにわたる、６５２個の２０ｍｅｒグリアジンペプチドからなる。このペプセットライブラリは、系統学的な分類に並べられた、ClustalWソフトウエア（MegAlign社）を用いて配列比較された遺伝子由来タンパク質配列から、「手作業で」設計された。
それぞれおよそ０．６マイクロモルの６５２個の２０ｍｅｒが、供された。二つの２０ｍｅｒマーカーペプチドを、９６個の各セットに含め（VLQQHNIAHGSSQVLQESTY−ペプチド161、及びIKDFHVYFRESRDALWKGPG）、そして逆相ＨＰＬＣ及びアミノ酸配列解析によって
特徴付けた。これらのマーカーペプチドの平均の純度は、それぞれ１９％及び５０％であった。ペプチドを、最初にアセトニトリル（１０％）及びヘペス１００ｍＭ中に、１０ｍｇ／ｍｌとなるよう溶解した。ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイのためにＰＢＭＣとインキュベートされた個々のペプチドの最終濃度は、２０ｍｃｇ／ｍｌであった。これらのペプチドを、モルモット組織ｔＴＧ（シグマＴ５３９８）と１００：３２ｍｃｇ／ｍｌの割合で３７℃にて２時間インキュベートすることによって、アミド分解した。ペプチド溶液を−２０℃に保管し、そして使用直前に解凍した。これらの試験を、オックスフォード、英国にて行った。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを、メルボルン、オーストラリアにて行われたもの（本明細書に記載されたすべての他の試験）に関して記載のように、行った。個々のペプチドに対する被験者の応答に関する「オックスフォード」のデータを、続いて行った「ＥＭアルゴリズム」（以下を参照されたい）における「最小限の」エピトープ解析に関する「メルボルン」のデータとともに、プールした。
二巡目のグリアジンエピトープスクリーニングライブラリ
二巡目のグリアジンエピトープライブラリを、６５２個の２０ｍｅｒの最初のグリアジンエピトープスクリーニングライブラリから同定された生物活性の配列にしたがって、設計した。すべての６５２個のアミド分解された２０ｍｅｒを用いて評価した、１５例のＨＬＡ−ＤＱ２＋被検者において最も強力なグリアジン２０ｍｅｒ（91：PQPFPPQLPYPQPQLPYPQP）の＞５％と同等の平均生物活性を伴うグリアジン２０ｍｅｒを、定義付けた。初期の試験（WO 03/104273を参照されたい）により、このペプセットのアミド分解されたプールが、アミド分解されていないものよりも強力であることが示されたことから、ｔＴＧによりアミド分解される可能性のある生物活性の２０ｍｅｒ内のグルタミン残基を、モチーフQXPX、QXZ (FYWILVM)（ここで、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸であり、そしてＰはプロリン、Ｚは任意のアミノ酸であり、そしてFYWILVMは疎水性アミノ酸を表す）（Vader W.ら、J Exp Med 2002 J. Exp. Med. 195:643-649、PCT WO 03/066079、及びFleckenstein B. 2002. J Biol Chem 277:34109-16により公表されたｔＴＧを介したアミド分解に関するモチーフと一致）にしたがって同定した。
次いで、１２ｍｅｒのペプチドを、各潜在的アミド分解部位が、ＨＬＡ−ＤＱ２結合溝内に位置する９ｍｅｒ中の４、６または７位のいずれにあることが可能であるか（これらの位置にあるＨＬＡ−ＤＱ２アンカーは、グルタミン酸が好ましいことを示す）を、同定した。次いで、候補の１２ｍｅｒのコアエピトープ配列を、親グリアジンポリペプチド中に存在するＮ末端残基に続くグリシンと、そしてＣ末端では、親グリアジンポリペプチド中に存在するＣ末端残基に続くグリシンと、隣接させた（すなわち、GXXXXXXXQXXXXXXG）。
９位がグルタミンまたはグルタミン酸のペプチドを、合成した。次いで、ペプチド（１００ｍｃｇ／ｍｌ）（ｔＴＧによる＋／−アミド分解）を、グルテン攻撃後の１５例のＨＬＡ−ＤＱ２＋セリアック志願者から得たＰＢＭＣを用いたインターフェロンγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、評価した。これらのアッセイの結果を、ＥＭアルゴリズム（以下を参照されたい）にしたがって解析した。加えて、最も強力な相異なるペプチドを、合成し、そして＞８０％に精製して（Mimotopes社）、そして、小麦グルテン攻撃後の１５例のＨＬＡ−ＤＱ２＋セリアック志願者から得たＰＢＭＣを用いたインターフェロンγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、評価した。
完全なグルテンエピトープスクリーニングライブラリ
すべての小麦グリアジン及びグルテニン、ライ麦、大麦及びオーツ麦グルテン様タンパク質（プロラミン）にわたる、実質的により大きなペプチドライブラリの設計をより実際的にし、かつ先のグリアジンペプチドライブラリのデータを確認するために、反復アルゴリズムを開発して、グルテンタンパク質中の（シグナルペプチド配列を除く）すべてのユニークな１２ｍｅｒを含む、２０ｍｅｒの最小セットの設計を、自動化した。ＳｃａｎＳｅｔアルゴリズムを、図１に示す。
該方法は、タンパク質群に由来するすべての可能なペプチドエピトープに対して、それらが様々な患者において潜在的な抗原であるかどうかを検査する。Ｔ細胞エピトープのサイズは、９〜１５ＡＡの範囲である。タンパク質セットにおけるすべての可能な１２ｍｅｒを検査することは、数が多いため、迅速な実行が不可能となる。
ここで、我々は、例えば、２０ｍｅｒペプチドが、９個までの異なる１２ｍｅｒを網羅することが可能であるとの事実を、用いる。したがって、我々は、タンパク質ファミリー中に表されるすべての可能な１２ｍｅｒを網羅する組み合わせアプローチを、開発した。
抗原として検査され、かつタンパク質群中に存在するすべての１２ｍｅｒのペプチド配列を網羅する、２０アミノ酸（２０ｍｅｒ）の長いペプチドを、作出する。我々は、作出すべきペプチドの長さをＬ（例えば、２０）として、そして我々が網羅したいエピトープの長さをＳとして、定義した。我々は、タンパク質セットからすべてのユニークに生じるＬｍｅｒを作出するコンピュータプログラムを、開発した。さらに、我々は、このタンパク質セットから、すべてのユニークに生じるＳｍｅｒを作出する。次に、我々は、Ｌｍｅｒのすべての配列を含有するＮ個のＬｍｅｒのセットを選択する。図１は、どのようにこのアルゴリズムが働くかを概説する。
２００３年６月１６日に、Ｇｅｎｂａｎｋは、５３個のα／β、５３個のγ及び２個のωグリアジン、ならびにT. aestivum由来の７７個のＬＭＷ及び５５個のＨＭＷ、５９個
のホルデイン、１４個のセカリンならびに２０個のアベニンの受入番号を、含有した（図２を参照されたい）。合計して、ＳｃａｎＳｅｔは、２２５個のグルテン遺伝子産物中に含有される１８１１７個のユニークな１２ｍｅｒを同定した。
すべてのユニークなグルテンの１２ｍｅｒを、２９２２個の２０ｍｅｒに含めることが可能である。これらの２０ｍｅｒを、ペプセットペプチドライブラリ（Mimotopes Inc.、メルボルン、オーストラリア）において合成した。ペプセットペプチドは、９６個のバッチで合成された（Mimotopes Inc.、メルボルン、オーストラリア）。それぞれおよそ０．７〜１．３マイクロモルの２９２２個の２０ｍｅｒが、供された。２個の２０ｍｅｒマーカーペプチドが、９６個の各セット（各特定のプレート上の９４個の他のペプチドに由来する一つの代表的なペプチド、及びIKDFHVYFRESRDALWKGPG）に含まれ、そして逆相ＨＰＬＣ及び質量分析により特徴付けられた。これらのマーカーペプチドの平均の純度は、それぞれ３６％（範囲：５〜６８％）及び６４％（範囲：５５〜７１％）であった。
ペプチドを、最初に水溶性アセトニトリル中に溶解した（５０％）。水溶性アセトニトリルに溶解したペプチドを、無菌９６ウェルプレートに移し、そして１ｍＭカルシウムを伴う無菌ＰＢＳ（２５０ｍｃｇ／ｍｌ）中に希釈し、次いでｔＴＧ（２５ｍｃｇ／ｍｌ）（Sigma T5398）とともに３７℃にて６時間インキュベートし、次いで使用するまで凍結
保管（−２０℃）した。
被験者は全員、生検によりセリアック病であることが証明されており、そして続いて厳密にグルテンを含まない食事を少なくとも６ヶ月間与えた。すべての被験者は、ＨＬＡ−ＤＱＢ０１＊０２（ＨＬＡ−ＤＱ２）のみ（ｎ＝１００）、またはＨＬＡ−ＤＱＡ１＊０３及びＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０２（ＨＬＡ−ＤＱ８）のみ（ｎ＝５）を有した。全症例において、ｔＴＧ−ＩｇＡを、グルテン攻撃前に評価し、そしてこれは正常範囲にあった（最初の志願者の３０％で、ｔＴＧ−ＩｇＡが上昇していることが見つかり、そして、慢性的なグルテン攻撃は、末梢血グルテン特異的Ｔ細胞を短期間のグルテン攻撃により誘導しないことを伴うため、除外した）。志願者は、Ｂａｋｅｒ'ｓ Ｄｅｌｉｇｈｔ社の「white bread block loaf」（毎日２００ｇを３日間）またはUncle Toby社のオーツ麦（毎日１００ｇを３日間）を消費した。３例を除くすべての被験者は、３日間の攻撃を完了した（１例は最初の一口のパンの後に除外され、そして他の２例は最初の二切れのパンの後に嘔吐した。後者２例のデータは、これに続く解析に含めた）。血液（３００ｍｌ）を、グルテン攻撃開始後６日に採取した。グルテンペプチド特異的ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔ応答は、我々の前の試験では見られず、したがって「攻撃前」血液を、この実験セットにおいて評価しなかった（Anderson, RPら、2000年、Nat. Med. 6:337-342.、WO 01/25793、WO 03/104273）。
ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ（Mabtech社、スウェーデン）を、９６ウェルプレ
ート（MAIP S-45、ミリポア社）にて行い、ここで各ウェルは、２５ｍｃｌのペプチド溶
液及び１００ｍｃｌのＰＢＭＣ（２〜８ｘ１０５／ウェル）を、１０％熱不活化ヒトＡＢ血清含有ＲＰＭＩ中に含有した。発色及び乾燥後に、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔプレートを、ＭＡＩＰ自動化ＥＬＩＳｐｏｔプレート計数器を用いて評価した。次いで、データを、新規のアルゴリズム（期待値最大化：ＥＭ）にしたがって解析して、ペプチドライブラリ内に含有される９ｍｅｒの配列に対するインターフェロンγ応答を定義及び定量した（図３及び以下を参照されたい）。次いで、９ｍｅｒのペプチドを、Ｔ細胞認識における重複性を仮定するアルゴリズムである「Iterative Cluster」アルゴリズム（図４及び以下を参照されたい）にしたがって、９ｍｅｒ中の任意の一つの位置に類似した化学的特性を有するアミノ酸群を配分することにより、あるいは、任意の位置のグルタミンをグルタミン酸（アミド分解が起こりうると仮定）に置き換えることにより、合理化した。
ＨＬＡ−ＤＱ２＋ではない２例のみのＨＬＡ−ＤＱ８＋個体から得たデータセットがあって、かつこれらが「完全なグルテンエピトープスクリーニングライブラリ」由来の７２１個の小麦グリアジンの２０ｍｅｒのみを利用していたことから、生物活性のペプチドを、２例の被験者におけるペプチド特異的ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ応答の平均の順位を取ることにより、同定した。ＨＬＡ−ＤＱ８拘束性グリアジンエピトープらしきものを予測するため、ｔＴＧを介したアミド分解に感受性のグルタミン残基が、エピトープの潜在的な９ｍｅｒのコア領域内の１〜９位のいずれかを占めると仮定した（ＨＬＡ−ＤＱ８結合モチーフ、及びvan de Walら（van de Wal, Y.ら、1998年、J. Immunol. 161(4):1585-1588）の発見と一致）。
ＥＬＩＳｐｏｔのデータを解析するための期待値最大化（ＥＭ）アルゴリズム
図３は、ＥＬＩＳｐｏｔを用いたアッセイから得られたデータを解析するためのアルゴリズムを示す。異なるペプチドに対するＴ細胞応答を、Ｔ細胞アッセイを用いて、９６ウェルプレートにて測定する。アッセイを、多くの異なるペプチド抗原を用いて行う。Ｔ細胞アッセイの結果を、表（横列がペプチドを表し、そして縦列が患者を表し、そして個々の測定値（計数値）が表中にある）中に要約することが可能である（例えば、図３Ｂを参照されたい）。ＥＭアルゴリズムの目的は、ペプチドに対する患者の応答と非応答とを区別し、そして応答の平均速度、及び各ペプチドに対して応答するヒトの比率を見積もることである。
応答を、多くの異なる患者（ｉを、患者を示すために用いることにする）及び多くの異なるペプチド（ｊを、ペプチドを示すために用いることにする）に関して測定する。各測定値（ｙｉｊ）は、ペプチドｊに応答する患者ｉのＴ細胞計数値を表す。患者における特定のペプチドに対する測定値を応答と呼ぶことが可能かどうか、あるいはこれがバックグラウンド分布からもたらされる可能性がより高いかどうかを見積もるために、我々は、ｙｉｊが観察されたスポットの計数値であり、かつｚｉｊが、ヒトがペプチドｊに応答するかどうかの観察されない指標である、不完全なデータ問題に対するモデルを、提唱する。
計数値の観察された数であるｙｉｊは、独立なポアソン分布から得られるようにモデル化される：患者ｉがペプチドｊに応答している場合（すなわち、ｚｉｊ＝１）は、ポアソン（αｉ、λｊ）、そして患者ｉがペプチドｊに応答していない場合（すなわち、ｚｉｊ＝０）は、ポアソン（αｉ、λ０）。
・完全なデータ：ｙｉｊ（観察された計数値）、ｚｉｊ（観察されない、応答の指標）。・パラメータ：θ＝（αｉ、λｊ、λ０、ｐｊ）
・αｉ：患者の全体的な応答性。
・λｊ：ペプチドにより誘導される応答速度。
・λ０：応答のバックグラウンド速度。
・ｐｊ：ペプチドｊに応答するヒトの比率。
ＥＭアルゴリズム：
・最初に、ランダムな値に対する変数を設定する。
・Ｅ工程：尤度をコンピュータ計算する。
・Ｍ工程：尤度関数を最大化する。
・Ｅ工程とＭ工程を繰り返す。
応答性エピトープの最小セットを見つけるための反復手順
ＥＭアルゴリズムにおいて見積もられるＴ細胞応答に基づいたワクチンにおける使用のために、ペプチドの最小セットをコンピュータ計算するためのプログラムを開発した。我々は、タンパク質群から得たＬｍｅｒに対するＴ細胞応答を、測定した。ペプチドは、す
べての可能なＳｍｅｒを網羅するよう作出された。我々は、該応答に対する以下のパラメータを、ＥＭアルゴリズムにより見積もった：応答速度、応答するヒトの数、応答するヒトの比率。応答するヒトの比率と見積もられる応答速度とを掛け合わせたものを、優れた抗原であるエピトープを定義付けるための判定基準として用いる。測定されたＬｍｅｒの多くは、同じＳｍｅｒのエピトープを含有する。Ｌｍｅｒにおけるすべての応答を説明可能なエピトープ（Ｓｍｅｒ）を見つけるため、我々は、平均して最も高度に応答するＬｍｅｒ内に含有されるＳｍｅｒを選択する。次に、我々は、残ったＬｍｅｒにおいて最も高度な応答を伴うＳｍｅｒを選択する。我々は、特定のカットオフよりも高度に応答するＳｍｅｒが存在しなくなるまで、この手順を反復する。我々は、異なるカットオフによる数回の反復を用いる。この過程を、図４に略図で示す。一群のＬｍｅｒのこのような定義付けられたリストを、至適なエピトープを定義付け、そして優れた抗原として機能するペプチドを選択するための基礎として用いることが可能である。
小麦グルテンにおけるＨＬＡ−ＤＱ２エピトープ
小麦グリアジン及びグルテニンにおけるＨＬＡ−ＤＱ２エピトープを、合計７６例のＨＬＡ−ＤＱ２＋個体におけるグルテン攻撃開始後第６日に採取されたＰＢＭＣを用いて、γ−インターフェロンＥＬＩＳＰＯＴアッセイにて同定した（最初のグリアジンエピトープライブラリ：ｎ＝１５、二巡目のグリアジンエピトープスクリーニングライブラリ：ｎ＝１５、完全なグルテンエピトープスクリーニングライブラリ：ｎ＝４６）。セリアック被験者における個々のペプチド応答に関連するすべてのデータをプールし、そしてＥＭアルゴリズムにより解析した。
一連の９ｍｅｒを、同定し、そしてγ−インターフェロン応答の強度及び応答する個体の比率にしたがって順序付けた（図５を参照されたい）。同定された配列の多くは、類似する化学的特性を伴ういくつかの異なるアミノ酸が、推定エピトープ内の任意の一位置に存在することが可能な「スーパーファミリー」に分類されることが可能であった（図６を参照されたい）。例えば、図６の「配列１」（配列番号１５５５）P(QR)P(QE)LP(FY)PQにおいて、グルタミン（Ｑ）またはアルギニン（Ｒ）は、Ｑが実質的により生物活性のエピトープを作り出すことを除けば、双方とも、２位において許容される。
ＥＭアルゴリズムにより同定された１１０個の最も「活性の」９ｍｅｒ配列を再検討することにより、９ｍｅｒモチーフの「リスト」を、４１個の９ｍｅｒへ要約することが可能であって、その多くは、重複していた（例えば、「配列１」と「配列２」（それぞれ、配列番号１５５５及び１５５８）は、７残基が重複し、かつＡ−グリアジン５７−７３ ＱＥ６５内に双方とも存在する）。選択された場合において、ハイグレードペプチドを合成し、そしてＥＭアルゴリズムにより同定されたペプチドの生物活性を確認した（図７を参照されたい）。
オーツ麦アベニンにおけるＨＬＡ−ＤＱ２エピトープ
アベニンペプチドを、ＨＬＡ−ＤＱ２＋セリアック被験者においてオーツ麦で攻撃後（ｎ＝３０例の被験者）または小麦パンで攻撃後（ｎ＝８）に、評価した。ＥＬＩＳＰＯＴ応答が、図８に見つけられるペプチドに対して見いだされた。反応性アベニンペプチドの一つは、小麦グルテンにおける配列（配列番号１５９０）と相同であった。
オーツ麦（アベニン）の高品質ペプチド試験
ハイグレードアベニンペプチドを、小麦を含まない純粋なオーツ麦１００ｇ／日３日間のオーツ麦攻撃完了後３日に、評価した（「第６日」にＰＢＭＣインターフェロンγ ＥＬＩＳＰＯＴ応答）。これらのペプチドを、スクリーニンググレードの（「一巡目の」）アベニンペプチドライブラリを用いて先に定義付けたペプチド、及び潜在的なアミド分解部位に基づいて、設計した。ＨＰＬＣにより＞８０％の純度と確認され、そして配列を質
量分析により確認された、２５個の（１６ｍｅｒとしての）ペプチドがあった。
ｔＴＧによるアミド分解後のハイグレードアベニンペプチドに対するインターフェロンγ ＥＬＩＳＰＯＴ応答を、ＤＱ２＋セリアック病を有する１８例の被験者において比較した。
オーツ麦攻撃後のドミナント（＞７０％最大応答）ペプチドには：EQQFGQNIFSGFSVQL
（配列番号１７６４）（１１／１８例の被験者）、QLRCPAIHSVVQAIIL（配列番号１７６５）（４／１８例の被験者）、及びQYQPYPEQEQPILQQQ（配列番号１７６６）（３／１８例の被験者）が含まれた。２／１８例の被験者はアベニン特異的な応答（ＳＦＵ（スポット形成単位）＞３Ｘブランクにより定義される）をせず、そして６／１８例の被験者の平均最大ＳＦＵは１０未満であった。二つのさらなるペプチドが、陽性応答を誘発した：QIPEQLRCPAIHSVVQ（配列番号１７６７）（３／１８例の被験者）、及びEQYQPEQQPFMQPL（配列番号１７６８）（５／１８例の被験者において、＞４０％最大ペプチド応答）。２５個のペプチドのパネルには、Arentz-Hansen, PLoS Medicine（２００４年１０月、第１巻、第１号（84-92））において報告されたペプチド１４９０（SEQYQPYPEQQEPFVQ）に類似するい
くつかのペプチドが含まれたが、しかしながら、そのペプチドは、１例のみの被験者で強い陽性応答を、そして５例の被験者でははるかに弱い応答を誘導した。
ハイグレードアベニンペプチドに対するインターフェロンγ ＥＬＩＳＰＯＴ応答は、グルテン攻撃前にはなく、そして抗ＨＬＡ ＤＱ抗体を用いたＰＢＭＣの前処理によってブロックされたが、しかし抗ＨＬＡ ＤＲ抗体を用いた場合にはブロックされなかった。
ライ麦及び大麦スクリーニングペプチドライブラリ
セカリン及びホルデインの２０ｍｅｒの一巡目のペプチドライブラリを、ライ麦（パン、１００ｇ／日を３日間）または大麦（茹でたもの、１００ｇ／日を３日間）攻撃完了後３日に、評価した（「第６日」にＰＢＭＣインターフェロンγ ＥＬＩＳＰＯＴ応答）。エピトープを定義付けるための二巡目及び三巡目のペプチドライブラリを用いた反復解析をまだ行っていないにもかかわらず、「強力な」応答を誘導することが見いだされた、ｔＴＧで前処理された２０ｍｅｒは、小麦攻撃後に同定された生物活性のペプチドと実質的な構造的類似性を共有した。しかしながら、ライ麦または大麦攻撃後のドミナントペプチド配列には、小麦攻撃後にドミナントなことが見いだされたPQPQLPY配列を伴うペプチドは含まれなかった。ライ麦攻撃後のドミナント（＞７０％最大ペプチド応答）の２０ｍｅｒは、通常はPQQLFPLPQQPFPQPQQPFP（配列番号１７６９）（８／１４例の被験者）、あるいは、時としてQPFPQPQQPTPIQPQQPFPQ（配列番号１７７０）（４／１４例）、QQPQQLFPQTQQSSPQQPQQ（配列番号１７７１）（１／１４例）、PQTQQPQQPFPQPQQPQQLF（配列番号１７７２）（１／１４例）及び／またはQEQREGVQILLPQSHQQLVG（配列番号１７７３）（１／１４例）であった。少なくとも１例の被験者において４０％を超える最大応答を示したさらなるペプチドには、以下が含まれる：
FPQQPQQPFPQPQQQLPLQP（配列番号：1774）（3/14例、2 > 70％）
PQQPFPQQPEQIIPQQPQQP（配列番号：1775）（5/14例、3 > 70％）
QQLPLQPQQPFPQPQQPIPQ（配列番号：1776）（6/14例、2 > 70％）
QQPQQPFPLQPQQPVPQQPQ（配列番号：1777）（3/14例、1 > 70％）
SIPQPQQPFPQPQQPFPQSQ（配列番号：1778）（4/14例、1 > 70％）
QTQQSIPQPQQPFPQPQQPF（配列番号：1779）（3/14例、1 > 70％）
NMQVGPSGQVEWPQQQPLPQ（配列番号：1780）（2/14例、1 > 70％）
VGPSGQVSWPQQQPLPQPQQ（配列番号：1781）（2/14例、2 > 70％）
QQPFLLQPQQPFSQPQQPFL（配列番号：1782）（1/14例、1 > 70％）
FPLQPQQPFPQQPEQIISQQ（配列番号：1783）（5/14例、1 > 70％）
PQQPQRPFAQQPEQIISQQP（配列番号：1784）（3/14例、1 > 70％）
SPQQPQLPFPQPQQPFVVVV（配列番号：1785）（4/14例、1 > 70％）
QQPSIQLSLQQQLNPCKNVL（配列番号：1786）（1/14例、1 > 70％）。
典型的には、大麦攻撃後のドミナントペプチドは、６個のペプチドモチーフのうちの１個を含んだか、あるいは大麦攻撃後に１７例の被験者中１例のみにおいて「ドミナント」であった、８個の他の個々の２０ｍｅｒうちの１個であった。同定された６個のモチーフ：
QQPIPQQPQPY（配列番号1787）
PFPQPQQPFPW（配列番号1788）
LQPQQPFPQ（配列番号1789）
PQPQQASPL（配列番号1790）
IIPQQPQQPF（配列番号1791）
YPEQPQQPF（配列番号1792）。
少なくとも１例の被験者において少なくとも４０％の最大ペプチド応答を示す大麦ホルデインペプチドには、以下が含まれる（ここで、アステリスクは１例の個体において最大応答を示した８個の個々のペプチドを示す）。
QQQPFPQQPIPQQPQPYPQQ（配列番号1793）（8/17例、2 > 70%）
QQPQPFSQQPIPQQPQPYPQ（配列番号1794）（9/17例、8 > 70%）
PQQPVPQQPQPYPQQPQPFP（配列番号1795）（5/17例、1 > 70%）
PQPFPQQPIPQQPQPYPQQP（配列番号1796）（6/17例、2 > 70%）
YPQQPQPFPQQPIPQQPQPY（配列番号1797）（6/17例、2 > 70%）
QPQPYPQQPQPYPQQPFQPQ（配列番号1798）（7/17例、2 > 70%）
QPQQPQPFPQQPVPQQPQPY（配列番号1799）（5/17例、2 > 70%）
PQPYPQQPQPFPQQPPFCQQ（配列番号1800）（1/17例、1 > 70%）*
QPFPQPQQPFPWQPQQPFPQ（配列番号1801）（10/17例、2 > 70%）
PFPQQPQQPFPQPQQPFRQQ（配列番号1802）（6/17例、3 > 70%）
WQPQQPFPQPQQPFPLQPQQ（配列番号1803）（9/17例、5 > 70%）*
PWQPQQPFPQPQEPIPQQPQ（配列番号1804）（1/17例、1 > 70%）
QQPFPQPQQPIPYQPQQPFN（配列番号1805）（5/17例、1 > 70%）
PQQPQQPFPQPQQPFSWQPQ（配列番号1806）（6/17例、2 > 70%）*
QPQQPFPQPQQPIPYQPQQP（配列番号1807）（4/17例、1 > 70%）*
QSQQQFPQPQQPFPQQPQQP（配列番号1808）（1/17例、0 > 70%）
PFPQPQQPFSWQPQQPFLQP（配列番号1809）（1/17例、0 > 70%）
FPQPQEPFPQQPQQPFPLQP（配列番号1810）（1/17例、0 > 70%）
PFPQPQQPFPWQPQQPFPQP（配列番号1811）（6/17例、0 > 70%）
FPQYQIPTPLQPQQPFPQQP（配列番号1812）（2/17例、1 > 70%）
FPLQPQQPFPQQPQQPFPQQ（配列番号1813）（1/17例、0 > 70%）
QQPFPLQPQQPFPQPQPFPQ（配列番号1814）（1/17例、0 > 70%）
SPLQPQQPFPQGSEQIIPQQ（配列番号1815）（1/17例、0 > 70%）
PQQASPLQPQPQQASPLQPQ（配列番号1816）（1/17例、1 > 70%）
PQQPPFWPQQPFPQQPPFGL（配列番号1817）（1/17例、1 > 70%）*
PVLSQQQPCTQDQTPLLQEQ（配列番号1818）（1/17例、1 > 70%）
RQLPKYIIPQQPQQPFLLQP（配列番号1819）（1/17例、1 > 70%）
QGSEQIIPQQPQQPFPLQPH（配列番号1820）（7/17例、3 > 70%）*
PQGSEQIIPQQPFPLQPQPF（配列番号1821）（2/17例、1 > 70%）
QPFPTPQQFFPYLPQQTFPP（配列番号1822）（4/17例、1 > 70%）
PFPQPPQQKYPEQPQQPFPW（配列番号1823）（1/17例、1 > 70%）
QKYPEQPQQPFPWQQPTIQL（配列番号1824）（1/17例、1 > 70%）
FQQPQQSYPVQPQQPFPQPQ（配列番号1825）（3/17例、1 > 70%）
QIPYVHPSILQQLNPCKVFL（配列番号1826）（1/17例、1 > 70%）
LAAQLPAMCRLEGGGGLLAS（配列番号1827）（1/17例、1 > 70%）
PYLPEELSPQYQIPTPLQPQ（配列番号1828）（1/17例、1 > 70%）*
VSPHPGQQTTVSPHQGQQTT（配列番号1829）（1/17例、1 > 70%）*
二巡目及び三巡目の小麦グルテニン及びグリアジンペプチドライブラリ
二巡目の小麦グリアジン及びグルテニンライブラリを、任意の被験者において最も活性のトランスグルタミナーゼ（ｔＴＧ）前処理（酵素によりアミド分解）２０ｍｅｒペプチドにより刺激された応答（インターフェロンγ ＥＬＩＳＰＯＴ）の少なくとも５％を誘導した２０ｍｅｒの小麦グリアジン及びグルテニンペプチドの配列に基づいて、設計した。すべての二巡目の１６ｍｅｒペプチドを、少なくとも１８例の被験者において評価した。「オックスフォード」のグリアジン２０ｍｅｒライブラリから作出された二巡目のライブラリを、１０例の被験者において評価した−このデータを、新たな二巡目の（拡大された）グリアジン／グルテニンライブラリを評価するために用いられた、１８例の被験者から作出されたデータと、合わせた。したがって、トランスグルタミナーゼで前処理された個々の１６ｍｅｒペプチドを、１８例（「メルボルン」の２０ｍｅｒライブラリに基づいた、新規のグリアジン／グルテニン配列）または２８例（「オックスフォード」の２０ｍｅｒライブラリに基づいた、グリアジン配列）の被験者のいずれかにおいて評価した。
二巡目のペプチドライブラリのデータを、個々の被験者におけるインターフェロンγ ＥＬＩＳＰＯＴにおけるペプチド応答（すなわち、ペプチドにより誘導される個体の最大応答に対して正規化された、特異的ペプチドに対する個体のＰＢＭＣのパーセント応答）の「ドミナンス」にしたがって、解析した。少なくとも１例の被験者で最大のペプチド特異的応答の少なくとも４０％を刺激したペプチドの配列を、以下の表１に示す。該データセットは、上述の期待値最大化（ＥＭ）アルゴリズムを用いた一巡目の２０ｍｅｒペプチドライブラリを用いて同定された配列に一致するペプチドの整合性及び「ドミナンス」を、サポートする。
Figure 2019089770
Figure 2019089770
三巡目のペプチドライブラリは、任意の被験者において任意のペプチドに対する最大応答の少なくとも１０％を誘導することが見いだされた、二巡目のライブラリ中の構造的に相異なる配列に基づいた７４個のペプチドからなった。これらのペプチドは、二巡目のライブラリにおいて用いられたものとほぼ同一の野生型（アミド分解されていない）配列と一致した。このライブラリの相異なる特色は、それが、ＨＰＬＣにより＞８０％の純度と確認され、そして質量分析により配列を確認されたペプチドからなることであった。
ｔＴＧによるアミド分解後の三巡目のライブラリペプチドに対するインターフェロンγ
ＥＬＩＳＰＯＴ応答を、１４例の被験者において比較した。この場合も、PQPQLPYモチ
ーフを含む配列は、９／１４例の被験者において「ドミナント」であった。しかしながら、PFPQPQQPFPW（配列番号１８９５）は１／１４例、PFPQQPQQPFPQ（配列番号１８９６）
は１／１４例、PQPFLPQLPYPQP（配列番号１８９７）は１／１４例、QPFPQPQQPQQP（配列
番号１８９８）は４／１４例（PQPQLPYペプチドが強力なエピトープではなかった３例の
被験者を含む）、SGQGVSQSQQQSQQQ（配列番号１８９９）は２／１４例（PQPQLPYが強力ではなかった１例を含む）の被験者において、QYEVIRSLVLRTLPNM（配列番号１９００）及びGLARSQMLQQSICHVG（配列番号１９０１）それぞれは、PQPQLPYが強力なエピトープでない
１例の（同じ）被験者において、RTTTSVPFGVGTGVGA（配列番号１９０２）は１／１４例の被験者において、そしてAIHTVIHSIIMQQEQQ（配列番号１９０３）は１／１４例の被験者において、最大応答の＞７０％を刺激した。
三巡目において検査された配列の多くは構造的に関連し、そして個々の被験者の応答は、特定の配列の「関連性」にしたがってあるかまたはなく、ｉｎ ｖｉｖｏグルテン攻撃により誘導されるグルテン特異的Ｔ細胞によって認識されるペプチドの重複性が示唆された。
三巡目のペプチドに対するインターフェロンγ ＥＬＩＳＰＯＴ応答は、グルテン攻撃前にはなく、そして抗ＨＬＡ ＤＱ抗体を用いたＰＢＭＣの前処理によってブロックされ
たが、しかし抗ＨＬＡ ＤＲ抗体を用いた場合にはブロックされなかった。
コンビトープ
エピトープの重複性の課題、ならびに「ユニークな」ドミナントエピトープを組み合わせるよう設計されたペプチドの、診断学及び治療学における潜在的な利用に、小麦（ｎ＝１６のＨＬＡ ＤＱ２セリアック病被験者）、ライ麦（ｎ＝１７）または大麦（ｎ＝１３）攻撃後の、配列：QLQPFPQPELPYPQPQL（配列番号１９０４）（「P04724E」）、QPEQPFPQPEQPFPWQP（配列番号１９０５）（「626fEE」）及びQLQPFPQPELPYPQPFPQQPEQPFPQPEQPFPWQP（配列番号１９０６）（「コンビトープ」）に対するインターフェロンγ ＥＬＩＳＰＯＴ応答を比較することによって、取り組んだ。ライ麦及び大麦攻撃後に、P04724E及び626fEEに対するＥＬＩＳＰＯＴ応答（スポット形成単位）のメディアンの合計は、同様な
（至適）濃度のコンビトープに対する応答とほぼ同一であった（それぞれ、９９％及び１０２％）。しかしながら、小麦攻撃後に（ｎ＝１６の被験者）、P04724Eへの応答のメディアンは、コンビトープに対するものの８９％であり、そして626fEEへの応答のメディアンは、コンビトープに対する応答の７０％であった。これらの発見は、小麦攻撃後の（しかし、ライ麦または大麦攻撃後でない）、これらの関連するエピトープ配列であるP04724Eと626fEEの実質的な重複性と一致することになり、そしてより長いペプチド内のその組み合わされたドミナントエピトープ配列は、その生物学的利用性を低下させない。したがって、選択された強力なエピトープに由来するコンビトープは、Ｔ細胞エピトープに基づいたセリアック病の治療学及び診断学のための効率的な送達装置であってもよい。
ＨＬＡ−ＤＱ８＋セリアック病に関連する小麦グルテン中のエピトープ
小麦グリアジン中のエピトープを、２例（１例はＨＬＡ−ＤＱ８ホモ接合型、及び１例はＨＬＡ−ＤＱ８へテロ接合型）の個体におけるグルテン攻撃後のＰＢＭＣを用いて、同定した。他のＨＬＡ−ＤＱ８（ＤＱ２でない）セリアック個体において誘導されたＴ細胞応答は、グルテン攻撃に対して弱く応答し、そしてそのデータで詳細な解析を行うことができなかった。
コア配列：QGSFQPSQQ（配列番号１９０７）を含むアミド分解された２０ｍｅｒは、公
知のＨＬＡ−ＤＱ８拘束性α−グリアジンエピトープ（至適な活性のために、Ｑ１及びＱ９がｔＴＧによってアミド分解されている）に一致し、中等度に強いペプチド応答を誘導した。しかしながら、一連の「コア」ペプチドは、γ及びωグリアジン由来の２０ｍｅｒにおけるより強力な応答と関連した（図９を参照されたい）。最も強力なペプチドは、（QGSFQPSQQ（配列番号１９０７）に見つけられるように）同様にアミド分解に対して感受性の第二のグルタミンと７残基により分離されているグルタミンを、アミド分解に対する感受性を示唆するであろう配列中に有し、これらのアミド分解された配列が、ｔＴＧによるアミド分解後にＨＬＡ−ＤＱ８に対して高親和性のバインダーとなることが、示唆された。（ＨＬＡ−ＤＱ８に対する結合モチーフは、１及び９位がグルタミン酸であることが好ましい。）２０ｍｅｒのさらなる群は、アミド分解に感受性であるが、ただしｔＴＧを介するアミド分解に感受性の第二のグルタミンと７残基により分離されていないグルタミン残基を、有した。
ＨＬＡ−ＤＱ８セリアック病グリアジン及びグルテニンエピトープ
ＨＬＡ ＤＱ２及びＨＬＡ ＤＱ８アリルを有するセリアック病の５例の被験者に、小麦グルテン攻撃を行った。最初に攻撃された２例の被験者から得たＰＢＭＣを用いて、一巡目の「メルボルン」の小麦グリアジン２０ｍｅｒライブラリをスクリーニングした。これらの２例のＨＬＡ ＤＱ８ ＣＤ被験者から得たＰＢＭＣを用いて同定された２０ｍｅｒ配列を、２例の元の被験者を含む５例のＨＬＡ ＤＱ８＋ ＤＱ２− ＣＤ被験者において、一巡目のライブラリ中の反応性の２０ｍｅｒに基づいた二巡目のライブラリをスクリーニングすることにより、さらに精査した。二巡目のライブラリは、スクリーニンググ
レードの重複１６ｍｅｒ、ならびに、１及び／または９位にグルタミンのアミド分解（ＨＬＡ−ＤＱ８ペプチド結合モチーフと一致）の可能性を伴うエピトープのｔＴＧを介したアミド分解産物と一致することが予測される１３ｍｅｒからなる。加えて、「メルボルン」小麦グルテンライブラリ中の１４００個のグルテニン（ＨＭＷ及びＬＭＷ）のｔＴＧにより前処理された２０ｍｅｒも、これら５例の被験者においてスクリーニングした。
最も強力かつ一貫してドミナントのグリアジン１６ｍｅｒは、関連する配列VYIPPYCTIAPFGIFG（配列番号１９０８）（３／５例の被験者で、最大のグリアジン１６ｍｅｒに対して＞７０％の応答）、及び同様に３／５例の被験者においてドミナントのAMCNVYIPPYCAMAPF（配列番号１９０８）であった（４／５例の被験者で、これらのペプチドの一方または双方に対するドミナントな応答が得られた）。加えて、ＥＬＩＳＰＯＴにおけるその応答が増強されているか、またはアミド分解されている特異的なグルタミンに許容的である、先に同定された生物活性の２０ｍｅｒ由来の一連のペプチドを、同定した：(QE)QPTPIQP(QE)（配列番号１９０９）、(QE)QPFPLQP(QE)（配列番号１９１０）、(QE)QPIPVQP(QE)（配列番号１９１１）、(QE)QPQQPFP(QE)（配列番号１９１２）、(QE)QP(QE)LPFP(QE)（配列番号１９１３）、(QE)GSFQPSQ(QE)（配列番号１９１４) （先に公表されたＨＬＡ ＤＱ８エピトープ、van der Wal、1998年）、(QE)LPFP(QE)QP(QE)（配列番号１９１５）、及び(QE)QPFP(QE)QP(QE)（配列番号１９１６）。
グルテニン２０ｍｅｒライブラリのスクリーニングは、少なくとも５例中１例の被験者においてドミナントのさらなる一連の配列を、同定した。ドミナントの２０ｍｅｒペプチドは、モチーフを共有するか、あるいは配列：PQQQQQQLVQQQ（配列番号１９１７）、QGIFLQPH(LQ)I(AS)QLEV（配列番号１９１８）、QPGQGQQG(HY)Y（配列番号１９１９）、QSRYEAIRAII(FY)S（配列番号１９２０）、RTTTSVPFD（配列番号１９２１）、QPPFWRQQP（配列番号１９２２）、Q(PS)(PS)(FI)(PS)QQQQ（配列番号１９２３）、(QPLR)GYYPTSPQ（配列番号１９２４) （先に同定されたＨＬＡ ＤＱ８エピトープ、van der Wal、2001年）、QGSYYPGQASPQ（配列番号１９２５）、GYYPTSSLQPEQGQQGYYPT（配列番号１９２６）及び、QGQQLAQGQQGQQPAQVQQG（配列番号１９２７)を有した。グルテニンペプチドを、トランスグルタミナーゼで前処理後に評価した。したがって、これらのエピトープのアミド分解のための必要条件は、公知でない。
（製パン用）小麦（Triticum aestivum）、ライ麦、大麦もしくはオーツ麦のグルテン
、グリアジン、グルテニン、セカリン、ホルデインまたはアベニンとして定義付けられたＧｅｎｂａｎｋに存在する遺伝子によりコードされる、すべてのユニークな１２ｍｅｒ配列を含む、「特徴付けられていない」スクリーニンググレードのペプチドの包括的なライブラリを、ｉｎ ｖｉｖｏでのグルテン攻撃開始後６日にＨＬＡ ＤＱ２＋（及び、いくつかの症例ではＨＬＡ ＤＱ８＋）セリアック病志願者から得たＴ細胞を用いて、評価した。比較的一貫したパターンのエピトープヒエラルキーが、セリアック病において毒性の他の穀粒の消費後と類似するが、しかし同一でないＨＬＡ ＤＱ２セリアック病において、同定された。配列PQPQLPYを有するペプチドは、ＨＬＡ ＤＱ２＋セリアック病の少な
くとも３分の２において、小麦攻撃後に場合によりドミナントであるが、しかし他のエピトープは場合によってはドミナントであり、一方、PQLPYペプチドは、セリアック病を有
する６例のＨＬＡ ＤＱ２＋被験者中１例未満において、基本的に不活性である。稀なドミナントエピトープの寄与を、多数（例えば、＞３０例）の被験者をスクリーニングした後に評価するのが良いであろう。ライ麦及び大麦消費後のエピトープヒエラルキーは、グリアジン／ホルデイン／セカリン配列であるPQPQQPFPまたはPFPQQPQQPに類似するアミド
分解されたペプチドが、通常はPQPQLPY（小麦α−グリアジンにユニークな配列）よりも
むしろドミナントであることを除けば、小麦消費後のものと類似する。連続的な、または部分的に重複するグルテンエピトープを含んでなるコンビトープは、単一のエピトープのみと同程度に活性であるか、またはそれよりも活性であり、そしてＴ細胞認識のための複
数のグルテンエピトープを効率的に送達する手段を提供する。したがって、このようなコンビトープは、複数のユニークなＴ細胞エピトープを標的とするセリアック病におけるペプチド療法の設計及び送達において、有用である。
参考文献
１．Molberg Oら、Nature Med. 4, 713-717（1998年）
２．Quarsten Hら、Eur. J. Immunol. 29, 2506-2514（1999年）
３．Greenberg CSら、FASEB 5, 3071-3077（1991年）
４．Mantzaris G, Jewell D. Scand. J. Gastroenterol. 26, 392-398（1991年）
５．Mauri Lら、Scand. J. Gastroenterol. 31, 247-253（1996年）
６．Bunce Mら、Tissue Antigens 46, 355-367（1995年）
７．Olerup Oら、Tissue antigens 41, 119-134（1993年）
８．Mullighan CGら、Tissue-Antigens. 50, 688-92（1997年）
９．Plebanski Mら、Eur. J. Immunol. 28, 4345-4355（1998年）
１０．Anderson DO, Greene FC. The alpha-gliadin gene family. II. DNA and protein
sequence variation, subfamily structure, and origins of pseudogenes. Theor Appl
Genet（1997年）95:59-65.
１１．Arentz-Hansen H, Korner R, Molberg O, Quarsten H, Van der Wal Y, Kooy YMC,
Lundin KEA, Koning F, Roepstorff P, Sollid LM, McAdam SN. The intestinal T cell
response to alpha-gliadin in adult celiac disease is focused on a single deamidated glutamine targeted by tissue transglutaminase. J Exp Med. 2000年；191:603-12.
１２．Vader LW, de Ru A, van der Wal, Kooy YMC, Benckhuijsen W, Mearin ML, Drijfhout JW, van Veelen P, Koning F. Specificity of tissue transglutaminase explains
cereal toxicity in celiac disease. J Exp Med 2002年；195:643-649.
１３．van der Wal Y, Kooy Y, van Veelan P, Pena S, Mearin L, Papadopoulos G, Koning F. Selective deamidation by tissue transglutaminase strongly enhances gliadin-specific T cell reactivity. J Immunol. 1998年；161:1585-8.
１４．van der Wal Y, Kooy Y, van Veelan P, Pena S, Mearin L, Molberg O, Lundin KEA, Sollid L, Mutis T, Benckhuijsen WE, Drijfhout JW, Koning F. Proc Natl Acad Sci USA 1998年；95:10050-10054.
１５．Vader W, Kooy Y, Van Veelen Pら、The gluten response in children with celiac disease is directed toward multiple gliadin and glutenin peptides. Gastroenterology 2002年、122:1729-37
１６．Arentz-Hansen H, McAdam SN, Molberg Oら、Celiac lesion T cells recognize epitopes that cluster in regions of gliadin rich in proline residues. Gastroenterology 2002年、123:803-809.
本明細書に引用または参照されるＰＴＣ公報、米国特許、他の特許、ジャーナル参考文献、及び任意の他の出版物は、その全体が参照によって本明細書に援用される。
図１は、タンパク質群からすべての可能なペプチドエピトープを作出する方法を示す。 図２は、２００３年６月１６日にＧｅｎｂａｎｋデータベースに存在したグルテン遺伝子産物のＧｅｎｂａｎｋ受入番号を示す。 図２は、２００３年６月１６日にＧｅｎｂａｎｋデータベースに存在したグルテン遺伝子産物のＧｅｎｂａｎｋ受入番号を示す。 図３Ａは、ＥＬＩＳｐｏｔから得たデータを解析するための期待値最大化（ＥＭ）アルゴリズムを示す。 図３Ｂは、セリアック病を有する患者のデータセットに関する検査を示す。 図４は、応答性エピトープの最小セットを見つけるための反復手順を示す。 図５は、グリアジン及びグルテニンの配列（配列番号１〜１５５４）を示す。「コンセンサス」の列では、小文字は標準的な一文字アミノ酸コードを用いるが、しかし大文字は異なる意味を有する：Ｅ＝［ｅまたはｑ］、Ｆ＝［ｆまたはｙまたはｗ］、Ｉ＝［ｉまたはｌまたはｖ］、Ｓ＝［ｓまたはｔ］、Ｒ＝［ｒまたはｋまたはｈ］。「配列」の列は、標準的な一文字アミノ酸コードを用いる。 図５は、グリアジン及びグルテニンの配列（配列番号１〜１５５４）を示す。「コンセンサス」の列では、小文字は標準的な一文字アミノ酸コードを用いるが、しかし大文字は異なる意味を有する：Ｅ＝［ｅまたはｑ］、Ｆ＝［ｆまたはｙまたはｗ］、Ｉ＝［ｉまたはｌまたはｖ］、Ｓ＝［ｓまたはｔ］、Ｒ＝［ｒまたはｋまたはｈ］。「配列」の列は、標準的な一文字アミノ酸コードを用いる。 図５は、グリアジン及びグルテニンの配列（配列番号１〜１５５４）を示す。「コンセンサス」の列では、小文字は標準的な一文字アミノ酸コードを用いるが、しかし大文字は異なる意味を有する：Ｅ＝［ｅまたはｑ］、Ｆ＝［ｆまたはｙまたはｗ］、Ｉ＝［ｉまたはｌまたはｖ］、Ｓ＝［ｓまたはｔ］、Ｒ＝［ｒまたはｋまたはｈ］。「配列」の列は、標準的な一文字アミノ酸コードを用いる。 図５は、グリアジン及びグルテニンの配列（配列番号１〜１５５４）を示す。「コンセンサス」の列では、小文字は標準的な一文字アミノ酸コードを用いるが、しかし大文字は異なる意味を有する：Ｅ＝［ｅまたはｑ］、Ｆ＝［ｆまたはｙまたはｗ］、Ｉ＝［ｉまたはｌまたはｖ］、Ｓ＝［ｓまたはｔ］、Ｒ＝［ｒまたはｋまたはｈ］。「配列」の列は、標準的な一文字アミノ酸コードを用いる。 図５は、グリアジン及びグルテニンの配列（配列番号１〜１５５４）を示す。「コンセンサス」の列では、小文字は標準的な一文字アミノ酸コードを用いるが、しかし大文字は異なる意味を有する：Ｅ＝［ｅまたはｑ］、Ｆ＝［ｆまたはｙまたはｗ］、Ｉ＝［ｉまたはｌまたはｖ］、Ｓ＝［ｓまたはｔ］、Ｒ＝［ｒまたはｋまたはｈ］。「配列」の列は、標準的な一文字アミノ酸コードを用いる。 図５は、グリアジン及びグルテニンの配列（配列番号１〜１５５４）を示す。「コンセンサス」の列では、小文字は標準的な一文字アミノ酸コードを用いるが、しかし大文字は異なる意味を有する：Ｅ＝［ｅまたはｑ］、Ｆ＝［ｆまたはｙまたはｗ］、Ｉ＝［ｉまたはｌまたはｖ］、Ｓ＝［ｓまたはｔ］、Ｒ＝［ｒまたはｋまたはｈ］。「配列」の列は、標準的な一文字アミノ酸コードを用いる。 図５は、グリアジン及びグルテニンの配列（配列番号１〜１５５４）を示す。「コンセンサス」の列では、小文字は標準的な一文字アミノ酸コードを用いるが、しかし大文字は異なる意味を有する：Ｅ＝［ｅまたはｑ］、Ｆ＝［ｆまたはｙまたはｗ］、Ｉ＝［ｉまたはｌまたはｖ］、Ｓ＝［ｓまたはｔ］、Ｒ＝［ｒまたはｋまたはｈ］。「配列」の列は、標準的な一文字アミノ酸コードを用いる。 図５は、グリアジン及びグルテニンの配列（配列番号１〜１５５４）を示す。「コンセンサス」の列では、小文字は標準的な一文字アミノ酸コードを用いるが、しかし大文字は異なる意味を有する：Ｅ＝［ｅまたはｑ］、Ｆ＝［ｆまたはｙまたはｗ］、Ｉ＝［ｉまたはｌまたはｖ］、Ｓ＝［ｓまたはｔ］、Ｒ＝［ｒまたはｋまたはｈ］。「配列」の列は、標準的な一文字アミノ酸コードを用いる。 図５は、グリアジン及びグルテニンの配列（配列番号１〜１５５４）を示す。「コンセンサス」の列では、小文字は標準的な一文字アミノ酸コードを用いるが、しかし大文字は異なる意味を有する：Ｅ＝［ｅまたはｑ］、Ｆ＝［ｆまたはｙまたはｗ］、Ｉ＝［ｉまたはｌまたはｖ］、Ｓ＝［ｓまたはｔ］、Ｒ＝［ｒまたはｋまたはｈ］。「配列」の列は、標準的な一文字アミノ酸コードを用いる。 図５は、グリアジン及びグルテニンの配列（配列番号１〜１５５４）を示す。「コンセンサス」の列では、小文字は標準的な一文字アミノ酸コードを用いるが、しかし大文字は異なる意味を有する：Ｅ＝［ｅまたはｑ］、Ｆ＝［ｆまたはｙまたはｗ］、Ｉ＝［ｉまたはｌまたはｖ］、Ｓ＝［ｓまたはｔ］、Ｒ＝［ｒまたはｋまたはｈ］。「配列」の列は、標準的な一文字アミノ酸コードを用いる。 図５は、グリアジン及びグルテニンの配列（配列番号１〜１５５４）を示す。「コンセンサス」の列では、小文字は標準的な一文字アミノ酸コードを用いるが、しかし大文字は異なる意味を有する：Ｅ＝［ｅまたはｑ］、Ｆ＝［ｆまたはｙまたはｗ］、Ｉ＝［ｉまたはｌまたはｖ］、Ｓ＝［ｓまたはｔ］、Ｒ＝［ｒまたはｋまたはｈ］。「配列」の列は、標準的な一文字アミノ酸コードを用いる。 図５は、グリアジン及びグルテニンの配列（配列番号１〜１５５４）を示す。「コンセンサス」の列では、小文字は標準的な一文字アミノ酸コードを用いるが、しかし大文字は異なる意味を有する：Ｅ＝［ｅまたはｑ］、Ｆ＝［ｆまたはｙまたはｗ］、Ｉ＝［ｉまたはｌまたはｖ］、Ｓ＝［ｓまたはｔ］、Ｒ＝［ｒまたはｋまたはｈ］。「配列」の列は、標準的な一文字アミノ酸コードを用いる。 図５は、グリアジン及びグルテニンの配列（配列番号１〜１５５４）を示す。「コンセンサス」の列では、小文字は標準的な一文字アミノ酸コードを用いるが、しかし大文字は異なる意味を有する：Ｅ＝［ｅまたはｑ］、Ｆ＝［ｆまたはｙまたはｗ］、Ｉ＝［ｉまたはｌまたはｖ］、Ｓ＝［ｓまたはｔ］、Ｒ＝［ｒまたはｋまたはｈ］。「配列」の列は、標準的な一文字アミノ酸コードを用いる。 図５は、グリアジン及びグルテニンの配列（配列番号１〜１５５４）を示す。「コンセンサス」の列では、小文字は標準的な一文字アミノ酸コードを用いるが、しかし大文字は異なる意味を有する：Ｅ＝［ｅまたはｑ］、Ｆ＝［ｆまたはｙまたはｗ］、Ｉ＝［ｉまたはｌまたはｖ］、Ｓ＝［ｓまたはｔ］、Ｒ＝［ｒまたはｋまたはｈ］。「配列」の列は、標準的な一文字アミノ酸コードを用いる。 図５は、グリアジン及びグルテニンの配列（配列番号１〜１５５４）を示す。「コンセンサス」の列では、小文字は標準的な一文字アミノ酸コードを用いるが、しかし大文字は異なる意味を有する：Ｅ＝［ｅまたはｑ］、Ｆ＝［ｆまたはｙまたはｗ］、Ｉ＝［ｉまたはｌまたはｖ］、Ｓ＝［ｓまたはｔ］、Ｒ＝［ｒまたはｋまたはｈ］。「配列」の列は、標準的な一文字アミノ酸コードを用いる。 図５は、グリアジン及びグルテニンの配列（配列番号１〜１５５４）を示す。「コンセンサス」の列では、小文字は標準的な一文字アミノ酸コードを用いるが、しかし大文字は異なる意味を有する：Ｅ＝［ｅまたはｑ］、Ｆ＝［ｆまたはｙまたはｗ］、Ｉ＝［ｉまたはｌまたはｖ］、Ｓ＝［ｓまたはｔ］、Ｒ＝［ｒまたはｋまたはｈ］。「配列」の列は、標準的な一文字アミノ酸コードを用いる。 図５は、グリアジン及びグルテニンの配列（配列番号１〜１５５４）を示す。「コンセンサス」の列では、小文字は標準的な一文字アミノ酸コードを用いるが、しかし大文字は異なる意味を有する：Ｅ＝［ｅまたはｑ］、Ｆ＝［ｆまたはｙまたはｗ］、Ｉ＝［ｉまたはｌまたはｖ］、Ｓ＝［ｓまたはｔ］、Ｒ＝［ｒまたはｋまたはｈ］。「配列」の列は、標準的な一文字アミノ酸コードを用いる。 図５は、グリアジン及びグルテニンの配列（配列番号１〜１５５４）を示す。「コンセンサス」の列では、小文字は標準的な一文字アミノ酸コードを用いるが、しかし大文字は異なる意味を有する：Ｅ＝［ｅまたはｑ］、Ｆ＝［ｆまたはｙまたはｗ］、Ｉ＝［ｉまたはｌまたはｖ］、Ｓ＝［ｓまたはｔ］、Ｒ＝［ｒまたはｋまたはｈ］。「配列」の列は、標準的な一文字アミノ酸コードを用いる。 図５は、グリアジン及びグルテニンの配列（配列番号１〜１５５４）を示す。「コンセンサス」の列では、小文字は標準的な一文字アミノ酸コードを用いるが、しかし大文字は異なる意味を有する：Ｅ＝［ｅまたはｑ］、Ｆ＝［ｆまたはｙまたはｗ］、Ｉ＝［ｉまたはｌまたはｖ］、Ｓ＝［ｓまたはｔ］、Ｒ＝［ｒまたはｋまたはｈ］。「配列」の列は、標準的な一文字アミノ酸コードを用いる。 図５は、グリアジン及びグルテニンの配列（配列番号１〜１５５４）を示す。「コンセンサス」の列では、小文字は標準的な一文字アミノ酸コードを用いるが、しかし大文字は異なる意味を有する：Ｅ＝［ｅまたはｑ］、Ｆ＝［ｆまたはｙまたはｗ］、Ｉ＝［ｉまたはｌまたはｖ］、Ｓ＝［ｓまたはｔ］、Ｒ＝［ｒまたはｋまたはｈ］。「配列」の列は、標準的な一文字アミノ酸コードを用いる。 図５は、グリアジン及びグルテニンの配列（配列番号１〜１５５４）を示す。「コンセンサス」の列では、小文字は標準的な一文字アミノ酸コードを用いるが、しかし大文字は異なる意味を有する：Ｅ＝［ｅまたはｑ］、Ｆ＝［ｆまたはｙまたはｗ］、Ｉ＝［ｉまたはｌまたはｖ］、Ｓ＝［ｓまたはｔ］、Ｒ＝［ｒまたはｋまたはｈ］。「配列」の列は、標準的な一文字アミノ酸コードを用いる。 図５は、グリアジン及びグルテニンの配列（配列番号１〜１５５４）を示す。「コンセンサス」の列では、小文字は標準的な一文字アミノ酸コードを用いるが、しかし大文字は異なる意味を有する：Ｅ＝［ｅまたはｑ］、Ｆ＝［ｆまたはｙまたはｗ］、Ｉ＝［ｉまたはｌまたはｖ］、Ｓ＝［ｓまたはｔ］、Ｒ＝［ｒまたはｋまたはｈ］。「配列」の列は、標準的な一文字アミノ酸コードを用いる。 図５は、グリアジン及びグルテニンの配列（配列番号１〜１５５４）を示す。「コンセンサス」の列では、小文字は標準的な一文字アミノ酸コードを用いるが、しかし大文字は異なる意味を有する：Ｅ＝［ｅまたはｑ］、Ｆ＝［ｆまたはｙまたはｗ］、Ｉ＝［ｉまたはｌまたはｖ］、Ｓ＝［ｓまたはｔ］、Ｒ＝［ｒまたはｋまたはｈ］。「配列」の列は、標準的な一文字アミノ酸コードを用いる。 図５は、グリアジン及びグルテニンの配列（配列番号１〜１５５４）を示す。「コンセンサス」の列では、小文字は標準的な一文字アミノ酸コードを用いるが、しかし大文字は異なる意味を有する：Ｅ＝［ｅまたはｑ］、Ｆ＝［ｆまたはｙまたはｗ］、Ｉ＝［ｉまたはｌまたはｖ］、Ｓ＝［ｓまたはｔ］、Ｒ＝［ｒまたはｋまたはｈ］。「配列」の列は、標準的な一文字アミノ酸コードを用いる。 図５は、グリアジン及びグルテニンの配列（配列番号１〜１５５４）を示す。「コンセンサス」の列では、小文字は標準的な一文字アミノ酸コードを用いるが、しかし大文字は異なる意味を有する：Ｅ＝［ｅまたはｑ］、Ｆ＝［ｆまたはｙまたはｗ］、Ｉ＝［ｉまたはｌまたはｖ］、Ｓ＝［ｓまたはｔ］、Ｒ＝［ｒまたはｋまたはｈ］。「配列」の列は、標準的な一文字アミノ酸コードを用いる。 図５は、グリアジン及びグルテニンの配列（配列番号１〜１５５４）を示す。「コンセンサス」の列では、小文字は標準的な一文字アミノ酸コードを用いるが、しかし大文字は異なる意味を有する：Ｅ＝［ｅまたはｑ］、Ｆ＝［ｆまたはｙまたはｗ］、Ｉ＝［ｉまたはｌまたはｖ］、Ｓ＝［ｓまたはｔ］、Ｒ＝［ｒまたはｋまたはｈ］。「配列」の列は、標準的な一文字アミノ酸コードを用いる。 図５は、グリアジン及びグルテニンの配列（配列番号１〜１５５４）を示す。「コンセンサス」の列では、小文字は標準的な一文字アミノ酸コードを用いるが、しかし大文字は異なる意味を有する：Ｅ＝［ｅまたはｑ］、Ｆ＝［ｆまたはｙまたはｗ］、Ｉ＝［ｉまたはｌまたはｖ］、Ｓ＝［ｓまたはｔ］、Ｒ＝［ｒまたはｋまたはｈ］。「配列」の列は、標準的な一文字アミノ酸コードを用いる。 図６は、ＨＬＡ−ＤＱ２＋セリアック病志願者においてグルテン攻撃後６日に採取されたＰＢＭＣにおける、γインターフェロンを刺激するグルテンペプチド（配列番号１５５５〜１６５５）を、示す。示された９ｍｅｒは、２００群の生物活性の「構造的に」関連する２０ｍｅｒペプチドに共通している。グルテン配列は、生物活性Ｘ応答する被験者の比率にしたがって順序付けられている。 図６は、ＨＬＡ−ＤＱ２＋セリアック病志願者においてグルテン攻撃後６日に採取されたＰＢＭＣにおける、γインターフェロンを刺激するグルテンペプチド（配列番号１５５５〜１６５５）を、示す。示された９ｍｅｒは、２００群の生物活性の「構造的に」関連する２０ｍｅｒペプチドに共通している。グルテン配列は、生物活性Ｘ応答する被験者の比率にしたがって順序付けられている。 図６は、ＨＬＡ−ＤＱ２＋セリアック病志願者においてグルテン攻撃後６日に採取されたＰＢＭＣにおける、γインターフェロンを刺激するグルテンペプチド（配列番号１５５５〜１６５５）を、示す。示された９ｍｅｒは、２００群の生物活性の「構造的に」関連する２０ｍｅｒペプチドに共通している。グルテン配列は、生物活性Ｘ応答する被験者の比率にしたがって順序付けられている。 図６は、ＨＬＡ−ＤＱ２＋セリアック病志願者においてグルテン攻撃後６日に採取されたＰＢＭＣにおける、γインターフェロンを刺激するグルテンペプチド（配列番号１５５５〜１６５５）を、示す。示された９ｍｅｒは、２００群の生物活性の「構造的に」関連する２０ｍｅｒペプチドに共通している。グルテン配列は、生物活性Ｘ応答する被験者の比率にしたがって順序付けられている。 図７は、小麦攻撃実験の結果を示す（配列番号１６５６〜１６７１）。これらのペプチドは、小麦攻撃後に１０例の被験者（Ａ〜Ｊ）において良質の応答（「Ｙ」で示す）をもたらした。 図８は、ＨＬＡ−ＤＱ２＋セリアック病志願者においてグルテン攻撃後６日に採取されたＰＢＭＣにおける、γインターフェロンを刺激するアベニンペプチド（ｔＴＧによる＋／−アミド分解）（配列番号１６７２〜１６９８）を、示す。＊を付けたものは、オーツ麦攻撃後にＩＦＮ−γを誘導する、至適なユニークな２０ｍｅｒである。 図９は、共有のコア配列にしたがって分類された、２例のＨＬＡ−ＤＱ８（ＨＬＡ−ＤＱ２でない）被験者における最も強力な４０個の２０ｍｅｒである。第６群のコア配列（ＱＧＳＦＱＰＳＱＱ）は、van de Walら（J. Immunol. 1998年、161(4):1585-1588）により記載されたα−グリアジンエピトープと一致する。被験者Ａにおける最大応答は、２７１ＳＦＣ（中等度のみ、ペプチド応答なし：４ＳＦＣ）であり、Ｂにおいては２６ＳＦＣ（中等度のみ、ペプチド応答なし：１ＳＦＣ）であった。 図１０は、アミノ酸配列決定に基づいたＡ−グリアジンのアミノ酸配列（配列番号１９２８）を示す。
具体的には、配列番号１〜１９２７のアミド分解型を含んでなる剤が、好ましい（このような配列が、まだアミド分解されていない場合）。最も好ましくは、本発明の剤は、配列番号１〜１９２７のトランスグルタミナーゼによるアミド分解型を含んでなる（同じく、まだアミド分解されていない場合）。本明細書に定義されるように、これらの剤のアナログ及び同等物もまた、本発明の範囲内に包含される。
本発明は、非限定的に以下の態様を含む。
［態様１］
（ａ） 配列番号１〜１９２７からなる群より選択される配列を含んでなる少なくとも一つのエピトープを含んでなるペプチド、及びその同等物；ならびに、
（ｂ） （ａ）のペプチドを認識するＴ細胞受容体により認識されることが可能であって、かつ５０アミノ酸長を超えない、（ａ）のアナログ；
から選択される少なくとも一つの剤を個体に投与することを含んでなる、セリアック病を予防または治療する方法。
［態様２］
剤がＨＬＡ−ＤＱ２拘束性である、態様１に記載の方法。
［態様３］
剤がＨＬＡ−ＤＱ８拘束性である、態様１に記載の方法。
［態様４］
一つの剤がＨＬＡ−ＤＱ２拘束性であり、かつ第二の剤がＨＬＡ−ＤＱ８拘束性である、態様１に記載の方法。
［態様５］
剤が小麦エピトープを含んでなる、態様１に記載の方法。
［態様６］
剤がオーツ麦エピトープを含んでなる、態様１に記載の方法。
［態様７］
一つの剤が小麦エピトープを含んでなり、かつ一つの剤がオーツ麦エピトープを含んでなる、態様１に記載の方法。
［態様８］
態様１に定義されるような剤、及び医薬的に許容可能なキャリアーまたは希釈剤を含んでなる医薬組成物を、個体に投与することを含んでなる、セリアック病を予防または治療する方法。
［態様９］
態様１に定義されるようなＴ細胞受容体を有するＴ細胞のアンタゴニスト、及び医薬的に許容可能なキャリアーまたは希釈剤を含んでなる医薬組成物を、個体に投与することを含んでなる、セリアック病を予防または治療する方法。
［態様１０］
態様１に定義されるような剤に対してＴ細胞もしくは抗体の応答が生じることを抑制するために、グルテンタンパク質に対して個体を寛容化するための、態様１に定義されるような剤を含んでなる組成物を、個体に投与することを含んでなる、セリアック病を予防または治療する方法。
［態様１１］
ａ） 宿主から得た試料を、
ｉ） 配列番号１〜１９２７からなる群より選択される配列を含んでなる少なくとも一つのエピトープを含んでなるペプチド、及びその同等物；ならびに、
ｉｉ） ｉ）を認識するＴ細胞受容体により認識されることが可能であって、かつ５０アミノ酸長を超えない、ｉ）のアナログ；
から選択される少なくとも一つの剤と接触させ、そして、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて試料中のＴ細胞が剤を認識するかどうかを判定すること；ここで、Ｔ細胞による認識は、該個体がセリアック病を有するかまたはそれに感受性であることを示す；あるいは、
ｂ） 態様１に定義されるような剤を投与し、そしてｉｎ ｖｉｖｏにおいて個体中のＴ細胞が剤を認識するかどうかを判定すること、ここで、剤の認識は、個体がセリアック病を有するかまたはそれに感受性であることを示す；
のいずれかにより、個体においてセリアック病を診断し、そして、
セリアック病を有するかまたはそれに感受性であると診断された個体に、セリアック病を予防または治療するための治療剤を投与する
ことを含んでなる、セリアック病を予防または治療する方法。
［態様１２］
セリアック病を治療または予防するための薬剤を調製するための剤の使用であって、当該剤は
（ａ） 配列番号１〜１９２７からなる群より選択される配列を含んでなる少なくとも一つのエピトープを含んでなるペプチド、及びその同等物；ならびに、
（ｂ） （ａ）のペプチドを認識するＴ細胞受容体により認識されることが可能であって、かつ５０アミノ酸長を超えない、（ａ）のアナログ；
を含んでなる、前記使用。
［態様１３］
剤がＨＬＡ−ＤＱ２拘束性である、態様１２に記載の使用。
［態様１４］
剤がＨＬＡ−ＤＱ８拘束性である、態様１２に記載の使用。
［態様１５］
一つの剤がＨＬＡ−ＤＱ２拘束性であり、かつ第二の剤がＨＬＡ−ＤＱ８拘束性である、態様１２に記載の使用。
［態様１６］
剤が小麦エピトープを含んでなる、態様１２に記載の使用。
［態様１７］
剤がオーツ麦エピトープを含んでなる、態様１２に記載の使用。
［態様１８］
一つの剤が小麦エピトープを含んでなり、かつ一つの剤がオーツ麦エピトープを含んでなる、態様１２に記載の使用。
［態様１９］
剤が、医薬的に許容可能なキャリアーまたは希釈剤を含んでなる医薬組成物中に存在する、態様１２に記載の使用。
［態様２０］
剤が、態様１２に定義されるようなＴ細胞受容体を有するＴ細胞のアンタゴニスト、及び医薬的に許容可能なキャリアーまたは希釈剤を含んでなる医薬組成物中に存在する、態様１２に記載の使用。
［態様２１］
剤が、態様１に定義されるような剤に対してＴ細胞もしくは抗体の応答が生じることを抑制するために、グルテンタンパク質に対して個体を寛容化するための組成物中に存在する、態様１２に記載の使用。
［態様２２］
所望によりキャリアーと会合していてもよい、態様１に定義されるような剤であって、当該剤を認識するＴ細胞を寛容化することによってセリアック病を治療または予防する方法における使用のための、前記剤。
［態様２３］
所望によりキャリアーと会合していてもよい、態様１に定義されるようなＴ細胞受容体を有するＴ細胞のアンタゴニストであって、そのようなＴ細胞をアンタゴナイズすることによってセリアック病を治療または予防する方法における使用のための、前記アンタゴニスト。
［態様２４］
態様１に定義されるような剤のエピトープと結合する抗体と結合する、態様１に定義されるような剤またはアナログであって、そのような抗体の産生を防ぐために個体を寛容化することによって個体においてセリアック病を治療または予防する方法における使用のための、前記剤またはアナログ。
［態様２５］
Ｔ細胞受容体と結合可能な配列を含んでなるタンパク質であって、Ｔ細胞受容体が態様１に定義されるような剤を認識し、かつ配列がこのようなＴ細胞受容体を保有するＴ細胞のアンタゴニズムを引き起こすことが可能な、上記タンパク質。
［態様２６］
態様１に定義されるような剤、または態様９に定義されるようなアンタゴニスト。
［態様２７］
態様１に定義されるような剤、または態様９に定義されるようなアンタゴニスト、及び医薬的に許容可能なキャリアーまたは希釈剤を含んでなる、医薬組成物。
［態様２８］
態様１に定義されるような剤に対してＴ細胞もしくは抗体の応答が生じることを抑制するために、グルテンタンパク質に対して個体を寛容化するための、態様１に定義されるような剤を含んでなる組成物。
［態様２９］
態様１に定義されるような剤に対するＴ細胞応答をアンタゴナイズするための、態様９に定義されるようなアンタゴニストを含んでなる組成物。
［態様３０］
変異グルテンタンパク質であって、その野生型配列は、態様１に定義されるような剤である配列へとトランスグルタミナーゼにより修飾されることが可能であって、その変異グルテンタンパク質は、態様１に定義されるような剤である配列へのトランスグルタミナーゼによる修飾を防ぐ変異を含んでいる、前記変異グルテンタンパク質；あるいは、少なくとも７アミノ酸長であり、かつ変異を含んでなる、このような変異グルテンタンパク質のフラグメント。
［態様３１］
態様２５または３０に定義されるようなタンパク質またはフラグメントをコードするコード配列を含んでなる、ポリヌクレオチド。
［態様３２］
コード配列と機能可能なように連結され、細胞におけるコード配列の発現を確保することが可能な１またはそれより多くの調節配列を、さらに含んでなる、態様３１に記載のポリヌクレオチド。
［態様３３］
調節配列（群）が、原核細胞または哺乳動物細胞においてコード配列の発現を可能にする、態様３２に記載のポリヌクレオチド。
［態様３４］
ベクターであるか、またはベクターの形態である、態様３１〜３３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
［態様３５］
態様３１〜３４のいずれか１項に定義されるようなポリヌクレオチドを含んでなるか、またはこのようなポリヌクレオチドで形質転換されている、細胞。
［態様３６］
原核細胞または哺乳動物細胞である、態様３５に記載の細胞。
［態様３７］
態様１に定義されるようなＴ細胞受容体を発現する、哺乳動物。
［態様３８］
（ａ） 宿主から得た試料を、
ｉ） 配列番号１〜１９２７からなる群より選択される配列を含んでなる少なくとも一つのエピトープを含んでなるペプチド、及びその同等物；ならびに、
ｉｉ） （ｉ）を認識するＴ細胞受容体により認識されることが可能であって、かつ５０アミノ酸長を超えない、（ｉ）のアナログ；
から選択される少なくとも一つの剤と接触させること；ならびに、
（ｂ） 試料中のＴ細胞が剤を認識するかどうかを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで判定すること、ここで、Ｔ細胞による認識は、該個体がセリアック病を有するかまたはそれに感受性であることを示す；
を含んでなる、個体においてセリアック病またはセリアック病に対する感受性を診断する方法。
［態様３９］
個体においてセリアック病またはセリアック病に対する感受性を診断する方法であって、個体のＴ細胞が剤を認識するかどうかを判定すること、ここにおいて、Ｔ細胞による認識は、該個体がセリアック病を有するかまたはそれに感受性であることを示す、を含んでなる前記方法における使用のための診断手段の調製のための、態様３８に定義されるような剤の使用。
［態様４０］
剤が、（ａ） ＨＬＡ分子または（ｂ） （ｉ）もしくは（ｉｉ）と結合可能なＨＬＡ分子のフラグメントと結合している（ｉ）または（ｉｉ）を含んでなる、アナログ（ｉｉｉ）である、態様３８もしくは３９に記載の方法または使用。
［態様４１］
ＨＬＡ分子またはフラグメントが、４個のＨＬＡ分子またはＨＬＡ分子のフラグメントを含んでなる複合体に含まれる、態様４０に記載の方法または使用。
［態様４２］
方法が、剤を個体の皮膚に投与し、そして投与部位における炎症の存在を検出すること、ここにおいて、炎症の検出は、該個体のＴ細胞が剤を認識することを示す、を含んでなる、態様３９〜４１のいずれか１項に記載の使用。
［態様４３］
試料が血液試料である、態様３９、４１または４２に記載の方法。
［態様４４］
Ｔ細胞が、前記判定の前にｉｎ ｖｉｔｒｏで抗原特異性に再刺激されていない、態様３８、４０、４１または４３に記載の方法。
［態様４５］
Ｔ細胞による剤の認識が、Ｔ細胞からのサイトカインの分泌を検出することによって判定される、態様３８〜４４のいずれか１項に記載の方法または使用。
［態様４６］
サイトカインがＩＦＮ−γである、態様４５に記載の方法または使用。
［態様４７］
サイトカインを、サイトカインに特異的な固定化された抗体と結合させ、次いで抗体／サイトカイン複合体の存在を検出することによって、サイトカインを検出する、態様４５または態様４６に記載の方法または使用。
［態様４８］
前記判定を、剤がＴ細胞受容体と結合するかどうかを測定することによって行う、態様３８〜４４のいずれか１項に記載の方法または使用。
［態様４９］
候補の物質が、態様３８に定義されるような配列を含んでなるエピトープを認識するＴ細胞受容体によって認識されるかどうかを判定すること、ここにおいて、該物質の認識は、該物質がアナログであることを示す、を含んでなる、態様３８、４０または４１に定義されるようなアナログを同定するための方法。
［態様５０］
個体においてセリアック病またはセリアック病に対する感受性を診断する方法であって、個体から得た試料において、態様３８に定義されるような配列を含んでなるエピトープのエピトープと結合する抗体の存在を判定すること、ここにおいて、抗体の存在は、該個体がセリアック病を有するかまたはそれに対して感受性であることを示す、を含んでなる、上記方法。
［態様５１］
組成物がセリアック病を引き起こすことが可能かどうかを判定する方法であって、トランスグルタミナーゼによって態様３８に定義されるようなオリゴペプチド配列へと修飾されることが可能なタンパク質が組成物中に存在するかどうかを判定すること、ここにおいて、タンパク質の存在は、該組成物がセリアック病を引き起こすことが可能なことを示す、を含んでなる、上記方法。
［態様５２］
前記判定を、組成物を、オリゴペプチド配列へと修飾されることが可能な配列に特異的な抗体と接触させることによって行う、ここにおいて、抗体と組成物中のタンパク質との結合は、該組成物がセリアック病を引き起こすことが可能なことを示す、態様５１に記載の方法。
［態様５３］
Ｔ細胞のアンタゴニストを同定する方法であって、（ここにおいて、Ｔ細胞は態様１に定義されるような剤を認識する）、候補の基質をＴ細胞と接触させ、そして該物質がＴ細胞の抗原特異的応答を起こす能の減少を引き起こすかどうかを検出すること、ここで、任意のこのような減少の検出は該物質がアンタゴニストであることを示す、を含んでなる、上記方法。
［態様５４］
態様３８、４０または４１に定義されるような剤、及びＴ細胞によるペプチドの認識を検出する手段を含んでなる、態様３８〜４８のいずれか１項に記載の方法または使用を実行するためのキット。
［態様５５］
認識を検出する手段が、ＩＦＮ−γに対する抗体を含んでなる、態様５４に記載のキット。
［態様５６］
抗体が固体担体上に固定され、そして所望によりキットが抗体／ＩＦＮ−γ複合体を検出する手段もまた含んでなる、態様５５に記載のキット。
［態様５７］
態様５６に定義されるような剤またはアンタゴニスト、あるいは態様３０に定義されるような野生型配列の、当該剤、アンタゴニストまたは野生型配列に特異的な抗体を産生するための使用。
［態様５８］
グルテンタンパク質のエピトープにおける変異の、グルテンタンパク質がセリアック病を引き起こす能を減少させるための使用であって、当該エピトープは態様３８に定義されるようなものである、前記使用。
［態様５９］
セリアック病治療剤である産物を同定する方法であって、セリアック病を有するかまたはそれに感受性である態様３７に定義されるような哺乳動物に候補の物質を投与し、そして該物質が哺乳動物においてセリアック病を予防または治療するかどうかを判定すること、ここにおいて、セリアック病の予防または治療は、該物質が治療用産物であることを示す、を含んでなる上記方法。
［態様６０］
セリアック病を予防または治療する方法における使用のための、態様５９に記載の方法において同定されるような治療用産物。
［態様６１］
個体においてセリアック病またはセリアック病に対する感受性を診断する方法であって、態様３８に定義されるような剤を投与し、そして個体のＴ細胞が剤を認識するかどうかをｉｎ ｖｉｖｏにて判定すること、ここにおいて、剤の認識は、該個体がセリアック病を有するかまたはそれに感受性であることを示す、を含んでなる、上記方法。
［態様６２］
イネ科単子葉植物種の細胞である、態様３５に記載の細胞。
［態様６３］
小麦、トウモロコシ、オーツ麦、ライ麦、米、大麦、ライ小麦、ソルガムまたはサトウキビの細胞である、態様６２に記載の細胞。
［態様６４］
（ａ） 態様３５、３６、６２または６３のいずれか１項に記載の細胞を、タンパク質の発現を可能にする条件下で培養すること；及び、所望により、
（ｂ） 発現したタンパク質を回収すること；
を含んでなる、態様３１に定義されるようなコード配列によってコードされるタンパク質の産生のためのプロセス。
［態様６５］
（ａ） 態様３４に記載のベクターで植物細胞を形質転換して、トランスジェニック植物細胞を得ること；
を含んでなる、トランスジェニック植物細胞を得る方法。
［態様６６］
（ｂ） 態様３４に記載のベクターで形質転換されたトランスジェニック植物細胞を再生して、トランスジェニック植物を得ること；
を含んでなる、第一世代トランスジェニック植物を得る方法。
［態様６７］
（ｃ） 態様６６の工程（ｂ）により得ることが可能なトランスジェニック植物から、トランスジェニック種子を得ること；
を含んでなる、トランスジェニック植物種子を得る方法。
［態様６８］
トランスジェニック後代植物を得る方法であって、態様６６に記載の方法によって得ることが可能な第一世代トランスジェニック植物から、第二世代トランスジェニック後代植物を得て、そして所望により、このように得られた第二世代後代植物から１またはそれより多くのさらなる世代のトランスジェニック植物を得ることを含んでなる、上記方法。
［態様６９］
（ｄ） トランスジェニック種子を、態様６７に記載の方法によって得ることが可能な第一世代トランスジェニック植物から得て、次いで第二世代トランスジェニック後代植物を、トランスジェニック種子から得ること；及び／または、
（ｅ） 態様６６に記載の方法によって得ることが可能な第一世代トランスジェニック植物をクローン増殖させて、第二世代後代植物を得ること；及び／または、
（ｆ） 態様６６に記載の方法によって得ることが可能な第一世代トランスジェニック植物を、別の植物と交配させて、第二世代後代植物を得ること；及び、所望により、
（ｇ） このように得られた後代植物から、１またはそれより多くのさらなる世代のトランスジェニック後代植物を得ること；
を含んでなる、態様６８に記載の方法。
［態様７０］
態様６５〜６９のいずれか１項に記載の方法によって得ることが可能な、トランスジェニック植物細胞、植物、植物種子または後代植物。
［態様７１］
態様６２または６３に記載の植物細胞を含んでなる、トランスジェニック植物または植物種子。
［態様７２］
態様６２、６３、または６５〜６９のいずれか１項に定義されるようなトランスジェニック植物細胞、第一世代植物、植物種子または後代から得ることが可能な、態様６２または６３に記載の植物細胞を含んでなる、トランスジェニック植物細胞カルス。
［態様７３］
態様６２または６３に定義されるような種のものである、態様７０〜７２のいずれか１項に記載の植物またはカルス。
［態様７４］
態様７０〜７３のいずれか１項に記載の植物から穀物を収穫し、そして所望により収穫された産物をさらに加工することを含んでなる、穀物を得る方法
［態様７５］
植物が小麦植物であり、かつ収穫された穀物が穀粒であって；所望により、小麦粉または別の穀粒産物へとさらに加工する、態様７４に記載の方法。
［態様７６］
態様７４または７５に記載の方法によって得ることが可能な、穀物。
［態様７７］
態様２５または３０のいずれかに定義されるようなタンパク質を含んでなる、食物。
［態様７８］
態様２５または３０に定義されるようなタンパク質が、野生型グルテンの代わりに用いられる、態様７７に記載の食物。

Claims (78)

  1. （ａ） 配列番号１〜１９２７からなる群より選択される配列を含んでなる少なくとも一つのエピトープを含んでなるペプチド、及びその同等物；ならびに、
    （ｂ） （ａ）のペプチドを認識するＴ細胞受容体により認識されることが可能であって、かつ５０アミノ酸長を超えない、（ａ）のアナログ；
    から選択される少なくとも一つの剤を個体に投与することを含んでなる、セリアック病を予防または治療する方法。
  2. 剤がＨＬＡ−ＤＱ２拘束性である、請求項１に記載の方法。
  3. 剤がＨＬＡ−ＤＱ８拘束性である、請求項１に記載の方法。
  4. 一つの剤がＨＬＡ−ＤＱ２拘束性であり、かつ第二の剤がＨＬＡ−ＤＱ８拘束性である、請求項１に記載の方法。
  5. 剤が小麦エピトープを含んでなる、請求項１に記載の方法。
  6. 剤がオーツ麦エピトープを含んでなる、請求項１に記載の方法。
  7. 一つの剤が小麦エピトープを含んでなり、かつ一つの剤がオーツ麦エピトープを含んでなる、請求項１に記載の方法。
  8. 請求項１に定義されるような剤、及び医薬的に許容可能なキャリアーまたは希釈剤を含んでなる医薬組成物を、個体に投与することを含んでなる、セリアック病を予防または治療する方法。
  9. 請求項１に定義されるようなＴ細胞受容体を有するＴ細胞のアンタゴニスト、及び医薬的に許容可能なキャリアーまたは希釈剤を含んでなる医薬組成物を、個体に投与することを含んでなる、セリアック病を予防または治療する方法。
  10. 請求項１に定義されるような剤に対してＴ細胞もしくは抗体の応答が生じることを抑制するために、グルテンタンパク質に対して個体を寛容化するための、請求項１に定義されるような剤を含んでなる組成物を、個体に投与することを含んでなる、セリアック病を予防または治療する方法。
  11. ａ） 宿主から得た試料を、
    ｉ） 配列番号１〜１９２７からなる群より選択される配列を含んでなる少なくとも一つのエピトープを含んでなるペプチド、及びその同等物；ならびに、
    ｉｉ） ｉ）を認識するＴ細胞受容体により認識されることが可能であって、かつ５０アミノ酸長を超えない、ｉ）のアナログ；
    から選択される少なくとも一つの剤と接触させ、そして、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて試料中のＴ細胞が剤を認識するかどうかを判定すること；ここで、Ｔ細胞による認識は、該個体がセリアック病を有するかまたはそれに感受性であることを示す；あるいは、
    ｂ） 請求項１に定義されるような剤を投与し、そしてｉｎ ｖｉｖｏにおいて個体中のＴ細胞が剤を認識するかどうかを判定すること、ここで、剤の認識は、個体がセリアック病を有するかまたはそれに感受性であることを示す；
    のいずれかにより、個体においてセリアック病を診断し、そして、
    セリアック病を有するかまたはそれに感受性であると診断された個体に、セリアック病を予防または治療するための治療剤を投与する
    ことを含んでなる、セリアック病を予防または治療する方法。
  12. セリアック病を治療または予防するための薬剤を調製するための剤の使用であって、当該剤は
    （ａ） 配列番号１〜１９２７からなる群より選択される配列を含んでなる少なくとも一つのエピトープを含んでなるペプチド、及びその同等物；ならびに、
    （ｂ） （ａ）のペプチドを認識するＴ細胞受容体により認識されることが可能であって、かつ５０アミノ酸長を超えない、（ａ）のアナログ；
    を含んでなる、前記使用。
  13. 剤がＨＬＡ−ＤＱ２拘束性である、請求項１２に記載の使用。
  14. 剤がＨＬＡ−ＤＱ８拘束性である、請求項１２に記載の使用。
  15. 一つの剤がＨＬＡ−ＤＱ２拘束性であり、かつ第二の剤がＨＬＡ−ＤＱ８拘束性である、請求項１２に記載の使用。
  16. 剤が小麦エピトープを含んでなる、請求項１２に記載の使用。
  17. 剤がオーツ麦エピトープを含んでなる、請求項１２に記載の使用。
  18. 一つの剤が小麦エピトープを含んでなり、かつ一つの剤がオーツ麦エピトープを含んでなる、請求項１２に記載の使用。
  19. 剤が、医薬的に許容可能なキャリアーまたは希釈剤を含んでなる医薬組成物中に存在する、請求項１２に記載の使用。
  20. 剤が、請求項１２に定義されるようなＴ細胞受容体を有するＴ細胞のアンタゴニスト、及び医薬的に許容可能なキャリアーまたは希釈剤を含んでなる医薬組成物中に存在する、請求項１２に記載の使用。
  21. 剤が、請求項１に定義されるような剤に対してＴ細胞もしくは抗体の応答が生じることを抑制するために、グルテンタンパク質に対して個体を寛容化するための組成物中に存在する、請求項１２に記載の使用。
  22. 所望によりキャリアーと会合していてもよい、請求項１に定義されるような剤であって、当該剤を認識するＴ細胞を寛容化することによってセリアック病を治療または予防する方法における使用のための、前記剤。
  23. 所望によりキャリアーと会合していてもよい、請求項１に定義されるようなＴ細胞受容体を有するＴ細胞のアンタゴニストであって、そのようなＴ細胞をアンタゴナイズすることによってセリアック病を治療または予防する方法における使用のための、前記アンタゴニスト。
  24. 請求項１に定義されるような剤のエピトープと結合する抗体と結合する、請求項１に定義されるような剤またはアナログであって、そのような抗体の産生を防ぐために個体を寛容化することによって個体においてセリアック病を治療または予防する方法における使用のための、前記剤またはアナログ。
  25. Ｔ細胞受容体と結合可能な配列を含んでなるタンパク質であって、Ｔ細胞受容体が請求
    項１に定義されるような剤を認識し、かつ配列がこのようなＴ細胞受容体を保有するＴ細胞のアンタゴニズムを引き起こすことが可能な、上記タンパク質。
  26. 請求項１に定義されるような剤、または請求項９に定義されるようなアンタゴニスト。
  27. 請求項１に定義されるような剤、または請求項９に定義されるようなアンタゴニスト、及び医薬的に許容可能なキャリアーまたは希釈剤を含んでなる、医薬組成物。
  28. 請求項１に定義されるような剤に対してＴ細胞もしくは抗体の応答が生じることを抑制するために、グルテンタンパク質に対して個体を寛容化するための、請求項１に定義されるような剤を含んでなる組成物。
  29. 請求項１に定義されるような剤に対するＴ細胞応答をアンタゴナイズするための、請求項９に定義されるようなアンタゴニストを含んでなる組成物。
  30. 変異グルテンタンパク質であって、その野生型配列は、請求項１に定義されるような剤である配列へとトランスグルタミナーゼにより修飾されることが可能であって、その変異グルテンタンパク質は、請求項１に定義されるような剤である配列へのトランスグルタミナーゼによる修飾を防ぐ変異を含んでいる、前記変異グルテンタンパク質；あるいは、少なくとも７アミノ酸長であり、かつ変異を含んでなる、このような変異グルテンタンパク質のフラグメント。
  31. 請求項２５または３０に定義されるようなタンパク質またはフラグメントをコードするコード配列を含んでなる、ポリヌクレオチド。
  32. コード配列と機能可能なように連結され、細胞におけるコード配列の発現を確保することが可能な１またはそれより多くの調節配列を、さらに含んでなる、請求項３１に記載のポリヌクレオチド。
  33. 調節配列（群）が、原核細胞または哺乳動物細胞においてコード配列の発現を可能にする、請求項３２に記載のポリヌクレオチド。
  34. ベクターであるか、またはベクターの形態である、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  35. 請求項３１〜３４のいずれか１項に定義されるようなポリヌクレオチドを含んでなるか、またはこのようなポリヌクレオチドで形質転換されている、細胞。
  36. 原核細胞または哺乳動物細胞である、請求項３５に記載の細胞。
  37. 請求項１に定義されるようなＴ細胞受容体を発現する、哺乳動物。
  38. （ａ） 宿主から得た試料を、
    ｉ） 配列番号１〜１９２７からなる群より選択される配列を含んでなる少なくとも一つのエピトープを含んでなるペプチド、及びその同等物；ならびに、
    ｉｉ） （ｉ）を認識するＴ細胞受容体により認識されることが可能であって、かつ５０アミノ酸長を超えない、（ｉ）のアナログ；
    から選択される少なくとも一つの剤と接触させること；ならびに、
    （ｂ） 試料中のＴ細胞が剤を認識するかどうかを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで判定すること、ここで、Ｔ細胞による認識は、該個体がセリアック病を有するかまたはそれに感受性で
    あることを示す；
    を含んでなる、個体においてセリアック病またはセリアック病に対する感受性を診断する方法。
  39. 個体においてセリアック病またはセリアック病に対する感受性を診断する方法であって、個体のＴ細胞が剤を認識するかどうかを判定すること、ここにおいて、Ｔ細胞による認識は、該個体がセリアック病を有するかまたはそれに感受性であることを示す、を含んでなる前記方法における使用のための診断手段の調製のための、請求項３８に定義されるような剤の使用。
  40. 剤が、（ａ） ＨＬＡ分子または（ｂ） （ｉ）もしくは（ｉｉ）と結合可能なＨＬＡ分子のフラグメントと結合している（ｉ）または（ｉｉ）を含んでなる、アナログ（ｉｉｉ）である、請求項３８もしくは３９に記載の方法または使用。
  41. ＨＬＡ分子またはフラグメントが、４個のＨＬＡ分子またはＨＬＡ分子のフラグメントを含んでなる複合体に含まれる、請求項４０に記載の方法または使用。
  42. 方法が、剤を個体の皮膚に投与し、そして投与部位における炎症の存在を検出すること、ここにおいて、炎症の検出は、該個体のＴ細胞が剤を認識することを示す、を含んでなる、請求項３９〜４１のいずれか１項に記載の使用。
  43. 試料が血液試料である、請求項３９、４１または４２に記載の方法。
  44. Ｔ細胞が、前記判定の前にｉｎ ｖｉｔｒｏで抗原特異性に再刺激されていない、請求項３８、４０、４１または４３に記載の方法。
  45. Ｔ細胞による剤の認識が、Ｔ細胞からのサイトカインの分泌を検出することによって判定される、請求項３８〜４４のいずれか１項に記載の方法または使用。
  46. サイトカインがＩＦＮ−γである、請求項４５に記載の方法または使用。
  47. サイトカインを、サイトカインに特異的な固定化された抗体と結合させ、次いで抗体／サイトカイン複合体の存在を検出することによって、サイトカインを検出する、請求項４５または請求項４６に記載の方法または使用。
  48. 前記判定を、剤がＴ細胞受容体と結合するかどうかを測定することによって行う、請求項３８〜４４のいずれか１項に記載の方法または使用。
  49. 候補の物質が、請求項３８に定義されるような配列を含んでなるエピトープを認識するＴ細胞受容体によって認識されるかどうかを判定すること、ここにおいて、該物質の認識は、該物質がアナログであることを示す、を含んでなる、請求項３８、４０または４１に定義されるようなアナログを同定するための方法。
  50. 個体においてセリアック病またはセリアック病に対する感受性を診断する方法であって、個体から得た試料において、請求項３８に定義されるような配列を含んでなるエピトープのエピトープと結合する抗体の存在を判定すること、ここにおいて、抗体の存在は、該個体がセリアック病を有するかまたはそれに対して感受性であることを示す、を含んでなる、上記方法。
  51. 組成物がセリアック病を引き起こすことが可能かどうかを判定する方法であって、トラ
    ンスグルタミナーゼによって請求項３８に定義されるようなオリゴペプチド配列へと修飾されることが可能なタンパク質が組成物中に存在するかどうかを判定すること、ここにおいて、タンパク質の存在は、該組成物がセリアック病を引き起こすことが可能なことを示す、を含んでなる、上記方法。
  52. 前記判定を、組成物を、オリゴペプチド配列へと修飾されることが可能な配列に特異的な抗体と接触させることによって行う、ここにおいて、抗体と組成物中のタンパク質との結合は、該組成物がセリアック病を引き起こすことが可能なことを示す、請求項５１に記載の方法。
  53. Ｔ細胞のアンタゴニストを同定する方法であって、（ここにおいて、Ｔ細胞は請求項１に定義されるような剤を認識する）、候補の基質をＴ細胞と接触させ、そして該物質がＴ細胞の抗原特異的応答を起こす能の減少を引き起こすかどうかを検出すること、ここで、任意のこのような減少の検出は該物質がアンタゴニストであることを示す、を含んでなる、上記方法。
  54. 請求項３８、４０または４１に定義されるような剤、及びＴ細胞によるペプチドの認識を検出する手段を含んでなる、請求項３８〜４８のいずれか１項に記載の方法または使用を実行するためのキット。
  55. 認識を検出する手段が、ＩＦＮ−γに対する抗体を含んでなる、請求項５４に記載のキット。
  56. 抗体が固体担体上に固定され、そして所望によりキットが抗体／ＩＦＮ−γ複合体を検出する手段もまた含んでなる、請求項５５に記載のキット。
  57. 請求項５６に定義されるような剤またはアンタゴニスト、あるいは請求項３０に定義されるような野生型配列の、当該剤、アンタゴニストまたは野生型配列に特異的な抗体を産生するための使用。
  58. グルテンタンパク質のエピトープにおける変異の、グルテンタンパク質がセリアック病を引き起こす能を減少させるための使用であって、当該エピトープは請求項３８に定義されるようなものである、前記使用。
  59. セリアック病治療剤である産物を同定する方法であって、セリアック病を有するかまたはそれに感受性である請求項３７に定義されるような哺乳動物に候補の物質を投与し、そして該物質が哺乳動物においてセリアック病を予防または治療するかどうかを判定すること、ここにおいて、セリアック病の予防または治療は、該物質が治療用産物であることを示す、を含んでなる上記方法。
  60. セリアック病を予防または治療する方法における使用のための、請求項５９に記載の方法において同定されるような治療用産物。
  61. 個体においてセリアック病またはセリアック病に対する感受性を診断する方法であって、請求項３８に定義されるような剤を投与し、そして個体のＴ細胞が剤を認識するかどうかをｉｎ ｖｉｖｏにて判定すること、ここにおいて、剤の認識は、該個体がセリアック病を有するかまたはそれに感受性であることを示す、を含んでなる、上記方法。
  62. イネ科単子葉植物種の細胞である、請求項３５に記載の細胞。
  63. 小麦、トウモロコシ、オーツ麦、ライ麦、米、大麦、ライ小麦、ソルガムまたはサトウキビの細胞である、請求項６２に記載の細胞。
  64. （ａ） 請求項３５、３６、６２または６３のいずれか１項に記載の細胞を、タンパク質の発現を可能にする条件下で培養すること；及び、所望により、
    （ｂ） 発現したタンパク質を回収すること；
    を含んでなる、請求項３１に定義されるようなコード配列によってコードされるタンパク質の産生のためのプロセス。
  65. （ａ） 請求項３４に記載のベクターで植物細胞を形質転換して、トランスジェニック植物細胞を得ること；
    を含んでなる、トランスジェニック植物細胞を得る方法。
  66. （ｂ） 請求項３４に記載のベクターで形質転換されたトランスジェニック植物細胞を再生して、トランスジェニック植物を得ること；
    を含んでなる、第一世代トランスジェニック植物を得る方法。
  67. （ｃ） 請求項６６の工程（ｂ）により得ることが可能なトランスジェニック植物から、トランスジェニック種子を得ること；
    を含んでなる、トランスジェニック植物種子を得る方法。
  68. トランスジェニック後代植物を得る方法であって、請求項６６に記載の方法によって得ることが可能な第一世代トランスジェニック植物から、第二世代トランスジェニック後代植物を得て、そして所望により、このように得られた第二世代後代植物から１またはそれより多くのさらなる世代のトランスジェニック植物を得ることを含んでなる、上記方法。
  69. （ｄ） トランスジェニック種子を、請求項６７に記載の方法によって得ることが可能な第一世代トランスジェニック植物から得て、次いで第二世代トランスジェニック後代植物を、トランスジェニック種子から得ること；及び／または、
    （ｅ） 請求項６６に記載の方法によって得ることが可能な第一世代トランスジェニック植物をクローン増殖させて、第二世代後代植物を得ること；及び／または、
    （ｆ） 請求項６６に記載の方法によって得ることが可能な第一世代トランスジェニック植物を、別の植物と交配させて、第二世代後代植物を得ること；及び、所望により、
    （ｇ） このように得られた後代植物から、１またはそれより多くのさらなる世代のトランスジェニック後代植物を得ること；
    を含んでなる、請求項６８に記載の方法。
  70. 請求項６５〜６９のいずれか１項に記載の方法によって得ることが可能な、トランスジェニック植物細胞、植物、植物種子または後代植物。
  71. 請求項６２または６３に記載の植物細胞を含んでなる、トランスジェニック植物または植物種子。
  72. 請求項６２、６３、または６５〜６９のいずれか１項に定義されるようなトランスジェニック植物細胞、第一世代植物、植物種子または後代から得ることが可能な、請求項６２または６３に記載の植物細胞を含んでなる、トランスジェニック植物細胞カルス。
  73. 請求項６２または６３に定義されるような種のものである、請求項７０〜７２のいずれか１項に記載の植物またはカルス。
  74. 請求項７０〜７３のいずれか１項に記載の植物から穀物を収穫し、そして所望により収穫された産物をさらに加工することを含んでなる、穀物を得る方法
  75. 植物が小麦植物であり、かつ収穫された穀物が穀粒であって；所望により、小麦粉または別の穀粒産物へとさらに加工する、請求項７４に記載の方法。
  76. 請求項７４または７５に記載の方法によって得ることが可能な、穀物。
  77. 請求項２５または３０のいずれかに定義されるようなタンパク質を含んでなる、食物。
  78. 請求項２５または３０に定義されるようなタンパク質が、野生型グルテンの代わりに用いられる、請求項７７に記載の食物。
JP2018244398A 2004-04-28 2018-12-27 セリアック病に関連するエピトープ Pending JP2019089770A (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2004201774A AU2004201774A1 (en) 2004-04-28 2004-04-28 Therapeutic Epitopes and Uses Thereof
AU2004201774 2004-04-28
AU2005900650A AU2005900650A0 (en) 2005-02-11 Therapeutic Epitopes and Uses Thereof
AU2005900650 2005-02-11

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2016214973A Division JP2017061493A (ja) 2004-04-28 2016-11-02 セリアック病に関連するエピトープ

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2019089770A true JP2019089770A (ja) 2019-06-13

Family

ID=35242226

Family Applications (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2007510112A Expired - Fee Related JP5946231B2 (ja) 2004-04-28 2005-04-28 セリアック病に関連するエピトープ
JP2013169893A Pending JP2014050386A (ja) 2004-04-28 2013-08-19 セリアック病に関連するエピトープ
JP2015116618A Pending JP2015231991A (ja) 2004-04-28 2015-06-09 セリアック病に関連するエピトープ
JP2016214973A Pending JP2017061493A (ja) 2004-04-28 2016-11-02 セリアック病に関連するエピトープ
JP2018244398A Pending JP2019089770A (ja) 2004-04-28 2018-12-27 セリアック病に関連するエピトープ

Family Applications Before (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2007510112A Expired - Fee Related JP5946231B2 (ja) 2004-04-28 2005-04-28 セリアック病に関連するエピトープ
JP2013169893A Pending JP2014050386A (ja) 2004-04-28 2013-08-19 セリアック病に関連するエピトープ
JP2015116618A Pending JP2015231991A (ja) 2004-04-28 2015-06-09 セリアック病に関連するエピトープ
JP2016214973A Pending JP2017061493A (ja) 2004-04-28 2016-11-02 セリアック病に関連するエピトープ

Country Status (11)

Country Link
US (2) US20080318852A1 (ja)
EP (4) EP2486934A1 (ja)
JP (5) JP5946231B2 (ja)
CN (3) CN1976715B (ja)
AU (1) AU2005237287B2 (ja)
BR (1) BRPI0510274B8 (ja)
CA (2) CA2564521C (ja)
ES (1) ES2648792T3 (ja)
MX (1) MXPA06012322A (ja)
NZ (1) NZ550600A (ja)
WO (1) WO2005105129A2 (ja)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0212885D0 (en) * 2002-06-05 2002-07-17 Isis Innovation Therapeutic epitopes and uses thereof
EP2486934A1 (en) * 2004-04-28 2012-08-15 BTG International Limited Epitopes Related To Coeliac Disease
US10105437B2 (en) * 2004-04-28 2018-10-23 Btg International Limited Epitopes related to coeliac disease
DE102007025291A1 (de) * 2007-05-30 2008-12-04 Euroimmun Ag Verfahren und Immunabsorbentien zur spezifischen Detektion und Absorption Zöliakie- und Dermatitis herpetiformis assoziierter Antikörper
DE102007044673A1 (de) * 2007-09-18 2009-03-19 Zimmer, Klaus-Peter, Prof. Dr. med. Impfstoff zur Behandlung von Zöliakie und Verfahren zur Herstellung des Impfstoffes, Verwendung einer mit einem bakteriellen Toxin konjugierten Peptidsequenz zur Aktivierung des Immunsystems gegen Prolamine sowie Designerpeptid
AU2013204429B9 (en) * 2008-11-30 2017-01-05 Immusant, Inc. Compositions and methods for treatment of celiac disease
US8835603B2 (en) * 2008-11-30 2014-09-16 Immusant, Inc. Agents for the treatment of celiac disease
DE102009045268A1 (de) 2009-10-01 2011-04-07 Charité - Universitätsmedizin Berlin Neue Marker für die Diagnose von Zöliakie
US9517257B2 (en) 2010-08-10 2016-12-13 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Erythrocyte-binding therapeutics
US9518087B2 (en) 2010-08-10 2016-12-13 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Erythrocyte-binding therapeutics
US9850296B2 (en) 2010-08-10 2017-12-26 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Erythrocyte-binding therapeutics
US20140037661A1 (en) * 2011-02-08 2014-02-06 Phadia Ab Wheat Antigens and Peptides for Diagnosis of Wheat Induced Hypersensitivity
ES2402286B1 (es) 2011-09-29 2014-03-04 Universidad De Valladolid Péptido inmunogénico del gluten y sus aplicaciones.
CA3191015A1 (en) * 2012-02-07 2013-08-15 Vibrant Holdings, Llc Substrates, peptide arrays, and methods
EP3043812A1 (en) 2013-09-10 2016-07-20 Immusant Inc. Dosage of a gluten peptide composition
WO2015041680A1 (en) * 2013-09-20 2015-03-26 Immusant, Inc. Compositions and methods related to oat sensitivity
US10953101B2 (en) 2014-02-21 2021-03-23 École Polytechnique Fédérale De Lausanne (Epfl) Glycotargeting therapeutics
US10946079B2 (en) 2014-02-21 2021-03-16 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne Glycotargeting therapeutics
US10046056B2 (en) 2014-02-21 2018-08-14 École Polytechnique Fédérale De Lausanne (Epfl) Glycotargeting therapeutics
EP3909603A1 (en) 2014-02-21 2021-11-17 Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL) Glycotargeting therapeutics
EP3134737A4 (en) 2014-04-24 2018-01-17 Immusant Inc. Methods of diagnosis and treatment of celiac disease in children
WO2016054038A1 (en) 2014-09-29 2016-04-07 Immusant, Inc. Use of hla genetic status to assess or select treatment of celiac disease
AU2015349728A1 (en) 2014-11-21 2017-07-13 Immusant, Inc. Peptides for use in treatment and diagnosis of type 1 diabetes
KR101736744B1 (ko) 2014-12-03 2017-05-17 주식회사 한국유전자정보연구원 셀리악병 진단용 프라이머 세트와 이를 이용한 셀리악병 진단방법
WO2018232176A1 (en) 2017-06-16 2018-12-20 The University Of Chicago Compositions and methods for inducing immune tolerance
EP3524983A1 (de) * 2018-02-08 2019-08-14 R-Biopharm Aktiengesellschaft Verfahren zur quantifizierung von gesamtgluten aus getreide in lebensmittelproben
EP4034144A1 (en) 2019-09-27 2022-08-03 Intrexon Actobiotics NV d/b/a Precigen Actobio Treatment of celiac disease
WO2022115498A1 (en) * 2020-11-26 2022-06-02 Ukko Inc. Modified high molecular weight glutenin subunit and uses thereof
IT202100021194A1 (it) * 2021-08-04 2023-02-04 Agenzia Naz Per Le Nuove Tecnologie Lenergia E Lo Sviluppo Economico Sostenibile Enea Proteina del glutine detossificata per la formulazione di alimenti a fini medici speciali

Family Cites Families (85)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4459355A (en) 1982-07-12 1984-07-10 International Paper Company Method for transforming plant cells
US4536475A (en) 1982-10-05 1985-08-20 Phytogen Plant vector
NL8300698A (nl) 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; agrobacterium tumefaciens bacterien en werkwijze voor het produceren daarvan; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
JPS6047683A (ja) 1983-08-24 1985-03-15 Kirin Brewery Co Ltd プロモ−タ−
US5100792A (en) 1984-11-13 1992-03-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5036006A (en) 1984-11-13 1991-07-30 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US4943674A (en) 1987-05-26 1990-07-24 Calgene, Inc. Fruit specific transcriptional factors
DK162399C (da) 1986-01-28 1992-03-23 Danisco Fremgangsmaade til ekspression af gener i baelgplanteceller, dna-fragment, rekombineret dna-fragment samt plasmid til brug ved udoevelsen af fremgangsmaaden
ES2018274T5 (es) 1986-03-11 1996-12-16 Plant Genetic Systems Nv Celulas vegetales resistentes a los inhibidores de glutamina sintetasa, preparadas por ingenieria genetica.
US5107065A (en) 1986-03-28 1992-04-21 Calgene, Inc. Anti-sense regulation of gene expression in plant cells
US5177010A (en) 1986-06-30 1993-01-05 University Of Toledo Process for transforming corn and the products thereof
US5187073A (en) 1986-06-30 1993-02-16 The University Of Toledo Process for transforming gramineae and the products thereof
NZ221259A (en) 1986-07-31 1990-05-28 Calgene Inc Seed specific transcriptional regulation
EP0267159A3 (de) 1986-11-07 1990-05-02 Ciba-Geigy Ag Verfahren zur genetischen Modifikation monokotyler Pflanzen
US4866247A (en) 1986-12-11 1989-09-12 The Lincoln Electric Company Apparatus and method of short circuiting arc welding
US4971908A (en) 1987-05-26 1990-11-20 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase
US5356799A (en) 1988-02-03 1994-10-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Antisense gene systems of pollination control for hybrid seed production
US5371014A (en) 1988-02-12 1994-12-06 Daicel Chemical Industries, Ltd. Process for the production of optically active 2-hydroxy acid esters using microbes to reduce the 2-oxo precursor
US5179022A (en) 1988-02-29 1993-01-12 E. I. Du Pont De Nemours & Co. Biolistic apparatus for delivering substances into cells and tissues in a non-lethal manner
US5614395A (en) 1988-03-08 1997-03-25 Ciba-Geigy Corporation Chemically regulatable and anti-pathogenic DNA sequences and uses thereof
US5250515A (en) 1988-04-11 1993-10-05 Monsanto Company Method for improving the efficacy of insect toxins
US5565346A (en) 1988-07-27 1996-10-15 Calgene, Inc. Transformation and regeneration system for legumes
US5428146A (en) 1988-11-07 1995-06-27 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Wound-stimulated DNA-sequence from solanum tuberosum and its use
US5110732A (en) 1989-03-14 1992-05-05 The Rockefeller University Selective gene expression in plants
US5086169A (en) 1989-04-20 1992-02-04 The Research Foundation Of State University Of New York Isolated pollen-specific promoter of corn
US5629183A (en) 1989-05-08 1997-05-13 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Plant transformation by gene transfer into pollen
US5097025A (en) 1989-08-01 1992-03-17 The Rockefeller University Plant promoters
US7705215B1 (en) 1990-04-17 2010-04-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US5550318A (en) 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
JPH05501352A (ja) 1989-08-09 1993-03-18 ディカルブ　ジェネティクス　コーポレイション 安定な形質転換稔性単子葉植物およびそれらの細胞を製造するための方法および組成物
US4919813A (en) 1989-08-25 1990-04-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Energy Photoenhanced anaerobic digestion of organic acids
EP0497884B1 (en) 1989-10-27 2004-04-28 The Salk Institute For Biological Studies Glutamate receptor compositions and methods
US5589583A (en) 1990-01-11 1996-12-31 Monsanto Company Plant promoter
HU220773B1 (hu) 1990-01-22 2002-05-28 Dekalb Genetics Corporation Eljárás termő transzgenikus kukoricanövények előállítására
US5484956A (en) 1990-01-22 1996-01-16 Dekalb Genetics Corporation Fertile transgenic Zea mays plant comprising heterologous DNA encoding Bacillus thuringiensis endotoxin
EP0442174A1 (en) 1990-02-13 1991-08-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Stable transformation of plant cells
US5618988A (en) 1990-03-02 1997-04-08 Amoco Corporation Enhanced carotenoid accumulation in storage organs of genetically engineered plants
US5204253A (en) 1990-05-29 1993-04-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method and apparatus for introducing biological substances into living cells
US5187267A (en) 1990-06-19 1993-02-16 Calgene, Inc. Plant proteins, promoters, coding sequences and use
AU655197B2 (en) 1990-06-25 1994-12-08 Monsanto Technology Llc Glyphosate tolerant plants
NZ239977A (en) 1990-11-14 1993-08-26 Pioneer Hi Bred Int Transforming plants by the use of agrobacterium
US5932782A (en) 1990-11-14 1999-08-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant transformation method using agrobacterium species adhered to microprojectiles
EP0559742A1 (en) 1990-11-26 1993-09-15 E.I. Du Pont De Nemours And Company Herbicidal oxazine ethers
US5459252A (en) 1991-01-31 1995-10-17 North Carolina State University Root specific gene promoter
EP0570422B1 (en) 1991-02-07 2007-12-19 Bayer BioScience N.V. Stamen-specific promoters from corn
IL101508A0 (en) 1991-04-08 1992-12-30 Rhone Poulenc Agrochimie Chimeric plant genes based on upstream regulatory elements of helianthinin
DE69232132T3 (de) 1991-05-15 2008-08-14 Monsanto Technology Llc. Verfahren zur schöpfung einer transformierten reispflanze
WO1993004178A1 (en) 1991-08-23 1993-03-04 University Of Florida A novel method for the production of transgenic plants
WO1994000977A1 (en) 1992-07-07 1994-01-20 Japan Tobacco Inc. Method of transforming monocotyledon
NZ257181A (en) 1992-10-29 1997-07-27 Medical Res Council Transcription factor dp-1, dna, vectors and host cells therefor
US5389226A (en) 1992-12-17 1995-02-14 Amorphous Technologies International, Inc. Electrodeposition of nickel-tungsten amorphous and microcrystalline coatings
TW360548B (en) 1993-04-08 1999-06-11 Powderject Res Ltd Products for therapeutic use
WO1994025613A1 (en) 1993-05-03 1994-11-10 Cornell Research Foundation, Inc. Isolated dna elements that direct pistil-specific and anther-specific gene expression and methods of using same
US5670349A (en) 1993-08-02 1997-09-23 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. HMG2 promoter expression system and post-harvest production of gene products in plants and plant cell cultures
EP0672752B1 (en) 1993-09-03 2004-05-26 Japan Tobacco Inc. Method of transforming monocotyledon by using scutellum of immature embryo
US5495007A (en) 1994-04-29 1996-02-27 Thompson; Gary A. Phloem-specific promoter
US5633363A (en) 1994-06-03 1997-05-27 Iowa State University, Research Foundation In Root preferential promoter
US5646333A (en) 1994-09-02 1997-07-08 Drexel University Plant promoter useful for directing the expression of foreign proteins to the plant epidermis
HUT76355A (en) 1995-11-24 1997-08-28 Bay Zoltan Alkalmazott Kutatas Plant gene-expression vector family based on dna fragments regulating alfalfa h3 histon gene variant (ms h3g1)
US6036983A (en) * 1996-05-20 2000-03-14 Novo Nordisk A/S Method of obtaining protein hydrolysates
CA2257972A1 (en) 1996-06-13 1997-12-18 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Plant proteins
GB9624456D0 (en) 1996-11-25 1997-01-15 Isis Innovation Assay method
US5959175A (en) 1997-04-09 1999-09-28 Thomas; Terry L. Sunflower albumin 5' regulatory region for the modification of plant seed lipid composition
US5977436A (en) 1997-04-09 1999-11-02 Rhone Poulenc Agrochimie Oleosin 5' regulatory region for the modification of plant seed lipid composition
ES2132025B1 (es) 1997-06-12 2000-12-01 Consejo Superior Investigacion Proteinas urag de las plantas.
EP0905518A1 (en) 1997-09-23 1999-03-31 Academisch Ziekenhuis Leiden Peptides specific for gluten-sensitive T-cells and use thereof
US6100450A (en) 1997-10-22 2000-08-08 Rhone-Poulenc Agrochimie Seed specific promoters based on arabidopsis genes
US6232445B1 (en) * 1997-10-29 2001-05-15 Sunol Molecular Corporation Soluble MHC complexes and methods of use thereof
EP1068334A2 (en) 1998-04-09 2001-01-17 E.I. Du Pont De Nemours And Company Cell cycle regulatory proteins cdc-16, dp-1, dp-2 and e2f from plants
WO1999058681A2 (en) 1998-05-08 1999-11-18 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Transgenic plant cells expressing a recombinant plant e2f peptide
AU3230200A (en) 1999-02-12 2000-08-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Transgenic plants with modified expression of the dp protein
GB9923306D0 (en) * 1999-10-01 1999-12-08 Isis Innovation Diagnostic and therapeutic epitope, and transgenic plant
MXPA03009313A (es) 2001-04-12 2004-11-12 Academish Ziekenhuis Leiden Metodos y medios para uso de receptores de celulas t restringidos por hla-dq y peptidos derivados de prolamina unidos a hla-dq.
EP1332760A1 (en) * 2002-02-04 2003-08-06 Academisch Ziekenhuis Leiden Novel epitopes for celiac disease and autoimmune diseases, methods for detecting those and novel non-antigenic food compounds
US7320788B2 (en) 2002-02-14 2008-01-22 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Enzyme treatment of foodstuffs for Celiac Sprue
DK1572127T4 (da) * 2002-02-14 2014-11-24 Univ Leland Stanford Junior Enzymbehandling af fødevarer til cøliaki
WO2003096979A2 (en) * 2002-05-14 2003-11-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Drug therapy for celiac sprue
US7202216B2 (en) * 2002-05-14 2007-04-10 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Drug therapy for celiac sprue
GB0212885D0 (en) 2002-06-05 2002-07-17 Isis Innovation Therapeutic epitopes and uses thereof
DK1563300T3 (da) * 2002-11-20 2012-07-23 Univ Leland Stanford Junior Diagnostisk fremgangsmåde til cøliaki
EP1424342A1 (en) * 2002-11-27 2004-06-02 BakeMark Deutschland GmbH Nucleic acid comprising a sequence encoding a modified glutenin polypeptide
US6992916B2 (en) * 2003-06-13 2006-01-31 Taiwan Semiconductor Manufacturing Co., Ltd. SRAM cell design with high resistor CMOS gate structure for soft error rate improvement
EP2486934A1 (en) * 2004-04-28 2012-08-15 BTG International Limited Epitopes Related To Coeliac Disease
US8835603B2 (en) 2008-11-30 2014-09-16 Immusant, Inc. Agents for the treatment of celiac disease

Also Published As

Publication number Publication date
JP2014050386A (ja) 2014-03-20
AU2005237287A1 (en) 2005-11-10
JP2017061493A (ja) 2017-03-30
MXPA06012322A (es) 2007-01-31
EP1755639A2 (en) 2007-02-28
CA2960504A1 (en) 2005-11-10
EP2486935B1 (en) 2021-04-07
US20080318852A1 (en) 2008-12-25
CN1976715A (zh) 2007-06-06
EP2486935A1 (en) 2012-08-15
JP5946231B2 (ja) 2016-07-05
CA2564521C (en) 2017-04-11
US9017690B2 (en) 2015-04-28
WO2005105129A2 (en) 2005-11-10
EP2412380B1 (en) 2021-01-06
EP2486934A1 (en) 2012-08-15
BRPI0510274B1 (pt) 2020-11-03
CN102430111B (zh) 2018-03-02
JP2008508856A (ja) 2008-03-27
WO2005105129A3 (en) 2006-07-06
CN104056251A (zh) 2014-09-24
JP2015231991A (ja) 2015-12-24
BRPI0510274A (pt) 2007-10-30
ES2648792T3 (es) 2018-01-08
CA2564521A1 (en) 2005-11-10
ES2648792T8 (es) 2019-09-30
EP1755639B1 (en) 2017-08-16
CN1976715B (zh) 2014-07-30
US20130078267A1 (en) 2013-03-28
AU2005237287B2 (en) 2011-08-11
BRPI0510274B8 (pt) 2021-05-25
CN102430111A (zh) 2012-05-02
NZ550600A (en) 2010-03-26
CN104056251B (zh) 2019-09-17
EP2412380A1 (en) 2012-02-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2019089770A (ja) セリアック病に関連するエピトープ
US20190008951A1 (en) Epitopes Related To Coeliac Disease
AU2016273885C9 (en) Epitopes related to coeliac disease
ANDERSON et al. Sommaire du brevet 2960504
ZA200608924B (en) Epitopes related to coeliac disease
ANDERSON et al. Patent 2960504 Summary

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20190128

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20190128

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20190808

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20191204

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20200303

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20200728