CN112684173A - 一种her2的检测方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种HER2的检测方法及其应用，属于医学检验技术领域。本发明通过一种血源性外泌体HER2的检测方法检测来自血液样品中HER2的表达水平，筛选出可能获益于靶向HER2治疗的优势人群。本发明涉及用于检测对象的来自血液的样品中外泌体中HER2表达水平的检测试剂在制备用于鉴定HER2阳性胃癌患者的试剂盒中的用途，以及在制备用于鉴定能获益于靶向HER2抗体类药物的HER2阳性晚期胃癌的试剂盒中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及一种HER2的检测方法及其应用，属于医学检验技术领域。
背景技术
胃癌是一种具有显著地域发病特点的常见消化道恶性肿瘤。具统计，胃癌的发病率和死亡率在我国均居所有恶性肿瘤的第二位，是严重威胁人类健康的疾病之一。由于胃癌早期症状无特异性，临床上缺乏简捷有效的筛查手段。34％的患者初诊时已处于晚期，总体的5年生存率小于20％。10-30％的晚期胃癌患者在病理组织中呈人表皮生长因子受体2(Human epidermal growth factor receptor-2，HER2)过表达状态，这部分人群由于具有明确的治疗靶点成为研究热点。
HER2是人表皮生长因子受体家族的成员之一，是一种跨膜酪氨酸激酶受体。ToGA研究作为第一项曲妥珠单抗(HER2的单克隆抗体)治疗HER2阳性胃癌的大型Ⅲ期临床研究，证实了加入抗HER2治疗较单纯化疗可显著延长患者的总生存期(Overall survival,OS)(13.5个月vs 11.1个月)和无疾病进展时间(Progression-free survival，PFS)(6.7个月vs 5.5个月)，降低26％死亡风险。近期的一些研究提示标志治疗后进展的患者如果再次活检仍为阳性者可继续获益于抗HER2治疗。因此，HER2的状态评估可以贯穿晚期胃癌患者的全程治疗。如何准确评估患者的HER2状态是临床合理选择抗HER2药物的基础。
目前，胃癌HER2的检测标本主要为病理组织，包括活检和手术标本。检测方法为免疫组化(immunohistochemistry,IHC)及原位杂交检测，其中荧光原位杂交(fluorescencein situ hybridization,FISH)是常规的检测手段，双色银染原位杂交(dual-colorsilver-enhanced in situ hybridization,DSISH)可在有条件的实验室开展。HER2阳性评判标准为：IHC 3+或IHC 2+且FISH扩增。然而，回顾既往研究不难发现，传统的HER2检测方法仍存在许多局限性。1)空间异质性：同一胃癌组织内的HER2状态存在差异，具有异质性的HER2阳性患者抗HER2治疗疗效差。增加胃癌组织取材量(至5块)可弥补肿瘤异质性对于HER2结果的影响。然而，对于不少晚期胃癌患者，活检标本的数量十分有限，并不能做到以上标准。2)时间异质性：当患者发生转移后，原发灶与转移灶的阳性率也有不一致的情况。即使原发肿瘤HER2初检阴性患者，对于转移灶再评估HER2阳性率仍可达5.7％，其中肝转移灶HER2阳性率最高可达17.2％。此外，HER2状态同样也会在新辅助或抗HER2治疗后发生改变。因此，再次活检对判断患者目前的HER2状况尤为重要。3)标本处理规范性要求高：美国病理学家协会及我国指南均建议手术标本应在1小时内给予10％的福尔马林进行固定，然而由于各种客观因素临床上很难及时固定标本。运输标本及取样固定的延迟可导致组织缺血、蛋白分解，影响HER2的检出率。
HER2的检测的最终目的是为了筛选临床上适合抗HER2治疗的人群。然而，即使是经IHC和FISH检测判断为HER2阳性的患者抗HER2治疗的疗效仍有差异。拉帕替尼二线治疗胃癌的研究将FISH阳性作为判断HER2状态的唯一标准，却得到了阴性结果；但在亚组分析中发现IHC判断为阳性的患者可以从拉帕替尼获益。目前的研究认为，当通过FISH检测用于预判疗效时，HER2基因拷贝数与染色体17着丝粒比值达到4.7是区分抗HER2治疗敏感性/难治性人群的合理阈值。这些结果虽然在一定程度上筛选出了更有可能从抗HER2治疗中获益的人群，然而随着肿瘤的进展、耐药，其内在的基因、表型等也会随之有所改变。遗憾的是，在临床实践中，由于技术原因或者患者耐受性差，重复活检几乎很难实现，无法作为实际可行的监测手段。
因此，探索有效、准确、经济的无创检测手段，做到实时动态监测胃癌患者HER2状态的变化，筛选合适的抗HER2靶向治疗人群，寻找可预测治疗疗效的生物标记物是临床工作的迫切需求。
发明内容
本发明的目的是为解决如何有效、准确、经济的通过无创检测手段，做到实时动态监测胃癌患者HER2状态，筛选合适的抗HER2靶向治疗人群的技术问题。
为达到解决上述问题的目的，本发明所采取的技术方案是提供一种HER2的检测方法；其特征在于：包括以下步骤：
步骤1：采集患者血液的样品；
步骤2：处理患者血液样品提取外泌体；
步骤3：检测外泌体中HER2蛋白水平。
优选地，上述步骤3中检测外泌体中HER2蛋白水平采用ELISA方法。
本发明提供一种血源性外泌体HER2的检测方法在制备用于鉴定HER2阳性胃癌患者的试剂盒中的应用。
本发明提供一种血源性外泌体HER2的检测方法在制备用于鉴定能获益于靶向HER2的抗体疗法的HER2阳性胃癌患者的试剂盒中的应用。
本发明提供的一种血源性外泌体HER2的检测方法中所用试剂在制备用于鉴定HER2阳性胃癌患者的试剂盒中的用途或在制备用于鉴定能获益于靶向HER2的抗体疗法的HER2阳性胃癌患者的试剂盒中的用途。
优选地，所述试剂包括用于检测来自血液的样品中HER2表达水平的检测试剂、用于从血液中提取囊泡的提取试剂和用于裂解囊泡的裂解试剂。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一种有效、准确、经济的无创检测手段，可以做到实时动态地监测胃癌患者HER2状态的变化，可以用于筛选出合适的抗HER2靶向治疗人群，通过本发明得到一种可预测治疗疗效的生物标记物并应用于制备鉴定HER2阳性胃癌患者的试剂盒和鉴定能获益于靶向HER2的抗体疗法的HER2阳性胃癌患者的试剂盒中。
附图说明
图1为评价ELISA法检测胃癌患者血清外泌体HER2表达水平的临床鉴定价值流程图。
图2为血清外泌体HER2的ROC曲线。
以患者病理学HER2结果作为横坐标，Exo HER2检测值作为纵坐标，绘制ROC曲线，得到曲线下面积。
图3为ELISA法检测血清外泌体HER2的敏感性和特异性曲线。
如图所示：各切点的敏感性特异性指标。两条曲线交叉附近区域为约登指数最大。
图4为各亚组人群ROC曲线下面积的森林图。
如图所示：根据外泌体HER2水平在不同亚组人群中的鉴定效果绘制的森林图，各亚组之间差异无统计学意义。黑色直线代表本方法在总体人群中的鉴定效果(AUC＝0.746)。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下：
如图1-4所示，本发明提供一种血源性外泌体HER2的检测方法；包括以下步骤：
步骤1：采集患者血液的样品；
步骤2：处理患者血液样品提取外泌体；
步骤3：检测外泌体中HER2蛋白水平。
上述步骤3中检测外泌体中HER2蛋白水平采用ELISA方法。
本发明提供的一种血源性外泌体HER2的检测方法在制备用于鉴定HER2阳性胃癌患者的试剂盒中的应用。
本发明提供一种血源性外泌体HER2的检测方法在制备用于鉴定患者癌病理组织中HER2状态的试剂盒中的应用。
上述试剂包括用于检测来自血液的样品中HER2表达水平的检测试剂、用于从血液中提取囊泡的提取试剂和用于裂解囊泡的裂解试剂。
晚期胃癌患者需要对其HER2状态进行判断，而组织学检测存在时间和空间上的异质性，同时晚期胃癌患者由于体能以及肿瘤状态的原因可能无法进行活检取得足够的病理组织。肿瘤细胞分泌的外泌体能够表达肿瘤特异性蛋白，且具有含量丰富、稳定性高等优点。对此，通过本发明可用于反应血液外泌体中HER2水平与胃癌病理组织HER2状态的关系；血液外泌体中HER2水平可反应病理组织中HER2的状态。本发明旨在通过无创方法利用血液外泌体HER2作为传统HER2检测的补充和替代，更能为无法取得足够组织进行检测的晚期患者提供无创、便利的液态活检方法。
本文所述“多个”表示任意整数。优选地，“一个或多个”中的“多个”可为范围内的任意整数。
本文所述“胃癌”包括胃腺癌或胃食管结合部腺癌。本发明特别可用于判断晚期胃癌患者病理组织HER2状态。
本文所述来自体液的样品包括来自血液的样品，如血液本身，或者血浆或血清。本文所述对象主要是哺乳动物，例如人。在一些实施方案中，本文所述的样品为人血清。利用人血清中的HER2水平实现本文所述的鉴定。
本文所述“囊泡”可以是外泌体。本文所述“外泌体”是囊泡的一种，多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。
本发明通过检测对象的来自体液(尤其是血液)的样品中HER2表达水平来获得HER2阳性胃癌患者。示例性的获得HER2阳性胃癌目标患者的方法包括以下步骤：(1)使样品与特异性结合HER2的试剂接触；和(2)检测结合复合物的形成，结合复合物包括与含癌细胞来源的HER2结合的一种或多种试剂。来自体液的样品可以是体液本身或经处理以从体液中分离含HER2的囊泡后的样品或进一步经处理以从囊泡中分离出HER2后的样品。胃癌患者血液中HER2的水平/浓度能够评估该胃癌患者是否为HER2阳性目标胃癌患者。经研究，对象体液(例如血清)中的HER2表达水平与组织学HER2状态正相关。ROC曲线下面积0.746(95％CI0.684-0.808)，外泌体HER2蛋白729.95ng/ml是判断患者HER2状态的界值，灵敏度为66.1％，特异度为74.6％。以此界值，外泌体HER2蛋白检测和组织学检测的一致率为70.59％。浓度大于729.95ng/ml的情况下，对象的胃癌为组织学HER2阳性目标胃癌患者。
示例性的鉴定为组织学HER2阳性胃癌患者的方法包括步骤：(1)使该患者的来自血液的样品与特异性结合HER2的试剂接触；和(2)检测结合复合物的形成。通过HER2的水平/浓度，可以对晚期胃癌的HER2状态进行判断。
上述方法或用途涉及检测血液(尤其是血清)囊泡(例如外泌体)中HER2的水平。检测HER2的方法通常通过ELISA实现，具体而言，通过特异性结合HER2的试剂(例如HER2的抗体或其抗原结合片段)实现。检测过程通常包括从血液(尤其是血清)中提取含HER2的囊泡(尤其是外泌体)、裂解囊泡并离心获得上清，以及通过ELISA检测上清中的HER2。
从样品例如血液中提取含HER2的囊泡(例如外泌体)的方法包括但不限于差速离心、密度梯度离心、尺寸排阻色谱、过滤、聚合物法、免疫分离技术、通过筛分分离。基于聚合物(例如高分子聚合物)的外泌体提取技术通常包括将样本与含聚合物的溶液混合，4℃温育并低速离心。用于聚合物沉淀的最常见聚合物之一是聚乙二醇(PEG)。聚合物沉淀具有许多优点，包括对分离的外泌体影响小、pH中性等。
可使用裂解试剂裂解囊泡后离心，获得含HER2的上清。示例性裂解液包含：Tris-HCL、Triton-X-100、EDTA、NaCl、焦磷酸钠、氟化钠、原钒酸钠、β-甘油磷酸、苯甲基磺酰氟和胃蛋白酶抑制剂、亮肽和抑肽酶。然后用例如特异性识别HER2的抗体检测蛋白中的HER2水平。
在具体实施方案中，检测样品(例如血液或血清)中HER2水平的过程包括：从样品获取外泌体，例如使用ExoQuick外泌体抽提试剂盒；裂解外泌体；和用特异性识别HER2的抗体检测裂解试剂中的HER2水平，例如通过ELISA。
实施例
材料和方法
1、研究对象：
复旦大学附属中山医院、上海中医药大学附属龙华医院、复旦大学附属华东医院自2016年8月至2019年8月收治的晚期胃腺癌患者，探索ELISA法检测外泌体中HER2表达水平和肿瘤负荷联合估计胃癌组织HER2阳性的的灵敏度和特异度；
2、试剂和仪器
2.1试剂
2.2仪器
3实验方法
3.1免疫组化
组织切片放入60℃恒温箱烤片过夜。石蜡切片常规脱蜡水化：二甲苯7min×3次、100％乙醇1min×2次、95％、85％、70％乙醇依次各1min。自来水、PBS依次各清洗3min。在PH9.0的EDTA液中高温98℃加热45min，自然冷却至室温，PBS洗3min×3次。按1：100比例稀释一抗，4℃孵育过夜，PBS洗3min×3次。加入二抗，37℃温箱孵育30min,PBS洗3min×3次。DAB显色1-5min，显微镜下观察染色情况，适时终止反应。苏木素复染2min，自来水冲洗。常规脱水、透明封片。
3.2荧光免疫杂交
预处理：先将组织切片固定包埋后置于处理干净后的涂胶玻片上。于65℃下将组织切片置过夜烘烤，老化玻片。第二日，将组织切片浸于二甲苯溶液中，室温状态下脱蜡2次，每次10分钟，随后浸入100％乙醇中5分钟。室温下，将组织切片依次置于100％乙醇、85％乙醇和70％乙醇中脱水，每次2分钟。接着，于去离子水中浸没3分钟，用无绒纸巾吸取组织切片多余水分。此后，将组织切片置于90℃(pH-7.0)的水中处理30分钟。将处理后的组织切片置于蛋白酶K工作液(终浓度200μg/ml，0.2-0.4ml蛋白酶K储存液(20mg/ml)溶于40ml 2×SSC，pH 7.0)中，37℃下孵育5-30分钟。消化后，于2×SSC溶液中漂洗组织切片2次，每次5分钟。室温下，于甲醛固定液中固定组织切片10分钟。最后，将组织切片玻片依次置于由低至高的(70％、85％、100％)乙醇中进行脱水，每次2分钟；待玻片自然干燥后，加热玻片至56℃。
变性杂交：将杂交缓冲液，去离子水，探针按7：1：2配制成总体积10ul的溶液。甩离后涡旋，再次将液体离心至EP管底。于73℃水浴箱中将装有以上探针混合物的EP管变性5分钟后，迅速放置于45-50℃水浴箱中保持至杂交前取出。在73℃-80℃的变性液中将玻片浸泡5分钟，于-20℃预冷的70％乙醇、85％乙醇和100％乙醇中依次进行梯度脱水，每次2分钟。于室温中待玻片自然干燥后，将玻片置于温度设定为45-50℃烤片机上预热3-5分钟，与探针杂交。于玻片杂交区域滴入10μl变性后的探针混合物，立即覆盖盖玻片，并利用橡皮胶进行封边处理。在42℃保温箱中放入置于预热的湿盒中的玻片，杂交过夜。
玻片洗涤：移去盖玻片，将玻片置于0.3％NP-40/0.4×SSC溶液中振荡处理1-3秒，再进行2分钟的漂洗；室温下将玻片置于0.1％NP-40/2×SSC中，振荡处理1-3秒后进行30秒漂洗，最后将玻片置于70％乙醇中，漂洗3分钟。
复染：于暗处将玻片自然晾干，于杂交区域位置滴加5μl DAPI复染剂后，再次盖上盖玻片。放置玻片于暗处10-20分钟后，通过荧光显微镜选用合适的滤光片组观察玻片。
FISH结果观察：首先需要通过HE染色切片确认癌细胞的区域，然后在10×物镜下，找到与HE染色切片上相同的组织细胞结构所在FISH标本中的位置，仔细观察信号；在40×物镜下扫描整张切片，观察标本的质量同时注意HER-2表达的异质性是否存在。一般认为，75％以上癌细胞核中都有杂交信号的标本应是处理满意的切片；在100×物镜下观察癌细胞核的FISH结果(红色信号和绿色信号的比例Ratio值)。要求计数30个细胞，统计30个细胞核中代表HER2基因扩增的红信号总数/30个细胞核中代表17号染色体的绿信号总数。
3.3冰冻血清提取外泌体
将储存于-80℃的血清样本取出，冰上融化，使用ExoQuick外泌体抽提试剂盒抽提。吸取250μl样本至新的EP管中，加入63μl ExoQuick Exosome PrecipitationSolution，吹吸混匀，4℃放置30min，冷藏过程中，应保持管子向上，切勿晃动。将混合液取出，1500×g，离心30min后，外泌体呈米黄色出现在底部，弃去上清，底部为提取的外泌体。
3.4 ELISA法检测HER2
首先在样本中加入110μL的外泌体裂解液(罗氏公司)，放置于冰上10min后，进行离心，条件为：4℃，14000g，10min。将上清转移至新的EP管中，即为外泌体蛋白。在ELISA板条中每孔加入50μL试剂Assay Diluent RD1W，再按每孔50μL分别加入2倍梯度稀释的标准品(5000，2500，1250，625，313，156，78.1，0pg/mL)及样品，密封板条后置于水平摇床，500rpm室温孵育2h。弃掉孔内液体，每孔用400μL的1×WB洗板4次，每次静置1-2min，弃掉洗液。每孔内加入200μL试剂Human ErbB2 Conjugat，避免产生气泡，用新的密封条覆盖，置于水平摇床上，室温孵育2小时后弃掉液体，用400μL的1×WB洗板4次，每次静置1-2min，弃掉洗液弃掉孔内液体。每孔加入200μL的底物溶液，于室温避光静置孵育30min后，每孔加入50μL的终止液。使用酶标仪分别测定样本在450nm、540nm处的吸光度值，并记录进行数据分析。检测值最大为5000ug/ml。
3.5 Western blot检测
在待收样品中加入合适体积含蛋白酶抑制剂的RIPA蛋白裂解液，转到EP管中置于冰上30min。12000rpm、4℃离心30min，吸取上清即蛋白质溶液。将收取的不同的蛋白质溶液进行定量，将BSA标准品、待测样品20ul(1:10稀释)分别加入96孔板的不同孔中，将BCA定量的A、B液(50:1)混合后每孔加入200ul，37℃放置约30min。酶标仪上测定570mn吸光度值(OD值)。以标准品的OD值绘制成标准曲线，计算样品的蛋白浓度。将不同样品调成相同浓度后，按体积比例将每个样品加入5x加样缓冲液，混匀后置于金属浴100℃煮15min。冷却后进行上样。浓缩胶恒压80V，当蛋白质进入分离胶后，把电压加到120V，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶的底部，关闭电源，取下凝胶，切除浓缩胶，置于转膜缓冲液中。分离胶在转膜缓冲液中浸泡20-30min。裁剪与凝胶大小相同的Whatman3M滤纸和PVDF膜。于甲醇中放入PVDF膜浸泡10s，再放入缓冲液。用转膜缓冲液浸湿滤纸后，按从阳极到阴极的顺序依次加滤纸-PVDF膜-分离胶-滤纸，4℃下以100V恒压转膜90min。取出PVDF膜，按marker大小剪下所需条带，使用1×TBST清洗1次，用5％BSA封闭1h。用一抗稀释液按照说明书稀释抗体，4℃孵育过夜。回收一抗，蛋白条带用TBST清洗3次，每次10min。配置相应的二抗(1:1000)，室温孵育1h。弃二抗，蛋白条带用1×TBST清洗三次，每次10min。取出条带，均匀加入ECL显影液，于凝胶成像系统中显影。
3.6外泌体鉴定
电镜观察：在洁净环境下，裁取适当大小的石蜡版置于培养皿中，将含样品的悬浮液滴滴在石蜡板上，用清洁镊子沿载网边缘将电镜碳网含碳膜的一面覆盖于悬浮液液珠上面，放置3min。将负载组织载网含有组织的一面轻轻的覆盖在2％的磷钨酸溶液的液珠上面进行染色，静置3分钟，吸干残留液体，置入新的培养皿，用60W的白炽灯在培养皿外烘干后，进行电镜下观察。
检测外泌体特异蛋白，将500ul血清提取的外泌体用合适容积的蛋白加样缓冲液(Lonza)重悬在合适的浓度下；用SDS-page分离外泌体的蛋白质，应用Western Blot检测外泌体中特异性蛋白CD9和(或)CD63的表达。
实验过程
1.鉴定试验
1.1鉴定实验入组标准
入组标准：
①经组织学证实的胃腺癌或胃食管交界处腺癌患者；
②晚期胃癌(局部晚期、复发或转移性)，无法行根治性治疗；
③未接受过抗肿瘤治疗；
④患者充分知情，并愿意签署知情同意书。
排除标准：
①患者组织学HER2报告无法获得或HER2状态不明确；
②患者拒绝提供血液检测标本；
③5年内曾患有其他肿瘤的患者；
④全身重度或严重疾病感染的患者。
1.2流程(如附图1)
①收集临床病理资料：性别、年龄、肿瘤原发灶部位、CEA水平、Lauren分型、转移灶累及器官、转移器官个数、血样与组织样本采集时间差；
②采集临血样：收集患者血液标本(3mL)，低温低速离心后获得血清，存放于-80℃冰箱；
③收集患者对应的组织标本(原发灶或转移灶手术或穿刺标本)，送病理科行石蜡包埋常规进行HER2检测(若已知患者组织学HER2状态者可省略此步，但需进行病理复核读片)；
④检测外泌体HER2表达水平：利用高分子聚合物方法抽提血清外泌体，经鉴定后，加入裂解液，使膜状外泌体破裂，从而释放出蛋白，再利用ELISA法定量检测HER2蛋白的表达量。
1.3统计分析，
①样本量计算：以胃癌组织HER2检测是否阳性为金标准，基于文献和初步预试验结果，可以预估灵敏度为90％，特异度为85％，本研究的置信区间为95％，容许的相对误差为10％，即：灵敏度的容许误差为9％，特异度的容许误差为8.5％，由于采用确切概率法估计，区间不对称，故要求灵敏度的95％可信区间左侧宽度(灵敏度的点估计至95％可信区间下限的距离)9％；特异度的95％可信区间左侧宽度8.5％。用PASS软件选择One Proportion模块进行计算：灵敏度分析需要77例HER2阳性患者，特异度分析需要100例HER2阴性患者，所需的样本量为177例受试者。
②对于基线特征的描述，连续性资料采用均数±标准差或中位数(四分位数)描述，分类资料采用频数(％)描述。对于不同临床病理特征的基线资料比较，根据资料的类型和分布，连续性资料采用t检验或Wilcoxon秩和检验，分类资料采用卡方检验或Fisher精确检验。
③评价血清外泌体鉴定试验的鉴定价值：金标准为与ToGA研究一致的组织学IHC或FISH检测，主要指标为ROC曲线下面积(Area under the ROC curve,AUC)及95％置信区间。ROC曲线是以1-特异度为横坐标，灵敏度为纵坐标，根据不同界值产生不同的点，把这些点用折线连接成的一条曲线，ROC曲线下的面积AUC作为综合预测指标估计病理HER2鉴定的能力指标。ROC曲线下面积介于0和1之间，一般认为，ROC曲线高于机会线，即曲线下面积>0.5才有鉴定价值。曲线下面积越大，表示鉴定价值越高，反之鉴定价值越低。并比较了不同亚组人群的鉴定试验的ROC曲线下面积，使用森林图(forest plot)报告了不同亚组人群的AUC及95％置信区间。如图4。
④基于ROC曲线选择最佳鉴定阈值：基于约登指数(Youden index)确定血清外泌体鉴定试验的最佳鉴定阈值。约登指数是ROC曲线上某个切点的灵敏度与特异度之和减去1，用来表示鉴定试验能够正确地判断病人和非病人的能力。假设代表遗漏率的假阴性和代表失误率的假阳性发生的危害性同等意义时，约登指数越大说明鉴定试验的效果越好，真实性越大，也称正确指数。以约登指数最大作为本部分鉴定实验的确定阈值的方法。准确度的评估指标包括：灵敏度(Se)、特异度(Sp)、阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)以及ROC曲线下面积。计算方法如下所示，结果形式如表1所示。
a.灵敏度(sensitivity)是实验中判断为阳性人数占真正有病人数的比例。其计算公式为：灵敏度＝a/(a+c)。
b.特异度(specificity)是实验中判断为阴性人数占真正无病人数的比例。其计算公式为：特异度＝d/(b+d)。
c.阳性预测值(positive predictive value)是在鉴定试验阳性的受试者中，标准鉴定有病的病例(真阳性)所占的比例。其计算公式为：阳性预测值＝a/(a+b)
d.阴性预测值则(negative predictive value)是在鉴定试验为阴性的受试者中，标准鉴定证实无病的受试者(真阴性)所占的比例。其计算公式为：阴性预测值＝d/(c+d)
e.正确分类率(Correctly classified)是在鉴定试验中与标准鉴定相符合的比例。其计算公式为：(a+d)/(a+b+c+d)
表1
⑤以上统计分析均使用StataSE 14.0和R语言完成，双侧检验P<0.05表示组间差异有统计学意义。
实施过程：
1.胃癌患者入组标准和最终入组情况：
2016年8月至2019年8月期间，前瞻性收集未经治疗的晚期胃癌患者242例，其中4例因血样溶血及其他原因导致外泌体提取不合格无法进行检测，最终可分析患者238例，基线特征见表2。其中组织学HER2阳性患者114例，阴性124例。中位年龄62岁(25-83岁)，男性157例，女性85例；190例(79.8％)原发灶位于胃部，48例(20.2％)位于食管胃交界处(Esophago-gastric junction，EGJ)，197例(82.8％)患者转移部位小于等于2个器官，41例(17.2％)大于2个器官；转移部位最常见的器官依次为淋巴结(50.4％)、肝脏(41.2％)、腹膜转移(29.0％)。159例(66.8％)患者血样与组织样本采集时间差(Interval betweenblood sample and patholgy，IBBP)小于等于180天，79例(33.2％)IBBP大于180天。
表2：患者基线特征
2.血清外泌体HER2蛋白检测的鉴定阈值及鉴定效果分析
组织HER2阳性患者定义为IHC法HER2 3+和(或)FISH法HER2阳性。所有患者的胃癌组织样本均接受IHC法检测HER2蛋白水平，0及+为HER2阴性，3+为HER2阳性；IHC 2+时必须加做FISH进行最终判断，HER2信号与17号染色体比值≥2为阳性，小于2为阴性。238例患者中HER2 IHC 3+者76例，IHC 2+经FISH判断为HER2阳性35例，IHC 1+FISH阳性者3例。血清外泌体HER2蛋白(Exosomal HER2,Exo HER2)中位值为677.34ng/ml(0ng/ml-5000ng/ml)。以患者病理学HER2结果作为金标准，根据Exo HER2检测值绘制ROC曲线，曲线下面积0.746(95％CI 0.684-0.808)(如图2)，各切点的敏感性和特异性见图3。Exo HER2为729.95ng/ml时约登指数最大且正确分类率最佳，以此选择作为判断患者HER2状态的阈值。该阈值的敏感性(Sensitivity，Se)为66.1％(95％CI:56.9％-74.2％)，特异性(Specificity，Sp)为74.6％(95％CI:66.4-81.4)，阳性预测值(Positive predictive value，Prv)69.8％，阴性预测值(Negative predictive value，Npv)71.2％，正确分类率(即和组织表达一致的比率)为70.59％。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
Claims (6)
1.一种HER2的检测方法；其特征在于：包括以下步骤：
步骤1：采集患者血液的样品；
步骤2：处理患者血液样品提取外泌体；
步骤3：检测外泌体中HER2蛋白水平。
2.如权利要求1所述的一种血源性外泌体HER2的检测方法，其特征在于：所述步骤3中检测外泌体中HER2蛋白水平采用ELISA方法。
3.如权利要求1所述的一种血源性外泌体HER2的检测方法在制备用于鉴定HER2阳性胃癌患者的试剂盒中的应用。
4.如权利要求1所述的一种血源性外泌体HER2的检测方法在制备用于鉴定能获益于靶向HER2的抗体疗法的HER2阳性胃癌患者的试剂盒中的应用。
5.如权利要求1所述的一种血源性外泌体HER2的检测方法中所用试剂在制备用于鉴定HER2阳性胃癌患者的试剂盒中的用途或在制备用于鉴定能获益于靶向HER2的抗体疗法的HER2阳性胃癌患者的试剂盒中的用途。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述试剂包括用于检测来自血液的样品中HER2表达水平的检测试剂、用于从血液中提取囊泡的提取试剂和用于裂解囊泡的裂解试剂。
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-
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- 2020-12-09 CN CN202011426048.0A patent/CN112684173A/zh active Pending
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