CN110470845A - 幽门螺旋杆菌CagL蛋白检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种幽门螺旋杆菌CagL蛋白检测试剂盒及其检测方法，试剂盒在微孔板上包被鼠单克隆CagL抗体，配以家兔多克隆CagL抗体以及HRP标记的山羊抗家兔IgG抗体，采用双抗体夹心法原理检测待检样本中的CagL蛋白；本发明为幽门螺旋杆菌的快速诊断以及综合诊治提供了一种方便、有效的工具，有着较广的应用前景，值得临床进一步研究推广。
Description
技术领域
本发明涉及一种纳试剂盒，具体涉及幽门螺旋杆菌CagL蛋白检测试剂盒及其检测方法，属于医药生物技术领域。
背景技术
幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylor,Hp)是人类胃部疾病的重要致病菌，具有很高的感染性，全球的感染率达到了50％；幽门螺旋杆菌是一种革兰氏阴性螺旋状杆菌，在胃上皮细胞定居繁殖。感染幽门螺旋杆菌后不仅是慢性胃炎、消化道溃疡的主要病原菌，也是引起胃癌的危险因子，而且还与胃外许多疾病相关。因此，幽门螺旋杆菌感染的诊断日益引起许多国家和地区的重视。
实验室诊断检测幽门螺旋杆菌感染的方法很多，包括传统的用病理标本的直接镜检、活体组织细菌培养和尿素酶试验等，但是这些方法均属于侵入性创伤性检查，给患者造成的痛苦大，不易被患者和家属接受。而近年来的研究热点多集中在应用免疫学、基因学和蛋白质组学方法。
CagL蛋白是HP的一种伴侣蛋白，是HPⅣ型分泌系统的一种表面蛋白，由hp0539基因序列编码，在启动异常细胞通路引起病理性的临床改变上都起到了重要的作用。
发明内容
本发明针对上述问题提出了一种幽门螺旋杆菌CagL蛋白检测试剂盒及其检测方法。
具体的技术方案如下：
幽门螺旋杆菌CagL蛋白检测试剂盒,在微孔板上包被鼠单克隆CagL抗体，配以家兔多克隆CagL抗体以及HRP标记的山羊抗家兔IgG抗体，采用双抗体夹心法原理检测待检样本中的CagL蛋白。
进一步的，试剂盒的组成成份包括：已包被CagL蛋白单克隆抗体的96孔的微孔板、家兔多克隆CagL蛋白抗体、HRP标记的山羊抗家兔IgG抗体、阳性对照品、阴性对照品、包被缓冲液、浓缩洗涤液、底物A、底物B和终止液。
进一步的，已包被CagL蛋白单克隆抗体的96孔的微孔板的制备方法为：用包被缓冲液将CagL单克隆抗体稀释至1:32000，加入96孔的微孔板，每孔100ul，4℃过夜，次日PBST洗板3次，每次5min，最后拍干。
进一步的，阳性对照品为CagL蛋白。
进一步的，阴性对照品为质量分数1％的BSA。
进一步的，包被缓冲液为PH9.6的碳酸盐缓冲液CBS。
进一步的，缩洗涤液为PBST缓冲液。
进一步的，底物A为过氧化氢。
进一步的，底物B为四甲基联苯胺。
进一步的，终止液为2M H2SO4。
进一步的，使用上述试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
1)包被：用包被缓冲液将CagL单克隆抗体稀释至1:32000，加入96孔微孔板，每孔100ul，4℃过夜，次日PBST洗板3次，每次5min，最后拍干；
2)封闭：加入质量分数为5％的脱脂奶粉，每孔200μL，37℃温育2h；
3)洗涤：弃封闭液，用PBST缓冲液洗板3次，每次5min，最后拍干；
4)加待检样本：每孔加入100ul待检标本，同时加入阴性对照品和阳性对照品各100ul,37℃孵育1h；
5)洗涤：弃液体，用PBST缓冲液洗板3次，每次5min，最后拍干；
6)加多抗：用CBS将家兔多克隆CagL抗体稀释至1：32000，加入微孔板，每孔100ul，37℃温育1h；
7)洗涤：弃液体，用PBST缓冲液洗板3次，每次5min，最后拍干；
8)加酶标二抗：每孔加入1:4000倍稀释的HRP标记的山羊抗家兔IgG抗体100μL，37℃孵育1h；
9)洗涤：弃液体，用PBST缓冲液洗板3次，每次5min，最后拍干；
10)显色：每孔加入50μL底物A和底物B，37℃显色20min；
11)终止反应：每孔加入50μL 2MH2SO4终止液；
12)测定OD450/620nm：酶标仪测定波长为450/620nm时的OD值；
13)判断：样本检测到的OD450/620nm值〉阴性样本的OD450/620nm均值(X)±3SD时,则可以判定其为阳性。
进一步的，步骤13)中的均值X＝0.023 SD＝0.0102；X±3SD＝0.0536。
进一步的，试剂盒的检测样本为人粪便标本，取黄豆粒大小至400ul生理盐水中振荡混匀。
进一步的，试剂盒应用与检测幽门螺旋杆菌。
本发明的有益效果为：
首先试剂盒的检测样本为人粪便标本，样本取材方便快捷，不需要侵入性检查，适合所有年龄段的人群，患者配合度较高,尤其适用于婴幼儿检测，并可作为远期根治疗效的评价指标；
其次，与传统的侵入性方法(胃粘膜细菌培养法、RUT、组织切片染色、PCR检测)以及非侵入性方法(13C、14C尿素呼气试验)相比，该方法不需要特殊的仪器设备以及昂贵的试剂，且该方法操作比较简便，对操作者的专业技术要求不是太高；与幽门螺旋杆菌抗体检测法相比，不存在窗口期一说，根据检测结果即可判断是否感染；
再次本试剂盒的敏感性、特异性、重复性、稳定性都比较好，符合试剂盒的一般要求。
因此，本发明双抗体夹心法的建立，为幽门螺旋杆菌的快速诊断以及综合诊治提供了一种方便、有效的工具。该方法有着较广的应用前景，值得临床进一步研究推广。
附图说明
图1为实施例八中三个批试剂盒检测6种不同菌种的结果图；
图2为实施例九中的稳定性试验结果图。
具体实施方式
为使本发明的技术方案更加清晰明确，下面对本发明进行进一步描述，任何对本发明技术方案的技术特征进行等价替换和常规推理得出的方案均落入本发明保护范围。
实施例一
幽门螺旋杆菌CagL蛋白检测试剂盒,在微孔板上包被鼠单克隆CagL抗体，配以家兔多克隆CagL抗体以及HRP标记的山羊抗家兔IgG抗体，采用双抗体夹心法原理检测待检样本中的CagL蛋白。
其中：
家兔多克隆CagL抗体的制备方法为：采用新西兰白兔皮下注射，初次免疫0.5mg/ml的CagL蛋白与等体积完全弗氏佐剂混合，背部皮下多点注射，每只2ml；14天后进行二次免疫取0.5mg/ml的CagL蛋白与不完全弗氏佐剂混合，背部皮下注射，每只2ml；21天后进行第三次免疫，方法同二免，但降低注射量，每只1ml；28天后加强免疫，耳缘静脉注射0.5mg/ml的CagL蛋白1ml；后每隔3天加强免疫一次；加强免疫3次后，耳缘静脉采血检测效价。达到效价则进行心脏采血；之后用IgG抗体纯化试剂盒对所采集的血清进行纯化；之后进行多克隆抗体效价测定，本实施例中的效价达到1:32000。
HRP标记的山羊抗家兔IgG抗体购自北京全式金生物制品公司，批号为L20316。
进一步的，试剂盒的组成成份包括：已包被CagL蛋白单克隆抗体的96孔的微孔板、家兔多克隆CagL蛋白抗体、HRP标记的山羊抗家兔IgG抗体、阳性对照品、阴性对照品、包被缓冲液、浓缩洗涤液、底物A、底物B和终止液。
已包被CagL蛋白单克隆抗体的96孔的微孔板的制备方法为：用包被缓冲液将CagL单克隆抗体稀释至1:32000，加入96孔的微孔板，每孔100ul，4℃过夜，次日PBST洗板3次，每次5min，最后拍干。
阳性对照品为CagL蛋白；
阴性对照品为1％BSA；
包被缓冲液为PH9.6的CBS；
缩洗涤液为PBST缓冲液；
底物A为过氧化氢；
底物B为四甲基联苯胺；
终止液为2M H2SO4。
其中，CagL单克隆抗体的制备方法如下：
用原核表达并纯化的CagL融合蛋白免疫BALB/c小鼠，用400μg/mLCagL融合蛋白与等体积完全弗氏佐剂混合乳化，注射于6周龄雌性BALB/c小鼠颈背部皮下，每只0.4mL；两周后用等体积不完全弗氏佐剂免疫，剂量及途径不变；1周后抗原量降为200μg/mL进行免疫接种；1周后小鼠腹腔注射100μg/mL CagL蛋白，每只0.1mL；3d后间接ELISA法检测多抗效价，效价达到预期状态时再进行末次尾静脉加强免疫1次，3d后进行融合。
取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，经亚克隆筛选获得阳性杂交瘤细胞株。
活体制备小鼠骨髓瘤SP2/0细胞，将1×106SP2/0细胞接种在6～8周龄正常雌性BALB/c小鼠背部皮下两侧，大约10～15d后注射部位长出实体瘤，无菌取出实体瘤用于融合实验。将末次加强免疫的小鼠脾细胞与实体瘤SP2/0细胞在PEG的作用下进行融合，融合10d后筛选阳性杂交瘤细胞，再用有限稀释法经3次亚克隆筛选出能稳定分泌目的蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并扩大培养和及时冻存。
CagL蛋白的制备方法如下：
利用大肠杆菌表达系统表达外源基因；将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质。
首先进行原核表达载体pET-28a(+)-cagL的构建与鉴定，将原核表达载体pET-28a(+)和TA克隆鉴定阳性的质粒pGEM-T-cagL分别经BamH I和xho I双酶切后,回收酶切片段,紫外分光光度法进行定量和纯度分析。载体消化片段和目的片段以摩尔比1:5的比例混合,用T4DNA连接酶16℃连接过夜"将连接产物转化感受态细菌E.coli BL21(DE3),转化好的细菌涂布含卡那霉素(50ug/mL)的LB琼脂培养基培养12一16h,挑选单菌落接种于含卡那霉素(50ug/mL)的LB液体培养基中,置37℃摇床振荡培养12h,碱裂解法抽提质粒,用BamH I和xho I进行双酶切鉴定。
然后进行目的蛋白的诱导表达与鉴定，将鉴定为阳性的重组工程菌接种于3m1LB培养基中(含50mg/L卡那酶素),37℃振荡培养过夜,取上述培养物按1:100体积接种于新鲜LB培养基(含50mg/L卡那酶素),37℃振荡培养至OD600为0.5-0.6时,加IPTG至终浓度为1mmol/L,30℃继续培养，收集诱导2-5h的菌液,采用SDS-PAGE分析融合蛋白的表达,以空载体PET28a(+)转化菌E.coliBL21(DE3)诱导后为阴性对照,并用westemblot鉴定表达蛋白。
最后采用过柱法进行目的蛋白的纯化，用SDS-PAGE检测纯化后蛋白的纯度。
实施例二
基于实施例一的试剂盒，作为对本发明的进一步改进，提供了该试剂盒的检测方法：
试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
1)包被：用包被缓冲液将CagL单克隆抗体稀释至1:32000，加入96孔微孔板，每孔100ul，4℃过夜，次日PBST洗板3次，每次5min，最后拍干；
2)封闭：加入5％脱脂奶粉，每孔200μL，37℃温育2h；
3)洗涤：弃封闭液，用PBST缓冲液洗板3次，每次5min，最后拍干；
4)加待检样本：每孔加入100ul待检标本，同时加入阴性对照品和阳性对照品各100ul,37℃孵育1h；
5)洗涤：弃液体，用PBST缓冲液洗板3次，每次5min，最后拍干；
6)加多抗：用CBS将家兔多克隆CagL抗体稀释至1：32000，加入微孔板，每孔100ul，37℃温育1h；
7)洗涤：弃液体，用PBST缓冲液洗板3次，每次5min，最后拍干；
8)加酶标二抗：每孔加入1:4000倍稀释的HRP标记的山羊抗家兔IgG抗体100μL，37℃孵育1h；稀释方法为每100mlPBS中加入牛血清白蛋白1g；
9)洗涤：弃液体，用PBST缓冲液洗板3次，每次5min，最后拍干；
10)显色：每孔加入50μL底物A和底物B，37℃显色20min；
11)终止反应：每孔加入50μL 2M H2SO4终止液；
12)测定OD450/620nm：酶标仪测定波长为450/620nm时的OD值。
判断方法为：样本检测到的OD450/620nm值〉0.0536时,则可以判定其为阳性。
在本实施例中，试剂盒的检测样本为CagL蛋白。
实施例三
基于实施例二的检测方法，在本实施例中，试剂盒的检测样本为幽门螺旋杆菌，并通过酶标仪测定波长为450/620nm时的OD值。
判断方法为：样本检测到的OD450/620nm值〉0.0536时,则可以判定其为阳性。
其制备方法为：选取生长良好的幽门螺旋杆菌菌株，加入生理盐水调至混悬菌液，最低调至OD为1.0。
20份阴性样本的检测值见下表：
不同浓度菌液的检测值
实施例四
基于实施例二的检测方法，在本实施例中，试剂盒的检测样本为人粪便标本，取黄豆粒大小至400ul生理盐水中振荡混匀。
判断方法为：样本检测到的OD450/620nm值〉0.0536时,则可以判定其为阳性，准确性可达99％以上。
实施例五
用同一批试剂盒(试剂盒A)的3块酶标板来检测10份样本，计算批内变异系数，结果如下：
由上表可知，批内变异系数在1.65％～10.5％之间，实验结果说明ELISA试剂盒的批内重复性良好。
实施例六
用三个不同批次的试剂盒(试剂盒A、试剂盒B、试剂盒C)对10份样本进行检测，计算批间变异系数，结果如下：
由上表可知，批间变异系数在1.3％～9.35％之间，本研究的实验结果说明自制的ELISA试剂盒的批间重复性良好。
实施例七
敏感性试验：采用已知浓度的CagL重组蛋白作为抗原，将抗原进行倍比稀释，根据ELISA双抗夹心法操作步骤，最终检测OD450/620nm处的吸光度值，根据不同稀释倍数时的吸光度值与阴阳性临界值进行判定，从而得出最低的检出浓度,结果见下表：
由上表可知，当倍比稀释到1:80时，检测的吸光度值>0.5，且P/N>2.1；而稀释至1:160时，检测的吸光度值<0.5，且P/N<2.1，结果判读为阴性。因此选取1:80为最大稀释倍数，此时该方法判读的最低蛋白浓度为9.75ug/ml。
实施例八
特异性试验，本实验研制的试剂盒的检测样本主要是针对人粪便标本，因粪便标本中包含较多种类的病原菌，而常见的病原菌主要有大肠埃希菌、志贺菌(鲍氏、志贺)小肠结肠炎耶尔森菌、白假丝酵母菌、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌。因此本研究选取了临床常见的几种菌种和幽门螺杆菌进行比较，分别挑取各种菌落制成OD＝1.0的菌液，作为检测样本，利用同一试剂盒进行检测，看结果是否存在交叉反应，结果如图1所示。
从图1中看出除了幽门螺杆菌呈现阳性结果，其余几种菌种的检测结果均为阴性，表明其他菌与幽门螺杆菌没有交叉反应，该试剂盒的特异性较好。
实施例九
稳定性试验，将包被好的酶标板分别存放于37℃和4℃，每隔15d取出试剂盒对相同样本进行检测，连续进行105天，连续观测其吸光度值的变化，来判断存储条件对试剂盒的影响，结果见图2。
从图2中可以看出该试剂盒在105d内在4℃和37℃的环境下，测得的P/N值均大于2.1，满足了该试剂盒的判断标准。在15-75d时试剂盒检测效果变化不明显，而75d之后出现了检测效果一个比较大的变化，可见随着时间的不断推移试剂盒的检测效果逐降低，因此建议试剂盒尽量提早使用。
Claims (10)
1.幽门螺旋杆菌CagL蛋白检测试剂盒,其特征为，试剂盒在微孔板上包被鼠单克隆CagL抗体，配以家兔多克隆CagL抗体以及HRP标记的山羊抗家兔IgG抗体，采用双抗体夹心法原理检测待检样本中的CagL蛋白。
2.如权利要求1所述的幽门螺旋杆菌CagL蛋白检测试剂盒,其特征为，试剂盒的组成成份包括：已包被CagL蛋白单克隆抗体的96孔的微孔板、家兔多克隆CagL蛋白抗体、HRP标记的山羊抗家兔IgG抗体、阳性对照品、阴性对照品、包被缓冲液、浓缩洗涤液、底物A、底物B和终止液。
3.如权利要求2所述的幽门螺旋杆菌CagL蛋白检测试剂盒,其特征为，已包被CagL蛋白单克隆抗体的96孔的微孔板的制备方法为：用包被缓冲液将CagL单克隆抗体稀释至1:32000，加入96孔的微孔板，每孔100ul，4℃过夜，次日PBST洗板3次，每次5min，最后拍干。
4.如权利要求2或3所述的幽门螺旋杆菌CagL蛋白检测试剂盒,其特征为，阳性对照品为CagL蛋白。
5.如权利要求4所述的幽门螺旋杆菌CagL蛋白检测试剂盒,其特征为，阴性对照品为1％BSA。
6.如权利要求5所述的幽门螺旋杆菌CagL蛋白检测试剂盒,其特征为，包被缓冲液为PH9.6的CBS；缩洗涤液为PBST缓冲液。
7.如权利要求6所述的幽门螺旋杆菌CagL蛋白检测试剂盒,其特征为，底物A为过氧化氢；底物B为四甲基联苯胺；终止液为2M H2SO4。
8.使用上述任一权利要求所述的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
1)包被：用包被缓冲液将CagL单克隆抗体稀释至1:32000，加入96孔微孔板，每孔100ul，4℃过夜，次日PBST洗板3次，每次5min，最后拍干；
2)封闭：加入5％脱脂奶粉，每孔200μL，37℃温育2h；
3)洗涤：弃封闭液，用PBST缓冲液洗板3次，每次5min，最后拍干；
4)加待检样本：每孔加入100ul待检标本，同时加入阴性对照品和阳性对照品各100ul,37℃孵育1h；
5)洗涤：弃液体，用PBST缓冲液洗板3次，每次5min，最后拍干；
6)加多抗：用CBS将家兔多克隆CagL抗体稀释至1：32000，加入微孔板，每孔100ul，37℃温育1h；
7)洗涤：弃液体，用PBST缓冲液洗板3次，每次5min，最后拍干；
8)加酶标二抗：每孔加入1:4000倍稀释的HRP标记的山羊抗家兔IgG抗体100μL，37℃孵育1h；
9)洗涤：弃液体，用PBST缓冲液洗板3次，每次5min，最后拍干；
10)显色：每孔加入50μL底物A和底物B，37℃显色20min；
11)终止反应：每孔加入50μL2M H2SO4终止液；
12)测定OD450/620nm：酶标仪测定波长为450/620nm时的OD值。
9.如权利要求8所述的试剂盒的检测方法，其特征为，样本的判断方法为：样本检测到的OD450/620nm值〉阴性样本的OD450/620nm均值(X)+3SD时,则可以判定其为阳性。
10.如权利要求9所述的试剂盒的检测方法，其特征为，试剂盒应用与检测幽门螺旋杆菌。
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