KR20140090811A - 비부인과용 세포 보존액 - Google Patents

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KR20140090811A
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김동욱
김현창
제갈승주
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전북대학교산학협력단
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Abstract

본 발명은 알코올 30 ~ 50 w/v% 및 증류수 50 ~ 65 w/v%를 포함하는 용매; 완충제 1.0 ~ 2.5 w/v%; 혈액제거제 0.1 ~ 1.5 w/v%; 단백질 침전제 0.1 ~ 1.5 w/v%; 혈액응고방지제 0.1 ~ 1.5 w/v%; 건조 방지제 0.1 ~ 2.0 w/v%; 삼투압 조절제 0.1 ~ 1.5 w/v%; 방부제 0.1 ~ 1.5 w/v%; 점액용해제 0.1 ~ 1.5 w/v%; 및 점액 연화제 0.1 ~ 1.5 w/v%를 포함하는 세포 보존액에 관한 것이다. 본 발명의 세포 보존액을 사용하면 보관 기간 중의 세포의 변성이 최소화되고 적정 pH를 유지할 수 있으며, 세포의 건조 및 부패를 방지하여 세포 형태를 원래의 형태에 가깝게 보존할 수 있으며, 예를 들어 비-부인과 검체용의 세포 보존액으로 활용될 수 있다.

Description

비부인과용 세포 보존액{NON-GYNECOLOGIC CELL PRESERVING SOLUTION}
본 발명은 세포 보존액에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 세포의 형태학적 보존이 가능한 비부인과용 세포 보존액에 관한 것이다.
암을 비롯한 각종 질병을 확인하기 위한 다양한 방법이 알려져 있으나, 질환이 의심되는 인체 영역 중의 세포를 채취하여 그 병리적 형태를 살펴보는 이른바 세포병리학(cytopathology)적인 방법이 가장 확실한 것으로 알려져 있다. 세포병리학적인 방법을 이용한 세포 검사를 위해서는 질환이 의심되는 인체 영역의 세포를 수집하여 현미경으로 검사한다.
일반적으로 세포 검체는 크게 자궁경부세포로 대표되는 부인과(gynecology) 검체와, 복수액이나 늑막액과 같은 체액이나 기관지 세척액 등이 대상이 되는 비-부인과(non-gynecology) 검체로 구분된다. 이들 검체 대상으로부터 수집된 세포를 현미경으로 검사하여 암세포의 유무를 포함하여 각종 질환 여부를 확인한다.
종래 세포병리학적 방법을 이용한 검사 방법으로서는 수집된 세포를 슬라이드 위에 도말하여 검사하는 세포진 검사(Papanicolaou smear, 약칭하여 Pap smear)가 주로 이용되고 있다. 하지만, 종래의 세포진 검사를 이용하는 경우에 세포를 슬라이드 상에 도말하는 과정에서 세포들이 건조되고, 점액이나 적혈구 등이 잔류하여 정확한 판독이나 진단이 곤란하였다. 또한 채집된 세포의 대부분이 슬라이드 상에 도말되지 못하기 때문에 검사의 신뢰성에서 한계가 있었다.
이러한 종래의 세포진 검사를 대체하여 액상세포검사(Liquid Based Cytology)가 개발되었다. 액상세포검사는 세포학적 진단을 위하여 채집된 세포를 보존액에 보관하고 필요한 경우에 보존액에 보관된 세포를 검사하여 세포의 이상 유무, 즉 특정 질환의 발생 여부를 검사, 확인한다. 액상세포검사와 관련해서는 적절히 염색되고 적절하게 보존된 세포의 단층(monolayer)을 포함하는 세포 검체를 표준화된 슬라이드 상에 놓고 자동적으로 스크리닝(screening)하는 기법 및 장치가 개발되기도 하였다.
기존의 세포진 검사와 비교할 때, 액상세포검사에서는 채집된 검체 세포가 슬라이드 상에 균일하게 분포한다. 또한 액상세포검사는 세포진 검사와 비교할 때, 세포의 고정이 향상되고, 불명료한 인자가 감소하며, 특히 자궁경부암의 진단과 관련해서 채집된 검체의 대부분을 버리는 세포진 검사와 달리 채집된 대부분의 세포를 활용할 수 있기 때문에, 검사의 특이성(specificity)과 민감도(sensitivity)를 향상시킬 수 있는 것으로 알려져 있다.
액상세포검사 중에서도 가장 널리 사용되고 있는 제품은 SurePath(TriPath Imaging, Inc, Burlington, NC, USA) 및 ThinPrep(Cytyc Corp, Marlborough, MA, USA)이다. 이들 제품에서는 인체로부터 채취한 검체를 브러시 기구 중 하나로 채집하여, 세포 보존액에 보관하였다가 추후의 세포조직학적 검사를 수행할 수 있도록 구성되어 있다. 세포 보존액에 보관된 검체는 농도 구배에 따라 적층되거나 원심분리한 후 필터에 의하여 분리하여 필요한 염색을 하여 검사하게 된다.
하지만, 현재 액상세포검사에 사용되는 세포 보존액을 사용하면 세포를 장기간 보관할 수 없을 뿐만 아니라, 세포 내에 잔류하는 혈구, 점액, 단백질성 물질 등이 완전히 제거되지 못하여 별도의 가공 공정이 요구된다. 특히 현재 널리 사용되고 있는 액상세포검사는 고가의 장비를 필요로 한다. 따라서 보다 저렴한 비용으로 액상세포검사를 수행할 수 있고, 세포의 형태를 그대로 유지하면서 장기간 보관할 수 있는 세포 보존액을 개발할 필요성이 있다.
본 발명은 전술한 종래기술의 문제점을 해소하기 위하여 제안된 것으로, 본 발명의 기본적인 목적은 인체에서 채취한 세포를 원래의 형태로 장기간 보존할 수 있으며 세포병리학적 검사에서 세포의 형태를 용이하게 파악할 수 있는 비부인과용 세포 보존액을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 저렴한 비용으로 세포병리학적 검사를 수행할 수 있는 비부인과용 세포 보존액을 제공하는데 있다.
전술한 목적을 갖는 본 발명에 따른 세포 보존액은 알코올 35 ~ 50 w/v% 및 증류수 50 ~ 65 w/v%를 포함하는 용매; 완충제 1.0 ~ 2.5 w/v%; 혈액제거제 0.1 ~ 1.5 w/v%; 단백질 침전제 0.1 ~ 1.5 w/v%; 혈액응고방지제 0.1 ~ 1.5 w/v%; 건조 방지제 0.1 ~ 2.0 w/v%; 삼투압 조절제 0.1 ~ 1.5 w/v%; 방부제 0.1 ~ 1.5 w/v%; 점액용해제 0.1 ~ 1.5 w/v%; 및 점액 연화제 0.1 ~ 1.5 w/v%를 포함한다.
용매로 사용가능한 상기 알코올은 메탄올, 에탄올, 이소프로판올 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택될 수 있으며, 상기 완충제는 트리스(하이드록시메틸)메틸아민(tris(hydroxymethyl)methylamine, Tris)일 수 있다.
한편, 상기 혈액제거제는 아세트산이고, 상기 단백질 침전제는 아세톤 또는 황산암모늄이며, 상기 혈액응고방지제는 구연산나트륨, 에틸렌디아민 테트라아세트산(ethylenediamine tetra-acetic acid, EDTA), 옥살산나트륨 및 헤파린으로 구성되는 군에서 1종 이상 선택될 수 있다.
아울러, 상기 건조방지제는 글리세린이고, 상기 삼투압 조절제로는 덱스트로스, 염화나트륨, 중탄산나트륨, 염화칼슘, 염화칼륨, 락트산 나트륨 및 링거액으로 구성되는 군에서 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 한다.
사용 가능한 상기 방부제는 아지드화나트륨, 소르브산, 벤조산나트륨 및 포르말린으로 구성되는 군에서 1종 이상 선택될 수 있다.
또한, 상기 점액 용해제는 아세틸시스테인(Acetylcysteine), 카르복시메틸 시스테인(Carboxymethyl cysteine), 에르도스테인(Erdostein), 레토스테인(Letostein) 및 폴리에틸렌글리콜-p-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)-페닐에테르(polyethylene glycol-p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether, Triton X-100)로 구성되는 군에서 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 한다.
한편, 본 발명에 따른 비부인과 검체용의 세포 보존액에 함유될 수 있는 상기 점액 연화제는 폴리에틸렌글리콜, 부틸렌글리콜 및 소르비톨로 구성되는 군에서 1종 이상 선택된다.
본 발명에 따른 세포 보존액은 예를 들어 액상세포검사에 활용할 수 있도록 인체에서 분리한 세포를 액상에서 원래의 형태로 장기간 보관할 수 있게 하여, 세포병리학적 검사에서 세포의 형태를 용이하게 파악할 수 있으며, 특히 비부인과 검체용으로 사용될 수 있다.
뿐만 아니라, 본 발명에 따른 보존액은 세포병리학적인 진단에서 어려움을 초래하는 혈액, 단백질성 물질 및 점액을 제거함으로써, 세포병리학적 검사를 통하여 세포의 이상 형태에 대한 특이성(specificity) 및 민감도(sensitivity)를 향상시킬 수 있을 것으로 기대된다.
특히 종래 세포 보존액에 사용되었던 자일렌(xylene)에 의한 용액 혼탁 및 세포 변성을 줄일 수 있으며, 필요한 경우에 세포의 건조를 방지함으로써 건조에 따른 염색상의 변화를 방지할 수 있다. 이에 따라, 종래 세포진 검사(pap smear)에서 대부분이 폐기되었던 세포를 모두 보존할 수 있어서 진단의 정확도를 크게 향상시킬 수 있다.
아울러, 현재 대부분의 세포 보존액이 외국 회사에서 개발된 고가의 제품을 이용하고 있는데 반하여, 본 발명에 따른 세포 보존액을 사용함으로써 상대적으로 저가의 비용으로 세포병리학적 검사에 활용될 수 있다. 아울러, 보존액에 남아 있는 검체를 이용하여 면역조직학적 검사나 분자생물학적 검사 등을 추가로 수행할 수 있는 이점을 갖는다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 비-부인과용 세포 보존액과 비교예에서 제조된 세포 보존액에 보관된 검체 세포의 염색 정도 및 세포 형태를 촬영한 사진.
도 2는 본 발명의 다른 실시예에 따라 제조된 비-부인과용 세포 보존액과 상업적으로 판매되고 있는 세포 보존액에 보관된 검체 세포의 염색 정도 및 세포 형태를 촬영한 사진.
이하, 첨부하는 도면을 참조하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 인체로부터 수집된 세포의 형태를 원래대로 보존하기 위하여 세포의 단백질 변성을 최소화하고, 보관 기간 동안 적정 pH를 유지할 수 있도록 하며, 세포 채취 후에 세포의 건조 및 부패를 방지함으로써, 세포 형태를 원래의 형태로 보존하기 위한 세포 보존액에 관한 것이다. 이러한 목적을 갖는 본 발명의 세포 보존액은 예를 들어, 비-부인과(non-gynecology) 검체용의 세포 보존액으로 사용될 수 있다.
먼저, 본 발명에 따른 비-부인과 검체용의 세포 보존액은 용매, 완충제, 혈액제거제, 단백질 침전제, 혈액응고방지제, 건조방지제, 삼투압 조절제, 방부제, 점액 용해제 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 세포 보존액에 사용될 수 있는 용매는 바람직하게는 알코올과 증류수의 혼합 용매를 사용할 수 있다. 알코올은 세포에 대한 침투성, 탈수 및 세균 억제 기능은 물론이고, 검체 세포의 슬라이드 부착력과 세포 고정을 증가시키는 역할을 수행할 수 있다. 예를 들어, 용매로서 사용가능한 알코올은 메탄올, 에탄올, 이소프로판올 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택될 수 있고, 바람직하게는 에탄올이다.
용매로서의 알코올은 세포 보존액 중에 30 ~ 50 w/v%, 바람직하게는 35 ~ 45 w/v%, 더욱 바람직하게는 35 ~ 40 w/v%(예를 들어 38.60 w/v%)의 농도로 포함될 수 있다. 한편, 혼합 용매를 구성하는 다른 용매인 증류수는 예를 들어 1차 증류수를 사용할 수 있으며, 50 ~ 65 w/v%, 바람직하게는 55 ~ 60 w/v%(예를 들어 57.90 w/v%)의 양으로 사용될 수 있다.
특히, 본 발명에 따르면 세포 보존액의 pH를 일정하게 유지시키기 위한 목적으로 전술한 용매에 완충제를 사용할 수 있다. 완충제를 사용함으로써 세포 보존액의 pH를 중성 범위, 예를 들어 pH 6.0 ~ 9.5 범위로 유지시켜 보관 중인 세포가 변성되는 것을 방지할 수 있다. 즉, 본 발명의 세포 보존액 중에 사용되는 완충제는 세포 보존액의 pH를 일정하게 유지함으로써, 세포의 형태를 원래의 정상적인 형태로 유지하는 동시에 염색 과정에서 pH에 따라 구분되는 염료들의 착색에 있어서 정확한 색채를 나타나게 한다.
본 발명의 세포 보존액에 사용될 수 있는 완충제는 상온(15 ~ 25℃)에서의 pKa 값이 7.0 ~ 9.0인 것을 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 세포 보존액에 사용될 수 있는 완충제는 트리스(하이드록시메틸)메틸아민(tris(hydroxymethyl)methylamine, Tris; pKa 8.06), 3-{[트리스(하이드록시메틸)메틸]아미노}프로판술폰산(3-{[tris(hydroxymethyl)methyl]amino}propane sulfonic acid, TAPS; pKa 8.43), 3-[N-트리스(하이드록시메틸)메틸아미노]-2-하이드록시프로판술폰산(3-[N-Tris(hydroxymethyl)methylamino]-2-hydroxypropane sulfonic Acid, TAPSO, pKa 7.63), 2-{[트리스(하이드록시메틸)메틸]아미노}에탄술폰산(2-{[tris(hydroxymethyl)methyl]amino}ethane sulfonic acid, TES; pKa 7.40), N,N-비스(2-하이드록시에틸)글리신(N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine, Bicine; pKa 8.35) 및 N-트리스(하이드록시메틸)메틸글리신(N-tris(hydroxymethyl)methyl glycine, Tricine; pKa 8.05)으로 구성되는 군에서 1종 이상 선택될 수 있지만, 본 발명이 예시한 완충제로 한정되는 것은 결코 아니다. 본 발명에 따른 세포 보존액 중의 완충제로서 바람직하게는 Tris, TAPS, TAPSO, TES, Tricine을 사용할 수 있으며, 특히 바람직하게는 Tris이다.
이러한 완충제는 세포 보존액 중에 1.0 ~ 2.5 w/v%, 바람직하게는 1.0 ~ 2.0 w/v%(예를 들어 1.45 w/v%)의 비율로 사용될 수 있다. 완충제의 함량이 이보다 적으면 pH 유지가 곤란할 수 있으며, 이를 초과하면 다른 성분을 사용할 수 없어서 세포를 보관하는 과정에서 세포의 변성이 일어날 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 세포 보존액에는 전술한 용매와 완충제 성분 외에도 검체 세포의 변성이나 도말 과정에서의 세포의 건조 및 부패를 방지하기 위한 기능성 첨가제를 포함한다. 이러한 기능성 첨가제의 일예로서 용혈 기능을 제공할 수 있는 혈액제거제를 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 혈액제거제의 예로는 아세트산을 사용할 수 있는데, 혈액제거제는 본 발명의 세포 보존액 중에 0.1 ~ 1.5 w/v%, 바람직하게는 0.5 ~ 1.0 w/v%(예를 들어 0.72 w/v%)의 양으로 포함될 수 있다.
또한 검체 세포 중에 포함될 수 있는 단백질 성분을 제거하기 위한 단백질 침전제가 포함된다. 사용가능한 단백질 침전제로는 아세톤과 같은 케톤류 또는 황산암모늄을 들 수 있지만, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다. 특히 아세톤을 사용하는 경우에 세포를 고정할 수 있는 동시에 본 발명의 세포 보존액을 검체 세포 내부로 효과적으로 침투할 수 있다.
단백질 침전제는 본 발명의 세포 보존액 중에 0.1 ~ 1.5 w/v%, 바람직하게는 0.1 ~ 0.5 w/v%(예를 들어 0.24 w/v%)의 농도로 포함될 수 있다. 단백질 침전제의 함량이 전술한 범위 미만이면 검체 세포 중에 포함될 수 있는 단백질 제거 효과를 기대하기 어렵고, 전술한 범위를 초과하면 오히려 세포의 변성이 일어날 수 있다.
아울러, 본 발명의 세포 보존액 중에는 혈액응고방지제가 포함될 수 있다. 혈액응고방지제를 사용함으로써 검체 세포에 포함된 혈액이 제거되는 과정에서 중간에 응고되어 진단 과정에서 에러를 유발할 수 있기 때문이다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 혈액응고방지제의 예로는 구연산나트륨, 에틸렌디아민 테트라아세트산(ethylenediamine tetra-acetic acid, EDTA), 옥살산나트륨 및 헤파린으로 구성되는 군에서 1종 이상 선택될 수 있다. 혈액응고방지제는 본 발명의 세포 보존액 중에 0.1 ~ 1.5 w/v%, 바람직하게는 0.1 ~ 0.5 w/v%(예를 들면 0.12 w/v%)의 양으로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 세포 보존액에는 건조방지제가 사용될 수 있다. 특히 바람직하게 사용될 수 있는 건조방지제는 투명한 화합물인 글리세린인데, 바람직하게는 세포 보존액 중에 0.1 ~ 2.0 w/v%, 바람직하게는 0.3 ~ 1.0 w/v%(예를 들면 0.48 w/v%)의 양으로 사용된다.
더욱이, 본 발명의 세포 보존액에는 삼투압 조절제를 포함함으로써, 세포 보존액이 적절한 삼투압을 유지하도록 함으로써 검체 세포의 보존 성능을 향상시킬 수 있다. 사용될 수 있는 세포 보존액은 덱스트로스, 염화나트륨, 중탄산나트륨, 염화칼슘, 염화칼륨, 락트산 나트륨 및 링거액으로 구성되는 군에서 1종 이상 선택될 수 있다. 예를 들면 삼투압 조절제는 본 발명의 세포 보존액 중에 0.1 ~ 1.5 w/v%, 바람직하게는 0.1 ~ 0.5 w/v%(예를 들면 0.12 w/v%)의 농도로 사용되는 것이 적절한 삼투압을 유지하여 검체 세포로의 침투성을 향상시킬 수 있다.
한편, 검체 대상이 되는 세포의 미생물 등에 의한 부패를 방지하기 위하여 본 발명에 따른 세포 보존액에는 방부제를 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 방부제의 예로는 아지드화나트륨, 소르브산, 벤조산나트륨 및 포르말린으로 구성되는 군에서 1종 이상 선택될 수 있다. 방부제는 본 발명에 따른 세포 보존액 중에 0.1 ~ 1.5 w/v%, 바람직하게는 0.1 ~ 0.5 w/v%(예를 들면 0.12 w/v%)의 양으로 포함될 수 있다. 방부제의 함량이 전술한 범위 미만이면 미생물 증식 억제와 같은 방부 효과를 기대하기 어렵고, 전술한 범위를 초과하면 세포 보존액의 점도가 지나치게 높아질 수 있다.
뿐만 아니라 예를 들면 비-부인과 검체용으로 사용될 수 있는 본 발명의 세포 보존액에는 점액 용해제(mucolytic agent)가 사용될 수 있다. 점액 용해제로서 사용될 수 있는 성분으로는 아세틸시스테인(Acetylcysteine), 바람직하게는 S-카르복시메틸 시스테인(S-carboxy methylcysteine, SCMC)인 카르복시메틸 시스테인(Carboxymethylcystein), 에르도스테인(Erdostein), 레토스테인(Letostein) 및 폴리에틸렌글리콜-p-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)-페닐에테르(polyethylene glycol-p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether, Triton X-100)로 구성되는 군에서 1종 이상 선택되는 것을 들 수 있다. 특히, Triton X-100의 경우에는 비-이온성 계면활성제로서 점액을 분산시키는데 적절하게 사용될 수 있다. 점액 용해제는 본 발명의 세포 보존액 중에 0.1 ~ 1.5 w/v%, 바람직하게는 0.1 ~ 1.0 w/v%(예를 들면 0.24 w/v%)의 농도로 사용될 수 있다.
특히, 비-부인과 검체 세포는 점액질이 다량 포함될 수 있으므로, 본 발명에 따른 세포 보존액에는 전술한 점액 용해제 외에 추가적으로 점액 연화제를 사용할 수 있다. 점액 연화제는 폴리에틸렌글리콜, 부틸렌글리콜 및 소르비톨로 구성되는 군에서 1종 이상 선택될 수 있다.
예를 들어 폴리에틸렌글리콜은 점액 연화 기능과 아울러 일종의 접착제로서 세포의 탈락을 방지하고, 세포의 수축 방지 및 동결 보관하는 경우에는 동해 방지 등의 기능을 갖는다. 이와 같은 점액 연화제를 추가로 사용하는 경우에 검체 세포의 건조 방지 효과를 증가시킬 수 있을 뿐만 아니라, 점액 용해제로 사용가능한 Triton X-100의 계면활성 기능을 강화하여 점액을 연화시킴으로써 점액 용해 효과를 더욱 극대화할 수 있다. 이에 따라 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT)과 같은 별도의 점액 용해제를 첨가할 필요가 없다. 예를 들어 점액 완화제는 본 발명의 세포 보존액 중에 0.1 ~ 1.5 w/v%, 바람직하게는 0.1 ~ 1.0 w/v%(예를 들면 0.2 w/v%)의 농도로 사용될 수 있다.
전술한 성분 및 농도로 배합된 세포 보존액은 상온(15 ~ 30℃) 또는 필요한 경우에는 약 -80℃의 온도에서 동결 건조된 상태로 앰플이나 크라이오튜브 등의 용기에 보관할 수 있다. 한편, 본 발명에 따른 세포 보존액의 보관 대상인 검체 세포는 예를 들어 브러시를 이용하여 인체 또는 다른 동물로부터 채집할 수 있으며, 원심 분리 등을 통해서 검체 세포를 분리할 수 있다.
이때, 보관 대상이 되는 검체 세포는 비-부인과 검체일 수 있다. 비-부인과 검체의 예로는 기관지 세척물(편평상피세포, 원주섬모세포, 폐포대식세포, 정상세포, 악성세포--편평상피암종, 선암종), 복수액/늑막액과 같은 체액(중피세포, 반응성 중피세포)을 들 수 있지만, 본 발명에 따른 세포 보존액에 보관될 수 있는 비-부인과용 검체가 이들로 한정되는 것은 결코 아니다.
본 발명에 따른 세포 보존액을 사용하여 검체 세포를 보관하는 경우, 예를 들어 1주일, 1개월, 6개월, 12개월, 18개월 또는 24개월 이상과 같은 장기간이 경과하더라도 검체 세포가 변성되지 않고 원래의 상태로 보존될 수 있다.
이어서 적절한 검체 세포를 분리하여 세포 보존액이 보관된 용기에서 보관하고 추후의 세포조직학적 검사에 활용될 수 있다. 이를 위해서 세포 보존액에 보관된 검체 세포를 슬라이드 상에 도말하는 방법을 사용할 수 있다.
특히, 본 발명에 따르면 검체 세포를 채취한 후 액체 상태에서 장기간 보관이 가능하고 세포 진단에 방해가 되는 혈액, 점액, 단백질 성분을 제거해 줌으로써 진단의 정확성을 높일 수 있으며, 도말 과정에서 발생할 수 있는 세포의 건조를 방지함으로써 건조에 따른 염색상의 변화를 막을 수 있다. 특히, 종래 세포 보존액에 사용되었던 자일렌에 의한 세포 보존액의 혼탁 및 세포 변성을 줄일 수 있으며, 세포진 검사에서 대부분 폐기되었던 세포를 모두 보존할 수 있어서 진단의 정확도를 향상시킬 수 있다. 아울러, 보존액에 잔류하는 검체 세포를 대상으로 면역조직학적 검사나 분자생물학적 검사를 추가로 수행할 수 있다.
이하, 예시적인 실시예를 통하여 본 발명을 설명하지만, 본 발명이 하기 실시예로 한정되는 것은 결코 아니다.
실시예 1 : 비-부인과 검체용 세포 보존액의 제조
하기 표 1에 표시된 성분 및 배합 비율에 따라 비-부인과 검체용의 세포 보존액을 제조하였다.
비-부인과 검체용 세포 보존액의 성분 및 배합
성분 범위(w/v%) 기능/비고
에틸알코올 30 ~ 50 용매
증류수(1차)/Tris 50 ~ 65 용매
아세트산 0.1 ~ 1.5 혈액제거제
아세톤 0.1 ~ 1.5 단백질침전제
구연산나트륨 0.1 ~ 1.5 혈액응고방지제
글리세린 0.1 ~ 2.0 건조방지제
폴리에틸렌글리콜 0.1 ~ 1.5 점액 연화제
덱스트로스 0.1 ~ 1.5 삼투압 조절제
아지드화나트륨 0.1 ~ 1.5 방부제
트리스 1.0 ~ 2.5 완충제
트리톤-x 100 0.1 ~ 1.5 점액용해제
비교예 1 ~ 2 : 비-부인과 검체용 세포 보존액의 제조
하기 표 2에 표시된 성분 및 배합 비율에 따라 비-부인과 검체용의 세포 보존액을 제조하였다.
비-부인과 검체용 세포 보존액의 성분 및 배합
성분 비교예 1(w/v%) 비교예 2(w/v%)
에틸알코올 30 ~ 50 40 ~ 50(메틸알코올)
증류수(1차) 50 ~ 65 50 ~ 60
아세트산 0.1 ~ 1.5 0.5 ~ 1.0
아세톤 0.1 ~ 1.5 0.1 ~ 0.5
구연산나트륨 0.1 ~ 1.5 0.1 ~ 0.5
글리세린 0.1 ~ 2.0 0.3 ~ 1.0
자일렌 0.1 ~ 1.5 -
덱스트로스 0.1 ~ 1.5 0.1 ~ 0.5
아지드화나트륨 0.1 ~ 1.5 0.1 ~ 0.5
트리스(Tris) 1.0 ~ 2.5 1.4 ~ 2.0
트리톤 X-100 0.1 ~ 1.5 0.1 ~ 0.9
실험예 1 : 비-부인과 세포 보존액을 이용한 세포 보존 상태 측정
상기 실시예 1 및 비교예 1-2에서 각각 제조된 세포 보존액을 이용하여 인체로부터 채취된 검체를 보관하여 세포의 보존 상태를 측정하였다. 비-부인과 검체로서 기관지 세척물, 복수액, 늑막액을 이용하였다. 기관지 세척물의 경우에는 편평상피세포, 원주섬모세포 및 폐포대식세포를 사용하였으며, 복수액/늑막액의 경우에는 중피세포와 반응성 중피세포를 대상으로 하였다.
브러시를 이용하여 각각의 검체를 채취하고, 이들 검체로부터 원심분리기에 넣고 원심분리하여 검체를 원심분리한 뒤, 각각의 세포 보존액이 보관된 검체 병에 넣고, 보관된 세포를 검사하여 세포의 이상 유무를 진단하였다.
평가지표로서는 1) 핵(크기, 염색성, 염색질, 핵소체, 핵막), 2) 세포질(모양, 염색성, 봉입체 및 내용물 보존 상태), 3) 배경(적혈구, 용혈 상태, 점액 제거 상태)을 사용하였으며, 평가 점수는 0(불량, poor), 1(보통, satisfactory), 2(양호, good), 3(우수, excellent)로 구분하였다. 하기 표 3은 기관지 세척물의 평가 지표 결과이고, 표 4는 복수액/늑막액의 평가지표이다. 한편, 도 1은 본 실험예에 따라 비-부인과 검체 세포 도말 표본의 세포 보존 상태를 살펴보기 위하여 각각의 세포 보존액에 보관된 검체 세포의 염색 정도 및 세포 형태를 촬영한 사진이다.
표 3 내지 표 4 및 도 1에 제시된 것과 같이, 본 발명의 실시예에 따라 제조된 세포 보존액에 보관된 비-부인과 검체 세포는 비교예에 따라 제조된 세포 보존액에 보관된 검체 세포와 비교할 때, 핵 및 세포질의 보존 상태가 훨씬 양호하였으며, 용혈 상태 및 적혈구/점액 제거 상태가 훨씬 양호하다는 것을 확인하였다.
기관지 세척물 평가지표(편평상피세포, 원주섬모세포, 폐포대식세포)
비교예 1 비교예 2 실시예 1
핵 1 2 3
세포질 2 2 3
배경 3 3 3
합계 6 8 9
복수액/늑막액-평가지표세포(중피세포, 반응성 중피세포)
비교예 1 비교예 2 실시예 1
핵 1 2 3
세포질 2 2 3
배경 2 3 3
합계 5 8 9
실험예 2 : 상업적으로 판매되는 세포 보존액과 비교
본 실험예에서는 실시예 1에서 제조된 비-부인과 검체용 세포 보존액과 상업적으로 판매되고 있는 세포 보존액으로서 ThinPrep(Cytyc Corp, Marlborough, MA, USA)을 사용하여 세포 보존 상태를 비교하였다. 비-부인과 검체로서 기관지 세척물, 복수액, 늑막액을 이용하였다.
기관지 세척물의 경우에는 정상세포, 악성세포-편평상피암종, 선암종 세포를 사용하였으며, 복수액/늑막액의 경우에는 중피세포와 반응성 중피세포를 대상으로 하였다. 전체적인 절차는 실험예 1에 제시된 절차를 반복하였다.
하기 표 5는 기관지 세척물의 평가 지표 결과이고, 표 6은 복수액/늑막액의 평가지표이다. 한편, 도 2는 본 실험예에 따라 비-부인과 검체 세포 도말 표본의 세포 보존 상태를 살펴보기 위하여 본 발명에 따른 세포 보존액과 상업적으로 판매되고 있는 세포 보존액에 보관된 검체 세포의 염색 정도 및 세포 형태를 촬영한 사진이다.
기관지 세척물 평가지표(정상세포, 악성세포-편평상피암종, 선암종)
ThinPrep 실시예 1
핵 3 3
세포질 3 3
배경 3 3
합계 9 9
복수액/늑막액-평가지표세포(중피세포, 반응성 중피세포)
ThinPrep 실시예 1
핵 3 3
세포질 3 3
배경 3 3
합계 9 9
표 5 내지 표 6 및 도 2에 제시되어 있는 것과 같이, 본 발명에 따라 제조된 세포 보존액에 보관된 세포는 상업적으로 판매되고 있는 세포 보존액에 보관된 세포에 버금갈 정도로 원래의 상태를 잘 유지하고 있었다.
구체적으로 살펴보면, 단층 도말의 품질과 관련해서 본 발명의 세포 보존액 및 상업적으로 판매되는 세포 보존액에 보관된 세포 모두 비교적 고르게 분산되어 도말되었다. ThinPrep에 보관된 뒤 도말된 세포는 주로 가장자리에 분포하고 중심부에 드물게 출현하여 중심 공간(central hole)이 뚜렷한 반면, 본 발명의 세포 보존액에 보관된 뒤 도말된 세포는 중심부와 주변부에 고른 세포 도말 양상을 보였으며 일부 세포 밀집도가 부위에서는 약간의 중첩현상을 보이기도 하였으나 세포진단에는 문제가 없었다.
도말 배경과 관련해서 ThinPrep 세포 보존액과 본 발명의 세포 보존액은 모두 점액, 단백질성 파편이나 적혈구, 및 염증세포가 거의 제거되어 배경이 깨끗하게 관찰되었다. 본 발명의 세포 보존액에 보관된 뒤 도말된 세포에서 단백질성 파편이나 염증 세포의 제거율은 ThinPrep 세포 보존액에 비하여 약간 낮았으나 세포 진단에 간섭하는 정도는 아니었다.
또한, 세포 형태와 관련해서, ThinPrep 세포 보존액과 본 발명의 세포 보존액은 지표로서 핵의 크기, 염색성, 염색질 그리고 핵막의 형태 차이와 세포질의 모양, 염색체, 봉입체 그리고 내용물 보존 상태가 모두 양호하였다. ThinPrep 세포 보존액과 본 발명의 세포 보존액에 보관된 뒤 도말된 세포 모두 핵의 크기에 차이가 없었고, 염색성도 뚜렷한 청색 또는 청자색을 나타내었고 과립상 및 그물상 염색질 양상과 암세포에서 곁염색질(parachromatin)이 잘 구별되었다.
본 발명의 세포 보존액에 보관된 세포의 경우, 일부 세포의 핵 염색질이 외국보존액에 비해 과립상 염색질이 다소 불투명하게 보이는 예도 보였으나 세포진단 기준에는 충분하였다. 핵소체는 두 보존액 모두 뚜렷한 적자색을 나타내었으나 본 발명의 세포 보존액이 ThinPrep 세포 보존액에 비하여 좀 더 뚜렷하고 적색 색상이 강하게 관찰되었다. 핵막은 두 보존액 사이에 차이가 없었다. 세포질의 모양, 염색성 및 봉입체 및 내용물 보존 상태들이 두 보존액 사이에 차이가 없었고 세포 내 점액 및 과립성 물질들의 보존 상태도 동일하였다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 기초하여 본 발명을 설명하였으나, 본 발명이 전술한 실시예에 기재된 내용으로 한정되는 것은 아니다. 오히려 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 전술한 실시예에 기초하여 다양한 변형과 변경을 용이하게 추고할 수 있을 것이다. 하지만, 이러한 변형과 변경은 모두 본 발명의 권리범위에 속한다는 사실은 첨부하는 청구의 범위를 통해서 더욱 분명해질 것이다.

Claims (7)

  1. 알코올 30 ~ 50 w/v% 및 증류수 50 ~ 65 w/v%를 포함하는 용매; 완충제 1.0 ~ 2.5 w/v%; 혈액제거제 0.1 ~ 1.5 w/v%; 단백질 침전제 0.1 ~ 1.5 w/v%; 혈액응고방지제 0.1 ~ 1.5 w/v%; 건조 방지제 0.1 ~ 2.0 w/v%; 삼투압 조절제 0.1 ~ 1.5 w/v%; 방부제 0.1 ~ 1.5 w/v%; 점액용해제 0.1 ~ 1.5 w/v%; 및 점액 연화제 0.1 ~ 1.5 w/v%를 포함하는 세포 보존액.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 알코올은 메탄올, 에탄올, 이소프로판올 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택되고, 상기 완충제는 트리스(하이드록시메틸)메틸아민(tris(hydroxymethyl)methylamine, Tris)을 포함하는 세포 보존액.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 혈액제거제는 아세트산이고, 상기 단백질 침전제는 아세톤 또는 황산암모늄이며, 상기 혈액응고방지제는 구연산나트륨, 에틸렌디아민 테트라아세트산(ethylenediamine tetra-acetic acid, EDTA), 옥살산나트륨 및 헤파린으로 구성되는 군에서 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 보존액.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 건조방지제는 글리세린이고, 상기 삼투압 조절제로는 덱스트로스, 염화나트륨, 중탄산나트륨, 염화칼슘, 염화칼륨, 락트산 나트륨 및 링거액으로 구성되는 군에서 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 보존액.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 방부제는 아지드화나트륨, 소르브산, 벤조산나트륨 및 포르말린으로 구성되는 군에서 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 보존액.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 점액 용해제는 아세틸시스테인(Acetylcysteine), 카르복시메틸 시스테인(Carboxymethyl cysteine), 에르도스테인(Erdostein), 레토스테인(Letostein) 및 폴리에틸렌글리콜-p-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)-페닐에테르(polyethylene glycol-p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether, Triton X-100)로 구성되는 군에서 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 보존액.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 점액 연화제는 폴리에틸렌글리콜, 부틸렌글리콜 및 소르비톨로 구성되는 군에서 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 보존액.
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