JPH07500674A - アルデヒド固定組織における免疫化学的染色の増強 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 アルデヒド固定組織における免疫化学的染色の増強本発明は、アルデヒド固定さ れた及び包埋された組織断片の免疫組織化学的染色に関する。臨床検体又は動物 実験から得られた組織断片は時々、光穎微鏡による後での試験のために適切な形 て固定され、包埋され、そして貯蔵される。免疫学的試薬、特にモノクローナル 抗体試薬は現在、特定の抗原化合物の存在のために少なくとも一定のそれらの固 定された組織サンプルの試験を可能にする。対象の抗原は疾病工程又は病理学に 関連し、又は特定細胞タイプ又は組織を同定することかてきる。最近調製された 生検及び検死サンプルの場合、そのような免疫組織化学的分析は直ちの診断価値 あるものである。

しかしながら、組織検体の免疫組織化学的分析は、検体固定の間、抗原損失のた めに妨げられて来た。従来の固定法は時々、アルデヒド固定剤を使用しており、 ここで固定剤は組織タンノくり質内ての及びその間ての架橋反応を引き起こすこ とによって組織を固定する。

２ｆｌのタイプの架橋反応か認識されている。第１の反応タイプは、ンソフ塩基 タイプの重合であり　ホルムアルデヒドがタンノくり質のアミノ基と縮合し、シ ッフ塩基中間体をもたらし、この中間体かタンパク質の架橋を導ひく急速な重合 を受けることかできる。

マンニッチ（Ｍａｎｎｉｃｈ）反応と呼ばれる第２タイプの反応におし）では、 ホルムアルデヒドはアミノ基及び活性水素基の両者と反応てき、マンニッチ塩基 の形成をもたらす。マンニッチ塩基の重合はタンノくり質架橋をもたらす。

架橋は組織形態及び結合性を保持し、スライスするために組織を硬化し、そして 微生物の攻撃を阻止する。不運な事には、架橋工程はまた組織抗原性の損失を引 き起こし、その結果はアルデヒド試薬、たとえばホルムアルデヒドにより固定さ れる組織に対する免疫学的試薬の有用性を阻止する。ホルムアルデヒドによるア ミノ酸及びタンパク質の架橋の化学は、Ｈａｒｌａｎ　ａｎｄ　Ｆｅａｉｒｈｅ ［ｌｅｒ、　”Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆｔｈｅ　Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ 　ｏｆ　ＣｏｌＣｏ１１ｏ　Ｄｕｒｉｎｇ　Ｔａｎｎｉｎｇ、”及びＫｅｌ　ｌ ｙ、　ｆ、Ｋ　＆　。

”Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ　ｏｆ　Ａｍ１ｎｏ　Ａｃ１ｄ　Ｂｙ　Ｆｏｒｍ ａｌｄｅｈｙｄｅ、”（１９７６）に記載されている。ホルムアルデヒドによる タンパク質アミノ基及び芳香族アミノ酸の架橋におけるマンニッチタイプ反応の 役割は、Ｆｒａｅｎｋｅｌ−Ｃｏｎｒａｔ、　？、；　Ｈ，、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、 　Ｃｈｅｍ、　（１９４７）１６８　：　９９〜１１８及びＦｒａｅｎｋｅｌＣ ｙｔｏｃｈｃｍ、　（１９８５）　３３　：　８４５〜８５５　；　Ｊｏｎｅｓ 、　”Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ａｌｄｅｈｙｄｅｗｉｔｈ　ｕｎｓａｔｕｒ ａｔｅｄ　ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄ　ｄｕｒｉＢ　ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ　ｆ ｉｘａｔｉｏｎ、″タイプの反応は、一般的にＭａｒｃｈ、　”Ａｄｖａｎｃｅ ｄ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、”特に３３３．４２４．６７０〜６ ７２ページ、（１９６８）に記載されている。

アルデヒド固定剤定の欠点を回避するための試みにおいては、他の固１０９５） か開発さ第１た。他の固定化法のいくらかの欠点にもかかわらず、それらは一般 的な使用においてアルデヒド固定化を代用していない。それらの制限された許容 性は、それらの他の方法に存在する欠点に影響を及はす。たとえばマイクロ波加 熱は赤血球細胞を溶解し、そして膜脂質を破壊する。エタノール固定化は組織サ ンプルの改良された抗原性を生成することが報告されているが、エタノールは高 められた細胞収縮を引き起こす（Ｂａｔｔｉｆｏｒａ　ａｎｄ　Ｋｏｐｉｎｓｋ ｉ、前記）。

従って、アルデヒド固定化組織に対する抗原性を回復するための方法は、現在の 臨床実施により生成される検体のために有用であり続ける。

さらに、抗原性を回復するための方法は、収集物にすてに存在する莫大な数のア ルデヒド固定化組織サンプルのために有用である。

それらの貯蔵された組織サンプルは、レトロ特異的免疫組織化学試験のための材 料に富んでいる貯蔵物を提供する。続く免疫組織化学染色の適切な方法か利用で きる場合、新らしく生成された免疫組織化学的データは、同し組織に対する従来 の調査から得られる存在する診断結果と組合され得る。しばしば、臨床学的サン プルは１０年間保存され、その結果、患者の根底にある病理学的工程の臨床学的 結果かすてに知られている。実験用組織、たとえば毒物学試験において動物から 得られたそれらの組織の場合、病理学及び毒性の他の測定か一般的に実施され、 そして記録されるであろう。両者の場合、影響される組織の免疫学的分析は、重 要な相互関係の情報をイー１与することかできる。

過去１０年間にわたっての免疫学的試薬の開発のために、多くの組織か元来貯蔵 された時点て不可能であった免疫組織化学分析か現在行なわれ得る。さらに、疾 病工程に関する新しい知識又は仮説は、貯蔵された組織の再試験を促進できる。

貯蔵された組織サンプルに対する免疫組織化学的研究は、統計学的に多くのサン プル集団に対して臨床研究を行なうために比較的時間−及び費用〜有効性の手段 を提供する。従って、通常の臨床学的又は実験的由来の包埋された組織断片への 免疫組織化学的分析の適用は、相当の興味ある事である。

アルデヒドによる組織固定化の間の抗原損失は、タンパク質の化学変性（抗原の 物理的除去ではない）による。免疫反応性の損失は２種の機構により生じると思 われている。まず第１の機構においては、固定化剤か反応性エピトープを化学的 に変性し、それを抗体結合できなくする。第２の機構においては、固定化剤が標 的エピトープ外の部位で抗原タンパク質の化学的架橋を引き起こす。そのような 架橋は、分子内又は分子間、すなわち近くのタンパク質の包含により存在する。

この架橋は、反応性エピトープへの抗体試薬の接近を立体的に阻害する。

第２機構、すなわち対象のエピトープ外のタンパク質内又はタンパク質問架橋に よる立体的阻害は、タンパク質の妨害架橋部分を除去するためにホルマリン固定 化組織のプロテアーゼ消化により逆転された。このアプローチは、ホルムアルデ ヒド固定化組織におけるケラチンの免疫染色を改良することか示されている（Ｂ ａｔｔｉｆｏｒａ　ａｎｄＫｏｐｉｎｓｋｉ、　、１．　ｔｌｉｓｔｏｃｈｅｍ 、　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、　（１９８６）　３４　：　１０９５〜１１００）　ｏ 　しかしなから、プロテアーゼ処理はアルコールにおいて固定された組織の染色 を実際分解し、その固定化溶液はタンパク質架橋を引き起こさない。制限された 時間でのホルムアルデヒド固定化組織のタンパク質分解による免疫染色のいくら かの改良が他の抗原に関して示されている（Ｈｕａｎｇ、など、、、１．Ｌａｂ 、Ｉｎｖｅｓｔ、（１９７６）　３５：　３８３〜３９０）。２３種の病理学的 対象の抗原の免疫染色の研究においては、従来のトリプシン処理は、サイトケラ チン及びデスミンの場を除いて、ホルムアルデヒド固定化組織の免疫染色におい て改良点を付与しないことか示された。多くの抗原に関しては、酵素消化は抗原 染色を実際に低下せしめた（Ｌｅｏｎｇ、　？、ｌ’、ｊ、ＰａｔｈｏｌｏｇＹ 　（１９８８）１５６　：　２７５〜２８２）。

それらの結果は、タンパク質のアルデヒド固定化剤−誘発化架橋か、エピトープ の化学的変性及び架橋により介在される立体的妨害の両者により免疫染色を減じ る仮説を支持する。タンパク質加水分解酵素による固定された組織の処理から得 られる混合された結果は容易に合理的に説明される　部分的タンパク質加水分解 は架橋を低め、そして立体的妨害を減じるか、タンパク質加水分解はまた対象の エステルを分解し、そして除去できる。さらに、タンパク質加水分解はエピトー プの化学的変性のために、抗原マスキングを逆にすることかできない。対照的に 、アルデヒド固定化剤により生成される化学的架橋反応を逆にする方法は、いづ れかの機構により前もって隠されたマスクされていない抗原への可能性を有する 。

重金属溶液においてマイクロ波による組織の加熱によりホルマリン−固定化され た、パラフィン包埋された組織断片の抗原性を再生するための方法か、Ｓｈｉ、 なと、　Ｊ、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ３９（ｂ）　：　７４１〜４８　（＋９９１）に記載されている。この方法 は、試験されるサンプルの約３／４、高められた免疫染色を提供する。その記載 された方法は、組織断片の脱パラフイン化及び再水和化、内因性ペルオキシダー ゼをブロックするために水性ペルオキシドによる短時間の処理、蒸留水によるス ライドの洗浄、蒸留水又は重金属溶液によるスライドの被覆及び数分間のマイク ロ波加熱の段階を包含する工程の一部である。この方法に続いて、スライドが冷 却され、すなわち、そして従来の態様て免疫染色される。

抗原性を再生するためのこの方法は、一定の制限を受ける。第１に、それは組織 サンプルを加熱するためにマイクロ波オーブンの使用を要する。多くの実験室は マイクロ波オープンを装備しておらず、そしていくつかの組織サンプルはマイク ロ波加熱に適さない。いづれの外部加熱源を伴わないで、室温で使用され得る抗 原回復方法のだめの必要性か存在する。さらに、前で記載された方法は特に、炭 化水素媒体、たとえばパラフィンに包埋された組織のために適切である。それは セロイジン、すなわち骨組織のだめの好ましい包埋媒体に包埋される組織断片の ために適切ではない。セロイジン包埋された組織による使用のために適切である 方法の必要性がまた存在する。さらに、脱カルシウム化された組織はしばしば前 に記載された方法に手におえないのて、脱カルシウム化された骨組織サンプルに より使用され得る方法の必要性か特に存在する。

アルデヒド固定された組織の免疫組織化学的分析のために抗原性を再生するため の方法及び組成物が提供される。その方法及び組成物は、セロイジン包埋された 組織及び脱カルシウム化（脱石灰化）された骨組織に関して特に有用である。そ の方法は、開放されるアルデヒドを非反応性形、すなわち非アルデヒド誘導体に 転換する時に不可逆性マンニッチ／シッフ塩基反応を触媒する化学物質によるア ルデヒド固定組織の処理を包含する。この適用において、そのような化学物質は 、”アルデヒド開放剤”と称されるであろう。１つの観点において、そのアルデ ヒド開放剤は核試薬溶液を含んて成り、そしてその方法は、（１）任意にカオト ロピック剤を含む請求核試薬溶液によるアルデヒド固定組織の処理、（２）前記 組織サンプルを中和し又はすすぐことによっての過剰の核試薬の除去及び（３） 免疫反応性試薬との前記組織の反応を包含する。もう１つの観点においては、ア ルデヒド開放試薬は酸化剤を含んで成り、そしてその方法は、（１）酸化剤によ るアルデヒド固定組織の処理、（２）過剰の酸化剤の除去及び（３）免疫反応性 試薬との前記組織の反応を包含する。第３の観点においては、アルデヒド開放試 薬は有機酸／塩基対を含んで成り、そしてその方法は、段階（１）において、そ の有機酸／塩基対による処理を包含する。典型的な有機酸は下記に示される。典 型的な塩基は水酸化ナトリウム及び水酸化カリウムである。また、アルデヒド固 定された組織の免疫染色のためのキットも提供される。そのキットは、溶媒及び アルデヒド開放試薬を含んで成る、抗原性の再生のだめの溶液を最少含んで成る 。場合によっては、そのキットはまた、過剰のアルデヒド開放試薬又は免疫染色 試薬を除去するための溶液も含んで成る。

本発明は、アルデヒド固定化剤により固定され、そして包埋媒体に包埋された組 織の免疫反応性を再生するための方法を提供し、その方法は溶媒及びアルデヒド 開放試薬を含んで成る、抗原性を再生するための溶液と前記組織とを接触する初 期段階を含んで成る。そのアルデヒド開放試薬は、たとえば逆マンニッチ又は逆 シッフ塩基反応を触媒することによって、組織におけるアルデヒドと生物学的成 分との反応の逆転を触媒する。開放されたアルデヒドは、非アルデヒド誘導体を 形成するために実質的に可逆性の態様で反応する。

他方、前記初期段階は、抗原性再生溶液の成分を別々に添加することによって次 の２つの段階に分けられる　まず、包埋媒体の少なくとも一部を除去するために 溶媒の添加であり、続いて、通常、同しか又は異なった溶媒におけるアルデヒド 開放試薬の添加である。そり固定され、そしてセロイジンを含んで成る包埋媒体 に包埋された脱カルシウム化された組織の免疫反応性を再生するための方法を提 供する。特定の態様は下記に詳細に記載される。本発明の初期固定化工程及び抗 原性再生工程の間に起こると思われる物理的及び化学的工程の簡単な論議と共に 、本発明かいかに作用するかの一般的な理論が下記に示される。それらは単に理 論であり、そして本発明は実施者により実施される特定の操作（及びその変法） の記載に関して十分に簡単に実施され得ることか理解されるへきである。

組織のアルデヒド固定化は、架橋されたタンパク質を生成すると思われる。その 架橋は、組織タンパク質のアミノ酸残基、たとえばリシン及びＮ−末端α−アミ ノ酸基上のアミノ基と固定化剤におけるアルデヒド基との反応により仲介される 。この反応の初期生成物は、アミノ−アルデヒド複合体、すなわちイミノシッフ 塩基（ＣＩＩＲ。

＝ＮＲ２Ｒ，）又はアミノ−メチロール（ＣＨＲ，０ＩＩＮＲ２Ｒ１）中間体で ある。次に、その中間体は、敏感な近くのアミノ酸基、たとえば酸性プロトン、 求核性へテロ原子又は電子に富む芳香族環を有するα−カルボニルメチレン炭素 により核性攻撃を受ける。主な核試薬は、芳香族環、たとえばチロシンのフェノ ール環のオルト位、トリプトファンのインドール環の（、−２位及びヒスチジン のイミダゾール環。

グルタノート及びアスパーテートの側鎖カルボン酸基に隣接するα−炭素、塩基 性へテロ原子、たとえばリシルε−アミノ基；及び中性窒素原子、たとえばアス パラギニル及びグルタミニルアミド基及びトリプト・ファンのインドール環窒素 を包含する。正式には、すべてのそのような反応は、反応性求電子試薬が少なく とも中間体アミノーアルデヒ１−複合体種である限り、マンニッチ反応のタイプ 又はその反応に少なくとも類似するタイプのものである。それらの反応は請求電 子性アルデヒド炭素と核性炭素又はヘテロ原子との間に共存結合をもたらす。

その得られる架橋は、特定の形態でタンパク質を固定し、そして隣接するタンパ ク質問で共有結合を形成することによって全体の組織を固定する。その架橋され たタンパク質は、高分子、たとえば抗体による侵入を妨害する。さらに、エピト ープ（アミン、アミド又は芳香族アミノ酸残基を含む）の化学的変性は、そのエ ピトープに対する抗体に対して認識されない変更された構造体を生成する。

通常のアルデヒド固定化剤はホルムアルデヒドであり、これは単官能価であり、 そしてリシンのメチロール−アミノ基と隣接する敏感なアミノ酸標的残基との間 での直接的な接触により架橋を生成する。しかしなから、他の二官能価又は多官 能価架橋アルデヒドも知られている。それらのうち、グルタルアルデヒドか最と も通常であり、これは両端でアルデヒドを有する５つの炭素原子の鎖である。

二〇二官能価試薬は、その試薬のアルキル鎖かスペーサーとして機能するので、 架橋のための追加の機会を供給する。その反応の機構は、固定化のために使用さ れる特定のアルデヒド試薬に関係なく、類似すると思われる。

本発明の方法は、持前に固定されたタンパク質の架橋の少なくともいくらかを逆 にし又は破壊し、それによってそのタンパク質の抗原性を再生するだめの手段を 提供する。その方法は、マンニッチタイプの反応及びホルムアルデヒドと組織成 分との間の他の反応の逆転を促進すると思われる、アルデヒド開放試薬を含む溶 液により前もってアルデヒド固定された組織を処理することを包含する。抗原性 の再生はまた、限定されたタンパク質加水分解の結果としても進行する。抗原性 を効果的に再生するために、試薬はすべてのアルデヒド誘発された結合を逆転し 又は破壊する必要はない。架橋の部分的破壊は、固定されたタンパク質をゆるめ 、抗体による侵入を十分に可能にする。特に敏感な結合は、アミノメチロール反 応体とへテロ原子、たとえばアミン及びアミド、又はα−カルボニルメチレン基 との間で生成される結合であると思われる。

本発明の実施のための最とも効果的なアルデヒド開放試薬は請求核性試薬、好ま しくは塩基性求核試薬である。特に好ましい核性試薬は、アルカリ金属水酸化物 、たとえば水酸化すｌ・リウム又はカリウムとして便利に供給される水酸化物ア ニオンである。他の便利な核性試薬は、第一、第二又は第三アミン、特に攻撃に 対する最少の立体的妨害を有するもの、たとえばピペリジン又はモルホリンを包 含する。ヒドロキシルアミン及びグリシンか好ましい。他の核性試薬は、チオー ル、たとえばメルカプトエタノールを包含する。

興味あるさらにもう１種の核性試薬は、アジド、たとえばアジ化すトリウム（Ｎ ａＮｚ）である。一般的に、逆マンニッチ反応を促進できる核性試薬は、少なく ともいくらかのタンパク質架橋を切断てき、そのような試薬はまた、ホルムアル デヒドにより引き起こされる他の反応タイプの逆転も触媒できる請求核性試薬の 濃度は広く異なり、より高い濃度の溶液はよりすばやく作用する。短い暴露のた めには、０．５Ｍ又はそれ以上の核性試薬濃度か通常好ましい。メタノール中、 Ｎａ０１１の場合、飽和の１／ｌＯ〜１／２の濃度（約０．６〜３Ｍ）か最とも 好ましい。たとえばヒドロキシルアミン塩酸塩の形てのヒドロキシルアミン又は グリシンのためには、１０％水溶液か好ましい。

本発明の実施のための他の効果的なアルデヒド開放試薬は、酸化剤である。好ま しい酸化剤は次亜塩素酸塩及び過ヨウ素酸塩、特に次亜塩素酸ナトリウム又は過 ヨウ素酸ナトリウムである。追加の酸化剤は、ヒトロジン水和物である。酸化剤 の濃度は試薬と共に変化する。たとえば次亜塩素酸ナトリウムに関しては、約ｏ 、ｏ＋９６〜約０、００５％、好ましくは０．００５％の水溶液（ｖ／ｖ）か適 切である。

過ヨウ素酸ナトリウムに関しては、約０．１％〜約１．０％、好ましくは０．１ ９６の水溶液（Ｖ　／　Ｖ　）か適切である。ヒドラジン水和物に関しては、約 ２．ｏ９＋〜約５．０％、好ましくは５．０％の水溶液（ｖ／ｖ）か適切である 。酸化剤によるサンプルの処理は、アルデヒドと組織成分との間の架橋を分解す ると思われ、そしてたとえばホルムアルデヒドを蟻酸に転換することによって、 開放されたアルデヒドを非反応性形に転換する。

一定の酸／塩基対か、本発明内でアルデヒド開放剤として機能することか見出さ れた。次の対は代表であるニトリクロロ酢酸／Ｎａ０ｆ（１０％水性／メタノー ル中、　１０／２０１０％Ｎａ０ｔｌ クエン酸／Ｎａ００　１０％水性／４０％水性　３０／３０蓚酸／ＮａＯＨ２０ ％水性／４０％水性　３０／３０酒石酸／Ｎａ０１１　１０％水性／４０％水性 　３０／３０アルデヒド開放性試薬溶液のための溶媒は、そのアルデヒド開放試 薬と相溶てき、且つそれに溶解できるいづれかの溶媒であり得る。

好ましくは、アルデヒド開放性試薬か酸化剤又は有機酸／塩基対である場合、水 溶液は可能である。有機溶液は、それらか包埋媒体の良好な侵入を促進するので 、アルデヒド開放性試薬か核性試薬である場合に好ましい。さらに、タンパク質 加水分解フラグメントはほとんとの有機溶媒に不溶性であり、そして従ってスラ イド上の適切な位置に存続する傾向かある。

セロイジン包埋された組織断片に使用するための好ましい溶媒は極性有機溶媒で ある。アルコール溶液は、それらかセロイジン包埋媒体の良好な侵入を促進する ので好ましく、そして特にアルカリ金属水酸化物の核性試薬のために良好な溶媒 である。低級アルコール、たとえばメタノール、エタノール、プロパツール及び ブタノールか好ましく、そしてメタノールか特に好ましい。ポリオール、たとえ ばエチレングリコール及びグリセロールもまた有用である：それらは、蒸発又は 流出を伴わないで長期間、スライド上への存続を可能にする、低い揮発性及び高 い粘度の利点を存する。極性非プロトン性溶媒、たとえばジメチルホルムアミド （ＤＭＦ）及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）かまた、適切な核性試薬と共 に使用され得る。

さらに、混合された溶媒溶液か許容され、但し、成分溶媒は試薬と及びお互いと 相溶性であるへきである。

２種の溶媒かある環境下で連続して使用され得る。たとえばセロイジン包埋され たスライドは、初め、包埋媒体を溶解するためにメタノールにより、処理され、 次にアルデヒド開放性試薬溶液、たとえばグリセロール中、ＫＯ［１溶液により 処理される。

非極性有機溶媒は、非極性媒体、たとえばパラフィンに包埋された組織に関して 有用である。非極性溶媒、たとえばトルエンの場合、第四塩か、非極性溶媒に溶 解するので所望される。例としては、水酸化テトラアルキルアンモニウム（たと えば水酸化テトラエチルアンモニウム）又は第四ホスホニウム塩を挙げることか できる。非極性溶媒及び第四塩基は、相移行反応においては不混和性極性水性相 と共に組合され得る。２つの相は組織に同時に適用され得、又は非極性相はまず 、パラフィン包埋媒体の可溶化を促進するために適用され得る。

添加剤は、溶液の所望する性質を増強するために含まれ得る。ケーオトロビック 剤、たとえばナトリウムチオシアネートが好ましい添加剤である。

包埋され、そして固定された組織断片は、数分〜数時間、アルデヒド開放性試薬 溶液に含浸され又はその溶液により被覆される。最適の処理期間は、アルデヒド 開放性試薬の濃度、溶媒（もし存在するなら）のタイプ、溶液による包埋媒体の 侵入の程度、組織固定化の程度及び温度に依存して変化する。変数の特定の組合 せのためには、処理の最適時間は、種々の時間、組織サンプルを処理し、そして 免疫染色の程度を測定することによって容易に決定され得る。メタノール性水酸 化ナトリウムを２５％飽和で含む溶液のためには、約３０分の処理期間かほとん どの組織断片のために適切である。約５分以下の時間では、はとんと改良は見ら れない。約２時間以上の長い接触の期間で、組織はスライドから分離する傾向か あり、これは特に、２０ｍｍのセロイジン断片に関して断定される。

処理温度は化学反応のための典型的な予測できるパターンで反応速度に影響を及 はし、高温はと、より急速な結果をもたらす。その方法は室温で便利に実施され 、そして温度調節は通常実施されない。

アルデヒド開放性試薬溶液による処理期間の後、過剰の試薬か、免疫染色のＭ、 組織サンプルから除去される。これは、試薬を含まない溶媒又は溶液により組織 をすすぐことによって最つども便利に達成され得る。すすぎ溶液の複数回の交換 が好ましい。組織水和化及び形態学的特徴の高い保存のためには、少なくとも１ 種のすすぎ溶液は好ましくは、アルデヒド開放性試薬溶液に使用される溶媒及び 水性緩衝液の混合物を含むであろう。これは緩衝液による組織の再平衡化を促進 する。好ましくは、水性緩衝液によるｌ又は複数回の洗浄か、免疫染色の前に行 なわれるであろう。好ましいすすぎ工程は、界面活性剤を含む緩衝液による少な くとも１回の洗浄、続く界面活性剤を含む緩衝液による１又は複数回のすすぎ、 続いて界面活性剤を含まない緩衝液による１又は複数回のすすぎを伴う。界面活 性剤はいづれかの組織相溶性界面活性剤（イオン性又は非イオン性のいづれか） であり得るか、但し、非イオン性界面活性剤、たとえばＴｒｉ　ｌｏｎ人−１０ ０か好ましい。

すすぎ段階に代わる手段どして、過剰の試薬か酸又は緩衝液により中和され得る 。この代用の手段は、溶媒か免疫染色のために使用される溶液に、組成において 類似し又は同一である場合に最とも実行可能である。はとんとの用途に関しては 、すすぎによる過剰の塩基の除去か好ましい。

過剰の試薬の除去の後、組織はいづれかの従来の技法により免疫染色される。多 くの種類の免疫染色法、試薬及び抗体が知られており、その多くは市販されてい る。上記抗原性を再生するための工程は、はとんどの免疫染色法と適合てきる条 件下に組織をゆだねることである。典型的には、組織が対象の抗原に対する一次 抗体と共にインキヨヘートされ、続いて検出可能なラベルにより処理される。

検出可能なラベルはその一次抗体に対する第２抗体をしばしば包含し：第２抗体 は実際に検出される第３種と結合する能力を有する。

それらの結合の複数のレベルは、検出てきるシグナルの強度を増幅するだめの手 段を提供する。一般的に、上記の抗原回復法は、検出工程を妨害しない。

アルデヒド解放性試薬を用いて抗原性を再生するための本発明の方法は、特にい づれかの包埋媒体、たとえば炭化水素、たとえばパラフィン及び合成樹脂により 使用され得る。しかしながら、骨組織のための従来の包埋媒体であるセロイジン に関してか特に有用である。セロイジンは、ビロキシリンの純粋な形、すなわち ニトロセルロースの低窒素形である。セロイジンは種々の市販源から入手できる 。

記載される方法は好ましくは、包埋媒体を溶解し又は膨潤し、そして軟化する溶 液により行なわれる。はとんどの包埋媒体は溶液として供給される。従って、溶 液のための適切な溶媒は、包埋媒体のために供給される溶媒の溶媒作用（たとえ ば疎水性、極性、水素結合）−カー／アクセプター能力）に基づかれると推定さ れる。溶液は、包埋媒体のために使用される溶媒と同一である溶媒を用いる必要 はない。しかしながら、適切な包埋媒体溶媒の特性は、アルデヒド開放性溶媒の ための適切な特徴に指針を提供する。

セロイジンの場合、包埋媒はエーテル−アルコール混合物、クローブ油（芳香族 テルペンを含む）、アルコール及びアセトンに溶解性である。メタノールは、塩 基性求核性試薬を溶解するので適切な溶媒であり、そしてセロイジン包埋された 組織と共に使用するための好ましい溶媒である。

過去において骨組織は、骨が固定化の間に暴露される脱カルシウム化処理のため に少なくとも部分的に特定の問題を提供して来た。

従来の脱カルシウム化は、酸、たとえばｌ・リクロロ酢酸（Ｃ１３ＣＣＯＯＨ） により行なわれる。現在、免疫組織化学的染色は、たとえば一時的な骨断片とし て、通常進行されるホルムアルデヒド固定化、脱カルシウム化及び包理化骨組織 のための診断及び調査性病理学に広く使用されない。一時的な骨断片を免疫染色 するためのいくつかの報告される試みは、変性された固定化、脱カルシウム化及 び包埋手段にｐｏｒａｌ　ｂｏｎｅ　ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、１．Ｓｅ ｍ１ｔｈｉｎ　３−５　ｕｍ　ｓｅｃｔｉｏｎｉｎｇｏｆ　ｕｎｄｅｃａｌｃｉ ｆｉｅｄ　ｈｕｍａｎ　ｔｅｍｐｏｒａｌ　ｂｏｎｅ　ａｆｔｅｒ　ｐｌａｓｔ ｉｃ　ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ。

Ａｃｔａ　Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ（Ｓｔｏｃｋｈ）（＋９８５）ＳｕｐＨｌｌ 　４２３　：　２４　；　Ｖｅｌｄｍａｎ　ｅｔ　旦、。

Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　ｔｅｍｐｏｒａｌ　ｂｏｎｅ　ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏ ｌｏｇｙ、　Ｉｆ、　１ｍｍｕｎｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｈｏｌｏｇｙ、ＩＩ ｌ、Ａｎ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｆｏｒ　ｉｍｍｕｎｏｈｉ ｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｉｎ−開示される方法は、骨検体に関して水又は他の 溶媒を単独で用いての抗原性の再生を妨害する、脱カルシウム化からのいづれか の残帝酸度を同時に中和する。付随する実験結果が示すように、その開示された 方法は、通常進行され、そして包埋された側頭骨断片の効果的な免疫染色を可能 にする。これは、総計８，０００−１３，０００の検体に達するヒト側頭骨採集 物がそれぞれヨーロッパ及びアメリカ合衆国に存在するので有意である（Ｓｃｈ ｕｋｎｅｃｈｔ、　Ａｎｎ、　Ｏｔ吐Ｒｈ１ｎｏ１．　Ｌａｒｙｎｇｏｌ。

（＋９８７）９６（Ｓｕｐｐｌ、　１３０）　：　Ｉ　）　、それらの採集物は 、光顕微鏡により耳痛理学を理解するために卓越された調査基礎を提供する。

組織の免疫染色に使用するためのキットが、上記方法の実施を単純化するために 供給され得る。そのキットは、ｌ又は複数の個々の試薬容器及び（１）溶媒及び アルデヒド開放性試薬を含んで成るアルデヒド開放性試薬溶液又は（２）池の容 器からの溶媒がアルデヒド開放性試薬容器を一定レベルまで満たすために使用さ れる場合、所望する濃度を達成するために適切な量でのアルデヒド開放性試薬を 含む少なくとも第１容器を保持するように適合されたレセプタクルを少なくとも 含む。はとんどの場合、キットはまた、（１）免疫染色試薬又は（２）過剰のア ルデヒド開放性試薬溶液を除去するための洗浄溶液を含む第２容器、又はそのよ うな両材料を有する容器を含むであろう。洗浄溶液は典型的には、包埋媒体をさ らに溶解又は膨潤しない緩衝溶液、たとえば緩衝水溶液である。洗浄溶液におけ る溶媒は、抗原回復溶液に使用される溶媒及びアルデヒド開放性試薬を溶解でき るであろう。免疫染色試薬は一般的に、抗体及び染色成分を含んで成る。そのよ うな試薬は当業界において良く知られており、そしてさらにここで記載する必要 はない。特定の例は、下記に示される本発明の一般的例に与えられている。本発 明の方法を実施するための適切な教授はまた、キットに包含されるであろう。

本発明は次の詳細な例により例示されるか、しかしそれらは本発明を制限するも のではない。

合計６０のセロイジン包理化ヒト側頭骨断片を、Ｅａｓｔｅｒｎ　Ｎａｔｉｏｎ ａｌＴｅｍｐｏｒａｌ　Ｂｏｎｅ　Ｂａｎｋ　ａｔ　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｌ ｓ　Ｅｙｅ　ａｎｄ　Ｅａｒ　Ｉｎｆｉｒｍａｒｙから得た（第１表）。はとん どの断片を、ｔｌｅｉｄｅｎｈａｉｎ−Ｓｕｓａ又は１００％ホルマリン固定に より一定して処理し、そして上記のようにして５？６トリクロロ酢酸によりカル シウム化した（Ｓｃｈｕｋｎｅｃｈｔ　ＨＦ、　Ｐａｔｈｏ−１ｏｇｙ　ｏｆ　 ｔｈｅ　Ｅａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ：ｌ１ａｒｖａｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒ ｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ、１９７４）。

たった１つの断片か、１０％中性の緩衝化されたホルマリン固定化剤を用いての 変性法により処理され、そしてＥＤＴＡ脱カルシウム化された。

使用されるモノクローナル抗体は第２表に列挙される。すへての抗体は、Ｂｉｏ Ｇｅｎｅｘ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓａｎ　Ｒａｍｏｎ、ＣＡ）から得ら れた。はとんとのスライドも、ＢｉｏＧｅｎｅｘからの５ｕｐｅｒ　５ｅｎｓｉ ｔｉｖｅビオチンートリブタビンンキツＩ−（ＳＳＢＳＡ）により染色した。少 数のスライドは、Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、　（Ｂ ｕｒ！ｉｎｇａｍｅ、　ＣＡ）から購入されたＡＢＣキットにより染色された。

Ｚ　アルデヒド開放性試薬溶液の調製 メタノール中、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液は、それらの実験に使用され る塩基性試薬の１つの配合物を提供する。５０〜１００ｇのＮａＯＨを、カッ色 ボトルにおけるメタノール５００ｍ１に添加した。その溶液を振盪により混合し 、そして室温で１〜２週間貯蔵し、沈降せしめた。液体の上層を沈殿物から注意 して除去し、そしてメタノールにより＝３に希釈した。使用の前、０．０１％の ナトリウムチオシアネートを任意に添加した。

セロイジンー包埋された側頭骨断片を、希釈された水により１０分間洗浄し、０ ．１％ポリ−Ｌ−リシン（Ｓｉｇｍａ）により被覆されたスライド上に積層した 。前記スライドを、Ｉ／４飽和Ｎａ　Ｏｔ（−メタノール溶液（飽和されたメタ ノール性ＮａＯＨ１約６Ｍ、メタノールによりｌ：３に希釈された）に、単独で は添加される０、０１９６ナトリウムチオシアネートと共に３０分間含浸した。

スライドを、　１００％及び７０％メタノールにより２回、及びリン酸緩衝溶液 （ＰＢＳ）により２回、それぞれ１５分間すすぎ、次に０．３％Ｔｒｉｔｏｎ　 Ｘ−１００により１０分間処理し、そしてＰＢＳにより再びすすいだ。

４、　免疫染色工程 処理に続いて、前記のようにして、５ＳＢＳＡ又はＡＢＣ法のいづれかで一晩一 次抗体と共に、続いてリンク（ＢｉｏＧｅｎｅｘ　５ｕｐｅｒ　５ｅｎｓｉｔｉ ｖｅビオチニル化抗−マウス免疫グロブリン又はＶｅｃｔｏｒビオチニル化抗− マウス免疫グロブリン）と共に４０〜６０分間インキュベートした。

ラベル（ＢｉｏＧｅｎｅｘ　５ｕｐｅｒ　５ｅｎｓｉｔｉｖｅ　Ａｌｋａｌｉｎ ｅホスファターゼ接合ストレプタビジン又はペルオキシダーゼ接合ストレブタビ ジン及びＶｅｃｔｏｒ　ＡＢＣ）を、４０〜６０分間にわたって添加した。スラ イドを、インキュベーションの間、ＰＢＳにより３度、それぞれ１５分間すすい だ。

ファーストレッド又はＤＡＢクロモゲンのいづれかを、基質として使用した。免 疫染色結果を、光顕微鏡により照合した。

−次抗体を、負の対照スライドのために非特異的マウス腹水又はＰＢＳのいづれ かにより置換した。

第１表、使用される通常のセロイジンー包埋されたヒト側頭骨断片（Ｎ　＝　６ ０） コード　断片の数　固定化　脱カルシウム化　切断　貯蔵Ｐ、Ｆ、　１０（Ｌ＆ Ｒ）　ＮＢＦ　ＥＤＴＡ　最近　く１年Ｃ，Ｂ、　ｔｏ（Ｒ）　Ｈ−３ＴＣＡ　 １９８９　＜２年Ｒ，１，，１０（１，）　Ｆ　ＥＤＴＡ　１．９８９　＜２年 Ｇ、Ｈ，ＩＱ（Ｒ）　＋１−３　ＴＣＡ　１９８６　４年Ｊ、Ｐ、　１０（Ｒ） 　Ｈ−３ＴＣＡ　１９８２　８年Ｒ，Ｙ、　１０（Ｌ）　Ｆ　ＴＣＡ　１．９６ ０　３０年ａ、Ｌ−左側。　Ｒ−側頭骨の右側。

ｂ、　ＮＢＦ　＝ｌＯ％中性緩衝化ホルマリン。）−（−３＝Ｈｅｉｄｅｎｈａ ｉｎ−３ｕｓａ固定化剤。Ｆ＝ＩＯ％ホルマリン。

ｃ、ＴｃＡ＝トリクロロ酢酸。

５、　椛愚 一定して処理されたセロイジンー包埋された断片上に使用される１５のモノクロ ーナル抗体の免疫反応性か第２表に要約されている。

染色結果は、７つのモノクローナル抗体のために強い陽性染色、４つの抗体のた めに中ぐらいの陽性染色及び１つの抗体のために弱い陽性染色を示した。３つの 抗体は負の結果を示した。種々の断片間に免疫反応性の有意な差異は存在しなか った。すべての負の対照スライド（ＰＢＳ又は非特異的マウス腹水）は、負の染 色を示した。

５ＳＢＳＡシステムにより得られた免疫染色の強さは、ＡＢＣシステムにより得 られる強さよりも強かった。

ケラチン（ＡＥＩ及びＮＣＬ−５Ｄ３）、ビメンチン、ニューロフィラメント、 筋肉特異的アクチン、Ｓ−１００タンパク質、ニューロン特異的エノラーゼ（Ｎ ＳＥ）　、グリア細繊維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）及び他のものに対するモノ クローナル抗体の免疫反応性は、強い陽性の結果を示した。アルデヒド開放性試 薬による処理に続いて、モノクローナル抗−ケラチン抗体ＮＣＬ−５Ｄ３及びＡ ＥＩにより免疫染色された一定のセロイジン包埋されたヒト側頭骨断片において は、蛸牛殻管をおおうすべての上皮細胞は、抗−ケラチン抗体により直接的にラ ベルされた。

コルティの器官内でのケラチン局在化はまた、識別され得る。ケラチン免疫反応 性は、すべての上皮細胞が免疫組織化学的染色により正確に示されるほど明確に 示した。

アルデヒド開放性試薬溶液による処理の後、モノクローナル抗体によす免疫染色 された他のセロイジン包埋された側頭骨断片はまた、強い陽性結果を示した。ニ ューロン特異的エノラーゼ（Ｎ５Ｅ）に対する抗体は、らせん状ガングリオンニ ューロン及びニューロン繊維に局在化された。抗−ＮＳＥ免疫染色は、コルティ の器官における内部製細胞内に局在化されるが、しかしたぶんシナプス及び末端 神経ブランチに存在する外部製細胞の底部でを除いて、外部製細胞には不在であ った。グリア細繊維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）は、ダリア−３ｃｈｗａｎｎ連 結部にそって脳側部のみに局在化された。デスミンは、抗−デスミン抗体により 張筋鼓膜筋肉に局在化された。抗−デスミン抗体によるこのラベリングは、マイ クロ−切開法を用いては不可能であった（Ｂａｕｗｅｎｓ笠旦、、Ａｃｔａ　Ｏ ｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ、（１９９０）Ｓｕｐｐｌ、　４７０　：　３４）　ｏ外 耳管における皮膚及び真皮の付属器官はまた、いくつの抗体、たとえばケラチン 及びアクチンにより陽性に染色された。チューブリンは全側頭骨のほとんとの上 皮及び開業細胞に広く局在化された。

第２表、一定して処理されたセロイジン包埋されたヒト側頭骨断片に対する免疫 組織化学的染色 モノクローナル抗体　結　果 ＮＣＬ−５Ｄ３　＋＋　＋ 筋肉特異的アクチン　＋＋＋ 免疫反応性は一〜＋十十の規模で評価され、−は非反応性であり、そして＋＋十 は高い反応性である。

蒸留水溶液中、次亜塩素酸すトリウム（ＮａＣＩＯ）か、それらの実験に使用さ れる塩基性試薬の１つの配合物を提供する。０．Ｏ１〜０．００５ｇのＮａＣｌ ０を、カッ色ボトルにおける蒸留水１００ｍ１に添加した。その溶液を振盪によ り混合し、そして室温で貯蔵する。

Ｚ　組織断片の処理 脱パラフイン化された組織スライドを蒸留水で１０分間洗浄した。

スライドを、アルデヒド開放性試薬溶液、すなわち希釈過塩素酸すｌ・リウム（ 水）溶液に１０分間含浸した。

３、　免疫染色工程及び結果 ３段階免疫染色技法により処理した。手短に言及すれば、スライドを一次抗体と 共に室温て一晩インキユベートし、続いてリンク（ＢｉｏＧｅｎｅｘ　５ｕｐｅ ｒ　５ｅｎｓｉｔｉｖｅビオチニル化された抗−マウス免疫グロブリン又はｖｅ ｃｔｏｒビオチニル化された抗−マウス免疫グロブリン）と共に２０〜３０分間 インキュベートした。ラベル（ＢｉｏＧｅｎｅｘ　５ｕｐｅｒＳｅｎｓｉｔｉｖ ｅ　Ａｌｋａｌｉｎｅホスファターゼ接合ストレプタビジン又はペルオキシダー ゼ接合ストレプタビジン及びＶｅｃｔｏｒ　ＡＢＣ）を２０〜３０分間にわたっ て添加した。インキュベーションの間、スライドを、ＰＢＳにより３度、それぞ れ１５分間すすいだ。ファーストレッドＸはＤＡＢクロモゲンのいづれかを基質 として使用した。免疫染色結果を、光顧微鏡により検証した。陽性結果か見られ た。

例３・アルデヒド開放性試薬としての有機酸／塩基対脱パラフイン化された組織 スライドを蒸留水で１０分間洗浄した。

そのスライドを、クエン酸の５〜ｌＯ％水溶液により充填した。１０〜３０分後 、そのスライドを、水酸化ナトリウムの１０％メタノール性／水溶液（例１に示 されるようにして調製された）により１０〜３０分間、充填した。免疫染色は例 ２に示されるようにして進行し、そして陽性結果か見られた。

本発明は十分に記載されて来たが、当業者か本発明の範囲内で変更及び修飾を行 なうことかできることは明らかであろう。

フロントページの続き （７２）発明者　カーラ、クリシャン　エル。

アメリカ合衆国、カリフォルニア　９４５８３゜サンラモン、ノーリス　キャニ オン　ロード　４６００ （７２）発明者　マルホトラ、ナゲシュアメリカ合衆国、カリフォルニア　９４ ５８３゜サンラモン、ノーリス　キャニオン　ロード　４６００ （７２）発明者　ス、シェンーフイ アメリカ合衆国、カリフォルニア　９４５８３゜サンラモン、ノーリス　キャニ オン　ロード　４６００ （７２）発明者　ユ、チェン　ジ アメリカ合衆国、カリフォルニア　９４５８３゜サンラモン、ノーリス　キャニ オン　ロード　４６００

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．アルデヒド固定化剤により固定化され、そして包埋媒体に包埋された組織の 免疫反応性を再生するための方法であって：ａ）前記包埋媒のための溶媒及びア ルデヒド開放性試薬と前記組織とを接触し； ｂ）前記アルデヒド開放性試薬により開放されるアルデヒドを、非アルデヒド誘 導体を形成するような実質的に不可逆的態様で前記アルデヒドを反応せしめるこ とによって前記組織との接触から除去し；そして ｃ）前記組織から過剰のアルデヒド開放性試薬を除去し又は中和する段階を含ん で成る方法。 ２．前記溶媒ガ、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、エチレ ングリコール及びグリセロールから成る群から選択される請求の範囲第１項記載 の方法。 ３．前記アルデヒド開放性試薬が、求核性塩基、酸化剤及び有酸／塩基対から成 る群から選択される請求の範囲第１項記載の方法。 ４．前記アルデヒド開放性試薬が酸化剤である請求の範囲第１項記載の方法。 ５，前記アルデヒド開放性試薬が求核性塩基である請求の範囲第１項記載の方法 。 ６．段階ａ）において、前記組織とケーオトロヒック材とを接触することをさら に含んで成る請求の範囲第１項記載の方法。 ７．前記組織が脱カルシウム化された組織を含んで成る請求の範囲第５及び６項 記載の方法。 ８，ホルムアルデヒド固定化剤により固定され、そして包埋媒体に包埋された組 織の免疫染色に使用するためのキットであって：ａ）求核性塩基、酸化剤耳及び 有機酸／塩墓対から成る群から選択されたアルデヒド開放性試薬及び溶媒を含ん で成るアルデヒド開放性試薬溶液を含む第１容器；及び ｂ）（１）免疫染色試薬又は（２）過剰のアルデヒド開放性試薬を除去するため の洗浄溶液を含む第２容器を含んで成るキット。 ９．前記アルデヒド開放性試薬溶液が、求核性塩基を、含み、前記包埋媒体がセ ロイジンを含み、前記免疫染色試薬が抗体を含み、そして前記組織が脱カルシウ ム化される請求の範囲第８項記載のキット。 １０．求核性塩基、酸化剤及び有機酸／塩基対から成る群から選択されたアルデ ヒド開放性試薬の、アルデヒド固定化された組織の免疫反応性を再生するための 方法への使用。