CN113504092A - 一种幽门螺杆菌染色试剂盒及应用 - Google Patents
一种幽门螺杆菌染色试剂盒及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种幽门螺杆菌染色试剂盒及应用。本发明的试剂盒包括过氧化物酶封闭剂、幽门螺杆菌单克隆抗体、鼠抗或兔抗Linker、酶标羊抗鼠/兔聚合物、DAB显色底物、DAB显色缓冲液、苏木素复染液、返蓝液、弱酸盐缓冲液和伊红染色液。该试剂盒能够同时满足免疫组化染色和常规HE染色需求，显著增加单张片子的信息量；并且，该试剂盒增加了弱酸盐缓冲液，适用于全自动免疫组化机。采用该试剂盒进行病理组织染色，可实现高通量全自动化机载染色，大大降低人力、时间成本。试验证明，该试剂盒提高了幽门螺杆菌染色的灵敏度和特异性，降低了假阳性和假阴性的发生几率，进而提高结果的重复性和判读的准确性，具有良好的应用前景和高度社会经济价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种幽门螺杆菌染色试剂盒及应用。
背景技术
胃癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一，居消化系统恶性肿瘤之首，生存率低，预后差。而幽门螺杆菌被证实是引起胃癌的重要致癌因子；幽门螺杆菌(HP)感染首先引起慢性胃炎并导致胃溃疡和胃萎缩，严重者可发展为胃癌。因此，临床上对HP进行准确检测显得尤为重要。
幽门螺杆菌是一种单极、多鞭毛、末端钝圆、螺旋形弯曲的细菌。长2.5～4.0μm，宽0.5～1.0μm.革兰染色阴性。有动力。在胃粘膜上皮细胞表面常呈典型的螺旋状或弧形。在固体培养基上生长时，除典型的形态外，有时可出现杆状或圆球状。目前，检测幽门螺杆菌的方法有很多种，例如C13/C14呼气实验、血清抗体检测、基因检测和胃镜活检等，各种检测方法各有其优缺点。尽管C13/14检测方便快速，但是会出现假阴性；而血清抗体检测存在一定的滞后性，很有可能会测出假阳性，还需二次检查。要诊断幽门螺杆菌感染，胃镜下黏膜活检是最可靠的方法，不但可以窥见上消化道有无炎症、糜烂、溃疡或新生物等，而且可以做幽门螺杆菌培养、涂片或切片染色等组织学检查。
胃镜活检标本的病理检测一般流程是先进行HE染色，依据组织病变情况再做特殊染色或者免疫组化染色，以便更详细观察幽门螺杆菌感染情况。显微镜下可通过HE切片观察幽门螺杆菌感染情况，但对诊断医生经验要求更高并且没有免疫组化或特染实验结果准确。同时，先做HE再做免疫组化或者特染，出报告时间至少2-3天，时间长，对患者会造成一定的经济和精神负担。免疫组化染色是一个高敏感和特异的染色方法，它是组织学检测的“金标准”。然而，胃镜标本比较小，可切片数量较少。如何做到同一样本同时进行两种检测，成为提高诊断效率的重要因素。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种幽门螺杆菌染色试剂盒，该试剂盒能够同时满足免疫组化染色和常规HE染色需求，显著增加单张片子的信息量，且适用于全自动免疫组化机，省时高效。
本发明的第二个目的在于提供上述试剂盒的应用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种幽门螺杆菌染色试剂盒，包括如下组分：过氧化物酶封闭剂、幽门螺杆菌单克隆抗体、、鼠抗或兔抗Linker,、酶标羊抗鼠/兔聚合物、DAB显色底物、DAB显色缓冲液、苏木素复染液、返蓝液、弱酸盐缓冲液和伊红染色液。
通常情况下，HE染色后再进行免疫组化操作，实验时间长，可检测标本数量有限，本发明的试剂盒有效的将免疫组化试剂和HE检测试剂组合，能够同时满足免疫组化染色和常规HE染色需求，显著增加单张片子的信息量；并且，本发明对试剂盒进行了改进，增加了弱酸盐缓冲液，使其适用于全自动免疫组化机，可同时对批量样本进行高通量机载染色，省时高效。使用弱酸盐缓冲液对返蓝后的载玻片进行冲洗，避免了常规TBS碱性清洗液pH对偏酸性伊红染色剂染色的影响，使其不仅可以在滴染状态下实现组织的良好着色，同时染色玻片及加样探针便于清洗，避免玻片背景着色，降低了伊红试剂污染探针的几率，从而实现幽门螺杆菌的机载染色，染色结果可同时满足免疫组化阳性着色位点判读和HE形态辨识的双重需求，提高了活检样本蜡块的使用效率。
优选的，所述幽门螺杆菌单克隆抗体为兔抗人幽门螺旋杆菌单克隆抗体，克隆号EP279。
优选的，所述弱酸盐缓冲液为醋酸钠缓冲液或柠檬酸钠缓冲液。
优选的，所述返蓝液为0.1-10％％氨水溶液。
优选的，所述试剂盒适用于全自动免疫组化染色机。
本发明还提供了上述试剂盒在病理组织染色中的应用。
采用本发明的试剂盒进行病理组织染色，可实现高通量全自动化机载染色，大大降低人力、时间成本，显著提高效率，能够当天取材当天出结果，减少患者等待时间。同时，试验证明，本发明的试剂盒提高了幽门螺杆菌染色的灵敏度和特异性，降低了假阳性和假阴性的发生几率，进而提高结果的重复性和判读的准确性，具有良好的应用前景和高度社会经济价值。
优选的，所述病理组织包括胃镜活检标本。
优选的，所述应用包括如下步骤：
1)烤片：将切片放入摊片烤片机烤片；
2)机载染色：将幽门螺杆菌染色试剂盒装载于全自动免疫组化染色机进行染色；
3)脱水、透明、封片。
进一步优选的，步骤2)机载染色的染色程序包括如下步骤：
a)机载脱蜡并进行抗原修复，机载清洗液清洗；
b)过氧化物酶封闭，机载清洗液清洗；
c)幽门螺杆菌单克隆抗体孵育，机载清洗液清洗；
d)鼠抗或兔抗Linker孵育，机载清洗液清洗；
e)酶标羊抗鼠/兔聚合物孵育，机载清洗液，去离子水清洗；
f)DAB显色，去离子水清洗；
g)渐行式苏木素复染，去离子水清洗；
h)氨水返蓝，机载清洗液清洗；
i)弱酸盐缓冲液清洗；
j)伊红染色，去离子水清洗。
优选的，步骤a)中过氧化物酶封闭5min；步骤b)中幽门螺杆菌单克隆抗体孵育30min；步骤c)中一鼠抗或兔抗Linker孵育20min；步骤d)中酶标羊抗鼠/兔聚合物孵育20min；步骤e)中DAB显色6min；步骤f)中渐行式苏木素复染1min；步骤g)中氨水返蓝20s；步骤i)中伊红染色1min。
进一步优选的，所述机载清洗液清洗为TBS缓冲液。
附图说明
图1为实施例2的机载染色结果图；
图中，箭头所指为棕色的点状或是条状的幽门螺杆菌，红色细胞质着色部位为伊红染色，蓝紫色为苏木素着色。
图2为对比例1的HE染色结果图；
图3为对比例2的机载染色结果图。
图中，箭头所指为幽门螺杆菌，呈棕色点状或条状。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此；实施例中涉及的免疫组化染色机器，厂家：河南赛诺特生物技术有限公司；型号：CNT-330。若为特殊说明，实施例及试验例中所用的各类试剂、设备等均为市售商品。
实施例1幽门螺杆菌染色试剂盒
该实施例提供了一种幽门螺杆菌染色试剂盒，由如下组分构成：
1)过氧化物酶封闭剂，购于河南赛诺特生物技术有限公司，货号：SD3002；
2)幽门螺杆菌单克隆抗体，购于河南赛诺特生物技术有限公司，货号：CHR-0171；
3)鼠抗或兔抗Linker，，购于河南赛诺特生物技术有限公司，货号：SD3010；
4)酶标羊抗鼠/兔聚合物，购于河南赛诺特生物技术有限公司，货号：SD3003；
5)DAB显色底物，购于河南赛诺特生物技术有限公司，货号：SD3004；
6)DAB显色缓冲液，购于河南赛诺特生物技术有限公司，货号：SD3005；
7)苏木素复染液，购于河南赛诺特生物技术有限公司，货号：SD3006；
8)返蓝液，即0.2％氨水溶液，购于河南赛诺特生物技术有限公司，货号：SD9006；
9)弱酸盐缓冲液，购于河南赛诺特生物技术有限公司，货号：SD9004；
10)伊红染色液，购于河南赛诺特生物技术有限公司，货号：HS1011。
将30mL过氧化物酶封闭剂、30mL幽门螺杆菌单克隆抗体、30mL鼠抗或兔抗Linker、30mL酶标羊抗鼠/兔聚合物、5mL DAB显色底物、30mL DAB显色缓冲液、30mL苏木素复染液、30mL返蓝液、30mL弱酸盐缓冲液和30mL伊红染色液组装成试剂盒。
实施例2在病理组织染色中的应用
该实施例提供了实施例1的试剂盒在病理组织染色中的应用，待测样本为胃活检样本或者胃组织蜡块切片，具体包括以下步骤：
1)烤片：将切片放入摊片烤片机，65℃烘烤2个小时。
2)机载染色：准备待测样本，将幽门螺杆菌染色试剂盒装载于全自动免疫组化染色机进行染色；设置CNT330染色程序，打印标签并贴签后进行试验操作，具体机载染色程序如下：
a)机载脱蜡并进行抗原修复，机载清洗液清洗；
b)过氧化物酶封闭5min；机载清洗液清洗3次，2min/次；
c)幽门螺杆菌单克隆抗体孵育30min；机载清洗液清洗3次，2min/次；
d)鼠抗或兔抗Linker孵育20min；机载清洗液清洗3次，2min/次；
e)酶标羊抗鼠/兔聚合物孵育20min；机载清洗液清洗3次，2min/次；去离子水清洗1次，2min/次；
f)DAB显色6min；去离子水清洗3次，2min/次；
g)渐行式苏木素复染1min；去离子水清洗3次，2min/次；
h)氨水返蓝20s；机载清洗液清洗3次，2min/次；
i)弱酸盐缓冲液清洗3次，2min/次；
j)伊红染色1min；去离子水清洗3次，2min/次；
3)脱水、透明、封片：常规无水乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。
其中，所述机载清洗液为TBS缓冲液。
按照上述步骤，对胃活检样本进行机载染色，结果如图1所示，由图1可知，组织胞浆部分为红色，阴性细胞细胞核为蓝色，胃粘膜上皮细胞为棕黄色，整体染色效果色彩对比鲜明，结果容易判读。
对比例1常规HE染色试剂盒及其应用
该对比例提供了常规HE染色试剂盒及其应用，具体的，常规HE染色试剂盒包括高清恒定液(A液)、苏木素染液(B液)、分化液(C液)、返蓝液(D液)、伊红染液(E液)。
应用该试剂盒对待测标本进行染色，包括如下步骤：
1)脱蜡：二甲苯脱蜡3次，2min/次。
2)水化：无水乙醇试剂水化3次，1min/次；80％乙醇水化1次，1min/次。
3)水洗1min，高清恒定液稳定30s；苏木素染液染色3～5min，水洗2min；
4)分化液分化3～15s，水洗1min；返蓝液处理1～2min，水洗1min；
5)95％乙醇处理1min，伊红染液染色5～60s，水洗1min；
6)脱水：100％乙醇试剂脱水3次，1min/次；二甲苯透明3次，1min/次。
7)滴上中性树胶，封片，用吸管滴上一滴即可，避免中间有气泡。
按照上述步骤，对胃活检样本进行机载染色，结果如图2所示，由图2可知HE染色显示的幽门螺杆菌阳性部位为粘膜上皮细胞，显色为蓝紫色，显微镜下阳性结果难以和正常的胃粘膜上皮细胞进行区分，容易漏检；采用本发明的试剂盒可以使阳性细胞着色为黄棕色，更易于与周围细胞进行区分，提高检出率(图1)。
对比例2不包含弱酸盐缓冲液的幽门螺杆菌染色试剂盒及其应用
该对比例提供了一种幽门螺杆菌染色试剂盒，与实施例1的不同之处在于，该试剂盒不包含弱酸盐缓冲液，具体包括如下组分：
1)过氧化物酶封闭剂，购于河南赛诺特生物技术有限公司，货号：SD3002；
2)幽门螺杆菌单克隆抗体，购于河南赛诺特生物技术有限公司，货号：CHR-0171；
3)酶标羊抗鼠/兔聚合物，购于河南赛诺特生物技术有限公司，货号：SD3003；
4)DAB显色底物，购于河南赛诺特生物技术有限公司，货号：SD3004；
5)DAB显色缓冲液，购于河南赛诺特生物技术有限公司，货号：SD3005；
6)苏木素复染液，购于河南赛诺特生物技术有限公司，货号：SD3006；
7)0.2％氨水溶液，购于河南赛诺特生物技术有限公司，货号：SD9006；
8)伊红染色液，购于河南赛诺特生物技术有限公司，货号：HS1011。
应用该试剂盒对待测标本进行染色，与实施例2的不同之处在于，返蓝处理后不用弱酸盐缓冲液进行处理，具体包括如下步骤：
1)烤片：将切片放入摊片烤片机，65℃烘烤2个小时。
2)机载染色：准备待测样本，设置CNT330染色程序，打印标签并贴签后进行试验操作。具体机载程序如下：
a)机载脱蜡并进行抗原修复，机载清洗液清洗；
b)过氧化物酶封闭5min；机载清洗液清洗3次，2min/次；
c)幽门螺杆菌单克隆抗体孵育30min；机载清洗液清洗3次，2min/次；
d)一抗后试剂孵育20min；机载清洗液清洗3次，2min/次；
e)二抗试剂孵育20min；机载清洗液清洗3次，2min/次；去离子水清洗1次，2min/次；
f)DAB显色6min；去离子水清洗3次，2min/次；
g)渐行式苏木素复染1min；去离子水清洗3次，2min/次；
h)氨水返蓝20s；机载清洗液清洗3次，2min/次；
i)伊红染色1min；去离子水清洗3次，2min/次；
3)脱水、透明、封片：常规无水乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。
按照上述步骤，对胃活检样本进行机载染色，结果如图3所示，由图3可知使用弱酸盐缓冲液一方面可以平衡TBS冲洗液高pH的干扰，另一方面弱酸盐提供的弱酸环境可以增强伊红染色效果，增加对比度，提高临床样本检测的准确度。
试验例1
该试验例分别采用实施例1、对比例1-2的试剂盒进行染色，实施例1的试剂盒的染色步骤参见实施例2，待测样本共310例，包括浅表性胃炎、萎缩性胃炎等组织样本，样本均有完整的临床诊断信息；其中，幽门螺杆菌阳性标本200例，阴性标本110例；所用样本均由赛诺特医院检验所提供。
试验结果如下：
| 组别 | 阳性 | 阴性 | 敏感度(％) | 特异性(％) | 准确度(％) |
| 实施例2 | 137/200 | 110/110 | 68.5 | 100 | 44.2 |
| 对比例1 | 124/200 | 109/110 | 62 | 99.1 | 40.3 |
| 对比例2 | 133/200 | 110/110 | 66.5 | 100 | 42.9 |
由上述结果可知，采用本发明实施例1提供的试剂盒，染色结果阳性率最高；说明免疫组化结合HE染色能够显著减少漏诊几率；同时，弱酸盐缓冲液的使用能够明显提高检测结果的准确性。
Claims (10)
1.一种幽门螺杆菌染色试剂盒，其特征在于，包括如下组分：过氧化物酶封闭剂、幽门螺杆菌单克隆抗体、鼠抗或兔抗Linker、酶标羊抗鼠/兔聚合物、DAB显色底物、DAB显色缓冲液、苏木素复染液、返蓝液、弱酸盐缓冲液和伊红染色液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述幽门螺杆菌单克隆抗体为兔抗人幽门螺旋杆菌单克隆抗体，克隆号EP279。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述弱酸盐缓冲液为醋酸钠缓冲液或柠檬酸钠缓冲液。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述返蓝液为质量百分含量为0.1％-10％的氨水溶液。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，其适用于全自动免疫组化染色机。
6.如权利要求1-5任一项所述的试剂盒在病理组织染色中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述病理组织包括胃镜活检标本。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
1)烤片：将切片放入摊片烤片机烤片；
2)机载染色：将幽门螺杆菌染色试剂盒装载于全自动免疫组化染色机进行染色；
3)脱水、透明、封片。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤2)机载染色的染色程序包括如下步骤：
a)机载脱蜡并进行抗原修复，机载清洗液清洗；
b)过氧化物酶封闭，机载清洗液清洗；
c)幽门螺杆菌单克隆抗体孵育，机载清洗液清洗；
d)鼠抗或兔抗Linker孵育，机载清洗液清洗；
e)酶标羊抗鼠/兔聚合物孵育，机载清洗液清洗，去离子水清洗；
f)DAB显色，去离子水清洗；
g)渐行式苏木素复染，去离子水清洗；
h)氨水返蓝，机载清洗液清洗；
i)弱酸盐缓冲液清洗；
j)伊红染色，去离子水清洗。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述机载清洗液为TBS缓冲液。
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