CN105994252A - 一种液基薄层细胞保存液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种液基薄层细胞保存液及其制备方法，所述液基薄层细胞保存液由以下组分组成：KCl1％‑3％；KH₂PO₄1％‑3％；Na₂HPO₄0.1％‑1％；EDTA‑2Na0.01％‑0.1％；乙二醇5％‑10％；dd H₂O70％‑77.79％；异丙醇15％‑20％；甲醛0.1％‑1％。本发明具有以下优点和效果：采用KCl、KH₂PO₄和Na₂HPO₄混合体系，调节液基薄层细胞保存液内Na⁺、K⁺浓度以保持细胞固定时细胞内外合理的渗透压，同时形成中性的缓冲体系，能固定正常和病变后的宫颈脱落细胞形态和大小，提高细胞保存的完整性和可靠性，其次，通过乙二醇和异丙醇组成的渗透性防冻剂，在细胞低温保存时防止液基细胞保存液内的水分结冰，最后，通过采用较低浓度的甲醛，在固定细胞的同时与EDTA‑2Na联合提高液基薄层细胞保存液的杀菌性能，提高安全性。

Description

一种液基薄层细胞保存液及其制备方法

技术领域

本发明涉及宫颈细胞病理检测领域，特别涉及一种液基薄层细胞保存液及其制备方法。

背景技术

液基细胞保存液是液基细胞学检测技术主要耗材。液基薄层细胞制片检查系统处理技术诞生于1991年，率先应用于妇科细胞学检查，国内从2001年开始作液基细胞学筛查宫颈癌的研究，使该项技术得到迅速发展。液基细胞保存液在妇科细胞学检查中,一般采用将样品细胞固定在溶液中,即终止任何正在进行的生化反应,增加样品的机械强度和稳定性,尽可能以接近生物材料的天然状态来保存样品,用于检验或者分析。

公开号为CN105409925A的中国专利《一种液基细胞保存液》公开了一种液基细胞保存液，涉及一种病理检验，尤其是对人体的子宫颈粘液、痰液、尿液、浆膜腔积液、气管粘液等细胞病理检验时使用的液基细胞保存液。该液基细胞保存液是由醇类、磷酸钠缓冲液、乙二胺四乙酸二钠、氯化钠0.08％-0.12％、氯化钾、甲醛、二硫苏糖醇、醋酸钙、醋酸镁等配制而成。

但是该液基细胞保存液存在以下缺点：磷酸钠缓冲液与醋酸钙、醋酸镁发生化学反应后生成磷酸镁磷酸钙沉淀和醋酸钠、醋酸，磷酸钠缓冲液形成的中性缓冲系统被破坏,化学反应后形成的醋酸和醋酸钠组成新的酸性的缓冲系统，醋酸具有腐蚀性,使细胞病理检测中的子宫颈粘液等样品中的红细胞在酸性和腐蚀性的环境下破裂，破裂的红细胞释放内容物如血红蛋白等，会对后续的分析和检测产生不良影响，例如血红蛋白沉积后会妨碍梅格吉染色、免疫细胞化学检测等等

发明内容

本发明的目的是提供一种液基薄层细胞保存液，具有稳定溶液缓冲体系,细胞形态完整性好的效果。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种液基薄层细胞保存液，以质量百分比计，所述液基薄层细胞保存液由以下成分组成

细胞，是能进行独立繁殖的有膜包围的生物体的基本结构和功能单位，其一般由质膜、细胞质和核(或拟核)构成。细胞内的主要阳离子是K⁺和Na⁺，当将细胞置于外环境中时，细胞内、外的K⁺和Na⁺的存在一定的浓度差，这将导致细胞内、外的压力不平衡，使得细胞内的水分外流或细胞外的溶液进入细胞内，这两种情况均会造成细胞膜破裂且细胞无法保持其原始状态，影响检测结果。本申请采用KCl、KH₂PO₄和Na₂HPO₄混合体系来调节，本申请的一种液基细胞保存液中的K⁺和Na⁺浓度，平衡细胞内外的K⁺和Na⁺浓度，从而平衡细胞内外的压力。首先，通过KCl和KH₂PO₄对本申请的一种液基细胞保存液中的可溶性K⁺进行补充，以增加细胞外的K⁺浓度来与细胞内主要阳离子K⁺平衡；其次，KH₂PO₄和Na₂HPO₄组成的缓冲系统，可用于调节本申请的一种液基细胞保存液的pH，有利于稳定平衡细胞内、外的压力，其中本申请的缓冲系统的调节机理为：当本申请的一种液基细胞保存液固定细胞时，pH值过高时，多余的碱就会与磷酸二氢根离子形成磷酸氢根离子，降低溶液的pH值；当pH值过低时，磷酸氢根离子就会与酸中的氢离子形成磷酸二氢根离子，提高溶液的pH值，有助于保持溶液恒定的pH值，使细胞不会在细胞固定中因pH变化而破裂；综上，通过KCl、KH₂PO₄和Na₂HPO₄的组合作用，将细胞置于本申请中的一种液基细胞保存液后，细胞处于合理的渗透性状态，既不会大量吸水而破裂，也不会失去水分而收缩，能避免渗透压造成细胞膜、细胞质膜和细胞核膜的破裂，从而避免细胞破裂，保持细胞的正常形态，进一步提高细胞检测结果的可靠性。

检测用细胞保持完整是细胞检测结果可靠性的前提，本申请通过乙二醇、异丙醇和甲醛的联合作用来实现对细胞的固定，其作用过程为：当样品细胞刚放入液基细胞保存液，在细胞未失活前，乙二醇、异丙醇和甲醛与样品细胞接触，首先，甲醛与细胞膜上蛋白质的氨基发生反应，对细胞大小形态进行固定，使得后期作用时细胞大小不会发生收缩(如醇作用于细胞后细胞存在收缩)的情况，保持细胞完整性；其次，乙二醇和异丙醇扩散到细胞质液内，对细胞进行固定，使细胞失活固定时保持在正常的状态；综上，通过乙二醇、异丙醇和甲醛的组合作用，细胞得到固定且固定后的细胞完整；另外，甲醛可以与抗凝聚机EDTA-2Na相联合，在固定细胞的同时防止细胞发生凝聚，进一步提高细胞检测的操作可行性和结果可靠性。

本申请的一种液基细胞保存液还具有较好的抑菌效果：本申请采用0.1wt％-1wt％的甲醛，甲醛兼具有良好的抗菌性能，可以减少外加抗菌剂的使用；革兰氏阴性菌的肽聚糖层位于细胞内壁层，其外覆盖大量的脂多糖，EDTA-2Na与甲醛联合作用后，EDTA-2Na与细胞表面的脂多糖之间盐桥二价阳离子鳌合，使细菌的细胞膜失去稳定性，达到增强液基细胞保存液杀菌性能的作用，可以提高安全性。

本发明的进一步设置为：所述液基薄层细胞保存液中KH₂PO₄的质量百分比为1wt％-1.5wt％，Na₂HPO₄的质量百分比为0.8wt％-1wt％。

宫颈粘液中正常的pH为7.0-8.2，偏弱碱性，但是病变后的宫颈粘液pH降低，变成酸性。在用本申请的一种液基薄层细胞保存液对宫颈粘液内的细胞进行保存时，KH₂PO₄溶于水后电离出K⁺和H₂PO₄ ^-，Na₂HPO₄溶于水后电离出NA⁺和HPO₄ ^2-，KH₂PO₄的质量百分比高于Na₂HPO₄的质量百分比，使本申请的液基薄层保存液pH在6-7之间，偏弱酸性，病变后酸性的宫颈粘液内脱落细胞进入弱酸性的液基薄层保存液中时，脱落细胞所处的环境pH不会变化较大，不会从酸性环境直接过渡到碱性环境，避免细胞在固定时pH发生较大变化而破裂，进一步提高细胞固定的完整性和可靠性。

本发明的进一步设置为：所述液基薄层细胞保存液内甲醛的质量百分比为0.1wt％-0.8wt％。

甲醛是易挥发的刺激性气体，具有毒性、致突变性、生殖毒性和致癌性，人对甲醛的嗅觉阈通常是0.06-0.07mg/m³，长期、低浓度接触甲醛会引起头痛、头晕、乏力、感觉障碍、免疫力降低，并可出现瞌睡、记忆力减退或神经衰弱、精神抑郁，本申请的一种液基薄层细胞保存液采用较低浓度的甲醛含量，质量百分比为0.1wt％-0.8wt％，使本申请的液基薄层细胞保存液内的甲醛仅具有刺激性，不会对人员健康产生影响，进一步提高安全性。

本发明的另一个目的在于提供一种液基薄层细胞保存液的制备方法，包括如下步骤：

a)将配方量的Na₂HPO₄、KH₂PO₄、KCl、EDTA-2Na溶解于dd H₂O中形成溶液a；

b)将步骤a)获得的溶液a搅拌均匀,得到溶液b；

c)向步骤b)获得的溶液b中加入配方量的乙二醇、异丙醇，搅拌均匀,得到溶液c；

d)向步骤c)获得的溶液中加入配方量的甲醛，搅拌均匀；

以上各步骤都是在常温，湿度≤90％RH下进行。

综上所述，本发明具有以下有益效果：采用KCl、KH₂PO₄和Na₂HPO₄混合体系，调节液基薄层细胞保存液内Na⁺、K⁺浓度以保持细胞固定时细胞内外合理的渗透压，同时形成中性的缓冲体系，既能固定处于弱碱性环境下的正常宫颈脱落细胞形态和大小，又能固定病变后处于酸性环境下的宫颈脱落细胞形态和大小，其次，通过乙二醇和异丙醇组成的渗透性防冻剂，在细胞低温保存时防止液基细胞保存液内的水分结冰，最后，通过采用较低浓度的甲醛，在固定细胞的同时与EDTA-2Na联合提高液基薄层细胞保存液的杀菌性能，提高安全性。

具体实施方式

具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

实施例1：一种液基薄层细胞保存液，其由如下方法制备得到：

在常温(25℃)，湿度≤90％RH下，按质量份称取1份KH₂PO₄、1份Na₂HPO₄、1份KCl、1份EDTA-2Na放入电搅拌桶内，再用量筒量取75.9份dd H₂O加入电搅拌桶内，开启电源以1500rpm搅拌2小时；再用量筒配合移液器量取5份乙二醇、15份异丙醇加入电搅拌桶内，搅拌30分钟；再用量筒配合移液器量取0.1份甲醛加入溶液内，盖上筒盖、搅拌30分钟。

实施例2：一种液基薄层细胞保存液，与实施例1的不同之处在于，按质量份，组分含量为KCl3份；KH₂PO₄3份；Na₂HPO₄0.1份；EDTA-2Na0.01份；乙二醇10份；dd H₂O 62.89份；异丙醇20份；甲醛1份。

实施例3：一种液基薄层细胞保存液，与实施例1的不同之处在于，按质量份，组分含量为KCl2份；KH₂PO₄1.2份；Na₂HPO₄0.9份；EDTA-2Na0.1份；乙二醇5份；dd H₂O75.3份；异丙醇15份；甲醛0.5份。

实施例4：一种液基薄层细胞保存液，与实施例3的不同之处在于，按质量份，EDTA-2Na的份数为1份，dd H₂O 74.4份。

对比例1：与实施例1的不同之处在于，KH₂PO₄更换为醋酸，Na₂HPO₄更换为醋酸钠。

对比例2：与实施例1的不同之处在于，按质量份，甲醛为0份，dd H₂O 76份。

对比例3：与实施例3的不同之处在于，按质量份，EDTA-2Na含量为0份，dd H₂O76.2份。

采集一份宫颈分泌物样品，均等分为7份，每份1g,分别浸入实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4所述的15ml的液基薄层细胞保存液内进行处理，再将获得的液体制备成细胞悬液，将制备的细胞悬液进行过滤离心，再将过滤离心后的液体分成两份，一份用作细胞完整性实验,另一份进行抗菌性实验。

试验1细胞形态完整性测试试验

试验仪器:实验仪器：复式双筒显微镜(带油镜)、Motic数码互动系统、擦镜纸、盖玻片、载玻片、镊子、记号笔、小片滤纸、吸头。

其他材料：Motic校准片。

试验材料：过滤离心处理后的宫颈细胞悬液1ml。

试验步骤：1)在一干净的载玻片上滴10微升宫颈细胞悬液，涂布开，加盖玻片，用同样方法制备10块待检玻片。

2)将motic校准片置于载物台上，以0.15mm黑点对准通光孔，物镜调至40倍镜下，调节旋钮至电脑屏幕上出现边缘清晰的黑色圆点。

3)点击工具栏上“动态测量”，在屏幕左侧出现工作框。在“校准”下选择圆直径600，物镜倍数40×，然后点击“校准”框。

4)取下校准片，换上待测标本。在40倍镜下调节清楚后，观察细胞形态，是否破损、凝集等。

5)在40倍镜下调节清楚后，以动态测量工具中选择适当的工具，在屏幕上点击，便可测定细胞的直径或面积等数据。

在表1中列出试验结果。

表1

	细胞形态	细胞平均大小(μm)
			实施例1	正常	17.3
实施例2	正常	29.2
			实施例3	正常	25.6
实施例4	正常	20.1
			对比例1	破损	-
对比例2	大小不一	6.4
			对比例3	凝集	-

试验2抗菌性能测试试验

1)用吸管吸取5ml宫颈细胞悬液于试管内，再加入45ml灭菌生理盐水，形成稀释液。

2)向5个灭菌的平皿内加入1ml稀释液，再将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿约15ml，并转动平皿，混合均匀。

3)待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养48±2h，取出计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每毫升样品所含菌落总数。

在表2中列出试验结果。

表2

	菌落数量(个/ml)
		实施例1	84
实施例2	14
		实施例3	39
实施例4	27
		对比例1	57
对比例2	1463
		对比例3	53

Claims (4)

1.一种液基薄层细胞保存液，其特征在于：以质量百分比计，所述液基薄层细胞保存液由以下成分组成

2.根据权利要求1所述的一种液基薄层细胞保存液，其特征在于：所述液基薄层细胞保存液中KH₂PO₄的质量百分比为1wt％-1.5wt％，Na₂HPO₄的质量百分比为0.8wt％-1wt％。

3.根据权利要求2所述的一种液基薄层细胞保存液，其特征在于：所述液基薄层细胞保存液内甲醛的质量百分比为0.1wt％-0.8wt％。

4.一种如权利要求1所述的液基薄层细胞缓冲液的制备方法，其特征在于：

a)将配方量的Na₂HPO₄、KH₂PO₄、KCl、EDTA-2Na溶解于dd H₂O中形成溶液a；

b)将步骤a)获得的溶液a搅拌均匀,得到溶液b；

c)向步骤b)获得的溶液b中加入配方量的乙二醇、异丙醇，搅拌均匀,得到溶液c；

d)向步骤c)获得的溶液c中加入配方量的甲醛，搅拌均匀；

以上各步骤都是在常温，湿度≤90％RH下进行。