KR101924401B1 - 구강상피세포 보존액과 이의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 구강상피세포 보존액과 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 구강상피세포의 세포질과 세포막에 존재하는 단백질 변성을 최소화하여 형태학적 구조를 유지하면서 세포의 건조 및 부패를 방지하여 세포형태를 원래의 형태에 가깝게 장기간 보존이 가능한 구강상피세포 보존액과 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 구강상피세포 보존액은 증류수 100중량부에 대하여 완충액 2 내지 10중량부와, 방부제 5 내지 15중량부를 함유하고, 상기 방부제는 티몰(thymol)을 알코올에 용해시킨 티몰액을 포함한다.

Description

구강상피세포 보존액과 이의 제조방법{preserving solution for oral epithelium cell and manufacturing method thereof}
본 발명은 구강상피세포 보존액과 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 구강상피세포의 세포질과 세포막에 존재하는 단백질 변성을 최소화하여 형태학적 구조를 유지하면서 세포의 건조 및 부패를 방지하여 세포형태를 원래의 형태에 가깝게 장기간 보존이 가능한 구강상피세포 보존액과 이의 제조방법에 관한 것이다.
일반적으로 세포 검체는 크게 자궁경부세포로 대표되는 부인과(gynecology) 검체와, 복수액이나 늑막액과 같은 체액이나 기관지 세척액 등이 대상이 되는 비-부인과(non-gynecology) 검체로 구분된다. 이들 검체 대상으로부터 수집된 세포를 현미경으로 검사하여 암세포의 유무를 포함하여 각종 질환 여부를 확인한다.
종래 세포병리학적 방법을 이용한 검사 방법으로서는 수집된 세포를 슬라이드 위에 도말하여 검사하는 세포진검사(Papanicolaou smear)가 주로 이용되고 있다. 하지만, 종래의 세포진 검사를 이용하는 경우에 세포를 슬라이드 상에 도말하는 과정에서 세포들이 건조되고, 점액이나 적혈구 등이 잔류하여 정확한 판독이나 진단이 곤란하였다. 또한 채집된 세포의 대부분이 슬라이드 상에 도말되지 못하기 때문에 검사의 신뢰성에서 한계가 있었다.
이러한 종래의 세포진 검사를 대체하여 액상세포검사(Liquid Based Cytology)가 개발되었다. 액상세포검사는 세포학적 진단을 위하여 채집된 세포를 보존액에 보관하고 필요한 경우에 보존액에 보관된 세포를 검사하여 세포의 이상 유무, 즉 특정 질환의 발생 여부를 검사, 확인한다. 액상세포검사와 관련해서는 적절히 염색되고 적절하게 보존된 세포의 단층(monolayer)을 포함하는 세포 검체를 표준화된 슬라이드 상에 놓고 자동적으로 스크리닝(screening)하는 기법 및 장치가 개발되기도 하였다.
기존의 세포진 검사와 비교할 때, 액상세포검사에서는 채집된 검체 세포가 슬라이드 상에 균일하게 분포한다. 또한 액상세포검사는 세포진 검사와 비교할 때, 세포의 고정이 향상되고, 불명료한 인자가 감소하며, 특히 자궁경부암의 진단과 관련해서 채집된 검체의 대부분을 버리는 세포진 검사와 달리 채집된 대부분의 세포를 활용할 수 있기 때문에, 검사의 특이성(specificity)과 민감도(sensitivity)를 향상시킬 수 있는 것으로 알려져 있다.
액상세포검사 중에서도 가장 널리 사용되고 있는 제품은 SurePath(TriPath Imaging, Inc, Burlington, NC, USA) 및 ThinPrep(Cytyc Corp, Marlborough, MA, USA)이다. 이들 제품에서는 인체로부터 채취한 검체를 브러시 기구 중 하나로 채집하여, 세포 보존액에 보관하였다가 추후의 세포조직학적 검사를 수행할 수 있도록 구성되어 있다. 세포 보존액에 보관된 검체는 농도 구배에 따라 적층되거나 원심분리한 후 필터에 의하여 분리하여 필요한 염색을 하여 검사하게 된다.
하지만, 현재 액상세포검사에 사용되는 세포 보존액을 사용하면 세포를 장기간 보관할 수 없을 뿐만 아니라, 세포 내에 잔류하는 혈구, 점액, 단백질성 물질 등이 완전히 제거되지 못하여 별도의 가공 공정이 요구된다.
대한민국 등록특허 제 10-0987949호에는 세포 보존액이 개시되어 있다.
상기 세포 보존액은 완충 용액 40~70%, 케톤 1.0~10.0%, 세포 코팅제 1.0~10.0%, 폴리올 0.1~2.0%, 가교결합제 0.2~5.0%, 세제 0.1~0.5%, 점액용해제 0.1~2.0%, PH유지제 0.1~2.0%, 혈액제거제0.1~2.0%, 방부제 0.1~0.5% 및 나머지 잔량이 용매를 포함한다.
상기 세포 보존액은 11종류의 물질들을 혼합하여 제조하므로 그 구성이 매우 복잡하다는 문제점이 있다.
대한민국 등록특허 제 10-0987949호: 세포 보존액
본 발명의 상기의 문제점을 개선하고자 창출된 것으로서, 조성이 간단하여 제조가 용이하면서 구강상피세포의 건조 및 부패를 방지하여 원래의 형태에 가깝게 장기간 보존이 가능한 구강상피세포 보존액과 이의 제조방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.
상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 구강상피세포 보존액은 증류수 100중량부에 대하여 완충액 2 내지 10중량부와, 방부제 5 내지 15중량부를 함유하고, 상기 방부제는 티몰(thymol)을 알코올에 용해시킨 티몰액을 포함한다.
상기 방부제는 포르말린 100중량부에 대하여 상기 티몰액 1 내지 10중량부를 혼합한다.
상기 완충액은 증류수100중량부에 대하여 제 1인산나트륨 5 내지 15중량부와, 제 2인산나트륨 10 내지 20중량부를 용해시켜 상기 보존액의 pH가 6.5~7.2로 형성된 것을 특징으로 한다.
그리고 상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 구강상피세포 보존액의 제조방법은 증류수 100중량부에 대하여 제 1인산나트륨 5 내지 15중량부와, 제 2인산나트륨 10 내지 20중량부를 용해시켜 완충액을 수득하는 완충액형성단계와; 알코올 100중량부에 대하여 0.1 내지 10중량부의 티몰(thymol)을 용해시켜 티몰액을 수득하는 티몰액형성단계와; 포르말린 100중량부에 대하여 상기 티몰액 1 내지 10중량부를 혼합하여 방부제를 수득하는 방부제형성단계와; 증류수 100중량부에 대하여 상기 완충액 2 내지 10중량부와, 상기 방부제 5 내지 15중량부를 혼합하는 혼합단계;를 포함한다.
상술한 바와 같이 본 발명은 조성이 간단하여 제조가 용이하면서 구강상피세포의 건조 및 부패를 방지하여 원래의 형태에 가깝게 장기간 보존이 가능하다.
도 1은 보존 1일차 구강상피세포의 모습을 나타낸 현미경 사진이고,
도 2는 보존 10일차 구강상피세포의 모습을 나타낸 현미경 사진이고,
도 3은 보존 30일차 구강상피세포의 모습을 나타낸 현미경 사진이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하면서 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 구강상피세포 보존액과 이의 제조방법에 대하여 구체적으로 설명한다.
본 발명의 구상상피세포 보존액은 인체의 구강에서 채취한 구강상피세포를 보존하여 세포병리학적 진단을 하는 액상세포검사(Liquid Based Cytology)를 하기 위한 용액이다. 구강상피세포의 일 예로 편평상피세포(squamous epithelium cell)를 들 수 있다. 액상세포검사는 세포학적 진단을 위하여 채집된 세포를 보존액에 보관하고 필요한 경우에 보존액에 보관된 세포를 검사하여 세포의 이상 유무, 즉 특정 질환의 발생 여부를 검사하고 확인한다.
본 발명의 일 예에 따른 구강상피세포 보존액은 증류수, 완충액, 방부제를 혼합하여 형성된다. 가령, 구강상피세포 보존액은 증류수 100중량부에 대하여 완충액 2 내지 10중량부와, 방부제 5 내지 15중량부를 함유할 수 있다.
증류수는 용매로 사용된다. 증류수를 멸균처리된 멸균 증류수를 이용하는 것이 바람직하다.
완충액은 보존액의 pH를 일정하게 유지시켜 급격한 pH 변화를 막아 세포의 형태를 정상적인 형태로 유지한다.
본 발명에 적용되는 완충액으로 증류수에 제 1인산나트륨과 제 2인산나트륨을 용해시킨 것을 이용할 수 있다. 가령, 증류수 100중량부에 대하여 제 1인산나트륨 5 내지 15중량부와, 제 2인산나트륨 10 내지 20중량부를 용해시켜 완충액을 얻는다. 제 1인산나트륨은 약산성, 제 2인산나트륨은 알칼리성 물질로서, 2종류의 인산나트륨을 혼합하여 이용하는 경우 보존액의 pH를 6.5~7.2 범위 내의 중성으로 유지시키는데 효과적이다. 따라서 본 발명은 별도의 pH유지제를 필요로 하지 않는다. 또한, 이러한 완충액은 버퍼용액으로서의 기능뿐만 아니라 세포코팅제, 점액용해제, 혈액제거제의 효과를 부가적으로 갖는다.
방부제는 미생물 등에 의한 세포의 부패를 방지한다. 통상적으로 세포 보존액에는 방부제로 소듐아자이드, 구연산, 소르브산, 벤조산나트륨, 포르말린 등이 사용된다.
본 발명은 이와 달리 방부제로서 티몰액을 사용한다. 티몰액은 티몰을 알코올에 용해시킨 것이다. 가령, 알코올 100중량부에 대하여 0.1 내지 10중량부의 티몰을 용해시켜 티몰액을 수득할 수 있다.
티몰(thymol)은 무색의 결정 또는 백색의 결정성 분말로서, 천연에서 유래한 항균활성물질이다. 티몰은 천연으로는 사향초유에 함유되어 있으며, 꿀풀과 식물 정유(精油)의 주성분이다. 천연에서 유래한 티몰을 방부제로 사용할 경우 세포에 부작용 없이 세포의 보존효과를 높일 수 있다.
본 발명에서 방부제의 다른 예는 포르말린과 티몰액을 혼합한 것이다. 가령, 포르말린 100중량부에 대하여 티몰액 1 내지 10중량부를 혼합할 수 있다. 포르말린은 포름알데히드의 수용액으로서, 농도 30 내지 40%(w/w)일 수 있다.
이하, 상술한 구강상피세포 보존액의 제조방법에 대하여 설명한다.
먼저, 완충액을 준비한다. 이를 위해 증류수 100중량부에 대하여 제 1인산나트륨 5 내지 15중량부와, 제 2인산나트륨 10 내지 20중량부를 용해시켜 완충액을 수득한다.
다음으로, 방부제를 준비한다.
방부제를 얻기 위해 알코올 100중량부에 대하여 0.1 내지 10중량부의 티몰(thymol)을 용해시켜 티몰액을 수득한다. 알코올에 티몰을 첨가한 후 40 내지 50℃로 알코올의 온도를 유지시킨 상태에서 20분 동안 초음파를 가해 티몰을 용해시킬 수 있다.
이렇게 수득한 티몰액을 방부제로 이용한다. 이와 달리 포르말린과 티몰액을 혼합한 것을 방부제로 이용할 수 있다. 이 경우 포르말린 100중량부에 대하여 티몰액 1 내지 10중량부를 혼합하여 방부제를 수득할 수 있다.
다음으로, 증류수에 완충액, 방부제를 혼합하여 구상상피세포 보존액을 제조한다. 가령, 증류수 100중량부에 대하여 완충액 2 내지 10중량부와, 방부제 5 내지 15중량부를 혼합할 수 있다.
완충액의 혼합비율이 2 내지 10중량부 범위 내에서 적절한 pH를 유지할 수 있다. 그리고 방부제의 혼합비율이 5중량부 미만이면 미생물 증식 억제와 같은 방부 효과를 기대하기 어렵고, 10중량부를 초과하면 세포 보존액의 점도가 지나치게 높아질 수 있다.
본 발명의 구강상피세포 보존액은 조성이 간단하여 제조가 용이하면서 구강상피세포의 건조 및 부패를 방지하여 원래의 형태에 가깝게 장기간 보존을 가능하게 한다.
인체의 구강에서 채취한 구상상피세포는 본 발명의 보존액에 보관한다. 그리고 필요시 보존액 내에 보관되던 구강상피세포를 검사하여 세포의 이상 유무를 진단할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 구체적으로 설명한다. 이는 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리 범위를 하기의 실시 예로 한정하는 것은 아니다.
(실시 예)
증류수 100중량부에 대하여 제 1인산나트륨 10중량부와, 제 2인산나트륨 15중량부를 용해시켜 완충액을 수득하였다. 증류수, 제 1인산나트륨, 제 2인산나트륨은 주식회사 대정화금에서 구입한 것을 이용하였다.
그리고 에탄올 100중량부에 대하여 5중량부의 티몰(시그마알드리치, 미국)을 용해시켜 티몰액을 얻은 다음, 포르말린(덕산약품공업 주식회사, 한국) 100중량부에 대하여 티몰액 5중량부를 혼합하여 방부제를 수득하였다.
그리고 증류수 100중량부에 대하여 완충액 6중량부와, 방부제 10중량부를 혼합하여 pH 6.8인 구강상피세포 보존액을 제조하였다.
<보존실험>
상기 실시 예의 구강상피세포 보존액의 보존효과를 살펴보기 위해 채취한 구강상피세포를 보존액에 한달간 보관하여 시간에 따른 구강상피세포의 형태변화를 관찰하였다.
1. 구강상피세포의 채취
면봉을 이용하여 피실험자의 혀 아랫부분에서 구강상피세포를 채취하였다.
2. 보존
면봉을 보존액에 넣어 흔든 다음 면봉을 제거한다. 그리고 구상상피세포가 들어있는 보존액을 20℃의 실온에서 보관하였다.
3. 세포관찰
보관된 보존액 2cc를 채취하여 슬라이드글라스에 도포한 후 염색하여 현미경으로 관찰하였다.
4. 실험결과
보존 1일차, 10일차, 30일차의 현미경 사진을 도 1 내지 도 3에 각각 나타내었다.
도 1 내지 도 3을 참조하면, 세포 보존액에 보관 중인 세포들은 10일 이상이 경과된 후에도 세포의 원형이 그대로 유지되고 있는 것으로 확인되었다.
따라서 본 발명은 구강상피세포의 건조 및 부패를 방지하여 원래의 형태에 가깝게 장기간 보존이 가능한 구강상피세포 보존액과 이의 제조방법을 제공할 수 있다.
이상, 본 발명은 일 실시 예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 실시 예가 가능하다는 점을 이해할 것이다.

Claims (4)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 증류수 100중량부에 대하여 제 1인산나트륨 5 내지 15중량부와, 제 2인산나트륨 10 내지 20중량부를 용해시켜 완충액을 수득하는 완충액형성단계와;
    알코올 100중량부에 대하여 0.1 내지 10중량부의 티몰(thymol)을 용해시켜 티몰액을 수득하는 티몰액형성단계와;
    포르말린 100중량부에 대하여 상기 티몰액 1 내지 10중량부를 혼합하여 방부제를 수득하는 방부제형성단계와;
    증류수 100중량부에 대하여 상기 완충액 2 내지 10중량부와, 상기 방부제 5 내지 15중량부를 혼합하여 pH 6.5 내지 7.2의 보존액을 수득하는 혼합단계;를 포함하고,
    상기 티몰액형성단계는 상기 알코올을 40 내지 50℃로 유지시킨 상태에서 20분 동안 초음파를 가해 상기 티몰을 용해시키는 것을 특징으로 하는 구강상피세포 보존액의 제조방법.
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