KR20100058932A - 용액상 세포보존제의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

개시된 내용은 밀폐 용기에 50% 이상의 알코올을 주입하여 밀폐 용기에 일정 농도 이상의 알코올 농도를 유지시켜 세포의 변성을 억제하고 세균의 증식을 억제하여 조직 혹은 세포 시료를 운반하는 과정에서의 안정성을 확보할 수 있는 세포 운반용 밀폐용기의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명의 세포 운반용기 제조 방법은 밀폐 용기의 50% 알코올을 포함하는 세포보존액을 주입하고 용기를 밀폐시켜 주는 과정으로 이루어진다. 상기의 제조 과정을 통하여 제조된 세포 운반용 밀폐 용기는 제조 과정의 단순화로 인하여 제조 과정에 알코올이 소실되어 운반 용기 내의 알코올 농도를 일정하게 유지시켜 줄 수 있어 세포의 변성과 손실 막아 줄 수 있다.

세포검사, 자궁경부암, 검체, 도말, 표본

Description

용액상 세포보존제의 제조 방법{the method of liquid cell preservation solution and kit}

본 발명은 세포 혹은 조직 시료가 변성되지 않은 상태로 보존하기 위한 보존제와 이를 포함하는 운반 용기에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 흡습성이 높은 부직포를 내포하는 밀폐 용기에 50% 이상의 알코올을 주입하여 부직포에 흡수된 알코올이 밀폐 용기에 일정 농도 이상의 알코올 농도를 유지시켜 세포의 변성을 억제하고 세균의 증식을 억제하여 조직 혹은 세포 시료를 운반하는 과정에서의 안정성을 확보할 수 있는 세포 운반용 밀폐용기의 제조 방법에 관한 것이다.

자궁경부암 검진을 위한 세포검사(Pap smear)는 세포의 형태학적으로 분석을 통하여 자궁경부암을 중요한 진단 방법이다. 이 검사는 경제적이고 편하면서도 상당히 효율적인 검사방법으로, 1940년대 Papanicolau에 의해 도입된 이래 자궁경부암의 진단에 크게 기여하였다.

그러나 자궁경부암 세포검사 과정이 정확하게 이루어지기 위하여서는 세포 시료가 슬라이드 표면에 얇게 도말되어야하고, 적절한 고정제로 처리되어, 변성 소견이나 세포의 겹침이 적고 적절히 염색된 표본을 검사하는 것이 중요하다. 이를 위해 가능하면 세포 시료를 채취한 즉시 유리슬라이드에 얇게 잘 도말하여 고정액으로 고정하여야 한다. 그러나 검체를 채취하는 의료인이 도말 기술이나 시료 취급 요령이 숙달되지 못한 경우 고정이 지연되어 변성되거나 시료가 공기 중에서 건조되거나 두껍게 도말되는 등의 문제가 발생하여 적절한 세포 표본을 얻기 어려울 수 있다. 따라서 보다 양호한 도말 세포 샘플(sample)을 얻기 위해서는 채취된 시료를 현장에서 곧바로 도말하지 않고 채취된 상태 그대로 보존하여 검체취급에 숙달된 실험자가 있는 전문 분석실로 보내어 처리하는 것이 바람직하다. 그러나 이 방법은 시료를 채취한 상태 그대로 유지하면서 수송 기간 중에 일어날 수 있는 세포 및 시료의 변성을 방지할 수 있어야 가능하다.

기존의 세포 시료 보관 운반 기법은 액상의 보존 용액에 채취한 시료를 풀어 사용하는 방법과 알코올을 포함하는 한천 젤을 보존제로 사용하는 경우가 있다. 액상 보존 방법의 경우 시료의 운반 이후 실험자가 별도의 장비를 사용하여 세포를 세척하고 유리 슬라이드 플레이트에 도말하는 과정을 거쳐야하고 이러한 보존 용액 자체가 인체에 유해한 성분으로 이루어져 있기에 시료 채취자와 실험자가 유해 성분에 노출되는 위험 요소가 있다.

그리고 한천 젤 형태의 보존제는 기본적으로 한천을 끓여서 녹여준 뒤 알코올을 넣어 용기에 부어 굳혀주는 과정으로 제조한다. 그러나 고온의 한천 용액에 알코올을 섞어줄 경우 알코올이 쉬게 증발되어 소실될 수 있기에 알코올을 섞어주는 단계에서 한천 용액의 온도를 60℃ 이상으로 일정하게 유지 관리하여야 하는 어려움이 있고 한천을 굳히는 단계에서도 주변의 온도와 습도 등의 차이에 따라 한천 내의 알코올 농도의 차이가 발생할 수 있다. 이러한 이유로 제조된 보존 용기 내의 알코올의 농도를 일정하게 유지시켜주는 것이 매우 어려우며 이로 인하여 세포 시료의 보존성을 일정하게 유지시킬 수 없다는 문제점이 있다.

이와 같은 기존 기법들의 한계와 문제점을 극복하기 위하여 세포가 보관 운송 과정에서 변성되지 않도록 알코올의 농도가 일정한 농도 이상으로 보존 용기에 내에 존재할 수 있도록 하는 보존 및 운반 용기 제조법의 개발이 필요하였다.

위와 같은 문제를 극복하기 위하여 기존의 젤상 보존재의 제조 방식상의 문제점을 해결하고 세포 시료를 채취한 뒤 실험실까지 안정하게 시료를 운송할 수 있는 우수한 보존재의 개발이 절실하게 요구되었다.

본 발명의 목적은 상술한 제 결점들을 해소하고 위의 기대에 부응하기 위해서 안출한 것으로서, 젤상 보존제 방식에서의 한천 젤을 대신하여 알코올을 포함하는 세포 보존제를 밀폐용기에 주입하여 밀폐용기의 대기 중에 일정한 농도의 알코올 농도를 유지시켜 줄 수 있도록 하여 세포 시료를 채취한 이후 보관 및 운송 과정에 세균증식을 억제하고 세포변성을 방지하여 우수한 보존성을 얻을 수 있는 세포 시료 보존제의 제조 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명은 검체를 채취한 장소에서 곧바로 검체 세포를 도말/고정하지 않아도 되므로 채취자가 이러한 표본제작에 익숙하지 않아도 채취된 검체를 원상태로 보존하여 병리검사실의 판독 숙련자에게 보내서 좋은 표본을 제작할 수 있는 효과가 있다.

또한, 본 발명의 보존제는 검체를 원형에 가깝게 그대로 보존할 수 있어 도말작업을 용이하게 수행할 수 있게 한다. 나아가, 본 보존제로 처리한 검체는 세포의 변성도가 낮아 핵과 세포질이 선명하게 염색되므로 판독에 유리하다. 또한, 본 발명은 채취된 검체를 보관하여 장시간 원상태로 보존할 수 있으므로 도말/고정작업이 잘못되었거나 이상소견이 있을 때, 보존된 검체를 이용하여 다시 도말하여 표본을 제작하여 확인검사를 시행할 수 있다. 또한, 다른 종류의 추가적인 검사, 예를 들어 인유두종바이러스(HPV;Human Papilloma Virus) 검사의 시료로 이용하는 것도 가 능하다.

특히, 본 발명의 세포검사방법은 검체채취 현장에서 직접 도말하지 않고 보존제 용기에 검체를 보관하여 전문병리검사실까지 수송하므로 수송단계에서 유리슬라이드의 파손 문제를 원천적으로 방지할 수 있다. 또한, 보존제 용기에 보존된 검체는 병리검사실로 운반되어 숙련된 검사자에 의해 도말 및 고정작업이 수행되므로 현장에서 미숙한 의사나 간호사에 의해 직접 도말/고정됨으로 인해 발생하는 표본제작의 불량문제를 방지할 수 있다. 나아가, 병리검사실에서 숙련된 병리사에 의해 수행되므로 균질하고 우수한 표본제작이 가능하여 검사정확도를 높일 수 있다. 또한, 현미경 소견을 촬영하기 위하여

진단결과 보고 직전 단계에서 한번 더 슬라이드 검색이 이루어지므로 전단계의 판독과정에서 발생할 수 있는 오진의 가능성을 줄일 수 있다. 이것은 환자에게 세포검사의 신뢰성을 심어줄 수 있는 효과가 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 세포 시료 보존제는 알코올과 세포 보존 용액을 포함한다.

상기 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 세포 시료 보존용 보존제 제조방 법은

밀폐용기 하단부에 밀착 고정될 정도의 크기로 부직포를 절단하고 이를 밀폐용기 하단에 고정하는

제 1단계; 50% 알코올과 5% polyethylene glycol, 0.5M EDTA 그리고 1X SSC를 섞어주어 세포보존 용액을 제조하는 제 1단계; 상기 제 1단계에서 준비된 세포보존 용액 0.5ml을 밀폐용기에 주입하고 밀폐 마개로 막아 밀폐하여주는 제 2단계를 포함한다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 용액상 보존제를 이용한 세포검사방법은 검체를 채취하여 용액상 보존제가 담긴 보존제 용기에 넣어 보존하는 제 1단계; 상기 보존제 용기에 보존된 검체를 검사실로 이동시키는 제 2단계; 검사실에서 상기 보존제 용기로부터 검체를 꺼내 슬라이드에 도말/고정하는 제 3단계; 상기 슬라이드에 고정된 검체를 염색하여 현미경으로 판독 가능한 표본 슬라이드를 제작하는 제 4단계; 및 상기 표본 슬라이드를 현미경으로 판독하여 진단하는 제 5단계를 포함한다. 바람직하게는, 상기 진단 후 상기 표본 슬라이드를 현미경 사진으로 촬영하는 제 6단계를 추가로 포함하는 것이 좋다.

이하에서는 본 발명의 바람직한 실시 예에 관하여 상세히 설명하기로 한다.

본 발명의 세포 시료 보존제는 알코올을 밀폐 용기에 주입하는 방식으로 제조된다. 이렇게 알코올을 포함하는 세포보존 용액은 밀폐된 밀폐용기 내에 일정한 농도의 알코올 농도를 유지시켜준다. 본 발명에 사용되는 세포보존 용액은 알코올을 함유하는 특성이 있어 세포 시료 보존제의 구성 물질로 적합한 물질이다.

알코올은 보존효과를 발휘하는 기능물질로서 50% 이상의 고순도 알코올(에탄올, 또는 메탄올)이 사용된다. Polyethylene glycol은 주로 부동액 제조에 사용되는 화학 물질로 본 발명의 세포 보존 용액에서는 용액의 점도 유지와 슬라이드에 세포가 잘 흡착되어 질 수 있도록 하는 기능을 담보한다. EDTA의 경우는 알코올과 함께 세균 번식 및 세포 파괴를 방지하기 위하여 포함되었다. 그리고 SSC 버퍼는 용액이 일정한 염도와 산도(pH)를 유지시켜주기 위하여 사용되었다. 세포 보존 용액의 제조는 상기에 언급한 각 성분의 농도에 따라 배합하여 제조한다.

상기와 같이 제조된 세포보존 용액에 포함된 알코올은 강한 휘발성을 지니고 있으므로 제조 후 밀폐용기에 수납하여야 하며, 검체 보존시에는 이 밀폐용기에 채취된 검체를 넣은 후 용기를 폐쇄시켜 밀봉하여야 한다.

전체 용액에서 각 성분의 농도가 50% 알코올과 5% polyethylene glycol, 0.5M EDTA, 1X SSC 그리고 멸균 증류수를 섞어주어 세포보존 용액을 제조하고, 이렇게 제조된 액체상태의 물질을 용기에 넣고 뚜껑을 닫아 밀폐하였다. 그 결과, 보관용 밀폐용기에 담겨 어디에서든지 사용가능한 상태의 용액상 보존제를 제조하였다.

위와 같이 제조한 본 보존제에 210명의 자궁경부진 세포 검체를 보존하여 검사실로 운반한 후, 검사실에서 표본 슬라이드를 제작하여 210명의 자궁경부진 세포의 진단검사를 시행하였다. 그리고 표본 슬라이드에 대하여 자궁경부진 세포검사에 관한 국제적 진단기준인 <Bethesda 2001>에 규정된 표본적정성 조항을 기준으로 검체의 적정성을 판정하였다.

참고로, Bethesda 2001이 규정한 적정표본 기준은 다음과 같으며, 다음의 3가지 조건을 모두 만족하여야 한다.

1) 편평상피세포가 잘 관찰되고, 그 수가 8,000 내지 12,000개 이상 되어야 한다.

2) 잘 보존된 내경관세포 또는 이행부세포가 적어도 10개 이상 존재하여야 한다.

3) 염증세포나 혈액 등에 의해 가려진 상피세포가 75% 이하이어야 한다.

검체 210건의 표본 슬라이드는 위와 같은 기준에 따라 적정성 검사를 시행한 결과가 다음 표 1에 나타나 있다.

표 1. 적정성 시험결과 (총 210건)

판정기준	적정	부적정
A. 편평상피세포	203	7 (검체 6건이 B판정 기준에서와 중복)
B. 내경관세포/이행부세포	200	10 (검체 6건이 A판정 기준에서와 중복)
C. 상피세포 가려짐	208	3
합계		20 (중복을 제외한 검체 수: 14)

위 표 1에서 알 수 있는 바와 같이, 본 보존제는 부적정 판정이 된 검체 건은 20건으로 9.5%로 나타났는데, 각 표본에서 판정기준 A와 B항목이 중복되는 검체 수가 6건이므로 실제 부적정 검체 수는 모두 14건이며 총 건수에 대비한 부적정 검체비율은 6.6%이다. 바꾸어 말하면, 본 보존제로 처리한 검체 수 중 적정한 건은 총 건 중 90.4%가 되므로, 본 보존제는 보존성능이 우수하다고 판단되었다.

이상 설명한 용액상 보존제를 이용하여 세포를 검사하는 방법에 대해 설명하면 다음과 같다.

1. 용액상 보존제 처리

의사가 외래에서 검체를 채취하고 이를 겔상 보존제가 들어있는 용기에 넣고 뚜껑을 닫아 보관한다. 여기서, 외래의 의미에는 숙련된 병리사가 상주하고 있지 않은 병의원을 포함한다.

2. 검체 수송

보존제 용기에 보관되어 보존된 검체를 병리검사실로 운반한다. 이때, 병리검사실은 자체의 병리검사실 또는 원거리의 수탁검사실일 수 있다. 이와 같이, 현장에서 직접 도말하지 않고 보존제 용기에 검체를 보관하여 전문병리검사실까지 수송하므로 수송단계에서 유리슬라이드의 파손 문제를 원천적으로 방지할 수 있다.

3. 도말/고정 과정

이렇게 수송된 보존제 용기에 보존된 검체는 병리검사실에서 숙련된 병리사가 검체를 용기에서 꺼낸 후 유리슬라이드에 도말하고 알코올 용액에 침지시켜 고정한다. 이때, 고정제로는 95% 알코올 용액을 사용한다. 이와 같이, 보존제 용기에 보존된 검체는 병리검사실로 운반되어 숙련된 병리사에 의해 도말 및 고정작업이 수행되므로 검체채취 현장에서 미숙한 의료인에 의해 직접 도말/고정됨으로 인해 발생하는 표본제작의 불량문제를 방지할 수 있다. 나아가, 병리검사실에서 숙련된 병리사에 의해 수행되므로 균질하고 우수한 표본제작이 가능하여 다음 단계에서의 검사정확도를 높일 수 있다.

4. 표본 슬라이드 제작

고정과정이 끝나면 병리사가 의뢰된 슬라이드를 염색하여 현미경으로 판독할 수 있도록 표본 슬라이드를 완성한다.

5. 표본 슬라이드 판독

병리의사는 위 단계에서 제작된 표본 슬라이드를 현미경으로 판독하여 진단을 한다. 이에 앞서 초검이 필요한 경우 세포병리사의 초검을 거칠 수 있다.

6. 현미경 사진 촬영

현미경 진단이 끝나면 표본의 일부를 다른 세포병리사가 현미경 사진으로 촬영한다. 이와 같이 현미경 사진을 촬영하기 위하여 진단결과 보고 직전 단계에서 슬라이드 검색이 한번 더 이루어지므로 전단계의 판독과정에서 발생할 수 있는 오진의 가능성을 줄일 수 있다. 이렇게 촬영된 표본사진은 진단결과와 함께 보고한다. 이것은 환자에게 세포검사의 신뢰성을 심어

줄 수 있는 효과가 있다.

여기에서 개시되는 실시 예는 여러 가지 실시가능한 예 중에서 당업자의 이해를 돕기 위하여 가장 바람직한 예를 선정하여 제시한 것일 뿐, 본 발명의 기술적 사상이 반드시 이 실시 예에 의해서만 한정되거나 제한되는 것은 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변화와 변경이 가능함은 물론, 균등한 다른 실시 예가 가능하다.

Claims (3)

1. 50% 알코올과 5% polyethylene glycol, 0.5M EDTA, 1X SSC 그리고 멸균증류수를 섞어주어 세포보존 용액을 제조하는 제 1단계, 상기 제 1단계에서 준비된 세포보존 용액 0.5ml을 밀폐용기에 주입하고 밀폐 마개로 막아 밀폐하여주는 제 2단계를 포함하는 용액상 세포보존제의 제조방법
2. 제 1항에 있어서

   상기 제 1단계에서 제조된 세포보존 용액이 용액의 성상을 지니는 것을 특징으로 하는 용액상 세포보존제의 제조방법.
3. 제 1항에 있어서

   상기 제 1단계에서 제조된 세포보존 용액에 polyethylene glycol이 포함되는 것을 특징으로 하는 겔상 보존제의 제조방법.