CN112710526A - 一种细胞固定保存液及其制备方法和应用 - Google Patents

一种细胞固定保存液及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种细胞固定保存液及其制备方法和应用，所述细胞固定保存液按重量百分数计由1％‑5％磷酸盐、30％‑70％脂肪醇或多元醇、5％‑10％有机胺盐、0.5％‑1％抗生素和15％‑60％水组成。本发明提供的细胞固定保存液在不含有醛类化合物的情况下仍保持细胞活性，对细胞进行保存固定，避免细胞中氨基酸与醛类物质结合而使蛋白质结构被破坏而使得抗原蛋白不能有效被抗体识别，在进行免疫化学染色实验前无需再使用高温高压设备进行抗原修复，简化了实验步骤，也避免因使用高温高压的仪器设备带来的实验风险高，结果不稳定的问题，使整个化学染色实验更加简便、稳定与安全。

Description

一种细胞固定保存液及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及临床医学技术领域，特别涉及一种细胞固定保存液及其制备方法和应用。
背景技术
对于液基脱落的细胞的免疫组化过程，需要将细胞放置于细胞固定固定保存液，免疫组化是临床诊断和组织病理学中常用的检测手段，抗原修复是免疫组化过程中不可忽略的关键步骤。在免疫组化过程中，常采用的固定液含有福尔马林，福尔马林的主要成分是甲醛，可用于保存细胞形态，稳定细胞基质，防止细胞发生自噬或蛋白移位。福尔马林中的甲醛可以特定地结合到某些氨基酸残基上，比如赖氨酸、酪氨酸、组氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺等。在这个反应中，组织上的活性氢首先与甲醛发生反应得到羟甲基，羟甲基再与其他的活性氢发生反应最终得到交联的蛋白。因为这一过程消耗了氨基中的氢，所以扰乱了氨基酸之间原有的氢键和相互作用，使蛋白质的三级或四级结构被破坏从而导致抗原不能很好的被抗体识别，从而影响了免疫细胞抗体识别效果。为此，使用含有福尔马林的细胞固定液固定固定保存液的免疫细胞化学染色还普遍需要使用高温、高压或化学试剂进行抗原修复，这样会导致免疫细胞化学染色实验步骤复杂繁琐，结果不稳定以及实验风险大。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种细胞固定保存液，液基脱落细胞样本取材后，放置于该细胞固定固定保存液中，在进行后续细胞化学染色实验前无需再使用高温高压设备或化学试剂进行抗原修复，简化了实验步骤，也避免因使用高温高压的仪器设备带来的实验风险高，结果不稳定的问题，使整个化学染色实验更加简便、稳定与安全。
本发明的另一个目的在于提供上述细胞固定保存液在免疫细胞染色中的应用。
本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：
本发明提供一种细胞的固定保存液，由磷酸盐、脂肪醇或多元醇、有机胺盐、抗生素和水组成，各组分按重量百分数计为：
水：15％-60％；
磷酸盐:1％-5％；
脂肪醇或多元醇：30％-70％；
有机胺盐：5％-10％；
抗生素：0.5％-1％。
本发明提供的细胞固定保存液，由磷酸盐、脂肪醇或多元醇、有机铵盐和抗生素组成，能够在保持PH值稳定情况下，为细胞提供生长和存活所需要的盐离子和氨基酸等成分，保持细胞活性，且加入的抗生素可加强细胞保存固定液所固定的细胞抗感染能力，且本发明细胞保存液不含有传统细胞固定保存液的中的福尔马林等醛类物质，可以避免传统细胞固定保存液的福尔马林等醛类化合物特定地结合到某些氨基酸残基上，最终形成交联蛋白，使蛋白质的三级或四级结构被破坏从而导致抗原不能很好的被抗体识别，在进行免疫细胞染色前无需进行高温抗原修复，简化了实验步骤，也避免因使用高温高压的仪器设备带来的实验风险高，结果不稳定的问题。
进一步地，所述细胞固定保存液各组分按重量百分数计为：
水：30％-40％；
磷酸盐：1％-4％；
脂肪醇或多元醇：35％-60％；
有机铵盐：8％-10％；
抗生素：1％。
进一步地，所述磷酸盐包括正磷酸盐、缩聚磷酸盐中一种或两种混合，加入磷酸盐可调节保存固定液的ph值，使得保存液呈弱酸性，在脱落细胞进入弱酸性的液基薄层保存液中时，脱落细胞所处的环境pH不会变化较大，不会从酸性环境直接过渡到碱性环境，避免细胞在固定时pH发生较大变化而破裂，进一步提高细胞固定的完整性和可靠性。而且，加入磷酸盐，不仅能维持pH值的稳定，而且能较长时间满足细胞良好生长所需的CO2浓度。
进一步地，所述脂肪醇包括甲醇、乙醇中的一种或两种混合；所述多元醇包括丙三醇、1,2,4-丁三醇、三羟甲基丙烷、季戊四醇中的一种或两种以上混合，通过醇类物质使得细胞低温保存时防止液基细胞保存液内的水分结冰。
进一步地，所述有机胺盐包括二氨基胍盐酸盐、2,4,5,6-四氨基嘧啶盐酸盐、氨基乙腈盐酸盐、6-硝基苯并咪唑硝酸盐一种或两种混合，加入有机铵盐，为细胞提供生长和存活所需要的盐离子和氨基酸等成分，保持细胞活性。
进一步地，所述抗生素包括喹诺酮类抗生素、β-内酰胺类抗生素、大环内酯类一种或两种混合，通过加入所述抗生素，使得细胞保存固定液所固定的细胞抗感染能力强。
本发明提供的细胞固定保存液的制备方法包含以下步骤：
(1)将磷酸盐和有机胺盐按照配方比例配好混合，加水进行溶解，制得第一混合溶液；
(2)往第一混合溶液再加入脂肪醇或多元醇，混合均匀，制得第二混合溶液；
(3)往第二溶液中加入抗生素，混合均匀，获得细胞固定保存液。
进一步地，本发明的细胞固定保存液可应用于细胞化学染色实验。
所述细胞化学染色实验包含以下步骤：
(31)用磷酸缓冲液冲洗载玻片；
(32)在载玻片上滴加内源性过氧化物酶阻断剂，如H2O2,室温下孵育10min-20min；
(33)再次用磷酸缓冲液冲洗载玻片；
(34)在载玻片上滴加封闭液，在室温下孵育10min-20min；
(35)在载玻片上滴加一抗稀释液，采用32℃恒温水浴30min-60min；
(36)再次用磷酸缓冲液冲洗；
(37)在载玻片上滴加二抗溶液，采用32℃恒温水浴10min-20min；
(38)再次用磷酸缓冲液冲洗载玻片；
(39)在载玻片上滴加显色液，如DAB显色液。
本发明所提供的细胞固定保存液不含有福尔马林等醛类化合物，所保存固定的液基脱落细胞的化学染色实验可不经过高温的抗原修复仍可取得良好的染色效果，使得整个实验过程高效快捷，同时由于不含醛类化合物有毒物质，也降低了化学染色实验的风险。
本发明相对于现有技术所具有的优点及有益效果：
(1)本发明提供的细胞保存固定液，对液基脱落细胞样本取材后进行保存固定，用于后续细胞化学染色实验，固定液不包含福尔马林等醛类化合物，仍能维持pH值的稳定，为细胞提供生长所需的CO2浓度，很好的维持细胞活性，防止细胞感染，固定保存细胞，避免醛类物质特定地结合到某些氨基酸残基上形成交联蛋白，使蛋白质的三级或四级结构被破坏从而导致抗原不能很好的被抗体识别，需进行高温抗原修复才可进行后续化学染色实验，本发明提供的细胞保存固定液则无需再使用高温、高压或化学试剂进行抗原修复仍能达到良好的化学染色效果，简化了实验步骤，也避免因使用高温高压的仪器设备带来的实验风险高，结果不稳定的问题，从而使整个免疫细胞化学染色更加简便、稳定与安全。
(2)本发明提供的细胞固定液，在不含无福尔马林等醛类化合物的情况下，能有效的维持细胞原有的形态结构和生理功能，且由于福尔马林等醛类化合物具有毒性且含有致癌物质，本发明提供的细胞固定液使得后续免疫临床实验更加安全无毒。
附图说明
图1为现有技术中含有甲醛的细胞保存固定液中的细胞在经过高温抗原修复后的染色效果；
图2为现有技术中含有甲醛的细胞保存固定液中的细胞在不经过高温抗原修复后的染色效果；
图3为本发明的实施例1中的细胞保存固定液保存的细胞进行高温抗原修复后的化学染色效果；
图4为本发明的实施例1中的细胞保存固定液保存的细胞不进行高温抗原修复后的化学染色效果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：一种细胞固定保存液的配方组分及制备方法
细胞固定保存液按如下量称取各组分，总量为100％：
组成物 组成物重量百分比(％)
正磷酸盐 1
甲醇 30
二氨基胍盐酸盐 10
青霉素 1
水 余量
制备方法如下：
步骤1：将正磷酸盐和二氨基胍盐酸盐按照配方比例配好混合，加水进行溶解，制得第一混合溶液；
步骤2：往第一混合溶液再加入甲醇，混合均匀，制得第二混合溶液；
步骤3：往第二溶液中加入青霉素，混合均匀，即得。
所述正磷酸盐为磷酸二氢钠。
实施例2：一种细胞固定保存液的配方组分及制备方法
细胞固定保存液按如下量称取各组分，总量为100％：
组成物 组成物重量百分比(％)
正磷酸盐 3
乙醇 45
二氨基乙腈盐酸盐 8
氯霉素 0.5
水 余量
步骤1：将正磷酸盐和二氨基乙腈盐酸盐按照配方比例配好混合，加水进行溶解，制得第一混合溶液；
步骤2：往第一混合溶液再加入乙醇，混合均匀，制得第二混合溶液；
步骤3：往第二溶液中加入氯霉素，混合均匀，即得。。
所述正磷酸盐为磷酸二氢钠。
实施例3：一种细胞固定保存液及制备方法
细胞固定保存液按如下量称取各组分，总量为100％：
Figure BDA0002246792590000041
Figure BDA0002246792590000051
步骤1：将缩聚磷酸盐和6-硝基苯并咪唑硝酸盐按照配方比例配好混合，加水进行溶解，制得第一混合溶液；
步骤2：往第一混合溶液再加入丙三醇，混合均匀，制得第二混合溶液；
步骤3：往第二溶液中加入红霉素，混合均匀，即得。
所述缩聚磷酸盐为六偏磷酸钠。
实施例4：一种细胞固定保存液及制备方法
细胞固定保存液按如下量称取各组分，总量为100％：
组成物 组成物重量百分比(％)
缩聚磷酸盐 5
季戊四醇 60
氨基乙腈酸盐 10
头孢菌素 0.5
水 余量
步骤1：将缩聚磷酸盐和氨基乙腈酸盐按照配方比例配好混合，加水进行溶解，制得第一混合溶液；
步骤2：往第一混合溶液再加入季戊四醇，混合均匀，制得第二混合溶液；
步骤3：往第二溶液中加入头孢菌素，混合均匀，即得。
所述缩聚磷酸盐为六偏磷酸钠。
实施例5：一种细胞固定保存液及制备方法
细胞固定保存液按如下量称取各组分，总量为100％：
组成物 组成物重量百分比(％)
正磷酸盐 5
1,2,4-丁三醇 35
2，4,5,6-四氨基嘧啶盐酸盐 10
链霉素 1
水 余量
步骤1：将正磷酸盐和2，4,5,6-四氨基嘧啶盐酸盐按照配方比例配好混合，加水进行溶解，制得第一混合溶液；
步骤2：往第一混合溶液再加入1,2,4-丁三醇，混合均匀，制得第二混合溶液；
步骤3：往第二溶液中加入链霉素，混合均匀，即得。
所述正磷酸盐为磷酸氢二钾。
实施例6：采用实施例1的细胞保存固定液的细胞取样的化学染色实验方法
采用实施例1中组分和方法制备的细胞保存固定液的细胞取样化学染色实验包含细胞取样样品制作与化学染色两个部分。
实验样本制作方法如下：
(1)对按照实施例1配置的细胞保存固定液进行宫颈细胞样本采集：将宫颈标本采集刷刷头毛尖插入确诊为宫颈癌的志愿者的宫颈口。轻轻用力使刷头上的刷毛紧贴子宫颈口。用手捏住刷杆尾部，顺时针方向旋转五圈。取出采集刷，卸下刷头放入细胞保存液瓶中，封盖。
(2)将步骤(1)中样本保存液使用TCT膜式机，通过负压和正压将附在TCT膜管上的细胞吹在载玻片上进行制片。
化学染色实验步骤方法如下：
(1)将取样制作好的玻片用磷酸缓冲液冲洗3次，每次1-2分钟；
(2)在玻片上滴加2-3滴内源性过氧化物酶阻断剂(如H2O2)，室温下孵育10-20min。
(3)再用磷酸缓冲液冲洗3次，每次1-2分钟；
(4)在玻片上滴加2-3滴或50-80ul封闭液，室温下孵育10-20min；
(5)在玻片上滴加1-2滴一抗稀释液，所述一抗稀释液为兔抗人P16蛋白的稀释液，经32℃恒温水浴30-60min；
(6)再用磷酸缓冲液冲洗3次，每次1-2分钟；
(7)在玻片上滴加1-2滴二抗溶液，所述二抗溶液为HRP标记山羊抗兔IgG溶液，经32℃恒温水浴10-20min；
(8)再用磷酸缓冲液冲洗3次，每次1-2分钟；
(9)在玻片上滴加2滴配置好的DAB显色液
根据颜色发展情况掌握染色时间，一般室温下染色时间约为5-10分钟或显微镜下观察5-10分钟，染色结果为棕黄色。
实施例7：市面细胞保存固定液的细胞取样与本发明细胞保存固定液细胞取样的化学染色效果的比较实验
本对比实验的实验样本分为四组：
①市面上含有甲醛的细胞保存固定液及其细胞取样；
②按照实施例1配置的细胞保存固定液其细胞取样；
③对①样本进行高温抗原修复后的细胞样品；
④对②样本进行高温抗原修复后的细胞样品。
样本制作过程如下：
(1)对市面含有甲醛的细胞保存固定液以及按照实施例1配置的细胞保存固定液进行宫颈细胞样本采集：将宫颈标本采集刷刷头毛尖插入确诊为宫颈癌的志愿者的宫颈口。轻轻用力使刷头上的刷毛紧贴子宫颈口。用手捏住刷杆尾部，顺时针方向旋转五圈。取出采集刷，卸下刷头放入细胞保存液瓶中，封盖。
(2)将步骤(1)中样本保存液使用TCT膜式机，通过负压和正压将附在TCT膜管上的
细胞吹在载玻片上进行制片，每个样本分别制作两组片子。
(3)将制得的一张片子进行高温修复，即得到样本③和样本④，另一张不进行高温修复，即得到样本①和样本②，高温修复的方法为放置于高压锅中高压高温10min。
将四组样本进行化学染色实验，对比观察染色效果。
染色实验步骤如下：
(10)将样本①-④的每张玻片用磷酸缓冲液冲洗3次，每次1-2分钟；
(11)每张玻片滴加2-3滴内源性过氧化物酶阻断剂(如H2O2)，室温下孵育10-20min。
(12)每张玻片磷酸缓冲液冲洗3次，每次1-2分钟；
(13)每张玻片滴加2-3滴或50-80ul封闭液，室温下孵育10-20min；
(14)每张玻片滴加1-2滴稀释后的一抗溶液，所述一抗稀释液为兔抗人P16蛋白的稀释液，经32℃恒温水浴30-60min；
(15)每张玻片磷酸缓冲液冲洗3次，每次1-2分钟；
(16)每张玻片滴加1-2滴二抗溶液，所述二抗溶液为HRP标记山羊抗兔IgG溶液，经32℃恒温水浴10-20min；
(17)每张玻片磷酸缓冲液冲洗3次，每次1-2分钟；
(18)每张玻片滴加2滴配置好的DAB显色液
根据颜色发展情况掌握染色时间，一般室温下染色时间约为5-10分钟或显微镜下观察5-10分钟，染色结果为棕黄色。
结果显示，如下表：③组和④组进行高温修复与不进行高温修复的染色效果差别不大。
实验组别 染色情况
①组：市面含有甲醛的保存液的细胞取样进行高温抗原修复 显棕色
②组：市面含有甲醛的保存液的细胞取样不进行高温抗原修复 不显色
③组：按照实施例1配置的保存液的细胞取样进行高温抗原修复 显棕色
④组：按照实施例1配置的保存液的细胞取样不进行高温抗原修复 显棕色
以上实验的染色对比结果可知，使用本发明提供的细胞保存固定液在不经过高温抗原修，其化学染色结果仍然良好，与使用传统带有福尔马林的细胞保存固定液进行高温修复后的染色效果无显著差别。使用本发明的细胞保存固定液，由于不含福尔马林、醛类化合物等剧毒致癌物质，使实验操作更加安全，可以避免需要高温修复而使用其他的具有安全风险的加热仪器设备，降低实验风险，且不用高温修复，化学染色的实验过程也会比较高效快捷。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

Claims (10)

1.一种细胞固定保存液，其特征在于，由磷酸盐、脂肪醇或多元醇、有机胺盐、抗生素和水组成，各组分按重量百分数计为：
水：15％-60％；
磷酸盐:1％-5％；
脂肪醇或多元醇：30％-70％；
有机胺盐：5％-10％；
抗生素：0.5％-1％。
2.根据权利要求1所述的细胞固定保存液，其特征在于，所述细胞固定保存液各组分按重量百分数计为：
水：30％-40％；
磷酸盐：1％-4％；
脂肪醇或多元醇：35％-60％；
有机铵盐：8％-10％；
抗生素：1％。
3.根据权利要求1所述的细胞固定保存液，其特征在于，所述磷酸盐包括正磷酸盐、缩聚磷酸盐中一种或两种混合。
4.根据权利要求1所述的细胞固定保存液，其特征在于，所述脂肪醇包括甲醇、乙醇中的一种或两种混合；所述多元醇包括丙三醇、1,2,4-丁三醇、三羟甲基丙烷、季戊四醇中的一种或两种以上混合。
5.根据权利要求1所述的细胞保存固定液，其特征在于，所述有机胺盐包括二氨基胍盐酸盐、2,4,5,6-四氨基嘧啶盐酸盐、氨基乙腈盐酸盐、6-硝基苯并咪唑硝酸盐中的一种或两种以上混合。
6.根据权利要求1所述的细胞固定保存液，所述抗生素包括喹诺酮类抗生素、β-内酰胺类抗生素、大环内酯类中的一种或两种以上混合。
7.一种权利要求1所述的细胞固定保存液的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将磷酸盐和有机胺盐按照配方比例配好混合，加水进行溶解，制得第一混合溶液；
(2)往第一混合溶液再加入脂肪醇或多元醇，混合均匀，制得第二混合溶液；
(3)往第二溶液中加入抗生素，混合均匀，获得细胞固定保存液。
8.权利要求1～6任意一项所述的细胞固定保存液在细胞化学染色中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述细胞化学染色包括以下步骤：
(1)提供细胞样本，将细胞样品置于所述细胞固定保存液中，得到样本保存液；
(2)采用样本保存液制备样本载玻片；
(3)制得的样本载玻片直接进行化学染色。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述化学染色包括以下步骤：
(31)用磷酸缓冲液冲洗载玻片；
(32)在载玻片上滴加内源性过氧化物酶阻断剂，室温下孵育10min-20min；
(33)再次用磷酸缓冲液冲洗载玻片；
(34)在载玻片上滴加封闭液，在室温下孵育10min-20min；
(35)在载玻片上滴加一抗稀释液，采用32℃恒温水浴30min-60min；
(36)再次用磷酸缓冲液冲洗；
(37)在载玻片上滴加二抗溶液，采用32℃恒温水浴10min-20min；
(38)再次用磷酸缓冲液冲洗载玻片；
(39)在载玻片上滴加显色液。
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