CN116368148A - 修饰的il-18多肽及其用途 - Google Patents

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本诺特·霍恩斯伯格
让-菲利普·卡拉洛特
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Abstract

本公开内容涉及修饰的IL‑18多肽、包含修饰的IL‑18多肽的组合物、它们的制备方法以及使用修饰的IL‑18多肽用于治疗疾病的方法。在一方面，本公开内容涉及使用修饰的IL‑18多肽治疗癌症。在一些实施方案中，所公开的IL‑18多肽诱导IFNγ的产生。在一些实施方案中，所公开的IL‑18多肽诱导IFNγ的产生而不被IL‑18结合蛋白中和。

Description

修饰的IL-18多肽及其用途
本申请要求于2020年8月19日提交的美国临时申请第63/067,658号的权益，该申请通过引用以其整体并入本文。
序列表
本申请包含序列表，所述序列表已经以ASCII格式电子地提交并且在此通过引用以其整体并入。于2021年8月16日生成的所述ASCII副本被命名为94917_0009_707601WO_SL.txt并且大小为185,376字节字节字节。
背景
免疫疗法利用受试者的免疫系统来帮助治疗疾病。免疫疗法可以根据被治疗的疾病的性质而设计为激活或抑制免疫系统。用于治疗癌症的免疫疗法的目标是刺激免疫系统，使得其识别和破坏肿瘤或其他癌组织。激活受试者体内的免疫系统以攻击癌细胞的一种方法是细胞因子疗法。细胞因子是体内产生的在细胞信号传导和调节免疫系统中重要的蛋白。一些细胞因子疗法利用细胞因子的这些特性来增强受试者的免疫系统以杀伤癌细胞。
概述
在一方面，本文描述了一种修饰的白细胞介素-18(IL-18)多肽，其包含含有E06K和K53A的修饰的IL-18多肽，其中修饰的IL-18多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1的修饰的IL-18多肽作为参考序列。
在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽还包含T63A。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽还包含Y01X、F02X、C38X、D54X、S55X、C68X、K70X、C76X或C127X中的至少一种，其中X是氨基酸或氨基酸衍生物。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽还包含Y01G、F02A、C38S、D54A、S55A、C68S、K70C、C76S或C127S中的至少一种。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽还包含Y01X、F02X、C38X、D54X、S55X、C68X、E69X、或K70X、C76X或C127X中的至少一种，其中X是氨基酸或氨基酸衍生物。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽还包含Y01G、F02A、C38S、C38A、D54A、S55A、C68S、C68A、E69C、K70C、C76S、C76A、C127A或C127S中的至少一种。
在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含共价附接在残基65、残基66、残基67、残基68、残基69、残基70、残基71、残基72、残基73、残基74或残基75处的聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含共价附接在残基C68处的聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含共价附接在残基69处的聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含共价附接在残基E69处的聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含共价附接在残基E69C处的聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含共价附接在残基70处的聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含共价附接在残基K70处的聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含共价附接在残基K70C处的聚合物。
在一些实施方案中，聚合物具有以下的重均分子量：至多约50,000道尔顿、至多约25,000道尔顿、至多约10,000道尔顿或至多约6,000道尔顿。在一些实施方案中，聚合物具有以下的重均分子量：至少约120道尔顿、至少约250道尔顿、至少约300道尔顿、至少约400道尔顿或至少约500道尔顿。
在一些实施方案中，聚合物包含缀合手柄或缀合手柄与互补缀合手柄的反应产物。在一些实施方案中，聚合物包含叠氮化物部分、炔烃部分或叠氮基-炔烃环加成反应的反应产物。在一些实施方案中，聚合物包含叠氮化物部分。在一些实施方案中，聚合物是水溶性聚合物。在一些实施方案中，水溶性聚合物包括聚(环氧烷)、多糖、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉、聚(丙烯酰吗啉)或其组合。在一些实施方案中，水溶性聚合物包括聚(环氧烷)。在一些实施方案中，聚(环氧烷)是聚乙二醇(PEG)。
在一些实施方案中，聚乙二醇具有约10kDa至约50kDa的重均分子量。在一些实施方案中，聚乙二醇具有约10kDa、约20kDa或约30kDa的重均分子量。在一些实施方案中，聚乙二醇具有约30kDa的重均分子量。在一些实施方案中，聚乙二醇具有约1kDa至约10kDa的重均分子量。在一些实施方案中，聚乙二醇具有约1kDa、约2kDa、约5kDa、约7.5kDa或约10kDa的重均分子量。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽的半衰期比对应的野生型IL-18多肽的半衰期长至少10％。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽的半衰期比对应的野生型IL-18多肽的半衰期长至少30％。
在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含N-末端延伸。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含N-末端截短。
在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含与SEQ ID NO:2-58具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％序列同一性的多肽序列。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含与SEQ ID NO:2-83具有至少约80％序列同一性的多肽序列。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含与SEQ ID NO:2-58具有至少约80％序列同一性的多肽序列。在一些实施方案中，多肽序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:18至少约80％相同。在一些实施方案中，多肽序列与SEQ ID NO:2至少约80％相同。在一些实施方案中，多肽序列与SEQ ID NO:2至少约90％相同。在一些实施方案中，多肽序列与SEQ ID NO:2至少约95％相同。在一些实施方案中，多肽序列与SEQ ID NO:18至少约80％相同。在一些实施方案中，多肽序列与SEQ ID NO:18至少约90％相同。在一些实施方案中，多肽序列与SEQ ID NO:18至少约95％相同。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽是重组体。
在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含选自以下的一个或更多个氨基酸取代：(a)位于残基26-36的任何一个处的高丝氨酸残基；(b)位于残基60-80的任何一个处的高丝氨酸残基；(c)位于残基110-120的任何一个处的高丝氨酸残基；(d)位于残基28-38的任何一个处的正亮氨酸残基；(d)位于残基46-56的任何一个处的正亮氨酸残基；(e)位于残基54-64的任何一个处的正亮氨酸残基；(f)位于残基80-90的任何一个处的正亮氨酸残基；(g)位于残基108-118的任何一个处的正亮氨酸残基；以及(h)位于残基145-155的任何一个处的正亮氨酸残基；其中该修饰的IL-18多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含选自以下的一个或更多个氨基酸取代：(a)位于残基26-36的任何一个处的高丝氨酸残基；(b)位于残基60-80的任何一个处的高丝氨酸残基；(c)位于残基110-120的任何一个处的高丝氨酸残基；(d)位于残基28-38的任何一个处的正亮氨酸或O-甲基-高丝氨酸残基；(d)位于残基46-56的任何一个处的正亮氨酸或O-甲基-高丝氨酸残基；(e)位于残基54-64的任何一个处的正亮氨酸或O-甲基-高丝氨酸残基；(f)位于残基80-90的任何一个处的正亮氨酸或O-甲基-高丝氨酸残基；(g)位于残基108-118的任何一个处的正亮氨酸或O-甲基-高丝氨酸残基；以及(h)位于残基145-155的任何一个处的正亮氨酸或O-甲基-高丝氨酸残基；其中该修饰的IL-18多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含选自以下的一个或更多个氨基酸取代：(a)位于残基26-36的任何一个处的高丝氨酸残基；(b)位于残基60-80的任何一个处的高丝氨酸残基；(c)位于残基110-120的任何一个处的高丝氨酸残基；(d)位于残基28-38的任何一个处的O-甲基-高丝氨酸残基；(d)位于残基46-56的任何一个处的O-甲基-高丝氨酸残基；(e)位于残基54-64的任何一个处的O-甲基-高丝氨酸残基；(f)位于残基80-90的任何一个处的O-甲基-高丝氨酸残基；(g)位于残基108-118的任何一个处的O-甲基-高丝氨酸残基；以及(h)位于残基145-155的任何一个处的O-甲基-高丝氨酸残基；其中该修饰的IL-18多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。
在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含选自以下的一个或更多个氨基酸取代：高丝氨酸(Hse)31、正亮氨酸(Nle)33、Nle51、Nle59、Hse75、Nle86、Nle113、Hse116和Nle150。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含选自以下的一个或更多个氨基酸取代：高丝氨酸(Hse)31、正亮氨酸(Nle)33、O-甲基-高丝氨酸(Omh)33、Nle51、Omh51、Nle60、Omh60、Hse75、Nle86、Omh86、Hse116、Nle113、Omh113、Nle150和Omh150。在一些实施方案中，修饰的IL-18肽包含用O-甲基-L-高丝氨酸进行的氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-18肽包含在位置Met 33、Met 51、Met 60、Met 86、Met 113或Met 150处用O-甲基-L-高丝氨酸进行的氨基酸取代。
在一方面，本文描述了修饰的白细胞介素-18(IL-18)多肽群体，包含：a)多于一种修饰的IL-18多肽；和b)至少一种聚合物部分，其中至少一种聚合物部分与修饰的IL-18多肽共价连接并附接在残基65、残基66、残基67、残基68、残基69、残基70、残基71、残基72、残基73、残基74或残基75处，其中氨基酸残基位置是基于SEQ ID NO:1作为参考序列；其中修饰的IL-18多肽中的至少90％具有在如通过高分辨率电喷雾电离质谱(ESI-HRMS)确定的多于一种修饰的IL-18多肽的峰值分子量的±500Da内的分子量。
在一方面，本文描述了修饰的白细胞介素-18(IL-18)多肽群体，包含：a)多于一种修饰的IL-18多肽；和b)多于一种聚合物部分，其中多于一种聚合物部分与修饰的IL-18多肽共价连接并附接在修饰的IL-18多肽的残基65、残基66、残基67、残基68、残基69、残基70、残基71、残基72、残基73、残基74或残基75处，其中氨基酸残基位置是基于SEQ ID NO:1作为参考序列；其中多于一种聚合物部分中的至少90％具有在如通过高分辨率电喷雾电离质谱(ESI-HRMS)确定的多于一种聚合物部分的峰值分子量的±500Da内的分子量。
在一些实施方案中，至少75％的多于一种聚合物具有在如通过高分辨率电喷雾电离质谱(ESI-HRMS)确定的多于一种聚合物的峰值分子量的±10％内的分子量。在一些实施方案中，至少一种聚合物部分或多于一种聚合物部分与修饰的IL-18多肽在氨基酸残基68处共价连接，其中修饰的IL-18多肽的氨基酸残基编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，至少一种聚合物部分或多于一种聚合物部分与修饰的IL-18多肽在氨基酸残基69处共价连接，其中修饰的IL-18多肽的氨基酸残基编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，至少一种聚合物部分或多于一种聚合物部分与修饰的IL-18多肽在氨基酸残基70处共价连接，其中修饰的IL-18多肽的氨基酸残基编号是基于SEQ IDNO:1作为参考序列。在一些实施方案中，至少一种聚合物部分或多于一种聚合物部分与修饰的IL-18多肽在C68处共价连接，其中修饰的IL-18多肽的氨基酸残基编号是基于SEQ IDNO:1作为参考序列。在一些实施方案中，至少一种聚合物部分或多于一种聚合物部分与修饰的IL-18多肽在E69处共价连接，其中修饰的IL-18多肽的氨基酸残基编号是基于SEQ IDNO:1作为参考序列。在一些实施方案中，至少一种聚合物部分或多于一种聚合物部分与修饰的IL-18多肽在E69C处共价连接，其中修饰的IL-18多肽的氨基酸残基编号是基于SEQ IDNO:1作为参考序列。在一些实施方案中，至少一种聚合物部分或多于一种聚合物部分与修饰的IL-18多肽在K70处共价连接，其中修饰的IL-18多肽的氨基酸残基编号是基于SEQ IDNO:1作为参考序列。在一些实施方案中，至少一种聚合物部分或多于一种聚合物部分与修饰的IL-18多肽在K70C处共价连接，其中修饰的IL-18多肽的氨基酸残基编号是基于SEQ IDNO:1作为参考序列。
在一些实施方案中，多于一种修饰的IL-18多肽中的每种修饰的IL-18多肽包含一个或更多个突变。在一些实施方案中，一个或更多个突变位于选自E06、K53、Y01、S55、F02、D54、C38、T63、C68、C76、C127和K70的残基位置处，其中修饰的IL-18多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，一个或更多个突变位于选自E06、K53、Y01、S55、F02、D54、C38、T63、C68、E69、C76、C127和K70的残基位置处，其中修饰的IL-18多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，一个或更多个突变选自E06K、K53A、Y01G、S55A、F02A、D54A、C38S、T63A、C68S、C76S、C127S和K70C。在一些实施方案中，一个或更多个突变选自E06K、K53A、Y01G、S55A、F02A、D54A、C38S、T63A、C68S、E69C、C76S、C127S和K70C。在一些实施方案中，一个或更多个突变是E06K和K53A。在一些实施方案中，一个或更多个突变是E06K、K53A和T63A。
在一些实施方案中，群体包括至少1μg、至少10μg或至少1mg修饰的IL-18多肽。在一些实施方案中，群体包括至少100种、至少1000种或至少10000种修饰的IL-18多肽。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体的重均分子量相比于数均分子量的比值为至多1.1。
在一些实施方案中，多于一种聚合物中的每一种包括水溶性聚合物。在一些实施方案中，水溶性聚合物包括聚(环氧烷)、多糖、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉、聚(丙烯酰吗啉)或其组合。在一些实施方案中，水溶性聚合物包括聚乙二醇。
在一些实施方案中，多于一种聚合物的重均分子量为约200Da至约50,000Da。在一些实施方案中，多于一种聚合物的重均分子量为约10,000Da至约30,000Da。
在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽调节IFNγ的产生，并且其中修饰的IL-18多肽诱导IFNγ的能力的EC50(nM)比SEQ ID NO:1的IL-18多肽的EC50(nM)高不超过10倍、高不超过5倍，或比SEQ ID NO:1的IL-18多肽的EC50(nM)低。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽诱导IFNγ的能力的EC50(nM)比SEQ ID NO:1的EC50(nM)大不超过10倍。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽诱导IFNγ的能力的EC50(nM)比SEQ ID NO:1的IL-18多肽的EC50(nM)低。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽诱导IFNγ的能力的EC50(nM)比SEQ ID NO:1的IL-18多肽的EC50(nM)低至少约10倍。
在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽调节IFNγ的产生，并且其中修饰的IL-18多肽针对IFNγ的EC50(nM)比SEQ ID NO:1的IL-18多肽的EC50(nM)低。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽针对IFNγ的EC50(nM)比SEQ ID NO:1的IL-18多肽的EC50(nM)低至少10倍。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽针对IFNγ的EC50(nM)比SEQ ID NO:1的IL-18多肽的EC50(nM)低约10倍。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽针对IFNγ的EC50(nM)比SEQ ID NO:1的IL-18多肽的EC50(nM)低约15倍。
在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含与SEQ ID NO:2-58具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％序列同一性的多肽序列。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含与SEQ ID NO:2-83具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％序列同一性的多肽序列。在一些实施方案中，多肽序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:18至少约80％相同。在一些实施方案中，多肽序列与SEQ ID NO:2至少约80％相同。在一些实施方案中，多肽序列与SEQ ID NO:2至少约90％相同。在一些实施方案中，多肽序列与SEQ ID NO:2至少约95％相同。在一些实施方案中，多肽序列与SEQ ID NO:18至少约80％相同。在一些实施方案中，多肽序列与SEQ ID NO:18至少约90％相同。在一些实施方案中，多肽序列与SEQ ID NO:18至少约95％相同。
在一些实施方案中，如通过KD测量的，修饰的IL-18多肽对IL-18受体α亚基(IL-18Rα)表现出比对IL-18结合蛋白(IL-18BP)低不超过10倍的亲和力、低不超过5倍的亲和力，或比对IL-18结合蛋白(IL-18BP)大的亲和力，并且其中[KD IL-18Rα]/[KD IL-18BP]大于0.1。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽与IL-18受体α(IL-18Rα)结合。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽以小于约200nM、小于约100nM、或小于约50nM的KD与IL-18Rα结合。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽以小于约10nM的KD与IL-18Rα结合。
在一些实施方案中，如通过KD测量的，修饰的IL-18多肽对IL-18受体(IL-18R)表现出比对IL-18结合蛋白(IL-18BP)大的亲和力，并且其中[KD IL-18R]/[KD IL-18BP]小于1。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽与IL-18受体α(IL-18Rα)结合。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽以小于约50nM的KD与IL-18Rα结合。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽以小于约10nM的KD与IL-18Rα结合。
在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽与IL-18受体α/β(IL-18Rα/β)异源二聚体结合。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽以小于约10nM的KD与IL-18Rα/β异源二聚体结合。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽以小于约2nM的KD与IL-18Rα/β异源二聚体结合。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽与另外的肽缀合。
在一方面，本文描述了包含修饰的IL-18多肽的宿主细胞。
在一方面，本文描述了产生修饰的IL-18多肽的方法，其中该方法包括在宿主细胞中表达修饰的IL-18多肽。
在一些实施方案中，宿主细胞是原核细胞或真核细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞、禽类细胞、真菌细胞或昆虫细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是CHO细胞、COS细胞或酵母细胞。
在一方面，本文描述了一种药物组合物，该药物组合物包含：a)修饰的IL-18多肽或修饰的IL-18多肽群体；和b)药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物呈冻干形式。
在一方面，本文描述了一种治疗有相应需要的受试者的癌症的方法，该方法包括：向受试者施用药学上有效量的修饰的IL-18多肽或包含修饰的IL-18多肽的药物组合物。
在一些实施方案中，癌症是实体癌症。在一些实施方案中，实体癌症是肾癌、皮肤癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、结肠直肠癌、食管癌、眼癌、头颈癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌或前列腺癌。在一些实施方案中，实体癌症是转移性肾细胞癌或黑素瘤。在一些实施方案中，实体癌症是癌或肉瘤。
在一些实施方案中，癌症是血液癌症。在一些实施方案中，血液癌症是白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤或多发性骨髓瘤。
在一些实施方案中，该方法还包括将修饰的IL-18多肽或药物组合物的冻干形式重构。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽与肽缀合。
在一方面，本文提供了一种合成IL-18多肽，包含：包含在选自残基21-41、残基60-80和残基106-126的区域的位置处的高丝氨酸(Hse)残基的合成IL-18多肽，其中修饰的IL-18多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。
在一些实施方案中，合成IL-18多肽包含在残基21-41、残基60-80和残基106-126的每个区域中的Hse残基。
在一些实施方案中，合成IL-18多肽包含在位置31处的Hse残基。在一些实施方案中，合成IL-18多肽包含在位置63或位置75处的Hse残基。在一些实施方案中，合成IL-18多肽包含在位置63处的Hse残基。在一些实施方案中，合成IL-18多肽包含在位置75处的Hse残基。在一些实施方案中，合成IL-18多肽包含在位置116处的Hse残基。在一些实施方案中，合成IL-18多肽包含在位置31、116、和位置63和75中的至少一个处的Hse残基。
在一些实施方案中，合成IL-18多肽包含SEQ ID NO:1中至少一个甲硫氨酸残基的氨基酸取代。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1中至少一个甲硫氨酸残基的氨基酸取代包括在M33、M51、M60、M86、M113或M150处的取代。在一些实施方案中，合成IL-18多肽包含至少三个甲硫氨酸残基的取代。在一些实施方案中，合成IL-18多肽包含至少五个甲硫氨酸残基的取代。在一些实施方案中，合成IL-18多肽包含至少六个甲硫氨酸残基的取代。
在一些实施方案中，至少一个甲硫氨酸残基被取代为O-甲基-高丝氨酸(Omh)残基。在一些实施方案中，至少三个甲硫氨酸残基被取代为Omh残基。在一些实施方案中，至少五个甲硫氨酸残基被取代为Omh残基。在一些实施方案中，每个甲硫氨酸被取代为正亮氨酸或Omh残基。在一些实施方案中，每个甲硫氨酸被取代为Omh残基。在一些实施方案中，SEQID NO:1的每个甲硫氨酸残基被取代为Omh残基。
在一些实施方案中，合成IL-18多肽包含SEQ ID NO:1的另外的突变。在一些实施方案中，合成IL-18多肽包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列至少约80％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，合成IL-18多肽包含与合成IL-18多肽的残基共价附接的聚合物。
在一方面，本文描述了一种制备修饰的IL-18多肽的方法，该方法包括：a)合成修饰的IL-18多肽的两种或更多种片段；b)连接所述片段；以及c)使所连接的片段折叠。在一些实施方案中，该方法还包括将水溶性聚合物与所折叠的连接的片段附接。
根据以下详细描述，本公开内容的另外的方面和优点对本领域技术人员而言将变得明显，详细描述中仅示出和描述了本公开内容的说明性实施方案。如将意识到的，本公开内容能够具有其他和不同的实施方案，并且其若干细节能够在各种明显的方面进行修改，所有这些都不偏离本公开内容。相应地，附图和描述应被认为本质上是说明性的而非限制性的。
通过引用并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，其程度如同每一个单独的出版物、专利或专利申请被特别和单独地指明通过引用并入。在通过引用并入的出版物和专利或专利申请与本说明书中包含的公开内容相矛盾的情况，意图本说明书取代和/或优先于任何这样的矛盾材料。
附图简述
本公开内容的新颖特征特别地在所附权利要求书中阐述。通过参考以下详细描述和附图将获得对本公开内容的特征和优点的更好理解，该详细描述阐述了其中利用了本公开内容的原理的说明性实施方案，在附图中：
图1图示了IL-18对IFNγ和IL-18BP的产生、以及IL-18BP对IL-18的抑制活性的作用机制。
图2A图示了合成的野生型IL-18多肽。
图2B图示了具有两个修饰的氨基酸残基(由黑色圆形指示)的修饰的合成IL-18多肽。
图2C图示了包含聚合物部分的修饰的合成IL-18多肽。
图3图示了二苯并环辛炔(DBCO)聚乙二醇(PEG)与包含叠氮化物的修饰的IL-18多肽的偶联。
图4图示了包含聚合物的修饰的IL-18多肽与IL-18Rα的结合。
图5示出了使用修饰的IL-18多肽片段制备包含叠氮化物部分的SEQ ID NO:26的修饰的IL-18多肽的合成方案。
图6A示出了与野生型IL-18多肽相比，本公开内容的修饰的IL-18多肽的IFNγ诱导能力。
图6B示出了与野生型IL-18多肽相比，本公开内容的修饰的IL-18多肽的IL-18BP抑制。
图7比较了对照(实心圆形、实线)；对照+IL-18BP(半空心圆形，虚线)；SEQ ID NO:1的IL-18多肽(实心三角形，实线)；SEQ ID NO:1的IL-18多肽+IL-18BP(空心三角形，虚线)；SEQ ID NO:2的修饰的IL-18多肽(实心菱形，实线)；以及SEQ ID NO:2的修饰的IL-18多肽+IL-18BP(半空心三角形，虚线)的EC50值。
图8示出了使用IL-18片段合成SEQ ID NO:24的修饰的IL-18多肽的合成方案。
图9示出了使用包含K70上的叠氮化物部分的IL-18片段合成修饰的IL-18多肽的合成方案。
图10示出了使用IL-18片段合成SEQ ID NO:25的修饰的IL-18多肽的合成方案。
图11示出了使用IL-18片段合成SEQ ID NO:31的修饰的IL-18多肽的合成方案。
图12示出了使用修饰的IL-18多肽片段制备包含叠氮化物部分的SEQ ID NO:32的修饰的IL-18多肽的合成方案。
图13示出了使用IL-18片段制备SEQ ID NO:33的修饰的IL-18多肽的合成方案。
图14示出了使用修饰的IL-18多肽片段制备包含叠氮化物部分的SEQ ID NO:34的修饰的IL-18多肽的合成方案。
图15示出了使用修饰的IL-18多肽片段制备包含共价附接在残基70处的PEG-叠氮化物部分的修饰的IL-18多肽的合成方案，该残基70已经被取代为天冬氨酸残基。
图16示出了使用修饰的IL-18多肽片段制备包含叠氮化物部分的SEQ ID NO:62的修饰的IL-18多肽的合成方案。
图17示出了可用于制备包含共价附接到各种氨基酸残基的PEG叠氮化物基团的修饰的IL-18多肽的一般合成方案。
图18示出了双官能探针与本文提供的IL-18多肽偶联的示意图。
图19示出了聚(乙二醇)部分与用双官能探针激活的IL-18多肽偶联的示意图。
图20示出了在小鼠模型中施用指定的IL-18多肽后的各时间点的干扰素γ(IFN·)水平。
图21示出了在小鼠模型中施用指定IL-18多肽后的各时间点的C-X-C基序趋化因子配体10(CXCL10)水平。
图22示出了用人类IL-18和指定变体刺激PBMC 24hr后，IFNγ、IL1β、TNFα、IL-6、IL-10和IL-12p70的体外诱导。
图23示出了在用人类IL-18和指定变体刺激72hr后，CD16在人类CD3-/CD56+NK细胞上的表面表达。
详细描述
对肿瘤的免疫应答主要是1型T辅助(Th1)淋巴细胞的功能。Th1应答包括细胞因子IL-2、IL-12、IL-18、IFNγ的分泌，以及识别特定肿瘤抗原的特异性细胞毒性T淋巴细胞的产生。Th1应答是宿主防御许多微生物的重要武器。然而，Th1应答也与自身免疫性疾病和器官移植排斥相关。
白细胞介素18(IL-18)是一种促炎细胞因子，在感染或损伤后引发启动或促进宿主防御和炎症的生物活性。IL-18涉及自身免疫性疾病、心肌功能、肺气肿、代谢综合征、银屑病、炎性肠病、噬血细胞综合征、巨噬细胞活化综合征、脓毒症和急性肾损伤。在一些疾病模型中，IL-18起着保护作用。
IL-18在由T细胞和自然杀伤细胞产生IFNγ中也起重要作用。IFNγ是一种主要由T细胞、NK细胞和巨噬细胞产生的Th1细胞因子，并且对针对病毒、一些细菌和原生动物感染的先天免疫和适应性免疫至关重要。IFNγ也是巨噬细胞的重要激活因子和II类主要组织相容性复合体(MHC)分子表达的诱导因子。
IL-18通过与IL-18α链(IL-18Rα)结合而形成信号传导复合物，IL-18α链是成熟IL-18的配体结合链。然而，IL-18与IL-18Rα的结合亲和力低。在表达共同受体IL-18受体β链(IL-18Rβ)的细胞中，形成高亲和力异源二聚体复合物，该复合物然后激活细胞信号传导。
IL-18的活性通过高亲和力、天然存在的IL-18结合蛋白(IL-18BP)的存在来平衡。IL-18BP结合IL-18并中和IL-18的生物活性。细胞表面的IL-18Rα与IL-18BP竞争IL-18的结合。增加的疾病严重程度可能与IL-18与IL-18BP的失衡相关，使得循环中游离IL-18的水平升高。图1图示了IL-18、IFNγ产生、IL-18BP产生以及IL-18BP对IL-18活性的抑制的作用机制。IL-18诱导IFNγ产生，IFNγ继而诱导IL-18BP产生。IL-18BP然后与IL-18Rα竞争从而抑制IL-18活性。
以下描述和实例详细说明了本公开内容的实施方案。应当理解，本公开内容不限于本文描述的特定实施方案，并因此可以变化。本领域的技术人员将认识到，本公开内容有许多变化和修改，这些都包括在本公开内容的范围内。
尽管本公开内容的各个特征可以在单个实施方案的上下文中被描述，但是这些特征也可以单独地或以任何合适的组合被提供。相反，尽管本公开内容可以为了清楚起见在单独的实施方案的上下文中在本文描述，但是本公开内容也可以以单个实施方案实施。
本文使用的章节标题仅用于组织目的，而不应被解释为限制所描述的主题。
I.定义
所有术语意图按照本领域技术人员将理解的方式理解。除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
以下定义补充了本领域的定义，并针对本申请，而不应归于任何相关或不相关的情况，例如任何共同拥有的专利或申请。尽管与本文描述的那些相似或等效的任何方法和材料都可以用于实践对本公开内容的测试，但本文描述了优选的方法和材料。相应地，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不意图是限制性的。
本文使用的术语仅用于描述特定情况的目的，并不意图是限制性的。在本申请中，除非另外特别说明，否则单数的使用包括复数。如本文使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”意图也包括复数形式，除非上下文另外清楚地指示。
在本申请中，除非另外说明，否则“或”的使用意指“和/或”。如本文使用的术语“和/或”和“其任何组合”及其语法等同物可以可互换使用。这些术语可以表示任何组合都被特别地设想。仅出于说明的目的，以下措辞“A、B和/或C”或“A、B、C或其任何组合”可以意指“单独地A；单独地B；单独地C；A和B；B和C；A和C；以及A、B、C”。除非上下文特别指分开使用，否则术语“或”可以结合地或分开地使用。
术语“约”或“大约”可以意指在如由本领域的普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围以内，其将部分地取决于值如何被测量或确定，即，测量系统的限制。例如，“约”可以根据本领域的实践意指1个或多于1个标准差以内。可选地，“约”可以意指特定值的最多20％、最多15％、最多10％、最多5％或最多1％的范围。可选地，特别是关于生物系统或生物过程，该术语可以意指在值的数量级以内，5倍以内或2倍以内。当在本申请和权利要求书中描述特定值时，除非另外说明，否则应该假定术语“约”意指特定值的可接受的误差范围以内。
如本说明书和权利要求书中使用的，词“包含(comprising)”(和包含(comprising)的任何形式，诸如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)，“具有(having)”(和具有(having)的任何形式，诸如“具有(have)”和“具有(has)”)，“包括(including)”(和包括(including)的任何形式，诸如“包括(include)”和包括“(include)”)，或“含有(containing)”(和“含有(containing)”的任何形式，诸如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包含性的或开放式的，并不排除另外的、未列举的要素或方法步骤。设想了本说明书中讨论的任何实施方案可以参考本公开内容的任何方法或组合物来实现，并且反之亦然。此外，本公开内容的组合物可以用于实现本公开内容的方法。
说明书中对“一些实施方案”、“实施方案”、“一种实施方案”或“其他实施方案”的提及意指结合实施方案描述的特定特征、结构或特性包括在本公开内容的至少一些实施方案中，但不必包含在所有实施方案中。为了便于理解本公开内容，一些术语和措辞定义如下。
如本文使用的，“α-酮氨基酸”或氨基酸名称前的措辞“α-酮”是指具有位于氨基酸的带有氨基基团的碳和羧酸之间的酮官能团的氨基酸或氨基酸衍生物。本公开内容的α-酮氨基酸具有如下式列出的结构：
Figure BDA0004186569250000161
其中R是任何天然或非天然氨基酸的侧链。根据标准氨基酸命名法，R官能团可以在L或D方向。在优选的实施方案中，α-酮氨基酸在L方向。当措辞“α-酮”用在常规天然氨基酸的名称之前(例如α-酮亮氨酸、α-酮苯丙氨酸等)或常见的非天然氨基酸的名称之前(例如α-酮正亮氨酸、α-酮O-甲基-高丝氨酸等)时，意图的是所提及的α-酮氨基酸与具有所提及的氨基酸的侧链的上式匹配。当α-酮氨基酸残基在本文的肽或多肽序列中列出时，意图的是也涵盖相关氨基酸的保护形式(例如，对于以C-末端α-酮氨基酸终止的序列，末端羧酸残基可以适当地用保护基团诸如叔丁基基团封端(cap))。
术语“药学上可接受的”是指联邦或州政府的管理机构所批准的或可批准的或在美国药典或其他一般公认的药典中列出的用于在动物包括人类中使用的。
“药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂”是指可以与剂一起向受试者施用且不破坏其药理活性并且在以足以递送治疗量的剂的剂量施用时无毒性的赋形剂、载体或稀释剂。
适于本公开内容的“药学上可接受的盐”可以是本领域中通常认为适于与人类或动物的组织接触使用而没有过度的毒性、刺激、过敏响应或其他问题或并发症的酸盐或碱盐。这样的盐包括碱性残基诸如胺的矿物和有机酸盐，以及酸性残基诸如羧酸的碱或有机盐。特定的药物盐包括但不限于以下酸的盐：诸如盐酸、磷酸、氢溴酸、苹果酸、乙醇酸、富马酸、硫酸、氨基磺酸、对氨基苯磺酸、甲酸、甲苯磺酸、甲磺酸、苯磺酸、乙二磺酸、2-羟乙基磺酸、硝酸、苯甲酸、2-乙酰氧基苯甲酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸、硬脂酸、水杨酸、谷氨酸、抗坏血酸、帕莫酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、丙酸、羟基马来酸、氢碘酸、苯乙酸、烷酸如诸乙酸、HOOC-(CH)2)n-COOH，其中n是0-4等。类似地，药学上可接受的阳离子包括但不限于钠、钾、钙、铝、锂和铵。本领域普通技术人员将从本公开内容和本领域知识中认识到，其他的药学上可接受的盐包括Remington’sPharmaceutical Sciences，第17版，Mack PublishingCompany，Easton，PA，第1418页(1985)列出的那些。通常，药学上可接受的酸盐或碱盐可以通过任何常规化学方法从包含碱性或酸性部分的母体化合物合成。简言之，这样的盐可以通过将这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量量的适当碱或酸在适当的溶剂中反应来制备。
本文提供的范围被理解为该范围内所有值的简写。例如，1至50的范围被理解为包括来自由以下组成的组的任何数字、数字的组合或子范围：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50，以及上述整数之间的所有中间小数数值，诸如，例如1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8和1.9。关于子范围，从范围的任一端点延伸的“嵌套子范围(nested sub-range)”被特别地设想。例如，1至50的示例性范围的嵌套子范围可以包括在一个方向上的1至10、1至20、1至30和1至40，或者在另一个方向上的50至40、50至30、50至20和50至10。
术语“受试者”是指作为治疗、观察或实验对象的动物。仅以示例的方式，受试者包括但不限于哺乳动物，包括但不限于人类或非人哺乳动物，诸如非人灵长类动物、牛科动物、马科动物、犬科动物、羊科动物或猫科动物。
术语“任选的”或“任选地”表示随后描述的事件或情形可以发生但不必须发生，并且表示该描述包括其中该事件或情形发生的情况和其中该事件或情形没有发生的情况。
术语“部分”是指分子的特定区段或官能团。化学部分通常是嵌入或附加至分子上的公认的化学实体。
如本文使用的，术语“数均分子量”(Mn)意指样品中所有个体单元的统计平均分子量，并且由式(1)定义：
Figure BDA0004186569250000181
其中Mi是单元的分子量并且Ni是该分子量的单元数。
如本文使用的，术语“重均分子量”(Mw)意指由式(2)定义的数：
Figure BDA0004186569250000182
其中Mi是单元的分子量并且Ni是该分子量的单元数。
如本文使用的，“峰值分子量”(Mp)意指在特定的分析方法(例如质谱、尺寸排阻色谱、动态光散射、分析型离心等)中最高峰值的分子量。
II.修饰的IL-18多肽
本公开内容涉及可用作治疗剂的修饰的IL-18多肽。本文提供的修饰的IL-18多肽可以用作免疫疗法或作为其他免疫疗法方案的部分。这样的修饰的IL-18多肽可能对IL-18受体(IL-18R)展示出与野生型IL-18不同的结合特征。
在一方面，本文描述的修饰的IL-18多肽对IL-18Rα或IL-18Rβ具有增加的亲和力。在一方面，本文描述的修饰的IL-18多肽对IL-18Rα或IL-18Rβ具有降低的亲和力。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽对IL-18Rα/β异源二聚体具有增加的亲和力。在一方面，本文描述的修饰的IL-18多肽对IL-18Rα/β异源二聚体具有降低的亲和力。
在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽与IL-18Rα之间的结合亲和力等于或低于野生型IL-18与IL-18Rα之间的结合亲和力。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽与IL-18Rα之间的结合亲和力等于或高于野生型IL-18与IL-18Rα之间的结合亲和力。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽与IL-18Rβ之间的结合亲和力等于或低于野生型IL-18与IL-18Rβ之间的结合亲和力。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽与IL-18Rβ之间的结合亲和力等于或高于野生型IL-18与IL-18Rβ之间的结合亲和力。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽与IL-18Rα/β异源二聚体之间的结合亲和力等于或低于野生型IL-18与IL-18Rα/β异源二聚体之间的结合亲和力。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽与IL-18Rα/β异源二聚体之间的结合亲和力等于或高于野生型IL-18与IL-18Rα/β异源二聚体之间的结合亲和力。图2A图示了合成的野生型IL-18多肽。
在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-18多肽在向患者施用后展示出诱导干扰素γ(IFNγ)产生的能力。在一些实施方案中，诱导IFNγ的能力与野生型IL-18诱导IFNγ的能力相当(例如，展示出在野生型IL-18的IFNγ诱导的EC50的约10倍以内的IFNγ诱导的EC50)。本文提供的展示该特征的示例性IL-18多肽在图6A中示出，其示出了IFNγ产生(ng/mL，y轴)随野生型与修饰的IL-18多肽(突变蛋白)的浓度(nM，x轴)变化的比较。在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-18多肽还展示出对IL-18结合蛋白(IL-18BP)的减少的结合。在一些实施方案中，即使在IL-18BP存在的情况下，本文提供的修饰的IL-18多肽也可以诱导IFNγ(例如，修饰的IL-18多肽诱导IFNγ的能力基本上不受IL-18BP存在的抑制)(nM，x轴)。与野生型IL-18相比，具有这种特性的IL-18多肽的实例在图6B中示出，其示出了在用相同水平的野生型IL-18(圆形)或本文提供的修饰的IL-18多肽(倒三角形)处理的样品中，IFNγ产生(ng/mL，y轴)随IL-18BP浓度(nM，x轴)的变化。值得注意的是，在IL-18BP存在的情况下，本文提供的修饰的IL-18多肽未显示出其诱导IFNγ的能力受到抑制，而野生型IL-18的这种能力随着IL-18BP浓度的增加显示出大幅降低。在一些实施方案中，与野生型IL-18相比，本文提供的修饰的IL-18多肽展示出相似的或仅略微降低的诱导IFNγ产生的能力。在一些实施方案中，与野生型IL-18相比，本文提供的修饰的IL-18多肽展示出对在IL-18BP存在的情况下诱导IFNγ产生的能力的抑制的显著降低。在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-18多肽展示出与野生型IL-18相比相似的或仅略微降低的诱导IFNγ产生的能力，以及与野生型IL-18相比对在IL-18BP存在的情况下诱导IFNγ产生的能力的抑制的显著降低。
如本文描述的修饰的IL-18多肽可以包含一个或更多个非典型氨基酸。“非典型”氨基酸可以指不属于通常掺入天然存在的蛋白中的20种典型氨基酸的D形式或L形式的氨基酸残基。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽的一个或更多个氨基酸用一个或更多个非典型氨基酸取代。非典型氨基酸包括但不限于N-α-(9-芴甲氧羰基)-L-叠氮基赖氨酸)(Fmoc-L-Lys(N3)-OH)、N-α-(9-芴甲氧羰基)-L-联苯丙氨酸(Fmoc-L-Bip-OH)和N-α-(9-芴甲氧羰基)-O-苄基-L-酪氨酸(Fmoc-L-Tyr(Bzl)-OH)。
示例性非典型氨基酸包括叠氮基-赖氨酸(AzK)、羟赖氨酸、别羟赖氨酸、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、5-羟赖氨酸、Fmoc-Lys(Me，Boc)、Fmoc-Lys(Me)3、Fmoc-Lys(棕榈酰)、Fmoc-L-photo-赖氨酸、DL-5-羟赖氨酸、H-L-photo-赖氨酸和/或其它类似氨基酸。示例性非典型氨基酸还包括D-甲硫氨酸、硒代半胱氨酸和/或其它类似氨基酸。
示例性非典型氨基酸还包括p-乙酰基-L-苯丙氨酸、p-碘-L-苯丙氨酸、p-甲氧基苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、p-炔丙基氧基苯丙氨酸、p-炔丙基-苯丙氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcp-丝氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、p-叠氮基-L-苯丙氨酸、p-酰基-L-苯丙氨酸、p-苯甲酰基-L-苯丙氨酸、p-硼苯丙氨酸、O-炔丙基酪氨酸、L-磷酸丝氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸酪氨酸、p-溴苯丙氨酸、p-氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、酪氨酸氨基酸的类似物；谷氨酰胺氨基酸的类似物；苯丙氨酸氨基酸的类似物；丝氨酸氨基酸的类似物；苏氨酸氨基酸的类似物；烷基(alkyl)、芳基、酰基、叠氮基、氰基、卤素、肼、酰肼、羟基、烯基、炔基、醚、硫醇、磺酰基、硒基、酯、硫代酸、硼酸(borate)、硼酸(boronate)、磷酸、膦酰基、膦、杂环、烯酮、亚胺、醛、羟胺、酮基或氨基取代的氨基酸、β-氨基酸；除了脯氨酸或组氨酸之外的环状氨基酸；除了苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸之外的芳族氨基酸；或其组合。在一些实施方案中，非典型氨基酸选自β-氨基酸、高氨基酸、环状氨基酸和具有衍生化侧链的氨基酸。在一些实施方案中，非典型氨基酸包括β-丙氨酸、β-氨基丙酸、哌啶酸、氨基己酸、氨基庚酸、氨基庚二酸、锁链素、二氨基庚二酸、Nα-乙基甘氨酸、Nα-乙基天冬酰胺、异锁链素、别异亮氨酸，ω-甲基精氨酸，Nα-甲基甘氨酸、Nα-甲基异亮氨酸、Nα-甲基缬氨酸、γ-羧基谷氨酸、O-磷酸丝氨酸、Nα-乙酰丝氨酸、Nα-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸和/或其它类似氨基酸。
在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽的氨基酸残基用修饰的赖氨酸残基取代。在一些实施方案中，修饰的赖氨酸残基包含氨基、叠氮化物、烯丙基、酯和/或酰胺官能团。在一些实施方案中，修饰的赖氨酸残基包含缀合手柄，其可用作有用的锚点以将另外的部分附接到修饰的IL-18多肽。在一些实施方案中，修饰的赖氨酸残基具有由前体结构1、结构2、结构3或结构4构建的结构：
Figure BDA0004186569250000211
在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含修饰的氨基酸残基的取代，其可用于另外的官能团的附接，另外的官能团可用于促进各种有效载荷(例如聚合物)与修饰的IL-18多肽的缀合反应或附接。取代可以是更易于另外官能团的附接的天然存在的氨基酸(例如，天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸)、任何天然存在的氨基酸的修饰形式的衍生物、或任何非天然氨基酸(例如，包含期望的反应性基团(诸如点击化学试剂，诸如叠氮化物、炔烃等)的氨基酸)。这样的修饰的氨基酸残基的非限制性实例包括下面提供的修饰的赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和半胱氨酸：
Figure BDA0004186569250000221
Figure BDA0004186569250000222
其中每个n是1-30的整数。修饰的氨基酸残基的这些非限制性实例可用于期望向修饰的IL-18多肽添加另外官能团(例如聚合物)的任何位置处。
位点特异性修饰
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-18多肽包含在一个或更多个氨基酸残基处的一个或更多个修饰。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽的残基位置编号基于野生型人类IL-18多肽作为参考序列。
本文描述的多肽的修饰包括突变、各种官能团的添加、氨基酸的缺失、氨基酸的添加、或者蛋白或蛋白片段的野生型形式的任何其他改变。可以添加至多肽的官能团包括聚合物、接头、烷基基团、可检测的分子诸如生色团或荧光团、反应性官能团或其任何组合。在一些实施方案中，官能团被添加至多肽的个体氨基酸。在一些实施方案中，官能团被位点特异性地添加至多肽。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-18多肽包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个修饰的氨基酸残基。在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-18多肽包含1个修饰的氨基酸残基。在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-18多肽包含2个修饰的氨基酸残基。在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-18多肽包含3个修饰的氨基酸残基。图2B图示了具有2个修饰的氨基酸残基的修饰的合成IL-18多肽。
在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-18多肽包含本文提供的SEQ ID NO:2-58中任何一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含与SEQ ID NO:2-58中任何一个的序列至少85％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-18多肽包含本文提供的SEQ ID NO:2-83中任何一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含与SEQ ID NO:2-83中任何一个的序列至少85％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含与SEQ ID NO:2的序列至少85％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含与SEQ ID NO:7的序列至少85％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含与SEQID NO:18的序列至少85％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，序列同一性使用矩阵BLOSUM62的以下参数通过蛋白-蛋白BLAST算法测量：空位成本存在:11、延伸:1和组分调整条件组分评分矩阵调整(Compositional Adjustments Conditional CompositionalScore Matrix Adjustment)。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-18多肽包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或至少9个氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含3个至9个氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含3个或4个氨基酸取代，3个至5个氨基酸取代、3个至6个氨基酸取代、3个至7个氨基酸取代、3个至9个氨基酸取代、4个或5个氨基酸取代、4个至6个氨基酸取代、4个至7个氨基酸取代、4个至9个氨基酸取代、5个或6个氨基酸取代、5个至7个氨基酸取代、5个至9个氨基酸取代、6个或7个氨基酸取代、6个至9个氨基酸取代或7个至9个氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含3个氨基酸取代、4个氨基酸取代、5个氨基酸取代、6个氨基酸取代、7个氨基酸取代或9个氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含至多4个氨基酸取代、5个氨基酸取代、6个氨基酸取代、7个氨基酸取代或9个氨基酸取代。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-18多肽包含第二修饰。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含第三修饰。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含第二修饰和第三修饰。
在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含基于人类IL-1837-193的序列(SEQ IDNO:1)的氨基酸残基1-127范围内的两个修饰。SEQ ID NO:1反映了IL-18的生物活性形式。内源性地，IL-18最初表达时在N-末端具有另外的36个氨基酸的区段，该区段被胱天蛋白酶裂解以介导生物活性。在一些实施方案中，一个修饰在基于SEQ ID NO:1的氨基酸残基6-63的范围内。在一些实施方案中，一个修饰位于氨基酸残基6处。在一些实施方案中，一个修饰位于氨基酸残基53-63的范围内。在一些实施方案中，一个修饰位于氨基酸残基53处。在一些实施方案中，一个修饰位于氨基酸残基63处。
在一方面，本文描述了一种修饰的白细胞介素-18(IL-18)多肽，其包含含有E06K和K53A的修饰的IL-18多肽，其中修饰的IL-18多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。
在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽还包含T63A。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽还包含Y01X、S55X、F02X、D54X、C38X、C68X、C76X、C127X或K70X中的至少一种，其中X是氨基酸或氨基酸衍生物。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽还包含Y01X、S55X、F02X、D54X、C38X、C68X、E69X、C76X、C127X或K70X中的至少一种，其中每个X独立地是氨基酸或氨基酸衍生物。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽还包含Y01G、S55A、F02A、D54A、C38S、C68S、C76S、C127S或K70C中的至少一种。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽还包含Y01G、S55A、F02A、D54A、C38S、C38A、C68S、C68A、C76S、C76A、C127S、C127A或K70C中的至少一种。
在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含对SEQ ID NO:1的氨基酸序列的至少一种修饰，该修饰选自：Y01X、F02X、E06X、S10X、V11X、D17X、C38X、M51X、K53X、D54X、S55X、T63X、C68X、K70X、C76X和C127X，其中X是天然或非天然氨基酸。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含对SEQ ID NO:1的氨基酸序列的至少一种修饰，该修饰选自：Y01X、F02X、E06X、S10X、V11X、D17X、C38X、M51X、K53X、D54X、S55X、T63X、C68X、E69X、K70X、C76X和C127X，其中每个X独立地是天然或非天然氨基酸。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含对SEQID NO:1的氨基酸序列的至少一种修饰，该修饰选自：Y01X、F02X、E06X、S10X、V11X、D17X、C38X、M51X、K53X、D54X、S55X、T63X、C68X、K70X、C76X和C127X，其中X是天然或非天然氨基酸。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含对SEQ ID NO:1的氨基酸序列的至少一种修饰，该修饰选自：Y01G、F02A、E06K、S10T、V11I、D17N、C38S、M51G、K53A、D54A、S55A、T63A、C68S、K70C、C76S和C127S。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含对SEQ ID NO:1的氨基酸序列的至少一种修饰，该修饰选自：Y01G、F02A、E06K、S10T、V11I、D17N、C38S、C38A、M51G、K53A、D54A、S55A、T63A、C68S、C68A、K70C、C76S、C76A、C127A和C127S。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含对SEQ ID NO:1的氨基酸序列的至少一种修饰，该修饰选自：Y01G、F02A、E06K、S10T、V11I、D17N、C38S、C38A、M51G、K53A、D54A、S55A、T63A、C68S、C68A、E69C、K70C、C76S、C76A、C127A和C127S。
在一些实施方案中，修饰的IL-18肽包含对SEQ ID NO:1的氨基酸序列的一种修饰，其中该修饰是E06X、K53X、S55X或T63X，其中X是天然或非天然氨基酸。在一些实施方案中，修饰的IL-18肽包含对SEQ ID NO:1的氨基酸序列的一种修饰，其中该修饰是E06X、K53X、S55X或T63X，其中每个X独立地是天然或非天然氨基酸。在一些实施方案中，修饰的IL-18肽包含对SEQ ID NO:1的氨基酸序列的两种修饰，其中该修饰是E06X和K53X；E06X和S55X；K53X和S55X；E06X和T63X；或K53X和T63X，其中X是天然或非天然氨基酸。在一些实施方案中，修饰的IL-18肽包含对SEQ ID NO:1的氨基酸序列的三种修饰，其中该修饰是E06X、K53X和S55X；或E06X、K53X和T63X，其中X是天然或非天然氨基酸。在一些实施方案中，修饰的IL-18肽包含对SEQ ID NO:1的氨基酸序列的四种修饰，其中该修饰是E06X、K53X、S55X和T63X；E06X、K53X、S55X和Y01X；E06X、K53X、S55X和F02X；E06X、K53X、S55X和D54X；E06X、K53X、S55X和M51X；或C38X、C68X、C76X和C127X，其中X是天然或非天然氨基酸。在一些实施方案中，修饰的IL-18肽包含对SEQ ID NO:1的氨基酸序列的四种修饰，其中该修饰是E06X、K53X、S55X和T63X；E06X、K53X、S55X和Y01X；E06X、K53X、S55X和F02X；E06X、K53X、S55X和D54X；E06X、K53X、S55X和M51X；C38X、E69X、C76X和C127X；或C38X、E70X、C76X和C127X，其中X是天然或非天然氨基酸。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含对SEQ ID NO:1的氨基酸序列的至少4种修饰，其中至少4种修饰是E06X、K53X、C68X和E69X；E06X、K53X、C68X和K70X；E06X、K53X、T63X和E69X；或E06X、K53X、T63X和K70X。在一些实施方案中，修饰的IL-18肽包含对SEQ ID NO:1的氨基酸序列的五种修饰，其中该修饰是C38X、C68X、C76X、C127X和K70X，其中X是天然或非天然氨基酸。在一些实施方案中，修饰的IL-18肽包含对SEQ ID NO:1的氨基酸序列的五种修饰，其中该修饰是C38X、C68X、C76X、C127X和E69X，其中X是天然或非天然氨基酸。在一些实施方案中，修饰的IL-18肽包含对SEQ ID NO:1的氨基酸序列的七种修饰，其中该修饰是E06X、K53X、C38X、C68X、C76X、C127X和K70X；或K53X、T63X、C38X、C68X、C76X、C127X和K70X，其中X是天然或非天然氨基酸。在一些实施方案中，修饰的IL-18肽包含对SEQ ID NO:1的氨基酸序列的七种修饰，其中该修饰是E06X、K53X、C38X、C68X、C76X、C127X和E69X；或K53X、T63X、C38X、C68X、C76X、C127X和E69X，其中X是天然或非天然氨基酸。在一些实施方案中，修饰的IL-18肽包含对SEQ ID NO:1的氨基酸序列的八种修饰，其中该修饰是Y01X、F02X、E06X、M51X、K53X、D54X、S55X和T63X；或E06X、K53X、S55X、C38X、C68X、C76X、C127X和K70X，其中X是天然或非天然氨基酸。在一些实施方案中，修饰的IL-18肽包含对SEQ ID NO:1的氨基酸序列的八种修饰，其中该修饰是E06X、K53X、S55X、C38X、C68X、C76X、C127X和E69X。在一些实施方案中，其中多于一个氨基酸残基被天然或非天然氨基酸X替代，每个X独立地是相同或不同的氨基酸。
在一些实施方案中，修饰的IL-18肽包含对SEQ ID NO:1的氨基酸序列的一种修饰，其中该修饰是E06K、K53A、S55A或T63A。在一些实施方案中，修饰的IL-18肽包含对SEQID NO:1的氨基酸序列的两种修饰，其中该修饰是E06K和K53A；E06K和S55A；K53A和S55A；E06K和T63A；或K53A和T63A。在一些实施方案中，修饰的IL-18肽包含对SEQ ID NO:1的氨基酸序列的三种修饰，其中该修饰是E06K、K53A和S55A；或E06K、K53A和T63A。在一些实施方案中，修饰的IL-18肽包含对SEQ ID NO:1的氨基酸序列的四种修饰，其中该修饰是E06K、K53A、S55A和T63A；E06K、K53A、S55A和Y01G；E06K、K53A、S55A和F02A；E06K、K53A、S55A和D54A；E06K、K53A、S55A和M51G；或C38S、C68S、C76S和C127S。在一些实施方案中，修饰的IL-18肽包含对SEQ ID NO:1的氨基酸序列的五种修饰，其中该修饰是C38S、C68S、C76S、C127S和K70C。在一些实施方案中，修饰的IL-18肽包含对SEQ ID NO:1的氨基酸序列的五种修饰，其中该修饰是C38S、C68S、C76S、C127S和E69C。在一些实施方案中，修饰的IL-18肽包含对SEQ ID NO:1的氨基酸序列的七种修饰，其中该修饰是E06K、K53A、C38S、C68S、C76S、C127S和K70C；或K53A、T63A、C38S、C68S、C76S、C127S和K70C。在一些实施方案中，修饰的IL-18肽包含对SEQ ID NO:1的氨基酸序列的七种修饰，其中该修饰是E06K、K53A、C38S、C68S、C76S、C127S和E69C；或K53A、T63A、C38S、C68S、C76S、C127S和E69C。在一些实施方案中，修饰的IL-18肽包含对SEQ ID NO:1的氨基酸序列的八种修饰，其中该修饰是Y01G、F02A、E06K、M51G、K53A、D54A、S55A和T63A；或E06K、K53A、S55A、C38S、C68S、C76S、C127S和K70C。在一些实施方案中，修饰的IL-18肽包含对SEQ ID NO:1的氨基酸序列的八种修饰，其中该修饰是Y01G、F02A、E06K、M51G、K53A、D54A、S55A和T63A；或E06K、K53A、S55A、C38S、C68S、C76S、C127S和E69C。
在一方面，本文提供了一种修饰的IL-18多肽，其包含含有E06K和K53A的修饰的IL-18多肽，其中修饰的IL-18多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽具有与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽还包含在一个或更多个半胱氨酸残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含一个或更多个半胱氨酸用丝氨酸或丙氨酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽在每个半胱氨酸残基处包含氨基酸取代。在一些实施方案中，每个半胱氨酸残基用丝氨酸或丙氨酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含附接在残基68、69或70处的聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含在1个、2个、3个、4个、5个或6个甲硫氨酸残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，甲硫氨酸残基处的每个取代为O-甲基-L-高丝氨酸残基。在一些实施方案中，每个甲硫氨酸残基用O-甲基-L-高丝氨酸残基取代。
在一方面，本文提供了一种修饰的IL-18多肽，其包含含有E06K和S55A的修饰的IL-18多肽，其中修饰的IL-18多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽具有与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽还包含在一个或更多个半胱氨酸残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含一个或更多个半胱氨酸用丝氨酸或丙氨酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽在每个半胱氨酸残基处包含氨基酸取代。在一些实施方案中，每个半胱氨酸残基用丝氨酸或丙氨酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含附接在残基68、69或70处的聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含在1个、2个、3个、4个、5个或6个甲硫氨酸残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，甲硫氨酸残基处的每个取代为O-甲基-L-高丝氨酸残基。在一些实施方案中，每个甲硫氨酸残基用O-甲基-L-高丝氨酸残基取代。
在一方面，本文提供了一种修饰的IL-18多肽，其包含含有E06K、K53A、S55A和T63A的修饰的IL-18多肽，其中修饰的IL-18多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽具有与SEQ ID NO:10的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽还包含在一个或更多个半胱氨酸残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含一个或更多个半胱氨酸用丝氨酸或丙氨酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽在每个半胱氨酸残基处包含氨基酸取代。在一些实施方案中，每个半胱氨酸残基用丝氨酸或丙氨酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含附接在残基68、69或70处的聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含在1个、2个、3个、4个、5个或6个甲硫氨酸残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，甲硫氨酸残基处的每个取代为O-甲基-L-高丝氨酸残基。在一些实施方案中，每个甲硫氨酸残基用O-甲基-L-高丝氨酸残基取代。
在一方面，本文提供了一种修饰的IL-18多肽，其包含含有E06K、K53A和T63A的修饰的IL-18多肽，其中修饰的IL-18多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽具有与SEQ ID NO:18的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽还包含在一个或更多个半胱氨酸残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含一个或更多个半胱氨酸用丝氨酸或丙氨酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽在每个半胱氨酸残基处包含氨基酸取代。在一些实施方案中，每个半胱氨酸残基用丝氨酸或丙氨酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含附接在残基68、69或70处的聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含在1个、2个、3个、4个、5个或6个甲硫氨酸残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，甲硫氨酸残基处的每个取代为O-甲基-L-高丝氨酸残基。在一些实施方案中，每个甲硫氨酸残基用O-甲基-L-高丝氨酸残基取代。
在一方面，本文提供了一种修饰的IL-18多肽，其包含含有T63A的修饰的IL-18多肽，其中修饰的IL-18多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽具有与SEQ ID NO:19的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽还包含在一个或更多个半胱氨酸残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含一个或更多个半胱氨酸用丝氨酸或丙氨酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽在每个半胱氨酸残基处包含氨基酸取代。在一些实施方案中，每个半胱氨酸残基用丝氨酸或丙氨酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含附接在残基68、69或70处的聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含在1个、2个、3个、4个、5个或6个甲硫氨酸残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，甲硫氨酸残基处的每个取代为O-甲基-L-高丝氨酸残基。在一些实施方案中，每个甲硫氨酸残基用O-甲基-L-高丝氨酸残基取代。
在一方面，本文提供了一种修饰的IL-18多肽，其包含含有E06K和T63A的修饰的IL-18多肽，其中修饰的IL-18多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽具有与SEQ ID NO:20的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽还包含在一个或更多个半胱氨酸残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含一个或更多个半胱氨酸用丝氨酸或丙氨酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽在每个半胱氨酸残基处包含氨基酸取代。在一些实施方案中，每个半胱氨酸残基用丝氨酸或丙氨酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含附接在残基68、69或70处的聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含在1个、2个、3个、4个、5个或6个甲硫氨酸残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，甲硫氨酸残基处的每个取代为O-甲基-L-高丝氨酸残基。在一些实施方案中，每个甲硫氨酸残基用O-甲基-L-高丝氨酸残基取代。
在一方面，本文提供了一种修饰的IL-18多肽，其包含含有E06K、K53A、C38S、C76S和C127S的修饰的IL-18多肽，其中修饰的IL-18多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽具有与SEQ ID NO:70的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含附接在残基68、69或70处的聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含在1个、2个、3个、4个、5个或6个甲硫氨酸残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，甲硫氨酸残基处的每个取代为O-甲基-L-高丝氨酸残基。在一些实施方案中，每个甲硫氨酸残基用O-甲基-L-高丝氨酸残基取代。
在一方面，本文提供了一种修饰的IL-18多肽，其包含含有E06K、C38S和K53A的修饰的IL-18多肽，其中修饰的IL-18多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽具有与SEQ ID NO:71的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含附接在残基68、69或70处的聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含附接在残基68处的聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含在1个、2个、3个、4个、5个或6个甲硫氨酸残基处的氨基酸取代。在一些实施方案中，甲硫氨酸残基处的每个取代为O-甲基-L-高丝氨酸残基。在一些实施方案中，每个甲硫氨酸残基用O-甲基-L-高丝氨酸残基取代。
在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含与SEQ ID NO:2-58具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％序列同一性的多肽序列。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含与SEQ ID NO:2-83具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％序列同一性的多肽序列。在一些实施方案中，多肽序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:18至少约80％相同。在一些实施方案中，多肽序列与SEQ ID NO:2至少约80％相同。在一些实施方案中，多肽序列与SEQ ID NO:2至少约90％相同。在一些实施方案中，多肽序列与SEQ ID NO:2至少约95％相同。在一些实施方案中，多肽序列与SEQ ID NO:18至少约80％相同。在一些实施方案中，多肽序列与SEQ ID NO:18至少约90％相同。在一些实施方案中，多肽序列与SEQ ID NO:18至少约95％相同。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽是重组体。
在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含选自以下的一个或更多个氨基酸取代：(a)位于残基26-36的任何一个处的高丝氨酸残基；(b)位于残基60-80的任何一个处的高丝氨酸残基；(c)位于残基110-120的任何一个处的高丝氨酸残基；(d)位于残基28-38的任何一个处的正亮氨酸残基；(d)位于残基46-56的任何一个处的正亮氨酸残基；(e)位于残基54-64的任何一个处的正亮氨酸残基；(f)位于残基80-90的任何一个处的正亮氨酸残基；(g)位于残基108-118的任何一个处的正亮氨酸残基；以及(h)位于残基145-155的任何一个处的正亮氨酸残基；其中该修饰的IL-18多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。
在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含选自以下的一个或更多个氨基酸取代：(a)位于残基26-36的任何一个处的高丝氨酸残基；(b)位于残基60-80的任何一个处的高丝氨酸残基；(c)位于残基110-120的任何一个处的高丝氨酸残基；(d)位于残基28-38的任何一个处的正亮氨酸或O-甲基-高丝氨酸残基；(e)位于残基46-56的任何一个处的正亮氨酸或O-甲基-高丝氨酸残基；(f)位于残基54-64的任何一个处的正亮氨酸或O-甲基-高丝氨酸残基；(g)位于残基80-90的任何一个处的正亮氨酸或O-甲基-高丝氨酸残基；(h)位于残基108-118的任何一个处的正亮氨酸或O-甲基-高丝氨酸残基；以及(i)位于残基145-155的任何一个处的正亮氨酸或O-甲基-高丝氨酸残基；其中该修饰的IL-18多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。
在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含选自以下的一个或更多个氨基酸取代：(a)位于残基26-36的任何一个处的高丝氨酸残基；(b)位于残基60-80的任何一个处的高丝氨酸残基；(c)位于残基110-120的任何一个处的高丝氨酸残基；(d)位于残基28-38的任何一个处的正亮氨酸或O-甲基-高丝氨酸残基；(e)位于残基46-56的任何一个处的O-甲基-高丝氨酸残基；(f)位于残基54-64的任何一个处的O-甲基-高丝氨酸残基；(g)位于残基80-90的任何一个处的O-甲基-高丝氨酸残基；(h)位于残基108-118的任何一个处的O-甲基-高丝氨酸残基；以及(i)位于残基145-155的任何一个处的O-甲基-高丝氨酸残基；其中该修饰的IL-18多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。
在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含选自以下的一个或更多个氨基酸取代：高丝氨酸(Hse)31、正亮氨酸(Nle)33、Nle51、Nle59、Hse75、Nle86、Nle113、Hse116和Nle150。在一些实施方案中，修饰的IL-18肽包含用O-甲基-L-高丝氨酸进行的氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-18肽包含在位置Met 33、Met 51、Met 60、Met 86、Met 113或Met 150处用O-甲基-L-高丝氨酸进行的氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含选自以下的一个或更多个氨基酸取代：高丝氨酸(Hse)31、正亮氨酸(Nle)33、O-甲基-高丝氨酸(Omh)33、Nle51、Omh51、Nle60、Omh60、Hse75、Nle86、Omh86、Hse116、Nle113、Omh113、Nle150和Omh150。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-18多肽包含接头部分。在一些实施方案中，接头部分包括但不限于聚合物、接头、间隔物或其组合。当添加至某些氨基酸残基时，接头部分可以调节修饰的IL-18多肽与野生型IL-18相比的活性或其他特性。
在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽与另外的多肽连接。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽与另外的多肽形成融合多肽。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽与另外的多肽缀合在一起。在一些实施方案中，另外的多肽包含抗体或其结合片段。在一些实施方案中，抗体包括人源化抗体、鼠抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、其任何片段或其任何组合。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体或其任何片段。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽与细胞因子缀合。
III.包含聚合物部分的修饰的IL-18多肽
本文描述的修饰的IL-18多肽可以包含一种或更多种聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽与一种聚合物部分缀合。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽与两种聚合物部分缀合。对某些氨基酸残基添加聚合物可以破坏修饰的IL-18多肽与IL-18BP的结合相互作用。图2C图示了包含聚合物部分的修饰的合成IL-18多肽。
在一些实施方案中，与一种或更多种聚合物部分缀合的修饰的IL-18多肽可以保持与IL-18Rα的结合，并具有与IL-18BP的减少的结合相互作用。在一些实施方案中，与一种或更多种聚合物部分缀合的修饰的IL-18多肽可以具有与IL-18Rα的增加的结合，并具有与IL-18BP的减少的结合相互作用。在一些实施方案中，与一种或更多种聚合物部分缀合的修饰的IL-18多肽可以保持与IL-18Rα/β异源二聚体的结合，并具有与IL-18BP的减少的结合相互作用。在一些实施方案中，与一种或更多种聚合物部分缀合的修饰的IL-18多肽可以具有与IL-18Rα/β异源二聚体的增加的结合，并具有与IL-18BP的减少的结合相互作用。
在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含共价附接在残基65、残基66、残基67、残基68、残基69、残基70、残基71、残基72、残基73、残基74或残基75处的聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含共价附接在残基C68处的聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含共价附接在残基68处的聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含共价附接在残基70处的聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含共价附接在残基K70处的聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含共价附接在残基69处的聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含共价附接在残基E69处的聚合物。
在一些实施方案中，聚合物通过修饰的氨基酸α共价附接。在一些实施方案中，修饰的氨基酸α是氨基酸-PEG-叠氮化物基团。在一些实施方案中，修饰的氨基酸α是谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、半胱氨酸或酪氨酸，这些氨基酸被修饰以掺入通过PEG间隔物与氨基酸连接的叠氮化物基团。在一些实施方案中，修饰的氨基酸α具有选自以下的结构：
Figure BDA0004186569250000351
其中每个n独立地是1-30中的整数。在一些实施方案中，n是1-20、1-10、2-30、2-20、2-10、5-30、5-20或5-10的整数。在一些实施方案中，n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。在一些实施方案中，n是10。在一些实施方案中，n是8。在一些实施方案中，n是6。在一些实施方案中，n是12。
在一些实施方案中，修饰的氨基酸α位于修饰的IL-18多肽上选自残基65、残基66、残基67、残基68、残基69、残基70、残基71、残基72、残基73、残基74和残基75的位置处。在一些实施方案中，修饰的氨基酸α位于修饰的IL-18多肽上选自残基68、残基69和残基70的位置处。在一些实施方案中，修饰的氨基酸α位于修饰的IL-18多肽的残基68处。在一些实施方案中，修饰的氨基酸α位于修饰的IL-18多肽的残基69处。在一些实施方案中，修饰的氨基酸α位于修饰的IL-18多肽的残基70处。
在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含与修饰的赖氨酸残基共价附接的聚合物。在一些实施方案中，修饰的赖氨酸残基包含缀合手柄。在一些实施方案中，修饰的赖氨酸残基包含叠氮化物。在一些实施方案中，修饰的赖氨酸残基具有结构B的结构，其中结构B是
Figure BDA0004186569250000361
或者/>
Figure BDA0004186569250000362
其中每个n独立地是1-30的整数。在一些实施方案中，n是1-20、1-10、2-30、2-20、2-10、5-30、5-20或5-10中的整数。在一些实施方案中，n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。在一些实施方案中，n是1、2、3、4、5、6、7或8。在一些实施方案中，n是3。在一些实施方案中，n是4。在一些实施方案中，n是5。在一些实施方案中，n是6。在一些实施方案中，n是8。在一些实施方案中，n是10。在一些实施方案中，n是12。
在一些实施方案中，结构B的修饰的赖氨酸位于修饰的IL-18多肽上选自残基65、残基66、残基67、残基68、残基69、残基70、残基71、残基72、残基73、残基74和残基75的位置处。在一些实施方案中，结构B的修饰的赖氨酸位于修饰的IL-18多肽上选自残基68、残基69和残基70的位置处。在一些实施方案中，结构B的修饰的赖氨酸位于修饰的IL-18多肽的残基68处。在一些实施方案中，结构B的修饰的赖氨酸位于修饰的IL-18多肽的残基69处。在一些实施方案中，结构B的修饰的赖氨酸位于修饰的IL-18多肽的残基70处。
在一方面，本文描述了修饰的白细胞介素-18(IL-18)多肽群体，包含：a)多于一种修饰的IL-18多肽；和b)至少一种聚合物部分，其中至少一种聚合物部分与修饰的IL-18多肽共价连接并附接在残基65、残基66、残基67、残基68、残基69、残基70、残基71、残基72、残基73、残基74或残基75处，其中氨基酸残基位置是基于SEQ ID NO:1作为参考序列；其中修饰的IL-18多肽中的至少90％具有在如通过高分辨率电喷雾电离质谱(ESI-HRMS)确定的多于一种修饰的IL-18多肽的峰值分子量的±500Da内的分子量。在一些实施方案中，群体中的每种修饰的IL-18多肽包含至少一种与其共价连接的聚合物部分。
在一方面，本文描述了修饰的白细胞介素-18(IL-18)多肽群体，包含：a)多于一种修饰的IL-18多肽；和b)多于一种聚合物部分，其中多于一种聚合物部分与修饰的IL-18多肽共价连接并附接在修饰的IL-18多肽的残基65、残基66、残基67、残基68、残基69、残基70、残基71、残基72、残基73、残基74或残基75处，其中氨基酸残基位置是基于SEQ ID NO:1作为参考序列；其中多于一种聚合物部分中的至少90％具有在如通过高分辨率电喷雾电离质谱(ESI-HRMS)确定的多于一种聚合物部分的峰值分子量的±500Da内的分子量。
在一些实施方案中，至少75％的多于一种聚合物具有在如通过高分辨率电喷雾电离质谱(ESI-HRMS)确定的多于一种聚合物的峰值分子量的±10％内的分子量。在一些实施方案中，至少一种聚合物部分或多于一种聚合物部分与修饰的IL-18多肽在氨基酸残基68处共价连接，其中修饰的IL-18多肽的氨基酸残基编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，至少一种聚合物部分或多于一种聚合物部分与修饰的IL-18多肽在氨基酸残基69处共价连接，其中修饰的IL-18多肽的氨基酸残基编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，至少一种聚合物部分或多于一种聚合物部分与修饰的IL-18多肽在氨基酸残基70处共价连接，其中修饰的IL-18多肽的氨基酸残基编号是基于SEQ IDNO:1作为参考序列。在一些实施方案中，至少一种聚合物部分或多于一种聚合物部分与修饰的IL-18多肽在C68处共价连接，其中修饰的IL-18多肽的氨基酸残基编号是基于SEQ IDNO:1作为参考序列。在一些实施方案中，至少一种聚合物部分或多于一种聚合物部分与修饰的IL-18多肽在K70处共价连接，其中修饰的IL-18多肽的氨基酸残基编号是基于SEQ IDNO:1作为参考序列。
在一些实施方案中，多于一种修饰的IL-18多肽中的每种修饰的IL-18多肽包含一个或更多个突变。在一些实施方案中，一个或更多个突变位于选自E06、K53、Y01、S55、F02、D54、C38、T63A、C68、C76、C127和K70的残基位置处，其中修饰的IL-18多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，多于一种修饰的IL-18多肽中的每种修饰的IL-18多肽包含一个或更多个突变。在一些实施方案中，一个或更多个突变位于选自E06、K53、Y01、S55、F02、D54、C38、T63A、C68、C76、C127和E69的残基位置处，其中修饰的IL-18多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，一个或更多个突变选自E06K、K53A、Y01G、S55A、F02A、D54A、C38S、T63A、C68S、C76S、C127S和K70C。在一些实施方案中，一个或更多个突变是E06K和K53A。在一些实施方案中，一个或更多个突变选自E06K、K53A、Y01G、S55A、F02A、D54A、C38S、T63A、C68S、C76S、C127S和E69C。在一些实施方案中，一个或更多个突变是E06K、K53A和T63A。
在一些实施方案中，聚合物具有以下的重均分子量：至多约50,000道尔顿、至多约25,000道尔顿、至多约10,000道尔顿或至多约6,000道尔顿。在一些实施方案中，聚合物具有以下的重均分子量：至少约120道尔顿、至少约250道尔顿、至少约300道尔顿、至少约400道尔顿或至少约500道尔顿。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-18多肽包含共价附接在C68或K70处的第一聚合物，其中修饰的IL-18多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-18多肽包含共价附接在C68、E69或K70处的第一聚合物，其中修饰的IL-18多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-18多肽包含共价附接在C68处的第一聚合物，其中修饰的IL-18多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-18多肽包含共价附接在E69处的第一聚合物，其中修饰的IL-18多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-18多肽包含共价附接在K70处的第一聚合物，其中修饰的IL-18多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。
在一些实施方案中，与修饰的IL-18多肽缀合的聚合物是水溶性聚合物，诸如聚乙二醇(PEG)。聚合物可以被添加到IL-18多肽或其突变体的残基C68和K70中的一个或两个处。聚合物也可以被添加到IL-18多肽或其突变体的残基C68、E69和K70中的一个、两个或全部三个处。另外，聚合物可以被添加以修饰IL-18多肽，以增加多肽的半衰期。
在一些实施方案中，与一种或更多种聚合物部分缀合的修饰的IL-18多肽可以保持与IL-18Rα的结合，与IL-18BP具有减少的结合相互作用，并表现出增加的半衰期(t1/2)。在一些实施方案中，与一种或更多种聚合物部分缀合的修饰的IL-18多肽可以与IL-18Rα具有增加的结合，与IL-18BP具有减少的结合相互作用，并表现出增加的半衰期(t1/2)。在一些实施方案中，与一种或更多种聚合物部分缀合的修饰的IL-18多肽可以保持与IL-18Rαβ异源二聚体的结合，与IL-18BP具有减少的结合相互作用，并表现出增加的半衰期(t1/2)。在一些实施方案中，与一种或更多种聚合物部分缀合的修饰的IL-18多肽可以与IL-18Rαβ异源二聚体具有增加的结合，与IL-18BP具有减少的结合相互作用，并表现出增加的半衰期(t1/2)。在一些实施方案中，半衰期是在受试者血液中的体内半衰期。
半衰期延长性聚合物可以具有任何尺寸，包括至多约6kDa、至多约25kDa或至多约50kDa。在一些实施方案中，半衰期延长性聚合物是PEG聚合物。在一些实施方案中，半衰期延长性聚合物具有约200至约20,000的平均分子量，例如PEG 200、PEG 400、PEG 600、PEG1000、PEG 1450、PEG 1500、PEG 4000、PEG 4600和PEG 8000。
IIIa.聚合物
在一方面，本文描述了包含修饰的IL-18多肽的修饰的多肽，其中该修饰的IL-18多肽包含共价附接的聚合物。在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-18多肽包含共价附接在其上的一种或更多种聚合物。在一些实施方案中，描述的修饰的IL-18多肽包含与修饰的IL-18多肽共价附接的1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种聚合物。
在一些实施方案中，聚合物包含可用于进一步将另外的部分附接到修饰的IL-18多肽上的缀合手柄。能够与附接到另一个部分的互补反应基团反应的任何合适的反应基团都可以用作缀合手柄。在一些实施方案中，缀合手柄包括用于以下的试剂：Cu(I)催化或“无铜”的炔烃-叠氮三唑形成反应(例如，应力促进的环加成(strain promotedcycloaddition))、Staudinger连接、逆电子需求Diels-Alder(IEDDA)反应、“光点击”化学、与反式环辛烯的四嗪环加成、或金属介导的过程，诸如烯烃复分解和Suzuki-Miyaura或Sonogashira交叉偶联。
在一些实施方案中，缀合手柄包括用于“无铜”炔烃叠氮三唑形成反应的试剂。用于所述炔烃叠氮三唑形成反应的炔烃的非限制性实例包括环辛炔试剂(例如，含(1R,8S,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲醇的试剂、二苯并环辛炔-胺试剂、二氟环辛炔或其衍生物)。
在一些实施方案中，缀合手柄包括选自以下的反应基团：叠氮化物、炔烃、四嗪、卤化物、巯基、二硫化物、马来酰亚胺、活化酯、烯烃、醛、酮、亚胺、肼、酰基三氟硼酸盐、羟胺、膦，反式环辛烯和酰肼。在一些实施方案中，缀合手柄和互补缀合手柄包括“点击”化学试剂。点击化学残基的示例性基团在Hein等人,“Click Chemistry,A Powerful Tool forPharmaceutical Sciences,”Pharmaceutical Research,第25卷,第2216-2230页(2008)；Thirumurugan等人,“Click Chemistry for Drug Development and Diverse Chemical–Biology Applications,”Chem.Rev.2013,113,7,49054979；US20160107999A1；US10266502B2；和US20190204330A1中示出，其中每一个通过引用以其整体并入。
在一些实施方案中，聚合物包含缀合手柄或缀合手柄与互补缀合手柄的反应产物。在一些实施方案中，缀合手柄与互补缀合手柄的反应产物由KAT连接(酰基三氟硼酸钾与羟胺的反应)、Staudinger连接(叠氮化物与膦的反应)、四嗪环加成(四嗪与反式环辛烯的反应)、或Huisgen环加成(炔烃与叠氮化物的反应)产生。在一些实施方案中，聚合物将包含缀合手柄与用于将聚合物附接到修饰的IL-18多肽的互补缀合手柄的反应产物。
在一些实施方案中，聚合物包含叠氮化物部分。在一些实施方案中，聚合物包含叠氮化物部分、炔烃部分或叠氮基-炔烃环加成反应的反应产物。在一些实施方案中，叠氮基-炔烃环加成反应的反应产物是1,2,3-三唑。
在一些实施方案中，通过使用双官能接头将聚合物附接到修饰的IL-18多肽。在一些实施方案中，双官能接头与修饰的IL-18多肽上的氨基酸残基的反应基团(例如，半胱氨酸巯基)反应形成共价键。在一些实施方案中，在第二步中，双官能接头的第二反应基团(例如，缀合手柄，诸如叠氮化物或炔烃)然后用于附接第二部分，诸如聚合物。
在一些实施方案中，聚合物是水溶性聚合物。在一些实施方案中，水溶性聚合物包括聚(环氧烷)、多糖、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉、聚(丙烯酰吗啉)或其组合。在一些实施方案中，水溶性聚合物包括聚(环氧烷)。在一些实施方案中，聚(环氧烷)是聚乙二醇(PEG)。
在一些实施方案中，聚合物是第一聚合物。在一些实施方案中，第一聚合物包括水溶性聚合物。在一些实施方案中，水溶性聚合物包括聚(环氧烷)、多糖、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉、聚(丙烯酰吗啉)或其组合。在一些实施方案中，水溶性聚合物是聚(环氧烷)。在一些实施方案中，水溶性聚合物是多糖。在一些实施方案中，水溶性聚合物是聚(环氧乙烷)。
在一些实施方案中，聚乙二醇具有约10kDa至约50kDa的重均分子量。在一些实施方案中，聚乙二醇具有约10kDa、约20kDa或约30kDa的重均分子量。在一些实施方案中，聚乙二醇具有约30kDa的重均分子量。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽的半衰期比对应的野生型IL-18多肽的半衰期长至少10％。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽的半衰期比对应的野生型IL-18多肽的半衰期长至少30％。
在一些实施方案中，附接的聚合物具有约6,000道尔顿至约50,000道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，聚合物具有以下的重均分子量：约6,000道尔顿至约10,000道尔顿、约6,000道尔顿至约25,000道尔顿、约6,000道尔顿至约50,000道尔顿、约10,000道尔顿至约25,000道尔顿、约10,000道尔顿至约50,000道尔顿或约25,000道尔顿至约50,000道尔顿。在一些实施方案中，聚合物具有约6,000道尔顿、约10,000道尔顿、约25,000道尔顿或约50,000道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，聚合物具有至少约6,000道尔顿、约10,000道尔顿或约25,000道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，聚合物具有至多约10,000道尔顿、约25,000道尔顿或约50,000道尔顿的重均分子量。
在一些实施方案中，附接的聚合物诸如第一聚合物具有约120道尔顿至约1,000道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，聚合物具有以下的重均分子量：约120道尔顿至约250道尔顿、约120道尔顿至约300道尔顿、约120道尔顿至约400道尔顿、约120道尔顿至约500道尔顿、约120道尔顿至约1,000道尔顿、约250道尔顿至约300道尔顿、约250道尔顿至约400道尔顿、约250道尔顿至约500道尔顿、约250道尔顿至约1,000道尔顿、约300道尔顿至约400道尔顿、约300道尔顿至约500道尔顿、约300道尔顿至约1,000道尔顿、约400道尔顿至约500道尔顿、约400道尔顿至约1,000道尔顿或约500道尔顿至约1,000道尔顿。在一些实施方案中，聚合物具有约120道尔顿、约250道尔顿、约300道尔顿、约400道尔顿、约500道尔顿或约1,000道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，聚合物具有至少约120道尔顿、约250道尔顿、约300道尔顿、约400道尔顿或约500道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，聚合物具有至多约250道尔顿、约300道尔顿、约400道尔顿、约500道尔顿或约1,000道尔顿的重均分子量。
在一些实施方案中，附接的聚合物诸如第一聚合物包括水溶性聚合物。在一些实施方案中，水溶性聚合物包括聚(环氧烷)、多糖、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉、聚(丙烯酰吗啉)或其组合。在一些实施方案中，水溶性聚合物是聚(环氧烷)，诸如聚乙二醇(即，聚环氧乙烷)。在一些实施方案中，水溶性聚合物是聚乙二醇。在一些实施方案中，水溶性聚合物包括改性聚(环氧烷)。在一些实施方案中，改性聚(环氧烷)包含一个或更多个接头基团。在一些实施方案中，一个或更多个接头基团包括双官能接头，诸如酰胺基团、酯基团、醚基团、硫醚基团、羰基基团等。在一些实施方案中，一个或更多个接头基团包括酰胺接头基团。在一些实施方案中，改性聚(环氧烷)包含一个或更多个间隔物基团。在一些实施方案中，间隔物基团包括被取代或未被取代的C1-C6亚烷基基团。在一些实施方案中，间隔物基团包括-CH2-、-CH2CH2-或-CH2CH2CH2-。在一些实施方案中，接头基团是双正交反应(例如，生物相容性和选择性反应)的产物。在一些实施方案中，生物正交反应是Cu(I)催化或“无铜”的炔-叠氮三唑形成反应、Staudinger连接、逆电子需求Diels-Alder(IEDDA)反应、炔烃-硝酮环加成化学或金属介导的过程，诸如烯烃复分解和Suzuki-Miyaura或Sonogashira交叉偶联。在一些实施方案中，第一聚合物经由点击化学与IL-18多肽附接。
在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-18多肽包含一种或更多种选自表1的聚合物。
表1.用于修饰的IL-18多肽的聚合物结构
Figure BDA0004186569250000431
在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-18多肽包含促进修饰的IL-18多肽与衍生化分子或部分(诸如抗体和聚合物)缀合的反应基团。在一些实施方案中，反应基团包括以下的一种或更多种：羧酸衍生的活性酯、混合酸酐、酰基卤化物、酰基叠氮化物、烷基卤化物、N-马来酰亚胺、亚氨基酯、异氰酸酯和异硫氰酸酯。在一些实施方案中，反应基团包括叠氮化物。
在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-18多肽包含与残基共价附接的化学试剂。在一些实施方案中，化学试剂包括生物正交试剂。在一些实施方案中，化学试剂包括叠氮化物。在一些实施方案中，化学试剂包括炔烃。在一些实施方案中，化学试剂附接在残基C68或K70处，其中残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，化学试剂附接在残基C68、E69或K70处，其中残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，化学试剂附接在C68的残基处，其中残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，化学试剂附接在E69的残基处，其中残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，化学试剂附接在残基K70处，其中残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。
在一些实施方案中，水溶性聚合物包含1个至10个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第一水溶性聚合物包含1个聚乙二醇链至10个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第一水溶性聚合物包括1个聚乙二醇链至2个聚乙二醇链、1个聚乙二醇链至4个聚乙二醇链、1个聚乙二醇链至6个聚乙二醇链、1个聚乙二醇链至10个聚乙二醇链、2个聚乙二醇链至4个聚乙二醇链、2个聚乙二醇链至6个聚乙二醇链、2个聚乙二醇链至10个聚乙二醇链、4个聚乙二醇链至6个聚乙二醇链、4个聚乙二醇链至10个聚乙二醇链或6个聚乙二醇链至10个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第一水溶性聚合物包含1个聚乙二醇链、2个聚乙二醇链、4个聚乙二醇链、6个聚乙二醇链或10个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第一水溶性聚合物包含至少1个聚乙二醇链、2个聚乙二醇链、4个聚乙二醇链或6个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第一水溶性聚合物包含至多2个聚乙二醇链、4个聚乙二醇链、6个聚乙二醇链或10个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第一水溶性聚合物包含4个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第一水溶性聚合物包括式(II)的结构：
Figure BDA0004186569250000451
其中每个m独立地是4-30的整数。在一些实施方案中，第一水溶性聚合物的至少一个聚乙二醇链包括式(III)的结构
Figure BDA0004186569250000452
其中每个m独立地是4-30的整数，并且每个n独立地是1-10的整数。在一些实施方案中，第一水溶性聚合物的每个聚乙二醇链包括式(III)的结构。在式(III)的一些实施方案中，m是4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40。在式(III)的一些实施方案中，n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-18多肽还包含与修饰的IL-18多肽共价附接的第二聚合物。在一些实施方案中，第二聚合物在残基68至残基70的氨基酸残基区域处共价附接。在一些实施方案中，第二聚合物在残基C68处共价附接。在一些实施方案中，第二聚合物与修饰的IL-18多肽的N末端共价附接。在一些实施方案中，第二聚合物在残基K70处共价附接。在一些实施方案中，第二聚合物与修饰的IL-18多肽的N末端共价附接。
在一些实施方案中，第二聚合物具有约6,000道尔顿至约50,000道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，第二聚合物具有以下的重均分子量：约6,000道尔顿至约10,000道尔顿、约6,000道尔顿至约25,000道尔顿、约6,000道尔顿至约50,000道尔顿、约10,000道尔顿至约25,000道尔顿、约10,000道尔顿至约50,000道尔顿或约25,000道尔顿至约50,000道尔顿。在一些实施方案中，第二聚合物具有约6,000道尔顿、约10,000道尔顿、约25,000道尔顿或约50,000道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，第二聚合物具有至少约6,000道尔顿、约10,000道尔顿或约25,000道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，第二聚合物具有至多约10,000道尔顿、约25,000道尔顿或约50,000道尔顿的重均分子量。
在一些实施方案中，第二聚合物具有约120道尔顿至约1,000道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，第二聚合物具有以下的重均分子量：约120道尔顿至约250道尔顿、约120道尔顿至约300道尔顿、约120道尔顿至约400道尔顿、约120道尔顿至约500道尔顿、约120道尔顿至约1,000道尔顿、约250道尔顿至约300道尔顿、约250道尔顿至约400道尔顿、约250道尔顿至约500道尔顿、约250道尔顿至约1,000道尔顿、约300道尔顿至约400道尔顿、约300道尔顿至约500道尔顿、约300道尔顿至约1,000道尔顿、约400道尔顿至约500道尔顿、约400道尔顿至约1,000道尔顿或约500道尔顿至约1,000道尔顿。在一些实施方案中，第二聚合物具有约120道尔顿、约250道尔顿、约300道尔顿、约400道尔顿、约500道尔顿或约1,000道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，第二聚合物具有至少约120道尔顿、约250道尔顿、约300道尔顿、约400道尔顿或约500道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，第二聚合物具有至多约250道尔顿、约300道尔顿、约400道尔顿、约500道尔顿或约1,000道尔顿的重均分子量。
在一些实施方案中，第二聚合物包括水溶性聚合物。在一些实施方案中，水溶性聚合物包括聚(环氧烷)、多糖、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉、聚(丙烯酰吗啉)或其组合。在一些实施方案中，水溶性聚合物是聚(环氧烷)。在一些实施方案中，水溶性聚合物是聚(环氧乙烷)。在一些实施方案中，第二聚合物经由点击化学与IL-18多肽附接。
在一些实施方案中，第二水溶性聚合物包含1个至10个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第二水溶性聚合物包含1个聚乙二醇链至10个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第二水溶性聚合物包含1个聚乙二醇链至2个聚乙二醇链、1个聚乙二醇链至4个聚乙二醇链、1个聚乙二醇链至6个聚乙二醇链、1个聚乙二醇链至10个聚乙二醇链、2个聚乙二醇链至4个聚乙二醇链、2个聚乙二醇链至6个聚乙二醇链、2个聚乙二醇链至10个聚乙二醇链、4个聚乙二醇链至6个聚乙二醇链、4个聚乙二醇链至10个聚乙二醇链或6个聚乙二醇链至10个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第二水溶性聚合物包含1个聚乙二醇链、2个聚乙二醇链、4个聚乙二醇链、6个聚乙二醇链或10个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第二水溶性聚合物包含至少1个聚乙二醇链、2个聚乙二醇链、4个聚乙二醇链或6个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第二水溶性聚合物包含至多2个聚乙二醇链、4个聚乙二醇链、6个聚乙二醇链或10个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第二水溶性聚合物包含4个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第二水溶性聚合物包括式(II)的结构
Figure BDA0004186569250000471
其中每个m独立地是4-30的整数。在一些实施方案中，第二水溶性聚合物的至少一个聚乙二醇链包括式(III)的结构
Figure BDA0004186569250000481
其中每个m独立地是4-30的整数，并且每个n独立地是1-10的整数。在一些实施方案中，第二水溶性聚合物的每个聚乙二醇链包括式(III)的结构。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-18多肽还包含与修饰的IL-18多肽共价附接的第三聚合物。在一些实施方案中，第三聚合物具有约6,000道尔顿至约50,000道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，第三聚合物具有以下的重均分子量：约6,000道尔顿至约10,000道尔顿、约6,000道尔顿至约25,000道尔顿、约6,000道尔顿至约50,000道尔顿、约10,000道尔顿至约25,000道尔顿、约10,000道尔顿至约50,000道尔顿或约25,000道尔顿至约50,000道尔顿。在一些实施方案中，第三聚合物具有约6,000道尔顿、约10,000道尔顿、约25,000道尔顿或约50,000道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，第三聚合物具有至少约6,000道尔顿、约10,000道尔顿或约25,000道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，第三聚合物具有至多约10,000道尔顿、约25,000道尔顿或约50,000道尔顿的重均分子量。
在一些实施方案中，第三聚合物具有约120道尔顿至约1,000道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，第三聚合物具有以下的重均分子量：约120道尔顿至约250道尔顿、约120道尔顿至约300道尔顿、约120道尔顿至约400道尔顿、约120道尔顿至约500道尔顿、约120道尔顿至约1,000道尔顿、约250道尔顿至约300道尔顿、约250道尔顿至约400道尔顿、约250道尔顿至约500道尔顿、约250道尔顿至约1,000道尔顿、约300道尔顿至约400道尔顿、约300道尔顿至约500道尔顿、约300道尔顿至约1,000道尔顿、约400道尔顿至约500道尔顿、约400道尔顿至约1,000道尔顿或约500道尔顿至约1,000道尔顿。在一些实施方案中，第三聚合物具有约120道尔顿、约250道尔顿、约300道尔顿、约400道尔顿、约500道尔顿或约1,000道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，第三聚合物具有至少约120道尔顿、约250道尔顿、约300道尔顿、约400道尔顿或约500道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，第三聚合物具有至多约250道尔顿、约300道尔顿、约400道尔顿、约500道尔顿或约1,000道尔顿的重均分子量。
在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含与其共价附接的第三聚合物，所述第三聚合物具有约250道尔顿至约50,000道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含与其共价附接的第三聚合物，所述第三聚合物具有约500道尔顿至约25,000道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含与其共价附接的第三聚合物，所述第三聚合物具有约1000道尔顿至约10,000道尔顿的重均分子量。
在一些实施方案中，第三聚合物包括水溶性聚合物。在一些实施方案中，水溶性聚合物包括聚(环氧烷)、多糖、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉、聚(丙烯酰吗啉)或其组合。在一些实施方案中，水溶性聚合物是聚(环氧烷)。在一些实施方案中，水溶性聚合物是聚乙二醇。在一些实施方案中，第三聚合物经由点击化学与IL-18多肽附接。
在另一方面，本文描述了一种修饰的IL-18多肽，包含：修饰的IL-18多肽，其中该修饰的IL-18多肽包含：(a)与第一氨基酸残基共价附接的具有至多约6000道尔顿重均分子量的第一聚合物；(b)与第二氨基酸残基共价附接的具有至多约6000道尔顿重均分子量的第二聚合物；并且其中修饰的IL-18多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一方面，本文描述了一种修饰的IL-18多肽，包含：修饰的IL-18多肽，其中该修饰的IL-18多肽包含：(a)与第一氨基酸残基共价附接的第一聚合物；和(b)与第二氨基酸残基共价附接的第二聚合物，其中第一聚合物和第二聚合物之一具有从约200Da、300Da或400Da至约600Da、1000Da或6000Da的范围内的重均分子量，并且第一聚合物和第二聚合物中的另一聚合物具有从约5000Da、10,000Da或20,000Da至约30,000Da、40,000Da或50,000Da的范围内的重均分子量，并且其中该修饰的IL-18多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，第一聚合物和第二聚合物的每一种独立地包括水溶性聚合物。
在一些实施方案中，每种聚合物包括水溶性聚合物。在一些实施方案中，水溶性聚合物包括聚(环氧烷)、多糖、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉、聚(丙烯酰吗啉)或其组合。在一些实施方案中，每种水溶性聚合物是聚(环氧烷)。在一些实施方案中，每种水溶性聚合物是聚乙二醇。
在一些实施方案中，第一聚合物和第二聚合物的每一种独立地包含1个至5个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第一聚合物和第二聚合物的每一种独立地包含单个聚乙二醇链。
在一些实施方案中，每种聚合物包括水溶性聚合物。在一些实施方案中，水溶性聚合物包括聚(环氧烷)、多糖、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉、聚(丙烯酰吗啉)或其组合。在一些实施方案中，每种水溶性聚合物是聚(环氧烷)。在一些实施方案中，每种水溶性聚合物是聚乙二醇。
在一些实施方案中，第一聚合物和第二聚合物的每一种独立地包含1个至5个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第一聚合物和第二聚合物的每一种独立地包含单个聚乙二醇链。
在一些实施方案中，第一聚合物和第二聚合物的每一种独立地包含具有3个至25个乙二醇单元的一个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第一聚合物和第二聚合物的每一种独立地包含具有3个乙二醇单元至25个乙二醇单元的一个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第一聚合物和第二聚合物的每一种独立地包含具有以下的一个聚乙二醇链：3个乙二醇单元至5个乙二醇单元、3个乙二醇单元至7个乙二醇单元、3个乙二醇单元至10个乙二醇单元、3个乙二醇单元至15个乙二醇单元、3个乙二醇单元至25个乙二醇单元、5个乙二醇单元至7个乙二醇单元、5个乙二醇单元至10个乙二醇单元、5个乙二醇单元至15个乙二醇单元、5个乙二醇单元至25个乙二醇单元、7个乙二醇单元至10个乙二醇单元、7个乙二醇单元至15个乙二醇单元、7个乙二醇单元至25个乙二醇单元、10个乙二醇单元至15个乙二醇单元、10个乙二醇单元至25个乙二醇单元或15个乙二醇单元至25个乙二醇单元。在一些实施方案中，第一聚合物和第二聚合物的每一种独立地包含具有3个乙二醇单元、5个乙二醇单元、7个乙二醇单元、10个乙二醇单元、15个乙二醇单元或25个乙二醇单元的一个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第一聚合物和第二聚合物的每一种独立地包含具有至少3个乙二醇单元、5个乙二醇单元、7个乙二醇单元、10个乙二醇单元或15个乙二醇单元的一个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第一聚合物和第二聚合物的每一种独立地包含具有至多5个乙二醇单元、7个乙二醇单元、10个乙二醇单元、15个乙二醇单元或25个乙二醇单元的一个聚乙二醇链。
在一些实施方案中，第三水溶性聚合物包含1个至10个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第三水溶性聚合物包含1个聚乙二醇链至10个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第三水溶性聚合物包含1个聚乙二醇链至2个聚乙二醇链、1个聚乙二醇链至4个聚乙二醇链、1个聚乙二醇链至6个聚乙二醇链、1个聚乙二醇链至10个聚乙二醇链、2个聚乙二醇链至4个聚乙二醇链、2个聚乙二醇链至6个聚乙二醇链、2个聚乙二醇链至10个聚乙二醇链、4个聚乙二醇链至6个聚乙二醇链、4个聚乙二醇链至10个聚乙二醇链或6个聚乙二醇链至10个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第三水溶性聚合物包含1个聚乙二醇链、2个聚乙二醇链、4个聚乙二醇链、6个聚乙二醇链或10个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第三水溶性聚合物包含至少1个聚乙二醇链、2个聚乙二醇链、4个聚乙二醇链或6个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第三水溶性聚合物包含至多2个聚乙二醇链、4个聚乙二醇链、6个聚乙二醇链或10个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第三水溶性聚合物包含4个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第三水溶性聚合物包括式(II)的结构
Figure BDA0004186569250000521
其中每个m独立地是4-30的整数。在一些实施方案中，第三水溶性聚合物的每个聚乙二醇链包括式(III)的结构。
Figure BDA0004186569250000522
其中每个m独立地是4-30的整数，并且每个n独立地是1-10的整数。
在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地包含约5个至约300个、约10个至约200个、约20个至约100个或约25个至约50个乙二醇单元。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地包含5个乙二醇单元至300个乙二醇单元。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地包含5个乙二醇单元至10个乙二醇单元、5个乙二醇单元至20个乙二醇单元、5个乙二醇单元至25个乙二醇单元、5个乙二醇单元至50个乙二醇单元、5个乙二醇单元至100个乙二醇单元、5个乙二醇单元至200个乙二醇单元、5个乙二醇单元至300个乙二醇单元、10个乙二醇单元至20个乙二醇单元、10个乙二醇单元至25个乙二醇单元、10个乙二醇单元至50个乙二醇单元、10个乙二醇单元至100个乙二醇单元、10个乙二醇单元至200个乙二醇单元、10个乙二醇单元至300个乙二醇单元、20个乙二醇单元至25个乙二醇单元、20个乙二醇单元至50个乙二醇单元、20个乙二醇单元至100个乙二醇单元、20个乙二醇单元至200个乙二醇单元、20个乙二醇单元至300个乙二醇单元、25个乙二醇单元至50个乙二醇单元、25个乙二醇单元至100个乙二醇单元、25个乙二醇单元至200个乙二醇单元、25个乙二醇单元至300个乙二醇单元、50个乙二醇单元至100个乙二醇单元、50个乙二醇单元至200个乙二醇单元、50个乙二醇单元至300个乙二醇单元、100个乙二醇单元至200个乙二醇单元、100个乙二醇单元至300个乙二醇单元或200个乙二醇单元至300个乙二醇单元。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地包含5个乙二醇单元、10个乙二醇单元、20个乙二醇单元、25个乙二醇单元、50个乙二醇单元、100个乙二醇单元、200个乙二醇单元或300个乙二醇单元。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地包含至少5个乙二醇单元、10个乙二醇单元、20个乙二醇单元、25个乙二醇单元、50个乙二醇单元、100个乙二醇单元或200个乙二醇单元。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地包含至多10个乙二醇单元、20个乙二醇单元、25个乙二醇单元、50个乙二醇单元、100个乙二醇单元、200个乙二醇单元或300个乙二醇单元。
在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地是线性的或支链的。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链是线性聚乙二醇。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链是支链聚乙二醇。例如，在一些实施方案中，第一聚合物和第二聚合物的每一种都包含线性聚乙二醇链。
在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地用羟基、烷基、烷氧基、酰胺基或氨基基团末端封端。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地用氨基基团末端封端。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地用酰胺基基团末端封端。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地用烷氧基基团末端封端。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地用烷基基团末端封端。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地用羟基基团末端封端。在一些实施方案中，一个或更多个聚乙二醇链独立地具有结构
Figure BDA0004186569250000531
其中n是4-30的整数。在一些实施方案中，一个或更多个聚乙二醇链独立地具有结构/>
Figure BDA0004186569250000541
其中m是4-30的整数。
在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含1个至10个共价附接的水溶性聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含1个至10个共价附接的水溶性聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含1个或2个共价附接的水溶性聚合物、1个至3个共价附接的水溶性聚合物、1个至4个共价附接的水溶性聚合物、1个至6个共价附接的水溶性聚合物、1个至8个共价附接的水溶性聚合物、1个至10个共价附接的水溶性聚合物、2个或3个共价附接的水溶性聚合物、2个至4个共价附接的水溶性聚合物、2个至6个共价附接的水溶性聚合物、2个至8个共价附接的水溶性聚合物、2个至10个共价附接的水溶性聚合物、3个或4个共价附接的水溶性聚合物、3个至6个共价附接的水溶性聚合物、3个至8个共价附接的水溶性聚合物、3个至10个共价附接的水溶性聚合物、4个至6个共价附接的水溶性聚合物、4个至8个共价附接的水溶性聚合物、4个至10个共价附接的水溶性聚合物、6个至8个共价附接的水溶性聚合物、6个至10个共价附接的水溶性聚合物或8个至10个共价附接的水溶性聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含1个共价附接的水溶性聚合物、2个共价附接的水溶性聚合物、3个共价附接的水溶性聚合物、4个共价附接的水溶性聚合物、6个共价附接的水溶性聚合物、8个共价附接的水溶性聚合物或10个共价附接的水溶性聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含至少1个共价附接的水溶性聚合物、2个共价附接的水溶性聚合物、3个共价附接的水溶性聚合物、4个共价附接的水溶性聚合物、6个共价附接的水溶性聚合物或8个共价附接的水溶性聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含至多2个共价附接的水溶性聚合物、3个共价附接的水溶性聚合物、4个共价附接的水溶性聚合物、6个共价附接的水溶性聚合物、8个共价附接的水溶性聚合物或10个共价附接的水溶性聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含2个至6个共价附接的水溶性聚合物。
在一些实施方案中，一种或更多种共价附接的聚合物包含接头。在一些实施方案中，一种或更多种共价附接的聚合物，诸如第三聚合物，包含一个或更多个接头。在一些实施方案中，接头包含一个或更多个氨基酸。在一些实施方案中，接头包含一个或更多个赖氨酸。在一些实施方案中，接头包含间隔物。在一些实施方案中，接头包含反应性官能团或官能团诸如酰胺。在一些实施方案中，接头具有式(IV)的结构
Figure BDA0004186569250000551
其中A、B、C和D各自独立地是聚合物。
在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含具有式(I)结构的一个或更多个PEG化赖氨酸，
Figure BDA0004186569250000552
其中n是选自4至30的整数。在一些实施方案中，n是4至6、4至8、4至10、4至15、4至20、4至25、4至30、6至8、6至10、6至15、6至20、6至25、6至30、8至10、8至15、8至20、8至25、8至30、10至15、10至20、10至25、10至30、15至20、15至25、15至30、20至25、20至30、或25至30。在一些实施方案中，n是4、6、8、10、15、20、25或30。在一些实施方案中，n是至少4、6、8、10、15、20或25。在一些实施方案中，n是至多6、8、10、15、20、25或30。在一方面，如本文描述的修饰的IL-18多肽包含在一个或两个氨基酸残基处共价附接的一种或两种水溶性聚合物。例如，在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含具有如表中所示的特征和附接位点的一种或两种水溶性聚合物。
表2.示例性多肽结构和水溶性聚合物特征
Figure BDA0004186569250000561
/>
Figure BDA0004186569250000571
在一些实施方案中，可以与修饰的IL-18多肽附接的水溶性聚合物包含式(A)的结构：
Figure BDA0004186569250000572
在一些实施方案中，可以与修饰的IL-18多肽附接的水溶性聚合物包含式(B)的结构：
Figure BDA0004186569250000573
在一些实施方案中，可以与修饰的IL-18多肽附接的水溶性聚合物包含式(C)的结构：
Figure BDA0004186569250000581
在一些实施方案中，可以与修饰的IL-18多肽附接的水溶性聚合物包含式(D)的结构：
Figure BDA0004186569250000582
在一些实施方案中，可以与修饰的IL-18多肽附接的水溶性聚合物包含式(E)的结构：
Figure BDA0004186569250000583
在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含一种或两种具有如表3中示出的结构和附接位点的水溶性聚合物。
表3.示例性多肽结构和水溶性聚合物结构
Figure BDA0004186569250000584
/>
Figure BDA0004186569250000591
在一些实施方案中，附接在残基68或70处的水溶性聚合物包含一个或更多个接头和/或间隔物。在一些实施方案中，一个或更多个接头包含一个或更多个酰胺基团。在一些实施方案中，一个或更多个接头包含一个或更多个赖氨酸基团。在一些实施方案中，附接在残基68或70处的水溶性聚合物包含式(II)、式(III)、式(IV)或其组合的结构。在一些实施方案中，附接在残基68或70处的水溶性聚合物包含式(A)、式(B)、式(C)、式(D)或其组合的结构。在一些实施方案中，附接在残基68或70处的水溶性聚合物包含
Figure BDA0004186569250000592
的结构。在一些实施方案中，附接在残基68或70处的水溶性聚合物包含一个或更多个接头和/或间隔物。在一些实施方案中，一个或更多个接头包含一个或更多个酰胺基团。在一些实施方案中，一个或更多个接头包含一个或更多个赖氨酸基团。在一些实施方案中，附接在残基68处的水溶性聚合物包含式(II)、式(III)、式(IV)或其组合的结构。在一些实施方案中，附接在残基70处的水溶性聚合物包含式(A)、式(B)、式(C)、式(D)或其组合的结构。在一些实施方案中，附接在残基68或70处的水溶性聚合物包含/>
Figure BDA0004186569250000593
的结构。
在一些实施方案中，附接在残基68、69或70处的水溶性聚合物包含一个或更多个接头和/或间隔物。在一些实施方案中，一个或更多个接头包含一个或更多个酰胺基团。在一些实施方案中，一个或更多个接头包含一个或更多个赖氨酸基团。在一些实施方案中，附接在残基68、69或70处的水溶性聚合物包含式(II)、式(III)、式(IV)或其组合的结构。在一些实施方案中，附接在残基68、69或70处的水溶性聚合物包含式(A)、式(B)、式(C)、式(D)或其组合的结构。在一些实施方案中，附接在残基68、69或70处的水溶性聚合物包含
Figure BDA0004186569250000601
的结构。在一些实施方案中，附接在残基68、69或70处的水溶性聚合物包含一个或更多个接头和/或间隔物。在一些实施方案中，一个或更多个接头包含一个或更多个酰胺基团。在一些实施方案中，一个或更多个接头包含一个或更多个赖氨酸基团。在一些实施方案中，附接在残基69处的水溶性聚合物包含式(II)、式(III)、式(IV)或其组合的结构。在一些实施方案中，附接在残基69处的水溶性聚合物包含式(A)、式(B)、式(C)、式(D)或其组合的结构。
在一些实施方案中，聚合物由合适的前体物质合成。在一些实施方案中，聚合物由结构6、结构7、结构8或结构9的前体物质合成，其中结构6是
Figure BDA0004186569250000602
结构7是
Figure BDA0004186569250000603
结构8是
Figure BDA0004186569250000604
并且结构9是
Figure BDA0004186569250000611
本文还描述了包含多于一种修饰的IL-18多肽的修饰的IL-18多肽群体，其中多于一种修饰的IL-18多肽包含附接在多肽的残基处的多于一种水溶性聚合物。在一些实施方案中，附接在多肽的残基处的多于一种水溶性聚合物的至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％具有在如通过基质辅助激光解吸/电离质谱(MALDI-MS)确定的附接的多于一种水溶性聚合物的峰值分子量的±10％内的分子量。在一些实施方案中，与多肽附接的多于一种水溶性聚合物的至多50％、至多60％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％、或至多95％具有在如通过MALDI-MS确定的与多肽附接的多于一种水溶性聚合物的峰值分子量的±10％内的分子量。在一些实施方案中，与多肽附接的多于一种水溶性聚合物的重均分子量相比于数均分子量的比值为约1.0至约1.5、约1.0至约1.1、约1.0至约1.2、约1.0至约1.3、约1.0至约1.25、约1.05至约1.1、约1.05至约1.2、约1.05至约1.5、约1.1至约1.2、约1.1至约1.5、或约1.2至约1.5，如通过色谱(诸如凝胶渗透色谱(GPC)和高效液相色谱(HPLC))或质谱(诸如MALDI-MS)确定的。
在一些实施方案中，群体包括至少1μg、至少10μg或至少1mg修饰的IL-18多肽。在一些实施方案中，群体包括至少100种、至少1000种或至少10000种修饰的IL-18多肽。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体的重均分子量相比于数均分子量的比值为至多1.1。
在一些实施方案中，多于一种聚合物中的每一种包括水溶性聚合物。在一些实施方案中，水溶性聚合物包括聚(环氧烷)、多糖、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉、聚(丙烯酰吗啉)或其组合。在一些实施方案中，水溶性聚合物包括聚乙二醇。
在一些实施方案中，多于一种聚合物的重均分子量为约200Da至约50,000Da。在一些实施方案中，多于一种聚合物的重均分子量为约10,000Da至约30,000Da。
在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含与SEQ ID NO:2-58具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％序列同一性的多肽序列。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含与SEQ ID NO:2-83具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％序列同一性的多肽序列。在一些实施方案中，多肽序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:18至少约80％相同。在一些实施方案中，多肽序列与SEQ ID NO:2至少约80％相同。在一些实施方案中，多肽序列与SEQ ID NO:2至少约90％相同。在一些实施方案中，多肽序列与SEQ ID NO:2至少约95％相同。在一些实施方案中，多肽序列与SEQ ID NO:18至少约80％相同。在一些实施方案中，多肽序列与SEQ ID NO:18至少约90％相同。在一些实施方案中，多肽序列与SEQ ID NO:18至少约95％相同。
在一些实施方案中，与多肽附接的多于一种水溶性聚合物的重均分子量相比于数均分子量的比值为至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2.0、至少2.5、或至少3.0，如通过色谱诸如GPC和HPLC或质谱确定的。在一些实施方案中，与多肽附接的多于一种水溶性聚合物的至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％具有在如通过MALDI-MS确定的与多肽附接的多于一种水溶性聚合物的峰值分子量的±10％内的分子量。在一些实施方案中，与多肽附接的多于一种水溶性聚合物的至多50％、至多60％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％、或至多95％具有在如通过MALDI-MS确定的与多肽附接的多于一种水溶性聚合物的峰值分子量的±10％内的分子量。
在一些实施方案中，与多肽附接的多于一种水溶性聚合物的重均分子量相比于数均分子量的比值为约1.0至约1.5、约1.0至约1.1、约1.0至约1.2、约1.0至约1.3、约1.0至约1.25、约1.05至约1.1、约1.05至约1.2、约1.05至约1.5、约1.1至约1.2、约1.1至约1.5、或约1.2至约1.5，如通过色谱诸如GPC和HPLC或质谱确定的。在一些实施方案中，与多肽附接的多于一种水溶性聚合物的重均分子量相比于数均分子量的比值为至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2.0、至少2.5、或至少3.0，如通过色谱诸如GPC和HPLC或质谱确定的。
IIIb.单分散性
在一方面，本文描述了修饰的IL-18多肽群体。在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-18多肽群体是单分散的。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体包含单分散聚合物。在一些实施方案中，单分散聚合物与多肽的N-末端或残基附接。在一些实施方案中，单分散聚合物与本公开内容的修饰的IL-18多肽的残基位置附接。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-18多肽群体包含与其共价附接的聚合物。在一些实施方案中，每种修饰的IL-18多肽包含与其共价附接的聚合物。在一些实施方案中，聚合物是单分散聚合物。在一些实施方案中，聚合物与残基68或70共价附接，其中修饰的IL-18多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，聚合物与残基68、69或70共价附接，其中修饰的IL-18多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，聚合物与修饰的IL-18多肽的N-末端区域共价附接。在一些实施方案中，聚合物与修饰的IL-18多肽的N-末端共价附接。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-18的群体包含与其共价附接的第二聚合物。在一些实施方案中，第二聚合物是单分散聚合物。在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-18多肽群体包含与其共价附接的第三聚合物。在一些实施方案中，第三聚合物是单分散聚合物。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-18多肽群体是单分散的。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体的重均分子量相比于数均分子量的比值是至多1.5、至多1.2、至多1.1或至多1.05。在一些实施方案中，药物组合物包含修饰的IL-18多肽群体，并且其中修饰的IL-18多肽群体的重均分子量相比于数均分子量的比值是1.05至1.5。在一些实施方案中，药物组合物包含修饰的IL-18多肽群体，并且其中修饰的IL-18多肽群体的重均分子量相比于数均分子量的比值是约1.0至约1.5、约1.0至约1.1、约1.0至约1.2、约1.0至约1.3、约1.0至约1.4、约1.05至约1.1、约1.05至约1.2、约1.05至约1.5、约1.1至约1.2、约1.1至约1.5、或约1.2至约1.5。在一些实施方案中，药物组合物包含修饰的IL-18多肽群体，并且其中修饰的IL-18多肽群体的重均分子量相比于数均分子量的比值是约1.05、约1.1、约1.2或约1.5。在一些实施方案中，药物组合物包含修饰的IL-18多肽群体，并且其中修饰的IL-18多肽群体的重均分子量相比于数均分子量的比值是至少1.05、1.1或1.2。在一些实施方案中，药物组合物包含修饰的IL-18多肽群体，并且其中修饰的IL-18多肽群体的重均分子量相比于数均分子量的比值是至多1.1、1.2或1.5。在一些实施方案中，比值通过色谱诸如凝胶渗透色谱(GPC)和高效液相色谱(HPLC)确定。在一些实施方案中，比值通过质谱诸如MALDI-MS和ESI-HRMS确定。
在本文描述的修饰的IL-18多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±10％内的分子量。在修饰的IL-18多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体的至少80％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±10％内的分子量。在修饰的IL-18多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体的至少85％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±10％内的分子量。在修饰的IL-18多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体中的至少90％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±10％内的分子量。在修饰的IL-18多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体的至少95％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±10％内的分子量。在修饰的IL-18多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体的至少99％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±10％内的分子量。在一些实施方案中，质谱是MALDI-质谱。在一些实施方案中，质谱是高分辨率电喷雾电离质谱(ESI-MS或ESI-HRMS)。
在本文描述的修饰的IL-18多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±5％内的分子量。在修饰的IL-18多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体的至少80％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±5％内的分子量。在修饰的IL-18多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体的至少85％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±5％内的分子量。在修饰的IL-18多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体中的至少90％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±5％内的分子量。在修饰的IL-18多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体的至少95％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±5％内的分子量。在修饰的IL-18多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体的至少99％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±5％内的分子量。
在本文描述的修饰的IL-18多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±2％内的分子量。在修饰的IL-18多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体的至少80％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±2％内的分子量。在修饰的IL-18多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体的至少85％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±2％内的分子量。在修饰的IL-18多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体中的至少90％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±2％内的分子量。在修饰的IL-18多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体的至少95％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±2％内的分子量。在修饰的IL-18多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体的至少99％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±2％内的分子量。
在本文描述的修饰的IL-18多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±1％内的分子量。在修饰的IL-18多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体的至少80％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±1％内的分子量。在修饰的IL-18多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体的至少85％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±1％内的分子量。在修饰的IL-18多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体中的至少90％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±1％内的分子量。在修饰的IL-18多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体的至少95％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±1％内的分子量。在修饰的IL-18多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体的至少99％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±1％内的分子量。
在本文描述的修饰的IL-18多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±1000道尔顿内的分子量。在修饰的IL-18多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体的至少80％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±1000道尔顿内的分子量。在修饰的IL-18多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体的至少85％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±1000道尔顿内的分子量。在修饰的IL-18多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体中的至少90％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±1000道尔顿内的分子量。在修饰的IL-18多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体的至少95％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±1000道尔顿内的分子量。在修饰的IL-18多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体的至少99％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±1000道尔顿内的分子量。
在本文描述的修饰的IL-18多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±500道尔顿内的分子量。在修饰的IL-18多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体的至少80％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±500道尔顿内的分子量。在修饰的IL-18多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体的至少85％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±500道尔顿内的分子量。在修饰的IL-18多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体中的至少90％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±500道尔顿内的分子量。在修饰的IL-18多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体的至少95％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±500道尔顿内的分子量。在修饰的IL-18多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体的至少99％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±500道尔顿内的分子量。
在本文描述的修饰的IL-18多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±100道尔顿内的分子量。在修饰的IL-18多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体的至少80％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±100道尔顿内的分子量。在修饰的IL-18多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体的至少85％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±100道尔顿内的分子量。在修饰的IL-18多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体中的至少90％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±100道尔顿内的分子量。在修饰的IL-18多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体的至少95％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±100道尔顿内的分子量。在修饰的IL-18多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体的至少99％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±100道尔顿内的分子量。
在修饰的IL-18多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体中的至少90％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±20Da、±10Da或±5 Da内的分子量。在修饰的IL-18多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体的至少95％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±20Da、±10Da或±5 Da内的分子量。在修饰的IL-18多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体的至少99％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±20Da、±10Da或±5 Da内的分子量。在一些实施方案中，质谱是MALDI-质谱。在一些实施方案中，质谱是ESI-HRMS。
在本文描述的修饰的IL-18多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体的至少80％、至少85％、至少90％或至少95％具有如通过质谱测量的相同的分子量。在修饰的IL-18多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体的至少80％具有如通过质谱测量的相同的分子量。在修饰的IL-18多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体的至少85％具有如通过质谱测量的相同的分子量。在修饰的IL-18多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体中的至少90％具有如通过质谱测量的相同的分子量。在修饰的IL-18多肽群体的一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体的至少95％具有如通过质谱测量的相同的分子量。
在一些实施方案中，当例如通过尺寸排阻色谱、动态光散射、ESI-MS、MALDI-MS或分析型超速离心评价时，本文描述的修饰的IL-18多肽群体大体上以一种表观分子量形式存在。在一些实施方案中，当例如通过尺寸排阻色谱、动态光散射、ESI-MS、MALDI-MS或分析型超速离心评价时，修饰的IL-18多肽群体的至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多以一种表观分子量形式存在。在一些实施方案中，当通过尺寸排阻色谱评价时，修饰的IL-18多肽群体大体上以一种表观分子量形式存在。在一些实施方案中，当通过动态光散射评价时，修饰的IL-18多肽群体大体上以一种表观分子量形式存在。在一些实施方案中，当通过MALDI-MS或ESI-MS评价时，修饰的IL-18多肽群体大体上以一种表观分子量形式存在。在一些实施方案中，当通过分析型超速离心评价时，修饰的IL-18多肽群体大体上以一种表观分子量形式存在。
在一方面，本文描述了一种修饰的IL-18多肽群体，其包含多于一种修饰的IL-18多肽，其中多于一种修饰的IL-18多肽包含多于一种聚合物(即，多于一种第一聚合物)，其中每种修饰的IL-18多肽包含与其共价附接的多于一种聚合物的一种。在一些实施方案中，多于一种聚合物的至少95％具有在如通过质谱确定的多于一种聚合物的峰值分子量的±10％内的分子量。在一些实施方案中，多于一种聚合物的至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％具有在如通过质谱确定的多于一种聚合物的峰值分子量的±10％内的分子量。在一些实施方案中，多于一种聚合物的至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％具有在如通过MALDI-MS确定的多于一种聚合物的峰值分子量的±5％内的分子量。在一些实施方案中，多于一种聚合物的至多50％、至多60％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％、或至多95％具有在如通过质谱确定的多于一种聚合物的峰值分子量的±10％内的分子量，其中修饰的IL-18多肽群体的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±10％内的分子量。在一些实施方案中，多于一种聚合物的至多50％、至多60％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％、或至多95％具有在如通过质谱确定的多于一种聚合物的峰值分子量的±5％内的分子量。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±1％内的分子量。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±0.5％内的分子量。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽群体的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％具有在如通过质谱确定的峰值分子量的±0.1％内的分子量。在一些实施方案中，多于一种聚合物的重均分子量相比于数均分子量的比值为约1.0至约1.5、约1.0至约1.1、约1.0至约1.2、约1.0至约1.3、约1.0至约1.25、约1.05至约1.1、约1.05至约1.2、约1.05至约1.5、约1.1至约1.2、约1.1至约1.5、或约1.2至约1.5，如通过色谱诸如GPC和HPLC或质谱(诸如MALDI-MS)确定的。在一些实施方案中，多于一种聚合物的重均分子量相比于数均分子量的比值为至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2.0、至少2.5、或至少3.0，如通过色谱诸如GPC和HPLC或质谱确定的。
在一些实施方案中，聚合物的重均分子量为至少约1000Da。在一些实施方案中，聚合物的重均分子量为至少约3000Da、至少约6000Da、至少约12,000Da或至少约24,000Da。在一些实施方案中，聚合物的重均分子量为至少约3000Da。在一些实施方案中，聚合物的重均分子量为至少约6000Da。在一些实施方案中，聚合物的重均分子量为至少约12000Da。在一些实施方案中，聚合物的重均分子量为至少约24000Da。
在一些实施方案中，本文描述的多于一种修饰的IL-18多肽包含多于一种第二聚合物，其中修饰的IL-18多肽的每一种包含与其共价附接的多于一种第二聚合物。在一些实施方案中，多于一种第二聚合物的至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％具有在如通过质谱诸如MALDI-MS和ESI-MS确定的多于一种第二聚合物的峰值分子量的±10％内的分子量。在一些实施方案中，多于一种第二聚合物的至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％具有在如通过质谱确定的多于一种第二聚合物的峰值分子量的±5％内的分子量。在一些实施方案中，多于一种第二聚合物的至多50％、至多60％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％、或至多95％具有在如通过质谱确定的多于一种第二聚合物的峰值分子量的±10％内的分子量。在一些实施方案中，多于一种第二聚合物的至多50％、至多60％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％、或至多95％具有在如通过质谱确定的多于一种第二聚合物的峰值分子量的±5％内的分子量。在一些实施方案中，多于一种第二聚合物的重均分子量相比于数均分子量的比值为约1.0至约1.5、约1.0至约1.1、约1.0至约1.2、约1.0至约1.3、约1.0至约1.25、约1.05至约1.1、约1.05至约1.2、约1.05至约1.5、约1.1至约1.2、约1.1至约1.5、或约1.2至约1.5，如通过色谱术(诸如GPC和HPLC)或质谱术(诸如质谱)确定的。在一些实施方案中，多于一种第二聚合物的重均分子量相比于数均分子量的比值为至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2.0、至少2.5、或至少3.0，如通过色谱诸如GPC和HPLC或质谱确定的。
在一些实施方案中，第二聚合物的重均分子量是至少约3000Da、至少约6000Da、至少约12,000Da或至少约24,000Da。在一些实施方案中，第二聚合物的重均分子量为至少约3000Da。在一些实施方案中，第二聚合物的重均分子量为至少约6000Da。在一些实施方案中，第二聚合物的重均分子量为至少约12,000Da。在一些实施方案中，第二聚合物的重均分子量为至少约24,000Da。
在一些实施方案中，多于一种包括至少100种、至少1000种、至少10000种、至少100000种、至少1000000种、至少10000000种修饰的IL-18多肽。在一些实施方案中，多于一种包括至少100种修饰的IL-18多肽。在一些实施方案中，多于一种包括至少1000种修饰的IL-18多肽。在一些实施方案中，多于一种包括至少10000种修饰的IL-18多肽。在一些实施方案中，多于一种包括至少100000种修饰的IL-18多肽。在一些实施方案中，多于一种包括至少1000000种修饰的IL-18多肽。在一些实施方案中，多于一种包括至少10000000种修饰的IL-18多肽。在一些实施方案中，多于一种包括至少100000000种修饰的IL-18多肽。
在一些实施方案中，多于一种包括约100种、约1000种、约10000种、约100000种、约1000000种、约10000000种修饰的IL-18多肽。在一些实施方案中，多于一种包括约100种修饰的IL-18多肽。在一些实施方案中，多于一种包括约1000种修饰的IL-18多肽。在一些实施方案中，多于一种包括约10000种修饰的IL-18多肽。在一些实施方案中，多于一种包括约100000种修饰的IL-18多肽。在一些实施方案中，多于一种包括约1000000种修饰的IL-18多肽。在一些实施方案中，多于一种包括约10000000种修饰的IL-18多肽。在一些实施方案中，多于一种包括约100000000种修饰的IL-18多肽。
在一些实施方案中，多于一种包括至少1μg、至少10μg、至少100μg、至少1mg、至少10mg或至少100mg修饰的IL-18多肽。在一些实施方案中，多于一种包括至少1μg修饰的IL-18多肽。在一些实施方案中，多于一种包括至少10μg修饰的IL-18多肽。在一些实施方案中，多于一种包括至少100μg修饰的IL-18多肽。在一些实施方案中，多于一种包括至少1mg修饰的IL-18多肽。在一些实施方案中，多于一种包括至少10mg修饰的IL-18多肽。
在一些实施方案中，多于一种包括约100mg修饰的IL-18多肽。在一些实施方案中，多于一种包括约1μg、约10μg、约100μg、约1mg、约10mg或约100mg修饰的IL-18多肽。在一些实施方案中，多于一种包括约1μg修饰的IL-18多肽。在一些实施方案中，多于一种包括约10μg修饰的IL-18多肽。在一些实施方案中，多于一种包括约100μg修饰的IL-18多肽。在一些实施方案中，多于一种包括约1mg修饰的IL-18多肽。在一些实施方案中，多于一种包括约10mg修饰的IL-18多肽。在一些实施方案中，多于一种包括约100mg修饰的IL-18多肽。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-18多肽是线性多肽。在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-18多肽是折叠的。在一些实施方案中，修饰的多肽包含一个或更多个二硫键。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-18多肽包含共价附接的聚合物用于半衰期延长。在一些实施方案中，本公开内容的修饰的IL-18多肽包含共价附接的聚合物用于血浆或血清半衰期延长。在一些实施方案中，本公开内容的修饰的IL-18多肽的血浆或血清半衰期与野生型IL-18多肽的血浆或血清半衰期相比长至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。在一些实施方案中，本公开内容的修饰的IL-18多肽的血浆或血清半衰期与野生型IL-18多肽的血浆或血清半衰期相比长1.5倍至10倍。在一些实施方案中，本公开内容的修饰的IL-18多肽的血浆或血清半衰期与野生型IL-18多肽的血浆或血清半衰期相比长1.5倍至2倍、1.5倍至4倍、1.5倍至6倍、1.5倍至8倍、1.5倍至10倍、2倍至4倍、2倍至6倍、2倍至8倍、2倍至10倍、4倍至6倍、4倍至8倍、4倍至10倍、6倍至8倍、6倍至10倍或8倍至10倍。在一些实施方案中，本公开内容的修饰的IL-18多肽的血浆或血清半衰期与野生型IL-18多肽的血浆或血清半衰期相比长1.5倍、2倍、4倍、6倍、8倍或10倍。在一些实施方案中，本公开内容的修饰的IL-18多肽的血浆或血清半衰期是至少1.5倍、2倍、4倍、6倍或8倍。在一些实施方案中，本公开内容的修饰的IL-18多肽的血浆或血清半衰期与野生型IL-18多肽的血浆或血清半衰期相比长至多2倍、4倍、6倍、8倍或10倍。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-18多肽的血浆或血清半衰期与没有半衰期延长性聚合物的修饰的IL-18多肽的血浆或血清半衰期相比长至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。在一些实施方案中，本公开内容的修饰的IL-18多肽的血浆或血清半衰期与没有半衰期延长性聚合物的修饰的IL-18多肽的血浆或血清半衰期相比长1.5倍至10倍。在一些实施方案中，本公开内容的修饰的IL-18多肽的血浆或血清半衰期与没有半衰期延长性聚合物的修饰的IL-18多肽的血浆或血清半衰期相比长1.5倍至2倍、1.5倍至4倍、1.5倍至6倍、1.5倍至8倍、1.5倍至10倍、2倍至4倍、2倍至6倍、2倍至8倍、2倍至10倍、4倍至6倍、4倍至8倍、4倍至10倍、6倍至8倍、6倍至10倍或8倍至10倍。在一些实施方案中，本公开内容的修饰的IL-18多肽的血浆或血清半衰期与没有半衰期延长性聚合物的修饰的IL-18多肽的血浆或血清半衰期相比长1.5倍、2倍、4倍、6倍、8倍或10倍。在一些实施方案中，本公开内容的修饰的IL-18多肽的血浆或血清半衰期是至少1.5倍、2倍、4倍、6倍或8倍。在一些实施方案中，本公开内容的修饰的IL-18多肽的血浆或血清半衰期与没有半衰期延长性聚合物的修饰的IL-18多肽的血浆或血清半衰期相比长至多2倍、4倍、6倍、8倍或10倍。
IV.药物组合物
在一方面，本文描述了一种药物组合物，药物组合物包含：本文描述的修饰的IL-18多肽；和药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物包含多于一种修饰的IL-18多肽。在一些实施方案中，药物组合物还包含选自碳水化合物、无机盐、抗氧化剂、表面活性剂或缓冲剂的一种或更多种赋形剂。
在一些实施方案中，药物组合物还包含碳水化合物。在某些实施方案中，碳水化合物选自由以下组成的组：果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖、棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、右旋糖酐、淀粉、甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨醇(葡糖醇)、吡喃糖山梨醇、肌肌醇、环糊精及其组合。
在一些实施方案中，药物组合物包含无机盐。在某些实施方案中，无盐选自由以下组成的组：氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、磷酸钠、磷酸钾、硫酸钠或其组合。
在某些实施方案中，药物组合物包含抗氧化剂。在某些实施方案中，抗氧化剂选自由以下组成的组：抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚、丁基羟基甲苯、焦亚硫酸钾、没食子酸丙酯、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠、维生素E、3,4-二羟基苯甲酸及其组合。
在某些实施方案中，药物组合物包含表面活性剂。在某些实施方案中，表面活性剂选自由以下组成的组：聚山梨醇酯、失水山梨醇酯、脂质、磷脂、磷脂酰乙醇胺、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、EDTA、锌及其组合。
在某些实施方案中，药物组合物包含缓冲剂。在某些实施方案中，缓冲剂选自由以下组成的组：柠檬酸、磷酸钠、磷酸钾、乙酸、乙醇胺、组氨酸、氨基酸、酒石酸、琥珀酸、富马酸、乳酸、tris、HEPES或其组合。在某些实施方案中，缓冲剂选自由以下组成的组：柠檬酸、磷酸钠、磷酸钾、乙酸、乙醇胺、组氨酸、氨基酸、酒石酸、琥珀酸、富马酸、乳酸、tris、HEPES、CHAPS或其组合。
在一些实施方案中，药物组合物被配制为用于肠胃外或肠内施用。在一些实施方案中，药物组合物被配制为用于静脉内或皮下施用。在一些实施方案中，药物组合物呈冻干形式。
在一方面，本文描述了一种液体或冻干组合物，液体或冻干组合物包含描述的修饰的IL-18多肽。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽是冻干粉末。在一些实施方案中，将冻干粉末重悬于缓冲溶液中。在一些实施方案中，缓冲溶液包含缓冲剂、糖、盐、表面活性剂或其任何组合。在一些实施方案中，缓冲溶液包含磷酸盐。在一些实施方案中，磷酸盐是钠Na2HPO4。在一些实施方案中，盐是氯化钠。在一些实施方案中，缓冲溶液包括磷酸盐缓冲盐水。在一些实施方案中，缓冲溶液包含甘露醇。在一些实施方案中，将冻干粉末悬浮在包含磷酸盐缓冲盐水溶液(pH 7.4)和50mg/mL甘露醇的溶液中。在一些实施方案中，药物组合物是冻干组合物，其在向受试者施用前不久被重构。
本文描述的修饰的IL-18多肽可以是各种剂型。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽作为冻干粉末的形式给药。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽作为悬浮液给药。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽作为溶液给药。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽作为可注射溶液给药。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽作为静脉内(IV)溶液给药。
V.修饰的IL-18多肽的合成
本文描述的修饰的IL-18多肽可以化学合成而不是表达为重组多肽。修饰的IL-18多肽可以通过合成全长的修饰的IL-18多肽的一种或更多种片段、将片段连接在一起、并使所连接的全长多肽折叠来制备。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含氨基酸序列中的至少一个突变和与多肽的残基C68或K70共价附接的PEG聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含氨基酸序列中的至少一个突变和与多肽的残基C68、E69或K70共价附接的PEG聚合物。在一些实施方案中，PEG与修饰的IL-18多肽的位置68、69或70处的半胱氨酸残基附接。在一些实施方案中，PEG聚合物具有至少约1kDa、至少约2kDa、至少约5kDa、至少约10kDa、至少约15kDa或至少约20kDa的分子量。在一些实施方案中，PEG聚合物具有约1kDa、约2kDa、约5kDa、约10kDa、约15kDa、约20kDa、约25kDa或约30kDa的分子量。
在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含氨基酸序列中的至少一个突变和与多肽的残基C68或K70共价附接的约30kDa的PEG聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽包含氨基酸序列中的至少一个突变和与多肽的残基C68、E69或K70共价附接的约30kDa的PEG聚合物。
在一些实施方案中，当向受试者施用时，修饰的IL-18多肽增强IFNγ诱导。在一些实施方案中，当向受试者施用时，修饰的IL-18多肽增强IFNγ诱导，同时对IL-18BP中和具有抗性。
VI.宿主细胞
在一方面，本文描述了包含修饰的IL-18多肽的宿主细胞。
在一方面，本文描述了产生修饰的IL-18多肽的方法，其中该方法包括在宿主细胞中表达修饰的IL-18多肽。
在一些实施方案中，宿主细胞是原核细胞或真核细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞、禽类细胞或昆虫细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞、禽类细胞、真菌细胞或昆虫细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是CHO细胞、COS细胞或酵母细胞。
VII.修饰的IL-18多肽的生物活性
VIIa.结合亲和力
在一方面，本文描述了修饰的IL-18多肽，其对IL-18Rα表现出比对IL-18BP大的亲和力。在一些实施方案中，对IL-18Rα、IL-18Rα/β异源二聚体或IL-18BP的亲和力通过解离常数(KD)测量。如本文使用的，措辞“修饰的IL-18多肽/IL-18Rα的KD”意指修饰的IL-18多肽与IL-18Rα结合相互作用的解离常数。措辞“修饰的IL-18多肽/IL-18Rα/β的KD”意指修饰的IL-18多肽与IL-18Rα/β异源二聚体结合相互作用的解离常数。类似地，措辞“修饰的IL-18多肽/IL-18BP的KD”意指修饰的IL-18多肽与IL-18BP结合相互作用的解离常数。
在一些实施方案中，如通过KD测量的，修饰的IL-18多肽对IL-18受体(IL-18R)表现出比对IL-18结合蛋白(IL-18BP)大的亲和力，并且其中[KD IL-18R]/[KD IL-18BP]低于1。
在一些实施方案中，如通过KD测量的，修饰的IL-18多肽对IL-18受体α亚基(IL-18Rα)表现出比对IL-18结合蛋白(IL-18BP)低不超过10倍的亲和力、低不超过5倍的亲和力，或比对IL-18结合蛋白(IL-18BP)大的亲和力。在一些实施方案中，如通过KD测量的，修饰的IL-18多肽对IL-18受体α亚基(IL-18Rα)表现出比对IL-18结合蛋白(IL-18BP)低不超过10倍的亲和力。在一些实施方案中，如通过KD测量的，修饰的IL-18多肽对IL-18受体α亚基(IL-18Rα)表现出比对IL-18结合蛋白(IL-18BP)低不超过5倍的亲和力。在一些实施方案中，KD通过表面等离子体共振测定来确定(参见例如实施例8、实施例10和实施例12)。在一些实施方案中，KD通过alphaLISA测定来确定(参见例如实施例9)。
在一些实施方案中，如通过KD测量的，修饰的IL-18多肽对IL-18受体α亚基(IL-18Rα)表现出比对IL-18结合蛋白(IL-18BP)低不超过10倍的亲和力、低不超过5倍的亲和力，或比对IL-18结合蛋白(IL-18BP)大的亲和力，并且其中[KD IL-18Rα]/[KD IL-18BP]大于0.1。在一些实施方案中，[KD IL-18Rα]/[KD IL-18BP]大于约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1。在一些实施方案中，KD通过表面等离子体共振测定来确定(参见例如实施例8、实施例10和实施例12)。在一些实施方案中，KD通过alphaLISA测定来确定(参见例如实施例9)。
在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽与IL-18受体α(IL-18Rα)结合。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽以小于约200nM、小于约100nM、或小于约50nM的KD与IL-18Rα结合。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽以小于约200nM的KD与IL-18Rα结合。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽以小于约100nM的KD与IL-18Rα结合。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽以小于约50nM的KD与IL-18Rα结合。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽以小于约10nM的KD与IL-18Rα结合。在一些实施方案中，KD通过表面等离子体共振测定来确定(参见例如实施例8和实施例10)。
在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽与IL-18受体α/β(IL-18Rα/β)异源二聚体结合。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽以小于约100nM的KD与IL-18Rα/β异源二聚体结合。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽以小于约500nM的KD与IL-18Rα/β异源二聚体结合。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽以小于约20nM的KD与IL-18Rα/β异源二聚体结合。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽以小于约10nM的KD与IL-18Rα/β异源二聚体结合。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽以小于约5nM的KD与IL-18Rα/β异源二聚体结合。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽以小于约2nM的KD与IL-18Rα/β异源二聚体结合。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽以类似于SEQ ID NO:1的IL-18多肽的KD与IL-18α/β结合。在一些实施方案中，KD通过表面等离子体共振测定来确定(参见例如实施例8和实施例11)。
在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽/IL-18Rα的KD小于1000nM、小于750nM、小于500nM、小于450nM、小于400nM、小于350nM、小于300nM、小于250nM、小于200nM、小于150nM、小于140nM、小于130nM、小于125nM、小于120nM、小于100nM。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽/IL-18Rα的KD小于150nM、小于50nM、小于25nM或小于10nM。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽/IL-18Rα的KD小于50nM。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽/IL-18Rα的KD小于10nM。在一些实施方案中，KD通过表面等离子体共振测定来确定(参见例如实施例8和实施例10)。
在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽/IL-18Rα/β异源二聚体的KD小于1000nM、小于750nM、小于500nM、小于450nM、小于400nM、小于350nM、小于300nM、小于250nM、小于200nM、小于150nM、小于140nM、小于130nM、小于125nM、小于120nM、小于100nM。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽/IL-18Rα/β异源二聚体的KD小于150nM、小于50nM、小于25nM、小于10nM、小于5nM或小于2nM。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽/IL-18Rα/β异源二聚体的KD小于50nM。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽/IL-18Rα/β异源二聚体的KD小于10nM。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽/IL-18Rα/β异源二聚体的KD小于5nM。在一些实施方案中，KD通过表面等离子体共振测定来确定(参见例如实施例8和实施例11)。
在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽/IL-18BP的KD小于1000nM、小于750nM、小于500nM、小于450nM、小于400nM、小于350nM、小于300nM、小于250nM、小于200nM、小于150nM、小于140nM、小于130nM、小于125nM、小于120nM、小于100nM。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽/IL-18BP的KD小于50nM、小于25nM、小于1nM或小于0.5nM在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽/IL-18BP的KD为约10nM。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽/IL-18BP的KD为约2.5nM。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽/IL-18BP的KD为约1nM。在一些实施方案中，KD通过表面等离子体共振测定来确定(参见例如实施例8和实施例12)。在一些实施方案中，KD通过alphaLISA测定来确定(参见例如实施例9)。
在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽/IL-18Rα的KD与野生型IL-18/IL-18Rα的KD基本上相同。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽/IL-18Rα的KD大于野生型IL-18/IL-18Rα的KD。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽/IL-18Rα的KD低于野生型IL-18/IL-18Rα的KD。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽/IL-18Rα的KD比野生型IL-18/IL-18Rα的KD大至多10％、至多20％、至多30％、至多40％、至多50％、至多60％、至多70％、至多80％、至多85％或至多90。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽/IL-18Rα的KD比野生型IL-18/IL-18Rα的KD大至少20％。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽/IL-18Rα的KD比野生型IL-18/IL-18Rα的KD大至少25％。KD通过表面等离子体共振测定来确定(参见例如实施例8和实施例10)。
在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽/IL-18Rα的KD比野生型IL-18/IL-18Rα的KD大至多100％、至多200％、至多300％、至多400％、至多500％或至多600％。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽/IL-18Rα的KD比野生型IL-18/IL-18Rα的KD大至多500％。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽/IL-18Rα的KD比野生型IL-18/IL-18Rα的KD大约500％。在一些实施方案中，KD通过表面等离子体共振测定来确定(参见例如实施例8和实施例10)。
在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽/IL-18Rα/β异源二聚体的KD与野生型IL-18/IL-18Rα/β的KD基本上相同。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽/IL-18Rα/β异源二聚体的KD大于野生型IL-18/IL-18Rα/β异源二聚体的KD。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽/IL-18Rα/β异源二聚体的KD比野生型IL-18/IL-18Rα/β异源二聚体的KD大至多10％、至多20％、至多30％、至多40％、至多50％、至多60％、至多70％、至多80％或至多90％。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽/IL-18Rα/β异源二聚体的KD比野生型IL-18/IL-18Rα/β异源二聚体的KD大至多25％。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽/IL-18Rα/β异源二聚体的KD比野生型IL-18/IL-18Rα/β异源二聚体的KD大约25％。在一些实施方案中，KD通过表面等离子体共振测定来确定(参见例如实施例8和实施例11)。
在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽/IL-18Rα/β异源二聚体的KD比野生型IL-18/IL-18Rα/β异源二聚体的KD大至多100％、至多200％、至多300％、至多400％、至多500％。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽/IL-18Rα/β异源二聚体的KD比野生型IL-18/IL-18Rα/β异源二聚体的KD大至多350％。在一些实施方案中，KD通过表面等离子体共振测定来确定(参见例如实施例8和实施例11)。
在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽/IL-18BP的KD与野生型IL-18/IL-18BP的KD基本上相同。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽/IL-18BP的KD大于野生型IL-18/IL-18BP的KD。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽/IL-18BP的KD比野生型IL-18/IL-18BP的KD大至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽/IL-18BP的KD比野生型IL-18/IL-18BP的KD大至少25％。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽/IL-18BP的KD比野生型IL-18/IL-18BP的KD大约25％。在一些实施方案中，KD通过表面等离子体共振测定来确定(参见例如实施例8和实施例12)。在一些实施方案中，KD通过alphaLISA测定来确定(参见例如实施例9)。
在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽/IL-18BP的KD大于野生型IL-18/IL-18BP的KD。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽/IL-18BP的KD比野生型IL-18/IL-18BP的KD大至少2倍、3倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍或50倍。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽/IL-18BP的KD比野生型IL-18/IL-18BP的KD大至少5倍。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽/IL-18BP的KD比野生型IL-18/IL-18BP的KD大至少30倍。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽/IL-18BP的KD比野生型IL-18/IL-18BP的KD大约8倍。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽/IL-18BP的KD比野生型IL-18/IL-18BP的KD大约35倍。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽/IL-18BP的KD比野生型IL-18/IL-18BP的KD大约40倍。在一些实施方案中，KD通过表面等离子体共振测定来确定(参见例如实施例8和实施例12)。在一些实施方案中，KD通过alphaLISA测定来确定(参见例如实施例9)。
VIIb.半最大有效浓度(EC50)
在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽调节IFN·的产生。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽诱导IFNγ的能力的EC50(nM)比SEQ ID NO:1的IL-18多肽的EC50(nM)高不超过10倍、高不超过5倍，或比SEQ ID NO:1的IL-18多肽的EC50(nM)低。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽诱导IFNγ的能力的EC50比SEQ ID NO:1的IL-18多肽的EC50(nM)高不超过10倍。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽诱导IFNγ的能力的EC50比SEQ ID NO:1的IL-18多肽的EC50(nM)高不超过5倍。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽诱导IFNγ的能力的EC50比SEQID NO:1的IL-18多肽的EC50(nM)低。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽诱导IFNγ的能力的EC50比SEQ ID NO:1的IL-18多肽的EC50(nM)高不超过10倍、高不超过8倍、高不超过6倍、高不超过5倍、高不超过4倍、高不超过3倍或高不超过2倍。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽诱导IFNγ的能力的EC50通过IFNγ诱导细胞测定来测量(参见例如实施例13)。
在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽调节IFNγ的产生，并且其中修饰的IL-18多肽针对IFNγ的EC50(nM)比SEQ ID NO:1的IL-18多肽的EC50(nM)低。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽针对IFNγ的EC50(nM)比SEQ ID NO:1的IL-18多肽的EC50(nM)低至少10倍。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽针对IFNγ的EC50(nM)比SEQ ID NO:1的IL-18多肽的EC50(nM)低约10倍。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽针对IFNγ的EC50(nM)比SEQ ID NO:1的IL-18多肽的EC50(nM)低约15倍。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽诱导IFNγ的能力的EC50通过IFNγ诱导细胞测定来测量(参见例如实施例13)。
VIII.治疗方法
在一方面，本文描述了一种治疗有相应需要的受试者的癌症的方法，该方法包括：向受试者施用有效量的如本文描述的修饰的IL-18多肽或药物组合物。
在另一方面，本文描述了本文提供的修饰的IL-18多肽，用于在治疗有相应需要的受试者的癌症中使用。在另一方面，本文描述了本文提供的修饰的IL-18多肽，用于制备用于治疗有相应需要的受试者的癌症的药物。
在一些实施方案中，癌症是实体癌症。在一些实施方案中，实体癌症是肾癌、皮肤癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、结肠直肠癌、食管癌、眼癌、头颈癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌或前列腺癌。在一些实施方案中，实体癌症是转移性肾细胞癌(转移性RCC)或黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是实体癌症。在一些实施方案中，实体癌症是癌或肉瘤。
在一些实施方案中，癌症是液体癌症。在一些实施方案中，癌症是血液癌症。在一些实施方案中，液体癌症是骨髓瘤或白血病。在一些实施方案中，液体癌症是白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤或多发性骨髓瘤。
在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽以有效量的修饰的IL-18多肽的单剂量施用，包括另外的实施方案，其中(i)修饰的IL-18多肽被每天一次施用；或(ii)修饰的IL-18多肽在一天跨度内向试者施用多于一次。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽被每天一次、每隔一天一次、每周3次、每周一次、每2周一次、每3周一次、每4周一次、每5周一次、每3天一次、每4天一次、每5天一次、每6天一次、每周两次、每周3次、每周4次、每周5次、每周6次、每月一次、每月两次、每月3次、每2个月一次、每3个月一次、每4个月一次、每5个月一次或每6个月一次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽被每天一次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽被每隔一天一次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽被每隔一天一次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽被每周3次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽被每周一次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽被每2周一次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽被每3周一次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽被每4周一次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽被每5周一次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽被每3天一次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽被每4天一次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽被每5天一次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽被每6天一次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽被每周两次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽被每周3次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽被每周4次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽被每周5次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽被每周6次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽被每月一次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽被每月两次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽被每月3次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽被每两个月一次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽被每3个月一次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽被每4个月一次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽被每5个月一次施用。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽被每6个月一次施用。
在一些实施方案中，受试者为5岁至75岁年龄。在一些实施方案中，受试者为5岁至10岁、5岁至15岁、5岁至18岁、5岁至25岁、5岁至35岁、5岁至45岁、5岁至55岁、5岁至65岁、5岁至75岁、10岁至15岁、10岁至18岁、10岁至25岁、10岁至35岁、10岁至45岁、10岁至55岁、10岁至65岁、10岁至75岁、15岁至18岁、15岁至25岁、15岁至35岁、15岁至45岁、15岁至55岁、15岁至65岁、15岁至75岁、18岁至25岁、18岁至35岁、18岁至45岁、18岁至55岁、18岁至65岁、18岁至75岁、25岁至35岁、25岁至45岁、25岁至55岁、25岁至65岁、25岁至75岁、35岁至45岁、35岁至55岁、35岁至65岁、35岁至75岁、45岁至55岁、45岁至65岁、45岁至75岁、55岁至65岁、55岁至75岁或65岁至75岁年龄。在一些实施方案中，受试者为至少5岁、10岁、15岁、18岁、25岁、35岁、45岁、55岁或65岁年龄。在一些实施方案中，受试者为至多10岁、15岁、18岁、25岁、35岁、45岁、55岁、65岁或75岁年龄。
在一些实施方案中，该方法还包括将修饰的IL-18多肽或药物组合物的冻干形式重构。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽或药物组合物在施用前被重构。在一些实施方案中，组合物在临施用前、施用前至多约5分钟、施用前至多约20分钟、施用前至多约40分钟、施用前至多1小时或施用前至多约4小时被重构。
IX.制备(合成)方法
本文还提供了一种合成修饰的IL-18多肽的方法。在一些情况下，修饰的IL-18多肽被化学合成而不是重组表达。在一些情况下，合成修饰的IL-18多肽的若干片段肽前体，并且随后使用合适的连接方法(例如α-酮酸羟胺(KAHA)连接)连接在一起。在一些情况下，在连接后，所得的修饰的IL-18多肽被折叠以产生具有与重组或野生型IL-18多肽的二级和三级结构基本相同的二级和三级结构的修饰的IL-18多肽。
在一些情况下，修饰的IL-18多肽的甲硫氨酸残基被取代，用于稳定性目的，并有助于线性的修饰的IL-18多肽的折叠，以产生最终的修饰的IL-18多肽。甲硫氨酸的侧链在合成过程(例如肽合成和蛋白质折叠)期间易于氧化，因此，在一些情况下，由于缺乏均一性，导致最终的IL-18多肽的质量不足以用于某些用途。
在一些情况下，为了克服这些限制，修饰的IL-18多肽的所有甲硫氨酸残基都用正亮氨酸残基替代。在一些情况下，线性肽的合成是成功的，但结果显示出不稳定的迹象，诸如增加的疏水性和沉淀倾向，以及失谐的生物活性，这可能是因为错误折叠导致修饰的IL-18多肽相对于野生型或重组IL-18的二级/三级结构改变。
在一些情况下，在前体肽的合成期间直接掺入氧化的甲硫氨酸来合成修饰的IL-18多肽，以试图产生均一的线性蛋白，而没有部分甲硫氨酸氧化的复杂混合物。在一些情况下，成功合成了修饰的线性IL-18多肽，但在将甲硫氨酸还原回非氧化形式时遇到了困难。
为了克服这些挑战，设计了新的修饰的IL-18多肽变体，该变体用O-甲基-L-高丝氨酸(Omh)残基替代甲硫氨酸残基。Omh是天然甲硫氨酸的结构类似物，其中甲硫氨酸的硫原子被氧替代。由于缺少硫原子，Omh残基不易于氧化，并且因此预计会给予修饰的IL-18多肽更大的稳定性，并容易合成/纯化。另外，与用正亮氨酸残基替代甲硫氨酸的变体相比，Omh残基与正亮氨酸残基相比的增加的亲水性，以及Omh与天然甲硫氨酸残基的更大的结构同源性，预计有助于修饰的IL-18多肽的正确折叠和更大的稳定性。因此，预计化学合成的用Omh残基替代甲硫氨酸残基的修饰的IL-18多肽将提供优于其他合成的修饰的IL-18多肽的若干优点。
在一方面，本文描述了一种制备修饰的IL-18多肽的方法。在另一方面，本文描述了一种制备修饰的IL-18多肽的方法，该方法包括合成修饰的IL-18多肽的两种或更多种片段并连接所述片段。在另一方面，本文描述了一种制备修饰的IL-18多肽的方法，该方法包括a.合成修饰的IL-18多肽的两种或更多种片段，b.连接所述片段；以及c.使所连接的片段折叠。在另一方面，本文描述了一种制备修饰的IL-18多肽的方法，该方法包括提供修饰的IL-18多肽的两种或更多种片段并连接所述片段。在另一方面，本文描述了一种制备修饰的IL-18多肽的方法，该方法包括a.提供修饰的IL-18多肽的两种或更多种片段，b.连接所述片段；以及c.使所连接的片段折叠。在另一方面，本文描述了一种制备修饰的IL-18多肽的方法，该方法包括连接修饰的IL-18多肽的两种或更多种片段，其中合成修饰的IL-18多肽的两种或更多种片段中的至少一种，并使所连接的片段折叠。
在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽的两种或更多种片段被化学合成。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽的两种或更多种片段通过固相肽合成来合成。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽的两种或更多种片段在自动化肽合成仪上合成。
在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽由2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种肽片段连接。在一些实施方案中，修饰的肽由2种肽片段连接。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽由3种肽片段连接。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽由4种肽片段连接。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽由2种至10种肽片段连接。
在一些实施方案中，所述两种或更多种片段包括N-末端片段、C-末端片段和任选地一种或更多种内部片段，其中N-末端片段包括修饰的IL-18多肽的N-末端，并且C-末端片段包括修饰的IL-18多肽的C-末端。在一些实施方案中，N-末端片段和一种或更多种内部片段中的每一种包含α-酮氨基酸作为每种片段的C-末端残基。在一些实施方案中，每种α-酮氨基酸选自α-酮-苯丙氨酸、α-酮-酪氨酸、α-酮-缬氨酸、α-酮-亮氨酸、α-酮-异亮氨酸、α-酮-正亮氨酸和α-酮-O-甲基-高丝氨酸。
在一些实施方案中，C-末端片段和一种或更多种内部片段中的每一种包含具有羟胺或环状羟胺官能团的残基作为每种片段的N-末端残基。在一些实施方案中，具有羟胺或环状羟胺官能团的每种残基是5-氧杂脯氨酸残基。
在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽的两种或更多种片段被连接在一起。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽的三种或更多种片段以顺序方式连接。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽的三种或更多种片段以一锅反应连接。
在一些实施方案中，合成修饰的IL-18多肽的两种或更多种片段包括合成四种片段。在一些实施方案中，提供修饰的IL-18多肽的两种或更多种片段包括提供四种片段。在一些实施方案中，四种片段包括四种各自与独立地选自表13中提供的那些序列的任何序列具有至少约80％的序列同一性的片段。在一些实施方案中，四种片段包括四种与表13中提供的那些序列具有至少约85％序列同一性的片段。在一些实施方案中，四种片段包括四种与表13中提供的那些序列具有至少约90％序列同一性的片段。在一些实施方案中，四种片段包括四种与表13中提供的那些序列具有至少约95％序列同一性的片段。在一些实施方案中，四种片段包括四种在表13中提供的片段。
表13-用于合成IL-18的示例性肽
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表13-X＝正亮氨酸；J＝O-甲基-L-高丝氨酸
在一些实施方案中，四种片段包括N-末端片段、第一内部片段、第二内部片段和C-末端片段。
在一些实施方案中，N-末端片段包含对应于修饰的IL-18多肽的氨基酸1-30的残基，其中修饰的IL-18多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，N-末端片段包含与SEQ ID NO:1的序列相比的N-末端延伸。在一些实施方案中，N-末端片段包含与如SEQ ID NO:201中列出的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，N-末端片段包含如SEQ ID No:201-209的任何一个中列出的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一内部片段包含对应于修饰的IL-18多肽的氨基酸31-62的残基，其中修饰的IL-18多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，第一内部片段包含与如SEQ ID NO:210中列出的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一内部片段包含如SEQ ID No:210-217的任何一个中列出的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第二内部片段包含对应于修饰的IL-18多肽的氨基酸63-115的残基，其中修饰的IL-18多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，第二内部片段包含与如SEQ ID NO:227中列出的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二内部片段包含如SEQ ID NO:227-236的任何一个中列出的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一内部片段包含对应于修饰的IL-18多肽的氨基酸31-74的残基，其中修饰的IL-18多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，第一内部片段包含与如SEQ ID NO:218中列出的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一内部片段包含如SEQ ID NO:218-226的任何一个中列出的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第二内部片段包含对应于修饰的IL-18多肽的氨基酸75-115的残基，其中修饰的IL-18多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，第二内部片段包含与如SEQ ID NO:237中列出的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二内部片段包含如SEQ ID NO:237-242的任何一个中列出的氨基酸序列。
在一些实施方案中，C-末端片段包含对应于修饰的IL-18多肽的氨基酸116-157的残基，其中修饰的IL-18多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，C-末端片段包含与如SEQ ID NO:243中列出的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，C-末端片段包含如SEQ ID NO:243-248的任何一个中列出的氨基酸序列。
在一些实施方案中，N-末端片段、第一内部片段、第二内部片段和C-末端片段分别从N-末端到C-末端排列在修饰的IL-18多肽中。
在一些实施方案中，方法还包括将连接的片段重排。在一些实施方案中，将连接的片段重排包括将线性IL-18多肽的一个或更多个酯肽键重排。在一些实施方案中，将一个或更多个酯肽键重排以形成一个或更多个酰胺键。在一些实施方案中，酯肽键是由于片段的连接而形成的。在一些实施方案中，酯肽键在高丝氨酸残基的羟基部分和邻近该高丝氨酸残基的氨基酸之间。在一些实施方案中，将连接的片段重排发生在每个片段已经连接之后。
在一些实施方案中，使连接的片段折叠。在一些实施方案中，折叠包括在修饰的IL-18多肽内形成一个或更多个二硫键。在一些实施方案中，连接的片段经历折叠过程。在一些实施方案中，连接的片段使用本领域熟知的方法折叠。在一些实施方案中，连接的多肽或折叠的多肽通过在其上附接一种或更多种聚合物来进一步修饰。在一些实施方案中，连接的多肽或折叠的多肽通过PEG化来进一步修饰。
在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽是合成的。
本文提供的特定的修饰的IL-18多肽的示例性非限制性合成方案在图5和图9-图17中示出。通常，在一些实施方案中，制备包含对应于修饰的IL-18多肽的残基编号1-30(与SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列相比)的氨基酸或氨基酸前体的第一片段(“区段1”)(例如，通过固相肽合成(SPPS))。将第一片段(“区段1”)与在一些实施方案中包含对应于修饰的IL-18多肽的残基编号31-74或残基编号31-62的氨基酸或氨基前体的第二片段(“区段2”)偶联，以产生单个片段(“区段12”)。在一些实施方案中，该第二片段也通过SPPS制备。类似地，在一些实施方案中，通过SPPS制备第三片段，其具有对应于修饰的IL-18多肽的残基编号63-115或75-115的氨基酸或氨基酸前体。将该第三片段与在一些实施方案中通过SPPS制备的包含对应于修饰的IL-18多肽的残基编号116-157的氨基酸或氨基酸前体的第四片段(“区段4”)偶联，以产生单个片段(“区段34”)。然后将区段12和区段34偶联以产生全长片段(“区段1234”)。在使用KAHA连接来连接片段的实施方案中，该位点残基然后被重排以在连接点产生酰胺键(例如，酯肽高丝氨酸重排为酰胺键)。最后，全长线性片段然后被折叠以产生合成的IL-18多肽。
图5示出了用于合成具有如SEQ ID NO:26中列出的氨基酸序列的修饰的IL-18多肽的示例性合成方案。该修饰的IL-18多肽掺入了在片段2的合成中通过PEG接头附加到残基K70的叠氮化物官能团。该叠氮化物官能团之后充当缀合手柄来附接更大的PEG基团。
图9示出了用于合成修饰的IL-18多肽的示例性合成方案。该图描绘的合成也在位置70处掺入了带有叠氮化物的PEG赖氨酸残基，类似于图5。
图10示出了用于合成修饰的IL-18多肽的另外的示例性合成方案。修饰的IL-18多肽具有如SEQ ID NO:25中列出的氨基酸序列。所描绘的IL-18多肽不包含半胱氨酸残基，并且没有被修饰以掺入缀合手柄，并且因此不能使用本文提供的技术进行位点特异性PEG化。
图11示出了用于合成具有如SEQ ID NO:31中列出的氨基酸序列的修饰的IL-18多肽的示例性合成方案。与图5、图9和图10中列出的合成相比，修饰的IL-18在位置62/63处而不是在位置74/75处连接。
图12示出了用于合成具有如SEQ ID NO:32中列出的氨基酸序列的修饰的IL-18多肽的示例性合成方案。修饰的IL-18多肽包含带有叠氮化物官能团的修饰的赖氨酸残基。
图13示出了用于合成具有如SEQ ID NO:33中列出的氨基酸序列的修饰的IL-18多肽的示例性合成方案。所描绘的IL-18多肽不包含半胱氨酸残基，并且没有被修饰以掺入缀合手柄，并且因此不能使用本文提供的技术进行位点特异性PEG化。
图14示出了用于合成具有如SEQ ID NO:34中列出的氨基酸序列的修饰的IL-18多肽的示例性合成方案。修饰的IL-18多肽包含带有叠氮化物官能团的修饰的赖氨酸残基。
图15示出了用于合成包含修饰的天冬氨酸残基的修饰的IL-18多肽的示例性合成方案，该修饰的天冬氨酸残基具有通过PEG基团附加到其上的叠氮化物部分。修饰的天冬氨酸残基可以放置在任何期望的位置(例如残基68、69或70)。
图16示出了用于合成包含修饰的谷氨酸残基的修饰的IL-18多肽的示例性合成方案，该修饰的谷氨酸残基具有通过PEG基团附加到其上的叠氮化物部分。修饰的谷氨酸残基可以放置在任何期望的位置(例如残基68、69或70)。
图17示出了用于制备修饰的IL-18多肽的一般合成方案，该修饰的IL-18多肽包含附加到区段3上的氨基酸残基(例如残基68、69或70)上的叠氮化物基团。示出的R基团指示叠氮化物官能团可以通过各种修饰的残基(包括半胱氨酸、赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸)附接。
在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽被表达为重组多肽。在一些实施方案中，修饰的IL-18多肽使用大肠杆菌(Escherichia coli)表达。
尽管已经详细描述了本公开内容及其优点，但应当理解，本文可以进行各种变化、替代和改变，而不偏离如所附权利要求书中限定的本公开内容的精神和范围。
X.合成的IL-18
本文还提供了化学合成的IL-18。在一些实施方案中，化学合成的IL-18展示出与SEQ ID NO:1的重组IL-18基本相同的生物活性。在一些实施方案中，化学合成的IL-18包含如本文提供的修饰。在一些实施方案中，本文提供的修饰调节如本文提供的修饰的IL-18多肽的生物活性。
化学合成的IL-18提供了优于重组IL-18的优势，因为化学合成的IL-18可以以位点特异性的方式容易地合成以包含任何期望的修饰，从而允许容易地调节生物活性。
在一方面，本文提供了一种合成IL-18多肽，包含：包含在选自残基21-41、残基60-80和残基106-126的区域的位置处的高丝氨酸(Hse)残基的合成IL-18多肽，其中修饰的IL-18多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，合成IL-18多肽包含在残基21-41、残基60-80和残基106-126的每个区域中的Hse残基。
在一些实施方案中，合成IL-18多肽包含在位置31处的Hse残基。在一些实施方案中，合成IL-18多肽包含在位置63或位置75处的Hse残基。在一些实施方案中，合成IL-18多肽包含在位置63处的Hse残基。在一些实施方案中，合成IL-18多肽包含在位置75处的Hse残基。在一些实施方案中，合成IL-18多肽包含在位置116处的Hse残基。在一些实施方案中，合成IL-18多肽包含在位置31、116、和位置63和75中的至少一个处的Hse残基。
在一些实施方案中，合成IL-18多肽包含SEQ ID NO:1中至少一个甲硫氨酸残基的氨基酸取代。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1中至少一个甲硫氨酸残基的氨基酸取代包括在M33、M51、M60、M86、M113或M150处的取代。在一些实施方案中，合成IL-18多肽包含至少三个甲硫氨酸残基的取代。在一些实施方案中，合成IL-18多肽包含至少五个甲硫氨酸残基的取代。在一些实施方案中，合成IL-18多肽包含至少六个甲硫氨酸残基的取代。
在一些实施方案中，至少一个甲硫氨酸残基被取代为O-甲基-高丝氨酸(Omh)残基。在一些实施方案中，至少三个甲硫氨酸残基被取代为Omh残基。在一些实施方案中，至少五个甲硫氨酸残基被取代为Omh残基。在一些实施方案中，每个甲硫氨酸被取代为正亮氨酸或Omh残基。在一些实施方案中，每个甲硫氨酸被取代为Omh残基。在一些实施方案中，SEQID NO:1的每个甲硫氨酸残基被取代为Omh残基。
在一些实施方案中，合成IL-18多肽包含SEQ ID NO:1的另外的突变。在一些实施方案中，合成IL-18多肽包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列至少约80％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，合成IL-18多肽包含与合成IL-18多肽的残基共价附接的聚合物。
本公开内容在以下实施例中进一步说明，这些实施例仅为了说明目的而提供，并不意图以任何方式限制本公开内容。
实施例
实施例1-修饰的IL-18多肽的合成
具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的修饰的IL-18多肽通过连接使用固相肽合成(SPPS)合成的单独的肽来制备。单独的肽使用下文描述的方法在自动化肽合成仪上合成。
商业上可得的试剂从Sigma-Aldrich、Acros、Merck或TCI Europe购买，并且不经进一步纯化地使用。用于固相肽合成的具有合适侧链保护基团的芴甲氧羰基(Fmoc)氨基酸从Novabiochem、Christof Senn Laboratories AG或PeptART购买，并将其按供应使用。用于肽合成的聚乙二醇衍生物由PolyPure购买。来自Sigma Aldrich的HPLC级CH3CN用于分析型和制备型HPLC纯化。
使用4-羟基-α-氰基肉桂酸(HCCA)作为基质，使用配有双ESI/MALDI-FTICR源的Bruker solariX(9.4T磁体)质谱仪通过高分辨率傅立叶变换质谱(FTMS)表征肽和蛋白。CD光谱用具有光程长为1.0mm的池的Jasco J-715光谱仪记录。CD光谱在25℃以标准灵敏度(100mdeg)、0.5nm数据间距、50nm/min扫描速度和1nm带宽的连续扫描模式收集。通过平均5次扫描并减去背景信号获得CD曲线。
通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)分析和纯化肽区段、连接肽和线性蛋白。肽分析和反应监测在具有双泵、混合器和在线脱气器(in-line degasser)、自动进样器、可变波长UV检测器(在220nm和254nm处同时监测洗脱液)和装有100μL注射环的注射器的分析型Jasco仪器上进行。肽区段的纯化在具有10-20mL注射环的Gilson制备型仪器或Jasco半制备型仪器上进行。在所有情况下，流动相是含有0.1％TFA(v/v)的MilliQ-H2O(缓冲液A)和含有0.1％TFA(v/v)的HPLC级CH3CN(缓冲液B)。分析型HPLC在bioZenTM Intact C4柱(3.6μm,150x4.6mm)上在室温进行或在Aeris WIDEPORE XB-C18柱(3.6μm,150x4.6mm)上在60℃以1mL/min的流量进行。制备型HPLC在Gemini NX-C18
Figure BDA0004186569250000951
柱(5μm，250x50mm)上或在Shiseido capcell Pak UG80 C18柱(5μm，250x50mm)上，以40mL/min的流量在40℃或60℃进行。半制备型HPLC在Shiseido capcell Pak C18柱(5μm，250x20mm)上以10mL/min的流量在60℃进行。
使用Fmoc-SPPS化学在自动化肽合成仪上合成肽区段。使用以下具有侧链保护基团的Fmoc-氨基酸：Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OBno)-OH、Fmoc-Asp(OAll)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(alloc)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Met(O)-OH、Fmoc-Hse(Me)-OH、Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH。在必要时将Fmoc-假脯氨酸二肽(Fmoc-pseudoproline dipeptides)掺入合成。Fmoc脱保护用DMF中的20％哌啶(2x8min)或包含0.1M Cl-HOBt的DMF中的25％哌啶(2x8min)或包含0.1M Cl-HOBt的DMF中的20％哌啶(2x8min)进行，并在304nm处通过UV以反馈回路监测以确保完全Fmoc去除。在室温或在50℃，用Fmoc-氨基酸(3.0-5.0当量，相对于树脂取代)、作为偶联试剂的HCTU或HATU(2.9-4.9当量)和DIPEA或NMM(6-10当量)在DMF中进行偶联。预活化3min后，将溶液添加到树脂，并根据氨基酸的不同允许反应15min、30min或2h。在一些情况下，需要双重偶联。在一些情况下，将树脂用DMF中的20％乙酸酐处理，用于对任何未反应的游离胺封端。在需要时，进行LiCl洗涤。烯丙氧羰基(Alloc)脱保护在氮气下使用苯基硅烷(24当量)和四(三苯基膦)钯(0)(0.5当量)在氮气吹扫的(nitrogen purged)二氯甲烷中在室温进行30min。
使用以下样品方案通过微裂解监测SPPS对肽区段的合成：10mg肽基树脂在室温用裂解混合物(200μL)处理1.5h。滤去树脂，并浓缩滤液，并用冷乙醚处理，研磨并离心。仔细地倾析乙醚层，并将剩余物再次悬浮于乙醚中，研磨并离心。重复乙醚洗涤两次。所得糊状物重新溶解在含有0.1％TFA(v/v)的1:1CH3CN/H2O中并使用Aeris WIDEPORE XB-C18柱(3.6μm,150x4.6mm)在60℃通过分析型HPLC和MALDI-TOF进行分析。
在肽合成完成后，在室温使用裂解混合物将肽从树脂裂解2h。滤去树脂，并浓缩滤液，并用冷乙醚处理，研磨并离心。仔细地倾析乙醚层，并将剩余物再次悬浮于乙醚中，研磨并离心。重复乙醚洗涤两次。所得的粗肽在真空下干燥并储存在-20℃。
用于产生本文提供的修饰的IL-18多肽的一般合成方案在图8中示出。简言之，线性肽片段(如图8中示出的片段1-4)使用SPPS制备，并在合成期间掺入对野生型IL-18的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的任何所期望的修饰。纯化单独的区段之后，分别将区段1与区段2以及区段3与区段4连接在一起。然后，将所得的区段1-2和区段3-4连接在一起，并共同脱保护以提供粗合成IL-18多肽。
然后，IL18-Seg1234-Acm的Acm基团被共同脱保护并纯化，以提供合成的IL18线性蛋白。
1.1用于合成IL-18片段的一般程序
1.1.1.区段1：IL18(1-29)-Leu-α-酮酸。
Figure BDA0004186569250000971
IL18(1-29)-Leu-α-酮酸(IL18-Seg1)
IL18(1-29)-Phe-α-酮酸区段在预先装载具有0.25mmol/g的取代量(substitution capacity)的保护的Fmoc-α-Phe-酮酸的Rink Amide MBHA树脂上合成。使用一般方法部分中描述的程序，通过自动化Fmoc-SPPS进行合成直到Tyr1。
区段1的变体：在一些情况下，Glu 6用Lys取代。
肽合成的进展通过进行如一般方法部分中描述的微裂解分析来监测。裂解混合物包括95:2.5:2.5 TFA/DODT/H2O的混合物。
在合成完成后，通过在95:2.5:2.5 TFA/DODT/H2O的混合物(10mL/g树脂)中在室温搅拌树脂2h将肽从树脂裂解，如一般方法中描述的。粗IL18(1-29)-Phe-α-酮酸区段的纯化通过制备型HPLC进行，使用Shiseido capcell Pak UG80 C18柱(5μm，250x50mm)以40mL/min的流量在60℃以在25min内含有0.1％TFA(v/v)的10％至60％CH3CN的梯度。将包含纯化产物的级分汇集并冻干以获得IL18(1-29)-Phe-α-酮酸区段(IL18-Seg1)。使用分析型HPLC和ESI-HRMS来确认产物的纯度和质量。
1.1.2区段2：Opr-IL18(32-61)-光保护的-Val-α-酮酸和Opr-IL18(32-73)-光保护的-Leu-α-酮酸
1.1.2.1 Opr-IL18(32-61)-光保护的-Val-α-酮酸
Figure BDA0004186569250000981
Opr-IL18(32-61)-光保护的-Val-α-酮酸(或IL18-Seg2)
Opr-IL18(32-61)-Val-光保护的-α-酮酸区段以0.2mmol规模在预先装载具有0.24mmol/g的取代量的Fmoc-Val-光保护的-α-酮酸的Rink Amide MBHA树脂上合成。使用一般方法部分中描述的程序，通过自动化Fmoc-SPPS进行合成直到Asp 32。假脯氨酸二肽是合成该区段所需要的，并被手动偶联在位置54-55、49-50和35-36处。将Boc-5-(S)-氧杂脯氨酸手动偶联在序列末端。在位置32、37和40处手动添加具有非常规侧链保护基团的天冬氨酸残基。在一些情况下，这些保护基团在将肽从树脂裂解后需要另外的脱保护步骤。
区段2的变体：在一些情况下，Lys 53用Ala取代。在一些情况下，Cys(Acm)38用Ser取代。在一些情况下，Met 33、Met 51和Met 60用Nle或O-甲基-L-高丝氨酸取代。
肽合成的进展通过进行一般方法部分中描述的微裂解来监测。裂解混合物包括95:2.5:2.5 TFA/DODT/H2O的混合物。在合成完成后，使用95:2.5:2.5 TFA/DODT/H2O的混合物(15mL/g树脂)将肽从树脂裂解，在室温持续2h。粗Opr-IL18(32-61)-光保护的-Val-α-酮酸区段通过制备型HPLC纯化，使用Gemini NX-C18
Figure BDA0004186569250000982
柱(5μm，250x50mm)以40mL/min的流量在40℃以在30min内含有0.1％TFA(v/v)的10％至60％CH3CN的梯度。将含有纯化产物的级分汇集并冻干以获得Opr-IL18(32-61)-光保护的-Val-α-酮酸(IL18-Seg2)。使用分析型HPLC和ESI-HRMS来确认产物的纯度和质量。将包含纯化产物的级分汇集并冻干以获得作为>98％纯度的白色固体的Opr-IL18(32-61)-光保护的-Val-α-酮酸(IL18-Seg2)。
1.1.2.1 Opr-IL18(32-73)-光保护的-Leu-α-酮酸
区段2长度的变化：在一些情况下，IL-18区段2的序列长了几个氨基酸，并且将包含IL-18的位置31至74的序列。
区段Opr-IL18(32-73)-光保护的-Phe-α-酮酸区段在预先装载具有0.21mmol/g的取代量的Fmoc-Phe-光保护的-α-酮酸的Rink Amide MBHA树脂上制备。使用一般方法部分中描述的程序，通过自动化Fmoc-SPPS进行合成直到Asp 32。将Boc-5-(S)-氧杂脯氨酸手动偶联至该序列。
Figure BDA0004186569250000991
Opr-IL18(32-73)-光保护的-Leu-α-酮酸
区段2的变体：在一些情况下，Lys 53用Ala取代并且Lys 70用非典型N-α-(9-芴甲氧羰基)-ε-叠氮基-L-赖氨酸(Fmoc-Lys(N3)-OH)取代。在一些情况下，Lys 70的侧链用alloc基团保护。然后在树脂上脱保护步骤期间去除alloc基团，并且将所得的游离胺与戊二酸酐偶联。然后将所得游离酸偶联到对应的期望基团，例如PEG基团或带有叠氮化物官能团的PEG基团。在一些情况下，Cys(Acm)38和Cys(Acm)68用Ser取代。在一些情况下，Met 33、Met 51和Met 60用Nle或O-甲基-L-高丝氨酸取代。
1.1.3区段3：Fmoc-Opr-IL18(64-114)-Phe-α-酮酸和Fmoc-Opr-IL18(76-114)-Phe-α-酮酸。
1.1.3.1 Fmoc-Opr-IL18(64-114)-Phe-α-酮酸
Figure BDA0004186569250000992
Fmoc-Opr-IL18(64-114)-Phe-α-酮酸(IL18-Seg3)
Fmoc-Opr-IL18(64-114)-Phe-α-酮酸区段以0.1mmol规模在预先装载具有0.47mmol/g的取代量的Fmoc-Phe-保护的-α-酮酸的Rink Amide
Figure BDA0004186569250001001
树脂上合成。使用一般方法部分中描述的程序，通过自动化Fmoc-SPPS进行合成直到Ile 64。假脯氨酸二肽是合成该区段所需要的，并被手动偶联在位置81-82和71-72处。将Fmoc-5-(S)-氧杂脯氨酸手动偶联在序列末端。
肽合成的进展通过进行一般方法部分中描述的微裂解来监测。裂解混合物包括95:2.5:2.5 TFA/DODT/H2O的混合物。在合成完成后，使用95:2.5:2.5 TFA/DODT/H2O的混合物(15mL/g树脂)将肽从树脂裂解，持续2h。粗Fmoc-Opr-IL18(76-114)-Phe-α-酮酸区段通过制备型HPLC纯化，使用Gemini NX-C18
Figure BDA0004186569250001002
柱(5μm，250x50mm)以40mL/min的流量在40℃以在40min内含有0.1％TFA(v/v)的10％至50％CH3CN的梯度。将包含纯化产物的级分汇集并冻干以获得Fmoc-Opr-IL18(76-114)-Phe-α-酮酸(IL18-Seg3)。使用分析型HPLC和ESI-HRMS来确认产物的纯度和质量。
区段3的变体：在一些情况下，Cys(Acm)68和Cys(Acm)76用Ser取代。在一些情况下，Met86和Met113用Nle或O-甲基-L-高丝氨酸取代。在一些情况下，Lys 70用非典型N-α-(9-芴甲氧羰基)-ε-叠氮基-L-赖氨酸(Fmoc-Lys(N3)-OH)取代。在一些情况下，Lys 70的侧链用alloc基团保护。然后在树脂上脱保护步骤期间去除alloc基团，并且将所得的游离胺与戊二酸酐偶联。然后将所得游离酸偶联到对应的期望基团，例如PEG基团或带有叠氮化物官能团的PEG基团。
1.1.3.2Fmoc-Opr-IL18(76-114)-Phe-α-酮酸
区段3长度的变化：在一些情况下，IL-18区段3的序列短了几个氨基酸，并且将包含IL-18的位置75至115的序列。区段Fmoc-Opr-IL18(74-114)-Phe-α-酮酸然后在预先装载具有0.47mmol/g的取代量的Fmoc-Phe-保护的-α-酮酸的Rink Amide
Figure BDA0004186569250001003
树脂上合成。使用一般方法部分中描述的程序，进行自动化Fmoc-SPPS直到Cys(Acm)76。将Fmoc-5-(S)-氧杂脯氨酸手动偶联至该序列。
Figure BDA0004186569250001011
Fmoc-Opr-IL18(76-114)-Phe-α-酮酸
区段3的变体：在一些情况下，Cys(Acm)76用Ser取代。在一些情况下，Met86和Met113用Nle或O-甲基-L-高丝氨酸取代。
1.1.4区段4：Opr-IL18(117-157)。
在Fmoc-Rink-Amide MBHA树脂上进行Fmoc-Asp(OtBu)-OH的预先装载。4g树脂(装载量：0.56mmol/g,2.24mmol规模)在DMF中溶胀15min。树脂用DMF中20％的哌啶(v/v)在室温处理20min。树脂用DMF洗涤若干次。将Fmoc-Asp(OtBu)-OH(691mg，1.68mmol，0.75当量)和HATU(638mg，1.68mmol，0.75当量)溶解在DMF(12mL)中。通过添加DIPEA(585μL，3.36mmol，1.5当量)在室温进行预活化3min。将反应混合物添加到溶胀的树脂中。让其在室温在温和搅拌下反应过夜。用DMF彻底冲洗树脂。通过添加在DMF(12mL)中的乙酸酐(1.17mL)和DIPEA(2.34mL)的溶液来启动对树脂上未反应的胺的封端。让其在室温在温和搅拌下反应15min。用DCM彻底冲洗树脂并干燥。测量树脂的装载量(0.34mmol/g)。
Figure BDA0004186569250001012
Opr-IL18(117-157)(IL18-Seg 4)
Opr-IL18(117-157)区段在预先装载具有0.34mmol/g的取代量的Fmoc-Asp(OtBu)-OH的Rink Amide MBHA树脂上合成。使用一般方法部分中描述的程序，进行自动化Fmoc-SPPS直到Ser 117。将Boc-5-(S)-氧杂脯氨酸偶联至该序列。
肽合成的进展通过进行一般方法部分中描述的微裂解来监测。裂解混合物包括92.5:2.5:2.5:2.5 TFA/TIPS/DODT/H2O的混合物。在合成完成后，使用92.5:2.5:2.5:2.5TFA/TIPS/DODT/H2O的混合物(10mL/g树脂)将肽从树脂裂解，持续2h。粗Opr-IL18(117-157)区段通过制备型HPLC纯化，使用Gemini NX-C18
Figure BDA0004186569250001021
柱(5μm，250x50mm)以40mL/min的流量在40℃以在45min内含有0.1％TFA(v/v)的10％至55％CH3CN的梯度。将包含纯化产物的级分汇集并冻干以获得Opr-IL18(117-157)(IL18-Seg4)。使用分析型HPLC和ESI-HRMS来确认产物的纯度和质量。
区段4的变体：在一些情况下，Cys(Acm)127用Ser取代。在一些情况下，Met 150用Nle或O-甲基-L-高丝氨酸取代。
1.2用于制备IL18线性蛋白的KAHA连接。
1.2.1.用于合成区段12(IL18-Seg12)的KAHA连接
Figure BDA0004186569250001022
区段12(IL18-Seg12)
连接：将IL18-Seg1(1.2当量)和IL18-Seg2(1当量)溶解在包含0.1M草酸的9:1DMSO/H2O中(对于限制性剂(the limiting agent)为20mM肽浓度)并在60℃反应15h。通过将小瓶包裹在铝箔中使连接小瓶避光。KAHA连接的进展通过HPLC监测，使用AerisWIDEPORE XB-C18柱(3.6μm,150x4.6mm)以1mL/min的流量在60℃，以在7min内20％至95％CH3CN的梯度。
光脱保护：连接完成后，将混合物用含有0.1％TFA(v/v)的1:1CH3CN/H2O稀释并以365nm的波长辐照1.5h。光解反应的完成通过HPLC和MALDI-TOF MS分析确认。
纯化：光脱保护的样品通过制备型HPLC纯化，使用Shiseido capcell Pak UG80C18柱(5μm,250x50mm)，在60℃保持，以2步梯度：在25min内含有0.1％TFA(v/v)的10％至60％CH3CN，然后保持60％CH3CN 5min，以40mL/min的流量。将包含纯化产物的级分汇集并冻干以获得IL18-Seg12。通过HPLC和ESI-HRMS分析确认区段的纯度和身份。
1.2.2用于合成区段34(IL18-Seg34)的KAHA连接
Figure BDA0004186569250001031
/>
区段34(IL18-Seg34)
连接：将IL18-Seg3(1当量)和IL18-Seg4(1.2当量)溶解在包含0.1M草酸的97.5:2.5 DMSO/H2O中(对于限制性剂为20mM肽浓度)并在60℃反应16h。KAHA连接的进展通过HPLC监测，使用Aeris WIDEPORE柱(3.6μm,150x4.6mm)以1mL/min的流量在60℃，以在7min内5％至65％CH3CN的梯度。
Fmoc脱保护：连接完成后，用DMSO稀释反应混合物(6.7mM肽浓度)。添加二乙胺(5％，v/v)并在室温振荡反应混合物15min。用DMSO第二次稀释反应混合物(3.3mM肽浓度)。添加二乙胺(2.5％，v/v)并在室温再振荡反应混合物15min。然后用含有0.1％TFA(v/v)的1:1CH3CN/H2O稀释反应混合物。
纯化：样品通过制备型HPLC纯化，在Gemini NX-C18
Figure BDA0004186569250001032
柱(5μm，250x50mm)上以40mL/min的流量在40℃，以在40min内含有0.1％TFA(v/v)的10％至55％CH3CN的梯度。将包含纯化产物的级分汇集并冻干，以获得IL18-Seg34(Seg34)。使用分析型HPLC和ESI-HRMS来确认产物的纯度和质量。
1.2.3用于合成IL18区段1234(IL18-Seg1234-Acm)的KAHA连接。
Figure BDA0004186569250001033
区段1234(IL18-Seg1234-Acm)
连接：将IL18-Seg12(1.2当量)和IL18-Seg34(1.0当量)溶解在包含0.1M草酸的9:1DMSO/H2O中(15mM肽浓度)，并在60℃搅拌反应24h。KAHA连接的进展通过分析型HPLC监测，使用Aeris WIDEPORE柱(3.6μm,150x4.6mm)以1mL/min的流量在60℃使用含有0.1％TFA(v/v)的CH3CN/H2O作为流动相，以在7min内20％至95％CH3CN的梯度。连接完成后，用DMSO稀释反应混合物，随后用含有0.1％TFA(v/v)的1:1CH3CN/H2O的混合物进一步稀释。
纯化：样品通过制备型HPLC纯化，在Gemini NX-C18
Figure BDA0004186569250001041
柱(5μm，250x50mm)上以40mL/min的流量在60℃，以在30min内含有0.1％TFA(v/v)的10％至60％CH3CN的梯度。将包含纯化产物的级分汇集并冻干，以获得具有Acm基团保护的半胱氨酸残基的IL18-Seg1234(IL18-Seg1234-Acm)。使用分析型HPLC和ESI-HRMS来确认产物的纯度和质量。
1.2.4用于合成IL18线性蛋白的重排和Acm脱保护
重排：将IL18-Seg1234-Acm溶解在包含0.1M Tris的6M Gu·HCl(pH8.1)中(1.5mL，0.13mM蛋白浓度)。pH值被调节到8.0。让其在50℃反应2h。反应完成后，将样品用包含0.1％TFA(v/v)的6M Gu·HCl(10mL)稀释，并通过制备型HPLC纯化，使用Proteonavi S5柱(250x20mm)以10mL/min的流量在60℃使用含有0.1％TFA(v/v)的CH3CN/H2O作为流动相，以含有0.1％TFA(v/v)的20％至40％(在19min内)和40％至50％(在11min内)CH3CN的梯度。将包含产物的级分汇集并冻干以获得具有Acm的IL18线性蛋白。使用分析型HPLC和ESI-HRMS来确认产物的纯度和质量。
Acm脱保护：将具有Acm的IL18线性蛋白溶解在1:1AcOH/H2O中(0.25mM蛋白浓度)，并且将乙酸银(1％，m/v)添加到溶液中。将混合物在50℃避光振荡2.5h。Acm脱保护反应的进展通过分析型HPLC监测，使用Aeris WIDEPORE柱(3.6μm,150x4.6mm)以1mL/min的流量在60℃使用含有0.1％TFA(v/v)的CH3CN/H2O作为流动相，以在7min内20％至95％CH3CN的梯度。反应完成后，将样品用含有0.1％TFA(v/v)的1:1CH3CN/H2O稀释。
纯化：样品通过制备型HPLC纯化，在Shiseido capcell Pak UG80 C18柱(250x20mm)上以10mL/min的流量在室温，使用含有0.1％TFA(v/v)的CH3CN/H2O作为流动相，以两步梯度：在5min内10％至30％CH3CN和在20min内30％至95％CH3CN。将包含纯化产物的级分汇集并冻干，以获得期望的IL18线性蛋白。使用分析型HPLC和HRMS来确认产物的纯度和质量。
实施例2-修饰的IL-18多肽的折叠
将合成的修饰的IL-18多肽溶解在缓冲溶液中，并经受特定的缓冲液和pH条件以促进多肽的折叠。使用分析技术(诸如HPLC、ESI-MS和/或MALDI-TOF)来确认折叠的蛋白。通过改变折叠缓冲液(缓冲液A和缓冲液B)和配制缓冲液的组成筛选和测试了若干条件。示例性折叠条件和缓冲液组合物在下表14示出。选择产生修饰的IL-18多肽的期望的分析和生化特性的一种或更多种条件用于规模放大折叠方案。
步骤1：将线性蛋白溶解在缓冲液A中(2mg/mL至4mg/mL蛋白浓度)。蛋白溶液在20℃温和地振荡长达1h。
步骤2：用缓冲液B以逐滴的方式缓慢稀释蛋白溶液。以0.2mg/mL至0.4mg/mL的浓度获得的澄清溶液在4℃、10℃或20℃孵育18h至48h。
步骤3：将溶液在10℃以10,000RPM离心10min。然后将其在室温针对包含0.02％Tween 80和5％-6％蔗糖的PBS(pH 7.4)透析，持续2h。将此步骤重复进行第二次。然后将其用相同的缓冲液在室温第三次透析，持续18h。
纯的折叠的蛋白的纯度和身份通过分析型HPLC和MALDI-TOF进一步确认。
表14：缓冲液A和缓冲液B的组成
Figure BDA0004186569250001051
Figure BDA0004186569250001061
/>
实施例3-折叠的IL-18的进一步修饰
折叠的IL-18通过与聚乙二醇聚合物反应来进一步修饰，并在适当的缓冲液中配制。
实施例4-SEQ ID NO:24的修饰的IL-18多肽的合成。
根据以下描述的方案制备SEQ ID NO:24的线性肽。
Figure BDA0004186569250001062
Fmoc-Phe-保护的-α-酮酸1
区段1(IL-18(1-29)-Phe-α-酮酸)：在Fmoc-Rink Amide MBHA树脂上进行Fmoc-Phe-保护的-α-酮酸1的预先装载。5g树脂(装载量：0.56mmol/g,1.8mmol规模)在DMF中溶胀20min。树脂用DMF中20％的哌啶(v/v)在室温处理10min两次，并用DMF洗涤若干次。将酮酸1(1.46g，1.8mmol，1.0当量)和HATU(650mg，1.71mmol，0.95当量)溶解在DMF(20mL)中。通过添加NMM(396μL，3.6mmol，2当量)在室温进行预活化，持续3min。将反应混合物添加到溶胀的树脂中，并在室温温和地搅拌2.5h。用DMF彻底冲洗树脂。通过添加在DMF(20mL)中的乙酸酐(1.17mL)和DIPEA(2.34mL)的溶液来启动对树脂上未反应的胺的封端，并在室温温和地搅拌反应物15min。树脂用DCM随后用乙醚彻底冲洗，并干燥。测量树脂的装载量(0.30mmol/g)。
Figure BDA0004186569250001071
IL18(1-29)-Phe-α-酮酸(IL18-Seg1)
IL18(1-29)-Phe-α-酮酸区段以0.45mmol规模在预先装载具有～0.30mmol/g的取代量的Fmoc-Phe-保护的-α-酮酸(1.5g)的Rink Amide MBHA树脂上合成。
IL18(1-29)-Phe-α-酮酸的自动化Fmoc-SPPS：在室温通过向树脂添加溶解在DMF中的Fmoc-氨基酸(10.0mL，0.4M，4当量)、在DMF中的HCTU(10.0mL，0.38M，3.8当量)和在DMF中的NMM(10.0mL，0.8M，8当量)的溶液进行偶联反应，持续30min。对于位置14至1，需要双重偶联。在Fmoc脱保护反应之前，每5个氨基酸用在DMF中的氯化锂(0.8M)的溶液进行洗涤。当需要时，在室温通过添加在DMF中20％(v/v)的乙酸酐溶液(10.0mL)和在DMF中的NMM(0.8M，10.0mL)进行封端，持续10min。使用包含Cl-HOBt(0.1M)的DMF中的20％(v/v)哌啶在室温进行Fmoc脱保护反应，持续8min。
用DCM洗涤树脂并在真空下干燥。干燥的肽基树脂的质量为4.6g。使用95:2.5:2.5TFA/DODT/H2O的混合物(10mL/g树脂)在室温将肽从树脂裂解，持续2.0h。从裂解混合物滤去树脂，并浓缩滤液并用冷乙醚(20℃)稀释20倍，允许肽沉淀。离心后，仔细地倾析乙醚层，并将肽沉淀物重悬于乙醚中，研磨并离心。重复乙醚洗涤两次，并干燥所得肽沉淀。粗肽的质量为1.8g。粗IL18(1-29)-Phe-α-酮酸区段的纯化通过制备型HPLC进行，使用ShiseidoCapcell Pak UG80 C18柱(5μm，250x50mm)以40mL/min的流量在60℃使用含有0.1％TFA(v/v)的CH3CN/H2O作为流动相，以在25min内含有0.1％TFA(v/v)的10％至60％CH3CN的梯度。将包含纯化产物的级分汇集并冻干以获得作为>98％纯度的白色固体的IL18(1-29)-Phe-α-酮酸(IL18-Seg1)。基于树脂装载量的分离产量为472mg(28％)。MS(ESI)：C233H348N58O69S；计算的平均同位素为3550.8936Da[M]；发现：3550.8948Da。
Figure BDA0004186569250001081
Fmoc-Leu-光保护的-α-酮酸2
区段2(Opr-IL18(32-73)-Leu-光保护的-α-酮酸)：在Fmoc-Rink-Amide MBHA树脂上进行Fmoc-Leu-光保护的-α-酮酸2的预先装载。5g树脂(装载量：0.56mmol/g，2.25mmol规模)在DMF中溶胀20min。将酮酸2(1.79g,2.25mmol，1当量)和HATU(813mg,2.14mmol,0.95当量)溶解在DMF(25mL)中。通过添加NMM(495μL，4.5mmol，2当量)在室温进行预活化，持续2min。将反应混合物添加到溶胀的树脂中，并在室温温和地搅拌6h。用DMF彻底冲洗树脂。通过添加在DMF(20mL)中的乙酸酐(2.0mL)和DIPEA(2.0mL)的溶液来启动对树脂上未反应的胺的封端，并在室温温和地搅拌混合物15min。树脂用DCM和乙醚彻底冲洗，并干燥。测量树脂的装载量(0.34mmol/g)。
Figure BDA0004186569250001082
Opr-IL18(32-73)-Phe-光保护的-α-酮酸(IL18-Seg2)
Opr-IL18(32-73)-Phe-光保护的-α-酮酸区段以0.2mmol规模在预先装载具有～0.34mmol/g的取代量的Fmoc-Phe-Leu-光保护的-α-酮酸的Rink Amide MBHA树脂上合成。
位置73至66的自动化Fmoc-SPPS：在室温通过向树脂添加溶解在DMF中的Fmoc-氨基酸(2.0mL，0.4M，4当量)、在DMF中的HCTU(2.0mL，0.38M，3.8当量)和在DMF中的NMM(2.0mL，0.8M，8当量)进行偶联反应，持续30min。对于每个偶联循环，使用包含Cl-HOBt(0.1M)的DMF中的20％(v/v)哌啶在室温进行Fmoc脱保护反应，持续7min。
然后进行Fmoc-L-Ile-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH的手动偶联。制备了在3mL DMF中的Fmoc-L-Ile-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH(384mg，0.8mmol，4当量)、HATU(290mg，0.76mmol，3.8当量)和NMM(176μL，1.6mmol，8当量)的溶液(在室温预活化3min)并添加到树脂。将反应物在室温温和地搅拌1h。
位置63的自动化Fmoc-SPPS：使用以上描述的条件进行偶联反应。位置63需要三重偶联。
位置64至56的自动化Fmoc-SPPS：使用以上描述的条件进行偶联反应。
然后进行Fmoc-L-Asp(tBu)-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH的手动偶联。制备了在3mLDMF中的Fmoc-L-Asp(tBu)-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH(430mg，0.8mmol，4当量)、HATU(290mg，0.76mmol，3.8当量)和NMM(176μL，1.6mmol，8当量)的溶液(在室温预活化3min)并添加到树脂。将反应物在室温温和地搅拌1h。
位置53至51的自动化Fmoc-SPPS：偶联反应使用与先前提到的序列开始时相同的条件进行。
然后进行Fmoc-L-Ile-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH的手动偶联。制备了在3mL DMF中的Fmoc-L-Ile-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH(384mg，0.8mmol，4当量)、HATU(290mg，0.76mmol，3.8当量)和NMM(176μL，1.6mmol，8当量)的溶液(在室温预活化3min)并添加到树脂。将反应物在室温温和地搅拌1h。
位置48至37的自动化SPPS：使用以上描述的条件进行偶联反应。每个位置都需要双重偶联。
然后进行Fmoc-L-Asp(tBu)-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH的手动偶联。制备了在3mLDMF中的Fmoc-L-Asp(tBu)-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH(430mg，0.8mmol，4当量)、HATU(290mg，0.76mmol，3.8当量)和NMM(176μL，1.6mmol，8当量)的溶液(在室温预活化3min)并添加到树脂。将反应物在室温温和地搅拌1h。
位置34至32的自动化Fmoc-SPPS：使用以上描述的条件进行偶联反应。每个位置都需要双重偶联。在室温通过添加在DMF中20％(v/v)的乙酸酐(2mL)和在DMF中的NMM(0.8M，2mL)在每个位置进行封端，持续10min。使用包含Cl-HOBt(0.1M)的DMF中的20％(v/v)哌啶在室温进行Fmoc脱保护，持续7min。
然后进行Boc-5-(S)-氧杂脯氨酸的手动偶联。制备了在7mL DMF中的Boc-5-(S)-氧杂脯氨酸(217mg，1.0mmol，5当量)、HATU(361mg，0.95mmol，4.8当量)和NMM(220μL，2.0mmol，10当量)的溶液(在室温预活化3min)并添加到树脂。将反应物在室温温和地搅拌2.5h。用DCM和乙醚洗涤树脂，并在真空下干燥。干燥的肽基树脂的质量为1.8g。
使用95:2.5:2.5 TFA/DODT/H2O的混合物(15mL/g树脂)将肽从树脂裂解，并在室温温和地搅拌混合物2.0h。从裂解混合物滤去树脂，并浓缩滤液并用冷乙醚(20℃)稀释20倍，允许肽沉淀。离心后，仔细地倾析乙醚层，并将肽沉淀物重悬于乙醚中，研磨并离心。重复乙醚洗涤两次，并干燥所得肽沉淀。粗肽的质量为1.2g。粗Opr-IL18(32-73)-Phe-光保护的-α-酮酸区段的纯化通过制备型HPLC进行，使用Gemini NX-C18
Figure BDA0004186569250001101
柱(5μm，250x50mm)以40mL/min的流量在40℃使用含有0.1％TFA(v/v)的CH3CN/H2O作为流动相，以在30min内含有0.1％TFA(v/v)的10％至60％CH3CN的梯度。将包含纯化产物的级分汇集并冻干以获得作为>98％纯度的白色固体的Opr-IL18(32-73)-Phe-光保护的-α-酮酸(IL18-Seg2)。基于树脂装载量的分离产量为148mg(14％)。LC-MS(ESI)：4.88min；C233H348N58O69S；计算的m/z：1315.4233Da[M+4H]；发现：1315.4231Da[M+4H]。
Figure BDA0004186569250001102
Fmoc-Phe-保护的-α-酮酸3
区段3(Fmoc-Opr-IL18(76-114)-Phe-α-酮酸)：222mg树脂(装载量：0.47mmol/g，0.1mmol规模)在DMF中溶胀15min。将酮酸3(163mg,0.2mmol，2当量)和HATU(76mg,0.2mmol,2当量)溶解在DMF(2mL)中。通过添加DIPEA(100μL，0.6mmol，6当量)在室温进行预活化，持续2min。将反应混合物添加到溶胀的树脂中。将反应物在室温温和地搅拌过夜。用DMF彻底冲洗树脂。通过添加在DMF(2mL)中的乙酸酐(100μL)和DIPEA(100μL)的溶液来启动对树脂上未反应的胺的封端。将反应物在室温温和地搅拌15min。用DMF彻底冲洗树脂。未计算树脂的最终装载量，并且估计为不变(0.47mmol/g)。
Figure BDA0004186569250001111
Fmoc-Opr-IL18(76-114)-Phe-α-酮酸(IL18-Seg3)
Fmoc-Opr-IL18(76-114)-Phe-α-酮酸区段以0.1mmol规模在预先装载具有～0.47mmol/g的取代量的Fmoc-Phe-保护的-α-酮酸的Rink Amide
Figure BDA0004186569250001112
树脂上合成。
位置96至114的自动化Fmoc-SPPS：在室温通过向树脂添加溶解在DMF中的Fmoc-氨基酸(1.0mL，0.5M，5当量)、在DMF中的HCTU(1.0mL，0.48M，4.8当量)和在NMP中的DIPEA(0.4mL，0.2M，8当量)进行偶联反应，持续30min。使用在DMF中的20％(v/v)哌啶在室温进行Fmoc脱保护，持续15min。
然后进行Fmoc-L-Asp(tBu)-L-Thr[Ψ(Me,Me)Pro]-OH的手动偶联。制备了在3mLDMF中的Fmoc-L-Asp(tBu)-L-Thr[Ψ(Me,Me)Pro]-OH(166mg，0.3mmol，3当量)、HATU(114mg，0.3mmol，3当量)和DIPEA(100μL，0.6mmol，6当量)的溶液(在室温预活化3min)并添加到树脂。将反应物在室温温和地搅拌2h。
位置76至93的自动化Fmoc-SPPS：使用以上描述的条件进行偶联反应。每个位置都需要双重偶联。在室温通过添加在DMF中的20％(v/v)的乙酸酐(1mL)和在DMF中的DIPEA(0.2M，1mL)在每个位置进行封端，持续10min。使用包含Cl-HOBt(0.1M)的DMF中的25％(v/v)哌啶在室温进行Fmoc脱保护反应，持续15min。
然后进行Fmoc-5-(S)-氧杂脯氨酸的手动偶联。制备了在3mL DMF中的Fmoc-5-(S)-氧杂脯氨酸(102mg，0.3mmol，3当量)、HATU(114mg，0.3mmol，3当量)和DIPEA(100μL，0.6mmol，6当量)的溶液(在室温预活化3min)并添加到树脂。将反应物在室温温和地搅拌2h。用DCM洗涤树脂并在真空下干燥。干燥的肽基树脂的质量为1.0g。
通过在95:2.5:2.5 TFA/DODT/H2O的混合物(15mL/g树脂)中在室温搅拌树脂2.0h，将肽从树脂裂解。从裂解混合物滤去树脂，并浓缩滤液并用冷乙醚(20℃)稀释20倍，允许肽沉淀。离心后，仔细地倾析乙醚层，并将肽沉淀物重悬于乙醚中，研磨并离心。重复乙醚洗涤两次，并干燥所得肽沉淀。粗肽的质量为540mg。粗Fmoc-Opr-IL18(76-114)-Phe-α-酮酸区段的纯化通过制备型HPLC进行，使用Gemini NX-C18
Figure BDA0004186569250001121
柱(5μm，250x250mm)以40mL/min的流量在40℃使用含有0.1％TFA(v/v)的CH3CN/H2O作为流动相，以在40min内含有0.1％TFA(v/v)的10％至50％CH3CN的梯度。将包含纯化产物的级分汇集并冻干以获得作为白色固体的Fmoc-IL18(76-114)-Phe-α-酮酸(IL18-Seg3)。基于树脂装载量的分离产量为128mg(25％)。MS(ESI)：C233H348N58O69S；计算的平均同位素为5094.5226Da[M]；发现：5094.5224Da。
区段4(Opr-IL18(117-157))：在Fmoc-Rink-Amide MBHA树脂上进行Fmoc-Asp(OtBu)-OH的预先装载。4g树脂(装载量：0.56mmol/g,2.24mmol规模)在DMF中溶胀15min。树脂用DMF中20％的哌啶(v/v)在室温处理20min。树脂用DMF洗涤若干次。将Fmoc-Asp(OtBu)-OH(691mg，1.68mmol，0.75当量)和HATU(638mg，1.68mmol，0.75当量)溶解在DMF(12mL)中。通过添加DIPEA(585μL，4.48mmol，2当量)在室温进行预活化，持续3min。将反应混合物添加到溶胀的树脂中，并在室温温和地搅拌过夜。用DMF彻底冲洗树脂。通过添加在DMF(12mL)中的乙酸酐(1.17mL)和DIPEA(2.34mL)的溶液来启动对树脂上未反应的胺的封端，并在室温温和地搅拌混合物15min。树脂用DCM彻底冲洗，并干燥。测量树脂的装载量(0.34mmol/g)。
Figure BDA0004186569250001131
Opr-IL18(117-157)(IL18-Seg4)
Opr-IL18(117-157)区段以0.1mmol规模在预先装载具有～0.34mmol/g的取代量的Fmoc-Asp(OtBu)-OH的Rink Amide MBHA树脂上合成。294mg树脂在DMF中溶胀15min。
位置147至157的自动化Fmoc-SPPS：在室温通过向树脂添加溶解在DMF中的Fmoc-氨基酸(1.0mL，0.5M，5当量)、在DMF中的HCTU(1.0mL，0.48M，4.8当量)和在NMP中的DIPEA(0.4mL，0.2M，8当量)进行偶联反应，持续30min。使用在DMF中的20％(v/v)哌啶在室温进行Fmoc脱保护，持续15min。位置117至146需要双重偶联以及封端步骤。在室温通过添加在DMF中的20％(v/v)的乙酸酐(1mL)和在DMF中的DIPEA(0.2M，1mL)在每个位置进行封端，持续10min。
然后进行Boc-5-(S)-氧杂脯氨酸的手动偶联。制备了在3mL DMF中的Boc-5-(S)-氧杂脯氨酸(65mg，0.3mmol，3当量)、HATU(114mg，0.3mmol，3当量)和DIPEA(100μL，0.6mmol，6当量)的溶液(在室温预活化3min)并添加到树脂。混合物在室温反应2h。
用DCM洗涤树脂并在真空下干燥。干燥的肽基树脂的质量为1.2g。使用92.5:2.5:2.5:2.5 TFA/TIPS/DODT/H2O的混合物(10mL/g树脂)在室温将肽从树脂裂解，持续2h。从裂解混合物滤去树脂，并浓缩滤液并用冷乙醚(20℃)稀释20倍，允许肽沉淀。离心后，仔细地倾析乙醚层，并将肽沉淀物重悬于乙醚中，研磨并离心。重复乙醚洗涤两次，并干燥所得肽沉淀。粗肽的质量为770mg。粗Opr-IL18(117-157)区段的纯化通过制备型HPLC进行，使用Gemini NX-C18
Figure BDA0004186569250001132
柱(5μm，250x50mm)以40mL/min的流量在40℃使用含有0.1％TFA(v/v)的CH3CN/H2O作为流动相，以在40min内含有0.1％TFA(v/v)的10％至50％CH3CN的梯度。将包含纯化产物的级分汇集并冻干以获得作为白色固体的Opr-IL18(117-157)(IL18-Seg4)。基于树脂装载量的分离产量为106mg(21％)。MS(ESI)：C222H346N56O73S；计算的平均同位素为1250.9051Da[M+4H+]；发现：1250.6293Da。/>
Figure BDA0004186569250001141
区段12(IL18-Seg12)
将肽光保护的酮酸IL18-Seg12(28.4mg；7.98μmol；1.2当量)和羟胺肽IL18-Seg2(25.9mg；6.65μmol；1.0当量)溶解在包含0.1M草酸的9:1DMSO/H2O(333μL)中。获得了均匀的液体溶液。通过将小瓶包裹在铝箔中使连接小瓶避光，并将反应物留在60℃过夜。连接完成后，将混合物用含有0.1％TFA(v/v)的1:1CH3CN/H2O(1780μL)稀释并以365nm的波长辐照1.5h，以允许C-末端酮酸的光脱保护。用含有TFA(0.1％,v/v)的1:1CH3CN/H2O(适量10mL)进一步稀释反应混合物。将稀释的混合物过滤并注射到制备型HPLC中。粗连接肽通过制备型HPLC纯化，使用Gemini NX-C18
Figure BDA0004186569250001142
柱(5μm，250x250mm)以40mL/min的流量在60℃，以在30min内含有0.1％TFA(v/v)的10％至60％CH3CN的梯度。将包含纯化产物的级分汇集并冻干以获得作为>98％纯度的白色固体的IL18-Seg12。分离产量为23.9mg(50％)。
LC-MS(ESI)：4.63min；C322H515N89O96S；计算的m/z：7196.7874Da[M]；发现：7196.7476Da[M]。
Figure BDA0004186569250001143
区段12(IL18-Seg12)
IL18-Seg12制备：将肽光保护的酮酸IL18-Seg1(18.1mg；5.09μmol；1.2当量)和羟胺肽IL18-Seg2(22.3mg；4.24μmol；1.0当量)溶解在包含0.1M草酸的9:1DMSO/H2O溶液(220μL)中。获得了非常均匀的液体溶液。通过将小瓶包裹在铝箔中使连接小瓶避光并在60℃温和地搅拌过夜。连接完成后，将混合物用含有0.1％TFA(v/v)的1:1CH3CN/H2O(1780μL)稀释并以365nm的波长辐照1.5h，以允许C-末端酮酸的光脱保护。用含有TFA(0.1％,v/v)的1:1CH3CN/H2O(适量10mL)进一步稀释混合物。将稀释的混合物过滤并注射到制备型HPLC中。粗连接肽通过制备型HPLC纯化，使用Gemini NX-C18
Figure BDA0004186569250001151
柱(5μm，250x250mm)以40mL/min的流量在60℃，以在25min内含有0.1％TFA(v/v)的10％至60％CH3CN的梯度。将包含纯化产物的级分汇集并冻干以获得作为>98％纯度的白色固体的IL18-Seg12。分离产量为16.9mg(47％)。
Figure BDA0004186569250001152
区段34(IL18-Seg34)
IL18-Seg34制备：将肽酮酸IL18-Seg3(54.6mg；10.9μmol；1.0当量)和羟胺肽IL18-Seg4(66.8mg；13.1μmol；1.2当量)溶解在包含0.1M草酸的9:1DMSO/H2O(546μL)中。获得了非常均匀的液体溶液，将其在60℃温和地搅拌过夜。连接反应完成时，用DMSO(1092μL)稀释混合物。通过添加二乙胺(82μL，5％，v/v)启动Fmoc脱保护，并在室温温和地搅拌15min。将在DMSO中(1638μL)的二乙胺(82μL)的第二溶液添加到反应混合物中，并在室温再温和地搅拌15min。预期会形成凝胶。添加三氟乙酸(200μL)以中和反应混合物。获得了均匀和无色的液体溶液，将其用含有TFA(0.1％，v/v)的1:1CH3CN/H2O(适量17mL)进一步稀释。将稀释的混合物直接注射到制备型HPLC中。过滤粗连接肽溶液并通过制备型HPLC纯化，使用Gemini NX-C18
Figure BDA0004186569250001153
柱(5μm，250x50mm)以40mL/min的流量在40℃使用含有0.1％TFA(v/v)的CH3CN/H2O作为流动相，以在40min内含有0.1％TFA(v/v)的10％至50％CH3CN的梯度。将稀释的混合物直接注射到制备型HPLC中。将包含纯化产物的级分汇集并冻干，以获得作为白色固体的IL18-Seg34。分离产量为60.1mg(56％)。MS(ESI)：C439H684N114O138S2；计算的平均同位素为9831.0810Da[M]；发现：9830.9439Da。
Figure BDA0004186569250001161
区段1234(IL18-Seg1234)
含有Acm的IL18-Seg1234的制备：将肽酮酸IL18-Seg12(16.1mg；1.97μmol；1.2当量)和羟胺肽IL18-Seg34(16.1mg；1.64μmol；1.0当量)溶解在包含0.1M草酸的9:1DMSO/H2O(110μL)中。获得了均匀的液体溶液，将其在60℃反应过夜。连接反应完成后，首先用DMSO(1890μL)稀释混合物。用包含(0.1％，v/v)的1:1 H2O/CH3CN(适量8mL)进一步稀释混合物。将稀释的混合物过滤并注射到制备型HPLC中。粗连接肽通过制备型HPLC纯化，使用GeminiNX-C18
Figure BDA0004186569250001162
柱(5μm，250x50mm)以40mL/min的流量在60℃使用含有0.1％TFA(v/v)的CH3CN/H2O作为流动相，以在30min内含有0.1％TFA(v/v)的10％至60％CH3CN的梯度。将包含纯化产物的级分汇集并冻干以获得作为>98％纯度的白色固体的IL18-Seg12。分离产量为10.0mg(33％)。
表4示出了可以根据本文提供的方法制备的修饰的IL-18多肽。
表4.修饰的IL-18多肽
Figure BDA0004186569250001163
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Figure BDA0004186569250001171
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Figure BDA0004186569250001181
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Figure BDA0004186569250001191
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Figure BDA0004186569250001201
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Figure BDA0004186569250001211
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Figure BDA0004186569250001221
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Figure BDA0004186569250001231
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Figure BDA0004186569250001241
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Figure BDA0004186569250001251
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Figure BDA0004186569250001261
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Figure BDA0004186569250001271
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Figure BDA0004186569250001281
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Figure BDA0004186569250001291
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Figure BDA0004186569250001301
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Figure BDA0004186569250001311
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Figure BDA0004186569250001321
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Figure BDA0004186569250001331
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Figure BDA0004186569250001341
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Figure BDA0004186569250001351
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Figure BDA0004186569250001361
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Figure BDA0004186569250001371
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Figure BDA0004186569250001381
*残基位置编号基于SEQ ID NO:1作为参考序列
实施例4A-SEQ ID NO:42的修饰的IL-18多肽的合成。
根据下面提供的方案制备SEQ ID NO:42的修饰的线性IL-18多肽。
Figure BDA0004186569250001382
Fmoc-Phe-保护的-α-酮酸1
区段1A(IL18(1-29)-Phe-α-酮酸)：在Fmoc-Rink Amide MBHA树脂上进行Fmoc-Phe-保护的-α-酮酸1的预先装载。5g树脂(装载量：0.56mmol/g,2.8mmol规模)在DMF中溶胀20min。树脂用DMF中20％的4-甲基哌啶(v/v)在室温处理10min两次，并用DMF洗涤若干次。将酮酸1(1.7g，2.1mmol，0.75当量)和HATU(800mg，2.1mmol，0.75当量)溶解在DMF(15mL)中。通过添加DIPEA(730μL，4.2mmol，1.5当量)在室温进行预活化，持续3min。将反应混合物添加到溶胀的树脂中，并在室温温和地搅拌3h。用DMF彻底冲洗树脂。通过添加在DMF(15mL)中的乙酸酐(2.1mL)和DIPEA(3.9mL)的溶液来启动对树脂上未反应的胺的封端，并在室温温和地搅拌反应物15min。树脂用DCM随后用乙醚彻底冲洗，并干燥。测量树脂的装载量(0.27mmol/g)。
Figure BDA0004186569250001391
IL18(1-29)-Phe-α-酮酸(IL18-Seg1)
IL18(1-29)-Phe-α-酮酸区段以0.2mmol规模在预先装载具有～0.27mmol/g的取代量的Fmoc-Phe-保护的-α-酮酸(741mg)的Rink Amide MBHA树脂上合成。
IL18(1-29)-Phe-α-酮酸的自动化Fmoc-SPPS：在室温通过向树脂添加溶解在DMF中的Fmoc-氨基酸(2.0mL，0.4M，4当量)、在DMF中的OxymaPure(2mL，0.4M，4当量)和在DMF中的DIC(2mL，0.4M，4当量)的溶液进行偶联反应，持续30min。对于位置14至1，需要双重偶联。在室温通过添加在DMF中的20％(v/v)乙酸酐溶液(2mL)和在DMF中的NMM(0.8M，2.0mL)在每个氨基酸之后进行封端，持续6min。使用包含Cl-HOBt(0.1M)的DMF中的20％(v/v)4-甲基哌啶在室温进行Fmoc脱保护反应，持续8min。
用DCM洗涤树脂并在真空下干燥。干燥的肽基树脂的质量为3.4g。使用95:2.5:2.5TFA/DODT/H2O的混合物(10mL/g树脂)在室温将肽从树脂裂解，持续2.0h。从裂解混合物滤去树脂，并浓缩滤液并用冷乙醚(20℃)稀释20倍，允许肽沉淀。离心后，仔细地倾析乙醚层，并将肽沉淀物重悬于乙醚中，研磨并离心。重复乙醚洗涤两次，并干燥所得肽沉淀。粗肽的质量为1.07g。粗IL18(1-29)-Phe-α-酮酸区段1A的纯化通过制备型HPLC进行，使用Shiseido Capcell Pak C18柱(5μm，250x20mm)以10mL/min的流量在60℃使用含有0.1％TFA(v/v)的CH3CN/H2O作为流动相，以在40min内含有0.1％TFA(v/v)的10％至60％CH3CN的梯度。将包含纯化产物的级分汇集并冻干以获得作为>90％纯度的白色固体的IL18(1-29)-Phe-α-酮酸(IL18-Seg1)。基于树脂装载量的分离产量为348mg(29％)。MS(ESI)：C164H260N44O44；计算的平均同位素为3551.9517Da[M]；发现：3551.9644Da[M]。
Figure BDA0004186569250001401
Fmoc-Val-光保护的-α-酮酸2
区段2A(Opr-IL18(32-61)-Val-光保护的-α-酮酸)：在Fmoc-Rink-Amide MBHA树脂上进行Fmoc-Val-光保护的-α-酮酸2的预先装载。3.05g树脂(装载量：0.56mmol/g，1.71mmol规模)在DMF中溶胀20min。将酮酸2(1.0g,1.28mmol，0.75当量)和HATU(487mg,1.28mmol,0.75当量)溶解在DMF(10mL)中。通过添加NMM(280μL，2.56mmol，1.5当量)在室温进行预活化，持续2min。将反应混合物添加到溶胀的树脂中，并在室温温和地搅拌15h。用DMF彻底冲洗树脂。通过添加在DMF(10mL)中乙酸酐(1.29mL)和DIPEA(2.38mL)的溶液来启动对树脂上未反应的胺的封端，并在室温温和地搅拌混合物15min。树脂用DCM和乙醚彻底冲洗，并干燥。测量树脂的装载量(0.307mmol/g)。
Figure BDA0004186569250001402
Opr-IL18(32-61)-Val-光保护的-α-酮酸(IL18-Seg2)
Opr-IL18(32-61)-Val-光保护的-α-酮酸区段以0.2mmol规模在预先装载具有～0.307mmol/g的取代量的Fmoc-Val-光保护的-α-酮酸的Rink Amide MBHA树脂上合成。
位置61至56的自动化Fmoc-SPPS：在室温通过向树脂添加溶解在DMF中的Fmoc-氨基酸(2.0mL，0.4M，4当量)、在DMF中的OxymaPure(2mL，0.4M，4当量)和在DMF中的DIC(2mL，0.4M，4当量)进行偶联反应，持续30min。在室温通过添加在DMF中的20％(v/v)乙酸酐溶液(2mL)和在DMF中的NMM(0.8M，2.0mL)在每个氨基酸之后进行封端，持续6min。在室温使用在DMF中的20％(v/v)4-甲基哌啶进行Fmoc脱保护反应，持续8min。
然后进行Fmoc-L-Asp(tBu)-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH的手动偶联。制备了在6mLDMF中的Fmoc-L-Asp(tBu)-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH(322mg，0.6mmol，3当量)、HATU(228mg，0.6mmol，3当量)和DIPEA(209μL，1.2mmol，6当量)的溶液(在室温预活化3min)并添加到树脂。将反应物在室温温和地搅拌2h。
位置53至51的自动化Fmoc-SPPS：偶联反应使用与先前提到的序列开始时相同的条件进行。
然后进行Fmoc-L-Ile-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH的手动偶联。制备了在6mL DMF中的Fmoc-L-Ile-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH(288mg，0.6mmol，3当量)、HATU(228mg，0.6mmol，3当量)和DIPEA(209μL，1.2mmol，6当量)的溶液(在室温预活化3min)并添加到树脂。将反应物在室温温和地搅拌2h。
位置48至37的自动化SPPS：使用以上描述的条件进行偶联反应。每个位置都需要双重偶联。
然后进行Fmoc-L-Asp(tBu)-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH的手动偶联。制备了在6mLDMF中的Fmoc-L-Asp(tBu)-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH(322mg，0.6mmol，3当量)、HATU(228mg，0.6mmol，3当量)和DIPEA(209μL，1.2mmol，6当量)的溶液(在室温预活化3min)并添加到树脂。将反应物在室温温和地搅拌2h。
位置34至32的自动化Fmoc-SPPS：使用以上描述的条件进行偶联反应。每个位置都需要双重偶联。
然后进行Boc-5-(S)-氧杂脯氨酸的手动偶联。制备了在6mL DMF中的Boc-5-(S)-氧杂脯氨酸(130mg，0.6mmol，3当量)、HATU(228mg，0.6mmol，3当量)和DIPEA(209μL，1.2mmol，6当量)的溶液(在室温预活化3min)并添加到树脂。将反应物在室温温和地搅拌2h。用DCM和乙醚洗涤树脂，并在真空下干燥。干燥的肽基树脂的质量为1.2g。
使用95:2.5:2.5 TFA/DODT/H2O的混合物(10mL/g树脂)将肽从树脂裂解，并在室温温和地搅拌混合物2.0h。从裂解混合物滤去树脂，并浓缩滤液并用冷乙醚(20℃)稀释20倍，允许肽沉淀。离心后，仔细地倾析乙醚层，并将肽沉淀物重悬于乙醚中，研磨并离心。重复乙醚洗涤两次，并干燥所得肽沉淀。粗肽的质量为520mg。粗Opr-IL18(32-61)-Val-光保护的-α-酮酸区段2A的纯化通过制备型HPLC进行，使用Shiseido Capcell Pak C18柱(5μm，250x20mm)以10mL/min的流量在60℃使用含有0.1％TFA(v/v)的CH3CN/H2O作为流动相，以在40min内含有0.1％TFA(v/v)的10％至70％CH3CN的梯度。将包含纯化产物的级分汇集并冻干以获得作为>95％纯度的白色固体的Opr-IL18(32-61)-Val-光保护的-α-酮酸(IL18-Seg2)。基于树脂装载量的分离产量为200mg(24％)。C166H259N45O57S；计算的平均同位素：3828.8527Da[M]；发现：3829.1116Da[M]。
区段3A(Fmoc-Opr-IL18(64-114)-Phe-α-酮酸)：488mg树脂(装载量：0.40mmol/g，0.2mmol规模)在DMF中溶胀15min。将酮酸1(326mg,0.4mmol，2当量)和HATU(152mg,0.4mmol,2当量)溶解在DMF(6mL)中。通过添加DIPEA(174μL，1mmol，5当量)在室温进行预活化，持续2min。将反应混合物添加到溶胀的树脂中。将反应物在室温温和地搅拌3小时。用DMF彻底冲洗树脂。通过添加在DMF(5mL)中的乙酸酐(200μL)和DIPEA(200μL)的溶液来启动对树脂上未反应的胺的封端。将反应物在室温温和地搅拌15min。用DMF彻底冲洗树脂。未计算树脂的最终装载量，并且估计为不变(0.40mmol/g)。
Figure BDA0004186569250001421
Fmoc-Opr-IL18(64-114)-Phe-α-酮酸(IL18-Seg3)
Fmoc-Opr-IL18(64-114)-Phe-α-酮酸区段以0.2mmol规模在预先装载具有～0.40mmol/g的取代量的Fmoc-Phe-保护的-α-酮酸的Rink Amide
Figure BDA0004186569250001422
树脂上合成。
位置96至114的自动化Fmoc-SPPS：在室温通过向树脂添加溶解在DMF中的Fmoc-氨基酸(2.0mL，0.4M，4当量)、在DMF中的OxymaPure(2mL，0.4M，4当量)和在DMF中的DIC(2mL，0.4M，4当量)进行偶联反应，持续30min。每个位置都需要双重偶联。在室温通过添加在DMF中的20％(v/v)乙酸酐溶液(2mL)和在DMF中的NMM(0.8M，2.0mL)在每个氨基酸之后进行封端，持续6min。在室温使用在DMF中的20％(v/v)4-甲基哌啶进行Fmoc脱保护反应，持续8min。
然后进行Fmoc-L-Asp(tBu)-L-Thr[Ψ(Me,Me)Pro]-OH的手动偶联。制备了在6mLDMF中的Fmoc-L-Asp(tBu)-L-Thr[Ψ(Me,Me)Pro]-OH(332mg，0.6mmol，3当量)、HATU(228mg，0.6mmol，3当量)和DIPEA(209μL，1.2mmol，6当量)的溶液(在室温预活化3min)并添加到树脂。将反应物在室温温和地搅拌2h。
位置73至93的自动化Fmoc-SPPS：使用以上描述的条件进行偶联反应。每个位置都需要双重偶联。使用包含Cl-HOBt(0.1M)的DMF中的20％(v/v)4-甲基哌啶在室温进行Fmoc脱保护反应，持续8min。
然后进行Fmoc-L-Ile-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH的手动偶联。制备了在6ml DMF中的Fmoc-L-Ile-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH(288mg，0.6mmol，3当量)、HATU(228mg，0.6mmol，3当量)和DIPEA(209μL，1.2mmol，6当量)的溶液(在室温预活化3min)并添加到树脂。让其在室温反应2h。
位置64至70的自动化Fmoc-SPPS：使用用于位置73至93的相同条件进行偶联反应。
然后进行Fmoc-5-(S)-氧杂脯氨酸的手动偶联。制备了在6mL DMF中的Fmoc-5-(S)-氧杂脯氨酸(204mg，0.6mmol，3当量)、HATU(228mg，0.6mmol，3当量)和DIPEA(209μL，0.6mmol，6当量)的溶液(在室温预活化3min)并添加到树脂。将反应物在室温温和地搅拌2h。用DCM洗涤树脂并在真空下干燥。干燥的肽基树脂的质量为2.0g。
通过在95:2.5:2.5 TFA/DODT/H2O的混合物(10mL/g树脂)中在室温搅拌树脂2.0h，将肽从树脂裂解。从裂解混合物滤去树脂，并浓缩滤液并用冷乙醚(20℃)稀释20倍，允许肽沉淀。离心后，仔细地倾析乙醚层，并将肽沉淀物重悬于乙醚中，研磨并离心。重复乙醚洗涤两次，并干燥所得肽沉淀。粗肽的质量为1.05g。粗Fmoc-Opr-IL18(64-114)-Phe-α-酮酸区段3A的纯化通过制备型HPLC进行，使用Shiseido Capcell Pak C18柱(5μm，250x20mm)以10mL/min的流量在60℃使用含有0.1％TFA(v/v)的CH3CN/H2O作为流动相，以在40min内含有0.1％TFA(v/v)的10％至45％CH3CN的梯度。将包含纯化产物的级分汇集并冻干以获得作为>95％纯度的白色固体的Fmoc-Opr-IL18(64-114)-Phe-α-酮酸(IL18-Seg3)。基于树脂装载量的分离产量为350mg(27.1％)。MS(MALDI-TOF)：C292H453N73O88S2；计算的平均同位素：6458.3790Da[M]；发现：6459.476Da[M+H+]。
区段4A(Opr-IL18(117-157))：在Fmoc-Rink-Amide MBHA树脂上进行Fmoc-Asp(OtBu)-OH的预先装载。4g树脂(装载量：0.56mmol/g,2.24mmol规模)在DMF中溶胀15min。树脂用DMF中20％的哌啶(v/v)在室温处理20min。树脂用DMF洗涤若干次。Fmoc-Asp(OtBu)-OH(691mg，1.68mmol，0.75当量)和HATU(638mg，1.68mmol，0.75当量)溶解在DMF(12mL)中。通过添加DIPEA(585μL，4.48mmol，2当量)在室温进行预活化，持续3min。将反应混合物添加到溶胀的树脂中，并在室温温和地搅拌过夜。用DMF彻底冲洗树脂。通过添加在DMF(12mL)中的乙酸酐(1.17mL)和DIPEA(2.34mL)的溶液来启动对树脂上未反应的胺的封端，并在室温温和地搅拌混合物15min。树脂用DCM彻底冲洗，并干燥。测量树脂的装载量(0.34mmol/g)。
Figure BDA0004186569250001441
Opr-IL18(117-157)(IL18-Seg4)
Opr-IL18(117-157)区段以0.1mmol规模在预先装载具有～0.34mmol/g的取代量的Fmoc-Asp(OtBu)-OH的Rink Amide MBHA树脂上合成。294mg树脂在DMF中溶胀15min。
位置147至157的自动化Fmoc-SPPS：在室温通过向树脂添加溶解在DMF中的Fmoc-氨基酸(1.0mL，0.5M，5当量)、在DMF中的HCTU(1.0mL，0.48M，4.8当量)和在NMP中的DIPEA(0.4mL，0.2M，8当量)进行偶联反应，持续30min。使用在DMF中的20％(v/v)哌啶在室温进行Fmoc脱保护，持续15min。位置117至146需要双重偶联以及封端步骤。在室温通过添加在DMF中的20％(v/v)的乙酸酐(1mL)和在DMF中的DIPEA(0.2M，1mL)在每个位置进行封端，持续10min。
然后进行Boc-5-(S)-氧杂脯氨酸的手动偶联。制备了在3mL DMF中的Boc-5-(S)-氧杂脯氨酸(65mg，0.3mmol，3当量)、HATU(114mg，0.3mmol，3当量)和DIPEA(100μL，0.6mmol，6当量)的溶液(在室温预活化3min)并添加到树脂。混合物在室温反应2h。
用DCM洗涤树脂并在真空下干燥。干燥的肽基树脂的质量为1.2g。使用92.5:2.5:2.5:2.5 TFA/TIPS/DODT/H2O的混合物(10mL/g树脂)在室温将肽从树脂裂解，持续2h。从裂解混合物滤去树脂，并浓缩滤液并用冷乙醚(20℃)稀释20倍，允许肽沉淀。离心后，仔细地倾析乙醚层，并将肽沉淀物重悬于乙醚中，研磨并离心。重复乙醚洗涤两次，并干燥所得肽沉淀。粗肽的质量为770mg。粗Opr-IL18(117-157)区段4A的纯化通过制备型HPLC进行，使用Gemini NX-C18
Figure BDA0004186569250001451
柱(5μm，250x50mm)以40mL/min的流量在40℃使用含有0.1％TFA(v/v)的CH3CN/H2O作为流动相，以在40min内含有0.1％TFA(v/v)的10％至50％CH3CN的梯度。将包含纯化产物的级分汇集并冻干以获得作为白色固体的IL18(117-157)(IL18-Seg4)。基于树脂装载量的分离产量为106mg(21％)。MS(ESI)：C222H346N56O73S；计算的平均同位素为4998.4861Da[M]；发现：4999.5126Da[M]。
Figure BDA0004186569250001452
/>
区段12(IL18-Seg12)
IL18-Seg12A制备：将肽酮酸IL18-Seg1(80.8mg；22.8μmol；1.2当量)和羟胺肽IL18-Seg2(72.6mg；19μmol；1.0当量)溶解在包含0.1M草酸的9.75:0.25 DMSO/H2O溶液(950μL)中。获得了非常均匀的液体溶液。通过将小瓶包裹在铝箔中使连接小瓶避光并在60℃温和地搅拌过夜。连接完成后，用DMSO(3550μL)稀释混合物并以365nm的波长辐照3h，以允许C-末端酮酸的光脱保护。用含有TFA(0.1％,v/v)的1:1CH3CN/H2O(适量10mL)进一步稀释混合物。将稀释的混合物过滤并注射到制备型HPLC中。粗连接肽通过制备型HPLC纯化，使用Shiseido capcell Pak UG80 C18柱(5μm，250x50mm)以40mL/min的流量在60℃，以在30min内含有0.1％TFA(v/v)的20％至50％CH3CN的梯度。将包含纯化产物的级分汇集并冻干以获得作为>98％纯度的白色固体的IL18-Seg12A。分离产量为66.1mg(48％)。MS(ESI)：C321H506N88O96S；计算的m/z：7129.7248Da[M]；发现7129.7177Da[M]。
Figure BDA0004186569250001461
区段34(IL18-Seg34)
IL18-Seg34A制备：将肽酮酸IL18-Seg3(28mg；4.4μmol；1.1当量)和羟胺肽IL18-Seg4(20mg；4μmol；1当量)溶解在包含0.1M草酸的97.5:2.5 DMSO/H2O(200μL)中。获得了非常均匀的液体溶液，将其在60℃温和地搅拌过夜。连接反应完成时，用DMSO(400μL)稀释混合物。通过添加二乙胺(30μL，5％，v/v)启动Fmoc脱保护，并在室温温和地搅拌15min。将二乙胺(30μL)在DMSO中(600μL)的第二溶液添加到反应混合物中，并在室温再温和地搅拌15min。预期会形成凝胶。添加三氟乙酸(100μL)以中和反应混合物。获得了均匀和无色的液体溶液，将其用含有TFA(0.1％，v/v)的1:2CH3CN/H2O(适量10mL)进一步稀释。将稀释的混合物直接注射到制备型HPLC中。过滤粗连接肽溶液并通过制备型HPLC纯化，使用ShiseidoCapcell Pak C18柱(5μm，250x20mm)以10mL/min的流量在60℃使用含有0.1％TFA(v/v)的CH3CN/H2O作为流动相，以在40min内含有0.1％TFA(v/v)的10％至45％CH3CN的梯度。将包含纯化产物的级分汇集并冻干以获得作为>97％纯度的白色固体的IL18-Seg34A。分离产量为20mg(45％)。MS(ESI)：C498H789N129O157S3；计算的平均同位素为11190.7044Da[M]；发现：11190.7341Da[M]。
Figure BDA0004186569250001462
区段1234-Acm(IL18-Seg1234-Acm)
IL18-Seg1234A-Acm制备：将肽酮酸IL18-Seg12(7.5mg；1.1μmol；1.0当量)和羟胺肽IL18-Seg34(13mg；1.2μmol；1.1当量)溶解在包含0.1M草酸的97.5:2.5 DMSO/H2O(69μL)中。获得了均匀的液体溶液，将其在60℃反应过夜。连接反应完成后，首先用DMSO(140μL)稀释混合物。用包含TFA(0.1％，v/v)的1:1 H2O/CH3CN(适量10mL)进一步稀释混合物。将稀释的混合物过滤并注射到制备型HPLC中。粗连接肽通过制备型HPLC纯化，使用ShiseidoCapcell Pak C18柱(5μm，250x20mm)以10mL/min的流量在60℃使用含有0.1％TFA(v/v)的CH3CN/H2O作为流动相，以在40min内含有0.1％TFA(v/v)的10％至45％CH3CN的梯度。将包含纯化产物的级分汇集并冻干以获得作为>92％纯度的白色固体的IL18-Seg1234A-Acm。分离产量为5.45mg(26％)。MS(ESI)：C815H789N129O157S3；计算的平均同位素：18277.4418Da[M]；发现：18278.5394Da。
Figure BDA0004186569250001471
IL18–Seg1234A线性蛋白
IL18-Seg1234A线性蛋白制备：
线性蛋白的重排：将IL18-Seg1234A-Acm(3.61mg，0.198μmol)溶解在包含0.1MTris的6M Gu·HCl水溶液中(1.4mL，15μM蛋白浓度)，并在50℃温和地振荡混合物2.5小时。重排反应完成后，将混合物用包含TFA(0.1％，v/v)的6M Gu·HCl(适量10mL)稀释。将稀释的混合物过滤并注射到制备型HPLC中。粗重排肽通过制备型HPLC纯化，使用ShiseidoCapcell Pak C18柱(5μm，250x20mm)以10mL/min的流量在60℃使用含有0.1％TFA(v/v)的CH3CN/H2O作为流动相，以在40min内含有0.1％TFA(v/v)的10％至45％CH3CN的梯度。将包含纯化产物的级分汇集并冻干以获得作为>97％纯度的白色固体的IL18-Seg1234A-Acm-重排。分离产量为1.41mg(38％)，并且该材料直接用于Acm脱保护步骤，而不进一步表征。
Acm脱保护：将IL18-Seg1234A-Acm-重排(1.41mg；0.077μmol)溶解在0.25mMAcOH/H2O(1:1)中(310μL、蛋白浓度)，并且将乙酸银(3.1mg，1％，m/v)添加到溶液中。将混合物在50℃避光振荡2.5小时。反应完成后，将样品用6mL含有0.1％TFA(v/v)的1:2CH3CN/H2O稀释。样品通过制备型HPLC纯化，在Shiseido Capcell Pak UG80 C18柱(5μm，250x20mm)上，以10mL/min的流量在60℃使用含有0.1％TFA(v/v)的CH3CN/H2O作为流动相，以在40min内含有0.1％TFA(v/v)的10％至45％CH3CN的梯度。将包含纯化产物的级分汇集并冻干以获得0.7mg作为>97％纯度的白色粉末的IL18-Seg1234A线性蛋白(50％产率)。MS(ESI)：C803H1275N213O247S4；计算的平均同位素：17992.2908Da[M]；发现：17993.3349Da[M]。
实施例4B-SEQ ID NO:28的修饰的IL-18多肽的合成。
对于该变体，除了区段3之外，所有其他区段都与用于实施例4A的区段相同。
Figure BDA0004186569250001481
Fmoc-Opr-IL18(64-114)-Phe-α-酮酸(IL18-Seg3B)
区段3B(Fmoc-Opr-IL18(64-114)-Phe-α-酮酸)：Fmoc-Opr-IL18(64-114)-Phe-α-酮酸区段以0.2mmol规模在预先装载具有～0.40mmol/g的取代量的Fmoc-Phe-保护的-α-酮酸的Rink Amide
Figure BDA0004186569250001482
树脂上合成。/>
位置96至114的自动化Fmoc-SPPS：在室温通过向树脂添加溶解在DMF中的Fmoc-氨基酸(2.0mL，0.4M，4当量)、在DMF中的OxymaPure(2mL，0.4M，4当量)和在DMF中的DIC(2mL，0.4M，4当量)进行偶联反应，持续30min。每个位置都需要双重偶联。在室温通过添加在DMF中的20％(v/v)乙酸酐溶液(2mL)和在DMF中的NMM(0.8M，2.0mL)在每个氨基酸之后进行封端，持续6min。在室温使用在DMF中的20％(v/v)4-甲基哌啶进行Fmoc脱保护反应，持续8min。
然后进行Fmoc-L-Asp(tBu)-L-Thr[Ψ(Me,Me)Pro]-OH的手动偶联。制备了在6mLDMF中的Fmoc-L-Asp(tBu)-L-Thr[Ψ(Me,Me)Pro]-OH(332mg，0.6mmol，3当量)、HATU(228mg，0.6mmol，3当量)和DIPEA(209μL，1.2mmol，6当量)的溶液(在室温预活化3min)并添加到树脂。将反应物在室温温和地搅拌2h。
位置73至93的自动化Fmoc-SPPS：使用以上描述的条件进行偶联反应。每个位置都需要双重偶联。使用包含Cl-HOBt(0.1M)的DMF中的20％(v/v)4-甲基哌啶在室温进行Fmoc脱保护反应，持续8min。
然后进行Fmoc-L-Ile-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH的手动偶联。制备了在6ml DMF中的Fmoc-L-Ile-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH(288mg，0.6mmol，3当量)、HATU(228mg，0.6mmol，3当量)和DIPEA(209μL，1.2mmol，6当量)的溶液(在室温预活化3min)并添加到树脂。让其在室温反应2h。在室温通过添加在DMF中的20％(v/v)乙酸酐溶液(2mL)和在DMF中的NMM(0.8M，2.0mL)进行封端，持续10min。在室温使用包含Cl-HOBt(0.1M)的DMF中的20％(v/v)4-甲基哌啶进行Fmoc脱保护反应，持续10min。
然后进行Fmoc-Lys(alloc)-OH的手动偶联。制备了在6ml DMF中的Fmoc-Lys(alloc)-OH(272mg，0.6mmol，3当量)、HATU(228mg，0.6mmol，3当量)和DIPEA(209μL，1.2mmol，6当量)的溶液(在室温预活化3min)并添加到树脂。让其在室温反应2h。
位置64至69的自动化Fmoc-SPPS：使用用于位置73至93的相同条件进行偶联反应。
然后进行Fmoc-5-(S)-氧杂脯氨酸的手动偶联。制备了在6mL DMF中的Fmoc-5-(S)-氧杂脯氨酸(204mg，0.6mmol，3当量)、HATU(228mg，0.6mmol，3当量)和DIPEA(209μL，0.6mmol，6当量)的溶液(在室温预活化3min)并添加到树脂。将反应物在室温搅拌2h。
alloc脱保护：树脂在无水DCM中溶胀15min。用N2吹扫的在3ml无水DCM中的苯基硅烷(595μL，4.80mmol，24当量)溶液，随后是用N2吹扫的在3ml无水DCM中的四(三苯基膦)钯(116mg，100μmol，0.5当量)溶液被添加到树脂，将其在室温搅拌30min。树脂用DCM和DMF洗涤若干次。
然后进行戊二酸酐的手动偶联。将在6ml DMF中的戊二酸酐(172μL，2mmol，10当量)和NMM(220μL，2mmol，10当量)的溶液添加到树脂，将其在室温搅拌30min。树脂用DCM和DMF洗涤若干次。
然后进行O-(2-氨基乙基)-O'-(2-叠氮乙基)九甘醇的手动偶联。将在3mL DMF中的HATU(228mg，0.6mmol，3当量)溶液添加到树脂，随后添加在2mL DMF中的商业上可得的O-(2-氨基乙基)-O'-(2-叠氮乙基)九甘醇(338mg，0.6mmol，3当量)和在1mL DMF中的DIPEA(209μL，0.6mmol，6当量)溶液。然后将树脂在室温搅拌2h。
用DCM洗涤树脂并在真空下干燥。干燥的肽基树脂的质量为1.81g。通过在95:2.5:2.5 TFA/DODT/H2O的混合物(10mL/g树脂)中在室温搅拌树脂2h，将肽从树脂裂解。从裂解混合物滤去树脂，并浓缩滤液并用冷乙醚(20℃)稀释20倍，允许肽沉淀。离心后，仔细地倾析乙醚层，并将肽沉淀物重悬于乙醚中，研磨并离心。重复乙醚洗涤两次，并干燥所得肽沉淀。粗肽的质量为1.08g。粗Fmoc-Opr-IL18(64-114)-Phe-α-酮酸区段3B的纯化通过制备型HPLC进行，使用Shiseido Capcell Pak C18柱(5μm，250x20mm)以10mL/min的流量在60℃使用含有0.1％TFA(v/v)的CH3CN/H2O作为流动相，以在40min内含有0.1％TFA(v/v)的10％至45％CH3CN的梯度。将包含纯化产物的级分汇集并冻干以获得作为>98％纯度的白色固体的Fmoc-Opr-IL18(64-114)-Phe-α-酮酸(IL18-Seg3B)。基于树脂装载量的分离产量为120mg(8.5％)。MS(ESI)：C319H503N77O100S2；发现：7081.0Da[M]。
IL18-Seg34B制备：将肽酮酸IL18-Seg3B(31mg；4.4μmol；1.1当量)和羟胺肽IL18-Seg4A(20mg；4μmol；1当量)溶解在包含0.1M草酸的97.5:2.5 DMSO/H2O(200μL)中。获得了非常均匀的液体溶液，将其在60℃温和地搅拌过夜。连接反应完成时，将混合物用DMSO(200μL)稀释，并进一步用含有TFA(0.1％，v/v)的1:1CH3CN/H2O(适量10mL)稀释。将稀释的混合物直接注射到制备型HPLC中。过滤粗连接肽溶液并通过制备型HPLC纯化，使用ShiseidoCapcell Pak C18柱(5μm，250x20mm)以10mL/min的流量在60℃使用含有0.1％TFA(v/v)的CH3CN/H2O作为流动相，以在40min内含有0.1％TFA(v/v)的10％至45％CH3CN的梯度。将包含纯化产物的级分汇集并冻干以获得30.3mg作为>98％纯度的白色固体的Fmoc保护的IL18-Seg34B。
将Fmoc保护的IL18-Seg34B溶解在300μL DMSO中。通过添加二乙胺(15μL，5％，v/v)启动Fmoc脱保护，并在室温温和地搅拌15min。将二乙胺(15μL)在DMSO中(300μL)的第二溶液添加到反应混合物中，并在室温再温和地搅拌15min。预期会形成凝胶。添加三氟乙酸(50μL)以中和反应混合物。获得了均匀和无色的液体溶液，将其用含有TFA(0.1％，v/v)的1:1CH3CN/H2O(适量10mL)进一步稀释。将稀释的混合物直接注射到制备型HPLC中。过滤粗连接肽溶液并通过制备型HPLC纯化，使用Shiseido Capcell Pak C18柱(5μm，250x20mm)以10mL/min的流量在60℃使用含有0.1％TFA(v/v)的CH3CN/H2O作为流动相，以在40min内含有0.1％TFA(v/v)的10％至45％CH3CN的梯度。将包含纯化产物的级分汇集并冻干以获得作为>94％纯度的白色固体的IL18-Seg34B。分离产量为12.5mg(26％)。MS(ESI)：C525H839N133O169S3；[发现：11815.0Da[M]。
IL18-Seg1234B-Acm制备：将肽酮酸IL18-Seg12A(7.2mg；1.01μmol；1.0当量)和羟胺肽IL18-Seg34B(12.5mg；1.06μmol；1.05当量)溶解在包含0.1M草酸的97.5:2.5 DMSO/H2O(68μL)中。获得了均匀的液体溶液，将其在60℃反应过夜。连接反应完成后，首先用DMSO(150μL)稀释混合物。用包含(0.1％，v/v)的2:1 H2O/CH3CN(适量10mL)进一步稀释混合物。将稀释的混合物过滤并注射到制备型HPLC中。粗连接肽通过制备型HPLC纯化，使用Shiseido Capcell Pak C18柱(5μm，250x20mm)以10mL/min的流量在60℃使用含有0.1％TFA(v/v)的CH3CN/H2O作为流动相，以在40min内含有0.1％TFA(v/v)的10％至45％CH3CN的梯度。将包含纯化产物的级分汇集并冻干以获得作为>98％纯度的白色固体的IL18-Seg1234B-Acm。分离产量为5.8mg(30.4％)。该材料直接用于重排步骤，而不进一步表征。
IL18-Seg1234B线性蛋白制备：
线性蛋白的重排：将IL18-Seg1234B-Acm(5.81mg，0.307μmol)溶解在包含0.1MTris的6M Gu·HCl水溶液中(2.2mL，15μM蛋白浓度)，并在50℃温和地振荡混合物2.5小时。重排反应完成后，将混合物用包含TFA(0.1％，v/v)的6M Gu·HCl(适量10mL)稀释。将稀释的混合物过滤并注射到制备型HPLC中。粗重排肽通过制备型HPLC纯化，使用ShiseidoCapcell Pak C18柱(5μm，250x20mm)以10mL/min的流量在60℃使用含有0.1％TFA(v/v)的CH3CN/H2O作为流动相，以在40min内含有0.1％TFA(v/v)的10％至45％CH3CN的梯度。将包含纯化产物的级分汇集并冻干以获得作为>90％纯度的白色固体的IL18-Seg1234B-Acm-重排。分离产量为1.2mg(21％)。该材料直接用于Acm脱保护步骤，而不进一步表征。
Acm脱保护：将IL18-Seg1234B-Acm-重排(1.2mg；0.063μmol)溶解在0.20mM AcOH/H2O(1:1)中(320μL、蛋白浓度)，并且将乙酸银(3.2mg，1％，m/v)添加到溶液中。将混合物在50℃避光振荡2.5小时。反应完成后，将样品用6mL含有0.1％TFA(v/v)的1:2CH3CN/H2O稀释。样品通过制备型HPLC纯化，在Shiseido Capcell Pak UG80 C18柱(5μm，250x20mm)上，以10mL/min的流量在60℃使用含有0.1％TFA(v/v)的CH3CN/H2O作为流动相，以在40min内含有0.1％TFA(v/v)的10％至45％CH3CN的梯度。将包含纯化产物的级分汇集并冻干以获得0.2mg作为86％纯度的白色粉末的IL18-Seg1234B线性蛋白(20％产率)。MS(ESI)：C830H1325N217O259S4；发现的质量：18617.00Da[M+H+]。
实施例4C-SEQ ID NO:63的修饰的IL-18多肽的合成。
以下方案用于制备SEQ ID NO:63的修饰的IL-18多肽，其中残基68包含修饰成包含叠氮化物官能团的天冬氨酸残基。
对于该变体，区段1A与用于实施例4A的区段1A相同。
区段2B(Opr-IL18(32-61)-Val-光保护的-α-酮酸)：Opr-IL18(32-61)-Val-光保护的-α-酮酸区段B以0.2mmol规模在预先装载具有～0.307mmol/g的取代量的Fmoc-Val-光保护的-α-酮酸的Rink Amide MBHA树脂上合成。
位置61的自动化Fmoc-SPPS：在室温通过向树脂添加溶解在DMF中的Fmoc-氨基酸(2.0mL，0.4M，4当量)、在DMF中的OxymaPure(2mL，0.4M，4当量)和在DMF中的DIC(2mL，0.4M，4当量)进行偶联反应，持续30min。在室温通过添加在DMF中20％(v/v)的乙酸酐溶液(2mL)和在DMF中的NMM(0.8M，2mL)进行封端，持续6min。在室温使用在DMF中的20％(v/v)4-甲基哌啶进行Fmoc脱保护反应，持续8min。
然后进行Fmoc-O-甲基-L-高丝氨酸的手动偶联。制备了在6mL DMF中的Fmoc-O-甲基-L-高丝氨酸(177mg，0.5mmol，2.5当量)、HATU(190mg，0.5mmol，2.5当量)和DIPEA(174μL，1.0mmol，5当量)的溶液(在室温预活化3min)并添加到树脂。将反应物在室温温和地搅拌2h。在室温通过添加在DMF(4mL)中的乙酸酐(150μL，1.6mmol，8当量)和DIPEA(278μL，1.6mmol，8当量)进行封端，在室温持续10min。使用在DMF中的20％(v/v)4-甲基哌啶在室温进行Fmoc脱保护反应，持续10min。
位置59至56的自动化Fmoc-SPPS：在室温通过向树脂添加溶解在DMF中的Fmoc-氨基酸(2.0mL，0.4M，4当量)、在DMF中的OxymaPure(2mL，0.4M，4当量)和在DMF中的DIC(2mL，0.4M，4当量)进行偶联反应，持续30min。在室温通过添加在DMF中的20％(v/v)乙酸酐溶液(2mL)和在DMF中的NMM(0.8M，2.0mL)在每个氨基酸之后进行封端，持续6min。在室温使用在DMF中的20％(v/v)4-甲基哌啶进行Fmoc脱保护反应，持续8min。
然后进行Fmoc-L-Asp(tBu)-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH的手动偶联。制备了在6mLDMF中的Fmoc-L-Asp(tBu)-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH(322mg，0.6mmol，3当量)、HATU(228mg，0.6mmol，3当量)和DIPEA(209μL，1.2mmol，6当量)的溶液(在室温预活化3min)并添加到树脂。将反应物在室温温和地搅拌2h。
位置53至52的自动化Fmoc-SPPS：偶联反应使用与先前提到的序列开始时相同的条件进行。
然后进行Fmoc-O-甲基-L-高丝氨酸的手动偶联。使用如先前提到的相同条件进行Fmoc-O-甲基-L-高丝氨酸手动偶联反应。
然后进行Fmoc-L-Ile-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH的手动偶联。制备了在6mL DMF中的Fmoc-L-Ile-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH(288mg，0.6mmol，3当量)、HATU(228mg，0.6mmol，3当量)和DIPEA(209μL，1.2mmol，6当量)的溶液(在室温预活化3min)并添加到树脂。将反应物在室温温和地搅拌2h。
位置48至37的自动化SPPS：使用以上描述的条件进行偶联反应。每个位置都需要双重偶联。
然后进行Fmoc-L-Asp(tBu)-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH的手动偶联。制备了在6mLDMF中的Fmoc-L-Asp(tBu)-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH(322mg，0.6mmol，3当量)、HATU(228mg，0.6mmol，3当量)和DIPEA(209μL，1.2mmol，6当量)的溶液(在室温预活化3min)并添加到树脂。将反应物在室温温和地搅拌2h。
位置34的自动化Fmoc-SPPS：使用以上描述的条件进行偶联反应。需要双重偶联。
然后进行Fmoc-O-甲基-L-高丝氨酸的手动偶联。使用如先前提到的相同条件进行Fmoc-O-甲基-L-高丝氨酸手动偶联反应。
位置32的自动化Fmoc-SPPS：使用以上描述的条件进行偶联反应。需要双重偶联。
然后进行Boc-5-(S)-氧杂脯氨酸的手动偶联。制备了在6mL DMF中的Boc-5-(S)-氧杂脯氨酸(130mg，0.6mmol，3当量)、HATU(228mg，0.6mmol，3当量)和DIPEA(209μL，1.2mmol，6当量)的溶液(在室温预活化3min)并添加到树脂。将反应物在室温温和地搅拌2h。用DCM和乙醚洗涤树脂，并在真空下干燥。干燥的肽基树脂的质量为1.4g。
使用95:2.5:2.5 TFA/DODT/H2O的混合物(10mL/g树脂)将肽从树脂裂解，并在室温温和地搅拌混合物2.0h。从裂解混合物滤去树脂，并浓缩滤液并用冷乙醚(20℃)稀释20倍，允许肽沉淀。离心后，仔细地倾析乙醚层，并将肽沉淀物重悬于乙醚中，研磨并离心。重复乙醚洗涤两次，并干燥所得肽沉淀。粗肽的质量为940mg。粗Opr-IL18(32-61)-Val-光保护的-α-酮酸区段2C的纯化通过制备型HPLC进行，使用Shiseido Capcell Pak C18柱(5μm，250x20mm)以10mL/min的流量在60℃使用含有0.1％TFA(v/v)的CH3CN/H2O作为流动相，以在40min内含有0.1％TFA(v/v)的10％至70％CH3CN的梯度。将包含纯化产物的级分汇集并冻干以获得作为>90％纯度的白色固体的Opr-IL18(32-61)-Val-光保护的-α-酮酸(IL18-Seg2)。基于树脂装载量的分离产量为340mg(40％)。C163H253N45O60S；计算的平均同位素：1278.6023Da[M+3H+]；发现：1278.6020Da[M+3H+]。
Figure BDA0004186569250001551
Fmoc-Opr-IL18(64-114)-Phe-α-酮酸(IL18-Seg3C)
区段3C(Fmoc-Opr-IL18(64-114)-Phe-α-酮酸)：Fmoc-Opr-IL18(64-114)-Phe-α-酮酸区段以0.2mmol规模在预先装载具有～0.40mmol/g的取代量的Fmoc-Phe-保护的-α-酮酸的Rink Amide
Figure BDA0004186569250001552
树脂上合成。
位置114处的自动化Fmoc-SPPS：在室温通过向树脂添加溶解在DMF中的Fmoc-氨基酸(2.0mL，0.4M，4当量)、在DMF中的OxymaPure(2mL，0.4M，4当量)和在DMF中的DIC(2mL，0.4M，4当量)进行偶联反应，持续30min。需要双重偶联。在室温通过添加在DMF中20％(v/v)的乙酸酐溶液(2mL)和在DMF中的NMM(0.8M，2mL)进行封端，持续6min。在室温使用在DMF中的20％(v/v)4-甲基哌啶进行Fmoc脱保护反应，持续8min。
然后进行Fmoc-O-甲基-L-高丝氨酸的手动偶联。制备了在6mL DMF中的Fmoc-O-甲基-L-高丝氨酸(177mg，0.5mmol，2.5当量)、HATU(190mg，0.5mmol，2.5当量)和DIPEA(174μL，1.0mmol，5当量)的溶液(在室温预活化3min)并添加到树脂。将反应物在室温温和地搅拌2h。在室温通过添加在DMF(4mL)中的乙酸酐(150μL，1.6mmol，8当量)和DIPEA(278μL，1.6mmol，8当量)进行封端，在室温持续10min。使用在DMF中20％(v/v)的4-甲基哌啶在室温进行Fmoc脱保护反应，持续10min。
位置96至112的自动化Fmoc-SPPS：在室温通过向树脂添加溶解在DMF中的Fmoc-氨基酸(2.0mL，0.4M，4当量)、在DMF中的OxymaPure(2mL，0.4M，4当量)和在DMF中的DIC(2mL，0.4M，4当量)进行偶联反应，持续30min。每个位置都需要双重偶联。在室温通过添加在DMF中的20％(v/v)乙酸酐溶液(2mL)和在DMF中的NMM(0.8M，2.0mL)在每个氨基酸之后进行封端，持续6min。在室温使用在DMF中的20％(v/v)4-甲基哌啶进行Fmoc脱保护反应，持续8min。
然后进行Fmoc-L-Asp(tBu)-L-Thr[Ψ(Me,Me)Pro]-OH的手动偶联。制备了在6mLDMF中的Fmoc-L-Asp(tBu)-L-Thr[Ψ(Me,Me)Pro]-OH(332mg，0.6mmol，3当量)、HATU(228mg，0.6mmol，3当量)和DIPEA(209μL，1.2mmol，6当量)的溶液(在室温预活化3min)并添加到树脂。将反应物在室温温和地搅拌2h。
位置87至93的自动化Fmoc-SPPS：使用以上描述的条件进行偶联反应。每个位置都需要双重偶联。使用包含Cl-HOBt(0.1M)的DMF中的20％(v/v)4-甲基哌啶在室温进行Fmoc脱保护反应，持续8min。
然后进行Fmoc-O-甲基-L-高丝氨酸的手动偶联。使用如先前提到的相同条件进行Fmoc-O-甲基-L-高丝氨酸手动偶联反应。
位置73至85的自动化Fmoc-SPPS：使用用于位置87至93的相同条件进行偶联反应。
然后进行Fmoc-L-Ile-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH的手动偶联。制备了在6ml DMF中的Fmoc-L-Ile-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH(288mg，0.6mmol，3当量)、HATU(228mg，0.6mmol，3当量)和DIPEA(209μL，1.2mmol，6当量)的溶液(在室温预活化3min)并添加到树脂。让其在室温反应2h。
位置69至70的自动化Fmoc-SPPS：使用用于位置73至85的相同条件进行偶联反应。
然后进行Fmoc-Asp(alloc)-OH的手动偶联。制备了在6ml DMF中的Fmoc-Asp(alloc)-OH(237mg，0.6mmol，3当量)、HATU(228mg，0.6mmol，3当量)和DIPEA(209μL，1.2mmol，6当量)的溶液(在室温预活化3min)并添加到树脂。让其在室温反应2h。
位置64至67的自动化Fmoc-SPPS：使用用于位置69至70的相同条件进行偶联反应。
然后进行Fmoc-5-(S)-氧杂脯氨酸的手动偶联。制备了在6mL DMF中的Fmoc-5-(S)-氧杂脯氨酸(204mg，0.6mmol，3当量)、HATU(228mg，0.6mmol，3当量)和DIPEA(209μL，0.6mmol，6当量)的溶液(在室温预活化3min)并添加到树脂。将反应物在室温温和地搅拌2h。
alloc脱保护：树脂在无水DCM中溶胀15min。用N2吹扫的在3ml无水DCM中的苯基硅烷(595μL，4.80mmol，24当量)溶液，随后是用N2吹扫的在3ml无水DCM中的四(三苯基膦)钯(116mg，100μmol，0.5当量)溶液被添加到树脂，将其在室温搅拌30min。树脂用DCM和DMF洗涤若干次。
然后进行O-(2-氨基乙基)-O'-(2-叠氮乙基)九甘醇的手动偶联。将在3mL DMF中的HATU(228mg，0.6mmol，3当量)溶液添加到树脂，随后添加在2mL DMF中的商业上可得的O-(2-氨基乙基)-O'-(2-叠氮乙基)九甘醇(338mg，0.6mmol，3当量)和在1mL DMF中的DIPEA(209μL，0.6mmol，6当量)溶液。然后将树脂在室温搅拌2h。
用DCM洗涤树脂并在真空下干燥。干燥的肽基树脂的质量为2g。通过在95:2.5:2.5TFA/DODT/H2O的混合物(10mL/g树脂)中在室温搅拌树脂2.0h，将肽从树脂裂解。从裂解混合物滤去树脂，并浓缩滤液并用冷乙醚(20℃)稀释20倍，允许肽沉淀。离心后，仔细地倾析乙醚层，并将肽沉淀物重悬于乙醚中，研磨并离心。重复乙醚洗涤两次，并干燥所得肽沉淀。粗肽的质量为1.5g。粗Fmoc-Opr-IL18(64-114)-Phe-α-酮酸区段3C的纯化通过制备型HPLC进行，使用Shiseido Capcell Pak C18柱(5μm，250x20mm)以10mL/min的流量在60℃使用含有0.1％TFA(v/v)的CH3CN/H2O作为流动相，以在40min内含有0.1％TFA(v/v)的10％至50％CH3CN的梯度。将包含纯化产物的级分汇集并冻干以获得作为>80％纯度的白色固体的Fmoc-Opr-IL18(64-114)-Phe-α-酮酸(IL18-Seg3C)。基于树脂装载量的分离产量为104mg(6％)。MS(MALDI-TOF)：C310H488N76O100S；计算的6907.5157Da[M]；发现：6902.4980Da。
Figure BDA0004186569250001581
Opr-IL18(117-157)(IL18-Seg4)
区段4C(Opr-IL18(117-157))：Opr-IL18(117-157)SEQ ID NO:63-Seg4的合成以0.5mmol规模使用预先装载具有～0.35mmol/g(1.43g)的取代量的Fmoc-Asp(OtBu)-OH的Rink Amide MBHA树脂开始。
位置153至156的手动Fmoc-SPPS：将Fmoc保护的氨基酸(5.0当量，2.5mmol)和HCTU(4.8当量，2.4mmol)溶解在NMP(6.0mL)中。通过添加DIPEA(0.5mL，2.2mmol)进行预活化，持续2min。将反应混合物倾倒在树脂上，并允许在温和的手动搅拌下反应45min。用DMF和DCM彻底冲洗树脂。在室温通过添加在DMF(6mL)中的乙酸酐(0.5mL)和DIPEA(0.5mL)在每个位置进行封端，持续6min。对于Fmoc脱保护，树脂用DMF中的20％的4-甲基哌啶冲洗一次。在温和的手动搅拌下，用相同的溶液处理树脂15min。用DMF和DCM彻底冲洗树脂。
Fmoc-Phe-Thr[Ψ(Me,Me)Pro]-OH的手动偶联：制备了在6mL NMP中的Fmoc-Phe-Thr[Ψ(Me,Me)Pro]-OH(793mg，1.5mmol，3.0当量)、HATU(570mg，1.5mmol，3.0当量)和DIPEA(500μL，2.9mmol，5.8当量)的溶液(在室温预活化3min)并添加到树脂。将反应物在室温温和地搅拌2h。在室温通过添加在DMF(6mL)中的乙酸酐(0.5mL)和DIPEA(0.5mL)在每个位置进行封端，持续6min。对于Fmoc脱保护，树脂用DMF中的20％(v/v)的4-甲基哌啶冲洗一次。在温和的手动搅拌下，用相同的溶液处理树脂15min。用DMF和DCM彻底冲洗树脂。
Fmoc-O-甲基-高丝氨酸的手动偶联：制备了在6mL NMP中的Fmoc-Hse(Me)-OH(533mg，1.5mmol，3.0当量)、HATU(570mg，1.5mmol，3.0当量)和DIPEA(500μL，2.9mmol，5.8当量)的溶液(在室温预活化3min)并添加到树脂。将反应物在室温温和地搅拌2h。在室温通过添加在DMF(6mL)中的乙酸酐(0.5mL)和DIPEA(0.5mL)在每个位置进行封端，持续6min。对于Fmoc脱保护，树脂用DMF中的20％(v/v)的4-甲基哌啶冲洗一次。在温和的手动搅拌下，用相同的溶液处理树脂15min。用DMF和DCM彻底冲洗树脂。
位置146至149的手动Fmoc-SPPS：使用用于位置151至156的相同条件进行偶联反应、乙酰化反应和脱保护反应。
Fmoc-Leu-(Dmb)Gly-OH的手动偶联：制备了在6mL NMP中的Fmoc-Leu-(Dmb)Gly-OH(842mg，1.5mmol，3.0当量)、HATU(570mg，1.5mmol，3.0当量)和DIPEA(500μL，2.9mmol，5.8当量)的溶液(在室温预活化3min)并添加到树脂。将反应物在室温温和地搅拌2h。在室温通过添加在DMF(6mL)中的乙酸酐(0.5mL)和DIPEA(0.5mL)在每个位置进行封端，持续6min。对于Fmoc脱保护，树脂用DMF中的20％(v/v)的4-甲基哌啶冲洗一次。在温和的手动搅拌下，用相同的溶液处理树脂15min。用DMF和DCM彻底冲洗树脂。
SEQ ID NO:63Seg4的合成在0.15mmol规模继续进行。
位置128至143的自动化Fmoc-SPPS：在室温通过向树脂添加溶解在DMF中的Fmoc-氨基酸(2.0mL，0.4M，5.3当量)、HCTU(2mL，0.4M，5.3当量)和在DMF中的NMM(2mL，0.8M，10.7当量)的溶液进行偶联反应，持续30min。对所有位置进行双重偶联。在室温通过添加在DMF中的20％(v/v)乙酸酐溶液(2mL)和在DMF中的NMM(0.8M，2.0mL)在每个氨基酸之后进行封端，持续6min。在室温使用在DMF中的20％(v/v)4-甲基哌啶进行Fmoc脱保护反应，持续10min。
Figure BDA0004186569250001601
Fmoc-Cys(Acm-NHalloc)-OH 3
Fmoc-Cys(Acm-NHalloc)-OH 3的手动偶联：制备了在4mL NMP中的Fmoc-Cys(Acm-NHalloc)-OH(308mg，0.75mmol，5.0当量)、HATU(285mg，0.75mmol，5.0当量)和DIPEA(210μL，1.2mmol，8当量)的溶液(在室温预活化3min)并添加到树脂。将反应物在室温温和地搅拌2h。在室温通过添加在DMF(4mL)中的乙酸酐(0.2mL)和DIPEA(0.2mL)在每个位置进行封端，持续6min。对于Fmoc脱保护，树脂用DMF中的20％(v/v)的4-甲基哌啶冲洗一次。在温和的手动搅拌下，用相同的溶液处理树脂15min。用DMF和DCM彻底冲洗树脂。
位置123至126的自动化Fmoc-SPPS：使用用于位置123至143的相同条件进行偶联反应、乙酰化反应和脱保护反应。
Fmoc-Glu(OtBu)-(Dmb)Gly-OH的手动偶联：制备了在4mL NMP中的Fmoc-Glu(OtBu)-(Dmb)Gly-OH(475mg，0.75mmol，5.0当量)、HATU(342mg，0.75mmol，5.0当量)和DIPEA(210μL，1.2mmol，8当量)的溶液(在室温预活化3min)并添加到树脂。将反应物在室温温和地搅拌2h。在室温通过添加在DMF(4mL)中的乙酸酐(0.2mL)和DIPEA(0.2mL)在每个位置进行封端，持续6min。对于Fmoc脱保护，树脂用DMF中的20％(v/v)的4-甲基哌啶冲洗一次。在温和的手动搅拌下，用相同的溶液处理树脂15min。用DMF和DCM彻底冲洗树脂。
位置117至120的自动化Fmoc-SPPS：使用用于位置123至143的相同条件进行偶联反应、乙酰化反应和脱保护反应。
Boc-Opr-OH的手动偶联：制备了在4mL NMP中的Boc-Opr-OH(163mg，0.75mmol，5.0当量)、HATU(342mg，0.75mmol，5.0当量)和DIPEA(210μL，1.2mmol，8当量)的溶液(在室温预活化3min)并添加到树脂。将反应物在室温轻轻搅拌2h。用DMF和DCM彻底冲洗树脂。
对于残基127的alloc脱保护：树脂在用氮气吹扫的DCM中溶胀。将用氮气吹扫的在DCM(3mL)中的苯基硅烷(444μL，3.6mmol，24当量)溶液添加到树脂。alloc脱保护在添加用氮气吹扫的在DCM(2mL)中的Pd(PPh3)4(58mg，0.075mmol，0.5当量)溶液后进行。让其在室温手动搅拌反应30min。然后用包含三个精氨酸残基的增溶标签将侧链官能化。它们使用用于位置123至143的相同条件以自动方式偶联。
使用92.5:2.5:2.5:2.5 TFA/TIPS/DODT/H2O的混合物(10mL/g树脂)在室温将肽从树脂裂解，持续2.0h。从裂解混合物滤去树脂，并浓缩滤液并用冷乙醚(-20℃)稀释20倍，允许肽沉淀。离心后，仔细地倾析乙醚层，并将肽沉淀物重悬于乙醚中，研磨并离心。重复乙醚洗涤两次，并干燥所得肽沉淀。粗区段4C的纯化通过制备型HPLC进行，使用ShiseidoProteonavi柱(5μm，250x50mm)以40mL/min的流量在60℃使用含有0.1％TFA(v/v)的CH3CN/H2O作为流动相，以在45min内含有0.1％TFA(v/v)的5％至50％CH3CN的梯度。将包含纯化产物的级分汇集并冻干以获得作为白色固体的区段4C。基于树脂装载量的分离产量为116mg(14％)。MS(MALDI-TOF)：C239H381N69O77S；计算的平均同位素为5485.14Da[M]；发现：5481.28。
IL18-Seg12C制备：将肽酮酸IL18-Seg1A(56.2mg；15.8μmol；1.2当量)和羟胺肽IL18-Seg2C(50.6mg；13.2μmol；1.0当量)溶解在包含0.1M草酸的9.75:0.25 DMSO/H2O溶液(660μL)中。获得了非常均匀的液体溶液。通过将小瓶包裹在铝箔中使连接小瓶避光并在60℃温和地搅拌过夜。连接完成后，用DMSO(1920μL)稀释混合物并以365nm的波长辐照2h，以允许C-末端酮酸的光脱保护。用含有TFA(0.1％,v/v)的1:1CH3CN/H2O(适量20mL)进一步稀释混合物。将稀释的混合物过滤并注射到制备型HPLC中。粗连接肽通过制备型HPLC纯化，使用Shiseido capcell Pak C18柱(5μm，250x50mm)以40mL/min的流量在60℃，以在40min内含有0.1％TFA(v/v)的10％至70％CH3CN的梯度。将包含纯化产物的级分汇集并冻干以获得作为>98％纯度的白色固体的IL18-Seg12C。分离产量为40mg(42％)。MS(MALDI-TOF)：C321H506N88O96S；计算的平均值7131.6516Da[M]；发现：7125.8340。
IL18-Seg34C制备：将肽酮酸IL18-Seg3C(25mg；3.6μmol；1.0当量)和羟胺肽IL18-Seg4C(22mg；4μmol；1.1当量)溶解在包含0.1M草酸的97.5:2.5 DMSO/H2O(180μL)中。获得了非常均匀的液体溶液，将其在60℃温和地搅拌过夜。连接反应完成时，将混合物用DMSO(320μL)稀释，并用含有TFA(0.1％，v/v)的1:2CH3CN/H2O(适量10mL)进一步稀释。将稀释的混合物直接注射到制备型HPLC中。过滤粗连接肽溶液并通过制备型HPLC纯化，使用Shiseido Capcell Pak C18柱(5μm，250x20mm)以10mL/min的流量在60℃使用含有0.1％TFA(v/v)的CH3CN/H2O作为流动相，以在40min内含有0.1％TFA(v/v)的10％至45％CH3CN的梯度。将包含产物的级分汇集并冻干以获得8mg作为白色固体的Fmoc保护的IL18-Seg34C。
将Fmoc保护的IL18-Seg34C溶解在DMSO(200μL)中。通过添加二乙胺(10μL，5％，v/v)起动Fmoc脱保护，并在室温温和地搅拌15min。将二乙胺(10μL)在DMSO中(200μL)的第二溶液添加到反应混合物中，并在室温再温和地搅拌15min。预期会形成凝胶。添加三氟乙酸(40μL)以中和反应混合物。获得了均匀和无色的液体溶液，将其用含有TFA(0.1％，/v)的1:2CH3CN/H2O(适量10mL)进一步稀释。将稀释的混合物直接注射到制备型HPLC中。过滤粗连接肽溶液并通过制备型HPLC纯化，使用Shiseido Capcell Pak C18柱(5μm，250x20mm)以10mL/min的流量在60℃使用含有0.1％TFA(v/v)的CH3CN/H2O作为流动相，以在40min内含有0.1％TFA(v/v)的10％至45％CH3CN的梯度。将包含纯化产物的级分汇集并冻干以获得作为>97％纯度的白色固体的IL18-Seg34C。分离产量为5.5mg(26％)。MS(MALDI-TOF)：C530H854N144O172S2；计算的平均值12059.62Da[M]；发现：12119.56[M+加合物]。
IL18-Seg1234C线性蛋白制备：
最终肽连接：将肽酮酸IL18-Seg12C(3.6mg；0.5μmol；1.1当量)和羟胺肽IL18-Seg34C(5.5mg；0.46μmol；1.0当量)溶解在包含0.1M草酸的97.5:2.5 DMSO/H2O(23μL)中。获得了均匀的液体溶液，将其在65℃反应过夜。连接反应完成后，首先用DMSO(0.95mL)稀释混合物。
重排：用包含0.1M Tris的6M Gu·HCl(1.0mL)进一步稀释混合物，并将混合物在50℃温和地振荡2h。重排反应完成后，用包含TFA(0.1％，v/v)的6M Gu·HCl(适量10.0mL)稀释混合物。将稀释的混合物过滤并注射到制备型HPLC中。粗重排肽通过制备型HPLC纯化，使用Shiseido Capcell Pak C18柱(5μm，250x20mm)以10mL/min的流量在60℃使用含有0.1％TFA(v/v)的CH3CN/H2O作为流动相，以在40min内含有0.1％TFA(v/v)的10％至45％CH3CN的梯度。将包含纯化产物的级分汇集并冻干以获得作为>97％纯度的白色固体的IL18-Seg1234C-Acm-重排。分离产量为1.9mg(22％)。该材料直接用于Acm脱保护步骤，而不进一步表征。
Acm脱保护：将IL18-Seg1234C-Acm-重排(1.9mg；0.099μmol)以0.20mM溶解在AcOH/H2O(1:1)(500μL)中，并且将乙酸银(5.0mg，1％，m/v)添加到溶液中。将混合物在50℃避光振荡3小时。反应完成后，将样品用9.5mL含有0.1％TFA(v/v)的1:2CH3CN/H2O稀释。样品通过制备型HPLC纯化，在Shiseido Capcell Pak UG80 C18柱(5μm，250x20mm)上，以10mL/min的流量在60℃使用含有0.1％TFA(v/v)的CH3CN/H2O作为流动相，以在40min内含有0.1％TFA(v/v)的10％至45％CH3CN的梯度。将包含纯化产物的级分汇集并冻干以获得0.5mg作为97％纯度的白色粉末的IL18-Seg1234C线性蛋白(30％产率)。MS(MALDI-TOF)：C819H1305N217O264S3；计算的平均值18511.88；发现：18513.3270Da。
IL18-Seg1234C线性蛋白的折叠和配制：
将蛋白粉末(0.22mg，冻干为TFA盐)溶解在110μL缓冲液A(包含8M尿素、2mM DTT和0.02％(m/v)Tween 80的Tris缓冲液(50mM，pH 8.0))中。获得2mg/mL的澄清溶液。将其在室温孵育30min。将蛋白溶液用包含2mM EDTA、137mM NaCl、2.7mM KCl、400mM精氨酸·HCl、2mM DTT和0.02％(m/v)Tween 80的Tris缓冲液(50mM，pH 7.8)(缓冲液B)在20℃以逐滴的方式缓慢稀释。将混合物温和地振荡(400RPM)以允许有效扩散。获得0.2mg/mL的澄清溶液。将其在20℃孵育20h。然后将其在室温以10,000RPM离心5min。蛋白溶液在室温针对650mL包含6％蔗糖和0.02％Tween 80的PBS(pH 7.4)进行透析，持续2h。将此步骤重复进行第二次。然后蛋白溶液在室温针对650mL包含6％蔗糖和0.02％Tween 80的PBS(pH 7.4)进行第三次透析，持续18h。最后，在室温以10,000RPM离心5min，并储存在-80℃。
以上折叠方案描述了示例性方案，可以测试该方案以便从线性Seg1234多肽前体制备正确折叠的IL-18多肽。在一些实施方案中，通过使用实施例2中概述的可选的缓冲液A和缓冲液B(参见表14)来修改以上描述的折叠方案。可以测试这些折叠方案，直到确定期望的折叠结果。
实施例5-组合物A和组合物B的结构
图4示出了修饰的IL-18多肽组合物A的合成。组合物A包含与残基C68通过短PEG聚合物的末端附接的30kDa PEG官能团。任选地，该30kDa PEG官能团通过无铜点击化学反应与短PEG聚合物共价附接。
本文还提供了修饰的IL-18多肽组合物B。组合物B包含与残基K70通过短PEG聚合物的末端附接的30kDa PEG官能团。任选地，该30kDa PEG官能团通过无铜点击化学反应与短PEG聚合物共价附接。
本文还提供了修饰的IL-18多肽组合物C。组合物C包含与残基E69通过短PEG聚合物的末端附接的30kDa PEG官能团。任选地，该30kDa PEG官能团通过无铜点击化学反应与短PEG聚合物共价附接。
实施例6-组合物A和组合物B的表征
对组合物A和组合物B进行一系列分析实验以表征组合物。通过HPLC分析修饰的IL-18多肽以确定组合物的均一度。还通过MALDI-MS分析修饰的IL-18多肽组合物，以确定组合物的MW和分子量分布。通过圆二色性进一步分析修饰的IL-18多肽组合物，以比较与野生型IL-18相比修饰的IL-18多肽组合物的折叠。
实施例7-修饰的IL-18多肽的配制
将冻干的修饰的IL-18多肽悬浮在包含PBS缓冲液(pH 7.4)和50mg/mL甘露醇的溶液中。
实施例8-IL-18SPR测量
用表面等离子体共振(SPR)技术测量野生型和修饰的IL-18多肽与人类IL-18受体亚基的相互作用。在捕获之前将抗人IgG抗体通过胺偶联结合到CM5芯片上，以捕获6μg/mLFc融合的人类IL-18Rα、6μg/mL Fc融合的人类IL-18Rβ、或2μg/mL Fc融合的人类IL-18BP异形体(isoform)(IL-18BPa)，持续30min。在其他设置中，将6μg/mL的αIL-18受体和βIL-18受体混合并预孵育30min，然后捕获α/β异源二聚体IL-18受体。
IL-18分析物的动力学结合用Biacore 8K仪器以从1μM开始降至0.98nM的两倍系列稀释液测量。在每一浓度的分析物之后，将表面再生回胺偶联的抗IgG抗体。为了测量蛋白与受体的缔合，将样品以50μL/min的流量注射60s，随后为300s单独的缓冲液以检测解离。所用的运行缓冲液是含有0.05％Tween20的1×PBS。相对响应单位(RU，Y轴)针对时间(s，X轴)作图，并以动力学1:1结合模型对单体受体结合和对与IL-18BP的结合进行分析。动力学异质配体拟合模型被应用于α/β异源二聚体结合。
实施例9-IL-18BP结合alphaLISA测定
人类IL-18BP AlphaLISA测定试剂盒用于确定每种IL-18变体对IL-18BP的结合亲和力，该试剂盒检测游离形式IL-18BP的存在。
在补充有20％FCS、Glutamax和25μMβ-巯基乙醇的aMEM培养基中，在5ng/mL加His标签的人类IL-18BP存在的情况下，制备16份IL-18分析物的三倍系列稀释液。最终IL-18分析物浓度的范围为2778nM至0.2pM。
在室温孵育1hr后，使用人类IFNγAlphaLISA测定试剂盒测量游离IL-18BP水平。在384孔OPTIplate中，将5μl的5X抗IL-18BP受体珠添加到7.5μl IL-18/IL-18BP混合物中。在室温振荡孵育30min后，向每个孔添加5μL生物素化的抗IL-18BP抗体。将平板在室温进一步孵育1hr。在弱光(subdued light)下，将12.5μL的2X链霉抗生物素蛋白(SA)供体珠移液到每个孔中，并将这些孔在室温振荡孵育另外30min。然后在Enspire读板器上测量AlphaLisa信号，分别以680nm和615nm作为激发和发射波长。解离常数(KD)使用GraphPad PRISM软件基于可变斜率、四参数分析进行计算。
实施例10-IL-18变体与IL-18Rα单体的结合
表5示出了使用如实施例8中阐述的方案观察到的描述的IL-18变体与IL-18Rα的解离常数(KD)的结果。结果显示，SEQ ID NO:6、7、8和20的修饰的IL-18多肽具有类似于或低于SEQ ID NO:1的WT IL-18的KD值的KD值。具有序列修饰E06K、K53A、S55A和T63A的修饰的IL-18多肽保持了与IL-18Rα的结合亲和力。
表5.IL-18Rα单体的结合
Figure BDA0004186569250001661
Figure BDA0004186569250001671
实施例11-IL-18变体与IL-18Rα/β异源二聚体的结合
表6示出了使用如实施例8中描述的实验观察到的描述的IL-18变体与IL-18Rα/β异源二聚体的解离常数(KD)的结果。结果显示，SEQ ID NO:6、7、8、18、19和20的修饰的IL-18多肽具有与SEQ ID NO:1的野生型IL-18相似的KD值。在一些情况下，修饰的IL-18多肽展示出比野生型IL-18更低的KD值。带有序列修饰E06K、K53A、S55A和T63A的修饰的IL-18多肽保持了与IL-18Rα/β异源二聚体的结合亲和力。数据显示，本公开内容的一些IL-18变体具有降低的解离常数，这反映了IL-18/IL-18R复合物的稳定化。
表6.IL-18Rα/β异源二聚体的结合
Figure BDA0004186569250001672
Figure BDA0004186569250001681
实施例12-对IL-18BP单体的结合测定
表7示出了使用与实施例8中描述的方案类似的方案观察到的描述的IL-18变体与IL-18BP的解离常数(KD)的结果。结果显示，SEQ ID NO:4、5、6、7、8、15、16、19、20和21的修饰的IL-18多肽具有类似于或高于SEQ ID NO:1的野生型IL-18的KD值。带有序列修饰K53A、S55A、E06K、C38S、C68S、C76S、C127S和/或K70C的修饰的IL-18多肽保持了与IL-18BP的结合亲和力。
许多修饰的IL-18变体并没有显著改变与IL-18BP的缔合(Kon)，但仅使复合物不稳定，如通过本公开内容的一些修饰的IL-18变体所观察到的10倍高的解离常数显示的。对于这些修饰的IL-18变体，IL-18/IL-18R复合物的稳定化和IL-18/IL-18BP复合物的去稳定化导致IL-18R和IL-18BP竞争IL-18的平衡的迁移。对于许多变体，与IL-18BP的结合没有被消除，然而它们表现出与IL-18BP相比相似或稍微改善的与IL18R的结合。
表7.通过SPR确定的IL-18BP单体的结合
Figure BDA0004186569250001682
Figure BDA0004186569250001691
表8示出了使用实施例9中描述的方案测量观察到的描述的IL-18变体与IL-18BP的解离常数(KD)的结果。结果显示，SEQ ID NO:5、6、8、15和16的修饰的IL-18多肽具有类似于或高于SEQ ID NO:1的野生型IL-18的KD值。
表8.通过alphaLISA确定的IL-18BP单体的结合
Figure BDA0004186569250001692
/>
Figure BDA0004186569250001701
实施例13-IFNγ诱导细胞测定
根据以下方案，在细胞测定中评估了本文提供的IL-18多肽诱导IFN·的能力。
来源于淋巴瘤患者的NK细胞系NK-92(
Figure BDA0004186569250001702
CRL-2407TM)在补充有20％FCS、Glutamax、25μM B-巯基乙醇和100IU/mL重组人类IL-2的aMEM培养基中培养。
在实验当天，收获细胞并用不含IL-2且包含1ng/mL重组人类IL-12的aMEM培养基洗涤。计数后，将细胞以100,000个细胞/孔接种在384孔滴定板中，并在37℃/5％CO2孵育。在aMEM培养基中制备16份IL-18分析物的4倍系列稀释液，并向NK-92细胞添加1ng/mL的IL-12。最终IL-18分析物浓度的范围为56nM至5x10-5 pM。
在37℃/5％CO2孵育细胞16-20hr后，仔细地将5μl上清液转移到384微孔OptiPlate中。IFNγ水平使用人类IFNγAlphaLISA测定试剂盒测量。简言之，将10μL的2.5XAlphaLISA抗IFNγ受体珠和生物素化的抗IFNγ抗体混合物添加到5μL的NK-92上清液中。混合物在室温振荡孵育1hr。在弱光下，将2.5μL的2X链霉抗生物素蛋白(SA)供体珠移液到每个孔中，并将孔在室温振荡孵育30min。然后在EnspireTM读板器上分别使用680nm和615nm作为激发和发射波长测量AlphaLISA信号。半最大有效浓度(EC50)使用GraphPad PRISM软件基于可变斜率和四参数分析进行计算。
各种IL-18多肽的该实验结果在下表9中示出(EC50数据)。
实施例14-IL-18结合蛋白抑制细胞测定
来源于淋巴瘤患者的NK细胞系NK-92(
Figure BDA0004186569250001711
CRL-2407TM)在补充有20％FCS-Glutamax、25μM B-巯基乙醇和100IU/mL重组人类IL-2的aMEM培养基中培养。
在实验当天，收获细胞并用不含IL-2且包含1ng/mL重组人类IL-12的aMEM培养基洗涤。计数后，将细胞以100,000个细胞/孔接种在384孔滴定板中，并在37℃/5％CO2孵育。在aMEM培养基中制备16份Fc融合的人类IL-18结合蛋白异形体(IL-18BPa)的2倍系列稀释液。向NK-92细胞添加包含2nM每种修饰的IL-18多肽变体的1ng/mL IL-12。最终IL-18分析物浓度为1nM，并且最终IL-18BPa浓度的范围为566nM至17pM。
在37℃/5％CO2孵育细胞16-20hr后，仔细地转将5μL上清液移到384微孔OptiPlate中。IFNγ水平使用人类IFNγAlphaLISA测定试剂盒测量。简言之，将10μL的2.5XAlphaLISA抗IFNγ受体珠和生物素化的抗IFNγ抗体混合物添加到5μL的NK-92上清液中。混合物在室温振荡孵育1hr。在弱光下，将2.5μL的2X SA供体珠移液到每个孔中，并在室温振荡孵育30min。然后在EnspireTM读板器上分别使用680nm和615nm作为激发和发射波长测量AlphaLISA信号。半最大抑制浓度(IC50)使用GraphPad PRISM软件基于可变斜率和四参数分析进行计算。
本公开内容的修饰的IL-18变体是有活性的并且能够在体外诱导IFNγ分泌。表9示出了许多测试的IL-18变体诱导IFNγ产生的能力，而一些IL-18变体对IL-18BP的抑制明显较不敏感，如分别通过EC50和IC50测量的。
表9.NK92 IFNγ释放测定数据中的IC50/EC50
Figure BDA0004186569250001721
Figure BDA0004186569250001731
实施例15-HEK-Blue IL18R报告物测定
IL-18R阳性HEK-Blue报告细胞系用于确定IL-18变体与IL-18R的结合和随后的下游信号传导。一般方案概述如下。
将5×104个HEK-Blue IL18R报告细胞(InvivoGen，#hkb-hmil18)接种到96孔板的每个孔中，并在37℃和5％CO2用0-100nM的IL-18多肽变体刺激。孵育20h后，从每个孔取出20μL细胞培养上清液，并在96孔板中与180μl QUANTI-Blue介质混合，在37℃和5％CO2孵育1小时。然后在Enspire读板器上测量620nm处的吸光度信号，分别以680nm和615nm作为激发和发射波长。半最大有效剂量(EC50)使用GraphPad PRISM软件基于可变斜率、四参数分析进行计算。
该实验的选择的变体的结果在下表12中示出。
表12.HEK-Blue IL18R报告物测定数据中的EC50
Figure BDA0004186569250001732
Figure BDA0004186569250001741
实施例16A-修饰的IL-18多肽变体的药代动力学和药效学特性
测量选择的IL-18多肽变体的药代动力学(PK)和药效学(PD)特性。每组和每个时间点测试三只C57BL/6小鼠。IL-18变体通过单次静脉内注射施加。将小鼠分成四个剂量组：0.5mg/kg、0.1mg/kg、0.02mg/kg、0.004mg/kg；和四个时间点组：5min、6hr、24hr、48hr。
通过分析血浆中的细胞因子水平来确定免疫相关的PD作用。测量以下血浆细胞因子：IFNγ、CXCL9、CXCL10、GM-CSF、IL-1a、FasL和IL-18BP。白细胞的激活状态通过监测以下表面标志物来确定：ICOS、PD-1、CD25、CD69和Fas。通过检测IL-18变体(游离的和IL-18BP复合的，参见图7)的总量进行生物分析。将Corning高结合半区板(Fisher Scientific，Reinach，Switzerland)在4℃用25μl在PBS中的2μg/ml的抗IL18单克隆抗体(MBL，cat#D043-3，克隆25-2G)包被过夜。然后用100μl PBS-0.02％Tween20洗涤板四次。在37℃用25μl PBS-0.02％Tween20-1％BSA封闭板表面，持续1h。然后用100μl PBS-0.02％Tween20洗涤板四次。将25微升IL-18变体(或小鼠血浆)以8倍系列稀释液(从50nM开始降至0.02nM)添加到PBS-0.02％Tween20-0.1％BSA中，并在37℃孵育，持续2小时。然后用100μl PBS-0.02％Tween20洗涤板四次，并添加25μl在PBS中的2μg/ml的生物素化抗IL18单克隆抗体(MBL，cat#D045-6，克隆159-12B)。将板在37℃孵育2h，并且然后用100μl PBS-0.02％Tween20洗涤4次。将25微升在PBS-0.02％Tween20-0.1％BSA中以1:500稀释的链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶(#RABHRP3，Merck，Buchs，Switzerland)添加到每个孔，并在室温孵育，持续30min。然后用100μl PBS-0.02％Tween20洗涤板四次。向每个孔添加50微升TMB底物试剂(#CL07，Merck，Buchs，Switzerland)，并在37℃孵育，持续5min。在37℃5min后，通过添加50μl/孔的0.5M H2SO4终止溶液来终止辣根过氧化物酶反应。然后在来自Perkin Elmer(Schwerzenbach,Switzerland)的EnSpire读板器上在450nm处测量ELISA信号。
图7示出了以下组的ELISA结果：对照；对照+IL-18BP；WT IL-18；WT IL-18+IL-18BP；SEQ ID NO:2的修饰的IL-18多肽；SEQ ID NO:2的修饰的IL-18多肽+IL-18BP。
实施例16B-含有E6K和K53A氨基酸取代的修饰的IL-18的PK/PD
在单独的实验中，每组和每个时间点测试三只C57BL/6小鼠。WT IL-18(SEQ IDNO:1)通过0.3mg/kg的单次静脉内注射施加。E6K、K53A变体IL-18(SEQ ID NO:7)通过在t＝0hr和t＝24hr的两次0.3mg/kg的静脉内注射施加。将小鼠分成七个时间点组：5min、1hr、2hr、4hr、8hr、24hr和48hr。
通过分析血浆中的细胞因子水平来确定免疫相关的PD作用。测量以下血浆细胞因子：GM-CSF，IFNγ、IL-4、IL-5、IL-6、IL-12、TNFa、IL-22、MCP-1、MCP-3、MIP-1a、MIP-1b和CXCL1。白细胞的激活状态通过监测以下表面标志物来确定：PD-1和CD25。通过检测IL-18变体(游离的和IL-18BP复合的)的总量进行生物分析。
与野生型人类IL-18相比，人类IL-18多肽变体(SEQ ID NO:7)增加了体内细胞因子的产生。图20示出了IFNγ的血浆浓度，并且图21示出了在静脉内(i.v.)注射野生型IL-18或变体IL-18后各时间点的CXCL10血浆浓度。发现IFNγ以及MCP-1、MCP-3、MIP-1a、MIP-1b和CXCL10趋化因子的响应最强力，其中在注射后2hr和8hr之间观察到显著增加(MCP-1、MCP-3、MIP-1a和MIO-1b的数据未示出)。人类IL-18多肽变体(SEQ ID NO:7)的重复i.v.注射导致更强且更快速的响应，其中血浆细胞因子水平在注射后1hr和8hr之间增加。
实施例17-rIL18表达和纯化
本文提供的重组IL-18变体可以根据下面提供的方案制备。
可溶性His-SUMO-IL18变体
将含有编码加N-His-SUMO标签的IL-18变体融合体的质粒的大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)接种到3L LB培养基中，并在30℃用0.4mM IPTG诱导6h。将细胞沉淀，并在裂解缓冲液(PBS，pH 7.4)中通过声处理进行细胞裂解。可溶性蛋白通过Ni-NTA珠6FF纯化(洗涤1用：PBS，20mM咪唑，pH 7.4；洗涤2用PBS、50mM咪唑、pH 7.4；洗脱用PBS，500mM咪唑，pH7.4)。
将包含蛋白的级分汇集，透析到pH 7.4的PBS中，并且随后进行SUMO消化。然后将蛋白用Ni-NTA珠(连续流过样品)和凝胶过滤进行两步纯化。将包含蛋白的级分汇集并且使用分析技术(诸如SDS-PAGE和分析型SEC)进行QC。
不溶性His-SUMO-IL18变体
将含有编码加N-His-SUMO标签的IL-18变体融合体的质粒的大肠杆菌BL21(DE3)接种到10L LB培养基中，并在30℃用0.4mM IPTG诱导6h。将细胞沉淀，并在裂解缓冲液(PBS，8M尿素，pH 7.4)中通过声处理进行细胞裂解。蛋白通过Ni-NTA珠6FF纯化(洗涤1用：PBS，8M尿素，20mM咪唑，pH 7.4；洗涤2用PBS，8M尿素，50mM咪唑，pH 7.4；洗脱用PBS，8M尿素，500mM咪唑，pH 7.4)。
将包含蛋白的级分汇集，透析到pH 7.4的PBS中，并且随后进行SUMO消化。然后用Ni-NTA珠纯化蛋白(平衡柱用PBS，8M尿素，pH 7.4，洗涤用PBS，8M尿素，pH 7.4，洗脱用PBS，8M尿素，pH 7.4)。将包含蛋白的级分汇集，透析到pH 7.4的PBS中，并且使用分析技术(诸如SDS-PAGE和分析型SEC)进行QC。
不溶性无标签IL18变体
将含有编码mIL-18的质粒的大肠杆菌BL21(DE3)接种到2L LB培养基中，并在30℃用0.4mM IPTG诱导6h。将细胞沉淀，并在裂解缓冲液(110mM Tris，1.1M胍HCl，5mM DTT，pH8.9中)通过声处理进行细胞裂解。蛋白通过Q Sepharose FF纯化(平衡缓冲液20mM MES，pH7.0，洗脱用从0M到1M NaCl的递增梯度)。
双顺反子系统
包含质粒(例如，SEQ ID:71)的大肠杆菌BL21的单菌落用作10mL包含25μg/ml硫酸卡那霉素的LB的接种物，并在37℃和200rpm孵育过夜。1mL预培养物用于接种1L包含100μg/ml硫酸卡那霉素的自诱导terrific培养基。培养物在37℃和110rpm孵育4h，并且然后转移到15℃再持续15h。将细胞重悬于10-15mL裂解缓冲液(100mM Hepes，1mM EDTA，5mM DTT，20μg/ml溶菌酶，0.1mg/mL DNA酶I，1mM PMSF，pH 7.5)中，并在4℃温和地振荡1h。然后用声处理裂解细胞，并通过离心(16,000×g,30min,4℃)和过滤(0.2μm膜)获得可溶性蛋白级分。
将上清液调节至约pH 7，并使用50mL超级环(superloop)(每次运行装载少于30mL裂解物)装载到串联柱系统(2×SP CIEX+1×HiPrep DEAE FF 16/10，全部来自cytiva)上。用洗涤缓冲液(25mM Hepes，1mM EDTA，5mM DTT，pH 7.0)运行系统，并且收集并汇集包含蛋白的级分(第二主峰)。
串联柱被分成它们各自的类型。DEAE柱用缓冲液E1和E2(分别为25mM Bis-Tris-丙烷HCl，pH 9.5和25mM Bis-Tris-丙烷HCl，1M NaCl，pH 9.5)以阶式梯度洗脱。首先，100％E1运行8个CV，随后是在5个CV内从0％到12％的E2梯度，并且然后将其保持在12％，再持续10个CV。此后是在5个CV内从12％到40％的E2梯度，并将其保持在40％，再持续5个CV。收集包含蛋白的级分(第二主峰)并与先前的级分汇集。用相同的方法洗涤SP柱并丢弃，因为在该洗脱中将不会发现蛋白。
将汇集的样品调节至pH 9.5，并装载在Mono Q(小规模)或Hitrap Q(大规模)柱上。使用的缓冲液是E2和E3(25mM Bis-Tris-丙烷HCl，1.5M硫酸铵，pH 9.5)。对于15个CV，阶式洗脱梯度从8％E3开始，在5个CV内增加到16％E3，并在3个CV内增加到50％E3。在第二主峰中发现包含蛋白的级分。
汇集包含靶蛋白的级分并通过渗滤(10kDa MWCO，小于3500×g，4℃)浓缩。将浓缩的样品装载在用缓冲液(20mM磷酸钾，150mM KCl，1mM DTT，pH 6.0)平衡的Superdex75上。收集、汇集和浓缩包含靶蛋白的级分。
实施例18-修饰的IL-18多肽的缀合
在一些情况下，本文提供的修饰的IL-18多肽与PEG官能团缀合。在一些情况下，PEG通过双官能接头附接，该双官能接头首先与修饰的IL-18多肽的期望残基(例如，C68或另一个合适的天然存在的半胱氨酸或已经在期望位点(诸如残基69或70)处掺入的半胱氨酸残基)附接。在与IL-18多肽附接后，双官能接头的第二个官能团用于附接PEG部分。这样的方法的示例性示意图在图18中示出。本文提供的重组IL-18变体的示例性方案描述如下。
缀合-将重组IL-18在-80℃以2.4mg/mL的浓度储存在包含50mM KCl和1mM DTT的磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中。样品在冰上解冻，产生澄清溶液。蛋白溶液在PBS,pH 7.4中稀释。获得～0.4mg/mL的浓度的澄清溶液。
将蛋白溶液针对PBS,pH 7.4透析(两次针对600mL透析2h，并且一次针对800mL透析18h)。透析后，获得无沉淀迹象的澄清溶液。使用在280nm处的紫外吸光度并通过BCA蛋白测定获得蛋白浓度。
在水中的双官能探针(溴乙酰氨基-PEG5-叠氮化物，CAS：1415800-37-1)的储备溶液以20mM的浓度制备。将500μL蛋白溶液与25μL探针溶液混合。将pH调节至7.5，并让其在20℃反应3h。
合成的进展通过反相HPLC(在Aeris WIDEPORE C18
Figure BDA0004186569250001781
柱(3.6μm，150x4.6mm)上，以1mL/min的流量在40℃使用含有0.1％TFA(v/v)的5％至30％(2.5min)和30％至75％(7.5min)CH3CN的梯度)和MALDI-TOF MS监测。
纯化-在一些情况下，离子交换色谱用于纯化缀合的蛋白。为了去除过量的探针，使用25mM Tris(pH 7.4)作为缓冲液，将反应混合物(体积为约500μL)流过Hi-Trap-G-FF-1mL柱。用相同缓冲液中0-0.35M NaCl的线性梯度洗脱柱。收集包含靶蛋白的级分，交换缓冲液(25mM Tris，pH 7.4，75mM NaCl，5％甘油)并浓缩为0.4mg/mL。纯化蛋白的浓度通过280nm处的紫外吸光度并通过BCA蛋白测定确定。蛋白溶液保存在-80℃
表征-来自商业来源的重组蛋白和缀合蛋白的纯度和身份通过aSEC、HPLC和MALDI-TOF MS确认。
实施例19-修饰的IL-18多肽的PEG化
在如实施例19中描述的和如图18中示出的双官能接头缀合后，修饰的IL-18多肽可以与PEG基团共价连接。该方法的示例性示意图在图19中示出。下面提供了PEG和适当活化的IL-18多肽之间缀合反应的示例性方案。此外，下面的方案可用于在制备修饰的IL-18多肽期间(例如，在合成的IL-18多肽的合成期间)直接将期望的PEG基团与掺入了缀合手柄的修饰的IL-18多肽共价连接。这样的方法的示例性示意图在图3中示出。
缀合-SEQ ID NO:71的重组修饰的IL-18多肽在-80℃储存在包含75mM NaCl和5％(v/v)甘油的PBS(pH 7.4)中。在PEG化反应之前，样品在冰上解冻，产生澄清溶液。将200μL蛋白溶液(0.4mg/mL)与2.0mg 30kDa DBCO-聚乙二醇聚合物混合。让其在20℃反应过夜。
合成的进展通过反相HPLC(在Aeris WIDEPORE C4
Figure BDA0004186569250001791
柱(3.6μm，150x4.6mm)上，以1mL/min的流量在40℃使用含有0.1％TFA(v/v)的5％至30％(2.5min)和30％至75％(7.5min)CH3CN的梯度)和MALDI-TOF MS监测。
纯化-为了去除过量的PEG，反应混合物用Tris缓冲液(25mM，pH7.4)稀释并使用25mM Tris(pH 7.4)作为缓冲液流过Hi-Trap-Q-FF柱。用相同缓冲液中0-0.35M NaCl的线性梯度洗脱柱。收集包含靶蛋白的级分，交换缓冲液(25mM Tris，pH 7.4，75mM NaCl，5％甘油)并浓缩为0.04mg/mL。通过BCA蛋白测定确定纯化蛋白的浓度。蛋白溶液保存在-80℃
表征-缀合蛋白的纯度和身份通过HPLC和MALDI-TOF MS确认。
实施例20-PBMC刺激测定
根据以下方案评估IL-18变体刺激外周血单个核细胞(PBMC)的能力。
淋巴细胞的分离：来自健康志愿者血沉棕黄层的血用等体积的PBS稀释，并缓慢倾倒在预先填充有15mL Histopaque-1077的SepMate管的顶部。将管以1200g离心10分钟，收集顶层并用包含2％胎牛血清的PBS洗涤3次。将PBMC计数并冷冻保存为20×106个细胞的等分试样。
将冷冻保存的PBMC解冻并在包含10％胎牛血清的RPMI中用范围为0.2pM至1μM的人类IL-18变体梯度刺激。
在24hr刺激后，通过Legendplex(Biolegend#740930)在多色流式细胞仪上测量的细胞因子产生。在培养物上清液中释放的IFNγ的半最大有效浓度(EC50)使用GraphPadPRISM软件基于可变斜率和四参数分析进行计算。
在72hr刺激后，通过流式细胞术测量NK细胞上FcγRIII的表面表达(小鼠IgG1克隆3G8)。
图22示出了在施用野生型IL-18(SEQ ID NO:1)和SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:10的修饰的IL-18多肽后人类IFNγ、IL-1β、IL-6、IL-12p70、IL-10和TNFα的诱导(从左上图起顺时针地)。在每个单独的图中，x轴展示指定的IL-18多肽的浓度(nM)，并且y轴指示指定生物标志物的平均荧光强度(MFI)。在图中，野生型IL-18表示为圆形，SEQ ID NO:7的修饰的IL-18多肽表示为正方形，并且SEQ ID NO:10的修饰的IL-18多肽表示为三角形。对于每种生物标志物，修饰的IL-18多肽以低于野生型的浓度诱导指定细胞因子的产生。在SEQ ID NO:7的修饰的IL-18多肽与SEQ ID NO:10的修饰的IL-18多肽之间，对于每种细胞因子，SEQ IDNO:10以更低的浓度诱导细胞因子产生。
图23示出了用修饰的IL-18多肽刺激的PBMC的NK细胞群体中CD16+细胞的百分比(y轴，表示为总群体的％)。x轴展示相关IL-18多肽的浓度(nM)。野生型IL-18表示为完整的圆形，SEQ ID NO:7表示为完整的正方形，SEQ ID NO:10表示为完整的三角形，SEQ ID NO:71表示为空的圆形，并且在残基C68处附接有30kDa PEG的SEQ ID NO:71表示为实心菱形。与野生型相比，SEQ ID NO:7和10在更低的浓度展示出活性，而SEQ ID NO:71和具有PEG的SEQ ID NO:71在与野生型相似但略高的浓度展示出活性。
序列表
<110> 明峰治疗股份公司
<120> 修饰的IL-18多肽及其用途
<130> 94917-0009.707601WO
<140>
<141>
<150> 63/067,658
<151> 2020-08-19
<160> 248
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 157
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
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<210> 2
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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<221> MOD_RES
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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<220>
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Xaa Asp Xaa Thr Asp Ser Asp Ser Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile
1 5 10 15
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Phe Ile Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val
20 25 30
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Xaa Asp Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile
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Phe Ile Ile Ser Met Tyr Ala Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val
20 25 30
Thr Ile Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Xaa
35 40
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Xaa Asp Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile
1 5 10 15
Phe Ile Ile Ser Met Tyr Ala Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val
20 25 30
Thr Ile Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Xaa
35 40
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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<223> 正亮氨酸
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<221> MOD_RES
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<223> α-酮基-亮氨酸
<400> 221
Xaa Asp Xaa Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile
1 5 10 15
Phe Ile Ile Ser Xaa Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Xaa Ala Val
20 25 30
Thr Ile Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Xaa
35 40
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<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> source
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<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
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<220>
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<222> (3)..(3)
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<222> (21)..(21)
<223> O-甲基-L-高丝氨酸
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<222> (30)..(30)
<223> O-甲基-L-高丝氨酸
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<221> MOD_RES
<222> (44)..(44)
<223> α-酮基-亮氨酸
<400> 222
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1 5 10 15
Phe Ile Ile Ser Xaa Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Xaa Ala Val
20 25 30
Thr Ile Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Xaa
35 40
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> source
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<223> O-甲基-L-高丝氨酸
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1 5 10 15
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20 25 30
Thr Ile Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Xaa
35 40
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1 5 10 15
Phe Ile Ile Ser Xaa Tyr Ala Asp Ser Gln Pro Arg Gly Xaa Ala Val
20 25 30
Ala Ile Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Xaa
35 40
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<223> O-甲基-L-高丝氨酸
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1 5 10 15
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20 25 30
Ala Ile Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Xaa
35 40
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35 40 45
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50
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1 5 10 15
Lys Ile Ile Ser Phe Lys Glu Xaa Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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Xaa Ile Ser Val Lys Ser Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Ser Glu Asn
1 5 10 15
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Xaa Ile Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Ser Glu Asn
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Xaa Ile Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Ser Glu Asn
1 5 10 15
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50
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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<223> O-甲基-L-高丝氨酸
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<222> (1)..(1)
<223> 5-氧杂-脯氨酸
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<221> MOD_RES
<222> (41)..(41)
<223> α-酮-苯丙氨酸
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Xaa Ser Glu Asn Lys Ile Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp
1 5 10 15
Asn Ile Lys Asp Thr Lys Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val
20 25 30
Pro Gly His Asp Asn Lys Met Gln Xaa
35 40
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<211> 41
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> source
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20 25 30
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> source
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<221> MOD_RES
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<221> MOD_RES
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<221> MOD_RES
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<223> 正亮氨酸
<220>
<221> MOD_RES
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<223> α-酮-苯丙氨酸
<400> 240
Xaa Ser Glu Asn Lys Ile Ile Ser Phe Lys Glu Xaa Asn Pro Pro Asp
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<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> source
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<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
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<220>
<221> MOD_RES
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<223> O-甲基-L-高丝氨酸
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<223> O-甲基-L-高丝氨酸
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<223> α-酮-苯丙氨酸
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Xaa Cys Glu Asn Lys Ile Ile Ser Phe Lys Glu Xaa Asn Pro Pro Asp
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<211> 41
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 5-氧杂-脯氨酸
<220>
<221> MOD_RES
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<223> O-甲基-L-高丝氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (41)..(41)
<223> α-酮-苯丙氨酸
<400> 242
Xaa Ser Glu Asn Lys Ile Ile Ser Phe Lys Glu Xaa Asn Pro Pro Asp
1 5 10 15
Asn Ile Lys Asp Thr Lys Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val
20 25 30
Pro Gly His Asp Asn Lys Xaa Gln Xaa
35 40
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<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> source
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<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 5-氧杂-脯氨酸
<400> 243
Xaa Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu Lys Glu Arg
1 5 10 15
Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu Gly Asp Arg
20 25 30
Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
35 40
<210> 244
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> source
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 5-氧杂-脯氨酸
<400> 244
Xaa Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Ser Glu Lys Glu Arg
1 5 10 15
Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu Gly Asp Arg
20 25 30
Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
35 40
<210> 245
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> source
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<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 5-氧杂-脯氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (35)..(35)
<223> 正亮氨酸
<400> 245
Xaa Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu Lys Glu Arg
1 5 10 15
Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu Gly Asp Arg
20 25 30
Ser Ile Xaa Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
35 40
<210> 246
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> source
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 5-氧杂-脯氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (35)..(35)
<223> 正亮氨酸
<400> 246
Xaa Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Ser Glu Lys Glu Arg
1 5 10 15
Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu Gly Asp Arg
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Ser Ile Xaa Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> source
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 5-氧杂-脯氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (35)..(35)
<223> O-甲基-L-高丝氨酸
<400> 247
Xaa Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu Lys Glu Arg
1 5 10 15
Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu Gly Asp Arg
20 25 30
Ser Ile Xaa Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
35 40
<210> 248
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221> source
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 5-氧杂-脯氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (35)..(35)
<223> O-甲基-L-高丝氨酸
<400> 248
Xaa Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Ser Glu Lys Glu Arg
1 5 10 15
Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu Gly Asp Arg
20 25 30
Ser Ile Xaa Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
35 40

Claims (151)

1.一种修饰的白细胞介素-18(IL-18)多肽，所述修饰的白细胞介素-18(IL-18)多肽包含：
包含E06K和K53A的修饰的IL-18多肽，其中所述修饰的IL-18多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。
2.根据权利要求1所述的修饰的IL-18多肽，其中所述修饰的IL-18多肽还包含T63A。
3.根据权利要求1或2所述的修饰的IL-18多肽，其中所述修饰的IL-18多肽还包含Y01X、S55X、F02X、D54X、C38X、C68X、E69X、C76X、C127X或K70X中的至少一种，其中X是氨基酸或氨基酸衍生物。
4.根据权利要求3所述的修饰的IL-18多肽，其中所述修饰的IL-18多肽包含Y01G、S55A、F02A、D54A、C38S、C38A、C68S、C68A、E69C、C76S、C76A、C127S、C127A或K70C中的至少一种。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的修饰的IL-18多肽，其中所述修饰的IL-18多肽包含共价附接在残基65、残基66、残基67、残基68、残基69、残基70、残基71、残基72、残基73、残基74或残基75处的聚合物。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的修饰的IL-18多肽，其中所述修饰的IL-18多肽包含共价附接在残基C68处的聚合物。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的修饰的IL-18多肽，其中所述修饰的IL-18多肽包含共价附接在残基E69或E69C处的聚合物。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的修饰的IL-18多肽，其中所述修饰的IL-18多肽包含共价附接在残基K70或K70C处的聚合物。
9.根据权利要求5至8中任一项所述的修饰的IL-18多肽，其中所述聚合物具有以下的重均分子量：至多约50,000道尔顿、至多约25,000道尔顿、至多约10,000道尔顿、至多约6,000道尔顿或至多约2,000道尔顿。
10.根据权利要求5至9中任一项所述的修饰的IL-18多肽，其中所述聚合物具有以下的重均分子量：至少约120道尔顿、至少约250道尔顿、至少约300道尔顿、至少约400道尔顿或至少约500道尔顿。
11.根据权利要求5-10中任一项所述的修饰的IL-18多肽，其中所述聚合物包含缀合手柄或缀合手柄与互补缀合手柄的反应产物。
12.根据权利要求5至11中任一项所述的修饰的IL-18多肽，其中所述聚合物包含叠氮化物部分、炔烃部分或叠氮基-炔烃环加成反应的反应产物。
13.根据权利要求5至12中任一项所述的修饰的IL-18多肽，其中所述聚合物是水溶性聚合物。
14.根据权利要求13所述的修饰的IL-18多肽，其中所述水溶性聚合物包括聚(环氧烷)、多糖、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉、聚(丙烯酰吗啉)或其组合。
15.根据权利要求13所述的修饰的IL-18多肽，其中所述水溶性聚合物包括聚(环氧烷)。
16.根据权利要求14或15所述的修饰的IL-18多肽，其中所述聚(环氧烷)是聚乙二醇(PEG)。
17.根据权利要求16所述的修饰的IL-18多肽，其中所述聚乙二醇具有约10kDa至约50kDa的重均分子量。
18.根据权利要求16所述的修饰的IL-18多肽，其中所述聚乙二醇具有约10kDa、约20kDa或约30kDa的重均分子量。
19.根据权利要求16所述的修饰的IL-18多肽，其中所述聚乙二醇具有约30kDa的重均分子量。
20.根据权利要求5-19中任一项所述的修饰的IL-18多肽，其中所述修饰的IL-18多肽的半衰期比对应的野生型IL-18多肽的半衰期长至少10％。
21.根据权利要求20所述的修饰的IL-18多肽，其中所述修饰的IL-18多肽的半衰期比对应的野生型IL-18多肽的半衰期长至少30％。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的修饰的IL-18多肽，其中所述修饰的IL-18多肽包含N-末端延伸。
23.根据权利要求1-21中任一项所述的修饰的IL-18多肽，所述修饰的IL-18多肽包含N-末端截短。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的修饰的IL-18多肽，其中所述修饰的IL-18多肽包含与SEQ ID NO:2-83中的任何一个具有至少约80％序列同一性的多肽序列。
25.根据权利要求24所述的修饰的IL-18多肽，其中所述多肽序列与SEQ ID NO:2或SEQID NO:18至少约80％相同。
26.根据权利要求25所述的修饰的IL-18多肽，其中所述多肽序列与SEQ ID NO:2至少约80％相同。
27.根据权利要求25所述的修饰的IL-18多肽，其中所述多肽序列与SEQ ID NO:2至少约90％相同。
28.根据权利要求25所述的修饰的IL-18多肽，其中所述多肽序列与SEQ ID NO:2至少约95％相同。
29.根据权利要求25所述的修饰的IL-18多肽，其中所述多肽序列与SEQ ID NO:18至少约80％相同。
30.根据权利要求25所述的修饰的IL-18多肽，其中所述多肽序列与SEQ ID NO:18至少约90％相同。
31.根据权利要求25所述的修饰的IL-18多肽，其中所述多肽序列与SEQ ID NO:18至少约95％相同。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的修饰的IL-18多肽，其中所述修饰的IL-18多肽是重组体。
33.根据权利要求1-31中任一项所述的修饰的IL-18多肽，所述修饰的IL-18多肽包含选自以下的一个或更多个氨基酸取代：
(a)位于残基26-36的任何一个处的高丝氨酸残基；
(b)位于残基60-80的任何一个处的高丝氨酸残基；
(c)位于残基110-120的任何一个处的高丝氨酸残基；
(d)位于残基28-38的任何一个处的正亮氨酸或O-甲基-高丝氨酸残基；
(d)位于残基46-56的任何一个处的正亮氨酸或O-甲基-高丝氨酸残基；
(e)位于残基54-64的任何一个处的正亮氨酸或O-甲基-高丝氨酸残基；
(f)位于残基80-90的任何一个处的正亮氨酸或O-甲基-高丝氨酸残基；
(g)位于残基108-118的任何一个处的正亮氨酸或O-甲基-高丝氨酸残基；以及
(h)位于残基145-155的任何一个处的正亮氨酸或O-甲基-高丝氨酸残基；
其中所述修饰的IL-18多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。
34.根据权利要求33所述的修饰的IL-18多肽，所述修饰的IL-18多肽包含选自以下的一个或更多个氨基酸取代：高丝氨酸(Hse)31、正亮氨酸(Nle)33、O-甲基-高丝氨酸(Omh)33、Nle51、Omh51、Nle60、Omh60、Hse75、Nle86、Omh86、Hse106、Nle113、Omh113、Nle150和Omh150。
35.根据权利要求1-34中任一项所述的修饰的IL-18多肽，其中所述修饰的IL-18多肽调节IFNγ的产生，并且其中所述修饰的IL-18多肽诱导IFNγ的能力的EC50(nM)比SEQ ID NO:1的IL-18多肽的EC50(nM)高不超过10倍、高不超过5倍，或比SEQ ID NO:1的IL-18多肽的EC50(nM)低。
36.根据权利要求35所述的修饰的IL-18多肽，其中所述修饰的IL-18多肽诱导IFNγ的能力的EC50(nM)比SEQ ID NO:1的EC50(nM)大不超过5倍。
37.根据权利要求35所述的修饰的IL-18多肽，其中所述修饰的IL-18多肽诱导IFNγ的能力的EC50(nM)比SEQ ID NO:1的IL-18多肽的EC50(nM)低。
38.根据权利要求35所述的修饰的IL-18多肽，其中所述修饰的IL-18多肽诱导IFNγ的能力的EC50(nM)比SEQ ID NO:1的EC50(nM)低至少约10倍。
39.一种修饰的IL-18多肽，所述修饰的IL-18多肽包含与SEQ ID NO:2-83中的任何一个具有至少约80％序列同一性的多肽序列。
40.根据权利要求39所述的修饰的IL-18多肽，其中所述多肽序列与SEQ ID NO:2或SEQID NO:18至少约80％相同。
41.根据权利要求39所述的修饰的IL-18多肽，其中所述多肽序列与SEQ ID NO:2至少约80％相同。
42.根据权利要求39所述的修饰的IL-18多肽，其中所述多肽序列与SEQ ID NO:2至少约90％相同。
43.根据权利要求39所述的修饰的IL-18多肽，其中所述多肽序列与SEQ ID NO:2至少约95％相同。
44.根据权利要求39所述的修饰的IL-18多肽，其中所述多肽序列与SEQ ID NO:18至少约80％相同。
45.根据权利要求39所述的修饰的IL-18多肽，其中所述多肽序列与SEQ ID NO:18至少约90％相同。
46.根据权利要求39所述的修饰的IL-18多肽，其中所述多肽序列与SEQ ID NO:18至少约95％相同。
47.根据权利要求1-46中任一项所述的修饰的IL-18多肽，其中通过KD测量，所述修饰的IL-18多肽对IL-18受体α亚基(IL-18Rα)表现出比对IL-18结合蛋白(IL-18BP)低不超过10倍的亲和力、低不超过5倍的亲和力，或比对IL-18结合蛋白(IL-18BP)大的亲和力，并且其中[KD IL-18Rα]/[KDIL-18BP]大于0.1。
48.根据权利要求47所述的修饰的IL-18多肽，其中所述修饰的IL-18多肽与IL-18受体α(IL-18Rα)结合。
49.根据权利要求47所述的修饰的IL-18多肽，其中所述修饰的IL-18多肽以小于约200nM、小于约100nM、小于约80nM、小于约70nM、小于约60nM或小于约50nM的KD与IL-18Rα结合。
50.根据权利要求47所述的修饰的IL-18多肽，其中所述修饰的IL-18多肽以小于约50nM的KD与IL-18Rα结合。
51.根据权利要求47-50中任一项所述的修饰的IL-18多肽，其中所述修饰的IL-18多肽与IL-18受体α/β(IL-18Rα/β)异源二聚体结合。
52.根据权利要求51所述的修饰的IL-18多肽，其中所述修饰的IL-18多肽以小于约25nM的KD与所述IL-18Rα/β异源二聚体结合。
53.根据权利要求51所述的修饰的IL-18多肽，其中所述修饰的IL-18多肽以小于约10nM的KD与所述IL-18Rα/β异源二聚体结合。
54.根据权利要求1-53中任一项所述的修饰的IL-18多肽，其中所述修饰的IL-18多肽与另外的肽缀合。
55.一种修饰的白细胞介素-18(IL-18)多肽群体，所述修饰的白细胞介素-18(IL-18)多肽群体包含：
a)多于一种修饰的IL-18多肽；和
b)至少一种聚合物部分，其中至少一种聚合物部分与所述修饰的IL-18多肽共价连接，并附接在残基65、残基66、残基67、残基68、残基69、残基70、残基71、残基72、残基73、残基74或残基75处，其中氨基酸残基位置是基于SEQ ID NO:1作为参考序列；
其中所述修饰的IL-18多肽中的至少90％具有在通过高分辨率电喷雾电离质谱(ESI-HRMS)确定的所述多于一种修饰的IL-18多肽的峰值分子量的±500Da内的分子量。
56.一种修饰的白细胞介素-18(IL-18)多肽群体，所述修饰的白细胞介素-18(IL-18)多肽群体包含：
a)多于一种修饰的IL-18多肽；和
b)多于一种聚合物部分，其中所述多于一种聚合物部分与所述修饰的IL-18多肽共价连接，并附接在所述修饰的IL-18多肽的残基65、残基66、残基67、残基68、残基69、残基70、残基71、残基72、残基73、残基74或残基75处，其中氨基酸残基位置是基于SEQ ID NO:1作为参考序列；
其中所述多于一种聚合物部分中的至少90％具有在通过高分辨率电喷雾电离质谱(ESI-HRMS)确定的所述多于一种聚合物部分的峰值分子量的±500Da内的分子量。
57.根据权利要求55或56所述的修饰的IL-18多肽群体，其中至少一种聚合物部分或所述多于一种聚合物部分在氨基酸残基68处与所述修饰的IL-18多肽共价连接，其中所述修饰的IL-18多肽的氨基酸残基编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。
58.根据权利要求55或56所述的修饰的IL-18多肽群体，其中至少一种聚合物部分或所述多于一种聚合物部分在氨基酸残基69处与所述修饰的IL-18多肽共价连接，其中所述修饰的IL-18多肽的氨基酸残基编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。
59.根据权利要求55或56所述的修饰的IL-18多肽群体，其中至少一种聚合物部分或所述多于一种聚合物部分在氨基酸残基70处与所述修饰的IL-18多肽共价连接，其中所述修饰的IL-18多肽的氨基酸残基编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。
60.根据权利要求55或56所述的修饰的IL-18多肽群体，其中至少一种聚合物部分或所述多于一种聚合物部分在C68处与所述修饰的IL-18多肽共价连接，其中所述修饰的IL-18多肽的氨基酸残基编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。
61.根据权利要求55或56所述的修饰的IL-18多肽群体，其中至少一种聚合物部分或所述多于一种聚合物部分在E69或E69C处与所述修饰的IL-18多肽共价连接，其中所述修饰的IL-18多肽的氨基酸残基编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。
62.根据权利要求55或56所述的修饰的IL-18多肽群体，其中至少一种聚合物部分或所述多于一种聚合物部分在K70或K70C处与所述修饰的IL-18多肽共价连接，其中所述修饰的IL-18多肽的氨基酸残基编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。
63.根据权利要求55-62中任一项所述的修饰的IL-18多肽群体，其中所述多于一种修饰的IL-18多肽中的每种修饰的IL-18多肽包含一个或更多个突变。
64.根据权利要求63所述的修饰的IL-18多肽群体，其中所述一个或更多个突变位于选自E06、K53、Y01、S55、F02、D54、C38、T63、C68、E69、C76、C127和K70的残基位置处，其中所述修饰的IL-18多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。
65.根据权利要求64所述的修饰的IL-18多肽群体，其中所述一个或更多个突变选自E06K、K53A、Y01G、S55A、F02A、D54A、C38S、C38A、T63A、C68S、C68A、E69C、C76S、C76A、C127S、C127A和K70C。
66.根据权利要求65所述的修饰的IL-18多肽群体，其中一个或更多个突变包括E06K和K53A。
67.根据权利要求65所述的修饰的IL-18多肽群体，其中一个或更多个突变包括E06K、K53A和T63A。
68.根据权利要求55-67中任一项所述的修饰的IL-18多肽群体，其中所述群体包括至少1μg、至少10μg或至少1mg所述修饰的IL-18多肽。
69.根据权利要求55-67中任一项所述的修饰的IL-18多肽群体，其中所述群体包括至少100种、至少1000种或至少10000种所述修饰的IL-18多肽。
70.根据权利要求55-69中任一项所述的修饰的IL-18多肽群体，其中所述修饰的IL-18多肽群体的重均分子量相比于数均分子量的比值为至多1.1。
71.根据权利要求55-70中任一项所述的修饰的IL-18多肽群体，其中所述多于一种聚合物中的每一种包括水溶性聚合物。
72.根据权利要求71所述的修饰的IL-18多肽群体，其中所述水溶性聚合物包括聚(环氧烷)、多糖、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉、聚(丙烯酰吗啉)或其组合。
73.根据权利要求71所述的修饰的IL-18多肽群体，其中所述水溶性聚合物包括聚乙二醇。
74.根据权利要求55-73中任一项所述的修饰的IL-18多肽群体，其中所述多于一种聚合物的重均分子量为约200Da至约50,000Da。
75.根据权利要求55-74中任一项所述的修饰的IL-18多肽群体，其中所述多于一种聚合物的重均分子量为约10,000Da至约30,000Da。
76.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求1-54中任一项所述的修饰的IL-18多肽。
77.一种产生权利要求1-54中任一项所述的修饰的IL-18多肽的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达所述修饰的IL-18多肽。
78.根据权利要求76或77所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核细胞或真核细胞。
79.根据权利要求76或77所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞、禽类细胞、真菌细胞或昆虫细胞。
80.根据权利要求79所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是CHO细胞、COS细胞或酵母细胞。
81.一种药物组合物，所述药物组合物包含：
a)权利要求1-54中任一项所述的修饰的IL-18多肽或权利要求55-75中任一项所述的修饰的IL-18多肽群体；和
b)药学上可接受的载体或赋形剂。
82.根据权利要求81所述的药物组合物，其中所述药物组合物呈冻干形式。
83.一种治疗有相应需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括：
向所述受试者施用药学上有效量的权利要求1-54中任一项所述的修饰的IL-18多肽或权利要求81或82所述的药物组合物。
84.根据权利要求83所述的方法，其中所述癌症是实体癌症。
85.根据权利要求84所述的方法，其中所述实体癌症是肾癌、皮肤癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、结肠直肠癌、食管癌、眼癌、头颈癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌或前列腺癌。
86.根据权利要求84所述的方法，其中所述实体癌症是转移性肾细胞癌或黑素瘤。
87.根据权利要求84所述的方法，其中所述实体癌症是癌或肉瘤。
88.根据权利要求83所述的方法，其中所述癌症是血液癌症。
89.根据权利要求88所述的方法，其中所述血液癌症是白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤或多发性骨髓瘤。
90.根据权利要求83-89中任一项所述的方法，所述方法还包括重构所述修饰的IL-18多肽或所述药物组合物的冻干形式。
91.一种合成IL-18多肽，所述合成IL-18多肽包含：
包含选自残基21-41、残基60-80和残基106-126的区域的位置处的高丝氨酸(Hse)残基的合成IL-18多肽，其中所述修饰的IL-18多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。
92.根据权利要求91所述的合成IL-18多肽，其中所述合成IL-18多肽包含在残基21-41、残基60-80和残基106-126的每个区域中的Hse残基。
93.根据权利要求91或92所述的合成IL-18多肽，其中所述合成IL-18多肽包含在位置31处的Hse残基。
94.根据权利要求91-93中任一项所述的合成IL-18多肽，其中所述合成IL-18多肽包含在位置63或位置75处的Hse残基。
95.根据权利要求94所述的合成IL-18多肽，其中所述合成IL-18多肽包含在位置63处的Hse残基。
96.根据权利要求94所述的合成IL-18多肽，其中所述合成IL-18多肽包含在位置75处的Hse残基。
97.根据权利要求91-96中任一项所述的合成IL-18多肽，其中所述合成IL-18多肽包含在位置116处的Hse残基。
98.根据权利要求91-97中任一项所述的合成IL-18多肽，其中所述合成IL-18多肽包含在位置31、116、和位置63和75中的至少一个处的Hse残基。
99.根据权利要求91-98中任一项所述的合成IL-18多肽，其中所述合成IL-18多肽包含SEQ ID NO:1中的至少一个甲硫氨酸残基的氨基酸取代。
100.根据权利要求99所述的合成IL-18多肽，其中所述SEQ ID NO:1中的至少一个甲硫氨酸残基的氨基酸取代包括在M33、M51、M60、M86、M113或M150处的取代。
101.根据权利要求99或100所述的合成IL-18多肽，其中所述合成IL-18多肽包含至少三个甲硫氨酸残基的取代。
102.根据权利要求99-101中任一项所述的合成IL-18多肽，其中所述合成IL-18多肽包含至少五个甲硫氨酸残基的取代。
103.根据权利要求99-102中任一项所述的合成IL-18多肽，其中所述合成IL-18多肽包含至少六个甲硫氨酸残基的取代。
104.根据权利要求99-103中任一项所述的合成IL-18多肽，其中至少一个甲硫氨酸残基被取代为O-甲基-高丝氨酸(Omh)残基。
105.根据权利要求99-104中任一项所述的合成IL-18多肽，其中至少三个甲硫氨酸残基被取代为Omh残基。
106.根据权利要求99-105中任一项所述的合成IL-18多肽，其中至少五个甲硫氨酸残基被取代为Omh残基。
107.根据权利要求99-106中任一项所述的合成IL-18多肽，其中每个甲硫氨酸被取代为正亮氨酸或Omh残基。
108.根据权利要求99-107中任一项所述的合成IL-18多肽，其中每个甲硫氨酸被取代为Omh残基。
109.根据权利要求99-108中任一项所述的合成IL-18多肽，其中SEQ ID NO:1的每个甲硫氨酸残基被取代为Omh残基。
110.根据权利要求91-109中任一项所述的合成IL-18多肽，其中所述合成IL-18多肽包含SEQ ID NO:1的另外突变。
111.根据权利要求91-110中任一项所述的合成IL-18多肽，其中所述合成IL-18多肽包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列至少约80％相同的氨基酸序列。
112.根据权利要求91-111中任一项所述的合成IL-18多肽，其中所述合成IL-18多肽包含与所述合成IL-18多肽的残基共价附接的聚合物。
113.一种制备修饰的IL-18多肽的方法，所述方法包括：
a)合成所述修饰的IL-18多肽的两种或更多种片段，
b)连接所述片段；和
c)使所连接的片段折叠。
114.根据权利要求113所述的方法，其中所述两种或更多种片段包括N-末端片段、C-末端片段和任选地一种或更多种内部片段，其中所述N-末端片段包括所述修饰的IL-18多肽的N-末端，并且所述C-末端片段包括所述修饰的IL-18多肽的C-末端。
115.根据权利要求114所述的方法，其中所述N-末端片段和所述一种或更多种内部片段中的每种包含α-酮氨基酸作为每种片段的C-末端残基。
116.根据权利要求115所述的方法，其中每种α-酮氨基酸选自α-酮-苯丙氨酸、α-酮-酪氨酸、α-酮-缬氨酸、α-酮-亮氨酸、α-酮-异亮氨酸、α-酮-正亮氨酸和α-酮-O-甲基-高丝氨酸。
117.根据权利要求114-117中任一项所述的方法，其中所述C-末端片段和所述一种或更多种内部片段中的每种包含具有羟胺或环状羟胺官能团的残基作为每种片段的N-末端残基。
118.根据权利要求117所述的方法，其中具有所述羟胺或所述环状羟胺官能团的每种残基是5-氧杂脯氨酸残基。
119.根据权利要求113-118中任一项所述的方法，其中合成所述修饰的IL-18多肽的两种或更多种片段包括合成四种片段。
120.根据权利要求119所述的方法，其中所述四种片段包括N-末端片段、第一内部片段、第二内部片段和C-末端片段。
121.根据权利要求120所述的方法，其中所述N-末端片段包含对应于所述修饰的IL-18多肽的氨基酸1-30的残基，其中所述修饰的IL-18多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。
122.根据权利要求120或121所述的方法，其中所述N-末端片段包含与SEQ ID NO:1的序列相比的N-末端延伸。
123.根据权利要求120-122中任一项所述的方法，其中所述N-末端片段包含与SEQ IDNO:201中列出的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
124.根据权利要求120-123中任一项所述的方法，其中所述N-末端片段包含SEQ IDNO:201-209中的任何一个列出的氨基酸序列。
125.根据权利要求120-124中任一项所述的方法，其中所述第一内部片段包含对应于所述修饰的IL-18多肽的氨基酸31-62的残基，其中所述修饰的IL-18多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。
126.根据权利要求120-125中任一项所述的方法，其中所述第一内部片段包含与SEQID NO:210中列出的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
127.根据权利要求120-126中任一项所述的方法，其中所述第一内部片段包含SEQ IDNO:210-217中的任何一个列出的氨基酸序列。
128.根据权利要求120-127中任一项所述的方法，其中所述第二内部片段包含对应于所述修饰的IL-18多肽的氨基酸63-115的残基，其中所述修饰的IL-18多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。
129.根据权利要求120-128中任一项所述的方法，其中所述第二内部片段包含与SEQID NO:227中列出的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
130.根据权利要求120-129中任一项所述的方法，其中所述第二内部片段包含SEQ IDNO:227-236中的任何一个列出的氨基酸序列。
131.根据权利要求120-124中任一项所述的方法，其中所述第一内部片段包含对应于所述修饰的IL-18多肽的氨基酸31-74的残基，其中所述修饰的IL-18多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。
132.根据权利要求120-124或131中任一项所述的方法，其中所述第一内部片段包含与SEQ ID NO:218中列出的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
133.根据权利要求120-124、131或132中任一项所述的方法，其中所述第一内部片段包含SEQ ID NO:218-226中的任何一个列出的氨基酸序列。
134.根据权利要求120-124或131-133中任一项所述的方法，其中所述第二内部片段包含对应于所述修饰的IL-18多肽的氨基酸75-115的残基，其中所述修饰的IL-18多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。
135.根据权利要求120-124或131-134中任一项所述的方法，其中所述第二内部片段包含与SEQ ID NO:237中列出的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
136.根据权利要求120-124或131-135中任一项所述的方法，其中所述第二内部片段包含SEQ ID NO:237-242中的任何一个列出的氨基酸序列。
137.根据权利要求120-136中任一项所述的方法，其中所述C-末端片段包含对应于所述修饰的IL-18多肽的氨基酸116-157的残基，其中所述修饰的IL-18多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。
138.根据权利要求120-137中任一项所述的方法，其中所述C-末端片段包含与SEQ IDNO:243中列出的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
139.根据权利要求120-138中任一项所述的方法，其中所述C-末端片段包含SEQ IDNO:243-248中的任何一个列出的氨基酸序列。
140.根据权利要求120-139中任一项所述的方法，其中所述N-末端片段、所述第一内部片段、所述第二内部片段和所述C-末端片段分别从N-末端到C-末端排列在所述修饰的IL-18多肽中。
141.根据权利要求113-140中任一项所述的方法，其中所述方法还包括重排所述连接的片段。
142.根据权利要求113-141中任一项所述的方法，其中所述IL-18多肽的至少一个片段包含缀合手柄。
143.根据权利要求113-142中任一项所述的方法，所述方法还包括将水溶性聚合物附接到所折叠的连接的片段。
144.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含修饰的IL-18多肽，其中所述修饰的IL-18多肽包含与SEQ ID NO:2-83中的任何一个至少约80％相同的序列。
145.根据权利要求144所述的融合蛋白，其中所述序列与SEQ ID NO:2至少约85％相同。
146.根据权利要求144所述的融合蛋白，其中所述序列与SEQ ID NO:2至少约90％相同。
147.根据权利要求144所述的融合蛋白，其中所述序列与SEQ ID NO:2至少约95％相同。
148.根据权利要求144所述的融合蛋白，其中所述序列与SEQ ID NO:18至少约85％相同。
149.根据权利要求144所述的融合蛋白，其中所述序列与SEQ ID NO:18至少约90％相同。
150.根据权利要求144所述的融合蛋白，其中所述序列与SEQ ID NO:18至少约95％相同。
151.根据权利要求144所述的融合蛋白，其中所述序列与SEQ ID NO:18相同。
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