CN109641922A - 点击化学用于ihc和ish测定中的信号扩增的应用 - Google Patents

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Abstract

申请人已经开发了用于IHC和ISH染色的扩增系统和方法，其利用“点击化学”将报告子分子共价结合至组织。

Description

点击化学用于IHC和ISH测定中的信号扩增的应用
工业适用性的声明
本公开在化学和诊断领域中具有工业适用性。
公开背景
免疫组织化学(IHC)是指使用对特定抗原特异性的抗体在生物样品中检测、定位和/或定量抗原(诸如蛋白)的过程。IHC提供了精确地确定特定蛋白位于组织样品内的位置的实质性优势。它也是检查组织本身的有效方式。原位杂交(ISH)是指检测、定位和定量核酸的过程。IHC和ISH两者都可以在各种生物样品(诸如组织(例如，新鲜冷冻、福尔马林固定，石蜡包埋的)和细胞学样品)上进行。无论靶标是核酸还是抗原，靶标的识别可以使用各种标记(例如显色、荧光、发光、辐射)来检测。为了在临床环境中稳健地检测、定位和定量靶标，扩增识别事件是期望的，因为确信地检测低丰度的细胞标志物的能力对于诊断目的变得越来越重要。例如，响应于单一抗原检测事件，在标志物的位点处沉积数百或数千个标记物分子，通过扩增增强检测该识别事件的能力。
不良事件经常伴随扩增，诸如作为增加的背景信号而显现的非特异性信号。增加的背景信号通过模糊可能与低、但临床上显著的表达相关的微弱信号而干扰临床分析。因此，尽管识别事件的扩增是期望的，但不增加背景信号的扩增方法是高度期望的。一种此方法是酪酰胺信号扩增(TSA)，其也被称为催化的报告子沉积(CARD)。美国专利号5,583,001公开了使用分析物依赖性酶活化系统检测和/或定量分析物的方法，所述系统依赖于催化的报告子沉积来扩增可检测的标记信号。通过使标记的酚分子与酶反应，增强CARD或TSA方法中酶的催化作用。利用TSA的现代方法有效地增加从IHC和ISH测定获得的信号，同时不产生显著的背景信号扩增(对于与酪酰胺扩增试剂相关的公开内容，参见例如，美国申请公开号2012/0171668，其以其整体通过引用并入)。这些扩增方法的试剂正被应用于临床重要靶标，以提供先前无法实现的稳健诊断能力(OPTIVIEW®扩增试剂盒, Ventana MedicalSystems, Tucson AZ, 目录号760-099)。
TSA利用辣根过氧化物酶(HRP)和酪酰胺之间的反应。在H2O2存在的情况下，酪酰胺被转化为高反应性和短寿命的自由基中间体，其优先与蛋白上富含电子的氨基酸残基反应。然后，可以通过各种显色显现技术和/或通过荧光显微术检测共价结合的可检测标记物。在高度重视空间和形态背景的固相免疫测定(诸如IHC和ISH)中，自由基中间体的短寿命导致酪酰胺与生成位点紧密靠近的组织上的蛋白的共价结合，给出离散和特异性的信号。
具有2015年2月20日的国际申请日的标题为“Quinone Methide Analog SignalAmplification”的共同未决申请PCT/EP2015/0533556描述了一种替代技术(“QMSA”)，其与TSA一样，可用于增加信号扩增而不增加背景信号。实际上，PCT/EP2015/0533556描述了新型醌甲基化物类似物前体和使用醌甲基化物类似物前体检测生物样品中的一种或多种靶标的方法。其中，检测方法被描述为包括使样品与检测探针接触、然后使样品与包含酶的标记缀合物接触的步骤。该酶与包含可检测标记物的醌甲基化物类似物前体相互作用，形成反应性醌甲基化物类似物，其靠近靶标或直接在靶标上结合生物样品。然后检测可检测标记物。
“点击化学”是一种化学理念，由Sharpless和Meldal的小组独立地定义，其描述经调节以通过将小单元连接在一起而快速且可靠地生成物质的化学法。“点击化学”已应用于可靠和自我引导的有机反应的集合(Kolb, H. C.; Finn, M. G.; Sharpless, K. B.Angew). Chem. Int. Ed. 2001, 40, 2004-2021)。例如，铜催化的叠氮化物-炔烃[3+2]环加成作为水中高度可靠的分子连接的认定(Rostovtsev, V. V.;等人 Angew. Chem. Int.编 2002, 41, 2596-2599)已被用于增加几种类型的生物分子相互作用的研究(Wang, Q.等人，J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 3192-3193; Speers, A. E.等人，J. Am. Chem.Soc. 2003, 125, 4686-4687; Link, A. J.; Tirrell, D. A. J. Am. Chem. Soc.2003, 125, 11164-11165; Deiters, A.等人，J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 11782-11783)。此外，也已出现在有机合成(Lee, L. V.等人，J. Am. Chem. Soc. 2003, 125,9588-9589)，药物发现(Kolb, H. C.; Sharpless, K. B. Drug Disc. Today 2003, 8,1128-1137; Lewis, W. G.等人，Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, 1053-1057)和表面的官能化(Meng, J.-C.等人，Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 1255-1260; Fazio, F.等人，J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 14397-14402; Collman, J. P.等人，Langmuir2004, ASAP, in press; Lummerstorfer, T.; Hoffmann, H. J. Phys. Chem. B 2004，排版中)中的应用。
通常，点击化学促进这样的反应，其具有范围广泛的模块化应用，具有高化学产率，生成无害的副产物，其为化学特异性的，需要简单的反应条件，使用容易获得的起始材料和试剂，不含溶剂或使用良性溶剂(诸如水)，导致容易的产物分离，具有大的热力学驱动力以有利于具有单一反应产物的反应，并且具有高原子经济性。尽管某些一般标准本质上可以是主观的，但并非所有标准都需要满足。
公开简述
本申请人已经开发了用于IHC和ISH染色的扩增系统和方法，其利用“点击化学”将报告子分子共价结合至组织。如本文将进一步描述，本公开的扩增方法允许报告子部分与QMSA或TSA测定条件分离，且因此提供优于QMSA和TSA方案的优点。
在本公开的一个方面是式(IIa)的缀合物：
其中，
A选自二苯并环辛炔、反式环辛烯、叠氮化物、四嗪、马来酰亚胺、硫醇、1,3-硝酮、醛、酮、肼和羟胺；
“接头”是具有2至80个碳原子且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子的分支或未分支、线性或环状、取代或未取代、饱和或不饱和的基团；
R1是选自磷酸酯基、酰胺基、硝基、脲基、硫酸酯基、甲基、酯基、β-内酰胺基或糖基的基团；
R2是卤素；
R3、R5和R6独立地选自氢或具有1至4个碳原子的脂族基团；
R4是氢、具有1至4个碳原子的脂族基团或基团-CH(R2)-R7-[接头]-A；且
R7选自-(CH2)wNH-、-O(CH2)wNH-、-N(H)C(O)(CH2)wNH-、-C(O)N(H)(CH2)wNH-、-(CH2)wO-、-O(CH2)wO-、-O(CH2CH2O)w-、-N(H)C(O)(CH2)wO-、-C(O)N(H)(CH2)wO-、-C(O)N(H)(CH2CH2O)w-、-(CH2)wS-、-O(CH2)wS-、-N(H)C(O)(CH2)wS-、-C(O)N(H)(CH2)wS-、-(CH2)wNH-、-C(O)N(H)(CH2CH2O)wCH2CH2NH、-C(O)(CH2CH2O)wCH2CH2NH-、-C(O)N(H)(CH2)NHC(O)CH(CH3)(CH2)wNH-或-N(H)(CH2)wNH-，其中w是范围为1至12的整数。
在一些实施方案中，R6、R5、R4和R3各自为氢。在一些实施方案中，R1是磷酸。在一些实施方案中，R2是氟。在一些实施方案中，R1是磷酸；R2是氟；且R6、R5、R4和R3各自为氢。
在一些实施方案中，“接头”具有式(Ia)：
其中
d和e是各自独立地范围为2至20的整数；
t和u独立地是0或1；
Q是键、O、S或N(Rc)(Rd)；
Ra和Rb独立地是H、C1-C4烷基基团、F、Cl或-N(Rc)(Rd)；
Rc和Rd独立地是CH3或H；且
X和Y独立地是具有1至12个碳原子且任选地具有一个或多个O、N或S杂原子的分支或未分支、线性或环状、取代或未取代、饱和或不饱和的基团。
在一些实施方案中，Ra和Rb各自为氢。在一些实施方案中，Q是氧。在一些实施方案中，R7是-C(O)N(H)(CH2)wNH-。在一些实施方案中，R1是磷酸且R7是-C(O)N(H)(CH2)wNH-，且w范围为2至10。在一些实施方案中，是氟；且R6、R5、R4和R3各自为氢。在一些实施方案中，“接头”包含PEG基团。
在本公开的另一个方面是式(IId)的缀合物：
其中
A选自二苯并环辛炔、反式环辛烯、叠氮化物、四嗪、马来酰亚胺、硫醇、1,3-硝酮、醛、酮、肼和羟胺；
“接头”是具有2至80个碳原子且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子的分支或未分支、线性或环状、取代或未取代、饱和或不饱和的基团；且
w范围为1至12。
在一些实施方案中，“接头”具有式(Ia)：
其中
d和e是各自独立地范围为2至20的整数；
t和u独立地是0或1；
Q是键、O、S或N(Rc)(Rd)；
Ra和Rb独立地是H、C1-C4烷基基团、F、Cl或N(Rc)(Rd)；
Rc和Rd独立地是CH3或H；且
X和Y独立地是具有1至12个碳原子且任选地具有一个或多个O、N或S杂原子的分支或未分支、线性或环状、取代或未取代、饱和或不饱和的基团。
在一些实施方案中，w范围为1至8；且其中Ra和Rb各自为氢。在一些实施方案中，w范围为2至8，且其中Q是氧。在一些实施方案中，d和e独立地是范围为2至10的整数。在一些实施方案中，A是二苯并环辛炔。在一些实施方案中，w范围为2至6，且其中所述接头包含PEG基团。在一些实施方案中，A是反式环辛烯。在一些实施方案中，范围为2至6，且其中所述接头包含PEG基团。在一些实施方案中，A是叠氮化物。在一些实施方案中，w范围为2至6，且其中所述接头包含PEG基团。在一些实施方案中，A是四嗪。在一些实施方案中，w范围为2至6，且其中所述接头包含PEG基团。
在本公开的另一个方面是式(III)的缀合物：
其中
M衍生自丙酸、肉桂酸或式(IIIa)的化合物，所述式(IIIa)的化合物具有以下结构：
其中每个R基团独立地选自氢或具有1至4个碳原子的低级烷基基团(其可能是直链或支链的)；
A选自二苯并环辛炔、反式环辛烯、叠氮化物、四嗪、马来酰亚胺、硫醇、1,3-硝酮、醛、酮、肼和羟胺；且
“接头”是具有2至80个碳原子且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子的分支或未分支、线性或环状、取代或未取代、饱和或不饱和的基团；
条件是当每个R是氢时，A选自叠氮化物、硫醇、1,3-硝酮、肼或羟胺。
在一些实施方案中，所述“接头”具有式(Ia)：
其中
d和e是各自独立地范围为2至20的整数；
t和u独立地是0或1；
Q是键、O、S或N(Rc)(Rd)；
Ra和Rb独立地是H、C1-C4烷基基团、F、Cl或N(Rc)(Rd)；
Rc和Rd独立地是CH3或H；且
X和Y独立地是具有1至12个碳原子且任选地具有一个或多个O、N或S杂原子的分支或未分支、线性或环状、取代或未取代、饱和或不饱和的基团。
在一些实施方案中，Ra和Rb各自为氢。在一些实施方案中，Q是氧。在一些实施方案中，Ra和Rb各自为氢，Q是氧，且e范围为2至10。
在本公开的另一个方面是式(Id)的缀合物：
其中
A选自二苯并环辛炔、反式环辛烯、叠氮化物、四嗪、马来酰亚胺、硫醇、1,3-硝酮、醛、酮、肼和羟胺；
“接头”是具有2至80个碳原子且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子的分支或未分支、线性或环状、取代或未取代、饱和或不饱和的基团；且
“组织反应性前体部分”衍生自选自以下的化合物：
在一些实施方案中，“接头”具有式(Ia)：
其中
d和e是各自独立地范围为2至20的整数；
t和u独立地是0或1；
Q是键、O、S或N(Rc)(Rd)；
Ra和Rb独立地是H、C1-C4烷基基团、F、Cl或N(Rc)(Rd)；
Rc和Rd独立地是CH3或H；且
X和Y独立地是具有1至12个碳原子且任选地具有一个或多个O、N或S杂原子的分支或未分支、线性或环状、取代或未取代、饱和或不饱和的基团。
在一些实施方案中，Ra和Rb各自为氢。在一些实施方案中，Q是氧。在一些实施方案中，Ra和Rb各自为氢，Q是氧，且e范围为2至10。
在本公开的另一个方面是式(IV)的缀合物：
其中
A选自二苯并环辛炔、反式环辛烯、叠氮化物、四嗪、马来酰亚胺、硫醇、1,3-硝酮、醛、酮、肼和羟胺；
“接头”是具有2至80个碳原子且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子的分支或未分支、线性或环状、取代或未取代、饱和或不饱和的基团；且
Z选自发色团、荧光团、酶、半抗原和螯合剂。
在一些实施方案中，Z是选自四甲基罗丹明、花菁5和Dabsyl的发色团。在一些实施方案中，Z选自：
在一些实施方案中，所述缀合物具有式(IVa)的结构：
。
在一些实施方案中，所述缀合物具有式(IVb)的结构：
。
在一些实施方案中，所述缀合物具有式(IVc)的结构：
。
在一些实施方案中，所述缀合物具有式(IVd)的结构：
。
在一些实施方案中，所述缀合物是：
。
在一些实施方案中，所述缀合物是：
。
在一些实施方案中，所述缀合物是：
。
在一些实施方案中，所述缀合物是：
。
在一些实施方案中，所述缀合物是：
。
在一些实施方案中，所述缀合物是：
。
在一些实施方案中，所述缀合物是：
。
在一些实施方案中，所述缀合物是：
。
在本公开的另一个方面是检测生物样品中的第一靶标的方法，其包括：使所述生物样品与对所述第一靶标特异性的第一检测探针接触以形成第一检测探针-靶标复合物；使所述生物样品与对所述第一检测探针特异性的第一标记缀合物接触，所述第一标记缀合物包含第一酶，使得第一检测探针-靶标复合物变得用第一酶标记；使所述生物样品与第一对点击缀合物的第一成员接触，所述第一对点击缀合物的第一成员包含组织反应性部分，其中所述第一酶将所述第一对点击缀合物的第一成员转化为第一反应性中间体，所述第一反应性中间体靠近第一靶标或直接在第一靶标上共价键合至生物样品，以形成第一固定的组织-点击缀合物复合物；使所述生物样品与第一对点击缀合物的第二成员接触，第一对点击缀合物的第二成员包含第二反应性部分，所述第二反应性部分能够与所述第一固定的组织-点击缀合物复合物的第一反应性部分反应，使得在所述第一固定的组织-点击缀合物复合物和第一对点击缀合物的第二成员之间形成共价键，以形成第一组织-点击缀合物加合物；和检测来自第一组织-点击缀合物加合物的第一报告子部分的信号。
在一些实施方案中，第一对点击缀合物的第二成员包含至少一个发色团。在一些实施方案中，所述第一对点击缀合物的第一成员包含醌甲基化物前体部分；且其中所述第一对点击缀合物的第二成员包含发色团。在一些实施方案中，所述第一对点击缀合物的第一成员包含酪酰胺部分；且其中所述第一对点击缀合物的第二成员包含发色团。在一些实施方案中，所述第一检测探针是一抗，且其中所述第一标记缀合物包含抗-抗体的抗体。在一些实施方案中，其中所述第一酶选自磷酸酶、磷酸二酯酶、酯酶、脂肪酶、酰胺酶、蛋白酶、硝基还原酶、脲酶、硫酸酯酶、细胞色素P450、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-内酰胺酶、α-葡糖醛酸酶、β-葡糖醛酸酶、α-5-半乳糖苷酶、神经氨酸酶、β-半乳糖苷酶、α-乳糖酶和β-乳糖酶。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括检测生物样品中的第二靶标，其中所述第二靶标通过如下检测：使所述生物样品与对所述第二靶标特异性的第二检测探针接触以形成第二检测探针-靶标复合物；使所述生物样品与对所述第二检测探针特异性的第二标记缀合物接触，所述第二标记缀合物包含第二酶，使得第二检测探针-靶标复合物变得用第二酶标记；使所述生物样品与第二对点击缀合物的第一成员接触，所述第二对点击缀合物的第一成员包含组织反应性部分，其中所述第二酶将所述第二对点击缀合物的第一成员转化为第二反应性中间体，所述第二反应性中间体靠近第二靶标或直接在第二靶标上共价键合至生物样品，以形成第二固定的组织-点击缀合物复合物；使所述生物样品与第二对点击缀合物的第二成员接触，第二对点击缀合物的第二成员包含第二反应性部分，所述第二反应性部分能够与所述第二固定的组织-点击缀合物复合物的第一反应性部分反应，使得在第二固定的组织-点击缀合物复合物和第二对点击缀合物的第二成员之间形成共价键；和检测来自第二组织-点击缀合物加合物的第二报告子部分的信号，其中所述第二报告子部分不同于所述第一报告子部分。
在一些实施方案中，第二对点击缀合物的第二成员包含至少一个发色团。在一些实施方案中，所述第二对点击缀合物的第一成员包含醌甲基化物前体部分；且其中所述第二对点击缀合物的第二成员包含发色团。在一些实施方案中，所述第二对点击缀合物的第一成员包含酪酰胺部分；且其中所述第二对点击缀合物的第二成员包含发色团。在一些实施方案中，所述第二检测探针是一抗，且其中第二第一标记缀合物包含抗-抗体的抗体。在一些实施方案中，所述第二酶选自磷酸酶、磷酸二酯酶、酯酶、脂肪酶、酰胺酶、蛋白酶、硝基还原酶、脲酶、硫酸酯酶、细胞色素P450、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-内酰胺酶、α-葡糖醛酸酶、β-葡糖醛酸酶、α-5-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-乳糖酶和β-乳糖酶。
在本公开的另一个方面是与组织样品共价键合的固定的点击缀合物，所述固定的点击-缀合物包含选自以下的第一反应性官能团：二苯并环辛炔、反式环辛烯、叠氮化物、四嗪、马来酰亚胺、硫醇、1,3-硝酮、醛、酮、肼和羟胺。在一些实施方案中，所述点击-缀合物通过组织样品内或其表面上的酪氨酸残基或亲核物质与组织键合。
在本公开的另一个方面是可检测的组织-点击加合物复合物，其通过使固定的点击-缀合物(诸如如上所示)与式(IV)的缀合物反应而形成：
其中
A选自二苯并环辛炔、反式环辛烯、叠氮化物、四嗪、马来酰亚胺、硫醇、1,3-硝酮、醛、酮、肼和羟胺；
“接头”是具有2至80个碳原子且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子的分支或未分支、线性或环状、取代或未取代、饱和或不饱和的基团；且
Z选自发色团、荧光团、酶、半抗原和螯合剂；且
其中式(IV)的缀合物包含能够与固定的点击-缀合物的第一反应性官能团反应的A基团。
在一些实施方案中，Z是至少一个发色团。在一些实施方案中，所述第一反应性官能团是二苯并环辛炔，且其中式(IV)的A选自叠氮化物或1,3-硝酮。在一些实施方案中，所述第一反应性官能团是反式环辛烯，且其中式(IV)的A是四嗪。在一些实施方案中，所述第一反应性官能团是叠氮化物，且其中式(IV)的A是二苯并环辛炔。在一些实施方案中，Z是螯合剂，且其中将镧系元素引入形成的可检测的组织-点击加合物复合物中。
本申请人已发现本文公开的点击缀合物适用于生物测定，并且它们的使用改进了TSA和QMSA的限制。例如且不希望受任何特定理论束缚，本申请人已发现由QMSA产生的染色质量高度依赖于醌甲基化物-报告子缀合物的溶解度。例如，非常疏水的QMSA缀合物倾向于离散地染色，但具有低信号强度，而非常亲水的QMSA缀合物倾向于以高信号强度染色，但也具有不期望的扩散水平。为了解决该问题，必须不同地合成每种醌甲基化物-报告子缀合物以优化扩散和信号强度。例如，非常疏水的报告子可能需要两亲性PEG接头，而亲水性报告子可能需要疏水性脂族接头。因此，QMSA可能是令人厌烦的，并且在一些情况下，就限制扩散至期望水平而言，缀合物不能被优化。本申请人已发现基于QMSA、但利用本文的点击缀合物的扩增方法改进了QMSA。
同样地，关于TSA且再次不希望受任何特定理论束缚，本申请人认为许多荧光团和发色团对氧化敏感，导致不可逆的分解和颜色和荧光的损失。本申请人还认为，TSA测定所需的氧化条件可以加速一些染料(即花菁染料)的氧化，使得它们对于TSA是差的报告子(尽管底物浓度高，但信号强度低)。本申请人也已显示，酪酰胺的疏水性与许多荧光团和发色团的疏水性相偶联可以导致酪酰胺缀合物不溶于所需的IHC和ISH水性反应介质中。对于几乎所有缀合物，需要两亲性PEG接头来溶解缀合物。然而，在一些情况下，PEG接头不足以克服疏水性，使一些期望的报告子(即dabsyl)不可用。由于这两个限制，目前使用TSA无法获得两个期望的颜色空间，即蓝色(cy5)和黄色(dabsyl)。本申请人已发现基于TSA、但利用本文的点击缀合物的扩增方法改进了TSA。
QMSA和TSA两者共同的一个进一步限制是相对于超过特定饱和点的信号不能扩增。在组织上存在有限数目的这些QMSA和TSA反应性中间体结合的反应位点。一旦那些反应位点被耗尽，信号强度就饱和。本申请人已发现利用本文公开的点击缀合物和方法的扩增方法能够增加总体信号，因此允许显现低丰度的标志物。
本申请人已令人惊讶地发现，利用如本文所述的点击缀合物对的扩增：(i)使报告子分子(这里，一对点击缀合物的一个成员的组分部分)“避免”于潜在地不利的条件(即，在TSA的情况下，氧化不稳定的发色团)，允许使用更广泛范围的报告子；(ii)解决与TSA的一些酪酰胺缀合物(即dabsyl)相关的水溶性问题；(iii)对于QMSA，仅需要“调节”几个QM-“点击”缀合物的溶解度，而不是荧光团、发色团和半抗原的整个文库。本申请人相信，这些性质在一起提供了QMSA和TSA两者的简化的扩增方法，为TSA调色板添加额外的期望颜色空间的能力，以及染色强度的总体增强。本文将进一步描述这些和其他方面。
附图简述
本专利或申请文件含有至少一幅以颜色绘制的图。根据请求并支付必要费用后，本专利或专利申请公开的具有彩图的副本将向官方提供。
图1A和1B阐述反应方案，其说明包含醌甲基化物前体部分的某些点击缀合物和组织结合的酶之间的反应；随后在所得组织-点击缀合物复合物和第二点击缀合物之间反应，以形成组织-点击缀合物加合物。
图2A和2B阐述反应方案，其说明包含酪酰胺部分的某些点击缀合物和组织结合的酶之间的反应；随后在所得组织-点击缀合物复合物和第二点击缀合物之间反应，以形成组织-点击缀合物加合物。
图3A阐述一对点击缀合物的第一和第二成员的实例，其中每对点击缀合物的第一成员包含如本文所述的式(II)的化合物。
图3B阐述一对点击缀合物的第一和第二成员的实例，其中每对点击缀合物的第一成员包含如本文所述的式(III)的化合物。
图4阐述包含至少一个发色团和反应性官能团的点击缀合物的实例。
图5阐述与组织结合的含醌甲基化物的点击缀合物(组织-点击缀合物复合物)和包含至少一个报告子部分的点击缀合物之间的反应。
图6阐述与组织结合的含酪酰胺的点击缀合物(组织-点击缀合物复合物)和包含至少一个报告子部分的点击缀合物之间的反应。
图7A、7B和7C说明用某些QMSA缀合物染色扁桃体样品。
图8A、8B和8C说明用某些TSA缀合物染色扁桃体样品。
图9A、9B、9C和9D比较地说明用具有不同报告子部分的不同点击缀合物的染色。
图10比较地说明使用(i)DAB对照、(ii)使用TSA方案和(iii)使用利用本公开的点击-缀合物的扩增方案的IHC染色的结果。
图11比较地说明在使用(i)TSA方案和(ii)利用本公开的点击缀合物的扩增方案的ISH测定中的染色强度的差异。
图12比较地说明当使用包含单个发色团的点击缀合物和包含多个发色团的点击缀合物时染色强度的差异。
图13说明使用包含碱性磷酸酶作为报告子部分的点击缀合物的染色强度。
图14阐述反应方案，其说明含有酪酰胺的点击缀合物和组织结合的酶之间的反应；随后在所得组织-点击缀合物复合物和第二点击缀合物之间反应，所述第二点击缀合物包含碱性磷酸酶报告子部分。
图15阐述流程图，其描绘利用扩增方案检测生物样品内的靶标的步骤，所述扩增方案利用本公开的点击缀合物。
详述
大体上，本公开涉及点击缀合物，以及采用点击缀合物用于检测生物样品中存在的一种或多种靶标的方法。在一些实施方案中，点击缀合物(或包含一种或多种点击缀合物的试剂盒)用于多重测定中以同时或依次检测组织样品内的多种靶标。本文更全面地详述本公开的这些和其他方面。
定义
如本文所用，单数术语“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数对象，除非上下文另有清楚指出。类似地，词语“或(or)”意在包括“和(and)”，除非上下文另有清楚指出。术语“包括”以包含的方式定义，使得“包括A或B”意味着包括A、B，或者A和B。
术语“包含”、“包括”、“具有”等可互换使用且具有相同含义。类似地，“包含”、“包括”、“具有”等可互换使用且具有相同含义。具体地，每个术语都与“包含”的通常美国专利法定义一致地定义，并且因此被解释为开放术语，意指“至少以下”，并且还被解释为不排除额外的特征、限制、方面等。因此，例如，“具有组件a、b和c的装置”意味着该装置至少包括组件a、b和c。类似地，短语：“涉及步骤a、b和c的方法”意味着该方法至少包括步骤a、b和c。此外，尽管本文可以以特定顺序概述所述步骤和方法，但技术人员将认识到，排序的步骤和方法可以变化。
如本文所用，碱性磷酸酶(AP)是这样的酶，其通过破坏磷酸-氧键并暂时形成中间酶-底物键而(通过水解)去除并转移磷酸基团有机酯。例如，AP将萘酚磷酸酯(底物)水解成酚类化合物和磷酸。酚类与无色重氮鎓盐(色原)偶联，以产生不溶性的有色偶氮染料。
如本文所用，术语“抗体”，偶尔缩写为“Ab”，是指免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子，包括例如但不限于，IgA、IgD、IgE、IgG和IgM、其组合以及在任何脊椎动物中(例如在哺乳动物诸如人、山羊、兔和小鼠中)的免疫应答过程中产生的类似分子和抗体片段，其特异性结合目标分子(或一组高度相似的目标分子)，以至基本上排除结合其他分子。抗体进一步是指至少包含特异性识别并结合抗原的表位的轻链或重链免疫球蛋白可变区的多肽配体。抗体可以由重链和轻链构成，其各自具有可变区，称为可变重(VH)区和可变轻(VL)区。VH区和VL区共同负责结合被抗体识别的抗原。术语抗体还包括完整的免疫球蛋白及其本领域众所周知的变体和部分。
如本文所用，短语“抗体缀合物”是指(直接或间接)缀合至一种或多种标记物的那些抗体，其中所述抗体缀合物对特定靶标是特异性的且其中所述标记物能够被(直接或间接)检测到，诸如用二抗(抗-标记物抗体)检测到。例如，抗体缀合物可以诸如通过聚合物接头和/或间隔子与半抗原偶联，并且可以借助半抗原间接检测抗体缀合物。作为一个替代实例，抗体缀合物可以诸如通过聚合物接头和/或间隔子与荧光团偶联，并且可以直接检测抗体缀合物。抗体缀合物进一步描述于美国公开号2014/0147906和美国专利号8,658,389；8,686,122；8,618,265；8,846,320；和8,445,191。作为进一步的实例，术语“抗体缀合物”包括缀合至酶、例如HRP或AP的那些抗体。
如本文所用，术语“抗原”是指可以由特异性体液或细胞免疫的产物诸如抗体分子或T细胞受体特异性结合的化合物、组合物或物质。抗原可以是任何类型的分子，包括例如半抗原、简单中间代谢物、糖(例如寡糖)、脂质和激素以及大分子诸如复杂碳水化合物(例如多糖)、磷脂、核酸和蛋白。
如本文所用，术语“生物样品”可以是获自任何活的生物体、由任何活的生物体排出或分泌的任何固体或流体样品，所述生物体包括但不限于单细胞生物体，尤其是诸如细菌、酵母、原生动物和变形虫等，以及多细胞生物体(诸如植物或动物，包括来自健康或表观健康的人类受试者或受待诊断或调查的病况或疾病诸如癌症影响的人类患者的样品)。例如，生物样品可以是获得自例如血液、血浆、血清、尿液、胆汁、腹水、唾液、脑脊液、房水或玻璃体液或任何身体分泌物、渗出物、流出物(例如，获得自脓肿或任何其他感染或炎症部位的流体)的生物流体，或获得自关节(例如，正常关节或受疾病影响的关节)的流体。生物样品也可以是获得自任何器官或组织的样品(包括活检或尸检样本，诸如肿瘤活检)，或者可以包括细胞(无论是原代细胞还是培养细胞)或由任何细胞、组织或器官调节的培养基。在一些实例中，生物样品是核提取物。在某些实例中，样品是质量控制样品，诸如公开的细胞团块切片样品之一。在其他实例中，样品是测试样品。普通技术人员可以使用本领域已知的任何方法来制备样品。可以从用于常规筛选的受试者或从被怀疑具有病症，诸如遗传异常、感染或瘤形成的受试者获得样品。公开的方法的所描述的实施方案也可以应用于被称为“正常”样品的不具有遗传异常、疾病、病症等的样品。样品可以包括可以被一种或多种检测探针特异性结合的多个靶标。
如本文所用，术语“发色团”是指分子或负责其颜色的分子部分。当分子吸收某些波长的可见光并透射或反射其他波长时，产生颜色。具有落在可见光谱范围内的两个不同分子轨道之间的能量差的分子可以吸收可见光，且因此被适当地表征为发色团。可以吸收入射在发色团上的可见光，因此将电子从基态分子轨道激发到激发态分子轨道。
如本文所用，术语“缀合物”是指共价连接至较大构建体中的两个或更多个分子或部分(包括大分子或超分子的分子)。在一些实施方案中，缀合物包括一种或多种共价连接至一个或多个其他分子部分的生物分子(诸如肽、蛋白、酶、糖、多糖、脂质、糖蛋白和脂蛋白)。
如本文所用，术语“偶联(couple)”或“偶联(coupling)”是指一个分子或原子与另一个分子或原子的接合、键合(例如共价键合)或连接。
如本文所用，“半抗原”是可以与抗体特异性组合，但除非与载体分子组合，通常基本上不能具有免疫原性的小分子。在一些实施方案中，半抗原包括但不限于吡唑类(例如硝基吡唑类)；硝基苯基化合物；苯并呋咱类；三萜类；脲类(例如苯基脲类)；硫脲类(例如苯基硫脲类)；鱼藤酮和鱼藤酮衍生物；噁唑(例如噁唑磺酰胺类)；噻唑类(例如噻唑磺酰胺类)；香豆素和香豆素衍生物；和环木脂素类。半抗原的额外非限制性实例包括噻唑类；硝基芳基；苯并呋喃类；三萜类；和环木脂素类。半抗原的具体实例包括二硝基苯基、生物素、洋地黄毒苷和荧光素及其任何衍生物或类似物。其他半抗原描述于美国专利号8,846,320；8,618,265；7,695,929；8,481,270；和9,017,954；其公开内容以其整体通过引用并入本文。半抗原本身可以适合于直接检测，即它们可以发出合适的信号用于检测。
如本文所用，辣根过氧化物酶(HRP)是可以与标记的分子缀合的酶。当与适当的底物一起孵育时，其产生标记的分子的有色、荧光或发光衍生物，允许其被检测和定量。HRP在电子供体存在的情况下起作用，以首先形成酶底物复合物，且然后接着起作用以氧化电子供体。例如，HRP可以作用于3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)以产生可检测的颜色。HRP还可以作用于标记的酪酰胺缀合物，或酪酰胺样反应性缀合物(即阿魏酸、香豆酸、咖啡酸、肉桂酸、多巴胺等)，以沉积有色或荧光或无色的报告子部分用于酪酰胺信号扩增(TSA)。
如本文所用，术语“多重”、“多重的”或“多重化”是指同时、基本上同时或依次检测样品中的多种靶标。多重化可以包括单独地和以任何和所有组合来鉴定和/或定量多种不同的核酸(例如，DNA、RNA、mRNA、miRNA)和多肽(例如，蛋白)。
如本文所用，术语“一抗”是指特异性结合组织样品中的靶标蛋白抗原的抗体。一抗通常是免疫组织化学程序中使用的第一抗体。
如本文所用，“醌甲基化物”是醌类似物，其中相应醌上的羰基氧之一被亚甲基基团(CH2)替代以形成烯烃。
如本文所用，术语“二抗”在本文中是指这样的抗体，其特异性结合一抗，由此在一抗和后续试剂(例如标记物、酶等，如果有的话)之间形成桥。二抗通常是免疫组织化学程序中使用的第二抗体。
如本文所用，术语“特异性结合部分”是指特异性结合对的成员。特异性结合对是分子对，其特征在于它们与彼此结合以实质上排除与其他分子的结合(例如，特异性结合对可具有比结合对的两个成员中任一个与生物样品中的其他分子的结合常数至少大10-3 M、大10-4 M或大10-5 M的结合常数)。特异性结合部分的具体实例包括特异性结合蛋白(例如，抗体、凝集素、抗生物素蛋白诸如链霉抗生物素蛋白和蛋白A)。特异性结合部分还可以包括被此类特异性结合蛋白特异性结合的分子(或其部分)。
如本文所用，术语“靶标”是指确定或可以确定其存在、位置和/或浓度的任何分子。靶标分子的实例包括蛋白、核酸序列和半抗原，诸如共价键合至蛋白的半抗原。通常使用特异性结合分子和可检测标记的一种或多种缀合物来检测靶标分子。
“点击”缀合物
本公开提供了点击缀合物的两个通用子集。点击缀合物的第一子集包含通过任选的接头与反应性官能团偶联的组织反应性部分。在一些实施方案中，该点击缀合物的第一子集用作点击缀合物对的第一成员。点击缀合物的第二子集包含通过任选的接头与反应性官能团偶联的一个或多个报告子部分。在一些实施方案中，该点击缀合物的第二子集用作点击缀合物对的第二成员。应当理解，本文公开的点击缀合物的不同子集可以充当模块化“构建嵌段”，使得当组合任何具有适当反应性官能团的两个缀合物时(“一对点击缀合物”)，它们可以经历反应并且形成共价键，由此偶联两个缀合物以形成具有期望结构或组分部分的“点击加合物”。
如本文将进一步描述，形成的点击加合物可以充当适合于在生物测定中检测靶标的物质。不希望受任何特定理论束缚，据信本文公开的点击缀合物在水性介质中是稳定的，且因此适用于某些生物测定，包括IHC和ISH。此外，据信点击缀合物具有大的热力学驱动力，其有利于提供单一产物的快速反应。此外，可以“调节”本文所述的任何点击缀合物的溶解度以满足任何特定测定的要求，并且这种“调节”可以通过例如将水溶性接头或水溶性接头组分引入缀合物来实现。此外，包含本文所述的点击缀合物的反应可以在各种各样的缓冲液中实施，且因此可以在各种各样的pH下进行，允许技术人员针对报告子稳定性选择理想条件。
在本公开的一个方面是式(I)的点击缀合物：
其中A是反应性官能团，“接头”是任选的连接基团，B选自“组织反应性部分”或报告子部分。
如本文所用，术语“组织反应性”是指能够与酶反应的部分。因此，当包含组织反应性部分的点击缀合物与适当的酶反应时，点击缀合物的组织反应性部分的部分经历结构、构象和/或电子变化，由此提供适于直接或间接键合至生物样品上(或在可能的程度上，在生物样品内)的组织反应性物质(中间体，包括自由基中间体)。例如，在组织反应性部分是酪酰胺或其衍生物的情况下，当酪酰胺与适当的酶(例如HRP)反应时，形成酪酰胺自由基物质(中间体)。这种高反应性酪酰胺自由基物质能够键合至生物样品中的酪氨酸残基。以类似的方式，醌甲基化物前体部分，在与适当的酶(例如AP)反应后，被转化为醌甲基化物，其据信与生物样品中的亲核试剂高度反应。本文进一步描述任何点击缀合物的组织反应性部分的部分的作用，其与合适的酶的相互作用，以及固定化组织-点击缀合物复合物的形成。
在一些实施方案中，A选自二苯并环辛炔("DBCO")、反式环辛烯("TCO")、叠氮化物、四嗪、马来酰亚胺、硫醇、1,3-硝酮、醛、酮、肼和羟胺。在一些实施方案中，A选自能够经历光-引发反应的基团。
点击缀合物任选地包含“接头”。在一些实施方案中，“接头”是具有2至80个碳原子且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子的分支或未分支、线性或环状、取代或未取代、饱和或不饱和的基团。在一些实施方案中，“接头”包含一个或多个选自氨基、烷基氨基、氧、硫、亚砜、磺酰基、羰基和亚胺基团的基团。接头链还可以包含芳族基团，包括杂芳族基团，其中所述杂芳族基团包含1至4个选自O、N或S的杂原子。
在一些实施方案中，所述“接头”具有式(Ia)中描绘的结构：
其中d和e是各自独立地范围为2至20的整数；t和u独立地是0或1；Q是键、O、S或N(Rc)(Rd)；Ra和Rb独立地是H、C1-C4烷基基团、F、Cl或N(Rc)(Rd)；Rc和Rd独立地是CH3或H；且X和Y独立地是具有1至12个碳原子且任选地具有一个或多个O、N或S杂原子的分支或未分支、线性或环状、取代或未取代、饱和或不饱和的基团。在一些实施方案中，X和Y包括羰基基团、酰胺基、酯基、酯基、取代或未取代的芳基基团或其任何组合。在其他实施方案中，d和e是范围为2至10的整数。在还有其他实施方案中，d和e是范围为2至6的整数。
在一些实施方案中，所述“接头”具有式(Ib)中描绘的结构：
其中
d和e是各自独立地范围为2至20的整数；
t和u独立地是0或1；
Q是键、O、S或N(Rc)(Rd)；
Rc和Rd独立地是CH3或H；且
X和Y独立地是具有1至12个碳原子且任选地具有一个或多个O、N或S杂原子的分支或未分支、线性或环状、取代或未取代、饱和或不饱和的基团。
在一些实施方案中，X和Y独立地是具有2至8个碳原子且任选地具有一个或多个O、N或S杂原子的分支或未分支、线性或环状、取代或未取代、饱和或不饱和的基团。
在一些实施方案中，所述“接头”具有式(Ic)中描绘的结构：
其中
d和e是各自独立地范围为2至20的整数；
t和u独立地是0或1；且
X和Y独立地是具有1至12个碳原子且任选地具有一个或多个O、N或S杂原子的分支或未分支、线性或环状、取代或未取代、饱和或不饱和的基团。
在其他实施方案中，d和e是范围为2至10的整数。在还有其他实施方案中，d和e是范围为2至6的整数。
式(Ia)、(Ib)和(Ic)的基于环氧烷的“接头”在本文中通过参考二醇类、诸如乙二醇类来表示。在一些实施方案中，此类环氧烷接头的并入据信增加点击缀合物的亲水性。本领域普通技术人员将理解，随着接头中环氧烷重复单元的数量增加，缀合物的亲水性也可增加。可用于实施本公开的某些公开实施方案的额外异双官能聚亚烷基二醇间隔子描述于受让人的共同未决申请，包括“Nanoparticle Conjugates,”2006年4月28日提交的美国专利申请号11/413,778；“Antibody Conjugates,”2006年4月27日提交的美国申请号11/413,415；和“Molecular Conjugate,”2005年11月23日提交的美国临时专利申请号60/739,794；所述申请全部都通过引用并入本文。
组织反应性前体部分“点击”缀合物
在一些实施方案中，本公开的点击缀合物具有式(Id)的结构：
其中“组织反应性前体部分”是(i)酪酰胺或其衍生物或类似物，或(ii)醌甲基化物前体；且其中A和接头如上所定义。适合于并入公开的式(I)的点击缀合物中的示例性醌甲基化物前体衍生物包括标题为“Quinone Methide Analog Signal Amplification”、具有2015年2月20日的国际申请日的PCT/EP2015/053556中列举的那些，其公开内容在此以其整体通过引用并入本文。
醌甲基化物"点击"缀合物
在一些实施方案中，所述化合物具有式(II)：
其中
A如上所定义；
“接头”是如上所定义的任选的连接基团；且
U是醌甲基化物前体、其衍生物或类似物。
在一些实施方案中，式(II)的化合物是一对点击缀合物的第一成员。
如本文所用，“醌甲基化物前体”是一类缀合的化合物，其当与适当的酶(例如，AP)反应时被转化为高反应性醌甲基化物。如上所示，醌甲基化物前体及其向醌甲基化物的转化描述于PCT/EP2015/053556，其公开内容在此以其整体通过引用并入本文。
在一些实施方案中，式(II)的缀合物的醌甲基化物前体部分衍生自以下醌甲基化物前体衍生物之一：
在一些实施方案中，式(II)的缀合物具有式(IIa)的结构：
其中“接头”和A如本文所定义，
R1是选自磷酸酯基、酰胺基、硝基、脲基、硫酸酯基、甲基、酯基、β-内酰胺基或糖基的基团；
R2是卤素；
R3、R5和R6独立地选自氢或具有1至4个碳原子的脂族基团；
R4是氢、具有1至4个碳原子的脂族基团或基团-CH(R2)-R7-[接头]-A；
R7是-(CH2)wNH-、-O(CH2)wNH-、-N(H)C(O)(CH2)wNH-、-C(O)N(H)(CH2)wNH-、-(CH2)wO-、-O(CH2)wO-、-O(CH2CH2O)w-、-N(H)C(O)(CH2)wO-、-C(O)N(H)(CH2)wO-、-C(O)N(H)(CH2CH2O)w-、-(CH2)wS-、-O(CH2)wS-、-N(H)C(O)(CH2)wS-、-C(O)N(H)(CH2)wS-、-(CH2)wNH-、-C(O)N(H)(CH2CH2O)wCH2CH2NH、-C(O)(CH2CH2O)wCH2CH2NH-、-C(O)N(H)(CH2)NHC(O)CH(CH3)(CH2)wNH-或-N(H)(CH2)wNH-，其中w是范围为1至12的整数。当R1是糖时，所述糖可以选自葡萄糖、β-葡萄糖、α-半乳糖苷、β-半乳糖苷、a-葡萄糖醛糖、神经氨酸或β-葡萄糖醛糖。
在其他实施方案中，式(II)的缀合物具有式(IIb)的结构：
其中R1选自磷酸、酰胺、硝基、脲、硫酸、甲基、酯、β-内酰胺或糖；且
其中R7是-(CH2)wNH-、-O(CH2)wNH-、-N(H)C(O)(CH2)wNH-、-C(O)N(H)(CH2)wNH-、-(CH2)wO-、-O(CH2)wO-、-O(CH2CH2O)w-、-N(H)C(O)(CH2)wO-、-C(O)N(H)(CH2)wO-、-C(O)N(H)(CH2CH2O)w-、-(CH2)wS-、-O(CH2)wS-、-N(H)C(O)(CH2)wS-、-C(O)N(H)(CH2)wS-、-(CH2)wNH-、-C(O)N(H)(CH2CH2O)wCH2CH2NH、-C(O)(CH2CH2O)wCH2CH2NH-、-C(O)N(H)(CH2)NHC(O)CH(CH3)(CH2)wNH-或-N(H)(CH2)wNH-，其中w是范围为1至12的整数。
在式(IIb)的缀合物的一些实施方案中，R1是磷酸且R7是-C(O)N(H)(CH2)wNH-，且w范围为2至10。
在还有其他实施方案中，式(II)的缀合物具有式(IIc)的结构：
其中R7是-(CH2)wNH-、-O(CH2)wNH-、-N(H)C(O)(CH2)wNH-、-C(O)N(H)(CH2)wNH-、-(CH2)wO-、-O(CH2)wO-、-O(CH2CH2O)w-、-N(H)C(O)(CH2)wO-、-C(O)N(H)(CH2)wO-、-C(O)N(H)(CH2CH2O)w-、-(CH2)wS-、-O(CH2)wS-、-N(H)C(O)(CH2)wS-、-C(O)N(H)(CH2)wS-、-(CH2)wNH-、-C(O)N(H)(CH2CH2O)wCH2CH2NH、-C(O)(CH2CH2O)wCH2CH2NH-、-C(O)N(H)(CH2)NHC(O)CH(CH3)(CH2)wNH-或-N(H)(CH2)wNH-，其中w是范围为1至12的整数。
在一些实施方案中，R7是C(O)N(H)(CH2)wNH且w如上所定义。在其他实施方案中，R7是C(O)N(H)(CH2)wNH且w范围为2至6。
在又进一步实施方案中，式(II)的缀合物具有式(IId)的结构：
其中
w范围为1至12，且
“接头”和A如上所定义。
在一些实施方案中，w范围为1至8。在其他实施方案中，w范围为2至8。在还有其他实施方案中，w范围为2至6。在进一步实施方案中，w是6。
式(II)的化合物的具体实例包括以下：
式(II)的醌甲基化物前体点击缀合物可以根据本领域普通技术人员已知的任何方法合成。在一些实施方案中，包含期望反应性官能团和接头的试剂仅与醌甲基化物前体或其衍生物或类似物偶联，如以下反应方案中所说明。例如，具有末端胺基的醌甲基化物前体可以与包含胺反应性基团(例如活性酯诸如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或磺基-NHS、异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰基叠氮化物、磺酰氯、醛、乙二醛、环氧化物、环氧乙烷、碳酸酯、芳基卤化物、亚氨酸酯、酸酐等)的化合物偶联。
在下面的具体实例中的一些中，具有NHS-酯基的点击配偶体与具有末端胺的醌甲基化物前体偶联。在一些实施方案中，反应在DMSO中发生并使其反应60分钟。然后将反应物用甲醇稀释，并通过制备型HPLC直接纯化。
方案1A：式(II)的化合物的合成的实例。
酪酰胺“点击”缀合物
在其他实施方案中，所述化合物具有式(III)：
其中A如上所定义；“接头”是如上所定义的任选的连接基团；且M是酪酰胺或其衍生物或类似物。在一些实施方案中，式(III)的化合物是一对点击配偶体的第一成员。
在一些实施方案中，式(III)的缀合物包含衍生自具有式(IIIa)的结构的化合物的酪酰胺：
其中每个R基团独立地选自氢或具有1至4个碳原子的低级烷基基团(其可能是直链或支链的)，且其中接头和A如本文所定义。
在一些实施方案中，式(III)的化合物包含衍生自具有式(IIIb)的结构的化合物的酪酰胺：
其中A选自叠氮化物、硫醇、1,3-硝酮、肼或羟胺，且其中接头如本文所定义。
在一些实施方案中，式(III)的化合物包含来自具有式(IIIc)或(IIId)的结构的化合物的部分：
。
特定酪酰胺点击缀合物的非限制性实例包括以下：
式(III)的酪酰胺点击缀合物可以根据本领域普通技术人员已知的任何方法合成。在一些实施方案中，包含期望反应性官能团和接头的试剂仅与酪酰胺或其衍生物或类似物偶联，如以下反应方案中所说明。例如，酪酰胺(具有末端胺基团)可以与包含胺反应性基团(例如活性酯诸如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或磺基-NHS、异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰基叠氮化物、磺酰氯、醛、乙二醛、环氧化物、环氧乙烷、碳酸酯、芳基卤化物、亚氨酸酯、酸酐等)的化合物偶联。
在下面的具体实例中的一些中，具有NHS-酯基团的点击配偶体与酪酰胺偶联。在一些实施方案中，反应在DMSO中发生并使其反应60分钟。然后将反应物用甲醇稀释，并通过制备型HPLC直接纯化。
方案1B：具有式(III)的点击缀合物的合成的实例。
报告子部分“点击”缀合物
在其他实施方案中，本公开的点击缀合物具有式(IV)的结构：
其中A如上所定义；“接头”是如上所定义的任选的连接基团；且Z包含至少一个报告子部分(术语“报告子部分”和“报告子”在本文中可互换使用)。在一些实施方案中，式(IV)的化合物是一对点击配偶体的第二成员。
在一些实施方案中，式(IV)的缀合物包含一个报告子部分，且因此基团Z是直接或通过接头间接偶联至反应性官能团A的报告子部分。在其他实施方案中，式(IV)的缀合物包含多个报告子部分，且因此Z代表具有两个或更多个报告子部分的基团。在其中Z代表具有两个或更多个报告子部分的基团的实施方案中，基团Z直接或通过接头间接偶联至反应性官能团A。
在一些实施方案中，Z包含两个报告子。在其他实施方案中，Z包含四个报告子。在其他实施方案中，Z包含六个报告子。在还有其他实施方案中，Z包含多于6个报告子。在其中Z包含多于一个报告子的实施方案中，所述报告子可以是相同或不同的。例如，Z可以包含两个相同的色原(例如两个TAMRA色原)。或者，Z可以包含两个不同的色原(例如，TAMRA和cy5)。
在一些实施方案中，Z包含至少两个报告子部分，且所述至少两个报告子部分经由直链或支链脂族基团(任选地包含一个或多个杂原子)与彼此连接。在其他实施方案中，Z包含至少两个报告子部分，且所述至少两个报告子部分经由树枝状分子或分支聚合物与彼此连接。
在一些实施方案中，式(IV)的化合物具有式(V)的结构：
其中
“支架”是能够偶联多个报告子部分的基团，且
v是范围为1至20的整数。
在一些实施方案中，“支架”是多胺(例如，降亚精胺、精胺及其衍生物或类似物；或包含2至10个胺基的多胺)；异双官能接头(例如赖氨酸或赖氨酸衍生物)；树枝状分子(例如聚酰胺-胺(PAMAM)树枝状分子、Janus树枝状分子(即由两个树枝状楔构成且由两个不同官能团封端的树枝状分子)，和双-MPA树枝状分子及其衍生物)；或聚合物。在一些实施方案中，“支架”是键。
在一些实施方案中，点击缀合物具有以下式：
其中接头和Z如本文所定义。
在一些实施方案中，所述报告子部分选自发色团、荧光团、酶、半抗原或螯合剂。
合适的半抗原的非限制性实例包括吡唑类，特别是硝基吡唑类；硝基苯基化合物；苯并呋咱类；三萜类；脲类和硫脲类，特别是苯基脲类，且甚至更特别是苯基硫脲类；鱼藤酮和鱼藤酮衍生物，本文也称为鱼藤酮类；噁唑和噻唑类，特别是噁唑和噻唑磺酰胺类；香豆素和香豆素衍生物；环木脂素类，例如鬼臼毒素和鬼臼毒素衍生物；及其组合。半抗原及其合成和使用方法的进一步实例公开于美国专利号7,695,929，其公开内容在此以其整体通过引用并入本文。
在一些实施方案中，合适的半抗原包括BD (苯并二氮杂䓬)、BF (苯并呋咱)、DABSYL (4-(二甲基氨基)偶氮苯-4'-磺酰胺，其具有约436 nm的最大值)、DCC (7-(二乙基氨基)香豆素-3-甲酸)、DIG (洋地黄毒苷)、DNP (二硝基苯基)、HQ (3-羟基-2-喹喔啉脲)、NCA (硝基肉桂酸)、NP (硝基吡唑)、PPT (鬼臼毒素)、Rhod (罗丹明)、ROT (鱼藤酮)和TS(噻唑磺酰胺)。其他合适的半抗原包括生物素和荧光素衍生物(FITC (异硫氰酸荧光素))、TAMRA (四甲基罗丹明)、德克萨斯红)和罗丹明110 (罗丹明)。
合适的发色团的非限制性实例包括香豆素和香豆素衍生物。
基于香豆素的发色团的实例包括DCC和2,3,6,7-四氢-l 1- 氧代-lH,5H,l lH-[l]苯并吡喃并[6,7,8-ij]喹嗪-10-甲酸。其他合适的发色团包括含重氮基的色原，诸如柠檬黄(tartrazine)。还有其他合适的发色团包括三芳基甲烷，包括下面提供的那些：
。
合适的发色团的其他非限定性实例包括下面提供的那些：
其他合适的发色团包括环状发色团，诸如下面提供的那些：
荧光团属于几种常见的化学类别，包括香豆素类、荧光素类(或荧光素衍生物和类似物)、罗丹明类、试卤灵类、发光体类和花菁类。荧光分子的额外实例可见于MolecularProbes Handbook — A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies,Molecular Probes, Eugene, OR, TheroFisher Scientific, 第11版。在其他实施方案中，所述荧光团选自呫吨衍生物、花菁衍生物、方酸衍生物、萘衍生物、香豆素衍生物、噁二唑衍生物、蒽衍生物、芘衍生物、噁嗪衍生物、吖啶衍生物、芳基次甲基衍生物和四吡咯衍生物。在其他实施方案中，所述荧光部分选自CF染料(可得自Biotium)，DRAQ和CyTRAK探针(可得自BioStatus)，BODIPY (可得自Invitrogen)，Alexa Fluor (可得自Invitrogen)，DyLight Fluor (例如DyLight 649) (可得自Thermo Scientific, Pierce)，Atto和Tracy(可得自Sigma Aldrich)，FluoProbes (可得自Interchim)，Abberior染料(可得自Abberior)，DY和MegaStokes染料(可得自Dyomics)，Sulfo Cy染料(可得自Cyandye)，HiLyte Fluor (可得自AnaSpec)，Seta、SeTau和Square染料(可得自SETA BioMedicals)，Quasar和Cal Fluor染料(可得自Biosearch Technologies)，SureLight染料(可得自APC,RPEPerCP, Phycobilisomes)(Columbia Biosciences)，和APC、APCXL、RPE、BPE (可得自Phyco-Biotech, Greensea, Prozyme, Flogen)。
合适的酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、神经氨酸酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶或β-内酰胺酶。在其他实施方案中，酶包括氧化还原酶或过氧化物酶(例如HRP，AP)。参考本文中的图14进一步说明酶作为报告子部分的用途。其中，一对点击缀合物的第二成员包含式(IV)的化合物，其中Z是酶，特别是碱性磷酸酶。如本文将进一步理解，可通过引入另外的碱性磷酸酶报告子(色原、荧光团)来检测所得的点击加合物。
在一些实施方案中，所述报告子部分是螯合剂或螯合试剂，其可以在镧系元素(例如铕)存在的情况下螯合。不希望受任何特定理论束缚，据信可以使用电感耦合等离子体质谱成像(ICP-MSI)检测镧系元素原子。此外，可以使用时间分辨荧光显微镜检测镧系元素，所述时间分辨荧光显微镜利用与常规荧光团相比镧系元素发光的相对长的寿命。为了显现镧系元素，必须存在天线配体以吸收能量并将能量转移至通常吸收不良的镧系元素。DBCO-叠氮化物点击反应的反应产物能够充当天线配体，大大简化了这些系统的设计。
包含与螯合剂部分缀合的叠氮化物反应性基团的式(IV)的化合物的实例如下所示：
。
在一些具体实施方案中，式(IV)的点击缀合物的报告子部分的部分(Z)选自：
在一些实施方案中，式(IV)的化合物包含式(IVa)的式：
其中A如上所述。尽管式(IVa)描绘了所述化合物具有包含PEG接头，但其他合适的接头可以被取代。
在一些实施方案中，式(IV)的化合物包含式(IVb)的式：
其中A如上所述。尽管式(IVb)描绘了所述化合物具有包含PEG接头，但其他合适的接头可以被取代。
在一些实施方案中，式(IV)的化合物包含式(IVc)的式：
其中A如上所述。尽管式(IVc)描绘了所述化合物具有包含PEG接头，但其他合适的接头可以被取代。
在一些实施方案中，式(IV)的化合物包含式(IVd)的式：
其中A如上所述。尽管式(IVd)描绘了所述化合物具有包含PEG接头，但其他合适的接头可以被取代。
式(IV)的缀合物的具体非限制性实例包括以下：
式(V)的缀合物的非限制性实例如下所说明：
。
式(IV)的报告子部分化合物可以根据本领域普通技术人员已知的方法合成。用于将NHS酯与胺偶联的合成方法的实例。该程序可应用于含有胺或NHS官能团的任何酪酰胺或醌甲基化物前体与含有胺或NHS酯官能团的点击配偶体的反应。其也可应用于含有胺或NHS官能团的报告子基团(色原、半抗原等)与含有胺或NHS酯官能团的点击配偶体的反应。
酪酰胺-peg5-DBCO。将酪酰胺(1.1当量, 110 mg, 0.79 mmol)溶解于DMSO (3mL)中，随后添加三乙胺(5.0当量, 360 mg, 3.6 mmol)。然后添加DBCO-peg5-DBCO (1.0当量, 500 mg, 0.72 mmol)，并将所得反应混合物在室温下搅拌1小时。将反应混合物用MeOH(2 mL)稀释，并将所得混合物通过制备型RP-HPLC (C18；40 mL/min；0.05% TFA，在H2O:MeCN 95:5至5:95中，经40分钟)纯化，以便在高真空下除去溶剂之后，得到作为无色玻璃状物的酪酰胺-peg5-DBCO (450 mg, 87%产率)。MS (ESI) m/z (M+H)+ C40H50N3O9+的计算值716.4，实测值716.6。
点击缀合物对的偶联
技术人员将认识到，本文公开的点击缀合物适合于与彼此偶联以形成“点击加合物”。技术人员还将认识到，为了使一对点击缀合物中的一个成员与该对点击缀合物中的另一个成员反应、且因此形成共价键，该对点击缀合物的两个成员必须具有能够与彼此反应的反应性官能团。下面的表格例举了不同对的反应性官能团，其将与彼此反应以形成共价键。
一对点击缀合物的第一成员上的反应性官能团 一对点击缀合物的第二成员上的反应性官能团
DBCO 叠氮化物
烯烃 四嗪
TCO 四嗪
马来酰亚胺 硫醇
DBCO 1,3-硝酮
醛或酮 肼
醛或酮 羟胺
叠氮化物 DBCO
四嗪 TCO
硫醇 马来酰亚胺
1,3-硝酮 DBCO
肼 醛或酮
羟胺 醛或酮
四嗪 烯烃
具有这些反应性官能团的点击缀合物对的具体非限制性实例说明于图3和4中。具体而言，图3提供了点击缀合物对的实例，其中每对点击缀合物的一个成员包含式(II)的化合物。图4也提供了点击缀合物对的实例，其中每对点击缀合物的一个成员包含式(III)的化合物。
在一些实施方案中，点击缀合物经由“张力促进的叠氮化物-炔烃环加成”(SPAAC)或“TCO-四嗪连接”(TTL)偶联。SPAAC涉及叠氮化物和张力炔烃之间的反应，其高能量允许在Cu(I)催化剂(传统叠氮化物-炔烃“点击”化学法所需)不存在的情况下发生1,3-偶极环加成。在一些实施方案中，二苯并环辛炔由于其商业可得性和文献先例而用作张力的环辛炔。TTL利用反式环辛烯和四嗪之间的反应以形成二氢哒嗪键。这些试剂也是商业可得的并且已经显示与SPAAC系统正交反应。
以下示意图进一步说明了包含不同反应性官能团的点击缀合物对的偶联。在下面的方案中，提供了该对点击缀合物的一个成员作为固定的组织-点击缀合物复合物。如本文将进一步描述，固定的组织-点击缀合物复合物通过如下形成：具有式(II)或(III)的点击缀合物与适当的酶的反应，且随后将由其生成的反应性中间体与组织偶联。
例如，方案2说明了具有DBCO反应性官能团的固定的组织-点击缀合物复合物与包含反应性叠氮化物基团和至少一个报告子部分Z的式(IV)的第二点击缀合物之间的反应。在一些实施方案中，所得加合物包含一个报告子部分。在其他实施方案中，所得加合物包含至少两个报告子部分，诸如通过支架(例如赖氨酸接头或树枝状分子)接合。在一些实施方案中，至少一个报告子部分Z是发色团。在一些实施方案中，至少一个发色团选自TAMRA、Cy5、Dabsyl和Dabcyl。在一些实施方案中，所述加合物包含两个TAMRA发色团，诸如经由赖氨酸连接。
同样，方案3说明了具有TCO反应性官能团的固定的组织-点击缀合物复合物与包含反应性四嗪基团和至少一个报告子部分Z的式(IV)的第二点击缀合物之间的反应。在一些实施方案中，所得加合物包含一个报告子部分。在其他实施方案中，所得加合物包含至少两个报告子部分，诸如通过支架(例如赖氨酸接头或树枝状分子)接合。在一些实施方案中，至少一个报告子部分Z是发色团。在一些实施方案中，至少一个发色团选自TAMRA、Cy5、Dabsyl和Dabcyl。在一些实施方案中，所述加合物包含两个TAMRA发色团，诸如经由赖氨酸连接。
方案4再次说明了具有马来酰亚胺(malemide)反应性官能团的固定的组织-点击缀合物复合物与包含反应性硫醇基团和至少一个报告子部分Z的式(IV)的第二点击缀合物之间的反应。在一些实施方案中，所得加合物包含一个报告子部分。在其他实施方案中，所得加合物包含至少两个报告子部分，诸如通过支架(例如赖氨酸接头或树枝状分子)接合。在一些实施方案中，至少一个报告子部分Z是发色团。在一些实施方案中，至少一个发色团选自TAMRA、Cy5、Dabsyl和Dabcyl。在一些实施方案中，所述加合物包含两个TAMRA发色团，诸如经由赖氨酸连接。
方案5说明了具有DBCO反应性官能团的固定的组织-点击缀合物复合物与包含反应性1,3-硝酮基团和至少一个报告子部分Z的式(IV)的第二点击缀合物之间的反应。在一些实施方案中，所得加合物包含一个报告子部分。在其他实施方案中，所得加合物包含至少两个报告子部分，诸如通过支架(例如赖氨酸接头或树枝状分子)接合。在一些实施方案中，至少一个报告子部分Z是发色团。在一些实施方案中，至少一个发色团选自TAMRA、Cy5、Dabsyl和Dabcyl。在一些实施方案中，所述加合物包含两个TAMRA发色团，诸如经由赖氨酸连接。
方案6说明了具有醛反应性官能团的固定的组织-点击缀合物与包含反应性肼基团和至少一个报告子部分Z的式(IV)的第二点击缀合物之间的反应。在一些实施方案中，所得加合物包含一个报告子部分。在其他实施方案中，所得加合物包含至少两个报告子部分，诸如通过支架(例如赖氨酸接头或树枝状分子)接合。在一些实施方案中，至少一个报告子部分Z是发色团。在一些实施方案中，至少一个发色团选自TAMRA、Cy5、Dabsyl和Dabcyl。在一些实施方案中，所述加合物包含两个TAMRA发色团，诸如经由赖氨酸连接。
方案7说明了具有醛反应性官能团的固定的组织-点击缀合物与包含反应性羟胺基团和至少一个报告子部分Z的式(IV)的第二点击缀合物之间的反应。在一些实施方案中，所得加合物包含一个报告子部分。在其他实施方案中，所得加合物包含至少两个报告子部分，诸如通过支架(例如赖氨酸接头或树枝状分子)接合。在一些实施方案中，至少一个报告子部分Z是发色团。在一些实施方案中，至少一个发色团选自TAMRA、Cy5、Dabsyl和Dabcyl。在一些实施方案中，所述加合物包含两个TAMRA发色团，诸如经由赖氨酸连接。
方案8说明了具有DBCO反应性官能团的固定的组织-点击缀合物复合物与包含反应性叠氮化物基团和作为报告子Z的螯合剂的式(IV)的第二点击缀合物之间的反应。在一些实施方案中，所得中间体加合物包含螯合剂，其当引入镧系元素时形成适合于用MSI检测的螯合的加合物络合物。
方案9A说明了具有DBCO反应性官能团的固定的组织-点击缀合物复合物和包含与树枝状分子偶联的反应性叠氮化物基团的式(IV)或式(V)的第二点击缀合物之间的反应，所述树枝状分子与两个、四个或八个报告子部分偶联，如所示。不希望受任何特定理论束缚，据信树枝状分子的使用允许并入多个报告子(可以是相同或不同的)，因此提供显著的信号扩增。
方案9B说明了具有DBCO反应性官能团的固定的组织-点击缀合物复合物和包含与树枝状分子(PAMAM)偶联的反应性叠氮化物基团的式(V)的第二点击缀合物之间的反应，所述树枝状分子与四个报告子部分Z偶联。
方案10说明了具有DBCO反应性官能团的固定的组织-点击缀合物复合物和包含与包含两个发色团的Z基团偶联的反应性叠氮化物基团的式(V)的第二点击缀合物之间的反应，其中两个发色团经由赖氨酸基团连接。尽管所述色原被描述为相同，但技术人员将认识到经由赖氨酸基团连接的色原可以是不同的。
固定的组织-点击缀合物复合物和它们与包含特异性报告子部分的点击缀合物的反应的具体实例示于图5和6中。
使用点击缀合物检测样品中的靶标的方法
本公开还提供了使用任何点击缀合物的配对检测组织样品内的一种或多种靶标的方法。尽管本文中某些公开的实施方案、实施例或附图可以涉及在IHC测定中结合使用点击缀合物，但技术人员将理解，点击缀合物也可以用于原位杂交(ISH)测定或IHC和ISH测定的任何组合中。技术人员还将理解，点击缀合物可以用于单纯测定和多重测定两者中。
本文描述的方法涉及适用于生物测定的点击缀合物对。在那些测定中，特定对点击缀合物的一个成员(或“配偶体”)包含式(II)或(III)的缀合物，且该对点击缀合物的另一个成员包含式(IV)或式(V)的缀合物。通常，使用QMSA或TSA将一对点击缀合物的第一成员共价沉积至组织上。然后，将包含报告子分子(即发色团、荧光团、酶、半抗原)的该对点击缀合物的第二成员应用于组织。两个“点击”配偶体之间的“点击”反应迅速发生，在QMSA或TSA化学品决定的位置将报告子分子共价结合至组织。此外，且如本文所示，本公开的扩增方法允许报告子部分与QMSA或TSA测定条件分离，据信其增强信号强度。
例如，图1A、1B、2A和2B说明具有组织反应性部分的一对点击缀合物的第一成员(10, 20)和靶标结合的酶(11, 21)之间的反应，以形成固定的组织-点击缀合物复合物(13, 23)。扩增过程的该第一部分类似于QMSA和TSA扩增过程中使用的部分。图1A、1B、2A和2B还说明固定的组织-点击缀合物(13, 23)复合物与该对点击缀合物的第二成员(14, 24)之间的后续反应，以提供包含可检测的报告子部分的固定的组织-点击加合物复合物(15,25)。
参考图1A，使包含反应性官能团的式(II)的化合物(10)与靶标结合的酶(11)接触以产生活性中间体(12)。在该实例中，反应性中间体(醌甲基化物)与组织样品上或组织内的亲核试剂形成共价键，因此提供固定的组织-点击缀合物复合物(13)。然后固定的组织-点击缀合物复合物可以与式(IV)的化合物(14)反应，条件是点击缀合物10和点击缀合物14具有可以与彼此反应以形成共价键的反应性官能团。固定的组织-点击缀合物复合物13和点击缀合物14的反应产物产生固定的组织-点击加合物复合物15。可以凭借从连接的报告子部分传递的信号检测组织-点击加合物复合物15。在一些实施方案中，所述报告子部分是至少一个发色团。
图1B说明具有与DBCO反应性官能团连接的醌甲基化物前体部分的式(II)的特定化合物和靶标结合的酶之间的反应以产生反应性醌甲基化物中间体，随后该反应性中间体与生物样品上或生物样品内的亲核试剂偶联。更具体地，碱性磷酸酶识别并裂解来自点击缀合物的所示醌甲基化物前体部分的磷酸基团，导致离去基团的抛出，并形成相应的醌甲基化物中间体。然后固定的组织-点击缀合物可以与式(IV)的化合物(诸如包含叠氮化物基团和发色团的化合物)反应，如所说明。所得产物是具有所描绘可检测发色团的组织-点击加合物复合物。
类似地，且参考图2A，使包含反应性官能团的式(III)的化合物(20)与靶标结合的酶(21)接触，以产生反应性中间体(22)，即酪酰胺自由基物质(或其衍生物)。然后，酪酰胺自由基中间体可以与组织样品形成共价键，因此提供固定的组织-点击缀合物复合物(23)。然后固定的组织-点击缀合物复合物可以与式(IV)的化合物(24)反应，条件是点击缀合物20和24具有可以与彼此反应以形成共价键的反应性官能团。固定的组织-点击缀合物复合物23和点击缀合物24的反应产物产生组织-点击加合物复合物25。
图2B说明式(III)的特定化合物(即具有与DBCO反应性官能团连接的酪酰胺部分的化合物)之间的反应。图4还说明靶标结合的酶以产生反应性酪酰胺自由基中间体，然后该中间体与生物样品偶联以形成固定的组织-点击缀合物复合物。然后固定的组织-点击缀合物复合物可以与式(IV)的化合物(诸如包含叠氮化物基团和发色团的化合物)反应，如所说明。所得产物是具有可检测发色团的组织-点击加合物复合物(25)。
在一些实施方案中，检测生物样品中的靶标的方法包括以下步骤：首先，使生物样品与对第一靶标特异性的第一检测探针接触。所述第一检测探针可以是一抗或核酸探针。随后，使样品与第一标记缀合物接触，所述第一标记缀合物包含第一酶。在一些实施方案中，所述第一标记缀合物是对一抗或与核酸探针缀合的标记物特异性的二抗。接下来，使生物样品与一对点击缀合物的第一成员接触，该对点击缀合物的第一成员具有式(II)或(III)的化合物中的任一个的结构。如本文所述，第一酶裂解该对点击缀合物的第一成员，由此将第一成员转化为反应性中间体，其靠近靶标或直接在靶标上共价结合生物样品。接下来，引入该对点击缀合物的第二成员，该对点击缀合物的第二成员包含第一报告子部分和第二反应性官能团，其中第一对点击缀合物的第二成员的第二反应性官能团能够与该对点击缀合物的第一成员的第一反应性官能团反应。该对点击缀合物的第二成员可以具有如式(IV)中所提供的结构。最后，检测来自第一报告子部分的信号。
参考图15，使用本文所述的点击缀合物检测组织样品内的一种或多种靶标的方法通常可分为两个阶段。在第一阶段中，组织样品内的每种靶标用酶标记(参见方框155和其中含有的步骤)。在第二阶段中，报告子部分直接沉积在每种靶标上或其附近(参见方框165和其中含有的步骤)，其中使用本文列举的一对点击缀合物(例如，包含组织反应性部分的部分且具有式(II)和(III)中的任一个的结构的第一缀合物和包含报告子部分且具有式(IV)的结构的第二缀合物)沉积报告子部分。技术人员将理解，可以在多重测定中重复这些一般步骤中的每一个(步骤170)以检测组织样品内的多种不同靶标。这些步骤各自将在本文进一步详细描述。
在一些实施方案中，且在引入任何检测试剂前，所述组织样品用酶失活组合物预处理以使内源性过氧化物酶活性基本上或完全失活。例如，在细胞或组织含有内源性过氧化物酶的情况下，HRP缀合的抗体的使用可以导致高的、非特异性背景染色。可以通过用如本文公开的酶失活组合物预处理样品来减少该非特异性背景。在一些实施方案中，所述样品仅用过氧化氢(约1重量％至约3重量％的适当的预处理溶液的)预处理以降低内源性过氧化物酶活性。
再次参考图15，使含有一种或多种靶标的组织样品与对第一靶标特异性的第一特异性结合部分接触，以提供第一特异性结合部分-靶标复合物(步骤100)。在一些实施方案中，所述第一特异性结合部分是一抗或抗体缀合物(例如未修饰的抗体或缀合至可检测标记物、诸如半抗原的抗体)。在其他实施方案中，所述第一特异性结合部分是缀合至可检测标记物、诸如半抗原的核酸探针。
随后，通过第一特异性结合部分，用第一酶标记第一特异性结合部分-靶标复合物(步骤110)。在一些实施方案中，靶标复合物的标记可以用二抗实现，所述二抗是抗-抗体的抗体(例如对一抗特异性的抗体，即抗-抗体的抗体)或抗-标记物抗体(例如抗-标记物抗体或抗-半抗原抗体)，所述二抗缀合至酶(例如HRP、AP等)。
然后使组织样品与第一对点击缀合物的第一成员接触，其中第一对点击缀合物的第一成员包含组织反应性部分和第一反应性官能团(步骤120)。第一对点击缀合物的第一成员可以具有如式(II)或(III)中任一个中提供的式。第一对点击缀合物的第一成员与第一酶相互作用/反应以形成反应性物质或中间体，其中反应性物质或中间体能够直接在第一靶标上或第一靶标附近直接或间接与组织样品形成共价键。接下来，引入第一对点击缀合物的第二成员(步骤130)，第一对点击缀合物的第二成员包含第一报告子部分和第二反应性官能团，其中第一对点击缀合物的第二成员的第二反应性官能团能够与第一对点击缀合物的第一成员的第一反应性官能团反应。第一对点击缀合物的第二成员可以具有如式(IV)中所提供的结构。最后，检测来自所述第一报告子部分的信号(例如明场显微术)(步骤140)。在一些实施方案中，所述第一报告子部分是发色团。在一些实施方案中，第一对点击缀合物的第二成员缀合至至少两个发色团，且其中第一对点击缀合物的第二成员具有式(V)的结构。
可以对样品内的任何数量的靶标重复上述过程(步骤170)。在一些实施方案中，可以引入酶失活组合物以基本上或完全失活来自任何上游步骤的任何酶。然后，所述组织样品可以与对第二靶标特异性的第二特异性结合部分接触，以提供第二特异性结合部分靶标复合物(步骤100)。随后，通过第二特异性结合部分，用第二酶标记第二特异性结合部分-靶标复合物(步骤110)。然后使组织样品与第二对点击缀合物的第一成员接触，其中第二对点击缀合物的第一成员包含醌甲基化物前体或酪酰胺部分和第一反应性官能团(步骤120)。第二对点击缀合物的第一成员与第二酶相互作用以形成反应性物质，其中所述反应性物质能够直接在第二靶标上或在第二靶标附近形成共价键。第一对点击缀合物的第一成员可以具有如式(II)或(III)中任一个中提供的式。接下来，引入第二对点击缀合物的第二成员(步骤130)，第二对点击缀合物的第二成员包含第二报告子部分和第二反应性官能团，其中第二对点击缀合物的第二成员的第二反应性官能团能够与第二对点击缀合物的第一成员的第一反应性官能团反应。第二对点击缀合物的第二成员可以具有如式(IV)中所提供的结构。然后检测第二报告子部分(步骤140)。可以对组织样品内的第三、第四或第n个靶标重复该过程(步骤170)。
技术人员将理解，图15中所说明的步骤可以依次地(或连续地)或基本上同时地进行。例如，所述组织样品可以在步骤100与两个特异性结合部分同时接触(其中每个特异性结合部分对特定靶标是特异性的)；且然后每个特异性结合部分-靶标复合物在步骤110用不同的酶同时标记。在这些实施方案中，在步骤100或110使用的任一试剂可以作为试剂的“合并物”或“混合物”提供。或者，可以沉积第一特异性结合部分(步骤100)，随后标记该第一特异性结合部分-靶标复合物(步骤110)。在引入任何点击缀合物前，步骤100和110可以连续重复任何次数(步骤150)。
随后，然后可以使具有多种酶标记的靶标复合物的组织样品(步骤100、110和150)与多种点击缀合物接触。在步骤120可以同时添加点击缀合物对的第一成员，然后在步骤130同时引入点击缀合物对的第二成员。或者，可以引入第一对点击缀合物的第一成员，随后引入第一对点击缀合物的第二成员，并且点击缀合物对的第一和第二成员的依次引入可以重复任何次数(步骤160)，以便为每种标记的靶标复合物引入报告子部分。
有利地，对于刚刚描述的方法，所述第一酶和所述第二酶是不同的酶。例如，所述第一酶可以是磷酸酶或磷酸二酯酶，且所述第二酶可以是过氧化物酶。在某些实施方案中，所述第一酶是碱性磷酸酶，且所述第二酶是辣根过氧化物酶。还有利地，第一酶不与第二对点击缀合物的第一成员相互作用，以便将源自第二对点击缀合物的第一成员的反应性中间体沉积至第一靶标附近。
自动化
本公开的测定和方法可以是自动化的并且可以与样本处理设备组合。所述样本处理设备可以是自动化设备，诸如由Ventana Medical Systems, Inc.销售的BENCHMARK XT仪器、SYMPHONY仪器、BENCHMARK ULTRA仪器。Ventana Medical Systems, Inc.是公开用于进行自动化分析的系统和方法的许多美国专利的受让人，包括美国专利号5,650,327、5,654,200、6,296,809、6,352,861、6,827,901和6,943,029以及美国公开专利申请号20030211630和20040052685，其各自以其整体通过引用并入本文。或者，可以手动处理样本。
所述样本处理设备可以将固定剂应用于样本。固定剂可包括交联剂(诸如醛，例如甲醛、多聚甲醛和戊二醛，以及非醛类交联剂)、氧化剂(例如，金属离子和络合物诸如四氧化锇和铬酸)、蛋白质变性剂(例如，乙酸、甲醇和乙醇)、机制未知的固定剂(例如氯化汞、丙酮和苦味酸)、组合试剂(例如卡诺固定剂、甲氧基乙酰苯胺(methacarn)、布安液、B5固定剂、罗斯曼氏液和让德尔氏液)、微波和混合固定剂(例如，排除体积固定和蒸气固定)。
如果样本是包埋在石蜡中的样品，则可以用样本处理设备使用适当的脱蜡流体将样品脱蜡。在废物去除剂去除脱蜡流体后，可以连续地向样本应用任何数目的物质。所述物质可以用于预处理(例如，蛋白-交联，暴露核酸等)，变性，杂交，洗涤(例如，严格洗涤)，检测(如将视觉或标记分子连接至探针)，扩增(例如扩增蛋白，基因等)，复染，盖玻片等。
样本处理设备可以将宽范围的物质应用于样本。所述物质包括但不限于染色剂、探针、试剂、漂洗剂和/或调理剂。所述物质可以是流体(例如，气体、液体或气体/液体混合物)等。所述流体可以是溶剂(例如极性溶剂、非极性溶剂等)、溶液(例如水溶液或其他类型的溶液)等。试剂可以包括但不限于，染色剂、润湿剂、抗体(例如单克隆抗体、多克隆抗体等)、抗原回收流体(例如基于水性或非水性的抗原修复溶液、抗原回收缓冲液等)等。探针可以是分离的核酸或分离的合成寡核苷酸，其附接至可检测的标记物。标记物可以包括放射性同位素、酶底物、辅因子、配体、化学发光或荧光试剂、半抗原和酶。
在处理样本之后，用户可以将携带样本的载片输送至成像设备。此处使用的成像设备是明场成像仪载片扫描仪。一种明场成像仪是由Ventana Medical Systems, Inc.销售的iScan Coreo™明场扫描仪。在自动化实施方案中，成像设备是如标题为IMAGINGSYSTEM AND TECHNIQUES的国际专利申请号：PCT/US2010/002772 (专利公开号：WO/2011/049608)中公开或2014年2月3日提交的标题为IMAGING SYSTEMS, CASSETTES, ANDMETHODS OF USING THE SAME的美国专利申请公开号2014/0178169中公开的数字病理学装置。国际专利申请号PCT/US2010/002772和美国专利申请公开号2014/0178169以其整体通过引用并入。在其他实施方案中，所述成像设备包括偶联至显微镜的数字相机。
复染
复染是在样品已经用试剂染色以检测一种或多种靶标之后进行后处理、使得它们的结构可更容易地在显微镜下被观察到的方法。例如，在盖上盖玻片之前任选使用复染剂以使得免疫组织化学染色剂更加清晰。复染剂的颜色与初始染色剂不同。众多复染剂是众所周知的，诸如苏木精、伊红、甲基绿、亚甲蓝、姬姆萨染料、阿辛蓝和核固红。DAPI (4',6-二脒基-2-苯基吲哚)是可以使用的荧光染料。
在一些实例中，多于一种染色剂可以混合在一起以产生复染剂。这提供了灵活性以及选择染色剂的能力。例如，可以对混合物选择具有特定属性、但还不具有不同的期望属性的第一染色剂。可向混合物中添加第二染色剂，其显示出缺少的期望属性。例如，甲苯胺蓝、DAPI和滂胺天蓝可以混合在一起以形成复染剂。
检测和/或成像
公开的实施方案的某些方面或全部方面可以通过计算机分析和/或图像分析系统而自动化且得到促进。在一些应用中，测量精确的颜色或荧光比率。在某些实施方案中，光显微术用于图像分析。某些公开的实施方案涉及获取数字图像。这可通过将数字照相机与显微镜联用来完成。使用图像分析软件来分析染色样品所获得的数字图像。颜色或荧光可以以数种不同方式来测量。例如，颜色可测量为红色、蓝色和绿色值；色调、饱和度和强度值；和/或使用光谱成像照相机来测量特定波长或者波长范围。也可定性和半定量评估该样品。定性评价包括评价染色强度、鉴定阳性染色的细胞和在染色中涉及的细胞内区室以及评估总体样品或者载片品质。在测试样品上进行分开的评估，且该分析可包括与已知的平均值进行比较以确定所述样品是否呈现异常状态。
试剂盒
在一些实施方案中，所述点击缀合物可以用作“检测试剂盒”的一部分。在一些实施方案中，所述检测试剂盒至少包含第一容器中的第一点击缀合物和第二容器中的第二点击缀合物。所述第一点击缀合物是一对点击缀合物的具有第一反应性官能团的第一成员；且所述第二点击缀合物是一对点击缀合物的具有第二反应性官能团的第二成员，其中第一和第二反应性官能团能够与彼此反应以形成共价键。在一些实施方案中，所述第一点击缀合物选自具有式(II)或(III)中任一个的结构的化合物。在一些实施方案中，所述第二点击缀合物选自具有式(IV)或式(V)的结构的化合物。
所述检测试剂盒还可以包含包括特异性结合部分的其他试剂和对特异性结合部分特异性的二抗，所述二抗缀合至可检测标记物。当然，任何试剂盒可以包括其他试剂，包括缓冲剂；复染剂；酶失活组合物；脱蜡溶液等，如用于手动或自动化靶标检测所需的。所述试剂盒还可以包括用于使用试剂盒的任何组分的说明书，包括将试剂盒组分应用于组织样品以实现其中的一种或多种靶标的检测的方法。
样品和靶标
样品包括生物学组分且通常怀疑包括一种或者多种目标靶标分子。靶标分子可以位于细胞表面上且细胞可在混悬液或者在组织切片中。靶标分子也可在细胞内且在细胞裂解或者细胞经探针渗透之后来检测。本领域普通技术人员将认识到检测样品中靶标分子的方法将取决于使用的样品和探针的类型而改变。收集和制备样品的方法是本领域已知的。
在所述方法的实施方式中且与本文公开的组合物一起使用的样品诸如组织或者其他生物样品可由普通技术人员使用本领域已知的任何方法来制备。可以从用于常规筛选的受试者或从被怀疑具有病症，诸如遗传异常、感染或瘤形成的受试者获得样品。公开的方法的所描述的实施方案也可以应用于被称为“正常”样品的不具有遗传异常、疾病、病症等的样品。此类正常样品可用作(除了别的之外)用于与其他样品比较的对照。样品可针对许多不同目的来分析。例如，样品可用于科学研究或用于诊断可疑疾病，或用作用于治疗成功、存活等的预后指标。
样品可包括可由探针或报告子分子特异性结合的多种靶标。所述靶标可以是核酸序列或蛋白。当涉及靶标蛋白时，在本公开通篇应当理解的是与该蛋白相关的核酸序列也可用作为靶标。在一些实例中，所述靶标是蛋白或核酸分子，其来自病原体诸如病毒、细菌或细胞内寄生物，诸如来自病毒基因组。例如，靶标蛋白可由与疾病相关(例如，与其相关、有因果关系等)的靶标核酸序列产生。
靶标核酸序列可在尺寸上实质性改变。非限制地，所述核酸序列可具有可变数目的核酸残基。例如，靶标核酸序列可具有至少约10个核酸残基，或至少约20、30、50、100、150、500、1000个残基。类似地，靶标多肽可在尺寸上实质性改变。非无限制地，所述靶标多肽将包含至少一个表位，其结合肽特异性抗体或者其片段。在一些实施方案中，该多肽可包含至少两个表位，其结合肽特异性抗体或者其片段。
在具体的非限制性实例中，靶标蛋白由与赘生物(例如，癌症)相关的靶标核酸序列(例如基因组靶标核酸序列)产生。已经在赘生细胞中鉴定出许多染色体异常(包括易位和其他重排、扩增或者缺失)，特别是在癌细胞诸如B细胞和T细胞白血病、淋巴瘤、乳腺癌、结肠癌、神经学癌症等中。因此，在一些实例中，至少部分的靶标分子由在样品中至少一种细胞子集中扩增或缺失的核酸序列(例如基因组靶标核酸序列)产生。
已知致癌基因是几种人类恶性肿瘤的原因。例如，涉及位于染色体18q11.2的断裂点区的SYT基因的染色体重排在滑膜肉瘤软组织肿瘤中是常见的。可例如使用具有不同标记物的探针来鉴定t(18q11.2)易位：第一探针包括由从SYT基因向远端伸展的靶标核酸序列产生的FPC核酸分子，且第二探针包括由向SYT基因3'或近端伸展的靶标核酸序列产生的FPC核酸。当对应于这些靶标核酸序列(例如基因组靶标核酸序列)的探针用于原位杂交程序中时，在SYT基因区缺失t(18q11.2)的正常细胞显示出两个融合(由邻近的两个标记物生成)信号，反映出SYT的两个完整拷贝。具有t(18q11.2)的异常细胞显示出单一的融合信号。
在其他实例中，选择由核酸序列(例如基因组靶标核酸序列)产生的靶标蛋白质，所述核酸序列为在恶性细胞中缺失(丢失)的肿瘤抑制基因。例如，位于染色体9p21的p16区(包括D9S1749、D9S1747、p16(INK4A)、p14(ARF)、D9S1748、p15(INK4B)和D9S1752)在某些膀胱癌中缺失。涉及染色体1的短臂的远端区(包括例如，SHGC57243、TP73、EGFL3、ABL2、ANGPTL1和SHGC-1322)以及染色体19的着丝粒周围(pericentromeric)区(例如19p13-19q13)(包括例如，MAN2B1、ZNF443、ZNF44、CRX、GLTSCR2和GLTSCR1)的染色体缺失是中枢神经系统的某些类型的实体瘤的特征性分子特征。
提供前面提及的实例以仅用于说明的目的且不意在进行限制。与赘生转化和/或生长相关的许多其他细胞遗传异常是本领域普通技术人员已知的。由核酸序列(例如基因组靶标核酸序列)产生的靶标蛋白(已经与赘生转化相关且可用于公开的方法)也包括EGFR基因(7p12; 例如，GENBANK™登记号NC-000007，核苷酸55054219-55242525)，C-MYC基因(8q24.21; 例如，GENBANK™登记号NC-000008，核苷酸128817498-128822856), D5S271(5p15.2)，脂蛋白脂肪酶(LPL)基因(8p22; 例如，GENBANK™登记号NC-000008，核苷酸19841058-19869049)，RB1 (13q14; 例如，GENBANK™登记号NC-000013，核苷酸47775912-47954023)，p53 (17p13.1; 例如，GENBANK™登记号NC-000017，互补序列，核苷酸7512464-7531642)), N-MYC (2p24; 例如，GENBANK™登记号NC-000002，互补序列，核苷酸151835231-151854620), CHOP (12q13; 例如，GENBANK™登记号NC-000012，互补序列，核苷酸56196638-56200567), FUS (16p11.2; 例如，GENBANK™登记号NC-000016，核苷酸31098954-31110601), FKHR (13p14; 例如，GENBANK™登记号NC-000013，互补序列，核苷酸40027817-40138734)，以及，例如：ALK (2p23; 例如，GENBANK™登记号NC-000002，互补序列，核苷酸29269144-29997936), Ig重链；CCND1 (11q13; 例如，GENBANK™登记号NC-000011，核苷酸69165054.69178423)，BCL2 (18q21.3; 例如，GENBANK™登记号NC-000018，互补序列，核苷酸58941559-59137593)，BCL6 (3q27; 例如，GENBANK™登记号NC-000003，互补序列，核苷酸188921859-188946169)，MALF1, AP1 (1p32-p31; 例如，GENBANK™登记号NC-000001，互补序列，核苷酸59019051-59022373)，TOP2A (17q21-q22; 例如，GENBANK™登记号NC-000017，互补序列，核苷酸35798321-35827695)，TMPRSS (21q22.3; 例如，GENBANK™登记号NC-000021，互补序列，核苷酸41758351-41801948)，ERG (21q22.3; 例如，GENBANK™登记号NC-000021，互补序列，核苷酸38675671-38955488)；ETV1 (7p21.3;例如，GENBANK™登记号NC-000007，互补序列，核苷酸13897379-13995289)，EWS (22q12.2;例如，GENBANK™登记号NC-000022，核苷酸27994271-28026505)；FLI1 (11q24.1-q24.3;例如，GENBANK™登记号NC-000011，核苷酸128069199-128187521)，PAX3 (2q35-q37; 例如，GENBANK™登记号NC-000002，互补序列，核苷酸222772851-222871944)，PAX7 (1p36.2-p36.12; 例如，GENBANK™登记号NC-000001，核苷酸18830087-18935219)，PTEN (10q23.3;例如，GENBANK™登记号NC-000010，核苷酸89613175-89716382)，AKT2 (19q13.1-q13.2;例如，GENBANK™登记号NC-000019，互补序列，核苷酸45431556-45483036)，MYCL1(1p34.2; 例如，GENBANK™登记号NC-000001，互补序列，核苷酸40133685-40140274)，REL(2p13-p12; 例如，GENBANK™登记号NC-000002，核苷酸60962256-61003682)和CSF1R(5q33-q35; 例如，GENBANK™登记号NC-000005，互补序列，核苷酸149413051-149473128)。
在其他实例中，靶标蛋白选自与疾病或病况相关的病毒或者其他微生物。在细胞或者组织样品中的病毒或微生物来源的靶标核酸序列(例如，基因组靶标核酸序列)的检出指示生物体的存在。例如，靶标肽、多肽或蛋白可选自致癌或致病性病毒、细菌或细胞内寄生物(诸如恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)和其他疟原虫属物种、利什曼原虫属(种)、小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、痢疾内变形虫(Entamoeba histolytica)和蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia)以及弓形虫属、艾美球虫属、泰勒虫属和巴贝西虫属物种)的基因组。
在一些实例中，靶标蛋白由来自病毒基因组的核酸序列(例如基因组靶标核酸序列)产生。示例性病毒和相应的基因组序列(括号内为GENBANK™ RefSeq登记号)包括人腺病毒A (NC_001460)、人腺病毒B (NC_004001)、人腺病毒C (NC_001405)、人腺病毒D (NC_002067)、人腺病毒E (NC_003266)、人腺病毒F (NC_001454)、人星形病毒(NC_001943)、人BK多瘤病毒(V01109；GI:60851)、人博卡病毒(NC_007455)、人冠状病毒229E (NC_002645)、人冠状病毒HKU1 (NC_006577)、人冠状病毒NL63 (NC_005831)、人冠状病毒OC43 (NC_005147)、人肠病毒A (NC_001612)、人肠病毒B (NC_001472)、人肠病毒C (NC_001428)、人肠病毒D (NC_001430)、人红细胞病毒V9 (NC_004295)、人泡沫病毒(NC_001736)、人疱疹病毒1 (单纯疱疹病毒类型1)(NC_001806)、人疱疹病毒2 (单纯疱疹病毒类型2)(NC_001798)、人疱疹病毒3 (水痘带状疱疹病毒)(NC_001348)、人疱疹病毒4类型1 (EB病毒类型1)(NC_007605)、人疱疹病毒4类型2 (EB病毒类型2)(NC_009334)、人疱疹病毒5株AD 169(NC_001347)、人疱疹病毒5株Merlin株(NC_006273)、人疱疹病毒6A (NC_001664)、人疱疹病毒6B (NC_000898)、人疱疹病毒7 (NC_001716)、人疱疹病毒8类型M (NC_003409)、人疱疹病毒8类型P (NC_009333)、人免疫缺陷病毒1 (NC_001802)、人免疫缺陷病毒2 (NC_001722)、人偏肺病毒(NC_004148)、人乳头瘤病毒-1 (NC_001356)、人乳头瘤病毒-18 (NC_001357)、人乳头瘤病毒-2 (NC_001352)、人乳头瘤病毒-54 (NC_001676)、人乳头瘤病毒-61 (NC_001694)、人乳头瘤病毒-cand90 (NC_004104)、人乳头瘤病毒RTRX7 (NC_004761)、人乳头瘤病毒类型10 (NC_001576)、人乳头瘤病毒类型101 (NC_008189)、人乳头瘤病毒类型103 (NC_008188)、人乳头瘤病毒类型107 (NC_009239)、人乳头瘤病毒类型16 (NC_001526)、人乳头瘤病毒类型24 (NC_001683)、人乳头瘤病毒类型26 (NC_001583)、人乳头瘤病毒类型32 (NC_001586)、人乳头瘤病毒类型34 (NC_001587)、人乳头瘤病毒类型4(NC_001457)、人乳头瘤病毒类型41 (NC_001354)、人乳头瘤病毒类型48 (NC_001690)、人乳头瘤病毒类型49 (NC_001591)、人乳头瘤病毒类型5 (NC_001531)、人乳头瘤病毒类型50(NC_001691)、人乳头瘤病毒类型53 (NC_001593)、人乳头瘤病毒类型60 (NC_001693)、人乳头瘤病毒类型63 (NC_001458)、人乳头瘤病毒类型6b (NC_001355)、人乳头瘤病毒类型7(NC_001595)、人乳头瘤病毒类型71 (NC_002644)、人乳头瘤病毒类型9 (NC_001596)、人乳头瘤病毒类型92 (NC_004500)、人乳头瘤病毒类型96 (NC_005134)、人副流感病毒1 (NC_003461)、人副流感病毒2 (NC_003443)、人副流感病毒3 (NC_001796)、人双埃可病毒(NC_001897)、人细小病毒4 (NC_007018)、人细小病毒B19 (NC_000883)、人呼吸道合胞病毒(NC_001781)、人鼻病毒A (NC_001617)、人鼻病毒B (NC_001490)、人泡沫反转录病毒(NC_001795)、人嗜T淋巴细胞病毒1 (NC_001436)、人嗜T淋巴细胞病毒2 (NC_001488)。
在某些实例中，靶标蛋白由来自致癌病毒诸如EB病毒(EBV)或人乳头瘤病毒(HPV，例如HPV16、HPV18)的核酸序列(例如基因组靶标核酸序列)产生。在其他实例中，由核酸序列(例如基因组靶标核酸序列)产生的靶标蛋白来自致病性病毒，诸如呼吸道合胞病毒、肝炎病毒(例如丙型肝炎病毒)、冠状病毒(例如SARS病毒)、腺病毒、多瘤病毒、巨细胞病毒(CMV)或者单纯疱疹病毒(HSV)。
实施例
本文呈现的非限制性实施例各自并入至少一对点击缀合物的使用。本申请人认为本文公开的点击缀合物适用于IHC测定，包括多重IHC测定和ISH测定，如以下实施例中所证实的。
通用免疫组织化学(IHC)方案
除非另有指定，否则所有IHC染色实验都在VENTANA BenchMark® XT自动化组织染色平台上实施，并且这些方案中使用的试剂来自Ventana Medical Systems, Inc. (Tucson,AZ, USA; “Ventana”)。多克隆山羊抗兔抗体、多克隆山羊抗小鼠抗体、辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)获得自Roche Diagnostics (德国曼海姆)。
进行以下常用步骤：(1)用EZ Prep去垢剂溶液(Ventana Medical Systems, Inc.(VMSI), #950-101)脱蜡(75℃；20分钟)；(2)用反应缓冲液(VMSI, #950-300)洗涤；(3)在细胞调理1 (VMSI #950-124)中的抗原修复(100℃；时间取决于目标抗原)；(4)洗涤(与步骤2相同)；(5)对于具有后续HRP检测步骤的方案，使用iVIEW抑制剂(VMSI, E253-2187)使内源性过氧化物酶失活(37℃；4分钟)；(6)洗涤(与步骤2相同)；(7)一抗孵育(抗靶标抗体)在37℃下进行一定时间，所述时间取决于一抗，范围为8-32分钟；(8)洗涤(与步骤2相同)；且(9)用缀合至酶(HRP或AP，37℃；8-12分钟)的山羊多克隆抗物种抗体进行二抗孵育。通过如步骤(2)中的洗涤，分开所有后续的试剂孵育步骤。如实施例1-6中所述检测靶标。
实施例1：用式(II)的化合物的“点击”扩增
用不同的式(II)的化合物的IHC“点击”扩增的三个实例说明于图7A、7B和7C。大体上，根据本文公开的方法进行每种IHC测定。在图7A、7B和7C中，首先使每个组织样品与对特定靶标特异性的一抗接触(图7A，CD8；图7B，Bcl6；和图7C，Ki67)。在引入相应的一抗后，每种抗体-靶标复合物用酶标记，诸如通过引入与碱性磷酸酶(AP)酶偶联的二抗(例如山羊抗兔抗体-AP缀合物或山羊抗小鼠抗体-AP缀合物)。
接下来，引入一对点击缀合物的第一成员并与每种AP标记的靶标反应。在图7A中，引入包含与DBCO反应性官能团连接的醌甲基化物前体的式(II)的化合物，并在与靶标结合的碱性磷酸酶反应之后形成醌甲基化物-DBCO组织缀合物复合物。随后，引入包含色原TAMRA和叠氮化物反应性官能团的式(IV)的缀合物并与组织缀合物复合物反应以形成可检测的组织-点击加合物复合物。图7A清楚地显示扁桃体组织样品内的CD8糖蛋白的染色。
在图7B中，引入包含与叠氮化物反应性官能团连接的醌甲基化物前体的式(II)的化合物，并在与靶标结合的碱性磷酸酶反应之后形成醌甲基化物-叠氮化物组织缀合物复合物。随后，引入包含色原TAMRA和DBCO反应性官能团的式(IV)的缀合物并与组织缀合物复合物反应以形成可检测的组织-点击加合物复合物。图7B清楚地显示扁桃体组织样品内的B细胞淋巴瘤6蛋白的染色。
在图7C中，引入包含与TCO反应性官能团连接的醌甲基化物前体的式(II)的化合物，并在与靶标结合的碱性磷酸酶反应之后形成醌甲基化物-TCO组织缀合物复合物。随后，引入包含色原TAMRA和四嗪反应性官能团的式(IV)的缀合物并与组织缀合物复合物反应以形成可检测的组织-点击加合物复合物。图7C清楚地显示扁桃体组织样品内的Ki67蛋白的染色。
实施例2：用式(III)的化合物的“点击”扩增
用不同的式(III)的化合物的IHC“点击”扩增的三个实例说明于图8A、8B和8C。大体上，根据本文公开的方法进行每种IHC测定。在图8A、8B和8C中，首先使每个组织样品与对特定靶标特异性的一抗接触(图8A，CD8；图8B，Bcl6；和图8C，Ki67)。在引入相应的一抗后，每种抗体-靶标复合物用酶标记，诸如通过引入与辣根过氧化物酶(HRP)酶偶联的二抗(例如山羊抗兔抗体-HRP缀合物或山羊抗小鼠抗体-HRP缀合物)。
接下来，引入一对点击缀合物的第一成员并与每种HRP标记的靶标反应。在图8A中，引入包含与叠氮化物反应性官能团连接的酪酰胺的式(III)的化合物，并在与靶标结合的HRP反应之后形成酪酰胺-叠氮化物组织缀合物复合物。随后，引入包含色原TAMRA和DBCO反应性官能团的式(IV)的化合物并与组织缀合物复合物反应以形成可检测的组织-点击加合物复合物。图8A清楚地显示扁桃体组织样品内的CD8糖蛋白的染色。
在图8B中，引入包含与DBCO反应性官能团连接的酪酰胺的式(III)的化合物，并在与靶标结合的HRP反应之后形成酪酰胺-DBCO组织缀合物复合物。随后，引入包含色原TAMRA和叠氮化物反应性官能团的式(IV)的化合物并与组织缀合物复合物反应以形成可检测的组织-点击加合物复合物。图8B清楚地显示扁桃体组织样品内的Ki67蛋白的染色。
在图8C中，引入包含与TCO反应性官能团连接的酪酰胺的式(III)的化合物，并在与靶标结合的HRP反应之后形成酪酰胺-TCO组织缀合物复合物。随后，引入包含色原TAMRA和四嗪反应性官能团的式(IV)的化合物并与组织缀合物复合物反应以形成可检测的组织-点击加合物复合物。图8C清楚地显示扁桃体组织样品内的CD8糖蛋白的染色。
实施例3
图9A、9B、9C和9D说明来自四种不同的IHC测定的结果。每种测定使用本文所述并例举于实施例1中的通用程序进行。如本文所应用，每种测定使用相同的式(II)的点击缀合物，即包含缀合至DBCO反应性官能团的酪酰胺部分的缀合物(“酪酰胺-DBCO”)。然而，使用四种不同的式(IV)的点击缀合物用于与酪酰胺-DBCO偶联，其各自具有与叠氮化物反应性官能团偶联的不同色原或显色系统。如图9A中所描绘，使酪酰胺-DBCO缀合物与式(IV)的点击缀合物反应，其中式(IV)的点击缀合物包含偶联的Cy5色原。如图9B中所描绘，使酪酰胺-DBCO缀合物与式(IV)的点击缀合物反应，其中式(IV)的点击缀合物包含偶联的Dabsyl色原。如图9C中所描绘，使酪酰胺-DBCO缀合物与式(IV)的点击缀合物反应，其中式(IV)的点击缀合物包含TAMRA色原和Dabcyl色原两者，其中两个色原经由赖氨酸支架偶联。如图9D中所描绘，使酪酰胺-DBCO缀合物与式(IV)的点击缀合物反应，其中式(IV)的点击缀合物包含偶联的TAMRA色原。因此，图9A至9D各自说明包含组织反应性前体部分和特定反应性官能团的点击缀合物物质可以与具有不同色原的不同式(IV)的化合物反应以将组织染色成不同颜色。
实施例4：在IHC测定中“传统”TSA与“点击”扩增的比较
图10比较地说明用DAB对照、各种TSA色原(TSA-TAMRA、TSA-Cy5和TSA-Dabsyl)和本公开的TSA“点击”缀合物(酪酰胺-DBCO:TAMRA-叠氮化物；酪酰胺-DBCO:Cy5-叠氮化物；和酪酰胺-DBCO:Dabsyl-叠氮化物)的染色。
标记为“DAB对照”的组织样品在IHC测定中染色，所述IHC测定利用对Ki67特异性的一抗和与HRP缀合的山羊抗兔抗体。在添加过氧化氢和3,3'-二氨基联苯胺(DAB)后，经由由HRP产生的棕色沉淀显现抗原。通过添加硫酸铜来调节DAB色调。
图10中的鉴定为用TSA-TAMRA、TSA-Cy5和TSA-Dabsyl染色的组织样品在使用传统的酪酰胺信号扩增技术的IHC测定中进行染色。首先，引入对Ki67特异性的一抗以形成一抗-Ki67复合物。然后通过二抗，即山羊抗兔抗体-HRP缀合物，用辣根过氧化物酶标记一抗-Ki67复合物。随后，各自独立地引入与色原偶联的酪酰胺，即TSA-TAMRA、TSA-Cy5和TSA-Dabsyl，并且各自随后在与辣根过氧化物酶反应后沉积在靶标上或靶标附近。
图10中被鉴定为用TSA-DBCO:TAMRA-叠氮化物、酪酰胺-DBCO:Cy5-叠氮化物；和酪酰胺-DBCO:Dabsyl-叠氮化物染色的组织样品在使用本文所述的通用技术和实施例2中提供的那些的IHC测定中进行染色。
与在传统TSA测定中染色的样品相比，根据本文所述的方法在“点击”扩增中使用Cy5或Dabsyl染色的组织显示染色强度的显著增加，如图10中清楚地显示。
实施例5：在ISH测定中“传统”TSA与“点击”扩增的比较
图11比较地说明各种TSA色原(TSA-TAMRA、TSA-Cy5和TSA-Dabsyl)和本公开的TSA“点击”缀合物(酪酰胺-DBCO:TAMRA-叠氮化物；酪酰胺-DBCO:Cy5-叠氮化物；和酪酰胺-DBCO:Dabsyl-叠氮化物)的染色。
图11中的鉴定为用TSA-TAMRA、TSA-Cy5和TSA-Dabsyl染色的组织样品在使用传统的酪酰胺信号扩增技术的ISH测定中进行染色。首先，将对Her2特异性的核酸探针引入组织样品中，Her2探针与可检测标记物(即DNP半抗原)缀合。DNP与兔抗DNP抗体结合，所述兔抗DNP抗体然后用缀合至HRP的山羊抗兔抗体标记。随后，各自独立地引入TSA-TAMRA、TSA-Cy5和TSA-Dabsyl，并且各自随后在与辣根过氧化物酶反应后沉积在靶标上或靶标附近。
图11中被鉴定为用TSA-DBCO:TAMRA-叠氮化物、酪酰胺-DBCO:Cy5-叠氮化物；和酪酰胺-DBCO:Dabsyl-叠氮化物染色的组织样品根据本文所述的通用技术进行染色(参见，例如，图15)。
与在传统TSA测定中染色的样品相比，根据本文所述的方法在“点击”扩增中使用Cy5或Dabsyl染色的组织显示染色强度的显著增加，如图11中清楚地显示。
实施例6
图12说明使用包含单个报告子部分的式(IV)的点击缀合物相比于另一包含多个报告子部分的式(IV)的点击缀合物的染色的差异。使用包含单个TAMRA色原的式(IV)的点击缀合物染色左侧的组织样品。使用包含至少两个TAMRA色原的式(V)的点击缀合物染色右侧的组织样品，所述TAMRA色原使用树枝状分子偶联在一起。
实施例7
图13说明用酶-组织点击加合物对组织的染色。根据本文公开的方法进行IHC测定。在引入兔抗Ki67一抗后，用与辣根过氧化物酶(HRP)酶偶联的山羊抗兔二抗标记每种抗体-靶标复合物。接下来，将包含与DBCO反应性官能团连接的酪酰胺的式(III)的化合物(一对点击缀合物的第一成员)与过氧化氢一起引入并与每种HRP标记的靶标反应。在与靶标结合的HRP反应后形成酪酰胺-DBCO组织缀合物复合物。随后，引入包含酶AP和叠氮化物反应性官能团的式(IV)的化合物(一对点击缀合物的第二成员)并与组织缀合物复合物反应以形成可检测的组织-点击加合物。然后用QMSA-TAMRA显色检测来检测AP-组织点击加合物。图13清楚地显示扁桃体组织样品中Ki67蛋白的染色的增加，其对应于AP-叠氮化物的浓度增加。
在本说明书中提及和/或在申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物以其整体通过引用并入本文。如果必要，可以修改实施方案的方面，以采用各种专利、申请和出版物的构思以提供另外的实施方案。
尽管已经参考具体实施方案描述了本文的公开内容，但应当理解，这些实施方案仅仅说明本公开内容的原理和应用。因此，应当理解，可以对说明性实施方案进行许多修改，并且可以在不脱离由所附权利要求限定的本公开内容的精神和范围的情况下设计其他布置。

Claims (75)

1.具有式(IIa)的缀合物：
其中
A选自二苯并环辛炔、反式环辛烯、叠氮化物、四嗪、马来酰亚胺、硫醇、1,3-硝酮、醛、酮、肼和羟胺；
“接头”是具有2至80个碳原子且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子的分支或未分支、线性或环状、取代或未取代、饱和或不饱和的基团；
R1是选自磷酸酯基、酰胺基、硝基、脲基、硫酸酯基、甲基、酯基、β-内酰胺基或糖基的基团；
R2是卤素；
R3、R5和R6独立地选自氢或具有1至4个碳原子的脂族基团；
R4是氢、具有1至4个碳原子的脂族基团或基团-CH(R2)-R7-[接头]-A；且
R7选自-(CH2)wNH-、-O(CH2)wNH-、-N(H)C(O)(CH2)wNH-、-C(O)N(H)(CH2)wNH-、-(CH2)wO-、-O(CH2)wO-、-O(CH2CH2O)w-、-N(H)C(O)(CH2)wO-、-C(O)N(H)(CH2)wO-、-C(O)N(H)(CH2CH2O)w-、-(CH2)wS-、-O(CH2)wS-、-N(H)C(O)(CH2)wS-、-C(O)N(H)(CH2)wS-、-(CH2)wNH-、-C(O)N(H)(CH2CH2O)wCH2CH2NH、-C(O)(CH2CH2O)wCH2CH2NH-、-C(O)N(H)(CH2)NHC(O)CH(CH3)(CH2)wNH-或-N(H)(CH2)wNH-，其中w是范围为1至12的整数。
2.权利要求1的缀合物，其中R6、R5、R4和R3各自为氢。
3.权利要求1或2的缀合物，其中R1是磷酸。
4.权利要求1至3中任一项的缀合物，其中R2是氟。
5.权利要求1的缀合物，其中R1是磷酸；R2是氟；且R6、R5、R4和R3各自为氢。
6.权利要求1至5中任一项的缀合物，其中“接头”具有式(Ia)：
其中
d和e是各自独立地范围为2至20的整数；
t和u独立地是0或1；
Q是键、O、S或N(Rc)(Rd)；
Ra和Rb独立地是H、C1-C4烷基基团、F、Cl或N(Rc)(Rd)；
Rc和Rd独立地是CH3或H；且
X和Y独立地是具有1至12个碳原子且任选地具有一个或多个O、N或S杂原子的分支或未分支、线性或环状、取代或未取代、饱和或不饱和的基团。
7.权利要求6的缀合物，其中Ra和Rb各自为氢。
8.权利要求7的缀合物，其中Q是氧。
9.权利要求1至8中任一项的缀合物，其中R7是-C(O)N(H)(CH2)wNH-。
10.权利要求1或2的缀合物，其中R1是磷酸且R7是-C(O)N(H)(CH2)wNH-，且w范围为2至10。
11.权利要求10的缀合物，其中R2是氟；且R6、R5、R4和R3各自为氢。
12.权利要求11的缀合物，其中“接头”包含PEG基团。
13.具有式(IId)的缀合物：
其中
A选自二苯并环辛炔、反式环辛烯、叠氮化物、四嗪、马来酰亚胺、硫醇、1,3-硝酮、醛、酮、肼和羟胺；
“接头”是具有2至80个碳原子且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子的分支或未分支、线性或环状、取代或未取代、饱和或不饱和的基团；且
w范围为1至12。
14.权利要求13的缀合物，其中“接头”具有式(Ia)：
其中
d和e是各自独立地范围为2至20的整数；
t和u独立地是0或1；
Q是键、O、S或N(Rc)(Rd)；
Ra和Rb独立地是H、C1-C4烷基基团、F、Cl或N(Rc)(Rd)；
Rc和Rd独立地是CH3或H；且
X和Y独立地是具有1至12个碳原子且任选地具有一个或多个O、N或S杂原子的分支或未分支、线性或环状、取代或未取代、饱和或不饱和的基团。
15.权利要求14的缀合物，其中w范围为1至8；且其中Ra和Rb各自为氢。
16.权利要求15的缀合物，其中w范围为2至8，且其中Q是氧。
17.权利要求16的缀合物，其中d和e独立地是范围为2至10的整数。
18.权利要求13至17中任一项的缀合物，其中A是二苯并环辛炔。
19.权利要求18的缀合物，其中w范围为2至6，且其中所述接头包含PEG基团。
20.权利要求13至17中任一项的缀合物，其中A是反式环辛烯。
21.权利要求20的缀合物，其中w范围为2至6，且其中所述接头包含PEG基团。
22.权利要求13至17中任一项的缀合物，其中A是叠氮化物。
23.权利要求23的缀合物，其中w范围为2至6，且其中所述接头包含PEG基团。
24.权利要求13至17中任一项的缀合物，其中A是四嗪。
25.权利要求24的缀合物，其中w范围为2至6，且其中所述接头包含PEG基团。
26.具有式(III)的缀合物：
其中
M衍生自丙酸、肉桂酸或式(IIIa)的化合物，
其中每个R基团独立地选自氢或具有1至4个碳原子的低级烷基基团；
A选自二苯并环辛炔、反式环辛烯、叠氮化物、四嗪、马来酰亚胺、硫醇、1,3-硝酮、醛、酮、肼和羟胺；且
“接头”是具有2至80个碳原子且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子的分支或未分支、线性或环状、取代或未取代、饱和或不饱和的基团；
条件是当每个R是氢时，A选自叠氮化物、硫醇、1,3-硝酮、肼或羟胺。
27.权利要求26的缀合物，其中“接头”具有式(Ia)
其中
d和e是各自独立地范围为2至20的整数；
t和u独立地是0或1；
Q是键、O、S或N(Rc)(Rd)；
Ra和Rb独立地是H、C1-C4烷基基团、F、Cl或N(Rc)(Rd)；
Rc和Rd独立地是CH3或H；且
X和Y独立地是具有1至12个碳原子且任选地具有一个或多个O、N或S杂原子的分支或未分支、线性或环状、取代或未取代、饱和或不饱和的基团。
28.权利要求27的缀合物，其中Ra和Rb各自为氢。
29.权利要求27或28的缀合物，其中Q是氧。
30.权利要求27的缀合物，其中Ra和Rb各自为氢，Q是氧，且e范围为2至10。
31.具有式(Id)的缀合物：
其中
A选自二苯并环辛炔、反式环辛烯、叠氮化物、四嗪、马来酰亚胺、硫醇、1,3-硝酮、醛、酮、肼和羟胺；
“接头”是具有2至80个碳原子且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子的分支或未分支、线性或环状、取代或未取代、饱和或不饱和的基团；且
“组织反应性部分”衍生自选自以下的化合物：
。
32.权利要求31的缀合物，其中“接头”具有式(Ia)：
其中
d和e是各自独立地范围为2至20的整数；
t和u独立地是0或1；
Q是键、O、S或N(Rc)(Rd)；
Ra和Rb独立地是H、C1-C4烷基基团、F、Cl或N(Rc)(Rd)；
Rc和Rd独立地是CH3或H；且
X和Y独立地是具有1至12个碳原子且任选地具有一个或多个O、N或S杂原子的分支或未分支、线性或环状、取代或未取代、饱和或不饱和的基团。
33.权利要求32的缀合物，其中Ra和Rb各自为氢。
34.权利要求32或33的缀合物，其中Q是氧。
35.权利要求32的缀合物，其中Ra和Rb各自为氢，Q是氧，且e范围为2至10。
36.具有式(IV)的缀合物：
其中
A选自二苯并环辛炔、反式环辛烯、叠氮化物、四嗪、马来酰亚胺、硫醇、1,3-硝酮、醛、酮、肼和羟胺；
“接头”是具有2至80个碳原子且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子的分支或未分支、线性或环状、取代或未取代、饱和或不饱和的基团；且
Z选自发色团、荧光团、酶、半抗原和螯合剂。
37.权利要求36的缀合物，Z是选自四甲基罗丹明、花菁5和Dabsyl的发色团。
38.权利要求36的缀合物，其中Z选自：
。
39.权利要求36的缀合物，其中所述缀合物具有式(IVa)的结构：
。
40.权利要求36的缀合物，其中所述缀合物具有式(IVb)的结构：
。
41.权利要求36的缀合物，其中所述缀合物具有式(IVc)的结构：
。
42.权利要求36的缀合物，其中所述缀合物具有式(IVd)的结构：
。
43.权利要求36的缀合物，其中所述缀合物是：
。
44.权利要求36的缀合物，其中所述缀合物是：
。
45.权利要求36的缀合物，其中所述缀合物是：
。
46.权利要求36的缀合物，其中所述缀合物是：
。
47.权利要求36的缀合物，其中所述缀合物是：
。
48.权利要求36的缀合物，其中所述缀合物是：
。
49.权利要求36的缀合物，其中所述缀合物是：
。
50.权利要求36的缀合物，其中所述缀合物是：
。
51.检测生物样品中的第一靶标的方法，其包括：
(i) 使所述生物样品与对所述第一靶标特异性的第一检测探针接触以形成第一检测探针-靶标复合物；
(ii) 使所述生物样品与对所述第一检测探针特异性的第一标记缀合物接触，所述第一标记缀合物包含第一酶，使得第一检测探针-靶标复合物变得用第一酶标记；
(iii) 使所述生物样品与第一对点击缀合物的第一成员接触，所述第一对点击缀合物的第一成员包含组织反应性部分，其中所述第一酶将所述第一对点击缀合物的第一成员转化为第一反应性中间体，所述第一反应性中间体靠近第一靶标或直接在第一靶标上共价键合至生物样品，以形成第一固定的组织-点击缀合物复合物；
(iv) 使所述生物样品与第一对点击缀合物的第二成员接触，第一对点击缀合物的第二成员包含第二反应性部分，所述第二反应性部分能够与所述第一固定的组织-点击缀合物复合物的第一反应性部分反应，使得在所述第一固定的组织-点击缀合物复合物和第一对点击缀合物的第二成员之间形成共价键，以形成第一组织-点击缀合物加合物；和
(v) 检测来自第一组织-点击缀合物加合物的第一报告子部分的信号。
52.权利要求51的方法，其中所述第一对点击缀合物的第一成员包含权利要求1至35中任一项的缀合物。
53.权利要求51或52的方法，其中所述第一对点击缀合物的第二成员包含权利要求36至50中任一项的缀合物。
54.权利要求51或52的方法，其中所述第一对点击缀合物的第二成员包含至少一个发色团。
55.权利要求51的方法，其中所述第一对点击缀合物的第一成员包含醌甲基化物前体部分；且其中所述第一对点击缀合物的第二成员包含发色团。
56.权利要求51的方法，其中所述第一对点击缀合物的第一成员包含酪酰胺部分；且其中所述第一对点击缀合物的第二成员包含发色团。
57.权利要求51至56中任一项的方法，其中所述第一检测探针是一抗，且其中所述第一标记缀合物包含抗-抗体的抗体。
58.权利要求51至57中任一项的方法，其中所述第一酶选自磷酸酶、磷酸二酯酶、酯酶、脂肪酶、酰胺酶、蛋白酶、硝基还原酶、脲酶、硫酸酯酶、细胞色素P450、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-内酰胺酶、α-葡糖醛酸酶、β-葡糖醛酸酶、α-5-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、神经氨酸酶、α-乳糖酶和β-乳糖酶。
59.权利要求51至58中任一项的方法，其进一步包括检测生物样品中的第二靶标，其中所述第二靶标通过如下检测：
(i) 使所述生物样品与对所述第二靶标特异性的第二检测探针接触以形成第二检测探针-靶标复合物；
(ii) 使所述生物样品与对所述第二检测探针特异性的第二标记缀合物接触，所述第二标记缀合物包含第二酶，使得第二检测探针-靶标复合物变得用第二酶标记；
(iii) 使所述生物样品与第二对点击缀合物的第一成员接触，所述第二对点击缀合物的第一成员包含组织反应性部分，其中所述第二酶将所述第二对点击缀合物的第一成员转化为第二反应性中间体，所述第二反应性中间体靠近第二靶标或直接在第二靶标上共价键合至生物样品，以形成第二固定的组织-点击缀合物复合物；
(iv) 使所述生物样品与第二对点击缀合物的第二成员接触，第二对点击缀合物的第二成员包含第二反应性部分，所述第二反应性部分能够与所述第二固定的组织-点击缀合物复合物的第一反应性部分反应，使得在第二固定的组织-点击缀合物复合物和第二对点击缀合物的第二成员之间形成共价键；和
(v) 检测来自第二组织-点击缀合物加合物的第二报告子部分的信号，其中所述第二报告子部分不同于所述第一报告子部分。
60.权利要求59的方法，其中所述第二对点击缀合物的第一成员包含权利要求1至35中任一项的缀合物。
61.权利要求59或60的方法，其中所述第二对点击缀合物的第二成员包含权利要求36至50中任一项的缀合物。
62.权利要求59或60的方法，其中所述第二对点击缀合物的第二成员包含至少一个发色团。
63.权利要求59的方法，其中所述第二对点击缀合物的第一成员包含醌甲基化物前体部分；且其中所述第二对点击缀合物的第二成员包含发色团。
64.权利要求59的方法，其中所述第二对点击缀合物的第一成员包含酪酰胺部分；且其中所述第二对点击缀合物的第二成员包含发色团。
65.权利要求59至64中任一项的方法，其中所述第二检测探针是一抗，且其中第二第一标记缀合物包含抗-抗体的抗体。
66.权利要求59至65中任一项的方法，其中所述第二酶选自磷酸酶、磷酸二酯酶、酯酶、脂肪酶、酰胺酶、蛋白酶、硝基还原酶、脲酶、硫酸酯酶、细胞色素P450、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-内酰胺酶、α-葡糖醛酸酶、β-葡糖醛酸酶、α-5-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、神经氨酸酶、α-乳糖酶和β-乳糖酶。
67.权利要求51至66中任一项的方法，其中所述步骤中的一个或多个由自动化系统执行。
68.与组织样品共价键合的固定的点击缀合物，所述固定的点击-缀合物包含选自以下的第一反应性官能团：二苯并环辛炔、反式环辛烯、叠氮化物、四嗪、马来酰亚胺、硫醇、1,3-硝酮、醛、酮、肼和羟胺。
69.权利要求68的固定的点击缀合物，其中所述点击-缀合物通过组织样品内或其表面上的酪氨酸残基或亲核物质与组织键合。
70.可检测的组织-点击加合物复合物，其通过使权利要求68和69的固定的点击-缀合物与具有式(IV)的缀合物反应而形成：
其中
A选自二苯并环辛炔、反式环辛烯、叠氮化物、四嗪、马来酰亚胺、硫醇、1,3-硝酮、醛、酮、肼和羟胺；
“接头”是具有2至80个碳原子且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子的分支或未分支、线性或环状、取代或未取代、饱和或不饱和的基团；且
Z选自发色团、荧光团、酶、半抗原和螯合剂；且
其中式(IV)的缀合物包含能够与所述固定的点击-缀合物的第一反应性官能团反应的A基团。
71.权利要求70的可检测的组织-点击加合物复合物，其中Z是至少一个发色团。
72.权利要求70或71的可检测的组织-点击加合物复合物，其中所述第一反应性官能团是二苯并环辛炔，且其中式(IV)的A选自叠氮化物或1,3-硝酮。
73.权利要求70或71的可检测的组织-点击加合物复合物，其中所述第一反应性官能团反式环辛烯，且其中式(IV)的A是四嗪。
74.权利要求70或71的可检测的组织-点击加合物复合物，其中所述第一反应性官能团是叠氮化物，且其中式(IV)的A是二苯并环辛炔。
75.权利要求70的可检测的组织-点击加合物复合物或权利要求72至74中任一项的可检测的组织-点击加合物复合物，其中Z是螯合剂，且其中将镧系元素引入形成的可检测的组织-点击加合物复合物中。
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