CN109425527A - 一种细胞染色方法 - Google Patents
一种细胞染色方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109425527A CN109425527A CN201710786781.5A CN201710786781A CN109425527A CN 109425527 A CN109425527 A CN 109425527A CN 201710786781 A CN201710786781 A CN 201710786781A CN 109425527 A CN109425527 A CN 109425527A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- sample
- minutes
- ethyl alcohol
- dyeing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 54
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 title claims abstract description 39
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 122
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims abstract description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 11
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 90
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 55
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 claims description 41
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims description 37
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 36
- 229960004756 ethanol Drugs 0.000 claims description 36
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 34
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 17
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 17
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 17
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 15
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 15
- 229960000935 dehydrated alcohol Drugs 0.000 claims description 13
- 210000000270 basal cell Anatomy 0.000 claims description 12
- 239000012224 working solution Substances 0.000 claims description 10
- WZUVPPKBWHMQCE-XJKSGUPXSA-N (+)-haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2C[C@]2(O)[C@H]1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-XJKSGUPXSA-N 0.000 claims description 9
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Natural products C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 8
- HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 3,3'-diaminobenzidine Chemical compound C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1 HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims description 7
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 claims description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 7
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 5
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 claims description 5
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 claims description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 claims description 3
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims description 3
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 claims description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 claims 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 30
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 22
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract description 17
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 abstract description 14
- 238000007689 inspection Methods 0.000 abstract description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 99
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 17
- 208000022361 Human papillomavirus infectious disease Diseases 0.000 description 16
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 description 12
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 9
- 206010008263 Cervical dysplasia Diseases 0.000 description 8
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 241000238370 Sepia Species 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- VLEIUWBSEKKKFX-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O VLEIUWBSEKKKFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 6
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 5
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 5
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 5
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 5
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 5
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 3
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 3
- 239000002344 surface layer Substances 0.000 description 3
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 208000007879 Atypical Squamous Cells of the Cervix Diseases 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 2
- 208000032124 Squamous Intraepithelial Lesions Diseases 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 2
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000005034 decoration Methods 0.000 description 2
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 2
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 2
- 229920001206 natural gum Polymers 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 238000011121 vaginal smear Methods 0.000 description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 208000009608 Papillomavirus Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000005775 Parakeratosis Diseases 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 101710132595 Protein E7 Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000012505 colouration Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000012631 diagnostic technique Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 210000002514 epidermal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004996 female reproductive system Anatomy 0.000 description 1
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000012760 immunocytochemical staining Methods 0.000 description 1
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 208000020082 intraepithelial neoplasia Diseases 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000026037 malignant tumor of neck Diseases 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004493 neutrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108091008819 oncoproteins Proteins 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003716 rejuvenation Effects 0.000 description 1
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000020077 squamous cell intraepithelial neoplasia Diseases 0.000 description 1
- 239000012128 staining reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明提供了一种细胞染色方法，该方法同时提供细胞形态学和癌症标志物E7癌蛋白的表达鉴定，从而提供细胞检测的多参数信息。所述方法实验结果表明，本发明的方法对细胞进行染色，能够有效避免漏检，同时极大地缩短了读片时间，有效地提高了判读的准确性。本发明的方法可以对含有肿瘤细胞的临床样本进行细胞染色和鉴定，也可以用于实验室研究目的的肿瘤细胞染色。
Description
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体地涉及一种细胞染色方法。
背景技术
宫颈癌是女性生殖系统的常见恶性肿瘤，位居女性恶性肿瘤第二位，晚期癌5年生存率低，在世界范围内具有较高的发病率和死亡率。中国每年宫颈癌的新发病例13万以上，占世界总发病数的28％；中国宫颈癌发病率由上世纪90年代到现在，每年以2％～3％的速度递增，且发病平均年龄在10年间下降约5岁，明显趋于年轻化。发达国家通过上半个多世纪的时间普及了宫颈癌筛查，使得宫颈癌的发病率及死亡率明显下降。而在发展中国家，宫颈癌发病率和致死率依旧很高，主要发生于贫困地区及未进行妇女病筛查的地区。
细胞形态学检查是目前宫颈癌普查的常规使用方法。对于30岁以上的妇女，如果出现接触性出血情况，应常规进行宫颈癌筛查。首要做的就是细胞形态学检查。液基细胞学检查是采用液基薄层细胞检测系统检测宫颈细胞并进行细胞学分类诊断，它是目前国际上较先进的一种宫颈癌细胞学检查技术。但大量的临床实践证明，宫颈癌筛查面临着细胞学检测敏感度较低(50～70％)，受取样、制片、染色、阅片水平等多种因素影响。细胞学判读要求有形态学依据具有不可规避的主观性，并造成病理医生工作负担极其繁重。另外，在抗肿瘤药物开发中，同样存在大量的需要对肿瘤细胞样本进行检测染色的工作，以判断肿瘤细胞的状态。
因此，本领域技术人员致力于开发灵敏度更高、特异性更好的细胞染色方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种细胞染色方法，该方法同时提供细胞形态学和根据癌蛋白表达的细胞标记和鉴别技术，从而提供细胞检测的多参数信息。该方法可以缩短读片时间、同时有效提高判读的准确性。用于检测宫颈上皮脱落细胞的检测可以提高早期诊断癌前病变的灵敏度，减少对早期癌症的漏检率。
本发明的第一方面，提供了一种细胞染色方法，所述方法包括步骤：
1)预处理
提供待染色的细胞，并用细胞固定液固定所述细胞，然后将所述细胞均匀涂片得到待染色的涂片；
2)第一次染色
2.1)对所述涂片上的细胞样本进行抗原修复，使得隐蔽的抗原决定簇暴露；加入过氧化氢消除内源性过氧化物酶；洗涤后加入封闭液进行封闭；
2.2)滴加抗肿瘤标志蛋白的单克隆抗体，孵育后洗涤；
2.3)滴加特异性结合所述单克隆抗体的辣根过氧化物酶标记二抗工作液，孵育后形成抗原-单克隆抗体-酶标二抗复合物，洗涤；
2.4)滴加DAB(3，3’-二氨基联苯胺)底物进行显色；去离子水洗涤后加入苏木素复染；
3)第二次染色
将步骤2.4)获得的样本放入乙醇(≥90％(v/v))中固定，然后用巴氏染色液对样本进行染色。
在另一优选例中，所述方法为非诊断目的。
在另一优选例中，所述细胞包括肿瘤细胞。
在另一优选例中，所述细胞为宫颈脱落细胞。
在另一优选例中，所述细胞为脱落的宫颈鳞状上皮细胞。
在另一优选例中，所述抗肿瘤标志蛋白为HPV E7蛋白。
在另一优选例中，所述步骤2.4)后包括步骤：
2.5)对涂片进行脱水处理，二甲苯透明后中性树胶封片；
2.6)褪片脱胶
取步骤2.5)获得的样本放入二甲苯中静置，然后放入无水乙醇中洗涤。
在另一优选例中，所述步骤1)中，所述细胞固定液为中性福尔马林、4％多聚甲醛或液基细胞固定液。
在另一优选例中，所述步骤1)中，涂片完成后使用乙醇(≥90％(v/v))固定20-60min，风干20min以上。
在另一优选例中，所述步骤2.1)中，将样本放入40-60％(v/v)乙醇中复水5-15分钟后，去离子水中浸泡至少30秒，然后将样本置于pH值为9.0的Tris-EDTA抗原修复液中进行抗原修复，使得隐蔽的抗原决定簇暴露。
在另一优选例中，所述步骤2.1)中，加入1-5％的过氧化氢进行处理5-15分钟，消除内源性过氧化物酶.
在另一优选例中，所述步骤2.1)中，滴加100-300ul封闭液并于湿盒中进行封闭40-80分钟；优选地，所述封闭液为质量分数为5-15％的新生牛血清或胎牛血清、0.2-0.5％的牛血清白蛋白或者其他封闭液。
在另一优选例中，所述步骤2.2)中，滴加抗HPV E7蛋白的单克隆抗体后孵育30-90分钟，优选为约60分钟。
在另一优选例中，所述步骤2.5)中，将样本依次放入65-85％乙醇(优选为75％乙醇)、90-98％乙醇(优选为95％乙醇)、无水乙醇中进行脱水。
在另一优选例中，所述步骤2.6)中，将样本放入二甲苯中静置至少30分钟，轻轻移去盖破片，二甲苯洗涤后放入无水乙醇中洗涤。
本发明的第二方面，提供了一种细胞染色系统，所述细胞染色系统执行本发明第一方面所述的细胞染色方法。
在另一优选例中，所述细胞染色系统为细胞染色试剂盒。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为宫颈脱落细胞样本经过免疫细胞化学染色后的结果图。病变的鳞状上皮细胞被染为黄棕色(红色箭头)，而正常细胞未染上黄棕色。
图2为免疫细胞化学染色的样本，再经过巴氏染色的结果图。黄棕色染色的病变细胞经巴氏染色后呈现出蓝绿色(红色箭头)。
图3为阴性样本免疫细胞化学染色后经过巴氏染色的结果图。未染色的正常细胞经巴氏染色后呈现出红色或者绿色(红色箭头)。
图4为对比试验的巴氏染色结果。
图5为与图4同一个视野的E7-ICC免疫染色结果。
具体实施方式
本发明人通过多种试验条件探索和深入研究，获得一种细胞染色方法。实验结果表明，使用本发明的方法对细胞进行染色，能够有效避免对癌症细胞和癌前病变细胞的漏检，同时极大地缩短了读片时间，有效地提高了判读细胞切片和识别癌细胞的准确性。本发明的方法可以对临床肿瘤细胞样本进行免疫组化染色，也可以用于实验室培养的肿瘤细胞株的染色。本发明的方法联合了基于肿瘤蛋白标记物的免疫化学染色(Immuno－cytochemical Staining,ICC)和巴氏染色，比如在宫颈部位取宫颈上皮脱落细胞样本，预处理后得到固定过的细胞样本制片；将细胞切片样本进行免疫细胞化学染色，通过使用抗癌蛋白抗体，该技术能够高特异性地检测到切片样本中的“阳性细胞”(包括宫颈癌细胞和宫颈病变细胞)。宫颈癌阳性细胞中表达特异性的生物标志物，例如：来源于高危型人乳头瘤病毒HPV的E7癌蛋白。样本经过抗E7抗体孵育、酶联二抗反应，可以通过底物显色，使细胞中抗原位点上出现棕色着色；该样本再进行巴氏染色，可以使阅读片子的病理医生或研究者结合细胞形态学特征分析样本，从而能够综合评估细胞形态学特征与免疫染色这两种细胞诊断技术的相互关系和一致性。即可以避免形态学的主观性和不确定因素，又可以利用癌蛋白标记技术提高诊断早期病变细胞的精准程度，有效提高病理医生的工作效率。
在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
在本发明的一个优选地实施方式中，本发明的方法可以用于宫颈病变的早期精准诊断。本发明的方法能够特异性地鉴定存在于所有患者群体中的高度子宫颈病变，尤其能够对形态学检测被分类为低度病变、而实际上是高度病变的病例或者有发展为高度病变的重大可能性的病例进行分流。另外，基于目前临床上对于传统形态学检测的依赖性，本本发明的方法联合了免疫细胞化学染色和巴氏染色法，一方面可以避免漏检，另一方面通过免疫学检测将样本中阳性或者疑似阳性的细胞筛选出来，并提供细胞学形态学分析，病理医生可以集中精力在阳性或者疑似细胞上，缩短读片时间，同时有效提高判读的准确性。
在巴氏染色中，胞核染为深蓝色；鳞状上皮底层、中层及表层角化前细胞胞质染为绿色，表层不全角化细胞细胞质染为粉红色，完全角化细胞胞质呈桔黄色；黏液呈淡蓝色或粉色；中性粒细胞和淋巴细胞、吞噬细胞胞质均为蓝色；红细胞染粉红色；高分化鳞癌细胞可染成粉红色或桔黄色；腺癌细胞质呈灰蓝色。根据TBS分类系统，分为NILM：未见上皮内病变/恶性细胞，ASC-US：意义未明的不典型鳞状细胞，ASC-H：不典型鳞状细胞，不除外高度鳞状上皮内病变，LSIL：低度鳞状上皮内病变；HSIL：高度鳞状上皮内病变；AGC：不典型腺上皮细胞。
在高危HPV持续性感染的高度病变患者中，HPV将其基因整合到寄主基因组中并表达该致癌基因产物E7蛋白，其功能是以破坏表皮干细胞的正常细胞周期导致细胞永生化，即：病变。癌蛋白E7的大量表达状态与病变恶化程度呈正相关(Middleton K.,et al.,Organization of human papil lomavirus productive cycle during neoplasticprogression provides a basis for selection of diagnostic markers.JVirol.2003)。2012年7月，美国病理学家协会(CAP)和美国阴道镜和宫颈病理学会(ASCCP)指南指出，p16可作为反映HPV E6/E7影响细胞增殖的标志物，有足够证据表明能够用于低级别肛门-生殖道鳞状上皮病变相关推荐，建议使用特定克隆号(E6H4)的p16INK4a抗体作为检测HPV感染是否影响到细胞周期调控的生物标志物。因此，理论和大量研究数据表明E7蛋白可作为高度宫颈损伤和宫颈癌检测的一个特异性肿瘤分子标志物。借助于该分子标志物可改善细胞形态学的检测，对宫颈癌早期的诊断提供更精准的检测指标。
以宫颈脱落细胞为例，说明根据本发明的细胞染色方法的步骤：
步骤(1)脱落细胞预处理：
于宫颈部位取宫颈脱落细胞，放入细胞保存液中固定脱落细胞，得到预处理后的样品溶液，于0℃-8℃下保存；
所述的保存液为中性福尔马林、4％多聚甲醛或液基细胞固定液；
步骤(2)液基细胞制片
将步骤(1)收集的脱落细胞溶液置于液基细胞仪上制成均匀涂片并立即用95％乙醇固定20-60min，风干20min以上，得到待染色的涂片；
步骤(3)免疫细胞化学染色：
3.1取步骤(2)液基细胞制片的样本放入50％乙醇中复水10分钟后，去离子水中浸泡至少30秒，然后将样本置于pH值为9.0的Tris-EDTA抗原修复液中进行抗原修复，使得隐蔽的抗原决定簇暴露，取出后冷却至室温。
3.2步骤3.1的样本经过洗涤后加入3％的过氧化氢进行处理10分钟，消除内源性过氧化物酶；
3.3步骤3.2的样本经过洗涤后滴加200ul封闭液并于湿盒中进行封闭60分钟；
所述的封闭液为质量分数为10％的新生牛血清或胎牛血清、0.2-0.5％的牛血清白蛋白或者其他封闭液。
3.4步骤3.3的样本滴加特异性结合HPV E7蛋白的单克隆抗体，孵育60分钟，洗涤；
3.5步骤3.4的样本滴加酶标二抗工作液，孵育30分钟后形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，洗涤；
3.6步骤3.5的样本经洗涤后滴加DAB(3，3’-二氨基联苯胺)底物进行显色。DAB在HPR酶(辣根过氧化物酶)的催化下转化为棕褐色不溶性沉淀，显色部位和待测样本中HPVE7癌蛋白单克隆抗体部位相一致。
3.7步骤3.6的样本去离子水洗涤后加入苏木素复染；
3.8步骤3.7样本依次放入75％乙醇、95％乙醇、无水乙醇中脱水，二甲苯透明后中性树胶封片。
步骤(4)褪片脱胶：
取步骤3.8的样本放入二甲苯中静置至少30分钟，轻轻移去盖破片，二甲苯洗涤后放入无水乙醇中洗涤；
步骤(5)巴氏染色
将步骤(4)褪片后免疫细胞染色的样本放入95％乙醇中固定20分钟，然后用巴氏染色法将制片染色，脱水封片后显微镜扫描观察棕色染色，并结合巴氏染色的细胞形态分析，判断肿瘤细胞。
步骤3.7处理的样本经水洗后可直接进行巴氏染色，具体操作是将样本放入95％乙醇中脱水1分钟，放入巴氏染色液中进行染色，脱水封片。
由于样本免疫染色后经过苏木素淡染，因此可以避免苏木素的重复染色及分化过程，简单脱水直接放入巴氏染液中即可获得同样的效果，可简化操作步骤，缩短操作时间。
步骤3.8处理后的样本在进行步骤(4)前，可对其进行显微镜扫描观察免疫化学染色的棕褐色染色判定肿瘤细胞；然后根据免疫化学染色的棕褐色部位与巴氏染色的着色类别统计规律。
本发明的主要优点在于：
1.单独采用形态学检测宫颈脱落细胞，工作繁琐，成本较高，耗时较长；而本发明采用免疫化学染色和巴氏染色相结合的染色技术，可以快速锁定肿瘤细胞或者疑似肿瘤细胞，并结合形态学分析确认判定结果，可显著提高病理医生的工作效率及准确度。
2.由于免疫化学染色过程基于抗原-抗体特异性反应，采用的是特异性识别肿瘤标志蛋白的单克隆抗体，因此可降低形态学判定过程中导致的主观性。
3.根据免疫化学染色与巴氏染色重合细胞颜色统计分析可以有效排除干扰，快速锁定肿瘤细胞或者疑似肿瘤细胞，提高工作效率，同时也可以提高判读准确度。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例1宫颈脱落细胞样本染色
步骤(1)脱落细胞预处理：
妇科医生在该病人的宫颈部位用妇科专用宫颈刷取得脱落细胞，放入TCT细胞保存液中固定脱落细胞，得到处理后的样本溶液，于2-8℃下保存；
步骤(2)液基细胞制片：
将步骤(1)收集的脱落细胞溶液置于液基细胞仪上制成均匀涂片并立即用质量分数为95％乙醇固定20min，然后风干20min，得到待染色的涂片；
步骤(3)免疫细胞化学染色：
3.1取步骤(2)液基细胞制片的样本放入50％乙醇中复水10分钟后，去离子水中浸泡30秒，然后将样本置于pH值为9.0的Tris-EDTA的抗原修复液中进行抗原修复，95～99℃水浴10分钟，取出后冷却至室温。
3.2步骤3.1的样本经TBST洗涤5分钟，然后加入3％的过氧化氢进行处理10分钟，消除内源性过氧化物酶；
3.3步骤3.2的样本经过洗涤5分钟后滴加10％的新生牛血清封闭液，放入湿盒中进行封闭60分钟；
3.4步骤3.3的样本滴加特异性结合HPV E7蛋白的单克隆抗体工作液(可购自艾托金生物医药(苏州)有限公司)，孵育60分钟，TBST洗涤。
3.5步骤3.4的样本滴加羊抗鼠酶标二抗工作液，孵育30分钟后形成抗原-抗体-酶标抗原复合物，TBST洗涤。
3.6步骤3.5的样本经洗涤后滴加底物DAB(3，3’-二氨基联苯胺)进行显色。DAB在HPR酶(辣根过氧化物酶)的催化下转化为棕褐色不溶性沉淀，显色部位即为表达HPV E7癌蛋白的肿瘤细胞。
3.7步骤3.6的样本去离子水洗涤2次后加入苏木素复染。
3.8步骤3.7的样本依次放入75％乙醇、95％乙醇、无水乙醇中脱水，二甲苯透明后中性树胶封片显微镜扫描观察有棕色染色，判断为阳性，见附图1。
步骤(4)褪片脱胶：
取步骤3.8的样本放入二甲苯中静置至少30分钟，轻轻移去盖破片，二甲苯洗涤后放入无水乙醇中洗涤；
步骤(5)液基细胞TCT检查：
将步骤(4)褪片后免疫细胞染色的样本放入95％乙醇中固定20分钟，然后根据巴氏染色法将制片染色脱水封片后显微镜扫描观察有棕色染色，并结合TCT检测结果为高度病变(HSIL)，对比棕色染色与巴氏染色重合色为绿色。见附图2。
实施例2.宫颈脱落细胞样本细胞染色
步骤(1)脱落细胞预处理：
妇科医生在该病人的宫颈部位用妇科专用宫颈刷取得脱落细胞，放入TCT细胞保存液中固定脱落细胞，得到处理后的样本溶液，于2-8℃下保存；
步骤(2)液基细胞制片：
将步骤(1)收集的脱落细胞溶液置于液基细胞仪上制成均匀涂片并立即用质量分数为95％乙醇固定20min，然后风干20min，得到待染色的涂片；
步骤(3)免疫细胞化学染色：
3.1取步骤(2)液基细胞制片的样本放入50％乙醇中复水10分钟后，去离子水中浸泡30秒，然后将样本置于pH值为9.0的Tris-EDTA的抗原修复液中进行抗原修复，95～99℃水浴10分钟，取出后冷却至室温。
3.2步骤3.1的样本经TBST洗涤5分钟，然后加入3％的过氧化氢进行处理10分钟，消除内源性过氧化物酶；
3.3步骤3.2的样本经过洗涤5分钟后滴加10％的新生牛血清封闭液，放入湿盒中进行封闭60分钟；
3.4步骤3.3的样本滴加特异性结合HPV E7蛋白的单克隆抗体工作液(可购自艾托金生物医药(苏州)有限公司)，孵育60分钟，TBST洗涤。
3.5步骤3.4的样本滴加羊抗鼠酶标二抗工作液，孵育30分钟后形成抗原-抗体-酶标抗原复合物，TBST洗涤。
3.6步骤3.5的样本经洗涤后滴加底物DAB(3，3’-二氨基联苯胺)进行显色。DAB在HPR酶(辣根过氧化物酶)的催化下转化为棕褐色不溶性沉淀，显色部位即为表达HPV E7癌蛋白的肿瘤细胞。
3.7步骤3.6的样本去离子水洗涤2次后加入苏木素复染。
3.8步骤3.7的样本显微镜扫描观察无棕色。
步骤(4)液基细胞TCT检查：
将步骤(3)免疫细胞染色的样本放入95％乙醇中脱水1分钟，放入巴氏染色液中进行染色2分钟，脱水封片。
正常细胞呈蓝色或红色染色，见附图3。
实施例3
取40例临床样本，包括20例TCT检测阳性(ASCUS,ASC-H,LSIL或HSIL)，20例TCT检测阴性(NILM)，以双盲试验将样本随机打乱后重新编号，按照以下步骤进行免疫细胞化学染色联合巴氏染色检测，并统计阳性棕色染色与巴氏染色重合处细胞类型。
步骤(1)脱落细胞预处理：
妇科医生在该病人的宫颈部位用妇科专用宫颈刷取得脱落细胞，放入TCT细胞保存液中固定脱落细胞，得到处理后的样本溶液，于2-8℃下保存；
步骤(2)液基细胞制片：
将步骤(1)收集的脱落细胞溶液置于液基细胞仪上制成均匀涂片并立即用质量分数为95％乙醇固定20min，然后风干20min，得到待染色的涂片；
步骤(3)免疫细胞化学染色：
3.1取步骤(2)液基细胞制片的样本放入50％乙醇中复水10分钟后，去离子水中浸泡30秒，然后将样本置于pH值为9.0的Tris-EDTA的抗原修复液中进行抗原修复，95～99℃水浴10分钟，取出后冷却至室温。
3.2步骤3.1的样本经TBST洗涤5分钟，然后加入3％的过氧化氢进行处理10分钟，消除内源性过氧化物酶；
3.3步骤3.2的样本经过洗涤5分钟后滴加10％的新生牛血清封闭液，放入湿盒中进行封闭60分钟；
3.4步骤3.3的样本滴加特异性结合HPV E7蛋白的单克隆抗体工作液，孵育60分钟，TBST洗涤。
3.5步骤3.4的样本滴加羊抗鼠酶标二抗工作液，孵育30分钟后形成抗原-抗体-酶标抗原复合物，TBST洗涤。
3.6步骤3.5的样本经洗涤后滴加底物DAB(3，3’-二氨基联苯胺)进行显色。DAB在HPR酶(辣根过氧化物酶)的催化下转化为棕褐色不溶性沉淀，显色部位即为表达HPV E7癌蛋白的肿瘤细胞。
3.7步骤3.6的样本去离子水洗涤2次后加入苏木素复染。
3.8步骤3.7的样本封片后显微镜扫描观察样本信息。
步骤(4)液基细胞TCT检查：
将步骤(3)免疫细胞染色的样本放入95％乙醇中脱水1分钟，放入巴氏染色液中进行染色2分钟，脱水封片。
经过统计，结果显示91.2％棕色染色与巴氏染色重合色为绿色，即与ICC染色重合的主要为鳞状上皮底层、中层及表层角化前细胞，为宫颈病变的主要细胞类型。在ICC-TCT联合检测，棕色染色对巴氏染色判读无影响，即ICC染色不影响细胞形态学的判读。经过统计，ICC-TCT联合检测结果与TCT检测结果的符合率为80％，不符合阳性样本中联合检测结果与病理结果一致。因此，一方面，ICC检测过程中部分样本存在免疫学染色法不可避免的非特异性染色，结合细胞形态学判读可以进一步提高判读的准确性；另一方面，ICC检测联合巴氏可以进一步对ICC阴性检测结果进行确认，避免漏诊。具体数据见表1。
表1
讨论
宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤，细胞形态学检测是目前宫颈癌的主要筛查手段，巴氏染色是临床医生对宫颈癌诊断的重要依据，尽管细胞学在很多国家是标准的宫颈癌筛查方法，但在临床实际操作中，存在诸多问题：由于其灵敏度较低，重复性差，检测结果存在一定的假阴性和假阳性率；针对细胞学不确定结果，阅片者间差异大。本发明采用基于宫颈癌标志物的ICC检测联合巴氏染色法进行宫颈脱落细胞学检测，最终确定一种能够用于宫颈病变诊断的ICC-TCT联合检测技术。宫颈脱落细胞采用ICC检测后，再进行巴氏染色，病理医生只需对重合染色的细胞进行确认，且重合染色主要集中在巴氏绿色染色细胞上，有助于提高临床医生工作效率。另外本发明中ICC染色不会对巴氏染色产生影响，在检测结果的确认中，医生可以方便的进行形态学判读复核检测结果，避免漏诊。借助此发明可为临床医生对患者诊疗提供辅助依据，即可以提高检测的灵敏度以及检测效率，又可以减少由于对细胞形态学的主观判断带来的漏诊率，进而减少过度治疗造成的损失。例如，本发明实施例中所用的抗体均为本领域的常规抗体，可购自艾托金生物医药(苏州)有限公司。
对比例1宫颈脱落细胞样本免疫细胞化学染色联合巴氏染色(TCT-ICC联合检测)
步骤(1)脱落细胞预处理：
妇科医生在该病人的宫颈部位用妇科专用宫颈刷取得脱落细胞，放入TCT细胞保存液中固定脱落细胞，得到处理后的样本溶液，于2-8℃下保存；
步骤(2)液基细胞制片：
将步骤(1)收集的脱落细胞溶液置于液基细胞仪上制成均匀涂片并立即用质量分数为95％乙醇固定20min，
步骤(3)液基细胞TCT检查：
3.1取步骤(2)液基细胞制片的样本放入苏木素中染色5分钟，清水冲洗30秒，
3.2步骤3.1的样本放入0.5％盐酸酒精中分化3-5秒后流水冲洗30秒，放入缓冲溶液中蓝化2分钟，流水冲洗30秒
3.3步骤3.2的样本放入95％乙醇中脱水1分钟，放入巴氏染色液中染色2分钟；
3.4步骤3.3的样本依次放入95％乙醇、无水乙醇中脱水，二甲苯透明后中性树胶封片显微镜扫描观察
步骤(4)褪片脱胶：
取步骤3.8的样本放入二甲苯中静置至少30分钟，轻轻移去盖破片，二甲苯洗涤后放入无水乙醇中洗涤；
步骤(5)免疫细胞化学染色：
5.1取步骤(4)褪片后的样本依次放入95％乙醇、75％乙醇3分钟，50％乙醇中复水10分钟。除去多余的液体，在去离子水中孵育至少30秒
5.2步骤5.1的样本放入盐酸酒精中褪色15分钟，去离子水中洗涤2分钟。然后将样本置于pH值为9.0的Tris-EDTA抗原修复液中进行抗原修复，使得隐蔽的抗原决定簇暴露，取出后冷却至室温。
5.3步骤5.2的样本经过洗涤后加入3％的过氧化氢进行处理10分钟，消除内源性过氧化物酶；
5.4步骤5.3的样本经过洗涤后滴加200ul封闭液并于湿盒中进行封闭60分钟；
所述的封闭液为质量分数为10％的新生牛血清或胎牛血清、0.2-0.5％的牛血清白蛋白或者其他封闭液。
5.5步骤5.4的样本滴加特异性结合HPV E7蛋白的单克隆抗体，孵育60分钟，洗涤；
5.6步骤5.5的样本滴加酶标二抗工作液，孵育30分钟后形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，洗涤；
5.7步骤5.6的样本经洗涤后滴加DAB(3，3’-二氨基联苯胺)底物进行显色。DAB在HPR酶(辣根过氧化物酶)的催化下转化为棕褐色不溶性沉淀，显色部位和待测样本中HPVE7癌蛋白单克隆抗体部位相一致。
5.8步骤5.7的样本去离子水洗涤后加入苏木素复染；
5.9步骤5.8样本依次放入75％乙醇、95％乙醇、无水乙醇中脱水，二甲苯透明后中性树胶封片显微镜扫描观察有棕色染色，附图4、图5。
讨论：
经过巴氏染色后临床样本再进行ICC染色后，巴氏染色全部消退，只保留了ICC染色的结果，无法实现TCT-ICC两种检测在同一样本上的共存；此外，巴氏染色后再经过ICC染色，降低了阳性细胞棕色强度，可能导致降低检测灵敏度，导致漏检概率上升。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种细胞染色方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
1)预处理
提供待染色的细胞，并用细胞固定液固定所述细胞，然后将所述细胞均匀涂片得到待染色的涂片；
2)第一次染色
2.1)对所述涂片上的细胞样本进行抗原修复，使得隐蔽的抗原决定簇暴露；加入过氧化氢消除内源性过氧化物酶；洗涤后加入封闭液进行封闭；
2.2)滴加抗肿瘤标志蛋白的单克隆抗体，孵育后洗涤；
2.3)滴加特异性结合所述单克隆抗体的辣根过氧化物酶标记二抗工作液，孵育后形成抗原-单克隆抗体-酶标二抗复合物，洗涤；
2.4)滴加DAB(3，3’-二氨基联苯胺)底物进行显色；去离子水洗涤后加入苏木素复染；
3)第二次染色
将步骤2.4)获得的样本放入乙醇(≥90％(v/v))中固定，然后用巴氏染色液对样本进行染色。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2.4)后包括步骤：
2.5)对涂片进行脱水处理，二甲苯透明后中性树胶封片；和
2.6)褪片脱胶
取步骤2.5)获得的样本放入二甲苯中静置，然后放入无水乙醇中洗涤。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，所述细胞固定液为中性福尔马林、4％多聚甲醛或液基细胞固定液。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，涂片完成后使用乙醇(≥90％(v/v))固定20-60min，风干20min以上。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2.1)中，将样本放入40-60％(v/v)乙醇中复水5-15分钟后，去离子水中浸泡至少30秒，然后将样本置于pH值为9.0的Tris-EDTA抗原修复液中进行抗原修复，使得隐蔽的抗原决定簇暴露。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2.1)中，加入1-5％的过氧化氢进行处理5-15分钟，消除内源性过氧化物酶。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2.1)中，滴加100-300ul封闭液并于湿盒中进行封闭40-80分钟；优选地，所述封闭液为质量分数为5-15％的新生牛血清或胎牛血清、0.2-0.5％的牛血清白蛋白或者其他封闭液。
8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤2.5)中，将样本依次放入65-85％乙醇(优选为75％乙醇)、90-98％乙醇(优选为95％乙醇)、无水乙醇中进行脱水。
9.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤2.6)中，将样本放入二甲苯中静置至少30分钟，轻轻移去盖破片，二甲苯洗涤后放入无水乙醇中洗涤。
10.一种细胞染色系统，其特征在于，所述细胞染色系统执行权利要求1所述的细胞染色方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710786781.5A CN109425527B (zh) | 2017-09-04 | 2017-09-04 | 一种细胞染色方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710786781.5A CN109425527B (zh) | 2017-09-04 | 2017-09-04 | 一种细胞染色方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109425527A true CN109425527A (zh) | 2019-03-05 |
| CN109425527B CN109425527B (zh) | 2021-10-01 |
Family
ID=65513664
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710786781.5A Active CN109425527B (zh) | 2017-09-04 | 2017-09-04 | 一种细胞染色方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109425527B (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112710526A (zh) * | 2019-10-24 | 2021-04-27 | 广州江元医疗科技有限公司 | 一种细胞固定保存液及其制备方法和应用 |
| CN113607534A (zh) * | 2021-08-20 | 2021-11-05 | 河南赛诺特生物技术有限公司 | 一种染色方法、试剂盒及应用 |
| WO2021238014A1 (zh) * | 2020-05-28 | 2021-12-02 | 王道祥 | 一种细胞病理学样本的染色制片方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104614526A (zh) * | 2015-01-08 | 2015-05-13 | 杭州泰申生物技术有限公司 | 一种鳞状上皮细胞内癌scc-tct联合检测方法 |
| CN104792988A (zh) * | 2015-02-15 | 2015-07-22 | 广州安必平医药科技股份有限公司 | 一种用于宫颈上皮内瘤变分级辅助诊断的双染试剂盒及其应用 |
| CN105131113A (zh) * | 2015-08-26 | 2015-12-09 | 艾托金生物医药（苏州）有限公司 | 用于宫颈癌检测和分级的单隆抗体及其应用 |
| CN105504049A (zh) * | 2014-09-26 | 2016-04-20 | 艾托金生物医药（苏州）有限公司 | 宫颈癌相关的hpv e7蛋白单克隆抗体及其应用 |
-
2017
- 2017-09-04 CN CN201710786781.5A patent/CN109425527B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105504049A (zh) * | 2014-09-26 | 2016-04-20 | 艾托金生物医药（苏州）有限公司 | 宫颈癌相关的hpv e7蛋白单克隆抗体及其应用 |
| CN104614526A (zh) * | 2015-01-08 | 2015-05-13 | 杭州泰申生物技术有限公司 | 一种鳞状上皮细胞内癌scc-tct联合检测方法 |
| CN104792988A (zh) * | 2015-02-15 | 2015-07-22 | 广州安必平医药科技股份有限公司 | 一种用于宫颈上皮内瘤变分级辅助诊断的双染试剂盒及其应用 |
| CN105131113A (zh) * | 2015-08-26 | 2015-12-09 | 艾托金生物医药（苏州）有限公司 | 用于宫颈癌检测和分级的单隆抗体及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 杨雪 等: "宫颈病变应用高危型HPV-DNA检测联合TCT方法的效果研究", 《中国妇幼保健》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112710526A (zh) * | 2019-10-24 | 2021-04-27 | 广州江元医疗科技有限公司 | 一种细胞固定保存液及其制备方法和应用 |
| WO2021238014A1 (zh) * | 2020-05-28 | 2021-12-02 | 王道祥 | 一种细胞病理学样本的染色制片方法 |
| CN113607534A (zh) * | 2021-08-20 | 2021-11-05 | 河南赛诺特生物技术有限公司 | 一种染色方法、试剂盒及应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN109425527B (zh) | 2021-10-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7452727B2 (en) | Method for increasing clinical specificity when detecting tumors and their precursor stages by simultaneously measuring at least two different molecular markers | |
| CN104007257B (zh) | 一种检测非体液性稀有有核细胞的方法和试剂盒 | |
| EP1025444B1 (en) | Determination of cellular growth abnormality | |
| Shah et al. | Usefulness of basal cell cocktail (34βE12+ p63) in the diagnosis of atypical prostate glandular proliferations | |
| CN109187146B (zh) | 人体细胞全形态免疫荧光染色方法及试剂盒 | |
| CN109425527A (zh) | 一种细胞染色方法 | |
| CN110187110A (zh) | 一种贲门癌预后预测标志物及其应用 | |
| CN109061165A (zh) | 一种乳头溢液cea检测的免疫层析试纸、检测方法和应用 | |
| CN111766385B (zh) | 术中快速鉴别肺癌和硬化性肺细胞瘤的免疫组化试剂盒 | |
| US7838215B2 (en) | Advanced cervical cell screening methods | |
| CN106834511A (zh) | 一种基于液体活检的乳腺癌检测的试剂盒 | |
| Cheung et al. | Chromosome in situ hybridisation, Ki-67, and telomerase immunocytochemistry in liquid based cervical cytology | |
| US20120264110A1 (en) | Automated pap screening using a plurality of biomarkers and multi-spectral imaging | |
| CN113295871B (zh) | 一种用于诊断乳腺癌的鸡尾酒免疫组化试剂盒 | |
| US9182403B2 (en) | Kits for and methods of differential staining of cervical cancer cells and/or tissues | |
| CN112213486A (zh) | 胰岛素瘤相关蛋白1作为诊断或预后评估前列腺神经内分泌小细胞癌的标志物的用途 | |
| El-Mansi et al. | Validation of tissue microarray technology using cervical adenocarcinoma and its precursors as a model system | |
| Amin et al. | Testicular fine needle aspiration cytology in male infertility | |
| CN106290876A (zh) | 一种肿瘤细胞检测方法 | |
| CN101995474A (zh) | 一种以sox2蛋白表达水平作为前列腺癌恶性程度判断的方法 | |
| Aslani et al. | Re-evaluation of Negative Cone Biopsy Results with Ki-67 and p16 Immunostaining following Positive Cervical Biopsy | |
| CN108474025A (zh) | 采用依次荧光淬灭和重新染色的生物样品的多表型分型 | |
| CN112229999B (zh) | 一种卵巢癌的预后诊断标志物Claudin21及其应用 | |
| ABDALAH et al. | Association of Epstein-Barr virus Detection with Histopathologic-prognostic Findings among Sudanese Breast Cancer patients. | |
| CN112684173A (zh) | 一种her2的检测方法及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A Cell Staining Method Granted publication date: 20211001 Pledgee: Suzhou Beiming Intelligent Manufacturing Co.,Ltd. Pledgor: ATTOGEN BIOMEDICAL (SUZHOU) Inc.,Ltd. Registration number: Y2024990000122 |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |