KR101825644B1

KR101825644B1 - Nedd4-1 단백질의 발현 수준을 측정하는 물질을 포함하는 자궁경부암 진단용 조성물 및 이를 이용한 자궁경부암 진단을 위한 정보제공방법

Info

Publication number: KR101825644B1
Application number: KR1020150101144A
Authority: KR
Inventors: 신진우
Original assignee: (의료)길의료재단; 가천대학교 산학협력단
Priority date: 2015-07-16
Filing date: 2015-07-16
Publication date: 2018-02-05
Also published as: KR20170009316A

Abstract

본 발명은 생물학적 시료로부터 Nedd4-1 단백질 발현 수준을 측정하는 물질로 자궁경부암을 진단하는 조성물 및 이를 이용한 진단키트와, 상기 발현 수준을 정상 대조군 시료의 해당 단백질 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 진단을 위한 정보제공방법 및 자궁경부암 치료제 스크리닝 방법을 제공할 수 있다. 본 발명의 Nedd4-1 단백질 발현 수준을 측정하는 물질로 자궁경부암을 진단하는 조성물 및 이를 이용한 진단키트를 이용하면, 자궁경부암, 특히 자궁경부 편평상피세포암 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

Nedd4-1 단백질의 발현 수준을 측정하는 물질을 포함하는 자궁경부암 진단용 조성물 및 이를 이용한 자궁경부암 진단을 위한 정보제공방법{Composition for diagnosing cervical cancer comprising an agent for determining level of expression of Nedd4-1 and a method of providing information for diagnosis of cervical cancer using the same}

본 발명은 Nedd4-1 단백질의 발현 수준을 측정하는 물질을 포함하는 자궁경부암 진단용 조성물 및 이를 이용한 진단을 위한 정보제공방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 생물학적 시료로부터 Nedd4-1 단백질 발현 수준을 측정하는 물질로 자궁경부암을 진단하는 조성물 및 이를 이용한 진단키트와, 상기 발현 수준을 정상 대조군 시료의 해당 단백질 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 진단을 위한 정보제공방법 및 자궁경부암 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다.

자궁경부암은 자궁을 구성하고 있는 체부(corpus)와 경부(cervix) 중에서, 질에 연결된 자궁경부에 발생하는 악성종양을 말한다. 자궁경부암은 전 세계적으로 여성에게 발병하는 암 중 두 번째로 흔한 암이며, 여성의 암에 의한 사망원인 중 4위에 해당될 정도로 그 수가 매우 방대하다. 구체적으로, 자궁경부암의 발병률은 서구의 경우는 1999년부터 2010년까지 볼 때 점차적으로 감소되고 있다고 보고되고 있으나, 오히려 아시아, 남미, 아프리카 등의 개발도상국에는 그 수가 증가되고 있으며, 실제로 현재 자궁경부암 환자의 약 80%가 아시아, 남미, 아프리카 등의 개발도상국에서 발생하는 것으로 보고되고 있다. 뿐만 아니라, 전 세계의 자궁경부암으로 인한 죽음의 85% 이상은 다량의 백신을 위한 재정적인 지원을 제공받기에 어려움이 있는 저소득 국가에서 나타난다고 보고되고 있다. 따라서 자궁경부암 진단을 위한 연구 및 자궁경부암에 대한 특이적 치료는 여전히 필요하다고 볼 수 있다.

또한, 한국의 경우도 2014년에 발표된 중앙암등록본부 자료에 따르면, 2012년에 224,177건의 암이 발생되었는데, 그 중 상피내암을 제외시킨 자궁경부암은 3,584 건으로 전체 암 발생의 1.6%로 여성의 암 중에서는 7위를 차지하고 있고, 인구 10만 명당 조 발생률은 7.1건에 해당한다고 보고될 정도로 자궁경부암의 발병률이 높은 편이다. 구체적으로, 연령대별로 살펴보면, 40대가 26.5%로 가장 많고, 50대가 22.2%, 30대가 15.9%로 35세 미만의 젊은 사람들의 자궁경부암 발병이 점차 증가되고 있는 추세이고, 조직학적으로는 2012년의 자궁경부암 전체 발생건수 3,584건 가운데 암종(carcinoma)이 96.2%, 육종(sarcoma)이 0.2%를 차지하고 있고, 특히, 암종 중에서는 편평상피세포암이 73.6%, 선암이 17.3%으로 자궁경부 편평상피세포암의 비율이 월등히 높다고 보고되고 있다. 여성암 중 자궁경부암은 예방 백신이 개발되어 있고, 특히 편평상피세포암의 경우는 암으로 발전하는 데까지 기간이 길어 정기적인 검진으로 충분히 예방이 가능함을 감안한다면 아직까지도 우리나라의 자궁경부 편평상피세포암의 발병율은 매우 높은 편이라 할 수 있다.

자궁경부암으로 진단되면 수술하기 전에 임상적으로 질병이 어느 정도 진행되었는지를 나타내는 병기를 결정하기 위한 몇 가지 검사를 시행하게 되는데, 자궁경부암의 병기는 1기부터 4기까지로, 상기 분류에 따라 각 병기에 따른 치료 원칙이 정해져 있다. 1기에서 2기 초에는 수술이나 동시화학방사선요법이 모두 가능하고, 2기 말보다 더 진행된 암에 대해서는 동시화학방사선요법이 시행된다. 치료 후 5년 생존율은 1기 초의 경우 100% 까지도 가능하다. 그러나 1기 말은 80~90%, 2기 초는 70~80%, 2기 말은 60~65%, 3기는 35~45% 정도이고, 4기에 암이 발견되는 경우에는 치료에도 불구하고 5년 생존율이 15% 정도에 불과하다. 즉, 자궁경부암은 조기에 발견될수록 그 생존율이 매우 높음을 알 수 있는바, 그 예방을 위해서는 정기적인 검진을 통해 암을 조기에 발견하려는 노력이 필요하다.

자궁경부암을 진단하는 방법으로는 자궁경부 세포검사, 질확대경 검사, 조직생검, 원추 절제술, 또는 인유두종 바이러스 검사 등의 많은 검사 방법이 있으나, 상기 검사 중 자궁경부 세포검사는 질병이 있음에도 음성으로 나타나는 위음성률이 50%에 달하고, 검체 적정성의 부족, 검체 채취의 오류 등의 단점이 있다. 또한, 질확대경 검사나 조직생검, 또는 원추 절제술 진단방법은 직접 자궁경부를 관찰하여 자궁경부의 여러 가지 이상 징후를 직접 눈으로 확인하는 방법으로, 일반적으로 자궁경부암이 일정 단계가 진전되고 나서야 시행하는 진단방법으로, 그 과정이 복잡하며 비용면에서도 부담이 되고 있으며, 인유두종 바이러스 검사는 자궁경부암 조기 진단을 위한 것으로 자궁경부 세포진 검사보다는 민감도가 높은 방법에 해당하나, 자궁경부 세포진 검사와 같이 질병이 있음에도 음성으로 나타나는 위음성률이 높다는 단점을 여전히 가지고 있다. 따라서 상기의 다양한 방법에도 불구하고, 자궁경부암의 발병 여부를 초기에 정확히 판별할 수 있는 자궁경부암의 진단 조성물 및 자궁경부암의 진단방법의 개발은 여전히 필요한 실정이다.

한편, 단백질 Nedd4-1은 WW와 C2 도메인을 포함하고 E3 유비퀴틴 리가아제를 포함하고 있는 HECT 도메인의 구성으로(Harvey KF, Kumar S. Nedd4-like proteins: an emerging family of ubiquitin-protein ligases implicated in diverse cellular functions, Trends Cell Biol 1999;9:166-9), 상기 HECT 도메인은 인유두종 바이러스 E6 단백질의 도움을 가지는 종양 억제제 p53을 분해하는 E6 연합 단백질 (E6-AP) C 발단의 유사체(homologous)를 포함한다. HPV E6 단백질이 자궁경부암의 주요 온코프로테인(oncoprotein)이기 때문에 자궁경부암에서의 발암이 가능하다. Nedd4-1은 표피생장인자 수용체(EGFR), 세포사멸에 민감인자(sensitive to apoptosis, SAG), PTEN, 및 mdm2의 조절자로서 보고되고 있고(Lee JS, Choi YD et al., Expression of PTEN in the progressino of cervical neoplasia and its relation to tumor behavior and angiogenesis in invasive squamous cell carcinoma. J Surg Oncol 2006;93:233-40), 역시 온코프로테인의 특징을 나타낸다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 자궁경부암, 특히 자궁경부 편평상피세포암의 진단 조성물 및 이를 이용하는 진단방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 자궁경부암에서 온코프로테인(oncoprotein)으로 의심되는 Nedd4-1이 인접한 일반 및 CIN III 상피에서보다 자궁경부암에서 높은 과발현율을 가지고, 상기 자궁경부암 환자의 조직에서 일반 상피로부터 CIN III를 거쳐 암까지 가는 동안 Nedd4-1이 계속적으로 증가하는 과발현 패턴이 나타나며, 특히, 선암에서보다 편평상피세포에서 통계적으로 유의미한 수치가 나타난다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 Nedd4-1 단백질의 발현 수준을 측정하는 물질을 포함하는 자궁경부암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 자궁경부암 진단키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 진단하고자 하는 개체의 생물학적 시료로부터 Nedd4-1 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정한 발현 수준을 정상 대조군 시료의 해당 단백질 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 자궁경부 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현 수준이 정상 대조군 시료의 해당 단백질 발현 수준보다 높은 경우 자궁경부암으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는 자궁경부암 진단방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 자궁경부암 치료후보 물질을 자궁경부암 조직에 처리하여 Nedd4-1의 발현 정도를 측정하는 단계, 및 상기 측정한 발현 정도를 상기 후보물질을 처리하지 않은 대조군의 발현 정도와 비교하는 단계를 포함하는 자궁경부암 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 Nedd4-1 단백질의 발현 수준을 측정하는 물질을 포함하는 자궁경부암 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어, "Nedd4-1 단백질"은 WW와 C2 도메인을 포함하고 E3 유비퀴틴 리가아제를 포함하고 있는 HECT 도메인의 구성으로, 표피생장인자 수용체(EGFR), 세포사멸에 민감인자(sensitive to apoptosis, SAG), PTEN, 및 mdm2의 조절자이다.

본 발명에서 용어, "Nedd4-1 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 물질"은 Nedd4-1 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체 등의 항체 또는 앱타머를 포함한다.

본 발명에서 용어, "항체"는 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다.

본 발명의 Nedd4-1 단백질은 공지된 단백질이므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당해 기술분야의 일반적 기술자가 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 다클론 항체는 Nedd4-1 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조가능하다. 단일클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법((hybridoma method)(Kohler 및 Milstein(1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태 뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab’), F(ab’)2 및 Fv 등이 있다. 본 발명에서는 구체적으로, Nedd4-1 단백질의 수준을 측정하는 물질은 Nedd4-1 단백질을 특이적으로 인식하는 항체이다.

본 발명에서 용어, "앱타머"는 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 의미한다. 상기 앱타머는 RNA, DNA, 수식(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있는데, 대체로, 상기 앱타머를 구성하는 뉴클레오티드의 서열이 짧을수록 화학합성 및 대량 생산이 보다 용이하고, 비용면에서의 장점이 우수하며, 화학수식이 용이하고, 생체 내 안정성이 우수하며, 독성이 낮다고 알려져 있다. 본 발명의 목적상 상기 앱타머는 Nedd4-1 단백질에 결합함으로써, 상기 단백질의 발현수준을 측정할 수 있는 수단으로 해석될 수 있다.

본 발명에서 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 자궁경부암 진단 마커의 발현 유무를 확인하여 자궁경부암의 발병 여부를 확인하는 것이다.

본 발명의 진단 대상이 되는 자궁경부암은 구체적으로는 자궁경부 편평상피세포암일 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, Nedd4-1 과발현은 일반 상피에서는 15.6%, CIN III에서는 37.1%가 관찰되었는바, 상기 두 개 사이의 과발현 차이는 통계적으로 유의미하였다(p=0.027). 일반상피(15.6%)와 암(80.34%)에서의 Nedd4-1 과발현 차이도 통계적으로 유의미하였고(P<0.001), CIN III(37.1%) 및 암 (80.4%)에서의 Nedd4-1 과발현의 차이도 통계적으로 유의미하였다(p<0.001).

특히, 자궁경부 편평상피세포암과 자궁경부 선암 사이의 Nedd4-1 과발현의 차이가 통계적으로 유의미하였다(p=0.006).

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 자궁경부암 진단키트를 제공한다.

본 발명에서 용어, "진단키트"는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다. 구체적으로는, 본 발명에서 단백질 발현 수준을 측정하는 물질이 항체인 경우, 상기 진단키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 진단키트일 수 있다. 이러한 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면 표지된 2차 항체, 발색단, 효소(예: 항체와 접합) 및 그의 기질을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 진단하고자 하는 개체의 자궁경부암 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다. 구체적으로는, 진단하고자 하는 개체의 생물학적 시료로부터 Nedd4-1 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계 및 상기 발현 수준을 정상 대조군 시료의 해당 단백질 발현 수준과 비교하는 단계를 포함한다.

구체적으로, 상기 발현 수준 측정은 자궁경부암 발암단계(carcinogenesis)에서 측정될 수 있다.

본 발명에서 용어, "발암단계"는 자궁 상피가 악성으로 변환되는 단계를 의미한다. 상기 발현 수준 측정은 발암단계 뿐 아니라 자궁경부암 예후를 진단하는 단계에서도 측정될 수 있다.

구체적으로, 상기 자궁경부암은 자궁경부 편평상피세포암일 수 있다.

본 발명에서 용어, "진단하고자 하는 개체"는 자궁경부암이 이미 발생한 대상 또는 자궁경부암을 갖기 쉬운 대상을 포함하며, 포유동물일 수 있다. 구체적인 포유동물은, 예를 들면, 인간, 인간이 아닌 영장류, 마우스, 래트, 개, 고양이, 말, 및 소를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 용어, "생물학적 시료"란 자궁경부 편평상피세포암 발병에 의해 Nedd4-1 유전자의 발현 수준이 차이나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 본 발명의 생물학적 시료는 환자의 자궁경부 조직일 수 있다.

본 발명에서는 Nedd4-1 단백질 수준을 측정하기 위해 항체를 이용하는 경우, 생물학적 시료 내의 Nedd4-1 마커 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물을 형성하며, 이를 본 발명에서는 "항원-항체 복합체"로 표현한다. 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 단백질 수준을 측정하기 위한 분석방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

상기 발현 수준을 정상 대조군 시료의 해당 단백질 발현 수준과 비교하는 단계는 자궁경부 조직에서의 Nedd4-1 단백질 발현 수준을 정상개체의 대조군 시료에서의 Nedd4-1 단백질의 발현 수준과 비교하는 것이다.

본 발명에서 용어, "대조군"은 자궁경부암이 발생하지 않은 정상개체를 의미한다.

본 발명은 상기 발현 수준이 정상 대조군 시료의 해당 단백질 발현 수준보다 높은 경우 자궁경부암으로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 발현 수준이 정상 대조군 시료의 해당 단백질 발현 수준보다 높다는 것은, 자궁경부 조직에서의 Nedd4-1 단백질 발현 수준이 자궁경부암이 발생하지 않은 정상개체의 Nedd4-1 단백질의 발현 수준과 비교할 때 그 발현량이 높다는 것을 의미한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 자궁경부 조직에서 Nedd4-1 항원에 대한 면역조직화학 염색을 실시하여 Nedd4-1 항원의 발현 증가와 자궁경부암의 발생관계를 살펴보고, 정량 및 통계분석을 위하여 Nedd4-1 과발현의 비율을 키-스퀘어(chi-square) 테스트 또는 피셔스 이그잭트 테스트(Fisher’s exact test)를 이용하여 자궁경부암의 조직학 및 병리학적 하위유형에 따라 비교하여 계산하였다. p<0.05일 때를 유의기준으로 정하였다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 자궁경부암 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 자궁경부암 치료후보 물질을 자궁경부암 조직에 처리하여 Nedd4-1의 발현 정도를 측정하는 단계 및 상기 측정한 발현 정도를 상기 후보물질을 처리하지 않은 대조군의 발현 정도와 비교하는 단계를 포함한다.

구체적으로, 자궁경부암 치료 후보 물질의 존재 및 부재하에서 Nedd4-1의 발현의 증가 또는 감소를 비교하는 방법으로 자궁경부암 치료제를 스크리닝하는데 유용하게 사용될 수 있다. Nedd4-1의 발현이 감소된 경우, 상기 후보 물질을 자궁경부암 치료제라고 판단할 수 있다.

본 발명에서 용어, "후보 물질"은 자궁경부암을 치료할 수 있는 물질을 제한없이 포함하나, 그 예로 화합물, siRNA, 안티센스올리고뉴클레오티드, 항체, 항암제, 방사선 물질 등일 수 있다.

구체적으로, 상기 측정은 자궁경부암 발암단계(carcinogenesis)에서 측정될 수 있다.

상기 발암단계는 자궁 상피가 악성으로 변환되는 단계를 의미하며, Nedd4-1의 발현 정도의 측정은 발암단계 뿐 아니라 자궁경부암 예후를 진단하는 단계에서도 측정될 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 Nedd4-1의 자궁경부 조직에서의 과발현은 자궁경부암, 특히 자궁경부 편평상피세포암에서 특이적으로 나타나므로, 본 발명의 Nedd4-1의 발현 수준을 측정하는 물질을 포함하는 조성물은 자궁경부암 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 자궁경부암 시료의 조직학적 유형에 따른 Nedd4-1의 IHC 염색에 관한 것이다. 구체적으로, A는 일반 자궁경부 상피, B는 CIN III, C는 침습성 암에서의 Nedd4-1의 발현을 나타낸다. 또한, D는 일반 상피, CIN III, 및 침습성 암에서의 Nedd4-1의 과발현의 비율을 나타낸 표이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

실시예 1: 연구대상

본 발명자들은 2007년부터 2008년까지 한국 가천대학교 길병원 센터의 산부인과학부에서 자궁경부암으로 진단받은 후 자궁절제술(radical hysterectomy)을 받은 환자 51명을 대상으로 하였다. 편평상피세포암으로 진단받은 대상은 40명으로 총 78.4%, 선암은 8명으로 15.7%, 선-편평상피세포암은 3명으로 5.9%였다. 연령은 대략 39세에서 63세였으며 평균연령은 51.3세였다(표 1).

		명 (%)
나이(평균±SD)		51.3 ± 11.9
조직 (Histology)	편평상피세포암	40 (78.4)
	선암	8 (15.7)
	선-편평상피세포암	3 (5.9)
FIGO 단계	IA	3 (5.9)
	IB	45 (88.2)
	IIA	3 (5.9)
총 인원		51

FIGO: International Federation of Gynecology and Obstetrics

실시예 2: 파라핀 블록 준비 및 면역화학염색

1) 파라핀 블록 준비

근치적 자궁절제술(radical hysterectomy)을 받은 자궁경부암 환자로부터 본 연구기간동안 파라핀 블록을 수집하였다. 상기 파라핀 블록들은 일반 상피, 자궁경부 상피내 종양(CIN) III, 및 그 자체가 암을 가지고 있는 것들이 우선적으로 선택되었다. 대안적으로, 암과 함께 일반 상피를 가지고 있는 파라핀 블록 또는 암과 함께 CIN III를 가지고 있는 파라핀 블록이 선택되었다. 상기의 선택 절차들은 병리학 전문가에 의해 수행되었다.

2) 면역화학염색

Nedd4-1을 위한 면역화학적(immunohistochemical, ICH) 염색은 제조자의 지시에 따라 스트렙타피딘-과산화효소 분석(streptavidin-peroxidase assay)을 이용하여 수행되었다. 간단하게 말하면, 파라핀이 내포된 블록(paraffin-embedded blocks)에서 파라핀을 4㎛ 두께로 제거하고, 3%의 과산화수소로 내재적인 과산화효소를 불활성화하였다. 항원회수(antigen retrieval)를 위해, 상기 파라핀이 제거된 구획을 10 mmol/L의 구연산염 버퍼로 30분간 99-100℃에서 가열하였다. 항원회수 후, 연속적으로 상기 구획들을 1차 anti-Nedd4-1 항체(Millipore, billerica, MA)로 1:100의 희석상태에서 60분간 배양하였고, 홀스래디쉬(horseradish) 과산화효소-스트렙타피딘을 30분간 활용한 후 3,3’-디아미노벤키딘(3,3’-diaminobenzidine) 염색을 수행하였다. 상기 슬라이드들을 헤마톡실린(hematoxylin)으로 대조염색하고 고정하였다. Nedd4-1 발현은 암세포의 세포질 염색의 단계별 정도에 의해 평가되었다. 상기 염색 정도는 없음, 약함, 중간, 또는 강함으로 단계가 나뉘어져 있다. Nedd4-1의 과발현은 세포가 Nedd4-1의 염색 정도가 중간에서 강함일 때로 정의되었다.

실시예 3: 통계적 분석

Nedd4-1 과발현의 비율을 키-스퀘어(chi-square) 테스트 또는 피셔스 이그잭트 테스트(Fisher’s exact test)를 이용하여 자궁경부암의 조직학 및 병리학적 하위유형에 따라 비교하였다. 병리학적 타입과 Nedd4-1 과발현 사이의 경향 테스트의 수행에서는 리니어 바이 리니어 연합(Linear by linear association)을 사용하였다. 정상 상피 및 암에서의 Nedd4-1 과발현에 따른 전체 생존의 비교에서는 로그-랭크(Log-rank) 테스트를 수행하였다. 상기 임상 및 병리학적 데이터는 소셜 사이언스를 위한 통계적인 패키지(statistical package for the social sciences, SPSS) 17.0(IBM, NY)를 사용하여 분석하였다.

결과

복부의 근치적 자궁절제술에 의해 치료받은 자궁경부암을 가진 총 57명의 환자가 실험기간동안 확인되었다. 57명의 암 환자 중 51명의 환자가 파라핀 블록 구획의 기준을 충족하였다. 45명의 환자들이 국제적인 산부인과학부 연합(International Federation of Gynecology and Obstetrics, FIGO) IB로 진단받았고, 각각 3명의 환자가 IA 및 IIA로 진단받았다. 40명의 환자가 편평상피세포암(SCC)로 진단받았고, 8명 및 3명이 각각 선암(AC) 및 선-편평상피세포암(ASC)로 진단받았다(표 1).

총 51개의 슬라이드가 암을 가지고 있었고 35개의 슬라이드가 CIN III를 가지고 있었으며, 45개의 슬라이드가 일반 상피를 가지고 있었다(표 2). 51개의 슬라이드 중 32개는 암, CIN III 및 일반상피 3개를 모두 가지고 있었다.

	Nedd4-1 과발현		총	P value
	음성(%)	양성(%)	총	P value
일반 상피	38 (84.4)	7 (15.6)	45	< 0.001
CIN III	22 (62.9)	13 (37.1)	35
암	10 (19.6)	41 (80.4)	51

Nedd4-1 과발현은 일반 상피에서는 15.6%, CIN III에서는 37.1%가 관찰되었고, 상기 두 개 사이의 과발현 차이는 통계적으로 유의미하였다(p=0.027). 일반상피 (15.6%) 및 암(8034%)에서의 Nedd4-1 과발현의 차이도 통계적으로 유의미하였고(P<0.001), CIN III(37.1%) 및 암 (80.4%)에서의 Nedd4-1 과발현의 차이 또한 통계적으로 유의미하였다(p<0.001)(표 2 및 도 1).

특히, Nedd4-1 과발현에서의 유의미적인 차이는 SCC 및 AC 사이에서 두드러지게 관찰되었다(P=0.006). 그러나 AC 및 ASC 사이와 SCC 및 ASC 사이에서는 Nedd4-1 과발현에서의 통계적인 유의미적 차이가 관찰되지 않았다(각각, p=0.182 및 p=1.0)(표 3).

	Nedd4-1 과발현		총	P value
	음성(%)	양성(%)	총	P value
SCC	5 (12.5)	35 (87.5)	40	< 0.012
AC	5 (12.5)	3 (37.5)	8
ASC	0 (0)	3 (100)	3

결론적으로, 상기와 같은 결과를 통해 자궁경부 조직에서 Nedd4-1 단백질이 과발현되는 것을 이용하면 자궁경부암 진단을 할 수 있고, 특히, 자궁경부 편평상피세포암에 대해 더 확실하게 진단할 수 있다는 것을 알 수 있다. 또한, 자궁경부에서의 Nedd4-1 단백질의 과발현을 통해 자궁경부암 발암단계에서 자궁경부암을 조기진단 할 수 있음을 알 수 있다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

Nedd4-1 단백질의 발현 수준을 측정하는 물질을 포함하는 자궁경부암 진단용 조성물.
제1항에 있어서, Nedd4-1 단백질의 발현 수준을 측정하는 물질은 Nedd4-1 단백질을 특이적으로 인식하는 항체 또는 앱타머인 것인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 자궁경부암은 자궁경부 편평상피세포암인 것인, 자궁경부암 진단용 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 자궁경부암 진단키트.
진단하고자 하는 개체의 생물학적 시료로부터 Nedd4-1 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
상기 측정한 발현 수준을 정상 대조군 시료의 해당 단백질 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 자궁경부암 진단을 위한 정보제공방법.
제5항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 자궁경부암 조직인 것인, 자궁경부암 진단을 위한 정보제공방법.
제5항에 있어서, 상기 측정은 자궁경부암 발암단계(carcinogenesis)에서 측정하는 것인, 자궁경부암 진단을 위한 정보제공방법.
제5항에 있어서, 상기 자궁경부암은 자궁경부 편평상피세포암인 것인, 자궁경부암 진단을 위한 정보제공방법.
제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 측정한 발현 수준이 정상 대조군 시료의 해당 단백질 발현 수준보다 높은 경우 자궁경부암으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 자궁경부암 진단을 위한 정보제공방법.
자궁경부암 치료후보 물질을 자궁경부암 조직에 처리하여 Nedd4-1의 발현 정도를 측정하는 단계; 및
상기 측정한 발현 정도를 상기 후보물질을 처리하지 않은 대조군의 발현 정도와 비교하는 단계를 포함하는, 자궁경부암 치료제 스크리닝 방법.
제10항에 있어서, 상기 측정은 자궁경부암 발암단계(carcinogenesis)에서 측정하는 것인, 자궁경부암 치료제 스크리닝 방법.
제10항에 있어서, 상기 자궁경부암은 자궁경부 편평상피세포암인 것인, 자궁경부암 치료제 스크리닝 방법.