KR100579467B1 - 세포학적 진단을 위한 보조용액 - Google Patents

세포학적 진단을 위한 보조용액 Download PDF

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KR100579467B1
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문상호
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(주)메드멕스
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Abstract

본 발명은 세포학적 진단을 위한 보조용액에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 수집된 세포를 소정의 pH로 유지하면서 보관하기 위한 완충용액과 상기 조직세포의 단백질 변성을 억제하여 그 형태학적 구조를 유지하기 위한 알코올 그리고 보관되는 상기 세포가 후속되는 병리학적 검사 시 건조되는 것을 방지하기 위한 건조방지제 및 보관되는 조직세포의 부패를 방지하기 위한 방부제를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포학적 진단을 위한 보조용액에 관한 것이다.
본 발명에 따른 세포학적 진단을 위한 보조용액은 인화성이 없어 다루기 쉬우며, 보관되는 세포를 그 형태학적 구조의 변형 없이 장기간 보관할 수 있고, 보관되어 있는 세포에서 DNA를 추출하여 분자병리학적 검사를 할 수 있는 장점이 있다.
세포진단, 용액, 세포의 형태학적 구조유지, 보관, 세포건조방지

Description

세포학적 진단을 위한 보조용액{A supporting solution for cytological diagnosis}
도 1은 종래의 재래식 세포진 검사법을 간략하게 나타낸 도면이다.
도 2는 재래식 세포진 검사법과 액상세포검사법의 정확도를 비교하여 보여주는 도면이다.
도 3은 수집된 세포를 본 발명의 실시 예에 따른 세포학적 진단을 위한 보조용액에 보관하기 시작하는 모습을 보여주는 도면이다.
도 4는 본 발명의 실시 예에 따른 세포학적 진단을 위한 보조용액 내에 세포가 18개월 이상 보관되고 있는 모습을 보여주는 도면이다.
도 5는 본 발명의 비교 예에서 보관된 수집물의 현미경관찰결과를 보여주는 도면이다.
도 6은 본 발명의 실시 예에 따른 세포학적 진단을 위한 보조용액 내에 보관된 수집물의 현미경 관찰결과를 보여주는 도면이다.
도 7 및 도 8은 본 발명의 실시 예에 따른 검체의 염색소견을 보여주는 도면이다.
도 9는 본 발명의 비교 예에 따른 검체의 염색소견을 보여주는 도면이다.
도 10 및 도 11은 본 발명의 실시 예에 따른 세포학적 진단을 위한 보조용액 내에 보관되던 세포의 유전자검사 결과를 보여주는 도면이다.
도 12는 본 발명의 실시 예에 따른 세포학적 진단을 위한 보조용액과 비교 예 내에 실온으로 보관되던 세포의 유전자 검사 결과를 보여주는 도면이다.
본 발명은 세포학적 진단을 위한 보조용액에 관한 것으로, 본 발명의 세포학적 진단을 위한 보조용액은 수집된 조직세포를 소정의 pH로 유지하면서 보관하기 위한 완충용액과 상기 조직세포의 단백질 변성을 억제하여 그 형태학적 구조를 유지하기 위한 알코올 그리고 보관되는 상기 조직세포가 후속되는 병리학적 검사 시 건조되는 것을 방지하기 위한 건조방지제 및 보관되는 조직세포의 부패를 방지하기 위한 방부제를 포함하는 것을 더욱 상세한 특징으로 한다.
세포학적 진단을 위한 보조용액이란 인체에서 채취된 세포를 잘 보존하여 세포병리학적 진단을 하는 액상세포검사(Liquid Based Cytology)를 하기 위한 용액을 말하는 것이다. 액상세포검사는 부인과 검체인 자궁경부세포, 그리고 비부인과 검체인 객담, 체액, 소변, 세침흡인생검 등에 이용되는 것으로 수집된 세포를 현미경으로 검사하여 암세포의 유무를 확인하는 것을 주로 한다.
도 1은 종래의 재래식 세포진 검사법을 간략하게 나타낸 도면이다. 도 1을 참조하여 설명하면, 종래의 세포병리학적검사는 세포를 슬라이드 위에 도말하여 검 사하는 재래식 세포진 검사(Conventional Pap Smear)를 주로 시행하였다. 그러나 이 경우 세포를 유리 슬라이드 위에 도말하게 되면 세포들이 건조되고, 점액이나 적혈구가 제거되지 않아 결과 판독의 어려움이 있다. 또한 자궁경부에서 브러시로 채취한 세포들 중 10%의 세포만이 슬라이드에 도말되고 나머지 세포들은 모두 버려지므로 진단에 중요한 세포들이 슬라이드위에 도말되지 못할 가능성이 있어서 검사의 신뢰성이 낮은 문제점이 있다.
상기한 문제점을 해결하기 위하여 최근에는 액상세포검사(Liquid Based Cytology)법이 개발되었다. 이는 수집된 조직세포를 세포학적 진단을 위한 보조용액에 보관하여 후속되는 병리학적 검사를 진행할 수 있도록 고안된 것으로서, 브러시로 세포를 채취한 후 채취된 세포들을 세포보관용 용액에 보관한 후 필요시 상기 세포보관 용액 내에 보관되던 세포를 검사하여 세포의 이상 유무를 진단하는 방법이다. 도 2는 상기한 재래식 세포진 검사법에 따른 세포검사의 정확도와 액상세포 검사법에 따른 세포검사의 정확도를 비교하여 설명하고 있는 도면이다. 도 2를 참조하여 설명하면, 세포진 검사법에 따르면 검사체가 슬라이드에서 불균등하게 분포하므로 어느 부분을 관찰하느냐에 따라 진단이 달라질 위험이 있으나, 액상세포검사법에 따를 경우에는 검사체가 슬라이드에 균일하게 분포하므로 진단의 정확도 높다는 것을 알 수 있다.
이러한 액상세포 검사법을 시행하기 위해서는 수집된 세포를 보관해 둘 수 있는 용액이 필요한데, 종래의 액상세포 검사법에 사용되었던 용액은 95%에탄올이었다. 그러나 이 경우에는 세포를 장기간 보존할 수 없는 단점(약 일주일정도 보관가능)이 있으며, 적혈구가 제거되지 않아 적혈구를 제거하기 위한 별도의 공정이 필요한 단점이 있었다. 그리고 세포핵의 변형으로 DNA추출을 할 수 없는 단점이 있었으며, 무엇보다도 알코올의 함량이 높아 인화성이 컸으므로 화재의 위험이 있었다.
이러한 단점을 해결하기 위하여 물에 녹는 알코올과 응집저해제 그리고 완충용액이 포함된 세포보존액이 미국등록특허 제 5, 256,571호에 개시되었다. 여기서 공개된 바에 의하면 사용된 알코올은 메탄올, 에탄올 그리고 이소프로판올로 선택되는 군 중 어느 하나이고, 응집저해제로는 에틸렌디아민테레프탈산 혹은 그 염이며, 완충용액은 인산완충용액, 에틸렌디아민테레프탈산과 그 염, 그리고 시트르산과 그 염이다. 그러나 미국등록특허 제 5, 256,571호에 공개된 세포보존액에서도 세포를 고정하기 위한 알코올의 량이 전체용액의 45 내지 55 중량부, 정확하게는 50 중량부를 차지하고 있어, 불이 잘 붙는 위험은 여전히 존재하며, 적혈구 제거율이 낮고, 보존기간이 비교적 단기간이며(약 3개월 정도), DNA추출이 잘 안된다는 단점이 있다.
본 발명은 상기한 종래기술의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 수집된 세포의 형태학적 구조를 유지하면서 장기간 보관할 수 있으며, 보관되는 세포에 존재하던 적혈구가 제거되므로 세포의 검사가 용이하면서도 정확하고, 보존되던 세포를 이용하여 DNA추출이 가능하며, 보관되던 세포의 검사 시 상기 세포가 건조되는 것을 방지할 수 있으며, 불연성이므로 다루기 용이한 세포학적 진단을 위한 보조용액을 제공하는 것이다.
상기한 본 발명의 목적은 소정범위의 pH로 유지하기 위한 완충용액, 알코올, 그리고 보관되던 세포를 대상으로 하는 후속 검사 시 상기 세포가 건조되는 것을 방지하기 위한 건조방지제를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포학적 진단을 위한 보조용액에 의해 달성할 수 있다.
상기한 목적을 달성하기 위한 세포학적 진단을 위한 보조용액은 상기 완충용액이 상기 세포학적 진단을 위한 보조용액의 산도를 pH 2 내지 6.5로 유지시키는 것이 바람직하다.
상기한 목적을 달성하기 위한 세포학적 진단을 위한 보조용액은 상기 완충용액이 젖산완충용액, 초산완충용액 그리고 인산완충용액으로 선택되는 군 중 어느 하나인 것으로 구성되는 것이 바람직하다.
상기한 목적을 달성하기 위한 세포학적 진단을 위한 보조용액은 상기 세포학적 진단을 위한 보조용액 중 상기 완충용액이 10 내지 40 중량부인 것이 바람직하다.
상기한 목적을 달성하기 위한 세포학적 진단을 위한 보조용액은 상기 알코올이 에탄올, 프로판올, 이소프로필알코올, 부탄올, 그리고 펜탄올로 선택되는 군 중 어느 하나인 것으로 구성되는 것이 바람직하다.
상기한 목적을 달성하기 위한 세포학적 진단을 위한 보조용액은 상기 알코올이 에탄올, 프로판올 그리고 이소프로필알코올로 선택되는 군 중 어느 하나인 것으로 구성되는 것이 더욱 바람직하다.
상기한 목적을 달성하기 위한 세포학적 진단을 위한 보조용액은 상기 세포학적 진단을 위한 보조용액 중 상기 알코올이 5 내지 40 중량부인 것이 바람직하다.
상기한 목적을 달성하기 위한 세포학적 진단을 위한 보조용액은 상기 세포학적 진단을 위한 보조용액 중 상기 알코올이 10 내지 35 중량부인 것이 바람직하다.
상기한 목적을 달성하기 위한 세포학적 진단을 위한 보조용액은 상기 건조방지제가 다가알코올인 것이 바람직하다.
상기한 목적을 달성하기 위한 세포학적 진단을 위한 보조용액은 상기 다가알코올이 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 그리고 글리세롤로 선택되는 군 중 어느 하나인 것으로 구성되는 것이 더욱 바람직하다.
상기한 목적을 달성하기 위한 세포학적 진단을 위한 보조용액은 상기 건조방지제가 폴리에틸렌글리콜 또는 폴리프로필렌글리콜로 선택되는 군 중 어느 하나인 것으로 구성되는 것이 바람직하다.
상기한 목적을 달성하기 위한 세포학적 진단을 위한 보조용액은 상기 폴리에틸렌글리콜 또는 폴리프로필렌글리콜의 분자량이 100 내지 100,000Da인 것이 바람직하다.
상기한 목적을 달성하기 위한 세포학적 진단을 위한 보조용액은 상기 세포학 적 진단을 위한 보조용액 중 상기 건조방지제가 0.1 내지 30 중량부인 것이 바람직하다.
상기한 목적을 달성하기 위한 세포학적 진단을 위한 보조용액은 상기 세포학적 진단을 위한 보조용액 중 상기 건조방지제가 0.1 내지 15 중량부인 것이 더욱 바람직하다.
상기한 목적을 달성하기 위한 세포학적 진단을 위한 보조용액은 방부제를 더 포함하는 것이 바람직하다.
상기한 목적을 달성하기 위한 세포학적 진단을 위한 보조용액은 상기 방부제가 아스코르브산, 소르브산, 구연산, 살리실산, 벤조산나트륨, 포르말린, 글리옥살, 그리고 프로피온산칼슘으로 선택되는 군 중 적어도 어느 하나 이상인 것으로 구성되는 것이 바람직하다.
상기한 목적을 달성하기 위한 세포학적 진단을 위한 보조용액은 상기 세포학적 진단을 위한 보조용액 중 상기 방부제가 0.1 내지 20 중량부인 것이 바람직하다.
본 발명의 그 밖의 목적, 특이한 장점 및 신규한 특징들은 첨부한 도면과 연관되어지는 이하의 상세한 설명과 바람직한 실시 예들로부터 더욱 분명해질 것이다.
이하에서는 첨부한 도면을 참조하여, 본 발명의 바람직한 실시 예에 대하여 상세히 설명하기로 한다.
본 발명은 세포학적 진단을 위한 보조용액에 관한 것으로, 본 발명의 세포학적 진단을 위한 보조용액은 수집된 세포를 소정범위의 pH로 유지하면서 보관하기 위한 완충용액과 보관되는 상기 세포의 단백질 변성을 억제하여 그 형태학적 구조를 유지하기 위한 알코올 그리고 보관되는 상기 세포가 후속되는 세포병리학적 검사 시 건조되는 것을 방지하기 위한 건조방지제 및 보관되는 세포의 부패를 방지하기 위한 방부제를 포함하는 것이다.
본 발명의 목적은 수집된 세포의 형태학적 구조를 유지하면서 장기간 보관할 수 있으며, 보관된 세포의 병리학적 검사가 용이하면서도 정확하고, 보관되던 세포를 이용하여 DNA추출이 가능하며, 불연성이므로 다루기 용이한 세포학적 진단을 위한 보조용액을 제공하는 것이다.
본 발명의 각 실시 예에서 사용한 각종 화학약품들은 시그마사의 것을 사용하였으며, 각 실시 예의 제조방법은 본 발명의 실시 예에 따른 완충용액과 알코올 그리고 건조방지제를 각각 첨가하여 교반한 후 방부제를 첨가 하였으며(방부제가 첨가되지 아니한 실시 예의 경우에는 제외) 여기에 증류수를 첨가하여 전체적인 중량비를 맞추었다.
[실시 예 1]
pH 3인 젖산완충용액 20중량부, 에탄올 30 중량부, 에틸렌글리콜 10 중량부 그리고 증류수 40 중량부인 세포학적 진단을 위한 보조용액을 제조하였다.
[실시 예 2]
pH 3인 젖산완충용액 20중량부, 에탄올 30 중량부, 에틸렌글리콜 10 중량부, 소르브산 4중량부 그리고 증류수 36 중량부인 세포학적 진단을 위한 보조용액을 제조하였다.
[실시 예 3]
pH 3인 젖산완충용액 20중량부, 에탄올 30 중량부, 글리세롤 10 중량부, 소르브산 2중량부, 구연산 2 중량부, 그리고 증류수 36 중량부인 세포학적 진단을 위한 보조용액을 제조하였다.
[실시 예 4]
pH 3인 젖산완충용액 20 중량부, 에탄올 15 중량부, 분자량 2834 Da인 폴리에틸렌글리콜 15 중량부, 구연산 2 중량부, 살리실산 2 중량부 그리고 증류수 36 중량부인 세포학적 진단을 위한 보조용액을 제조하였다.
[실시 예 5]
pH 3인 젖산완충용액 20 중량부, 프로판올 35 중량부, 에틸렌글리콜 10 중량부, 그리고 증류수 35 중량부인 세포학적 진단을 위한 보조용액을 제조하였다.
[실시 예 6]
pH 3인 젖산완충용액 20 중량부, 프로판올 35 중량부, 에틸렌글리콜 10 중량부, 살리실산 4 중량부, 그리고 증류수 31 중량부인 세포학적 진단을 위한 보조용액을 제조하였다.
[실시 예 7]
pH 3인 젖산완충용액 20 중량부, 프로판올 35 중량부, 글리세롤 5 중량부, 포르말린 2 중량부, 벤조산나트륨 2 중량부, 그리고 증류수 36 중량부인 세포학적 진단을 위한 보조용액을 제조하였다.
[실시 예 8]
pH 3인 젖산완충용액 20 중량부, 프로판올 35 중량부, 분자량 1854 Da인 폴리프로필렌글리콜 15 중량부, 소르브산 2 중량부, 글리옥살 2 중량부, 그리고 증류수 26 중량부인 세포학적 진단을 위한 보조용액을 제조하였다.
[실시 예 9]
pH 3인 젖산완충용액 15 중량부, 이소프로필알코올 35 중량부, 에틸렌글리콜 5 중량부, 소르브산 4 중량부, 그리고 증류수 41 중량부인 세포학적 진단을 위한 보조용액을 제조하였다.
[실시 예 10]
pH 3인 젖산완충용액 15 중량부, 이소프로필알코올 35 중량부, 에틸렌글리콜 5 중량부, 소르브산 2 중량부, 구연산 2 중량부 그리고 증류수 41 중량부인 세포학적 진단을 위한 보조용액을 제조하였다.
[실시 예 11]
pH 3인 젖산완충용액 15 중량부, 이소프로필알코올 35 중량부, 글리세롤 5 중량부, 구연산 2 중량부, 글리옥살 2 중량부, 그리고 증류수 41 중량부인 세포학적 진단을 위한 보조용액을 제조하였다.
[실시 예 12]
pH 3인 젖산완충용액 15 중량부, 이소프로필알코올 35 중량부, 분자량 2834 Da인 폴리에틸렌글리콜 10 중량부, 살리실산 2 중량부, 벤조산나트륨 2 중량부, 그리고 증류수 36 중량부인 세포학적 진단을 위한 보조용액을 제조하였다.
[실시 예 13]
pH 4인 초산완충용액 20 중량부, 에탄올 30 중량부, 에틸렌글리콜 5 중량부, 그리고 증류수 45 중량부인 세포학적 진단을 위한 보조용액을 제조하였다.
[실시 예 14]
pH 4인 초산완충용액 20 중량부, 에탄올 30 중량부, 에틸렌글리콜 5 중량부, 아스코르브산 2 중량부 그리고 증류수 43 중량부인 세포학적 진단을 위한 보조용액을 제조하였다.
[실시 예 15]
pH 4인 초산완충용액 20 중량부, 에탄올 30 중량부, 프로필렌글리콜 5 중량부, 아스코르브산 2 중량부, 소르브산 2 중량부, 그리고 증류수 41 중량부인 세포학적 진단을 위한 보조용액을 제조하였다.
[실시 예 16]
pH 4인 초산완충용액 20 중량부, 에탄올 30 중량부, 프로필렌글리콜 5 중량부, 소르브산 2 중량부, 구연산 2 중량부, 그리고 증류수 41 중량부인 세포학적 진단을 위한 보조용액을 제조하였다.
[실시 예 17]
pH 4인 초산완충용액 20 중량부, 에탄올 30 중량부, 분자량 2834 Da인 폴리에틸렌글리콜 5 중량부, 구연산 2 중량부, 글리옥살 2 중량부, 그리고 증류수 41 중량부인 세포학적 진단을 위한 보조용액을 제조하였다.
[실시 예 18]
pH 4인 초산완충용액 20 중량부, 에탄올 30 중량부, 분자량 1854 Da인 폴리프로필렌글리콜 5 중량부, 구연산 2 중량부, 벤조산나트륨 2 중량부, 그리고 증류수 41 중량부인 세포학적 진단을 위한 보조용액을 제조하였다.
[실시 예 19]
pH 4인 초산완충용액 20 중량부, 프로판올 35 중량부, 에틸렌글리콜 10 중량부, 그리고 증류수 35 중량부인 세포학적 진단을 위한 보조용액을 제조하였다.
[실시 예 20]
pH 4인 초산완충용액 20 중량부, 프로판올 35 중량부, 에틸렌글리콜 10 중량부, 포르말린 2 중량부, 그리고 증류수 33 중량부인 세포학적 진단을 위한 보조용액을 제조하였다.
[실시 예 21]
pH 4인 초산완충용액 20 중량부, 프로판올 35 중량부, 글리세롤 5 중량부, 포르말린 2 중량부, 프로피온산칼슘 2 중량부, 그리고 증류수 36 중량부인 세포학적 진단을 위한 보조용액을 제조하였다.
[실시 예 22]
pH 4인 초산완충용액 20 중량부, 프로판올 35 중량부, 분자량 2834Da인 폴리에틸렌글리콜 10 중량부, 구연산 2 중량부, 아스코르브산 2 중량부, 그리고 증류수 31 중량부인 세포학적 진단을 위한 보조용액을 제조하였다.
[실시 예 23]
pH 4인 초산완충용액 20 중량부, 이소프로필알코올 35 중량부, 에틸렌글리콜 10 중량부, 소르브산 2 중량부, 그리고 증류수 33 중량부인 세포학적 진단을 위한 보조용액을 제조하였다.
[실시 예 24]
pH 4인 초산완충용액 20 중량부, 이소프로필알코올 35 중량부, 에틸렌글리콜 10 중량부, 소르브산 2 중량부, 벤조산나트륨 2 중량부, 그리고 증류수 31 중량부인 세포학적 진단을 위한 보조용액을 제조하였다.
[실시 예 25]
pH 4인 초산완충용액 20 중량부, 이소프로필알코올 35 중량부, 프로필렌글리콜 10 중량부, 소르브산 2 중량부, 글리옥살 2 중량부, 그리고 증류수 31 중량부인 세포학적 진단을 위한 보조용액을 제조하였다.
[실시 예 26]
pH 4인 초산완충용액 20 중량부, 이소프로필알코올 35 중량부, 글리세롤 5 중량부, 글리옥살 2 중량부, 구연산 2 중량부, 그리고 수증기 36 중량부인 세포학적 진단을 위한 보조용액을 제조하였다.
[실시 예 27]
pH4 인 초산완충용액 20 중량부, 이소프로필알코올 35 중량부, 분자량 2834 Da인 폴리에틸렌글리콜 10 중량부 살리실산 2 중량부, 구연산 2 중량부, 그리고 증류수 31 중량부인 세포학적 진단을 위한 보조용액을 제조하였다.
[실시 예 28]
pH 5인 인산완충용액 20 중량부, 에탄올 20 중량부, 에틸렌글리콜 10 중량부, 포르말린 2 중량부, 그리고 증류수 48중량부인 세포학적 진단을 위한 보조용액을 제조하였다.
[실시 예 29]
pH 5인 인산완충용액 20 중량부, 프로판올 30 중량부, 에틸렌글리콜 10 중량부, 소르브산 2 중량부, 살리실산 2 중량부, 그리고 증류수 36 중량부인 세포학적 진단을 위한 보조용액을 제조하였다.
[비교 예 1]
95%의 에탄올용액을 사용하였다.
[비교 예 2]
PBS(Phosphate buffered saline)를 사용하였다.
도 3은 본 발명의 실시 예에 따른 세포학적 진단을 위한 보조용액 내에 수집된 세포를 보관하기 시작할 때의 모습을 보여주는 도면이다. 도 3을 참조하여 설명하면, 브러시를 이용하여 자궁경부에서 수집될 수 있는 물질들은 자궁경부세포와 적혈구 기타 점액성물질 등이 있다. 그러나 세포진단에 필요한 자궁경부세포를 제외한 나머지 물질들은 적당한 방법으로 제거되어야 하는데, 본 발명의 실시 예에서는 필요한 세포를 제외한 나머지 물질들을 제거하기 위하여 세포학적 진단을 위한 보조용액의 산도를 약산성으로 유지하였다. 즉 브러시 혹은 다른 기구를 이용하여 자궁경부, 소변, 객담, 체액 등으로부터 세포를 채취하면서 묻어나오는 적혈구와 같은 부산물은 약산성의 분위기에서 막의 탄력성이 파괴되면서 적혈구 등 부산물의 막이 제거되어 본 발명의 실시 예에 따른 세포학적 진단을 위한 보조용액에 용해되게 된다. 따라서 세포학적 진단 시 적혈구를 제거하기 위하여 별도의 공정을 거쳐야만 했던 종래기술의 단점을 보완할 수 있게 되는 것이다.
그리고 본 발명의 실시 예에 따르면, 검사하고자 하는 세포의 형태학적 구조를 고정시켜 보관하기 위하여 세포학적 진단을 위한 보조용액에 C2 내지 C4의 알코올을 포함시켰다. 또한 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세롤, 폴리에틸렌글리콜 혹은 폴리프로필렌글리콜 등의 건조방지제를 포함시켜 보관되던 세포를 이용한 각종 후속 검사 시 세포표면이 건조되는 것을 방지하여 원형그대로의 형태를 유지하고 있는 세포를 관찰할 수 있도록 하였다.
따라서 본 발명의 기술 분야에 속하는 평균적인 지식을 가진 당업자라면 상기한 본 발명의 각 실시 예들은 본 발명의 바람직한 실시 예들 중 대표적인 것을 예시적으로 선택하여 기술한 것이라는 것을 쉽게 알 수 있을 것이며, 상기한 본 발명의 실시 예를 참고로 하면, 상기한 실시 예 이외에도 다양한 응용예가 존재한다는 것을 자명하게 알 수 있을 것이다.
[보관기간에 따른 형태학적 소견 실험]
1. 실험목적
본 발명의 각 실시 예에 따라 제조된 세포학적 진단을 위한 보조용액에 수집된 세포를 보관할 경우 수집된 세포의 보관기간에 따른 형태학적 변화를 관찰하여 본 발명의 실시 예에 따른 세포학적 진단을 위한 보조용액의 세포보존능력을 살펴본다.
2. 실험방법
발명의 각 실시 예에 따른 세포학적 진단을 위한 보조용액과 비교 예에 자궁경부에서 수집한 세포를 실온에서 보관한다. 1주일, 1개월, 6개월, 12개월, 18개월이 각각 경과한 후 세포학적 진단을 위한 보조용액에 보관되어 있는 세포를 한외여과용 고분자박막(Filtered Membrane)에 부착시키고 부착된 세포를 다시 유리 슬라이드 위에 이동시킨다(Cell Transfer). 슬라이드로 이동된 세포들은 95% 에탄올에 고정한 후 염색(Pap Stain)하여 현미경으로 세포들을 관찰한다.
3. 실험결과
본 발명의 실시 예에 따른 세포학적 진단을 위한 보조용액에 보관되던 세포들은 약 12 내지 18 개월이 지난 후에도 세포의 원형이 그대로 유지되고 있는데 비하여 비교예의 경우에는 세포의 보존이 불가능하거나 혹은 세포의 변형이 나타나 형태학적 구조가 그대로 유지되지 않아서 세포학적 진단이 불가능하다.
이를 표로 정리하면 [표 1]과 같다. [표 1]의 결과를 살펴보면, 방부제를 사 용할 경우 세포의 보존기간이 연장된다는 것을 알 수 있다.
도 4는 세포를 보관한지 18개월이 경과한 본 발명의 실시 예에 따른 세포학적 진단을 위한 보조용액을 보여주는 도면이다.
[인화성 검사]
1. 실험목적
본 발명의 각 실시 예에 따른 세포학적 진단을 위한 보조용액이 인화성이 있는지를 살펴본다.
2. 실험방법
본 발명의 각 실시 예에 따른 세포학적 진단을 위한 보조용액과 각 비교 예 약 10cc정도를 각각 실험용 용기에 담고 라이터로 불을 붙여보았다.
3. 실험결과
비교 예1인 95%에탄올의 경우 갑자기 불이 붙었으나, 본 발명의 각 실시 예에 따른 세포학적 진단을 위한 보조용액 및 비교 예 2는 불이 붙지 않았다. [표 1]에 각 실시 예 및 비교 예에 따른 인화성실험의 결과를 정리하였다. 본 발명의 실시 예에 따른 세포학적 진단을 위한 보조용액은 알코올의 함량이 낮아 인화성이 없으므로 안전하게 사용할 수 있다는 것을 알 수 있다.
[적혈구 제거도 실험 및 염색상(像)]
1. 실험목적
수집된 세포에 묻어 있는 적혈구가 본 발명의 각 실시 예에 따른 세포학적 진단을 위한 보조용액에 의해 제거되는지 살펴보고, 본 발명의 실시 예에 따른 세포학적 진단을 위한 보조용액 내에 보관되던 세포를 염색하여 관찰한 결과를 살펴본다.
2. 실험방법
(1)적혈구 제거도 검사
자궁경부를 스크럽한 브러시를 본 발명의 실시 예에 따른 세포학적 진단을 위한 보조용액 혹은 비교 예가 담겨있는 용기의 바닥에 문질러 상기 브러시에 묻어있는 자궁경부세포들을 본 발명의 실시 예에 따른 세포학적 진단을 위한 보조용액 혹은 비교 예로 이동시킨다. 약 하루가 지난 후 각 용기에서 용액 2 cc 정도를 채취하여 한외여과용 고분자박막에 부착시킨 후 유리슬라이드위에 세포를 이동시키고 염색하여 현미경으로 관찰한다.
(2)염색상
자궁경부를 스크럽한 브러시를 본 발명의 실시 예에 따른 세포학적 진단을 위한 보조용액 혹은 비교 예가 담겨있는 용기의 바닥에 문질러 상기 브러시에 묻어있는 수집물을 본 발명의 실시 예에 따른 세포학적 진단을 위한 보조용액 혹은 비교 예로 이동시킨다. 1 달 혹은 1 년 후 각 용기에 담겨있는 용액을 한외여과용 고분자박막을 통하여 여과시켜, 보관되던 자궁경부 세포를 상기 한외여과용 고분자박 막으로 이동시킨다. 그 후 상기 자궁경부 세포가 이동된 고분자박막을 세포관찰용 유리슬라이드에 찍어 상기 자궁경부 세포를 상기 슬라이드로 이동시킨다. 상기 자궁경부세포가 이동된 슬라이드를 95% 알코올에 담가서 고정한 후 염색액(Pap stain)으로 염색하고 현미경으로 관찰하여 판독하였다.
3. 실험결과
(1) 적혈구제거도 검사
도 5는 본 발명의 비교 예 1인 95% 에탄올에 보관되었던 수집물의 현미경 판독 결과를 보여주는 도면이다. 도 5를 참조하여 설명하면, 본 발명의 비교 예 1 및 비교 예 2에 보관되었던 수집물에 존재하던 적혈구는 보관 중 제거되지 않아 전체적으로 붉은 원반형을 그대로 유지하고 있어 현미경으로 자궁경부세포를 관찰하는 것이 불가능한 것을 알 수 있다.
도 6은 본 발명의 실시 예에 따른 세포학적 진단을 위한 보조용액에 수집물을 보관한 후 하루가 경과한 후의 결과를 보여주는 현미경사진이다. 도 6을 참조하여 설명하면, 본 발명의 실시 예에 따른 세포학적 진단을 위한 보조용액에 보관되었던 수집물은 그 중에 존재하던 적혈구가 제거되어, 자궁경부세포가 명확하게 관찰되는 것을 알 수 있다. 본 발명의 각 실시 예에 따른 적혈구 제거율은 약 85 내지 95%이며, 각 실시 예에 따른 자세한 제거율은 [표 1]에 상세히 열거하였다.
(2) 염색상 검사 결과
도 7 및 도 8은 본 발명의 실시 예에 따른 염색상 검사 결과를 보여주는 도면이다. 도 7 및 도 8을 참조하여 설명하면, 먼저 도 7은 본 발명의 실시 예에 따른 세포학적 진단을 위한 보조용액 내에 보관된 지 1개월이 되는 자궁경부세포의 염색상이다. 각 세포가 선명하게 관찰되며 세포의 특징(예를 들면, 정상세포인지 암세포인지)에 따라 서로 다른 색으로 선명하게 구분됨을 알 수 있다. 도 8은 본 발명의 실시 예에 따른 세포학적 진단을 위한 보조용액 내에 보관된 지 1년이 지난 자궁경부세포의 염색상이다. 상기한 바와 마찬가지로 세포의 특성에 따라 서로 다른 색을 나타내는 세포들이 선명하게 관찰되고 있다. 따라서 본 발명의 실시 예에 따른 세포학적 진단을 위한 보조용액 내에 보관되는 세포는 보관된 후 장기간 시간이 경과한 후에도 정확하게 진단이 가능하다는 것을 알 수 있다.
반면 도 9는 본 발명의 비교 예 내에 보관되던 자궁경부세포의 염색상을 보여주는 도면이다. 도 9를 살펴보면, 각 세포들이 변성되어 파괴되거나 불분명하게 엉켜있어서 세포의 진단이 불가능하다는 것을 알 수 있다.
[유전자검사 가능여부 조사]
1. 조사의 목적
본 발명의 실시 예에 따른 세포학적 진단을 위한 보조용액 내에 보관되던 자궁경부세포를 증폭하여 유전자검사를 할 수 있는지 여부를 살펴본다.
2. 조사방법
본 발명의 실시 예에 따른 세포학적 진단을 위한 보조용액에 수집된 검체를 실온에서 적어도 1개월 이상 보관한 뒤, 상기 검체가 보관되고 있는 본 발명의 실시 예에 따른 세포학적 진단을 위한 보조용액 약 2 cc를 추출하여 중합효소연쇄반응( PCR :Polymerase Chain Reaction)을 25 회 내지 30회 반복한 후 전기영동사진을 찍었다. 비교 예 2인 PBS용액도 동일한 방법 및 기간으로 자궁경부세포를 보관한 후 약 2cc를 추출하여 중합효소연쇄반응(PCR :Polymerase Chain Reaction)을 25 회 내지 30회 반복한 후 전기영동사진을 찍었다.
3. 실험결과
도 10 및 도 11은 본 발명의 실시 예에 따른 세포학적 진단을 위한 보조용액에 보관되던 자궁경부세포를 이용하여 촬영한 전기영동사진이다. 도 10을 참조하여 설명하면, 본 발명의 실시 예에 따른 세포학적 진단을 위한 보조용액에 보관되던 자궁경부세포는 별도의 다른 절차를 거치지 않고 바로 중합효소연쇄반응을 수회 반복하여 유전자 검사를 할 수 있는 것을 알 수 있다. 또한 실온에서 보관하던 세포를 이용하여도 유전자 검사를 할 수 있다. 이러한 유전자 검사율은 약 99.9%에 달하였다. (도 10 및 도 11에서 1개가 음성으로 나온 것은 음성대조군입니다)
도 11은 본 발명의 실시 예에 따른 세포학적 진단을 위한 보조용액 내에서 실온으로 1년 이상 보관한 세포의 전기영동사진이다. 도 11의 판독결과에서 알 수 있는 바와 같이 본 발명의 실시 예에 따른 세포학적 진단을 위한 보조용액에 보관되는 세포는 보관기간이 실온에서 1년이 지난 경우에도 유전자 검사를 할 수 있다.
도 12는 본 발명의 실시 예에 따른 세포학적 진단을 위한 보조용액과 PBS용액 내에 각각 세포를 실온에서 1개월 보관한 후 촬영한 전기영동사진 결과를 보여주는 도면이다. 도 12를 참조하여 설명하면, 도 12에서 1로 표시된 것은 본 발명의 실시 예에 따른 세포학적 진단을 위한 보조용액 내에서 실온으로 세포를 보관한 경우의 전기영동실험 결과를 나타낸 것이고, 2로 표시된 것은 PBS 용액 내에서 실온으로 보관된 세포의 전기영동 결과를 보여주고 있다. 본 발명의 실시 예에 따른 세포학적 진단을 위한 보조용액 내에 보관되는 세포는 실온에서 보관되는 경우라 하더라도 유전자검사를 할 수 있는 반면, 비교 예인 PBS 용액 내에서 보관되는 세포의 경우에는 실온에서 보관된 경우에는 유전자 검사를 할 수 없다. 따라서 본 발명의 실시 예에 따른 세포학적 진단을 위한 보조용액을 이용하게 되면 실온에서 세포를 보관한 경우에도 유전자 검사를 할 수 있으므로 종래의 PBS 용액을 이용하여 유전자 검사를 하는 경우보다 좀 더 간편하게 유전자 검사를 할 수 있다.
세포학적 진단을 위한 보조용액 내에 보관되던 세포를 이용하여 유전자검사를 할 수 있는 경우에는 유전자 검사를 위한 별도의 절차가 요구되지 않아 환자에게 빠르고 편리하게 검사결과를 통보해 줄 수 있다는 장점이 있으며, 장기간 실온에서 보관한 세포의 경우에도 유전자 검사를 할 수 있게 되면 검사를 위한 세포의 보관에 드는 비용이 획기적으로 감소되는 장점이 있다.
[표 1] 실험결과
보관기간에 따른 형태학적 소견 인화성 염색상 적혈구 제거도 유전자검사 가능여부
1주 1개월 6개월 12개월 18개월
1 적절 적절 적절 적절 부적절 無 적절 85% 가능
2 적절 적절 적절 적절 적절 無 적절 90% 가능
3 적절 적절 적절 적절 적절 無 적절 90% 가능
4 적절 적절 적절 적절 적절 無 적절 90% 가능
5 적절 적절 적절 적절 부적절 無 적절 90% 가능
6 적절 적절 적절 적절 적절 無 적절 95% 가능
7 적절 적절 적절 적절 적절 無 적절 90% 가능
8 적절 적절 적절 적절 적절 無 적절 90% 가능
9 적절 적절 적절 적절 적절 無 적절 85% 가능
10 적절 적절 적절 적절 적절 無 적절 95% 가능
11 적절 적절 적절 적절 적절 無 적절 95% 가능
12 적절 적절 적절 적절 적절 無 적절 95% 가능
13 적절 적절 적절 적절 부적절 無 적절 95% 가능
14 적절 적절 적절 적절 적절 無 적절 95% 가능
15 적절 적절 적절 적절 적절 無 적절 90% 가능
16 적절 적절 적절 적절 적절 無 적절 90% 가능
17 적절 적절 적절 적절 적절 無 적절 90% 가능
18 적절 적절 적절 적절 적절 無 적절 90% 가능
19 적절 적절 적절 적절 부적절 無 적절 90% 가능
20 적절 적절 적절 적절 적절 無 적절 90% 가능
21 적절 적절 적절 적절 적절 無 적절 85% 가능
22 적절 적절 적절 적절 적절 無 적절 90% 가능
23 적절 적절 적절 적절 적절 無 적절 90% 가능
24 적절 적절 적절 적절 적절 無 적절 90% 가능
25 적절 적절 적절 적절 적절 無 적절 85% 가능
26 적절 적절 적절 적절 적절 無 적절 85% 가능
27 적절 적절 적절 적절 적절 無 적절 90% 가능
28 적절 적절 적절 적절 부적절 無 적절 90% 가능
29 적절 적절 적절 적절 부적절 無 적절 90% 가능
비교예 1 적절 부적절 부적절 부적절 부적절 有 1주이상 부적절 불가 일부가능
비교예 2 실온보관 불가 실온보관 불가 실온보관 불가 실온보관 불가 실온보관 불가 無 부적절 불가 냉장고 보관 시 가능
이상과 같이, 본 발명에 대한 구체적인 설명은 첨부된 도면을 참조한 실시 예에 의해서 이루어졌지만, 상술한 실시 예는 본 발명의 바람직한 예를 들어 설명하였을 뿐이기 때문에 본 발명이 상기의 실시 예에만 국한되는 것으로 이해되어져 서는 아니 된다. 따라서 상기에서 설명한 것 외에도 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 사람은 본 발명의 실시 예에 대한 설명만으로도 쉽게 상기 실시 예와 동일 범주내의 다른 형태의 본 발명을 실시할 수 있거나, 본 발명과 균등한 영역의 발명을 실시 할 수 있을 것이다.
상기한 구성을 갖는 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 세포학적 진단을 위한 보조용액에 의하면 첫째, 세포의 형태학적 구조를 유지하면서 장기간 세포를 보관할 수 있는 현저한 효과가 있다.
둘째, 적혈구를 제거하는 효과가 우수하여 수집된 세포를 간편하면서도 명확하게 판독할 수 있는 현저한 효과가 있다.
셋째, 인화성이 없어 안전하게 다룰 수 있는 현저한 효과가 있다.
넷째, 염색상이 우수하여 정확한 진단을 할 수 있는 현저한 효과가 있다.
다섯째, 환자로부터 별도로 검체를 채취할 필요가 없이 기존의 보관되어 있는 세포를 이용하여 용이하게 유전자 검사를 할 수 있는 현저한 효과가 있다.
비록 본 발명이 상기 언급된 바람직한 실시 예와 관련하여 설명되어졌지만, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 따라서 첨부된 특허청구의 범위는 본 발명의 요지에서 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함할 것이다.

Claims (17)

  1. 소정범위의 pH로 유지하기 위한 완충용액, 알코올, 그리고 보관되던 세포를 대상으로 하는 후속 검사 시 상기 세포가 건조되는 것을 방지하기 위한 건조방지제를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포학적 진단을 위한 보조용액.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 완충용액은 상기 세포학적 진단을 위한 보조용액의 산도를 pH 2 내지 6.5로 유지시키는 것을 특징으로 하는 세포학적 진단을 위한 보조용액.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 완충용액은 젖산완충용액, 초산완충용액 그리고 인산완충용액으로 선택되는 군 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 세포학적 진단을 위한 보조용액.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 세포학적 진단을 위한 보조용액 중 상기 완충용액이 10 내지 40 중량부인 것을 특징으로 하는 세포학적 진단을 위한 보조용액.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 알코올은 에탄올, 프로판올, 이소프로필알콜, 부탄올, 그리고 펜탄올로 선택되는 군 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 세포학적 진단을 위한 보조용액
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 알코올은 에탄올, 프로판올 그리고 이소프로필알콜로 선택되는 군 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 세포학적 진단을 위한 보조용액.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 세포학적 진단을 위한 보조용액 중 상기 알코올이 5 내지 40 중량부인 것을 특징으로 하는 세포학적 진단을 위한 보조용액.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 세포학적 진단을 위한 보조용액 중 상기 알코올이 10 내지 35 중량부인 것을 특징으로 하는 세포학적 진단을 위한 보조용액.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 건조방지제는 다가알코올인 것을 특징으로 하는 세포학적 진단을 위한 보조용액.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 다가알코올은 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 그리고 글리세롤로 선택되 는 군 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 세포학적 진단을 위한 보조용액.
  11. 제 1항에 있어서,
    상기 건조방지제는 폴리에틸렌글리콜 또는 폴리프로필렌글리콜인 것을 특징으로 하는 세포학적 진단을 위한 보조용액.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 폴리에틸렌글리콜 또는 폴리프로필렌글리콜은 분자량이 100 내지 100,000Da인 것을 특징으로 하는 세포학적 진단을 위한 보조용액.
  13. 제 1항에 있어서,
    상기 세포학적 진단을 위한 보조용액은 상기 건조방지제가 0.1 내지 30 중량부인 것을 특징으로 하는 세포학적 진단을 위한 보조용액.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 세포학적 진단을 위한 보조용액은 상기 건조방지제가 0.1 내지 15 중량부인 것을 특징으로 하는 세포학적 진단을 위한 보조용액.
  15. 제 1항에 있어서,
    상기 세포학적 진단을 위한 보조용액은 방부제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포학적 진단을 위한 보조용액.
  16. 제 15항에 있어서,
    상기 방부제는 아스코르브산, 소르브산, 구연산, 살리실산, 벤조산나트륨, 포르말린, 글리옥살, 그리고 프로피온산칼슘으로 선택되는 군 중 적어도 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 세포학적 진단을 위한 보조용액.
  17. 제 15항에 있어서,
    상기 세포학적 진단을 위한 보조용액은 상기 방부제가 0.1 내지 20 중량부인 것을 특징으로 하는 세포학적 진단을 위한 보조용액.
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