KR101133997B1 - 세포 검사용 보존시약 조성물 - Google Patents

Abstract

발명은 세포학적 또는 조직학적 진단에 있어서 세포보존을 위한 검사용 시약에 관한 것이다. 보다 상세하게는 조직세포의 세포학적 진단을 위해 세포의 변성 및 건조 기타 부패를 방지하기 위한 시료 조성물로서 세포의 세포학적 보존 및 고정을 위한 조성물에 있어서,
에틸알코올 100 중량부와;
상기 에틸알코올 100 중량부를 기준으로 아세톤(Acetone) 8 내지 15 중량부;
PEG 6000 0.1 내지 0.5 중량부;
글리세롤 1 내지 5 중량부;
포름알데하이드 1.5 내지 6 중량부;
제 1 인산나트륨 2 내지 10 중량부;
제 2 인산나트륨 3 내지 11 중량부;
아세트산(acetic acid) 1 내지 5 중량부
를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 검사용 보존시약 조성물을 기본적 조성으로 하는 것을 특징으로 한다.

Description

세포 검사용 보존시약 조성물{A composite for the use of cytological analysis}

본 발명은 세포학적 또는 조직학적 진단에 있어서 세포고정을 위한 검사용 시약에 관한 것이다. 보다 상세하게는 조직세포의 세포학적 진단을 위해 세포의 변성 및 건조 기타 부패를 방지하기 위한 세포고정용시료로서 특히 액상세포검사에 있어 유용하다.

오늘날 세포학적 검사 또는 조직학적 진단은 매우 다양한 분야에서 이용되고 있으며, 최근 자궁경부암에 대한 세포학적 진단 내지 조기 진단, 임신초기 유산에 의한 Papanicolaou Smear에 의한 세포학적 진단법, 종양의 세포학적 진단, 암의 세포학적 조기 진단 등에서 있어 주목을 받고 있다.

통상적으로 채취된 세포는 일정기간 동안 보존이 전제되어야 한다. 이를 세포 고정이라고 하는데, 이는 끊임없이 동적(動的)으로 변화하는 살아 있는 세포나 세포를 구성하는 분자구조를, 어느 임의의 시점에서 일시적 또는 영구적으로 그 변화를 정지시키는 조작으로서, 그 목적은 생체 또는 그 일부분에 대한 파손자기융해(autolysis, 自己融解)를 억제하고 외형내부구조물질조성(物質組成) 등을 가능한 한 살아 있는 상태에 가깝도록 보존하거나 연구목적에 맞도록 일부의 물질을 용출시켜 선택적으로 내부구조물질을 보존함으로써 살아 있던 상태를 살펴볼 수 있도록 함과 동시에 광학현미경전자현미경으로 관찰하는 데 필요한 포매(包埋)절단(切斷)염색 등의 조작을 쉽게 한다.

이러한 세포검사에 있어 종래의 기술을 보면, 세포채취 브러쉬로 필요한 세포를 채취하고, 슬라이드에 세포를 도말하여 검사하는 재래식 세포진 검사를 주로 이용하였는데, 이러한 재래식 세포진 검사는 슬라이드 글라스 위에 세포를 도말하는 과정에서 세포가 건조되고 채취한 세포의 일부만이 도말되고 80%이상의 세포들이 버려지게 되어 확률적으로 검사의 신뢰성을 낮추게 되는 문제점이 있어왔다.

상기와 같은 재래식 세포진 검사를 해결하기 위해 최근에는 수집된 세포를 보조용액에 보관하여 이후 병리학적 검사를 진행시킬 수 있도록 하는 액상세포검사(Liquid Based Cytology)법이 각광을 받고 있다. 채취된 검체를 슬라이드에 직접 도말하지 않고 보존액에 씻어 수거함으로써 80% 이상이 채취도구에 남은 채로 버려지던 귀중한 진단 세포를 모두 수거함과 동시에 검체 채취 직후부터 건조되어 세포가 변형되는 것을 방지하여 오진 발생의 주원인으로 알려진 샘플처리 과정의 오류를 방지할 수 있고, 슬라이드 전표면에 걸쳐 도말된 각종 불순물과 이중삼중으로 겹친 세포를 관찰하는 대신 잘 여과된 진단 세포만을 직경 2cm의 단층 세포군으로 도말시켜주어 판독과정의 오류도 최소화하여 검사의 신뢰성이 높다고 할 수 있는데 이에 더하여 보존액에 남아 있는 검체를 이용하여 동일한 슬라이드를 다시 만들 수도 있어 추가 검사가 필요한 경우에도 남아 있는 검체로 추가검사의 실시가 가능한 장점이 있다.

한편, 액상세포검사법에 있어서도 세포보존이 매우 중요한데, 세포학적 검사를 위한 검체는 보존 용액을 포함시킨 용기에 보관되며, 이러한 세포 고정 및 보존은 검사의 신뢰성 및 정확성과 연결되는 중요한 문제이다.

종래의 액상세포 검사법에 사용되던 보존액을 보면, 주로 50 내지 90%의 알코올계 혼합물로서 주로 메틸 알코올 또는 에틸 알코올이 사용되었다. 그러나 이러한 알코올 함량이 높은 고정제는 단백질이 많은 유체에 사용하는 경우 경화된 단백질 침전제가 생길 수 있으며, 검체 조직에 악영향을 주어 조직의 탄력성을 파괴하는 문제가 있어왔다. 또한 알코올 함량이 높은 경우 인화성이 높아 위험할 수가 있었다.

따라서 바람직한 세포 보전제 조성물로서는 단백질 구조를 안정화시키고 세포의 자가분해 및 부패를 억제하며, 응집저해 역할을 할 수 있어야 한다. 또한, 보존기간이 비교적 길어야 한다.

본 발명은 상기한 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명의 목적은 채취된 검체인 세포의 세부적인 형태학적 구조를 최대한 유지하면서도 pH를 유지하고 자가분해 및 부패를 억제하여 세포검사에 있어 정확도를 높이는데 기여하게 함과 아울러, 보다 장기간 보전으로 후속검사까지 가능하도록 하여 시험에 탄력성을 가질 수 있도록 하는 것이다.

또한, 알코올 함량을 낮춘 최적의 조성물 및 그 배합비를 제시하여 상기와 같은 종래 보존액의 문제점을 해결하는 것을 목적으로 한다.

상기와 같은 목적을 해결하기 위하여 본 발명은 세포학적 또는 조직학적 검체를 보존 및 고정하기 위한 조성물에 대한 것으로서 상기 조성물은 세포 보존에 가장 적합하고 다루기 용이한 구성을 가지는 것으로 세포의 세부적인 구조 유지 및 장기간 보존을 위한 각 구성요소의 최적의 배합비를 확인하여 상기 목적에 부합하는 세포보존을 위한 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 기본적인 조성을 보면 세포의 세포학적 보존 및 고정을 위한 조성물에 있어서,

에틸알코올 100 중량부와;

상기 에틸알코올 100 중량부를 기준으로 아세톤(Acetone) 8 내지 15 중량부;

PEG 6000 0.1 내지 0.5 중량부;

글리세롤(glycerol) 1 내지 5 중량부;

포름알데하이드(formaldehyde) 1.5 내지 6 중량부;

제 1 인산나트륨 2 내지 10 중량부;

제 2 인산나트륨 3 내지 11 중량부;

아세트산(acetic acid) 1 내지 5 중량부

를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 검사용 보존시약 조성물에 관한 것이다. 이에 필요에 따라 비이온성 세제 또는 방부제를 더 포함할 수 있다.

상기 구성을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다. 본 발명의 조성물은 알코올과 제1인산나트륨 및 제2인산나트륨을 주성분으로 하며, 고정제와 가교제 및 접착제를 포함하고 경우에 따라 건조방지제와 세제를 함유하는 것을 특징으로 한다.

조성물의 구성에 대하여 구체적으로 보면, 상기 알코올은 에틸 알코올이 바람직하며 특히, 조성물 총량에 대하여 20 내지 40 중량%로 포함되는 것이 바람직 한데, 이는 조성물 배합에 있어 증류수의 양을 조절하여 맞출 수 있다.

한편, 상기 에틸 알코올에 고정제 및 접착제를 배합하고, 가교제와 제1인산나트륨 및 제2인산나트륨을 혼합하여 세포 검사용 보존시약 조성물을 제조하는데, 상기 고정제는 케톤류가 적당하고, 바람직하게는 아세톤(Acetone)을 사용하는 것이 세포 구조의 고정에 있어 바람직하고, 전체 조성물을 세포에 침투시키는데 있어 효과가 좋다. 상기 아세톤은 상기 에틸알코올 100 중량부를 기준으로 8 내지 15중량부로 포함하는 것이 세포에 대한 우수한 침투효과를 나타낸다.

또한, 상기 접착제로는 폴리에틸렌글리콜(Poly Ethylene Glycol)을 사용하는데 바람직하게는 평균 분자량이 5600 내지 6400이 되는 PEG6000을 사용하며, 이는 상기 에틸알코올 100중량부를 기준으로 0.1 내지 0.5중량부로 포함되는 것을 특징으로 한다. 상기 PEG6000의 역할은 점액제거, 접착제로서 세포탈락방지이며, 채취된 검체에 포함된 점액량에 따라 함량을 조절해야 한다. 점액이 많은 객담에는 많은 함량이, 점액이 적은 소변에는 적은 함량이 포함되어야 한다. 그러므로 PEG6000은 소량을 첨가해 제조하고 검체에 따라 이후에 가감하는 것이 더 적합하다고 할 수 있다. 아울러 가교제로는 포름알데하이드(formaldehyde)를 사용하는데, 이는 세포 고정 및 완충을 위함이다. 상기 포름알데하이드는 에틸알코올 100중량부를 기준으로 1.5 내지 6 중량부로 포함하도록 한다.

제1인산나트륨은 상기 에틸알코올 100중량부를 기준으로 2 내지 10 중량부, 제2인산나트륨은 3 내지 11 중량부로 포함하는 것을 특징으로 하는데 이는 기본적 구성으로서 상기 세포 검사용 보존시약 조성물 용액에 대한 pH를 3 내지 7로 유지시키는 완충역할을 위함이다. 상기 제1인산나트륨과 제2인산나트륨은 인산완충액에 사용되는 주시약으로 보존액의 세포들의 산도를 일정하게 유지시켜, 세포의 형태를 정상적으로 유지시킴과 동시에 염색과정에서 산도별로 구분된 염료들의 착색에 있어서 정확한 색깔을 나타내게 한다. 상기 제1인산나트륨과 제2인산나트륨은 각각 산도에 미치는 기전이 달라 시약 제조시 화학반응에서도 독립적으로 산화치환 되므로 독립된 시약으로서 그 화학반응이 수행된다. 그러므로 제1인산나트륨과 제2인산나트륨을 나누어서 배합하는 것이 더 적합하다.

또한 상기 기본 구성에 대하여 보다 효과적인 세포 구조 유지 및 장기간 보존을 위하여 용해제 및 건조방지제, 방부제를 더 포함하는데, 최적의 효과를 나타내기 위하여 상기 에틸알코올 100중량부를 기준으로 상기 용해제로는 1 내지 5 중량부의 아세트산(acetic acid)이 바람직하다. 상기 건조방지제로는 1 내지 5 중량부의 글리세롤(glycerol), 상기 세제로는 0.01 내지 0.05 중량부의 비이온성 세제를 사용하며, 바람직하게는 비이온성 세제로서 널리 이용되는 Triton X-100을 사용한다. 아울러, 방부제로는 상기 에틸아코올 100 중량부를 기준으로 소듐아자이드(sodium azide) 0.01 내지 0.05 중량부를 첨가하는 것을 특징으로 한다.

한편, 상기 알코올이 전체 조성물 총량에 대하여 20 내지 40 중량%가 될 수 있도록 적정한 양의 증류수를 사용하여 배합시킬 수 있다.

상기 세포의 세포학적 보존 및 고정을 위한 조성물을 제조하기 위한 방법을 보면 아래의 순서에 따른 배합을 사용하는데,

a) 에틸알코올 100 중량부와 상기 에틸알코올 100 중량부를 기준으로 아세톤(Acetone) 8 내지 15 중량부, PEG 6000 0.1 내지 0.5 중량부, 글리세롤 1 내지 5 중량부를 순서대로 혼합하여 만드는 혼합물 A를 제조하는 단계;

b) 포름알데하이드 1.5 내지 6 중량부, 제 1 인산나트륨 2 내지 10 중량부, 제 2 인산나트륨 3 내지 11 중량부, 증류수를 순서대로 혼합하여 만드는 혼합물 B를 제조하는 단계;

c) 아세트산(acetic acid) 1 내지 5 중량부; 소듐아자이드 0.01 내지 0.05중량부; 트리톤-X(triton X) 0.01 내지 0.05 중량부를 순서대로 혼합하여 만드는 혼합물 C를 제조하는 단계;

d) 상기 혼합물 A와 B를 혼합한 후에 상기 혼합물 C를 더 혼합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 배합에 있어서는 배합순서에 따라 격렬하게 혼합시키도록 하며, 다만 과도한 혼합은 삼가한다.

상기 구성을 갖는 본 발명에 따라 알코올 함량이 낮으면서도 채취된 세포의 보존 및 고정에 최적화하고 보다 장기간 동안의 보존을 가능하게 하는 특징이 있다.

즉, 상기 조성물과 그 배합비를 유지하는 본 발명의 경우 채취된 검체인 세포의 세부적인 형태학적 구조를 유지하면서도 자가분해 및 부패를 억제하는데, 그에 따라 세포검사의 보다 정확한 측정치를 얻을 수 있는 전제가 되며, 나아가 장기간 보전이 가능함에 따라 후속시험을 위한 추가적인 세포 채취를 요하지 않는 장점이 있다.

한편, 알코올 함량이 낮은 배합비로서 보다 안정성 있는 고정제로 활용가능하다.

도1은 E-Prep DNA indicator (130bp)에 대한 전기영동 자료이다.
도2는 Alcohol DNA indicator (130bp)에 대한 전기영동 자료이다.
도3은 E-Prep sample에서 검출한 HPV Positive (190~220bp)에 대한 전기영동 자료이다.
도4는 E-Prep sample에서 검출한 Chlamydia Positive (113bp)에 대한 전기영동 자료이다.
도5는 E-Prep sample에서 검출한 Neisseria gonorrhoeae Positive (113bp)에 대한 전기영동 자료이다.
도6은 시료 조성물과 대조군의 대표검체에 대한 사진이다.

1. 시료의 제조방법

1-1. 시료의 배합

상기 최적의 배합비 구성을 위하여 아래와 같이 세포 검사용 보존시약 조성물을 제조하였는데 그 구체적인 제법을 보면,

에틸알코올 100중량부와 상기 에틸알코올을 100중량부를 기준으로 아세톤 11중량부, PEG-6000 0.35중량부, 글리세롤 3.5중량부를 순서대로 배합하여 제조하는 '혼합A'를 만들고;

상기 에틸알코올 100중량부를 기준으로, 포름알데하이드 3.6 중량부, 제1인산나트륨 6 중량부, 제2인산나트륨 7.5 중량부, 증류수 181중량부를 순서대로 배합하여 제조하는 '혼합 B'를 만들고;

상기 에틸알코올 100중량부를 기준으로, 아세트산 3 중량부, 소듐아자이드 0.03 중량부, 트리톤-X 0.03 중량부를 순서대로 배합하여 제조하는 '혼합 C'를 만든다.

다음으로, 상기 혼합 A와 혼합 B를 배합한 후에 이를 혼합 C와 배합한다. 상기의 배합은 격렬하게 혼합하도록 하되 과도한 혼합은 피하도록 한다.

1-2. 조성물의 충진과 포장

상기 혼합 A, B, C로 혼합된 조성물을 40ml용기(solution bottle)에 20ml씩 충진하며, 포장하여 보관한다.

2. 세포 보존능에 대한 실험

2-1. 세포 검사용 보존시약 조성물에 대한 보존능 시험

상기 조성물을 이용한 세포보존 효과 및 보존기간을 확인하기 위함으로서 검체는 자궁경부세포를 사용하여 아래와 같은 실험을 수행하였다.

2-2. 보존효과 시험

상기 검체를 상온에서 세포 검사용 보존시약 조성물에 보존하고, 최초 보존일로부터 1월 이후에 상기 보조용액을 추출하였다. 상기 보조용액 추출물을 PCR로 증폭시켰는데, 약 30회 반복하였다. 이후 전기 영동 사진을 찍었다. 이와 관련하여 에탄올을 이용한 대조군을 제조하여 상기와 같은 방법으로 비교 실험하였다.

2-3. 보존기간에 대한 시험

상기 보존 효과 시험에 대하여 검체를 세포 검사용 보존시약 조성물에 보관하는 기간을 늘여 최대 보존가능기간에 대한 시험을 수행하였다. 보존기간을 월단위로 조정하여 1월, 2월, 3월, 6월, 12월, 18월, 24월을 기준으로 하여 검체에 대한 보존능을 상기의 보존효과시험과 같은 방법으로 비교 실험하였고, 대조군으로서 상기의 보존효과 실험과 마찬가지로 에탄올을 사용하였다.

2-4. 실험결과

하기 표1에서 보는 바와 같이 본 보존액과 대조액의 세포보존력은 많은 차이가 있으며, 본보존액으로 처리된 검체는 24개월에서도 검경이 가능하지만, 대조액에서 처리된 검체는 1개월 까지도 변성이 존재하며, 3개월 부터는 검경이 고도로 난이 하거나 불가능하였다. (도6 참조)

검체 보존일		형태학적 검토		보존능 검사
		시료 조성물	대조군	염색상	세포검사 가부
1 개월	설명	핵과 세포질의 형태분별이 명확하고, 크기의 변화 및 형태변성이 없음	핵과 세포질의 형태분별이 불명확하고, 경도의 크기의 변화 및 형태변성이 나타남	보존액에 의한 보존성에 의해 PH 변화는 없음,호산성 염색질과 호염성 염색질 분별양호	진단을 위해 검경가능
2 개월	설명	핵과 세포질의 형태분별이 명확하고, 크기의 변화 및 형태변성이 없음	핵과 세포질의 형태분별이 불명확하고, 중도의 크기의 변화 및 형태변성으로 검경이 난이함	보존액에 의한 보존성에 의해 PH 변화는 없음, 호산성 염색질과 호염성 염색질 분별양호하고, 내경부세포의 염색도 양호	진단을 위해 검경가능
3 개월	설명	핵과 세포질의 형태분별이 명확하고, 크기의 변화 및 형태변성이 없으나, 경도의 선명도 변화가 있음	핵과 세포질의 형태분별이 불명확하고, 고도의 크기의 변화 및 형태변성으로 검경이 고도로 난이함	보존액에 의한 보존성에 경도의 PH 변화 존재, 호산성 염색질과 호염성 염색질 분별양호하지만, 경도의 선명도 변화 있음	진단을 위해 검경가능하나, 선명성 떨어지기 시작함
6 개월	설명	핵과 세포질의 형태분별이 명확하고, 크기의 변화 및 형태변성이 없으나, 경도의 선명도 변화와 변성 있음	핵과 세포질의 형태분별이 불명확하고, 고도의 크기의 변화 및 형태변성으로 검경이 고도로 난이함	보존액에 의한 보존성에 경도의 PH 변화 존재, 호산성 염색질과 호염성 염색질 분별양호하지만, 경도의 선명도 변화 와 변성 있음	진단을 위해 검경가능하나, 선명성감소와 변성 존재
12 개월	설명	핵과 세포질의 형태분별은 이 명확하지만, 경도의 크기의 변화 및 형태변성으로 경도의 선명도 변화와 변성 있음	핵과 세포질의 형태분별이 불명확하고, 고도의 크기의 변화 및 형태변성으로 검경불가능함	보존액에 의한 보존성에 경도의 PH 변화 존재, 호산성 염색질과 호염성 염색질 분별양호하지만, 경도의 선명도 변화 와 변성 있음	진단을 위해 검경가능하나, 선명성감소와 변성 존재
18 개월	설명	핵과 세포질의 형태분별은 이 명확하지만, 경도의 크기의 변화 및 형태변성으로 경도의 선명도 변화와 변성 있음	핵과 세포질의 형태분별이 불명확하고, 고도의 크기의 변화 및 형태변성으로 검경 불가능	보존액에 의한 보존성에 경도의 PH 변화 존재, 호산성 염색질과 호염성 염색질 분별양호하지만, 경도의 선명도 변화 와 변성 있음	진단을 위해 검경가능하나, 경도의 선명성 감소와 변성 존재
24 개월	설명	핵과 세포질의 형태분별은 이 명확하지만, 중도의 크기의 변화 및 형태변성으로 중도의 선명도 변화와 변성 있음	핵과 세포질의 형태분별이 불명확하고, 고도의 크기의 변화 및 형태변성으로 검경 불가능	보존액에 의한 보존성에 중도의 PH 변화 존재, 호산성 염색질과 호염성 염색질 분별가능하지만, 중도의 선명도 변화 와 변성 있음	진단을 위해 검경가능하나, 중도의 선명성 감소와 변성 존재
결론		본 보존액과 대조액의 세포보존력은 많은 차이가 있으며,본보존액으로 처리된 검체는 24개월에서도 검경이 가능하지만, 대조액에서 처리된 검체는 1개월 까지도 변성이 존재하며, 3개월 부터는 검경이 고도로 난이 하거나 불가능함

Claims (5)

1. 객담을 포함하는 체액 내 세포의 세포학적 보존 및 고정을 위한 조성물에 있어서,
   에틸알코올 100 중량부와;
   상기 에틸알코올 100 중량부를 기준으로 아세톤(Acetone) 8 내지 15 중량부;
   체액에 포함된 점액제거 및 세포탈락방지를 위한 접착제로서 분자량 5600 내지 6400의 PEG 6000 0.1 내지 0.5 중량부;
   글리세롤 1 내지 5 중량부;
   포름알데하이드 1.5 내지 6 중량부;
   제 1 인산나트륨 2 내지 10 중량부;
   제 2 인산나트륨 3 내지 11 중량부;
   아세트산(acetic acid) 1 내지 5 중량부;
   비이온성 세제로서 트리톤-X(triton X) 0.01 내지 0.05 중량부;
   소듐아자이드 0.01 내지 0.05중량부;
   상기 에틸 알코올이 조성물 총량에 대하여 20 내지 40 중량%가 되도록 증류수
   를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 검사용 보존시약 조성물.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 세포의 세포학적 보존 및 고정을 위한 조성물의 제조방법에 있어서,
   a) 에틸알코올 100 중량부와 상기 에틸알코올 100 중량부를 기준으로 아세톤(Acetone) 8 내지 15 중량부, PEG 6000 0.1 내지 0.5 중량부, 글리세롤 1 내지 5 중량부를 순서대로 혼합하여 만드는 혼합물 A를 제조하는 단계;
   b) 포름알데하이드 1.5 내지 6 중량부, 제 1 인산나트륨 2 내지 10 중량부, 제 2 인산나트륨 3 내지 11 중량부, 증류수를 순서대로 혼합하여 만드는 혼합물 B를 제조하는 단계;
   c) 아세트산(acetic acid) 1 내지 5 중량부; 소듐아자이드 0.01 내지 0.05중량부; 트리톤-X(triton X) 0.01 내지 0.05 중량부를 순서대로 혼합하여 만드는 혼합물 C를 제조하는 단계;
   d) 상기 혼합물 A와 B를 혼합한 후에 상기 혼합물 C를 더 혼합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 검사용 보존시약 조성물 제조방법.
   

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