WO2021238014A1 - 一种细胞病理学样本的染色制片方法 - Google Patents

一种细胞病理学样本的染色制片方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2021238014A1
WO2021238014A1 PCT/CN2020/120070 CN2020120070W WO2021238014A1 WO 2021238014 A1 WO2021238014 A1 WO 2021238014A1 CN 2020120070 W CN2020120070 W CN 2020120070W WO 2021238014 A1 WO2021238014 A1 WO 2021238014A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cell
staining
nucleic acid
cells
chromogenic
Prior art date
Application number
PCT/CN2020/120070
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
楚文江
王剑
Original Assignee
王道祥
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 王道祥 filed Critical 王道祥
Priority to CA3181420A priority Critical patent/CA3181420A1/en
Priority to PCT/US2021/033672 priority patent/WO2021242637A1/en
Priority to JP2022573589A priority patent/JP7540010B2/ja
Priority to EP21812791.8A priority patent/EP4158349A4/en
Priority to US17/999,542 priority patent/US20230204582A1/en
Priority to AU2021281183A priority patent/AU2021281183A1/en
Publication of WO2021238014A1 publication Critical patent/WO2021238014A1/zh

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis

Definitions

  • the invention relates to a staining method for cell immunocytochemistry and/or chromogenic in situ hybridization in the field of cytopathology.
  • This method can more effectively and accurately display the expression information of one or more specific biomarkers on cytopathological cell suspension samples.
  • the staining results are suitable for observing the expression of one or more specific biomarkers on cytopathological samples under a common optical microscope.
  • the present invention also relates to the cell suspension obtained by the method and the pathological section carrying the cell suspension.
  • Cytopathology is mainly based on the abnormal conditions within the cells to study the causes and pathogenesis of diseases, as well as the changes in the physiological functions of cells in the process of disease occurrence, so as to propose the basis for diagnosis and prevention of diseases.
  • Clinical samples cover exfoliative cytology, fine needle aspiration (FNA) cytology, blood circulating tumor cells, and other cytology (cytology during surgery, bone marrow, peripheral blood cytology, AIDS cytology, etc.).
  • Staining results can show the characteristics of cell membranes, such as cell membrane folds and bulges; cytoplasmic mucus, fat granules, neuroendocrine granules; the characteristics of cell nuclei, including the shape and size of the nucleus, the number and shape of nucleoli, the number of chromosomes, and chromatin
  • the texture provides cell pathologists with diagnostic information on cell morphology.
  • the conventional workflow of cytopathology is to make pathological smears of cell samples, perform routine staining, and then perform cytopathological morphological diagnosis.
  • cytopathologists can perform immunocytochemical staining or nucleic acid chromogenic in situ hybridization staining on protein or nucleic acid markers of cells to further help diagnosis, judge prognosis, and select treatment.
  • current cytopathological samples cannot be effectively stained with cellular immunohistochemistry or nucleic acid chromogenic in situ hybridization. This clinical disadvantage is caused by the following reasons:
  • the staining solution cannot reach the contact position between the cells and the glass slide, and a blind area of staining is formed at the contact part of the cell and the glass slide, so that the cells cannot be fully stained in all directions, leaving staining dead corners, which affects the sensitivity and accuracy of the staining results. . 3) Conventional cytopathological immunohistochemical staining and nucleic acid chromogenic in situ hybridization. Using pathological slides as the carrier for cell samples, the edges of cells fixed on the pathological slides will inevitably loosen and float in the staining solution. Wash each time It is not easy to clean the staining solution completely, and the edge of the cell will be stained due to the so-called edge effect. This leads to false positive results and affects the accuracy of diagnosis.
  • the invention solves the technical difficulties of performing immunohistochemistry and/or chromogenic in situ hybridization on cell suspension samples, avoids the loss of cell samples in the staining process, and is suitable for staining samples with a small number of cells.
  • the staining process there are no dead corners and no blind areas on the cells, and the background noise is low, which avoids the edge effect during the staining process, and the staining results are more sensitive and accurate. It is suitable for observing the expression of one or more specific biomarkers on the cell suspension sample under the ordinary optical microscope.
  • cell nucleic acid markers on conventional pathological slides is observed by the method of chromogenic in situ hybridization staining of nucleic acid.
  • chromogenic in situ hybridization staining of nucleic acid By adding specific nucleic acid fragments to the samples on the pathological slides as the original nucleic acid probes, and then adding special reagents that can recognize the original probes labeled with chromogenic enzymes, and then adding the corresponding chromogenic enzyme substrates, after the chromogenic enzymes Catalyze the reaction, and finally produce the precipitation of the color product, which shows the expression signal of a specific nucleic acid in the cell on the pathological slide.
  • the core of a cytopathological sample is cells, and each cell is individually adsorbed or placed on a pathological glass slide by methods such as smears to form a so-called cell smear.
  • the cell smear sample is in an open environment during the staining process. During the staining process, the staining liquid must be constantly replaced, washed, and then discarded. With the continuous replacement and disposal of the staining solution and washing solution, some cell samples on the pathological slides will inevitably fall off and be lost, reducing the sensitivity and accuracy of the staining results, and prone to false negatives, especially when the sample contains a small number of cells. in the case of.
  • the inventor adopted a new and improved staining method of cellular immunohistochemistry and nucleic acid chromogenic in situ hybridization.
  • the pathological slide is not used as a carrier for staining, but the sample cells are placed in a container and stained in the form of a cell suspension. After the cells are stained, the smear is fixed and observed under a microscope. The order in which the sample cells are fixed is opposite to the conventional method.
  • the inventor places the cells in a container, and completes the incubation of the first antibody or nucleic acid probe in the cell suspension, and the color reaction and other dyeing processes.
  • centrifugal precipitation of cell samples is used to eliminate target cells in the discarded supernatant rinsing solution, which greatly reduces the loss of clinical cell samples during the staining process.
  • spread the stained cells on the pathological glass slide to ensure the stability and reliability of the results.
  • the inventors did not use pathological slides as a carrier during the staining and chemical development process, and always allowed the cells to be fully immersed and contacted in a suspension state.
  • the staining reagents there are no staining blind spots and dead corners, which can improve the staining effect of cells, which is obviously helpful for improving the sensitivity of staining and reducing the false negative rate of staining.
  • the improved chemical color development method makes the color products evenly distributed.
  • Conventional immunohistochemical staining and nucleic acid chromogenic in situ hybridization are carried out on pathological glass slides.
  • the color reaction is carried out on fixed tissues.
  • the catalyzed chromogenic precipitation products are easy to accumulate locally because they are opaque and can be covered.
  • the morphological characteristics of the microstructure of cells affect the subsequent diagnosis of cell pathology and morphology.
  • the inventor continuously oscillates the cells suspended in the liquid to uniformly disperse the color development precipitate products produced by the catalysis, and does not accumulate concentratedly, which affects the smoothness of the optical path.
  • the chromogenic product produced by the catalysis can be reasonably distributed on the cell, which can display the expression information of the biomarker without hindering the subsequent diagnosis of cell morphology, and greatly improve the accuracy of the pathologist's diagnosis of cell morphology.
  • the present invention can easily wash a single cell in all directions without blind areas and dead corners in the cell suspension. At the same time, because there are no undesirable links such as non-specific deposition and edge effects on the pathological glass slide, it can greatly reduce the pathological glass. Non-specific background staining noise on the slice. It is obviously helpful to improve the staining effect of cells, increase the sensitivity of staining, and reduce the false positive rate of staining results.
  • the present invention relates to the following technical solutions:
  • the present invention relates to a method for improved immunohistochemical staining and/or nucleic acid chromogenic in situ hybridization staining of cell samples, including:
  • the first antibody and/or first nucleic acid probe that specifically binds to the antigen and/or nucleic acid marker on the cell is added to the cell suspension to complete the first antibody and/or first nucleic acid The specific binding of the probe to the antigen and/or nucleic acid marker;
  • steps ii), iv) and vi) the unbound first antibody and/or the first nucleic acid probe are removed, and the unbound second antibody conjugated with the chromogenic enzyme is removed And/or the second nucleic acid probe labeled with a chromogenic enzyme and the removal of excess chromogenic substrate are through the following steps:
  • the cell sample is selected from the group consisting of cytopathology fine needle aspiration (FNA) sample, blood circulating tumor cell sample, cervical scrape cell sample, and urine exfoliated cell sample, or the cell sample is obtained by dilution Obtained from cell precipitates of samples from patients selected from body fluids, blood, serum, plasma, urine, saliva, sweat, sputum, semen, mucus, tears, lymph, amniotic fluid, pleural fluid, and ascites , Interstitial fluid, lung lavage fluid, cerebrospinal fluid, stool and tissue samples.
  • FNA cytopathology fine needle aspiration
  • the first antibody and/or first probe is a combination of multiple antibodies and/or probes, which respectively stain the cell membrane, cytoplasm, and/or cell nucleus.
  • the present invention relates to a stained suspension of cells in vitro, said cells being stained for cell biomarkers.
  • the cells are from a cell sample selected from the group consisting of: cytopathology fine needle aspiration (FNA) sample, blood circulating tumor cell sample, cervical smear cell sample, urine exfoliated cell sample, body fluid, blood , Serum, plasma, urine, saliva, sweat, sputum, semen, mucus, tears, lymph, amniotic fluid, pleural fluid, ascites, interstitial fluid, lung lavage fluid, cerebrospinal fluid, stool and tissue samples.
  • FNA cytopathology fine needle aspiration
  • the cell is a tumor cell, which is stained for tumor markers.
  • the ex vivo cell suspension is obtained by the method described above.
  • the present invention also relates to a pathological section, which contains the cell suspension described above. Sections can be made with conventional glass slides and other media.
  • Figure 1 shows a smear of exfoliated urinary epithelial cells in urine, in which two morphologically atypical urinary epithelial cells were stained brown by liquid immunohistochemistry.
  • the brown signal shown in the figure corresponds to the expression of cytokeratin 20 (CK20) in two exfoliated urinary epithelial cells.
  • Figure 2 shows a smear of exfoliated urinary epithelial cells in urine.
  • Four of the cells morphologically diagnosed as urinary epithelial carcinoma were stained brown by nucleic acid in situ hybridization.
  • the brown signal shown in the figure corresponds to the expression of human transcription factor GATA-3 in exfoliated urinary epithelial cancer cells.
  • chromogenic reagent Peroxidase-Liquid DAB+ (source Dako), place the cell suspension sample on a shaker, shake at 600-2500 rpm, and incubate for 10 minutes.
  • DIFF Fast Stain No. 2 source Fisher Scientific, product code #22750012
  • DIFF Fast Stain No. 1 source Fisher Scientific, product code #22750012

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种细胞病理学样本的染色制片方法。具体地，本发明涉及细胞病理学领域的一种细胞免疫组化或/和显色原位杂交的染色制片方法。该方法可以在细胞病理学细胞悬液样本上，更有效更准确地显示一个或者多个特定生物标志物的表达信息。染色结果适合在普通光学显微镜下观察一个或者多个特定生物标志物在细胞病理学样本上的表达。本发明还涉及所述方法得到的细胞悬液和载有所述细胞悬液的病理切片。

Description

一种细胞病理学样本的染色制片方法 技术领域
本发明涉及细胞病理学领域的一种细胞免疫细胞化学和/或显色原位杂交的染色制片方法。该方法可以在细胞病理学细胞悬液样本上，更有效更准确地显示一个或者多个特定生物标志物的表达信息。染色结果适合在普通光学显微镜下观察一个或者多个特定生物标志物在细胞病理学样本上的表达。本发明还涉及所述方法得到的细胞悬液和载有所述细胞悬液的病理切片。
背景技术
细胞病理学主要是根据细胞内异常状况，研究疾病发生的原因、发病原理，以及疾病发生过程中，细胞的生理功能发生的改变，从而提出诊断和防治疾病的依据。临床样本涵盖脱落细胞学、细针穿刺(FNA)细胞学、血液循环肿瘤细胞，其他细胞学(手术中的细胞学，骨髓、外周血细胞学，艾滋病细胞学等)。
细胞病理学常规染色方法包括巴氏(Papanicolaou)染色、瑞氏-吉姆萨(Wright-Giemsa)染色等。目前最常用的是迪夫快速染色(Diff-Quik)，其染液是采用世界卫生组织(WHO)推荐的快速染色方法而配制，与瑞氏-吉姆萨类似都是利用巴氏染色技术原理改良而来的。染色结果可以显示细胞膜的特点，比如细胞膜皱褶和凸起；细胞质的粘液、脂肪颗粒、神经内分泌颗粒；细胞核的特点，包括细胞核的形态和大小、核仁的数目和形状、染色体数目、染色质的质地，为细胞病理学家提供细胞形态学诊断信息。
细胞病理学的常规工作流程是先对细胞样本制作病理涂片，进行常规染色，然后再进行细胞病理形态学诊断。随着科学和技术的发展，细胞病理学家可以对细胞的蛋白或者核酸标志物进行免疫细胞化学染色或者核酸显色原位杂交染色，来进一步帮助诊断、判断预后，和选择治疗。但是，目前细胞病理学样本无法有效地进行细胞免疫组化或者核酸显色原位杂交染色。这个临床不利点是由以下原因造成的：
1)细胞涂片在染色过程中处在一个开放的环境，在染色过程中染色液体要不断更换，冲洗，随后丢弃。随着对染色液和冲洗液的不断 更换和丢弃，会造成病理玻片上细胞样本脱落而丢失，影响结果的准确性。2)常规细胞病理学免疫组化染色和核酸显色原位杂交以病理玻片为细胞样本的载体，要求细胞样本和病理玻片两者直接紧密接触，之间不能有间隙而导致细胞从玻片上脱落。但染色液因此也无法到达细胞和玻片接触的位置，在细胞和玻片的接触部位形成染色盲区，从而不能把细胞全方位充分染色，留有染色死角，影响染色结果的敏感性和准确性。3)常规细胞病理学免疫组化染色和核酸显色原位杂交以病理玻片为细胞样本的载体，固定在病理玻片上的细胞边缘不可避免会松脱而漂浮在染色液中，每次清洗不易将染色液完全清洗干净，会由于所谓边缘效应导致细胞边缘着色。形这导致假阳性结果，影响诊断的准确性。
尽管免疫组化和显色原位杂交染色成为组织病理学上已经成为不可或缺的辅助染色，但因为以上的技术阻碍，细胞病理学上免疫组化和显色原位杂交染色的应用并没有在临床上广泛应用。因此，本领域还需要新的染色方法以克服上述现有技术的缺点。
发明内容
本发明解决了对细胞悬液样本进行免疫组化和/或显色原位杂交的技术困难，避免了染色过程中细胞样本的丢失，适合具有少量细胞的样本的染色。染色过程在细胞上无死角无盲区，背景噪音低，避免了染色过程中的边缘效应，染色结果更敏感更准确。适合在普通光学显微镜下观察一个或者多个特定生物标志物在细胞悬液样本上的表达。
常规的免疫组化染色都是以病理玻片为载体来进行的，常规病理玻片上细胞蛋白标记物的表达是通过免疫组织化学的方法来实现的。通过对病理玻片上的样本加入第一抗体，能够特异性识别第一抗体的显色酶标记的第二抗体，再加入相应的显色酶底物，经过显色酶的催化反应，最终通过产生的显色产物沉淀，在病理玻片显示某种特异性生物标志物在细胞中的表达信号。
常规病理玻片上细胞核酸标志物表达是通过核酸显色原位杂交染色的方法来观察的。通过对病理玻片上的样本加入特异性的核酸片段作为原始核酸探针，再加入能够识别原始探针的显色酶标记的特殊试剂，随后加入相应的显色酶底物，经过显色酶的催化反应，最终产生 显色产物沉淀，在病理玻片上显示某种特异性核酸在细胞中的表达信号。
以上两种方法的最大区别是一个使用抗体，一个使用核酸探针进行初始标记，随后的显色反应原理一致。经过病理制片以后都可以在普通光学显微镜下观察，来帮助病理医生做进一步的诊断。
现有的免疫组化和显色原位杂交染色技术对细胞病理学样本来说有以下缺点：
1)细胞病理学样本的核心是细胞，经涂片等方法将每一个细胞单独吸附或者放置在病理玻片上，形成所谓的细胞涂片。细胞涂片样本在染色过程中处在一个开放的环境，在染色过程中染色液体要不断更换，冲洗，随后丢弃。随着对染色液和冲洗液的不断更换和丢弃，不可避免会造成病理玻片上一些细胞样本脱落而丢失，降低染色结果的敏感性和准确性，容易产生假阴性，尤其在样本包含少量细胞数目的情况下。
2)常规细胞病理学免疫组化染色和核酸显色原位杂交以病理玻片为细胞样本的载体，要求细胞样本和病理玻片两者直接紧密接触，之间不能有间隙而导致细胞从玻片上脱落。但染色液因此也无法到达细胞和玻片接触的位置，在细胞和玻片的接触部位形成染色盲区，从而不能把细胞全方位充分染色，留有染色死角，影响染色结果的敏感性和准确性。
3)常规的免疫组化染色和核酸显色原位杂交是在病理玻片上进行的，显色反应在固定的组织或者细胞上进行，各种染色试剂会非特异性沉淀吸附在病理玻片或者细胞组织上。细胞和玻片接触的边缘也可以产生染色过程中所谓的边缘效应，造成假阳性结果。需要在病理玻片上多次彻底冲洗，才能消除非特异性的试剂吸附，沉淀，和边缘效应，也增加了细胞被冲离玻片的机会。
发明人在免疫组化和显色原位杂交的染色过程中，采用了新型改良的细胞免疫组化和核酸显色原位杂交的染色方法。
1)改变的染色顺序和流程：采用对细胞样本先染色，再涂片的方法。传统的细胞免疫组化和核酸显色原位杂交染色是以病理玻片为载体，细胞样本先涂片固定，再对固定在病理玻片上的细胞进行染色。
本发明不用病理玻片为载体染色，而是把样本细胞放置在一个容 器中，以细胞悬液的形式进行染色，染好细胞以后再进行涂片固定，显微镜下观察。在样本细胞固定的顺序上，和常规的方法相反。
2)改良的换液和冲洗手段，避免细胞样本的丢失。常规的免疫组化染色或者核酸显色原位杂交都是在病理玻片上进行，细胞涂片在染色过程中处在一个开放的环境，在染色过程中染色液体要不断更换，冲洗，随后丢弃。随着对染色液和冲洗液的不断更换和丢弃，会造成病理玻片上细胞样本脱落而丢失，不可避免会影响样本的最终诊断。
在本发明中，发明人把细胞放置于一个容器中，在细胞悬液中完成第一抗体或者核酸探针的孵育，和显色反应等染色过程。在多次更换染色试剂和冲洗液的过程中，通过离心沉淀细胞样本等手段，使丢弃的上清冲洗液中没有靶向细胞，极大幅度地减少了临床细胞样本在染色过程中的流失。完成全部染色以后，再把染好的细胞涂布在病理玻片上，保证结果的稳定可靠。
3)改变的染色环境避免传统染色方法细胞上的染色盲区。传统的免疫组化和核酸显色原位杂交，是在病理玻片上进行染色的。染色试剂无法到达细胞和玻片的接触部位，形成染色盲区和死角。
为使样本细胞能够充分染色，避免细胞上的染色盲区和死角，发明人在染色和化学显色过程中，不用病理玻片为载体，始终让细胞在悬液状态下，充分浸泡和接触在不同的染色试剂中，没有染色盲区和死角，提高细胞的染色效果，对提高染色的敏感性，降低染色的假阴性率，有显而易见的帮助。
4)改良的化学显色方法使显色产物分布均匀。常规的免疫组化染色和核酸显色原位杂交是在病理玻片上进行的，显色反应在固定的组织上进行，催化产生的显色沉淀产物容易在局部集中堆积，因为其不透明，可以遮盖细胞细微结构的形态学特点，影响随后的细胞病理形态学诊断。
发明人在显色过程中，不断震荡悬浮在液体中的细胞，使催化产生的显色沉淀产物均匀散开，不集中堆积而影响光学路径的通畅。使催化产生的显色产物在细胞上分布合理，既能够显示生物标记物的表达信息，又不妨碍随后的细胞形态学的诊断，大幅提高病理学家对细胞相态学诊断的准确性。
5)改进的更有效的消除染色背景噪音的方法。常规的免疫组化染 色和核酸显色原位杂交是在病理玻片上进行的，显色反应在固定的组织上进行，各种染色试剂会非特异性沉淀吸附在病理玻片或者细胞组织上。细胞和玻片接触的边缘可以产生染色过程中所谓的边缘效应，造成染色成分的非特异性吸附和沉淀。需要在病理玻片上多次彻底冲洗，才能消除非特异性的试剂吸附和沉淀。
本发明在完成染色反应后，在细胞悬液中很容易对单个细胞全方位无盲区无死角充分冲洗，同时因为不存在病理玻片上的非特异性沉积和边缘效应这些不良环节，能够大幅降低病理玻片上的非特异性背景染色噪音。对提高细胞的染色效果，提高染色的敏感性，降低染色结果的假阳性率，有显而易见的帮助。
具体地，本发明涉及以下技术方案：
一方面，本发明涉及对细胞样本进行改良的免疫组化染色和/或核酸显色原位杂交染色的方法，包括：
a)在容器中制备细胞样本的细胞悬液；
b)在所述容器中的所述细胞悬液中，对所述细胞进行免疫组化染色和/或核酸显色原位杂交染色，包括：
i)在所述细胞悬液中加入特异性结合所述细胞上的抗原和/或核酸标志物的第一抗体和/或第一核酸探针，完成所述第一抗体和/或第一核酸探针与所述抗原和/或核酸标志物的特异性结合；
ii)去除未结合的所述第一抗体和/或第一核酸探针，然后重新制备细胞悬液，
iii)在所述细胞悬液中加入缀合了显色酶的第二抗体和/或显色酶标记的第二核酸探针，使其特异性结合第一抗体和/或第一核酸探针；
iv)去除未结合的所述缀合了显色酶的第二抗体和/或显色酶标记的第二核酸探针，然后重新制备细胞悬液，
v)在所述细胞悬液中加入显色底物进行显色，在显色过程中，不断震荡悬浮在液体中的细胞，使催化产生的显色沉淀产物均匀散开而避免集中堆积；以及
vi)去除多余的显色底物，然后重新制备细胞悬液；以及
c)对所述细胞悬液进行涂片。
在一些实施方案中，步骤ii)、iv)和vi)中去除未结合的所述第一抗 体和/或第一核酸探针、去除未结合的所述缀合了显色酶的第二抗体和/或显色酶标记的第二核酸探针和去除多余的显色底物是通过以下步骤：
i)清洗细胞；
ii)离心沉淀细胞；和
iii)丢弃上清液。
在一些实施方案中，所述细胞样本选自细胞病理学细针穿刺(FNA)样本、血液循环肿瘤细胞样本、宫颈刮片细胞样本，和尿液脱落细胞样本，或者所述细胞样本是通过稀释来自患者的样本的细胞沉淀物而得到的，所述来自患者的样本选自体液、血液、血清、血浆、尿、唾液、汗液、痰、精液、粘液、泪液、淋巴液、羊水、胸水、腹水、间质液、肺灌洗液、脑脊液、粪便和组织样本。
在一些实施方案中，所述第一抗体和/或第一探针是多重抗体和/或探针组合，分别染色细胞膜、细胞质，和/或细胞核。
另一方面，本发明涉及经过染色的离体细胞悬液，所述细胞具备细胞生物标志物染色。
在一些实施方案中，所述细胞来自选自下组的细胞样本：细胞病理学细针穿刺(FNA)样本、血液循环肿瘤细胞样本、宫颈刮片细胞样本、尿液脱落细胞样本、体液、血液、血清、血浆、尿、唾液、汗液、痰、精液、粘液、泪液、淋巴液、羊水、胸水、腹水、间质液、肺灌洗液、脑脊液、粪便和组织样本。
在一些实施方案中，所述细胞是肿瘤细胞，其具备肿瘤标志物染色。
在一些实施方案中，所述离体细胞悬液是通过上文所述的方法得到的。
另一方面，本发明还涉及病理切片，其载有上文所述的细胞悬液。切片可以用常规的玻片等介质来制作。
附图说明
图1显示尿液中的脱落泌尿上皮细胞涂片，其中两个形态学上不典型的泌尿上皮细胞，被液相免疫组化染成棕色。图中显示的棕色信号对应于细胞角蛋白20(CK20)在两个脱落泌尿上皮细胞中的表达。
图2显示尿液中的脱落泌尿上皮细胞涂片，其中四个形态学上诊断为泌尿上皮癌的细胞，被核酸显色原位杂交染成棕色。图中显示的棕色信号对应于人类转录因子GATA-3在脱落泌尿上皮癌细胞中的表达。
具体实施方式
实施例1
基于新型改良的细胞免疫化学蛋白标记物细胞悬液染色方法
(所有离心都是以1500r/min离心5min，去上清液，然后将沉淀物重新悬浮在PBS中)
1. 25毫升含有4％多聚甲醛固定液膀胱癌患者尿液，离心沉淀细胞，丢弃上清液，然后稀释沉淀物并且重新悬浮在1毫升的PBS(pH7.4)缓冲液中，放置到10毫升塑料试管中。
2.加入20微升Triton-100(增加细胞膜通透性，利于细胞质、细胞核染色)。
3.加热细胞悬液92摄氏度5分钟进行抗原修复。
4.在悬浮液中加入100微升Dual Endogenous Enzyme Block(Dako，Carpinteria，Ca)，并且孵育5分钟，以抑制细胞内源性的过氧化物酶(peroxidase)和碱性磷酸酶(alkline phosphatase)的活性。
5.离心后去除上清液，去掉多余的Dual Endogenous Enzyme Block，然后稀释沉淀物并且重新悬浮在1毫升的PBS(pH7.4)缓冲液中。
6.加入200微升Serum-Free Block(Dako)，孵育5分钟(填充非特异性蛋白结合点)。
7.加入第一抗体，即，200微升CK20小鼠抗体，室温下孵育2小时。
8.加入1毫升PBS缓冲液，混匀后离心，去掉上清液。重复一到三次，冲洗掉未结合的第一抗体。
9.加入200微升羊抗鼠的、多聚体酶标结合的过氧化物酶的第二抗体(EnVision，Dako)；室温下孵育30分钟。
10.用1毫升PBS缓冲液离心冲洗细胞样本三次，去掉未结合的第二抗体。
11.加入显色剂：过氧化物酶-Liquid DAB+(来源Dako)，细胞悬液样本放置振荡器上，震荡速度600-2500rpm，孵育10分钟。
12.加入1毫升PBS缓冲液，然后离心沉淀细胞，去除多余显色剂，
13.用1毫升PBS缓冲液洗涤冲洗染好的细胞样本，然后离心沉淀细胞，丢弃上清液，重复三次，有效消除非特异性的染色背景噪音。
14.加入1毫升迪夫快速染色剂2号(来源Fisher Scientific，产品编号#22750012)，孵育1分钟然后离心，去除多余显色剂；
15.加入1毫升迪夫快速染色剂1号(来源Fisher Scientific，产品编号#22750012)，孵育1分钟然后离心，去除多余显色剂；
16.加入200微升PBS缓冲液，涂片。
在显微镜下观察细胞病理涂片，如图1所示。
实施例2
基于新型改良的细胞核酸显色原位杂交的细胞悬液染色方法：
(所有离心都是以1500r/min离心5min，去上清液，然后将沉淀物重新悬浮在PBS中)
1. 25毫升含有4％多聚甲醛固定液膀胱癌患者尿液，离心沉淀细胞，丢弃上清液，然后稀释沉淀物并且重新悬浮在1毫升的PBS(pH7.4)缓冲液中，放置到10毫升塑料试管中。
2.加入20微升Triton-100(增加细胞膜通透性，利于细胞质、细胞核染色)。
3.用
Figure PCTCN2020120070-appb-000001
2.5HD Reagent Kit(ACD Bio，美国加州)免疫组化核酸原位杂交试剂盒按照厂家推荐的实验步骤进行核酸标记物染色。加入人类转录因子GATA-3的RNA核酸探针(Hs-GATA3，ACD Bio，美国加州)，40摄氏度孵育2小时。
4.离心细胞悬液，弃掉上清液，加入1毫升厂家提供的冲洗缓冲液，离心5分钟，弃掉上清液。加入冲洗缓冲液再重复冲洗一次。
5.加入4滴杂交液AMP1，40摄氏度孵育30分钟。
6.离心细胞悬液，弃掉上清液，加入1毫升冲洗缓冲液，离心5分钟，弃掉冲洗上清液。再重复冲洗一次。
7.加入4滴杂交液AMP2，40摄氏度孵育30分钟。
8.离心细胞悬液，弃掉上清液，加入1毫升冲洗缓冲液，离心5 分钟，弃掉冲洗上清液。再重复冲洗一次。
9.加入4滴杂交液AMP3，40摄氏度孵育30分钟。
10.离心细胞悬液，弃掉上清液，加入1毫升冲洗缓冲液，离心5分钟，弃掉冲洗上清液。再重复冲洗一次。
11.加入4滴杂交液AMP4，40摄氏度孵育15分钟。
12.离心细胞悬液，弃掉上清液，加入1毫升冲洗缓冲液，离心5分钟，弃掉冲洗上清液。再重复冲洗一次。
13.加入4滴杂交液AMP5，40摄氏度孵育30分钟。
14.离心细胞悬液，弃掉上清液，加入1毫升冲洗缓冲液，离心5分钟，弃掉冲洗上清液。再重复冲洗一次。
15.加入4滴杂交液AMP6，40摄氏度孵育15分钟。
16.离心细胞悬液，弃掉上清液，加入1毫升冲洗缓冲液，离心5分钟，弃掉冲洗上清液。再重复冲洗一次。
17.加入120微升事先混匀的DAB-A和DAB-B显色液，细胞悬液样本放置振荡器上，震荡速度600-2500rpm，孵育10分钟。离心细胞悬液，弃掉上清液。
18.用1毫升1X冲洗液洗涤冲洗染好的细胞样本，然后离心沉淀细胞，丢弃上清液，重复三次，有效消除非特异性的染色背景噪音。
19.加入1毫升迪夫快速染色剂2号(来源Fisher Scientific，产品编号#22750012)，孵育1分钟然后离心，去除多余显色剂；
20.加入1毫升迪夫快速染色剂1号(来源Fisher Scientific，产品编号#22750012)，孵育1分钟然后离心，去除多余显色剂；
21.加入200微升PBS缓冲液，涂片。
在显微镜下观察细胞病理涂片，如图2所示。

Claims (9)

  1. 对细胞样本进行改良的免疫组化染色和/或核酸显色原位杂交染色的方法，包括：
    a)在容器中制备细胞样本的细胞悬液；
    b)在所述容器中的所述细胞悬液中，对所述细胞进行免疫组化染色和/或核酸显色原位杂交染色，包括：
    i)在所述细胞悬液中加入特异性结合所述细胞上的抗原和/或核酸标志物的第一抗体和/或第一核酸探针，完成所述第一抗体和/或第一核酸探针与所述抗原和/或核酸标志物的特异性结合；
    ii)去除未结合的所述第一抗体和/或第一核酸探针，然后重新制备细胞悬液，
    iii)在所述细胞悬液中加入缀合了显色酶的第二抗体和/或显色酶标记的第二核酸探针，使其特异性结合第一抗体和/或第一核酸探针；
    iv)去除未结合的所述缀合了显色酶的第二抗体和/或显色酶标记的第二核酸探针，然后重新制备细胞悬液，
    v)在所述细胞悬液中加入显色底物进行显色，在显色过程中，不断震荡悬浮在液体中的细胞，使催化产生的显色沉淀产物均匀散开而避免集中堆积；以及
    vi)去除多余的显色底物，然后重新制备细胞悬液；以及
    c)对所述细胞悬液进行涂片。
  2. 权利要求1所述的方法，其中步骤ii)、iv)和vi)中去除未结合的所述第一抗体和/或第一核酸探针、去除未结合的所述缀合了显色酶的第二抗体和/或显色酶标记的第二核酸探针和去除多余的显色底物是通过以下步骤：
    i)清洗细胞；
    ii)离心沉淀细胞；和
    iii)丢弃上清液。
  3. 权利要求1所述的方法，其中所述细胞样本选自细胞病理学细针穿刺(FNA)样本、血液循环肿瘤细胞样本、宫颈刮片细胞样本，和尿液脱落细胞样本，或者所述细胞样本是通过稀释来自患者的样本 的细胞沉淀物而得到的，所述来自患者的样本选自体液、血液、血清、血浆、尿、唾液、汗液、痰、精液、粘液、泪液、淋巴液、羊水、胸水、腹水、间质液、肺灌洗液、脑脊液、粪便和组织样本。
  4. 权利要求1-3的任一项所述的方法，其中所述第一抗体和/或第一探针是多重抗体和/或探针组合，分别染色细胞膜、细胞质，和/或细胞核。
  5. 经过染色的离体细胞悬液，所述细胞具备细胞生物标志物染色。
  6. 权利要求5的离体细胞悬液，其中所述细胞来自选自下组的细胞样本：细胞病理学细针穿刺(FNA)样本、血液循环肿瘤细胞样本、宫颈刮片细胞、尿液脱落细胞样本、体液、血液、血清、血浆、尿、唾液、汗液、痰、精液、粘液、泪液、淋巴液、羊水、胸水、腹水、间质液、肺灌洗液、脑脊液、粪便和组织样本。
  7. 权利要求5的离体细胞悬液，其中所述细胞是肿瘤细胞，其具备肿瘤标志物染色。
  8. 权利要求5-7的任一项的离体细胞悬液，其是通过权利要求1-4的任一项的方法得到的。
  9. 病理切片，其载有权利要求5-8的任一项的细胞悬液。
PCT/CN2020/120070 2020-05-28 2020-10-10 一种细胞病理学样本的染色制片方法 WO2021238014A1 (zh)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CA3181420A CA3181420A1 (en) 2020-05-28 2021-05-21 Cytopathological staining
PCT/US2021/033672 WO2021242637A1 (en) 2020-05-28 2021-05-21 Cytopathological staining
JP2022573589A JP7540010B2 (ja) 2020-05-28 2021-05-21 細胞病理染色
EP21812791.8A EP4158349A4 (en) 2020-05-28 2021-05-21 CYTOPATHOLOGICAL STAINING
US17/999,542 US20230204582A1 (en) 2020-05-28 2021-05-21 Cytopathological staining
AU2021281183A AU2021281183A1 (en) 2020-05-28 2021-05-21 Cytopathological staining

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010467313.3 2020-05-28
CN202010467313.3A CN112113820A (zh) 2020-05-28 2020-05-28 一种细胞病理学样本的染色制片方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021238014A1 true WO2021238014A1 (zh) 2021-12-02

Family

ID=73799688

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/CN2020/120070 WO2021238014A1 (zh) 2020-05-28 2020-10-10 一种细胞病理学样本的染色制片方法

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN112113820A (zh)
WO (1) WO2021238014A1 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112113821B (zh) * 2020-05-28 2021-09-03 王剑 一种细胞病理学样本的多重染色制片方法
CN114112605A (zh) * 2020-08-27 2022-03-01 王剑 血液循环肿瘤细胞病理芯片的制作方法
CN113311150A (zh) * 2021-03-18 2021-08-27 汕头大学医学院 一种快速免疫组化染色仪

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101948901A (zh) * 2010-09-19 2011-01-19 公安部物证鉴定中心 一种有核细胞标识方法及其应用
US8280134B2 (en) * 2008-09-22 2012-10-02 Cambridge Research & Instrumentation, Inc. Multi-spectral imaging including at least one common stain
CN106940266A (zh) * 2017-03-21 2017-07-11 上海美吉医学检验有限公司 一种用于细胞表面染色的染色增强液及染色方法
CN109115566A (zh) * 2017-11-10 2019-01-01 佛山市艾达思精密仪器有限公司 一种用喷雾湿片去制备细胞染色体核型分析载玻片的方法
CN109425527A (zh) * 2017-09-04 2019-03-05 艾托金生物医药（苏州）有限公司 一种细胞染色方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110318756A1 (en) * 2009-01-09 2011-12-29 C.V. Diagnostics Llc Small specimen staining and diagnosing of cells
CN107365847A (zh) * 2010-10-21 2017-11-21 领先细胞医疗诊断有限公司 用于原位检测核酸的超灵敏方法
CN102288471B (zh) * 2011-07-27 2013-06-12 上海交通大学医学院附属仁济医院 一种悬浮细胞的免疫荧光染色方法
CN109641922A (zh) * 2016-06-28 2019-04-16 文塔纳医疗系统公司 点击化学用于ihc和ish测定中的信号扩增的应用
EP3475701B1 (en) * 2016-06-28 2023-02-22 Ventana Medical Systems, Inc. New colors for chromogenic ihc and ish staining with multi-dye quinone methide and tyramide conjugates
CN206945404U (zh) * 2017-05-22 2018-01-30 上海市第一人民医院 一种用于不贴壁细胞免疫染色的染色管
CN110376044B (zh) * 2019-08-29 2022-06-10 北京银丰鼎诚生物工程技术有限公司 一种神经球免疫荧光染色的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8280134B2 (en) * 2008-09-22 2012-10-02 Cambridge Research & Instrumentation, Inc. Multi-spectral imaging including at least one common stain
CN101948901A (zh) * 2010-09-19 2011-01-19 公安部物证鉴定中心 一种有核细胞标识方法及其应用
CN106940266A (zh) * 2017-03-21 2017-07-11 上海美吉医学检验有限公司 一种用于细胞表面染色的染色增强液及染色方法
CN109425527A (zh) * 2017-09-04 2019-03-05 艾托金生物医药（苏州）有限公司 一种细胞染色方法
CN109115566A (zh) * 2017-11-10 2019-01-01 佛山市艾达思精密仪器有限公司 一种用喷雾湿片去制备细胞染色体核型分析载玻片的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN112113820A (zh) 2020-12-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2021238015A1 (zh) 一种细胞病理学样本的多重染色制片方法
WO2021238014A1 (zh) 一种细胞病理学样本的染色制片方法
US20210047697A1 (en) Method for improved diagnosis of dysplasias
CN1836166B (zh) 在溶解的体样本中检测肿瘤疾病的方法
JP5872655B2 (ja) 異形成の進行を評価する方法および疾患段階の決定に用いるキット
JP2022169540A (ja) 定量的免疫組織化学のための方法及びシステム
JP2007530949A (ja) 子宮頸部疾患を検出するための方法及び組成物
JP2013150616A5 (zh)
KR20060011817A (ko) 세포 수준 검출 및 질병 상태의 식별
JP7540010B2 (ja) 細胞病理染色
WO2022042777A1 (zh) 血液循环肿瘤细胞病理芯片的制作方法
US20200400674A1 (en) A method of detecting magea4
Cheung et al. Chromosome in situ hybridisation, Ki-67, and telomerase immunocytochemistry in liquid based cervical cytology
Pusztaszeri et al. Ancillary studies for salivary gland cytology
Abati et al. If cells could talk: the application of new techniques to cytopathology
US20230332986A1 (en) A method for multiple staining and slide preparation for a cytopathological sample
US9182403B2 (en) Kits for and methods of differential staining of cervical cancer cells and/or tissues
He et al. Cytology Techniques
WO2019237528A1 (zh) Ush1g基因在制备抗胃癌药物及其诊断试剂盒中的应用
Tandon Histopathology-based cancer detection methods
CN113671187A (zh) 一种用于检测mycn蛋白的ihc检测试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 20937392

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 20937392

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1