KR20230052956A - 변형된 il-18 폴리펩티드 및 이의 용도 - Google Patents

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베르톨트 크레프트
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카밀 델론
클라우디아 페츠
알렉산더 프로흘
베노이트 호른슈페르거
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제프리 윌리엄 보데
루이즈 마틸드 아레발로
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안나 하이든
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Abstract

본 개시 내용은 변형된 IL-18 폴리펩티드, 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함하는 조성물, 이의 제조 방법, 및 질환 치료를 위한 변형된 IL-18 폴리펩티드의 사용 방법에 관한 것이다. 한 측면에서, 본 개시 내용은 변형된 IL-18 폴리펩티드를 사용한 암 치료에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 개시된 IL-18 폴리펩티드는 IFNγ의 생성을 유도한다. 일부 실시양태에서, 개시된 IL-18 폴리펩티드는 IL-18 결합 단백질에 의해 중화되지 않으면서 IFNγ의 생성을 유도한다.

Description

변형된 IL-18 폴리펩티드 및 이의 용도
상호 참조
본 출원은 2020년 8월 19일자로 출원된 미국 가출원 제63/067,658호의 이익을 주장하며, 이 출원은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자 제출된 서열 목록을 포함하며 이로써 그 전체가 참고로 포함된다. 2021년 8월 16일자로 생성된 상기 ASCII 사본의 명칭은 94917_0009_707601WO_SL.txt이며 크기는 185,376바이트이다.
배경
면역치료는 질병의 치료를 돕기 위해 대상체의 면역계를 이용한다. 면역치료는 치료 중인 질환의 특성에 따라 면역계를 활성화하거나 억제하도록 설계될 수 있다. 암 치료를 위한 면역치료의 목표는 면역계를 자극하여 종양이나 다른 암 조직을 인식하고 파괴하는 것이다. 면역계를 활성화하여 대상체의 체 내에서 암세포를 공격하는 한 가지 방법은 사이토카인 요법이다. 사이토카인은 체내에서 생성되는 단백질로 세포 신호 전달 및 면역계 조절에 중요하다. 일부 사이토카인 요법은 암세포를 사멸시키기 위해 대상체의 면역계를 강화하는 사이토카인의 이러한 특성을 이용한다.
한 측면에서, 변형된 인터류킨-18(IL-18) 폴리펩티드로서, E06K 및 K53A를 포함하는 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1의 변형된 IL-18폴리펩티드를 기준으로 하는 것인 변형된 IL-18 폴리펩티드가 본원에 기재된다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 T63A를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 Y01X, F02X, C38X, D54X, S55X, C68X, K70X, C76X, 또는 C127X 중 적어도 하나를 추가로 포함하며, 여기서 X는 아미노산 또는 아미노산 유도체이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 Y01G, F02A, C38S, D54A, S55A, C68S, K70C, C76S, 또는 C127S 중 적어도 하나를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 Y01X, F02X, C38X, D54X, S55X, C68X, E69X, 또는 K70X, C76X, 또는 C127X 중 적어도 하나를 추가로 포함하며, 여기서 X는 아미노산 또는 아미노산 유도체이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 Y01G, F02A, C38S, C38A, D54A, S55A, C68S, C68A, E69C, K70C, C76S, C76A, C127A, 또는 C127S 중 적어도 하나를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 잔기 65, 잔기 66, 잔기 67, 잔기 68, 잔기 69, 잔기 70, 잔기 71, 잔기 72, 잔기 73, 잔기 74, 또는 잔기 75에서 공유 부착되는 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 잔기 C68에서 공유 부착되는 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 잔기 69에서 공유 부착되는 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 잔기 E69에서 공유 부착되는 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 잔기 E69C에서 공유 부착되는 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 잔기 70에서 공유 부착되는 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 잔기 K70에서 공유 부착되는 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 잔기 K70C에서 공유 부착되는 중합체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 중합체는 최대 약 50,000 달톤, 최대 약 25,000 달톤, 최대 약 10,000 달톤, 또는 최대 약 6,000 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 중합체는 적어도 약 120 달톤, 적어도 약 250 달톤, 적어도 약 300 달톤, 적어도 약 400 달톤, 또는 적어도 약 500 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는다.
일부 실시양태에서, 중합체는 접합 핸들 또는 접합 핸들과 상보적인 접합 핸들의 반응 생성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합체는 아지드 모이어티, 알킨 모이어티, 또는 아지드-알킨 고리첨가 반응의 반응 생성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합체는 아지드 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합체는 수용성 중합체이다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 폴리(알킬렌 옥시드), 다당류, 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알코올), 폴리옥사졸린, 폴리(아크릴로일모르폴린), 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 폴리(알킬렌 옥시드)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리(알킬렌 옥시드)는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다.
일부 실시양태에서, 폴리에틸렌 글리콜은 약 10 kDa 내지 약 50 kDa의 중량 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리에틸렌 글리콜은 약 10 kDa, 약 20 kDa, 또는 약 30 kDa의 중량 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리에틸렌 글리콜은 약 30 kDa의 중량 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리에틸렌 글리콜은 약 1 kDa 내지 약 10 kDa의 중량 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리에틸렌 글리콜은 약 1 kDa, 약 2 kDa, 약 5 kDa, 약 7.5 kDa, 또는 약 10 kDa의 중량 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드의 반감기는 상응하는 야생형 IL-18 폴리펩티드의 반감기보다 적어도 10% 더 길다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드의 반감기는 상응하는 야생형 IL-18 폴리펩티드의 반감기보다 적어도 30% 더 길다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 N-말단 연장부를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 N-말단 절두(truncation)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 서열 번호 2-58과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 서열 번호 2-83과 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 서열 번호 2-58과 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 서열은 서열 번호 2 또는 서열 번호 18과 적어도 약 80% 동일하다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 서열은 서열 번호 2와 적어도 약 80% 동일하다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 서열은 서열 번호 2와 적어도 약 90% 동일하다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 서열은 서열 번호 2와 적어도 약 95% 동일하다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 서열은 서열 번호 18과 적어도 약 80% 동일하다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 서열은 서열 번호 18과 적어도 약 90% 동일하다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 서열은 서열 번호 18과 적어도 약 95% 동일하다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 재조합체이다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 (a) 잔기 26-36 중 어느 하나에 위치한 호모세린 잔기; (b) 잔기 60-80 중 어느 하나에 위치한 호모세린 잔기; (c) 잔기 110-120 중 어느 하나에 위치한 호모세린 잔기; (d) 잔기 28-38 중 어느 하나에 위치한 노르류신 잔기; (d) 잔기 46-56 중 어느 하나에 위치한 노르류신 잔기; (e) 잔기 54-64 중 어느 하나에 위치한 노르류신 잔기; (f) 잔기 80-90 중 어느 하나에 위치한 노르류신 잔기; (g) 잔기 108-118 중 어느 하나에 위치한 노르류신 잔기; 및 (h) 잔기 145-155 중 어느 하나에 위치한 노르류신 잔기로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 (a) 잔기 26-36 중 어느 하나에 위치한 호모세린 잔기; (b) 잔기 60-80 중 어느 하나에 위치한 호모세린 잔기; (c) 잔기 110-120 중 어느 하나에 위치한 호모세린 잔기; (d) 잔기 28-38 중 어느 하나에 위치한 노르류신 또는 O-메틸-호모세린 잔기; (d) 잔기 46-56 중 어느 하나에 위치한 노르류신 또는 O-메틸-호모세린 잔기; (e) 잔기 54-64 중 어느 하나에 위치한 노르류신 또는 O-메틸-호모세린 잔기; (f) 잔기 80-90 중 어느 하나에 위치한 노르류신 또는 O-메틸-호모세린 잔기; (g) 잔기 108-118 중 어느 하나에 위치한 노르류신 또는 O-메틸-호모세린 잔기; 및 (h) 잔기 145-155 중 어느 하나에 위치한 노르류신 또는 O-메틸-호모세린 잔기로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 (a) 잔기 26-36 중 어느 하나에 위치한 호모세린 잔기; (b) 잔기 60-80 중 어느 하나에 위치한 호모세린 잔기; (c) 잔기 110-120 중 어느 하나에 위치한 호모세린 잔기; (d) 잔기 28-38 중 어느 하나에 위치한 O-메틸-호모세린 잔기; (d) 잔기 46-56 중 어느 하나에 위치한 O-메틸-호모세린 잔기; (e) 잔기 54-64 중 어느 하나에 위치한 O-메틸-호모세린 잔기; (f) 잔기 80-90 중 어느 하나에 위치한 O-메틸-호모세린 잔기; (g) 잔기 108-118 중 어느 하나에 위치한 O-메틸-호모세린 잔기; 및 (h) 잔기 145-155 중 어느 하나에 위치한 O-메틸-호모세린 잔기로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 호모세린(Hse) 31, 노르류신(Nle) 33, Nle51, Nle59, Hse75, Nle86, Nle113, Hse116, 및 Nle150으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 호모세린(Hse) 31, 노르류신(Nle) 33, O-메틸-호모세린(Omh) 33, Nle51, Omh51, Nle60, Omh60, Hse75, Nle86, Omh86, Hse116, Nle113, Omh113, Nle150, 및 Omh150으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 펩티드는 O-메틸-L-호모세린으로 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 펩티드는 위치 Met 33, Met 51, Met 60, Met 86, Met 113, 또는 Met 150에서 O-메틸-L-호모세린으로 아미노산 치환을 포함한다.
한 측면에서, 변형된 인터류킨-18(IL-18) 폴리펩티드 집단으로서, a) 복수의 변형된 IL-18 폴리펩티드; 및 b) 적어도 하나의 중합체 모이어티로서 적어도 하나의 중합체 모이어티는 변형된 IL-18 폴리펩티드에 공유 결합되고 잔기 65, 잔기 66, 잔기 67, 잔기 68, 잔기 69, 잔기 70, 잔기 71, 잔기 72, 잔기 73, 잔기 74, 또는 잔기 75에서 부착되며, 여기서 아미노산 잔기 위치는 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 하는 것인 적어도 하나의 중합체 모이어티를 포함하며; 변형된 IL-18 폴리펩티드의 적어도 90%는 고해상도 전자분무 이온화 질량 분석법(ESI-HRMS: high resolution electrospray ionization mass spectrometry)에 의해 결정되는 바와 같이 복수의 변형된 IL-18 폴리펩티드의 피크 분자량의 ±500 Da 이내인 분자량을 갖는 것인 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단이 본원에 기재된다.
한 측면에서, 변형된 인터류킨-18(IL-18) 폴리펩티드 집단으로서, a) 복수의 변형된 IL-18 폴리펩티드; 및 b) 복수의 중합체 모이어티로서 복수의 중합체 모이어티는 변형된 IL-18 폴리펩티드에 공유 결합되고 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 65, 잔기 66, 잔기 67, 잔기 68, 잔기 69, 잔기 70, 잔기 71, 잔기 72, 잔기 73, 잔기 74, 또는 잔기 75에서 부착되며, 여기서 아미노산 잔기 위치는 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 하는 것인 복수의 중합체 모이어티를 포함하며; 복수의 중합체 모이어티의 적어도 90%는 고해상도 전자분무 이온화 질량 분석법(ESI-HRMS)에 의해 결정되는 바와 같이 복수의 변형된 IL-18 폴리펩티드의 피크 분자량의 ±500 Da 이내인 분자량을 갖는 것인 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단이 본원에 기재된다.
일부 실시양태에서, 복수의 중합체 중 적어도 75%는 고분해능 전기분무 이온화 질량 분석법(ESI-HRMS)에 의해 결정되는 바와 같이 복수의 중합체의 피크 분자량의 ±10% 이내인 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 중합체 모이어티 또는 복수의 중합체 모이어티는 아미노산 잔기 68에서 변형된 IL-18 폴리펩티드에 공유 결합되며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 아미노산 잔기 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 중합체 모이어티 또는 복수의 중합체 모이어티는 아미노산 잔기 69에서 변형된 IL-18 폴리펩티드에 공유 결합되며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 아미노산 잔기 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 중합체 모이어티 또는 복수의 중합체 모이어티는 아미노산 잔기 70에서 변형된 IL-18 폴리펩티드에 공유 결합되며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 아미노산 잔기 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 중합체 모이어티 또는 복수의 중합체 모이어티는 C68에서 변형된 IL-18 폴리펩티드에 공유 결합되며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 아미노산 잔기 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 중합체 모이어티 또는 복수의 중합체 모이어티는 E69에서 변형된 IL-18 폴리펩티드에 공유 결합되며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 아미노산 잔기 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 중합체 모이어티 또는 복수의 중합체 모이어티는 E69C에서 변형된 IL-18 폴리펩티드에 공유 결합되며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 아미노산 잔기 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 중합체 모이어티 또는 복수의 중합체 모이어티는 K70에서 변형된 IL-18 폴리펩티드에 공유 결합되며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 아미노산 잔기 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 중합체 모이어티 또는 복수의 중합체 모이어티는 K70C에서 변형된 IL-18 폴리펩티드에 공유 결합되며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 아미노산 잔기 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다.
일부 실시양태에서, 복수의 변형된 IL-18 폴리펩티드의 각각의 변형된 IL-18 폴리펩티드는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 E06, K53, Y01, S55, F02, D54, C38, T63, C68, C76, C127, 및 K70으로부터 선택된 잔기 위치에 위치하며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 E06, K53, Y01, S55, F02, D54, C38, T63, C68, E69, C76, C127, 및 K70으로부터 선택된 잔기 위치에 위치하며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 E06K, K53A, Y01G, S55A, F02A, D54A, C38S, T63A, C68S, C76S, C127S, 및 K70C로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 E06K, K53A, Y01G, S55A, F02A, D54A, C38S, T63A, C68S, E69C, C76S, C127S, 및 K70C로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 E06K 및 K53A이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 E06K, K53A, 및 T63A이다.
일부 실시양태에서, 집단은 적어도 1 ㎍, 적어도 10 ㎍, 또는 적어도 1 mg의 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 집단은 적어도 100개, 적어도 1000개, 또는 적어도 1000개의 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 수 평균 분자량에 대한 중량 평균 분자량의 비율은 최대 1.1이다.
일부 실시양태에서, 복수의 중합체 각각은 수용성 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 폴리(알킬렌 옥시드), 다당류, 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알코올), 폴리옥사졸린, 폴리(아크릴로일모르폴린), 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.
일부 실시양태에서, 복수의 중합체의 중량 평균 분자량은 약 200 Da 내지 약 50,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 복수의 중합체의 중량 평균 분자량은 약 10,000 Da 내지 약 30,000 Da이다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 IFNγ 생성을 조절하고, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 IFNγ 유도 능력의 EC50(nM)은 서열 번호 1의 IL-18 폴리펩티드의 EC50(nM)보다 10배 미만 더 높거나, 5배 미만 더 높거나, 더 낮다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드의 IFNγ 유도 능력의 EC50(nM)은 서열 번호 1의 EC50(nM)보다 10배 미만 더 크다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드의 IFNγ 유도 능력의 EC50(nM)은 서열 번호 1의 IL-18 폴리펩티드의 EC50(nM)보다 더 작다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드의 IFNγ 유도 능력의 EC50(nM)은 서열 번호 1의 IL-18 폴리펩티드의 EC50(nM)보다 적어도 약 10배 더 작다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 IFNγ 생성을 조절하고, 여기서 IFNγ에 대한 변형된 IL-18 폴리펩티드의 EC50(nM)은 서열 번호 1의 IL-18 폴리펩티드의 EC50(nM)보다 더 작다. 일부 실시양태에서, IFNγ에 대한 변형된 IL-18 폴리펩티드의 EC50(nM)은 서열 번호 1의 IL-18 폴리펩티드의 EC50(nM)보다 적어도 10배 더 작다. 일부 실시양태에서, IFNγ에 대한 변형된 IL-18 폴리펩티드의 EC50(nM)은 서열 번호 1의 IL-18 폴리펩티드의 EC50(nM)보다 약 10배 더 작다. 일부 실시양태에서, IFNγ에 대한 변형된 IL-18 폴리펩티드의 EC50(nM)은 서열 번호 1의 IL-18 폴리펩티드의 EC50(nM)보다 약 15배 더 작다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 서열 번호 2-58과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 서열 번호 2-83과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 서열은 서열 번호 2 또는 서열 번호 18과 적어도 약 80% 동일하다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 서열은 서열 번호 2와 적어도 약 80% 동일하다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 서열은 서열 번호 2와 적어도 약 90% 동일하다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 서열은 서열 번호 2와 적어도 약 95% 동일하다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 서열은 서열 번호 18과 적어도 약 80% 동일하다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 서열은 서열 번호 18과 적어도 약 90% 동일하다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 서열은 서열 번호 18과 적어도 약 95% 동일하다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 KD에 의해 측정되는 바와 같이 IL-18 결합 단백질(IL-18BP)에 대해보다 IL-18 수용체 알파 서브유닛(IL-18Rα)에 대해 10배 미만 더 낮은 친화도, 5배 미만 더 낮은 친화도, 또는 더 큰 친화도를 나타내고, 여기서 [KD IL-18Rα]/[KD IL-18BP]는 0.1보다 크다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 IL-18 수용체 알파(IL-18Rα)에 결합한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 약 200 nM 미만, 약 100 nM 미만, 또는 약 50 nM 미만의 KD로 IL-18Rα에 결합한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 약 10 nM 미만의 KD로 IL-18Rα에 결합한다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 KD에 의해 측정되는 바와 같이 IL-18 결합 단백질(IL-18BP)에 대해보다 IL-18 수용체(IL-18R)에 대해 더 큰 친화도를 나타내고, 여기서 [KD IL-18R]/[KD IL-18BP]는 0.1보다 작다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 IL-18 수용체 알파(IL-18Rα)에 결합한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 약 50 nM 미만의 KD로 IL-18Rα에 결합한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 약 10 nM 미만의 KD로 IL-18Rα에 결합한다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 IL-18 수용체 알파/베타(IL-18Rα/β) 이종이량체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 약 10 nM 미만의 KD로 IL-18Rα/β 이종이량체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 약 2 nM 미만의 KD로 IL-18Rα/β 이종이량체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 추가 펩티드에 접합된다.
한 측면에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함하는 숙주 세포가 본원에 기재된다.
한 측면에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드의 생산 방법이 본원에 기재되며, 상기 방법은 변형된 IL-18 폴리펩티드를 숙주 세포에서 발현시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 포유동물 세포, 조류 세포, 진균 세포, 또는 곤충 세포이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 CHO 세포, COS 세포, 또는 효모 세포이다.
한 측면에서, a) 변형된 IL-18 폴리펩티드 또는 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단; 및 b) 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물이 본원에 기재된다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 동결건조된 형태이다.
한 측면에서, 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 약학적 유효량의 변형된 IL-18 폴리펩티드 또는 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다.
일부 실시양태에서, 암은 고형암이다. 일부 실시양태에서, 고형암은 신장암, 피부암, 방광암, 골암, 뇌암, 유방암, 결장직장암, 식도암, 안암, 두경부암, 폐암, 난소암, 췌장암, 또는 전립선 암이다. 일부 실시양태에서, 고형암은 전이성 신세포 암종 또는 흑색종이다. 일부 실시양태에서, 고형암은 암종 또는 육종이다.
일부 실시양태에서, 암은 혈액암이다. 일부 실시양태에서, 혈액암은 백혈병, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 또는 다발성 골수종이다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 변형된 IL-18 폴리펩티드 또는 약학 조성물의 동결건조된 형태를 재구성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 펩티드에 접합된다.
한 측면에서, 합성 IL-18 폴리펩티드로서, 잔기 21-41, 잔기 60-80, 및 잔기 106-126의 영역으로부터 선택된 위치에서 호모세린(Hse) 잔기를 포함하는 합성 IL-18 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 하는 것인 합성 IL-18 폴리펩티드가 본원에 제공된다.
일부 실시양태에서, 합성 IL-18 폴리펩티드는 잔기 21-41, 잔기 60-80, 및 잔기 106-126의 각각의 영역에 Hse 잔기를 포함한다.
일부 실시양태에서, 합성 IL-18 폴리펩티드는 위치 31에 Hse 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 합성 IL-18 폴리펩티드는 위치 63 또는 위치 75에서 Hse 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 합성 IL-18 폴리펩티드는 위치 63에서 Hse 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 합성 IL-18 폴리펩티드는 위치 75에서 Hse 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 합성 IL-18 폴리펩티드는 위치 116에서 Hse 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 합성 IL-18 폴리펩티드는 위치 63 및 75 중 적어도 하나, 위치 31, 및 위치 116에서 Hse 잔기를 포함한다.
일부 실시양태에서, 합성 IL-18 폴리펩티드는 서열 번호 1에서 적어도 하나의 메티오닌 잔기의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열 번호 1에서 적어도 하나의 메티오닌 잔기의 아미노산 치환은 M33, M51, M60, M86, M113, 또는 M150에서 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 합성 IL-18 폴리펩티드는 적어도 3개의 메티오닌 잔기의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 합성 IL-18 폴리펩티드는 적어도 5개의 메티오닌 잔기의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 합성 IL-18 폴리펩티드는 적어도 6개의 메티오닌 잔기의 치환을 포함한다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 메티오닌 잔기는 O-메틸-호모세린(Omh) 잔기로 치환된다. 일부 실시양태에서, 적어도 3개의 메티오닌 잔기는 Omh 잔기로 치환된다. 일부 실시양태에서, 적어도 5개의 메티오닌 잔기는 Omh 잔기로 치환된다. 일부 실시양태에서, 각각의 메티오닌 치환은 노르류신 또는 Omh 잔기로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 각각의 메티오닌 치환은 Omh 잔기로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 서열 번호 1의 각각의 메티오닌 잔기는 Omh 잔기로 치환된다.
일부 실시양태에서, 합성 IL-18 폴리펩티드는 서열 번호 1에 대해 추가 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 합성 IL-18 폴리펩티드는 서열 번호 1의 아미노산 서열과 적어도 약 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 합성 IL-18 폴리펩티드는 합성 IL-18 폴리펩티드의 잔기에서 공유 부착되는 중합체를 포함한다.
한 측면에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드의 제조 방법으로서, a) 변형된 IL-18 폴리펩티드의 2개 이상의 단편을 합성하는 단계; b) 단편을 결찰하는 단계; 및 c) 결찰된 단편을 폴딩하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 수용성 중합체를 폴딩된 결찰된 단편에 부착시키는 단계를 추가로 포함한다.
본 개시 내용의 추가적인 측면 및 이점은 본 개시 내용의 단지 예시적인 실시양태가 제시되고 설명되는 다음의 상세한 설명으로부터 당업자에게 쉽게 명백해질 것이다. 이해되는 바와 같이, 본 개시 내용은 다른 상이한 실시양태가 가능하며, 그 몇몇 세부 사항은 모두 본 개시 내용에서 벗어나지 않고 다양하고 명백한 측면에서 변형될 수 있다. 따라서, 도면과 설명은 본질적으로 예시적인 것으로 간주되어야 하며 제한적인 것으로 간주되어서는 안 된다.
참고에 의한 포함
본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허, 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참고로 포함되는 것으로 표시된 것과 동일한 정도로 본원에 참고로 포함된다. 참고로 포함된 간행물 및 특허 또는 특허 출원이 명세서에 포함된 개시 내용과 모순되는 경우, 명세서는 이러한 모순되는 자료를 대체하고/거나 우선한다.
본 발명의 신규 특징은 특히 첨부된 청구범위에 제시되어 있다. 본 개시 내용의 특징 및 장점은 본 개시 내용의 원리가 활용되는 예시적인 실시양태를 제시하는 다음의 상세한 설명 및 다음의 첨부된 도면을 참조함으로써 더 잘 이해될 것이다:
[도 1]은 IFNγ 및 IL-18BP 생성에 대한 IL-18의 작용 기전 및 IL-18BP에 의한 IL-18 억제 활성을 예시한다.
[도 2a]는 합성 야생형 IL-18 폴리펩티드를 예시한다.
[도 2b]는 2개의 변형된 아미노산 잔기(검은색 원으로 표시됨)를 갖는 변형된 합성 IL-18 폴리펩티드를 예시한다.
[도 2c]는 중합체 모이어티를 포함하는 변형된 합성 IL-18 폴리펩티드를 예시한다.
[도 3]은 아지드를 포함하는 변형된 IL-18 폴리펩티드와 디벤조시클로옥틴(DBCO) 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 커플링을 예시한다.
[도 4]는 중합체를 포함하는 변형된 IL-18 폴리펩티드와 IL-18Rα의 결합을 예시한다.
[도 5]는 변형된 IL-18 폴리펩티드 단편을 사용하여 아지드 모이어티를 포함하는 서열 번호 26의 변형된 IL-18 폴리펩티드를 제조하기 위한 합성 반응식을 보여준다.
[도 6a]는 야생형 IL-18 폴리펩티드와 비교한 본 개시 내용의 변형된 IL-18 폴리펩티드의 IFNγ 유도 능력을 보여준다.
[도 6b]는 야생형 IL-18 폴리펩티드와 비교한 본 개시 내용의 변형된 IL-18 폴리펩티드의 IL-18BP 억제를 보여준다.
[도 7]은 대조군(채워진 원, 실선); 대조군 + IL-18BP(반 열린 원, 점선); 서열 번호 1의 IL-18 폴리펩티드(채워진 삼각형, 실선); 서열 번호 1의 IL-18 폴리펩티드 + IL-18BP(열린 삼각형, 점선); 서열 번호 2의 변형된 IL-18 폴리펩티드(채워진 마름모, 실선); 및 서열 번호 2의 변형된 IL-18 폴리펩티드 + IL-18BP(반 열린 삼각형, 점선)의 EC50 값을 비교한다.
[도 8]은 IL-18 단편을 사용하여 서열 번호 24의 변형된 IL-18 폴리펩티드를 합성하기 위한 합성 반응식을 보여준다.
[도 9]는 K70에 아지드 모이어티를 포함하는 IL-18 단편을 사용하여 변형된 IL-18 폴리펩티드를 합성하기 위한 합성 반응식을 보여준다.
[도 10]은 IL-18 단편을 사용하여 서열 번호 25의 변형된 IL-18 폴리펩티드를 합성하기 위한 합성 반응식을 보여준다.
[도 11]은 IL-18 단편을 사용하여 서열 번호 31의 변형된 IL-18 폴리펩티드를 합성하기 위한 합성 반응식을 보여준다.
[도 12]는 변형된 IL-18 폴리펩티드 단편을 사용하여 아지드 모이어티를 포함하는 서열 번호 32의 변형된 IL-18 폴리펩티드를 제조하기 위한 합성 반응식을 보여준다.
[도 13]은 IL-18 단편을 사용하여 서열 번호 33의 변형된 IL-18 폴리펩티드를 제조하기 위한 합성 반응식을 보여준다.
[도 14]는 변형된 IL-18 폴리펩티드 단편을 사용하여 아지드 모이어티를 포함하는 서열 번호 34의 변형된 IL-18 폴리펩티드를 제조하기 위한 합성 반응식을 보여준다.
[도 15]는 변형된 IL-18 폴리펩티드 단편을 사용하여 아스파르테이트 잔기로 치환된 잔기 70에서 공유 부착된 PEG-아지드 모이어티를 포함하는 변형된 IL-18 폴리펩티드를 제조하기 위한 합성 반응식을 보여준다.
[도 16]은 변형된 IL-18 폴리펩티드 단편을 사용하여 아지드 모이어티를 포함하는 서열 번호 62의 변형된 IL-18 폴리펩티드를 제조하기 위한 합성 반응식을 보여준다.
[도 17]은 다양한 아미노산 잔기에 공유 부착된 PEG 아지드 기를 포함하는 변형된 IL-18 폴리펩티드를 제조하는 데 사용될 수 있는 일반적인 합성 반응식을 보여준다.
[도 18]은 본원에 제공되는 IL-18 폴리펩티드에 대한 이작용성 프로브의 커플링의 개략도를 보여준다.
[도 19]는 이작용성 프로브로 활성화된 IL-18 폴리펩티드에 대한 폴리(에틸렌 글리콜) 모이어티의 커플링의 개략도를 보여준다.
[도 20]은 마우스 모델에서 지시된 IL-18 폴리펩티드 투여 후 다양한 시점에서의 인터페론 감마(IFNγ) 수준을 나타낸다.
[도 21]은 마우스 모델에서 지시된 IL-18 폴리펩티드의 투여 후 다양한 시점에서의 C-X-C 모티프 케모카인 리간드 10(CXCL10) 수준을 나타낸다.
[도 22]는 인간 IL-18 및 지시된 변이체로 PBMC를 24시간 자극한 후 IFNγ, IL1β, TNFα, IL-6, IL-10, 및 IL-12p70의 시험관 내 유도를 나타낸다.
[도 23]은 인간 IL-18 및 지시된 변이체로 72시간 자극 시 인간 CD3-/CD56+ NK 세포 상에서 CD16의 표면 발현을 나타낸다.
종양에 대한 면역 반응은 주로 T 헬퍼 1형(Th1) 림프구의 기능이다. Th1 반응에는 사이토카인 IL-2, IL-12, IL-18, IFNγ의 분비, 및 특정 종양 항원을 인식하는 특정 세포독성 T 림프구의 생성이 포함된다. Th1 반응은 많은 미생물에 대한 숙주 방어의 중요한 부분이다. 그러나 Th1 반응은 자가면역 질환 및 장기 이식 거부와도 관련이 있다.
인터류킨 18(IL-18)은 감염이나 손상 후 숙주 방어와 염증을 개시하거나 촉진하는 생물학적 활성을 유도하는 염증 유발성(pro-inflammatory) 사이토카인이다. IL-18은 자가면역 질환, 심근 기능, 폐기종, 대사 증후군, 건선, 염증성 장 질환, 혈구 식세포 증후군, 대식세포 활성화 증후군, 패혈증, 및 급성 신장 손상과 관련되어 있다. 일부 질환 모델에서, IL-18은 보호 역할을 한다.
IL-18은 또한 T 세포와 자연 살해 세포로부터 IFNγ 생성에 있어 중요한 역할을 한다. IFNγ는 주로 T 세포, NK 세포, 및 대식세포에 의해 생성되는 Th1 사이토카인이며, 바이러스, 일부 세균, 및 원충 감염에 대한 선천 및 적응 면역에 중요하다. IFNγ는 또한 대식세포의 중요한 활성제이자 II형 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 분자 발현의 유도제이다.
IL-18은 성숙한 IL-18에 대한 리간드 결합 사슬인 IL-18 알파 사슬(IL-18Rα)에 결합하여 신호 전달 복합체를 형성한다. 그러나 IL-18의 IL-18Rα에 대한 결합 친화도는 낮다. 보조 수용체인 IL-18 수용체 베타 사슬(IL-18Rβ)을 발현하는 세포에서, 고친화성 이종이량체 복합체가 형성된 후 세포 신호 전달을 활성화한다.
IL-18의 활성은 고친화성 자연 발생 IL-18 결합 단백질(IL-18BP)의 존재에 의해 균형을 이룬다. IL-18BP는 IL-18에 결합하여 IL-18의 생물학적 활성을 중화한다. 세포 표면 IL-18Rα는 IL-18 결합에 대해 IL-18BP와 경쟁한다. 증가된 질환 중증도의 증가는 IL-18과 IL-18BP의 불균형과 연관될 수 있어 유리 IL-18 수준이 순환계에서 상승한다. [도 1]은 IL-18의 작용 메커니즘, IFNγ 생성, IL-18BP 생성, 및 IL-18BP에 의한 IL-18 활성 억제를 예시한다. IL-18은 IFNγ 생성을 유도하고, 이는 차례로 IL-18BP 생성을 유도한다. 그런 다음 IL-18BP는 IL-18Rα와 경쟁하여 IL-18 활성을 억제한다.
다음의 설명 및 실시예는 본 개시 내용의 실시양태를 상세히 예시한다. 본 개시 내용은 본원에 기재된 특정 실시양태에 제한되지 않으며, 따라서 변경될 수 있음을 이해해야 한다. 당업자는 본 개시 내용의 범위 내에 포함되는 본 개시 내용의 다양한 변형 및 수정이 있음을 인식할 것이다.
본 개시 내용의 다양한 특징이 단일 실시양태의 맥락에서 설명될 수 있지만, 그 특징은 또한 개별적으로 또는 임의의 적절한 조합으로 제공될 수 있다. 역으로, 본원에서는 명확성을 위해 별도의 실시양태의 맥락에서 본 개시 내용을 설명할 수 있지만, 본 개시 내용은 단일 실시양태로 구현될 수도 있다.
본원에 사용된 섹션 제목은 구성 목적으로만 사용되며 설명된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
I. 정의
모든 용어는 당업자에 의해 이해되는 대로 이해되도록 의도된다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시 내용이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
다음 정의는 해당 기술 분야의 정의를 보완하고 현재 출원에 관한 것이며, 관련되거나 관련되지 않은 사례, 예를 들어 공동 소유의 특허 또는 출원에 귀속되지 않는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 개시 내용의 테스트를 위한 실시에 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본원에 기재되어 있다. 따라서, 본원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시양태를 설명하기 위한 것으로, 한정하려는 의도는 아니다.
본원에 사용된 용어는 단지 특정한 경우를 설명하기 위한 것이며 한정하려는 의도는 아니다. 본 출원에서, 단수의 사용은 특별히 달리 언급하지 않는 한 복수를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 단수형 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 명백하게 달리 나타내지 않는 한 복수형도 포함하는 것으로 의도된다.
본 출원에서, "또는"의 사용은 달리 명시되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "및/또는" 및 "이들의 임의의 조합" 및 이들의 문법적 상당 어구는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 이들 용어는 임의의 조합이 구체적으로 고려된다는 것을 전달할 수 있다. 단지 예시 목적으로, 다음 어구 "A, B, 및/또는 C" 또는 "A, B, C, 또는 이들의 조합"은 " A 개별적으로; B 개별적으로; C 개별적으로; A와 B; B와 C; A와 C; 및 A, B, 및 C"를 의미할 수 있다. "또는"이라는 용어는 문맥에서 특별히 분리적인 사용을 언급하지 않는 한 결합적으로 또는 분리적으로 사용될 수 있다.
용어 "약" 또는 "대략"은 당업자에 의해 결정되는 특정 값에 대한 허용 가능한 오차 범위 내를 의미할 수 있으며, 이는 부분적으로 값이 측정 또는 결정되는 방식, 즉 측정 시스템의 한계에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, "약"은 해당 분야의 관례에 따라 1 또는 1 초과 이내의 표준 편차를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 최대 20%, 최대 15%, 최대 10%, 최대 5%, 또는 최대 1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 공정과 관련하여, 상기 용어는 값의 10배 이내, 5배 이내, 또는 2배 이내를 의미할 수 있다. 특정 값이 출원 및 청구범위에 기재되어 있는 경우, 달리 명시되지 않는 한 용어 "약"은 특정 값에 대한 허용 가능한 오차 범위 내를 의미하는 것으로 가정되어야 한다.
본 명세서 및 청구항(들)에 사용되는 바와 같이, 단어 "포함하는(comprising)"(및 "포함하다" 및 "포함한다"와 같은 "포함하는"의 모든 형태), "가지고 있는"(및 "가지다" 및 "가진다"와 같은 "갖는"의 모든 형태), "포함하는(including)"(및 "포함하다" 및 "포함한다"와 같은 "포함하는"의 모든 형태) 또는 "함유하는(containing)"(및 "함유하다" 및 "함유한다"와 같은 "함유하는"의 모든 형식)은 포괄적이거나 개방적이며, 추가의 언급되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 본 명세서에서 논의되는 임의의 실시양태는 본 개시 내용의 임의의 방법 또는 조성물과 관련하여 구현될 수 있고 그 반대도 가능하다는 것이 고려된다. 또한, 본 개시 내용의 조성물은 본 개시 내용의 방법을 달성하기 위해 사용될 수 있다.
명세서에서 "일부 실시양태", "실시양태", "일 실시양태" 또는 "다른 실시양태"에 대한 언급은 실시양태와 관련하여 설명된 특정한 특징, 구조, 또는 특성이 적어도 일부 실시양태에 포함되지만, 반드시 본 개시 내용의 모든 실시양태에 포함되지는 않는다. 본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해, 다수의 용어 및 어구가 아래에 정의된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "알파-케토 아미노산" 또는 아미노산 이름 앞의 "알파-케토"라는 어구는 아미노기를 보유하는 탄소와 아미노산의 카르복실산 사이에 위치된 케톤 작용기를 갖는 아미노산 또는 아미노산 유도체를 지칭한다. 본 개시 내용의 알파-케토 아미노산은 하기 화학식에 제시된 바와 같은 구조를 갖는다:
Figure pct00001
여기서 R은 임의의 천연 또는 비천연 아미노산의 측쇄이다. R 작용성은 표준 아미노산 명명법에 따라 L 또는 D 배향일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 알파-케토 아미노산은 L 배향이다."알파-케토"라는 어구가 전통적인 천연 아미노산(예를 들어, 알파-케토 류신, 알파-케토 페닐알라닌 등) 또는 일반적인 비천연 아미노산(예를 들어, 알파-케토 노르류신, 알파-케토 O-메틸-호모세린 등)의 이름 앞에 사용될 때, 이는 언급된 알파-케토 아미노산이 언급된 아미노산의 측쇄를 갖는 상기 화학식과 일치하는 것으로 의도된다. 알파-케토 아미노산 잔기가 본원의 펩티드 또는 폴리펩티드 서열에 제시될 때, 관련 아미노산의 보호된 버전도 포함되는 것으로 의도된다(예를 들어, C-말단 알파-케토 아미노산에서 종결되는 서열의 경우, 말단 카복실산 잔기는 tert-부틸 기와 같은 보호 기로 적절하게 캡핑될 수 있음).
용어 "약학적으로 허용 가능한"은 인간을 포함하는 동물에 사용하기 위해 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 승인될 수 있거나 미국 약전 또는 기타 일반적으로 인정되는 약전에 등재된 것을 지칭한다.
"약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 또는 희석제"는 작용제와 함께 대상체에게 투여될 수 있고 그의 약리학적 활성을 파괴하지 않으며 작용제의 치료량을 전달하기에 충분한 용량으로 투여될 때 무독성인 부형제, 담체 또는 희석제를 지칭한다.
본 개시 내용에 적합한 "약학적으로 허용 가능한 염"은 일반적으로 당업계에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 기타 문제 또는 합병증 없이 인간 또는 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하다고 간주되는 산 또는 염기 염일 수 있다. 이러한 염은 아민과 같은 염기성 잔기의 무기산 및 유기산 염뿐만 아니라 카르복실산과 같은 산성 잔기의 알칼리 또는 유기 염을 포함한다. 구체적인 약학적인 염은 염산, 인산, 브롬화수소산, 말산, 글리콜산, 푸마르산, 황산, 설팜산, 설파닐산, 포름산, 톨루엔설폰산, 메탄설폰산, 벤젠 설폰산, 에탄 디설폰산, 2-히드록시에틸 설폰산, 질산, 벤조산, 2-아세톡시벤조산, 시트르산, 타르타르산, 락트산, 스테아르산, 살리실산, 글루탐산, 아스코르브산, 파모산, 숙신산, 푸마르산, 말레산, 프로피온산, 히드록시말레산, 요오드화수소산, 페닐아세트산, 알칸산, 예컨대 아세트산, HOOC-(CH2)n-COOH(여기서 n은 0, 2, 3, 4, 또는 4임) 등과 같은 산의 염을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 마찬가지로, 약학적으로 허용 가능한 양이온에는 나트륨, 칼륨, 칼슘, 알루미늄, 리튬 및 암모늄이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 당업자는 추가의 약학적으로 허용 가능한 염이 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, p. 1418 (1985)]에 열거된 것들을 포함한다는 것을 본 개시 내용 및 당해 분야의 지식으로부터 인지할 것이다. 일반적으로, 약학적으로 허용 가능한 산 또는 염기 염은 임의의 통상적인 화학적 방법에 의해 염기성 또는 산성 모이어티를 함유하는 모 화합물로부터 합성될 수 있다. 간단히 말해서, 이러한 염은 이들 화합물의 유리산 또는 염기 형태를 적절한 용매 중에서 화학량론적 양의 적절한 염기 또는 산과 반응시켜 제조할 수 있다.
본원에 제공된 범위는 범위 내의 모든 값에 대한 속기인 것으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50으로 이루어진 군으로부터의 임의의 수, 수의 조합, 또는 하위 범위 뿐만 아니라 예를 들어 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 및 1.9와 같이 앞서 언급한 정수 사이의 모든 중간 소수점 값을 포함하는 것으로 이해된다. 하위 범위와 관련하여, 범위의 종점에서 확장되는 "내포된 하위 범위"가 구체적으로 고려된다. 예를 들어, 1 내지 50의 예시적인 범위의 내포된 하위 범위는 한 방향으로 1 내지 10, 1 내지 20, 1 내지 30, 및 1 내지 40을 포함하거나, 또는 다른 방향으로 50 내지 40, 50 내지 30, 50 내지 20, 및 50에서 10을 포함할 수 있다.
"대상체"라는 용어는 치료, 관찰, 또는 실험의 대상이 되는 동물을 지칭한다. 단지 예로서, 대상체는 인간 또는 비인간 포유동물, 예컨대 비인간 영장류, 소, 말, 개, 양, 또는 고양이를 포함하지만 이에 제한되지 않는 비인간 포유동물을 포함한다.
"선택적" 또는 "선택적으로"라는 용어는 이후에 설명되는 이벤트 또는 상황이 발생할 수 있지만 반드시 발생할 필요는 없으며 설명에는 이벤트 또는 상황이 발생하는 경우와 발생하지 않는 경우가 포함됨을 나타낸다.
용어 "모이어티"는 분자의 특정 세그먼트 또는 작용기를 지칭한다. 화학 모이어티는 종종 분자에 내장되거나 부착된 인식되는 화학 엔티티(entity)이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "수 평균 분자량"(Mn)이라는 용어는 샘플 내의 모든 개별 단위의 통계적 평균 분자량을 의미하며, 하기 식 (1)로 정의된다:
Figure pct00002
여기서 Mi는 단위의 분자량이고 Ni는 해당 분자량의 단위 수이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "중량 평균 분자량"(Mw)은 하기 식 (2)로 정의되는 수를 의미한다:
Figure pct00003
여기서 Mi는 단위의 분자량이고 Ni는 해당 분자량의 단위 수이다.
본원에 사용되는 바와 같이, "피크 분자량"(Mp)은 주어진 분석 방법(예를 들어, 질량 분석법, 크기 배제 크로마토그래피, 동적 광 산란, 분석 원심분리 등)에서 가장 높은 피크의 분자량을 의미한다.
II. 변형된 IL-18 폴리펩티드
본 개시 내용은 치료제로서 유용한 변형된 IL-18 폴리펩티드에 관한 것이다. 본원에서 제공되는 변형된 IL-18 폴리펩티드는 면역치료로서 또는 다른 면역치료 요법의 일부로서 사용될 수 있다. 이러한 변형된 IL-18 폴리펩티드는 야생형 IL-18과 상이한 IL-18 수용체(IL-18R)에 대한 결합 특성을 나타낼 수 있다.
한 측면에서, 본원에 기재된 변형된 IL-18 폴리펩티드는 IL-18Rα 또는 IL-18Rβ에 대해 증가된 친화도를 갖는다. 한 측면에서, 본원에 기재된 변형된 IL-18 폴리펩티드는 IL-18Rα 또는 IL-18Rβ에 대해 감소된 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 IL-18Rα/β 이종이량체에 대해 증가된 친화도를 갖는다. 한 측면에서, 본원에 기재된 변형된 IL-18 폴리펩티드는 IL-18Rα/β 이종이량체에 대해 감소된 친화도를 갖는다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드와 IL-18Rα 사이의 결합 친화도는 야생형 IL-18과 IL-18Rα 사이의 결합 친화도와 동일하거나 그보다 더 낮다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드와 IL-18Rα 사이의 결합 친화도는 야생형 IL-18과 IL-18Rα 사이의 결합 친화도와 동일하거나 그보다 더 높다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드와 IL-18R β 사이의 결합 친화도는 야생형 IL-18과 IL-18R β 사이의 결합 친화도와 동일하거나 그보다 더 낮다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드와 IL-18R β 사이의 결합 친화도는 야생형 IL-18과 IL-IL-18R β 사이의 결합 친화도와 동일하거나 그보다 더 높다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드와 IL-18Rα/β 이종이량체 사이의 결합 친화도는 야생형 IL-18과 IL-18R α/β 이종이량체 사이의 결합 친화도와 동일하거나 그보다 더 낮다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드와 IL-18R α/β 이종이량체 사이의 결합 친화도는 야생형 IL-18과 IL-18R α/β 이종이량체 사이의 결합 친화도와 동일하거나 그보다 더 높다. [도 2a] 합성 야생형 IL-18 폴리펩티드를 예시한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 변형된 IL-18 폴리펩티드는 대상체에게 투여된 후 인터페론 감마(IFNγ) 생성을 유도하는 능력을 나타낸다. 일부 실시양태에서, IFNγ를 유도하는 능력은 야생형 IL-18의 능력과 비슷하다(예를 들어, 야생형 IL-18의 EC50의 약 10배 이내인 IFNγ 유도에 대한 EC50을 나타냄). 이러한 특징을 나타내는 본원에서 제공되는 예시적인 IL-18 폴리펩티드는 [도 6a]에 도시되어 있으며, 이는 야생형 대 변형된 IL-18 폴리펩티드(뮤테인)(nM, x축)의 농도의 함수로서 IFNγ 생성(ng/mL, y축)의 비교를 보여준다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 변형된 IL-18 폴리펩티드는 또한 IL-18 결합 단백질(IL-18BP)에 대해 감소된 결합을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 변형된 IL-18 폴리펩티드는 IL-18BP의 존재 하에서도 IFNγ를 유도할 수 있다(예를 들어, 변형된 IL-18 폴리펩티드의 IFNγ 유도 능력은 IL-18BP의 존재에 의해 실질적으로 억제되지 않음)(nM, x축). 야생형 IL-18과 비교하여 이러한 특성을 갖는 IL-18 폴리펩티드의 예는 [도 6b]에 도시되어 있으며, 이는 동일한 수준의 야생형 IL-18(원) 또는 본원에서 제공되는 변형된 IL-18 폴리펩티드(역삼각형)로 처리된 샘플에서 IL-18BP 농도(nM, x축)의 함수로서 IFNγ 생성(ng/mL, y축)을 보여준다. 특히, 본원에서 제공되는 변형된 IL-18 폴리펩티드는 IL-18BP의 존재 하에서 IFNγ를 유도하는 능력에 있어 억제를 나타내지 않았던 반면, 야생형 IL-18은 IL-18BP의 농도가 증가함에 따라 이러한 능력의 실질적 감소를 나타냈다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 변형된 IL-18 폴리펩티드는 야생형 IL-18과 비교하여 IFNγ 생성을 유도하는 유사하거나 약간만 감소된 능력을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 변형된 IL-18 폴리펩티드는 야생형 IL-18과 비교하여 IL-18BP의 존재 하에서 IFNγ 생성을 유도하는 능력의 억제에 있어 상당한 감소를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 변형된 IL-18 폴리펩티드는 야생형 IL-18과 비교하여 IFNγ 생성을 유도하는 유사하거나 단지 약간 감소된 능력을 나타내고, 야생형 IL-18과 비교하여 IL-18BP의 존재 하에서 IFNγ 생성을 유도하는 능력의 억제에 있어 상당한 감소를 나타낸다.
본원에 기재된 바와 같은 변형된 IL-18 폴리펩티드는 하나 이상의 비표준 아미노산을 포함할 수 있다. "비표준" 아미노산은 일반적으로 자연 발생 단백질에 포함되는 20개의 표준 아미노산에 속하지 않는 D- 또는 L-형태의 아미노산 잔기를 지칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산은 하나 이상의 비표준 아미노산으로 치환된다. 비표준 아미노산에는 N-알파-(9-플루오레닐메틸옥시카르보닐)-L-아지도리신(Fmoc-L-Lys(N3)-OH), N-알파-(9-플루오레닐메틸옥시카르보닐)-L-비페닐알라닌(Fmoc-L-Bip-OH), 및 N-알파-(9-플루오레닐메틸옥시카르보닐)-O-벤질-L-티로신(Fmoc-L-Tyr(Bzl)-OH가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
예시적인 비표준 아미노산은 아지도-리신(AzK), 히드록시리신, 알로-히드록시리신, ε-N,N,N-트리메틸리신, ε-N-아세틸리신, 5-히드록시리신, Fmoc-Lys(Me, Boc), Fmoc-Lys(Me)3, Fmoc-Lys(팔미토일), Fmoc-L-포토-리신, DL-5-히드록시리신, H-L-포토-리신, 및/또는 기타 유사한 아미노산을 포함한다. 비표준 아미노산의 예는 또한 D-메티오닌, 셀레노시스테인, 및/또는 다른 유사한 아미노산을 포함한다.
예시적인 비표준 아미노산은 또한 p-아세틸-L-페닐알라닌, p-요오도-L-페닐알라닌, p-메톡시페닐알라닌, O-메틸-L-티로신, p-프로파르길옥시페닐알라닌, p-프로파르길-페닐알라닌, L-3-(2-나프틸)알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, O-4-알릴-L-티로신, 4-프로필-L-티로신, 트리-O-아세틸-GlcNAcp-세린, L-도파, 플루오르화 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌, p-보로노페닐알라닌, O-프로파르길티로신, L-포스포세린, 포스포노세린, 포스포노티로신, p-브로모페닐알라닌, p-아미노-L-페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, 티로신 아미노산의 유사체; 글루타민 아미노산의 유사체; 페닐알라닌 아미노산의 유사체; 세린 아미노산의 유사체; 트레오닌 아미노산의 유사체; 알킬, 아릴, 아실, 아지도, 시아노, 할로, 히드라진, 히드라지드, 히드록실, 알케닐, 알키닐, 에테르, 티올, 설포닐, 셀레노, 에스테르, 티오산, 보레이트, 보로네이트, 포스포, 포스포노, 포스핀, 헤테로시클릭, 에논, 이민 , 알데히드, 히드록실아민, 케토, 또는 아미노 치환된 아미노산, β-아미노산; 프롤린 또는 히스티딘 이외의 시클릭 아미노산; 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판 이외의 방향족 아미노산; 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비표준 아미노산은 β-아미노산, 호모아미노산, 시클릭 아미노산 및 유도체화된 측쇄를 갖는 아미노산으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 비표준 아미노산은 β-알라닌, β-아미노프로피온산, 피페리딘산, 아미노카프로산, 아미노헵탄산, 아미노피멜산, 데스모신, 디아미노피멜산, Nα-에틸글리신, Nα-에틸아스파르긴, 이소데스모신, 알로-이소류신, ω-메틸아르기닌, Nα-메틸글리신, Nα-메틸이소류신, Nα-메틸발린, γ-카르복시글루타메이트, O-포스포세린, Nα-아세틸세린, Nα-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 및/또는 기타 유사한 아미노산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드의 아미노산 잔기는 변형된 리신 잔기로 치환된다. 일부 실시양태에서, 변형된 리신 잔기는 아미노, 아지드, 알릴, 에스테르, 및/또는 아미드 작용기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 리신 잔기는 변형된 IL-18 폴리펩티드에 추가 모이어티를 부착하기 위한 유용한 고정점 역할을 할 수 있는 접합 핸들을 함유한다. 일부 실시양태에서, 변형된 리신 잔기는 전구체 구조 1, 구조 2, 구조 3, 또는 구조 4로부터 구축된 구조를 갖는다:
Figure pct00004
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 변형된 IL-18 폴리펩티드에 대한 다양한 페이로드(예를 들어, 중합체)의 부착 또는 접합 반응을 촉진하는데 사용될 수 있는 추가의 작용기의 부착에 사용될 수 있는 변형된 아미노산 잔기로 치환을 포함한다. 치환은 추가적인 작용기의 부착에 보다 용이한 자연 발생 아미노산(예를 들어, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 리신, 세린, 트레오닌, 또는 티로신), 임의의 천연 아미노산의 변형된 버전의 유도체, 임의의 비천연 아미노산(예를 들어, 아지드, 알킨 등과 같은 CLICK 화학 시약과 같은 원하는 반응 기를 함유하는 아미노산)으로 이루어질 수 있다. 이러한 변형된 아미노산 잔기의 비제한적 예는 하기에 제공된 변형된 리신, 글루탐산, 아스파르트산, 및 시스테인을 포함한다:
Figure pct00005
Figure pct00006
여기서 각 n은 1-30의 정수이다. 변형된 아미노산 잔기의 이러한 비제한적인 예는 변형된 IL-18 폴리펩티드에 추가적인 작용성(예를 들어, 중합체)을 추가하는 것이 바람직한 임의의 위치에서 사용될 수 있다.
부위 특이적 변형
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 변형된 IL-18 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 잔기에서 하나 이상의 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 야생형 인간 IL-18 폴리펩티드를 기준으로 한다.
본원에 기재된 폴리펩티드에 대한 변형은 돌연변이, 다양한 작용성의 추가, 아미노산의 결실, 아미노산의 첨가, 또는 단백질 또는 단백질 단편의 야생형 버전의 임의의 다른 변경을 포함한다. 폴리펩티드에 추가될 수 있는 작용성에는 중합체, 링커, 알킬 기, 발색단 또는 형광단과 같은 검출 가능한 분자, 반응성 작용기 또는 이들의 조합이 포함된다. 일부 실시양태에서, 작용성은 폴리펩티드의 개별 아미노산에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 작용성은 폴리펩티드에 부위 특이적으로 첨가된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 변형된 IL-18 폴리펩티드는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 변형된 아미노산 잔기를 함유한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 변형된 IL-18 폴리펩티드는 1개의 변형된 아미노산 잔기를 함유한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 변형된 IL-18 폴리펩티드는 2개의 변형된 아미노산 잔기를 함유한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 변형된 IL-18 폴리펩티드는 3개의 변형된 아미노산 잔기를 함유한다. [도 2b]는 2개의 변형된 아미노산 잔기를 갖는 변형된 합성 IL-18 폴리펩티드를 예시한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 변형된 IL-18 폴리펩티드는 본원에서 제공되는 서열 번호 2-58 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 서열 번호 2-58 중 어느 하나의 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 변형된 IL-18 폴리펩티드는 본원에서 제공되는 서열 번호 2-83 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 서열 번호 2-83 중 어느 하나의 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 서열 번호 2의 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 서열 번호 7의 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 서열 번호 18의 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열 동일성은 매트릭스(Matrix) BLOSUM62, 갭 비용(Gap Costs) 존재(Existence):11, 연장(Extension):1, 및 조성 조절 조건부 조성 점수 매트릭스 조절(Conditional Compositional Score Matrix Adjustment)의 매개변수를 사용하여 단백질-단백질 BLAST 알고리즘에 의해 측정된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 변형된 IL-18 폴리펩티드는 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 또는 적어도 9개의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 3 내지 9개의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 3 또는 4개의 아미노산 치환, 3 내지 5개의 아미노산 치환, 3 내지 6개의 아미노산 치환, 3 내지 7개의 아미노산 치환, 3 내지 9개의 아미노산 치환, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 4 내지 6개의 아미노산 치환, 4 내지 7개의 아미노산 치환, 4 내지 9개의 아미노산 치환, 5 또는 6개의 아미노산 치환, 5 내지 7개의 아미노산 치환, 5 내지 9개의 아미노산 치환, 6 또는 7개의 아미노산 치환, 6 내지 9개의 아미노산 치환, 또는 7 내지 9개의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 3개의 아미노산 치환, 4개의 아미노산 치환, 5개의 아미노산 치환, 6개의 아미노산 치환, 7개의 아미노산 치환, 또는 9개의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 최대 4개의 아미노산 치환, 5개의 아미노산 치환, 6개의 아미노산 치환, 7개의 아미노산 치환, 또는 9개의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 변형된 IL-18 폴리펩티드는 제2 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 제3 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 제2 및 제3 변형을 포함한다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 인간 IL-1837-193(서열 번호 1)의 서열을 기준으로 아미노산 잔기 1-127 범위에서 2개의 변형을 포함한다. 서열 번호 1은 IL-18의 생물활성 형태를 반영한다. 내재적으로, IL-18은 초기에 생물학적 활성을 매개하기 위해 카스파제에 의해 절단되는 N-말단에 추가 36개 아미노산 세그먼트를 가지고 발현된다. 일부 실시양태에서, 하나의 변형은 서열 번호 1을 기준으로 하여 아미노산 잔기 6-63의 범위에 있다. 일부 실시양태에서, 하나의 변형은 아미노산 잔기 6에 있다. 일부 실시양태에서, 하나의 변형은 아미노산 잔기 53-63의 범위에 있다. 일부 실시양태에서, 하나의 변형은 아미노산 잔기 53에 있다. 일부 실시양태에서, 하나의 변형은 아미노산 잔기 63에 있다.
한 측면에서, E06K 및 K53A를 포함하는 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함하는 변형된 인터류킨-18(IL-18) 폴리펩티드가 본원에 기재되며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 T63A를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 Y01X, S55X, F02X, D54X, C38X, C68X, C76X, C127X, 또는 K70X 중 적어도 하나를 추가로 포함하며, 여기서 X는 아미노산 또는 아미노산 유도체이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 Y01X, S55X, F02X, D54X, C38X, C68X, E69X, C76X, C127X, 또는 K70X 중 적어도 하나를 추가로 포함하며, 여기서 각각의 X는 독립적으로 아미노산 또는 아미노산 유도체이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 Y01G, S55A, F02A, D54A, C38S, C68S, C76S, C127S, 또는 K70C 중 적어도 하나를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 Y01G, S55A, F02A, D54A, C38S, C38A, C68S, C68A, C76S, C76A, C127S, C127A, 또는 K70C 중 적어도 하나를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 Y01X, F02X, E06X, S10X, V11X, D17X, C38X, M51X, K53X, D54X, S55X, T63X, C68X, K70X, C76X, 및 C127X 로부터 선택된 서열 번호 1의 아미노산 서열에 대한 적어도 하나의 변형을 포함하며, 여기서 X는 천연 또는 비천연 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 Y01X, F02X, E06X, S10X, V11X, D17X, C38X, M51X, K53X, D54X, S55X, T63X, C68X, E69X, K70X, C76X, 및 C127X 로부터 선택된 서열 번호 1의 아미노산 서열에 대한 적어도 하나의 변형을 포함하며, 여기서 각각의 X는 독립적으로 천연 또는 비천연 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 Y01X, F02X, E06X, S10X, V11X, D17X, C38X, M51X, K53X, D54X, S55X, T63X, C68X, K70X, C76X, 및 C127X 로부터 선택된 서열 번호 1의 아미노산 서열에 대한 적어도 하나의 변형을 포함하며, 여기서 X는 천연 또는 비천연 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 Y01G, F02A, E06K, S10T, V11I, D17N, C38S, M51G, K53A, D54A, S55A, T63A, C68S, K70C, C76S, 및 C127S로부터 선택된 서열 번호 1의 아미노산 서열에 대한 적어도 하나의 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 Y01G, F02A, E06K, S10T, V11I, D17N, C38S, C38A, M51G, K53A, D54A, S55A, T63A, C68S, C68A, K70C, C76S, C76A, C127A, 및 C127S로부터 선택된 서열 번호 1의 아미노산 서열에 대한 적어도 하나의 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 Y01G, F02A, E06K, S10T, V11I, D17N, C38S, C38A, M51G, K53A, D54A, S55A, T63A, C68S, C68A, E69C, K70C, C76S, C76A, C127A, 및 C127S로부터 선택된 서열 번호 1의 아미노산 서열에 대한 적어도 하나의 변형을 포함한다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 펩티드는 서열 번호 1의 아미노산 서열에 대한 하나의 변형을 포함하며, 여기서 변형은 E06X, K53X, S55X, 또는 T63X이고, 여기서 X는 천연 또는 비천연 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 펩티드는 서열 번호 1의 아미노산 서열에 대한 하나의 변형을 포함하며, 여기서 변형은 E06X, K53X, S55X, 또는 T63X이고, 여기서 각각의 X는 독립적으로 천연 또는 비천연 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 펩티드는 서열 번호 1의 아미노산 서열에 대한 2개의 변형을 포함하며, 여기서 변형은 E06X 및 K53X; E06X 및 S55X; K53X 및 S55X; E06X 및 T63X; 또는 K53X 및 T63X이며, 여기서 X는 천연 또는 비천연 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 펩티드는 서열 번호 1의 아미노산 서열에 대한 3개의 변형을 포함하며, 여기서 변형은 E06X, K53X, 및 S55X; 또는 E06X, K53X, 및 T63X이고, 여기서 X는 천연 또는 비천연 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 펩티드는 서열 번호 1의 아미노산 서열에 대한 4개의 변형을 포함하며, 여기서 변형은 E06X, K53X, S55X, 및 T63X; E06X, K53X, S55X, 및 Y01X; E06X, K53X, S55X, 및 F02X; E06X, K53X, S55X, 및 D54X; E06X, K53X, S55X, 및 M51X; 또는 C38X, C68X, C76X, 및 C127X이고, 여기서 X는 천연 또는 비천연 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 펩티드는 서열 번호 1의 아미노산 서열에 대한 4개의 변형을 포함하며, 여기서 변형은 E06X, K53X, S55X, 및 T63X; E06X, K53X, S55X, 및 Y01X; E06X, K53X, S55X, 및 F02X; E06X, K53X, S55X, 및 D54X; E06X, K53X, S55X, 및 M51X; C38X, E69X, C76X, 및 C127X; 또는 C38X, E70X, C76X, 및 C127X이고, 여기서 X는 천연 또는 비천연 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 서열 번호 1의 아미노산 서열에 대한 적어도 4개의 변형을 포함하며, 여기서 적어도 4개의 변형은 E06X, K53X, C68X, 및 E69X; E06X, K53X, C68X, 및 K70X; E06X, K53X, T63X, 및 E69X; 또는 E06X, K53X, T63X, 및 K70X이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 펩티드는 서열 번호 1의 아미노산 서열에 대한 5개의 변형을 포함하며, 여기서 변형은 C38X, C68X, C76X, C127X, 및 K70X이고, 여기서 X는 천연 또는 비천연 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 펩티드는 서열 번호 1의 아미노산 서열에 대한 5개의 변형을 포함하며, 여기서 변형은 C38X, C68X, C76X, C127X, 및 E69X이고, 여기서 X는 천연 또는 비천연 아미노산이다. 일부 실시양태에서 변형된 IL-18 펩티드는 서열 번호 1의 아미노산 서열에 대한 7개의 변형을 포함하며, 여기서 변형은 E06X, K53X, C38X, C68X, C76X, C127X, 및 K70X; 또는 K53X, T63X, C38X, C68X, C76X, C127X, 및 K70X를 포함하고, 여기서 X는 천연 또는 비천연 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 펩티드는 서열 번호 1의 아미노산 서열에 대한 7개의 변형을 포함하며, 여기서 변형은 E06X, K53X, C38X, C68X, C76X, C127X, 및 E69X; 또는 K53X, T63X, C38X, C68X, C76X, C127X, 및 E69X이고, 여기서 X는 천연 또는 비천연 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 펩티드는 서열 번호 1의 아미노산 서열에 대한 8개의 변형을 포함하며, 여기서 변형은 Y01X, F02X, E06X, M51X, K53X, D54X, S55X, 및 T63X; 또는 E06X, K53X, S55X, C38X, C68X, C76X, C127X, 및 K70X이고, 여기서 X는 천연 또는 비천연 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 펩티드는 서열 번호 1의 아미노산 서열에 대한 8개의 변형을 포함하며, 여기서 변형은 E06X, K53X, S55X, C38X, C68X, C76X, C127X, 및 E69X이다. 일부 실시양태에서, 복수의 아미노산 잔기가 천연 또는 비천연 아미노산 X로 대체되고, 각각의 X는 독립적으로 동일하거나 상이한 아미노산이다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 펩티드는 서열 번호 1의 아미노산 서열에 대한 하나의 변형을 포함하며, 여기서 변형은 E06K, K53A, S55A, 또는 T63A이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 펩티드는 서열 번호 1의 아미노산 서열에 대한 2개의 변형을 포함하며, 여기서 변형은 E06K 및 K53A; E06K 및 S55A; K53A 및 S55A; E06K 및 T63A; 또는 K53A 및 T63A이다. 일부 실시양태에서, 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 펩티드는 서열 번호 1의 아미노산 서열에 대한 3개의 변형을 포함하며, 여기서 변형은 E06K, K53A, 및 S55A; 또는 E06K, K53A, 및 T63A이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 펩티드는 서열 번호 1의 아미노산 서열에 대한 4개의 변형을 포함하며, 여기서 변형은 E06K, K53A, S55A, 및 T63A; E06K, K53A, S55A, 및 Y01G; E06K, K53A, S55A, 및 F02A; E06K, K53A, S55A, 및 D54A; E06K, K53A, S55A, 및 M51G; 또는 C38S, C68S, C76S, 및 C127S이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 펩티드는 서열 번호 1의 아미노산 서열에 대한 5개의 변형을 포함하며, 여기서 변형은 C38S, C68S, C76S, C127S, 및 K70C이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 펩티드는 서열 번호 1의 아미노산 서열에 대한 5개의 변형을 포함하며, 여기서 변형은 C38S, C68S, C76S, C127S, 및 E69C이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 펩티드는 서열 번호 1의 아미노산 서열에 대한 7개의 변형을 포함하며, 여기서 변형은 E06K, K53A, C38S, C68S, C76S, C127S, 및 K70C; 또는 K53A, T63A, C38S, C68S, C76S, C127S, 및 K70C이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 펩티드는 서열 번호 1의 아미노산 서열에 대한 7개의 변형을 포함하며, 여기서 변형은 E06K, K53A, C38S, C68S, C76S, C127S, 및 E69C; 또는 K53A, T63A, C38S, C68S, C76S, C127S, 및 E69C이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 펩티드는 서열 번호 1의 아미노산 서열에 대한 8개의 변형을 포함하며, 여기서 변형은 Y01G, F02A, E06K, M51G, K53A, D54A, S55A, 및 T63A; 또는 E06K, K53A, S55A, C38S, C68S, C76S, C127S, 및 K70C이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 펩티드는 서열 번호 1의 아미노산 서열에 대한 8개의 변형을 포함하며, 여기서 변형은 Y01G, F02A, E06K, M51G, K53A, D54A, S55A, and T63A; 또는 E06K, K53A, S55A, C38S, C68S, C76S, C127S, 및 E69C이다.
한 측면에서, E06K 및 K53A를 포함하는 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함하는 변형된 IL-18 폴리펩티드가 본원에서 제공되며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 서열 번호 7의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 하나 이상의 시스테인 잔기에서 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 세린 또는 알라닌으로 치환되는 하나 이상의 시스테인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 각각의 시스테인 잔기에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 시스테인 잔기는 세린 또는 알라닌으로 치환된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 잔기 68, 69, 또는 70에서 부착되는 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 메티오닌 잔기에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 메티오닌 잔기에서 각각의 치환은 O-메틸-L-호모세린 잔기로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 각각의 메티오닌 잔기는 O-메틸-L-호모세린 잔기로 치환된다.
한 측면에서, E06K 및 S55A를 포함하는 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함하는 변형된 IL-18 폴리펩티드가 본원에서 제공되며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 서열 번호 8의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 하나 이상의 시스테인 잔기에서 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 세린 또는 알라닌으로 치환되는 하나 이상의 시스테인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 각각의 시스테인 잔기에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 시스테인 잔기는 세린 또는 알라닌으로 치환된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 잔기 68, 69, 또는 70에서 부착되는 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 메티오닌 잔기에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 메티오닌 잔기에서 각각의 치환은 O-메틸-L-호모세린 잔기로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 각각의 메티오닌 잔기는 O-메틸-L-호모세린 잔기로 치환된다.
한 측면에서, E06K, K53A, S55A, 및 T63A를 포함하는 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함하는 변형된 IL-18 폴리펩티드가 본원에서 제공되며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 서열 번호 10의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 하나 이상의 시스테인 잔기에서 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 세린 또는 알라닌으로 치환되는 하나 이상의 시스테인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 각각의 시스테인 잔기에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 시스테인 잔기는 세린 또는 알라닌으로 치환된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 잔기 68, 69, 또는 70에서 부착되는 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 메티오닌 잔기에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 메티오닌 잔기에서 각각의 치환은 O-메틸-L-호모세린 잔기로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 각각의 메티오닌 잔기는 O-메틸-L-호모세린 잔기로 치환된다.
한 측면에서, E06K, K53A, 및 T63A를 포함하는 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함하는 변형된 IL-18 폴리펩티드가 본원에서 제공되며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 서열 번호 18의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 하나 이상의 시스테인 잔기에서 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 세린 또는 알라닌으로 치환되는 하나 이상의 시스테인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 각각의 시스테인 잔기에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 시스테인 잔기는 세린 또는 알라닌으로 치환된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 잔기 68, 69, 또는 70에서 부착되는 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 메티오닌 잔기에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 메티오닌 잔기에서 각각의 치환은 O-메틸-L-호모세린 잔기로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 각각의 메티오닌 잔기는 O-메틸-L-호모세린 잔기로 치환된다.
한 측면에서, T63A를 포함하는 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함하는 변형된 IL-18 폴리펩티드가 본원에서 제공되며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 서열 번호 19의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 하나 이상의 시스테인 잔기에서 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 세린 또는 알라닌으로 치환되는 하나 이상의 시스테인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 각각의 시스테인 잔기에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 시스테인 잔기는 세린 또는 알라닌으로 치환된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 잔기 68, 69, 또는 70에서 부착되는 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 메티오닌 잔기에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 메티오닌 잔기에서 각각의 치환은 O-메틸-L-호모세린 잔기로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 각각의 메티오닌 잔기는 O-메틸-L-호모세린 잔기로 치환된다.
한 측면에서, E06K 및 T63A를 포함하는 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함하는 변형된 IL-18 폴리펩티드가 본원에서 제공되며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 서열 번호 20의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 하나 이상의 시스테인 잔기에서 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 세린 또는 알라닌으로 치환되는 하나 이상의 시스테인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 각각의 시스테인 잔기에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 시스테인 잔기는 세린 또는 알라닌으로 치환된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 잔기 68, 69, 또는 70에서 부착되는 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 메티오닌 잔기에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 메티오닌 잔기에서 각각의 치환은 O-메틸-L-호모세린 잔기로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 각각의 메티오닌 잔기는 O-메틸-L-호모세린 잔기로 치환된다.
한 측면에서, E06K, K53A, C38S, C76S, 및 C127S를 포함하는 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함하는 변형된 IL-18 폴리펩티드가 본원에서 제공되며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 서열 번호 70의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 잔기 68, 69, 또는 70에서 부착되는 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 메티오닌 잔기에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 메티오닌 잔기에서 각각의 치환은 O-메틸-L-호모세린 잔기로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 각각의 메티오닌 잔기는 O-메틸-L-호모세린 잔기로 치환된다.
한 측면에서, E06K, C38S, 및 K53A를 포함하는 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함하는 변형된 IL-18 폴리펩티드가 본원에서 제공되며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 서열 번호 71의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 잔기 68, 69, 또는 70에서 부착되는 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 잔기 68에서 부착되는 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 메티오닌 잔기에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 메티오닌 잔기에서 각각의 치환은 O-메틸-L-호모세린 잔기로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 각각의 메티오닌 잔기는 O-메틸-L-호모세린 잔기로 치환된다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 서열 번호 2-58과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 서열 번호 2-83과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 서열은 서열 번호 2 또는 서열 번호 18과 적어도 약 80% 동일하다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 서열은 서열 번호 2와 적어도 약 80% 동일하다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 서열은 서열 번호 2와 적어도 약 90% 동일하다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 서열은 서열 번호 2와 적어도 약 95% 동일하다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 서열은 적어도 서열 번호 18과 약 80% 동일하다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 서열은 서열 번호 18과 적어도 약 90% 동일하다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 서열은 서열 번호 18과 적어도 약 95% 동일하다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 재조합체이다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 (a) 잔기 26-36 중 어느 하나에 위치한 호모세린 잔기; (b) 잔기 60-80 중 어느 하나에 위치한 호모세린 잔기; (c) 잔기 110-120 중 어느 하나에 위치한 호모세린 잔기; (d) 잔기 28-38 중 어느 하나에 위치한 노르류신 잔기; (d) 잔기 46-56 중 어느 하나에 위치한 노르류신 잔기; (e) 잔기 54-64 중 어느 하나에 위치한 노르류신 잔기; (f) 잔기 80-90 중 어느 하나에 위치한 노르류신 잔기; (g) 잔기 108-118 중 어느 하나에 위치한 노르류신 잔기; 및 (h) 잔기 145-155 중 어느 하나에 위치한 노르류신 잔기로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 (a) 잔기 26-36 중 어느 하나에 위치한 호모세린 잔기; (b) 잔기 60-80 중 어느 하나에 위치한 호모세린 잔기; (c) 잔기 110-120 중 어느 하나에 위치한 호모세린 잔기; (d) 잔기 28-38 중 어느 하나에 위치한 노르류신 또는 O-메틸-호모세린 잔기; (e) 잔기 46-56 중 어느 하나에 위치한 노르류신 또는 O-메틸-호모세린 잔기; (f) 잔기 54-64 중 어느 하나에 위치한 노르류신 또는 O-메틸-호모세린 잔기; (g) 잔기 80-90 중 어느 하나에 위치한 노르류신 또는 O-메틸-호모세린 잔기; (h) 잔기 108-118 중 어느 하나에 위치한 노르류신 또는 O-메틸-호모세린 잔기; 및 (i) 잔기 145-155 중 어느 하나에 위치한 노르류신 또는 O-메틸-호모세린 잔기로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 (a) 잔기 26-36 중 어느 하나에 위치한 호모세린 잔기; (b) 잔기 60-80 중 어느 하나에 위치한 호모세린 잔기; (c) 잔기 110-120 중 어느 하나에 위치한 호모세린 잔기; (d) 잔기 28-38 중 어느 하나에 위치한 O-메틸-호모세린 잔기; (e) 잔기 46-56 중 어느 하나에 위치한 O-메틸-호모세린 잔기; (f) 잔기 54-64 중 어느 하나에 위치한 O-메틸-호모세린 잔기; (g) 잔기 80-90 중 어느 하나에 위치한 O-메틸-호모세린 잔기; (h) 잔기 108-118 중 어느 하나에 위치한 O-메틸-호모세린 잔기; 및 (i) 잔기 145-155 중 어느 하나에 위치한 O-메틸-호모세린 잔기로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 호모세린(Hse) 31, 노르류신(Nle) 33, Nle51, Nle59, Hse75, Nle86, Nle113, Hse116, 및 Nle150으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 펩티드는 O-메틸-L-호모세린으로 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 펩티드는 위치 Met 33, Met 51, Met 60, Met 86, Met 113, 또는 Met 150에서 O-메틸-L-호모세린으로 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 호모세린(Hse) 31, 노르류신(Nle) 33, O-메틸-호모세린(Omh) 33, Nle51, Omh51, Nle60, Omh60, Hse75, Nle86, Omh86, Hse116, Nle113, Omh113, Nle150, 및 Omh150 으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 변형된 IL-18 폴리펩티드는 링커 모이어티를 함유한다. 일부 실시양태에서, 링커 모이어티는 중합체, 링커, 스페이서, 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 특정 아미노산 잔기에 첨가될 때, 링커 모이어티는 야생형 IL-18과 비교하여 변형된 IL-18 폴리펩티드의 활성 또는 다른 특성을 조절할 수 있다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 추가적인 폴리펩티드와 연결된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 및 추가적인 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드를 형성한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 및 추가 폴리펩티드는 함께 접합된다. 일부 실시양태에서, 추가적인 폴리펩티드는 항체 또는 이의 결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간화 항체, 뮤린 항체, 키메라 항체, 이중특이적 항체, 이들의 임의의 단편 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 단클론 항체 또는 이의 임의의 단편이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 사이토카인에 접합된다.
III. 중합체 모이어티를 포함하는 변형된 IL-18 폴리펩티드
본원에 기재된 변형된 IL-18 폴리펩티드는 하나 이상의 중합체를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 하나의 중합체 모이어티에 접합된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 2개의 중합체 모이어티에 접합된다. 특정 아미노산 잔기에 대한 중합체의 첨가는 변형된 IL-18 폴리펩티드와 IL-18BP의 결합 상호작용을 방해할 수 있다. [도 2c]는 중합체 모이어티를 포함하는 변형된 합성 IL-18 폴리펩티드를 예시한다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 중합체 모이어티에 접합된 변형된 IL-18 폴리펩티드는 IL-18Rα에 대한 결합을 유지할 수 있고 IL-18BP와의 감소된 결합 상호작용을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 중합체 모이어티에 접합된 변형된 IL-18 폴리펩티드는 IL-18Rα에 대한 증가된 결합을 가질 수 있고 IL-18BP와의 감소된 결합 상호작용을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 중합체 잔기에 접합된 변형된 IL-18 폴리펩티드는 IL-18Rα/β 이종이량체에 대한 결합을 유지할 수 있고 IL-18BP와의 감소된 결합 상호작용을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 중합체 모이어티에 접합된 변형된 IL-18 폴리펩티드는 IL-18Rα/β 이종이량체에 대한 증가된 결합을 가질 수 있고 IL-18BP와의 감소된 결합 상호작용을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 잔기 65, 잔기 66, 잔기 67, 잔기 68, 잔기 69, 잔기 70, 잔기 71, 잔기 72, 잔기 73, 잔기 74 또는 잔기 75에서 공유 부착되는 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 잔기 C68에서 공유 부착되는 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 잔기 68에서 공유 부착되는 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 잔기 70에서 공유 부착되는 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 잔기 K70에서 공유 부착되는 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 잔기 69에서 공유 부착되는 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 잔기 E69에서 공유 부착되는 중합체를 포함한다.
실시양태에서, 중합체는 변형된 아미노산 α를 통해 공유 부착된다. 일부 실시양태에서, 변형된 아미노산 α는 아미노산-PEG-아지드기이다. 일부 실시양태에서, 변형된 아미노산 α는 PEG 스페이서를 통해 아미노산에 연결된 아지드기를 포함하도록 변형된 글루타메이트, 아스파르테이트, 리신, 시스테인, 또는 티로신이다. 일부 실시양태에서, 변형된 아미노산 α는 다음으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00007
Figure pct00008
여기서 각각의 n은 독립적으로 1-30의 정수이다. 일부 실시양태에서, n은 1-20, 1-10, 2-30, 2-20, 2-10, 5-30, 5-20, 또는 5-10의 정수이다. 일부 실시양태에서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30이다. 일부 실시양태에서, n은 10이다. 일부 실시양태에서, n은 8이다. 일부 실시양태에서, n은 6이다. 일부 실시양태에서, n은 12이다.
일부 실시양태에서, 변형된 아미노산 α는 잔기 65, 잔기 66, 잔기 67, 잔기 68, 잔기 69, 잔기 70, 잔기 71, 잔기 72, 잔기 73, 잔기 74, 및 잔기 75로부터 선택되는 변형된 IL-18 폴리펩티드 상의 위치에 위치한다. 일부 실시양태에서, 변형된 아미노산 α는 잔기 68, 잔기 69, 및 잔기 70으로부터 선택되는 변형된 IL-18 폴리펩티드 상의 위치에 위치한다. 일부 실시양태에서, 변형된 아미노산 α는 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 68에 위치한다. 일부 실시양태에서, 변형된 아미노산 α는 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 69에 위치한다. 일부 실시양태에서, 변형된 아미노산 α는 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 70에 위치한다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 변형된 리신 잔기에 공유 부착되는 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 리신 잔기는 접합 핸들을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 리신 잔기는 아지드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 리신 잔기는 구조 B의 구조를 가지며, 여기서 구조 B는
Figure pct00009
이며, 여기서 각 n은 독립적으로 1-30의 정수이다. 일부 실시양태에서, n은 1-20, 1-10, 2-30, 2-20, 2-10, 5-30, 5-20, 또는 5-10의 정수이다. 일부 실시양태에서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30이다. 일부 실시양태에서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8이다. 일부 실시양태에서, n은 3이다. 일부 실시양태에서, n은 4이다. 일부 실시양태에서, n은 5이다. 일부 실시양태에서, n은 6이다. 일부 실시양태에서, n은 8이다. 일부 실시양태에서, n은 10이다. 일부 실시양태에서, n은 12이다.
일부 실시양태에서, 구조 B의 변형된 리신은 잔기 65, 잔기 66, 잔기 67, 잔기 68, 잔기 69, 잔기 70, 잔기 71, 잔기 72, 잔기 73, 잔기 74, 및 잔기 75로부터 선택되는 변형된 IL-18 폴리펩티드 상의 위치에 위치한다. 일부 실시양태에서, 구조 B의 변형된 리신은 잔기 68, 잔기 69, 및 잔기 70으로부터 선택되는 변형된 IL-18 폴리펩티드 상의 위치에 위치한다. 일부 실시양태에서, 구조 B의 변형된 리신은 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 68에 위치한다. 일부 실시양태에서, 구조 B의 변형된 리신은 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 69에 위치한다. 일부 실시양태에서, 구조 B의 변형된 리신은 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 70에 위치한다.
한 측면에서, 변형된 인터류킨-18(IL-18) 폴리펩티드 집단으로서, a) 복수의 변형된 IL-18 폴리펩티드; 및 b) 적어도 하나의 중합체 모이어티로서 적어도 하나의 중합체 모이어티는 변형된 IL-18 폴리펩티드에 공유 결합되고 잔기 65, 잔기 66, 잔기 67, 잔기 68, 잔기 69, 잔기 70, 잔기 71, 잔기 72, 잔기 73, 잔기 74, 또는 잔기 75에서 부착되며, 여기서 아미노산 잔기 위치는 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 하는 것인 적어도 하나의 중합체 모이어티를 포함하며; 변형된 IL-18 폴리펩티드의 적어도 90%는 고해상도 전자분무 이온화 질량 분석법(ESI-HRMS)에 의해 결정되는 바와 같이 복수의 변형된 IL-18 폴리펩티드의 피크 분자량의 ±500 Da 이내인 분자량을 갖는 것인 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단이 본원에 기재된다. 일부 실시양태에서, 집단의 각각의 변형된 IL-18 폴리펩티드는 그에 공유 결합되는 중합체 모이어티 중 적어도 하나를 포함한다.
한 측면에서, 변형된 인터류킨-18(IL-18) 폴리펩티드 집단으로서, a) 복수의 변형된 IL-18 폴리펩티드; 및 b) 복수의 중합체 모이어티로서 복수의 중합체 모이어티는 변형된 IL-18 폴리펩티드에 공유 결합되고 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 65, 잔기 66, 잔기 67, 잔기 68, 잔기 69, 잔기 70, 잔기 71, 잔기 72, 잔기 73, 잔기 74, 또는 잔기 75에서 부착되며, 여기서 아미노산 잔기 위치는 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 하는 것인 복수의 중합체 모이어티를 포함하며; 복수의 중합체 모이어티의 적어도 90%는 고해상도 전자분무 이온화 질량 분석법(ESI-HRMS)에 의해 결정되는 바와 같이 복수의 변형된 IL-18 폴리펩티드의 피크 분자량의 ±500 Da 이내인 분자량을 갖는 것인 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단이 본원에 기재된다.
일부 실시양태에서, 복수의 중합체 중 적어도 75%는 고분해능 전기분무 이온화 질량 분석법(ESI-HRMS)에 의해 결정되는 바와 같이 복수의 중합체의 피크 분자량의 ±10% 이내인 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 중합체 모이어티 또는 복수의 중합체 모이어티는 아미노산 잔기 68에서 변형된 IL-18 폴리펩티드에 공유 결합되며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 아미노산 잔기 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 중합체 모이어티 또는 복수의 중합체 모이어티는 아미노산 잔기 69에서 변형된 IL-18 폴리펩티드에 공유 결합되며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 아미노산 잔기 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 중합체 모이어티 또는 복수의 중합체 모이어티는 아미노산 잔기 70에서 변형된 IL-18 폴리펩티드에 공유 결합되며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 아미노산 잔기 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 중합체 모이어티 또는 복수의 중합체 모이어티는 C68에서 변형된 IL-18 폴리펩티드에 공유 결합되며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 아미노산 잔기 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 중합체 모이어티 또는 복수의 중합체 모이어티는 K70에서 변형된 IL-18 폴리펩티드에 공유 결합되며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 아미노산 잔기 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다.
일부 실시양태에서, 복수의 변형된 IL-18 폴리펩티드의 각각의 변형된 IL-18 폴리펩티드는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 E06, K53, Y01, S55, F02, D54, C38, T63A, C68, C76, C127, 및 K70으로부터 선택된 잔기 위치에 위치하며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 IL-18 폴리펩티드의 각각의 변형된 IL-18 폴리펩티드는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 E06, K53, Y01, S55, F02, D54, C38, T63A, C68, C76, C127, 및 E69로부터 선택된 잔기 위치에 위치하며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 E06K, K53A, Y01G, S55A, F02A, D54A, C38S, T63A, C68S, C76S, C127S, 및 K70C로부터 선택되며. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 E06K 및 K53A이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 E06K, K53A, Y01G, S55A, F02A, D54A, C38S, T63A, C68S, C76S, C127S, 및 E69C로부터 선택되며. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 E06K, K53A, 및 T63A이다.
일부 실시양태에서, 중합체는 최대 약 50,000 달톤, 최대 약 25,000 달톤, 최대 약 10,000 달톤, 또는 최대 약 6,000 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 중합체는 적어도 약 120 달톤, 적어도 약 250 달톤, 적어도 약 300 달톤, 적어도 약 400 달톤, 또는 적어도 약 500 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 변형된 IL-18 폴리펩티드는 C68 또는 K70에서 공유 부착되는 제1 중합체를 포함하며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 변형된 IL-18 폴리펩티드는 C68, E69, 또는 K70에서 공유 부착되는 제1 중합체를 포함하며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 변형된 IL-18 폴리펩티드는 C68에서 공유 부착되는 제1 중합체를 포함하며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 변형된 IL-18 폴리펩티드는 E69에서 공유 부착되는 제1 중합체를 포함하며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 변형된 IL-18 폴리펩티드는 K70에서 공유 부착되는 제1 중합체를 포함하며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드에 접합되는 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 수용성 중합체이다. 중합체는 IL-18 폴리펩티드, 또는 이의 돌연변이체들의 잔기 C68 및 K70 중 하나 또는 둘 다에 첨가될 수 있다. 중합체는 또한 IL-18 폴리펩티드, 또는 이의 돌연변이체들의 잔기 C68, E69, 및 K70 중 1개, 2개 또는 3개 모두에 첨가될 수 있다. 추가로, IL-18 폴리펩티드를 변형시켜 폴리펩티드의 반감기를 증가시키기 위해 중합체를 첨가할 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 중합체 모이어티에 접합된 변형된 IL-18 폴리펩티드는 IL-18Rα에 대한 결합을 유지할 수 있고, IL-18BP와의 감소된 결합 상호작용을 가질 수 있으며, 증가된 반감기(t1/2)를 나타낼 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 중합체 모이어티에 접합된 변형된 IL-18 폴리펩티드는 IL-18Rα에 대한 증가된 결합을 가질 수 있고, IL-18BP와의 감소된 결합 상호작용을 가질 수 있으며, 증가된 반감기(t1/2)를 나타낼 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 중합체 모이어티에 접합된 변형된 IL-18 폴리펩티드는 IL-18Rαβ 이종이량체에 대한 결합을 유지할 수 있고, IL-18BP와의 감소된 결합 상호작용을 가질 수 있며, 증가된 반감기(t1/2)를 나타낼 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 중합체 모이어티에 접합된 변형된 IL-18 폴리펩티드는 IL-18Rαβ 이종이량체에 대한 증가된 결합을 가질 수 있고, IL-18BP와의 감소된 결합 상호작용을 가질 수 있으며, 증가된 반감기(t1/2)를 나타낼 수 있다. 일부 실시양태에서, 반감기는 대상체의 혈중 생체 내 반감기이다.
반감기 연장 중합체는 약 6 kDa 이하, 약 25 kDa 이하, 또는 약 50 kDa 이하를 포함하는 임의의 크기일 수 있다. 일부 실시양태에서, 반감기 연장 중합체는 PEG 중합체이다. 일부 실시양태에서, 반감기 연장 중합체, 예를 들어 PEG 200, PEG 400, PEG 600, PEG 1000, PEG 1450, PEG 1500, PEG 4000, PEG 4600, 및 PEG 8000은 평균 분자량이 약 200 내지 약 20,000이다.
IIIa . 중합체
한 측면에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함하는 변형된 폴리펩티드가 본원에 기재되며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드는 공유 부착되는 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 변형된 IL-18 폴리펩티드는 그 위에 공유 부착된 하나 이상의 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 기재된 변형된 IL-18 폴리펩티드는 변형된 IL-18 폴리펩티드에 공유 부착된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 중합체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 중합체는 추가 모이어티를 변형된 IL-18 폴리펩티드에 추가로 부착시키는 데 사용될 수 있는 접합 핸들을 포함한다. 다른 모이어티에 부착된 상보적 반응기와 반응할 수 있는 임의의 적합한 반응기가 접합 핸들로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 접합 핸들은 Cu(I)-촉매 또는 "구리가 없는" 알킨 아지드 트리아졸 형성 반응(예를 들어, 변형 촉진 고리첨가), Staudinger 결찰, 역전자-요구 Diels-Alder(IEDDA) 반응, "포토 클릭" 화학, 트랜스-시클로옥텐을 사용한 테트라진 고리첨가, 또는 올레핀 복분해 및 Suzuki-Miyaura 또는 Sonogashira 교차 커플링과 같은 금속 매개 공정을 위한 시약을 포함한다.
일부 실시양태에서, 접합 핸들은 "구리가 없는" 알킨 아지드 트리아졸 형성 반응을 위한 시약을 포함한다. 상기 알킨 아지드 트리아졸 형성 반응을 위한 알킨의 비제한적 예는 시클로옥틴 시약(예를 들어, (1R,8S,9s)-비시클로[6.1.0]논-4-인-9-일메탄올 함유 시약, 디벤조시클로옥틴-아민 시약, 디플루오로시클로옥틴, 또는 이의 유도체)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 접합 핸들은 아지드, 알킨, 테트라진, 할라이드, 설프히드릴, 디설파이드, 말레이미드, 활성화된 에스테르, 알켄, 알데히드, 케톤, 이민, 히드라진, 아실트리플루오로보레이트, 히드록실아민, 포스핀, 트랜스-시클로옥텐, 및 히드라지드로부터 선택된 반응 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 접합 핸들 및 상보적 접합 핸들은 "클릭" 화학 시약을 포함한다. 클릭 화학 잔기의 예시적인 기는 문헌[Hein et al., "Click Chemistry, A Powerful Tool for Pharmaceutical Sciences," Pharmaceutical Research, volume 25, pages 2216-2230 (2008); Thirumurugan et al., "Click Chemistry for Drug Development and Diverse Chemical-Biology Applications," Chem . Rev. 2013, 113, 7, 4905-4979; US20160107999A1; US10266502B2; 및 US20190204330A1]에 제시되며, 이들 각각은 그 전체가 참고로 포함된다.
일부 실시양태에서, 중합체는 접합 핸들 또는 접합 핸들과 상보적인 접합 핸들의 반응 생성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 접합 핸들과 상보적 접합 핸들의 반응 생성물은 KAT 결찰(칼륨 아실트리플루오로보레이트와 히드록실아민의 반응), Staudinger 결찰(아지드와 포스핀의 반응), 테트라진 고리첨가(테트라진과 트랜스-시클로옥텐의 반응) 또는 Huisgen 고리첨가(알킨과 아지드의 반응)로부터 생긴다. 일부 실시양태에서, 중합체는 중합체를 변형된 IL-18 폴리펩티드에 부착시키는 데 사용된 상보적 접합 핸들과 접합 핸들의 반응 생성물을 포함할 것이다.
일부 실시양태에서, 중합체는 아지드 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합체는 아지드 모이어티, 알킨 모이어티, 또는 아지드-알킨 고리첨가 반응의 반응 생성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아지드-알킨 고리첨가 반응의 반응 생성물은 1,2,3-트리아졸이다.
일부 실시양태에서, 중합체는 이작용성 링커의 사용을 통해 변형된 IL-18 폴리펩티드에 부착된다. 일부 실시양태에서, 이작용성 링커는 변형된 IL-18 폴리펩티드 상의 아미노산 잔기의 반응 기(예를 들어, 시스테인 설프히드릴)와 반응하여 공유 결합을 형성한다. 일부 실시양태에서, 제2 단계에서, 그 다음 이작용성 링커의 제2 반응 기(예를 들어, 아지드 또는 알킨과 같은 접합 핸들)를 사용하여 중합체와 같은 제2 모이어티를 부착한다.
일부 실시양태에서, 중합체는 수용성 중합체이다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 폴리(알킬렌 옥시드), 다당류, 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알코올), 폴리옥사졸린, 폴리(아크릴로일모르폴린), 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 폴리(알킬렌 옥시드)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리(알킬렌 옥시드)는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다.
일부 실시양태에서, 중합체는 제1 중합체이다. 일부 실시양태에서, 제1 중합체는 수용성 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 폴리(알킬렌 옥시드), 다당류, 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알코올), 폴리옥사졸린, 폴리(아크릴로일모르폴린), 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 폴리(알킬렌 옥시드)이다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 다당류이다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 옥시드)이다.
일부 실시양태에서, 폴리에틸렌 글리콜은 약 10 kDa 내지 약 50 kDa의 중량 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리에틸렌 글리콜은 약 10 kDa, 약 20 kDa, 또는 약 30 kDa의 중량 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리에틸렌 글리콜은 약 30 kDa의 중량 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드의 반감기는 상응하는 야생형 IL-18 폴리펩티드의 반감기보다 적어도 10% 더 길다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드의 반감기는 상응하는 야생형 IL-18 폴리펩티드의 반감기보다 적어도 30% 더 길다.
일부 실시양태에서, 부착되는 중합체는 약 6,000 달톤 내지 약 50,000 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 중합체는 약 6,000 달톤 내지 약 10,000 달톤, 약 6,000 달톤 내지 약 25,000 달톤, 약 6,000 달톤 내지 약 50,000 달톤, 약 10,000 달톤 내지 약 25,000 달톤, 약 10,000 달톤 내지 약 50,000 달톤, 또는 약 25,000 달톤 내지 약 50,000 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 중합체는 약 6,000 달톤, 약 10,000 달톤, 약 25,000 달톤, 또는 약 50,000 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 중합체는 적어도 약 6,000 달톤, 약 10,000 달톤, 또는 약 25,000 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 중합체는 최대 약 10,000 달톤, 약 25,000 달톤, 또는 약 50,000 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는다.
일부 실시양태에서, 제1 중합체와 같은 부착되는 중합체는 약 120 달톤 내지 약 1,000 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 중합체는 약 120 달톤 내지 약 250 달톤, 약 120 달톤 내지 약 300 달톤, 약 120 달톤 내지 약 400 달톤, 약 120 달톤 내지 약 500 달톤, 약 120 달톤 내지 약 1,000 달톤, 약 250 달톤 내지 약 300 달톤, 약 250 달톤 내지 약 400 달톤, 약 250 달톤 내지 약 500 달톤, 약 250 달톤 내지 약 1,000 달톤, 약 300 달톤 내지 약 400 달톤, 약 300 달톤 내지 약 500 달톤, 약 300 달톤 내지 약 1,000 달톤, 약 400 달톤 내지 약 500 달톤, 약 400 달톤 내지 약 1,000 달톤, 또는 약 500 달톤 내지 약 1,000 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 중합체는 약 120 달톤, 약 250 달톤, 약 300 달톤, 약 400 달톤, 약 500 달톤, 또는 약 1,000 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 중합체는 적어도 약 120 달톤, 약 250 달톤, 약 300 달톤, 약 400 달톤, 또는 약 500 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 중합체는 최대 약 250 달톤, 약 300 달톤, 약 400 달톤, 약 500 달톤, 또는 약 1,000 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는다.
일부 실시양태에서, 제1 중합체와 같은 부착되는 중합체는 수용성 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 폴리(알킬렌 옥시드), 다당류, 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알코올), 폴리옥사졸린, 폴리(아크릴로일모르폴린), 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(즉, 폴리에틸렌 옥시드)과 같은 폴리(알킬렌 옥시드)이다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜이다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 개질된 폴리(알킬렌 옥시드)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리(알킬렌 옥시드)는 하나 이상의 링커 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 링커 기는 아미드 기, 에스테르 기, 에테르 기, 티오에테르 기, 카르보닐 기 등과 같은 이작용성 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 링커 기는 아미드 링커 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 개질된 폴리(알킬렌 옥시드)는 하나 이상의 스페이서 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 스페이서 기는 치환된 또는 비치환된 C1-C6 알킬렌 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 스페이서 기는 -CH2-, -CH2CH2-, 또는 -CH2CH2CH2-를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커 기는 이중직교 반응(예를 들어, 생체적합성 및 선택적 반응)의 생성물이다. 일부 실시양태에서, 생체직교 반응은 Cu(I)-촉매 또는 "구리가 없는" 알킨 아지드 트리아졸 형성 반응, Staudinger 결찰, 역전자-요구형 Diels-Alder(IEDDA) 반응, 알킨-니트론 고리첨가 화학, 또는 올레핀 복분해 및 Suzuki-Miyaura 또는 Sonogashira 교차 커플링과 같은 금속 매개 공정이다. 일부 실시양태에서, 제1 중합체는 클릭 화학을 통해 IL-18 폴리펩티드에 부착된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 변형된 IL-18 폴리펩티드는 표 1로부터 선택된 하나 이상의 중합체를 포함한다.
[표 1]
Figure pct00010
일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 변형된 IL-18 폴리펩티드는 항체 및 중합체와 같은 유도체화된 분자 또는 모이어티와 변형된 IL-18 폴리펩티드의 접합을 촉진하는 반응 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 반응 기는 카복실산 유도 활성 에스테르, 혼합 무수물, 아실 할라이드, 아실 아지드, 알킬 할라이드, N-말레이미드, 이미노 에스테르, 이소시아네이트, 및 이소티오시아네이트 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 반응 기는 아지드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 변형된 IL-18 폴리펩티드는 잔기에 공유 부착된 화학 시약을 포함한다. 일부 실시예에서, 화학 시약은 생체직교 시약을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학 시약은 아지드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학 시약은 알킨을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화학 시약은 잔기 C68 또는 K70에서 부착되며, 여기서 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 화학 시약은 잔기 C68, E69, 또는 K70에서 부착되며, 여기서 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 화학 시약은 C68의 잔기에서 부착되며, 여기서 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 화학 시약은 E69의 잔기에서 부착되며, 여기서 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 화학 시약은 잔기 K70에서 부착되며, 여기서 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다.
일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 1 내지 10개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 수용성 중합체는 1개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬 내지 10개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 수용성 중합체는 1개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬 내지 2개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 1개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬 내지 4개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 1개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬 내지 6개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 1개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬 내지 10개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 2개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬 내지 4개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 2개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬 내지 6개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 2개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬 내지 10개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 4개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬 내지 6개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 4개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬 내지 10개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 또는 6개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬 내지 10개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 수용성 중합체는 1개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 2개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 4개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 6개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 또는 10개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 수용성 중합체는 적어도 1개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 2개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 4개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 또는 6개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 수용성 중합체는 최대 2개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 4개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 6개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 또는 10개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 수용성 중합체는 4개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 수용성 중합체는 하기 화학식 (II)의 구조를 포함한다:
Figure pct00011
여기서 각각의 m은 독립적으로 4-30의 정수이다. 일부 실시양태에서, 제1 수용성 중합체의 적어도 하나의 폴리에틸렌 글리콜 사슬은 하기 화학식 (III)의 구조를 포함한다:
Figure pct00012
여기서 각각의 m은 독립적으로 4-30의 정수이고 각각의 n은 독립적으로 1-10의 정수이다. 일부 실시양태에서, 제1 수용성 중합체의 각각의 폴리에틸렌 글리콜 사슬은 화학식 (III)의 구조를 포함한다. 화학식 (III)의 일부 실시양태에서, m은 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40이다. 화학식 (III)의 일부 실시양태에서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 변형된 IL-18 폴리펩티드는 변형된 IL-18 폴리펩티드에 공유 부착된 제2 중합체를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 중합체는 잔기 68 내지 잔기 70의 아미노산 잔기 영역에서 공유 부착된다. 일부 실시양태에서, 제2 중합체는 잔기 C68에서 공유 부착된다. 일부 실시양태에서, 제2 중합체는 변형된 IL-18 폴리펩티드의 N-말단에서 공유 부착된다. 일부 실시양태에서, 제2 중합체는 잔기 K70에서 공유 부착된다. 일부 실시양태에서, 제2 중합체는 변형된 IL-18 폴리펩티드의 N-말단에서 공유 부착된다.
일부 실시양태에서, 제2 중합체는 약 6,000 달톤 내지 약 50,000 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 제2 중합체는 약 6,000 달톤 내지 약 10,000 달톤, 약 6,000 달톤 내지 약 25,000 달톤, 약 6,000 달톤 내지 약 50,000 달톤, 약 10,000 달톤 내지 약 25,000 달톤, 약 10,000 달톤 내지 약 50,000 달톤, 또는 약 25,000 달톤 내지 약 50,000 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 제2 중합체는 약 6,000 달톤, 약 10,000 달톤, 약 25,000 달톤, 또는 약 50,000 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 제2 중합체는 적어도 약 6,000 달톤, 약 10,000 달톤, 또는 약 25,000 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 제2 중합체는 최대 약 10,000 달톤, 약 25,000 달톤, 또는 약 50,000 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는다.
일부 실시양태에서, 제2 중합체는 약 120 달톤 내지 약 1,000 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 제2 중합체는 약 120 달톤 내지 약 250 달톤, 약 120 달톤 내지 약 300 달톤, 약 120 달톤 내지 약 400 달톤, 약 120 달톤 내지 약 500 달톤, 약 120 달톤 내지 약 1,000 달톤, 약 250 달톤 내지 약 300 달톤, 약 250 달톤 내지 약 400 달톤, 약 250 달톤 내지 약 500 달톤, 약 250 달톤 내지 약 1,000 달톤, 약 300 달톤 내지 약 400 달톤, 약 300 달톤 내지 약 500 달톤, 약 300 달톤 내지 약 1,000 달톤, 약 400 달톤 내지 약 500 달톤, 약 400 달톤 내지 약 1,000 달톤, 또는 약 500 달톤 내지 약 1,000 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 제2 중합체는 약 120 달톤, 약 250 달톤, 약 300 달톤, 약 400 달톤, 약 500 달톤, 또는 약 1,000 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 제2 중합체는 적어도 약 120 달톤, 약 250 달톤, 약 300 달톤, 약 400 달톤, 또는 약 500 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 제2 중합체는 최대 약 250 달톤, 약 300 달톤, 약 400 달톤, 약 500 달톤, 또는 약 1,000 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는다.
일부 실시양태에서, 제2 중합체는 수용성 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 폴리(알킬렌 옥시드), 다당류, 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알코올), 폴리옥사졸린, 폴리(아크릴로일모르폴린), 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 폴리(알킬렌 옥시드)이다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 옥시드)이다. 일부 실시양태에서, 제2 중합체는 클릭 화학을 통해 IL-18 폴리펩티드에 부착된다.
일부 실시양태에서, 제2 수용성 중합체는 1 내지 10개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 수용성 중합체는 1개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬 내지 10개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 수용성 중합체는 1개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬 내지 2개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 1개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬 내지 4개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 1개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬 내지 6개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 1개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬 내지 10개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 2개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬 내지 4개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 2개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬 내지 6개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 2개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬 내지 10개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 4개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬 내지 6개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 4개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬 내지 10개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 또는 6개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬 내지 10개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 수용성 중합체는 1개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 2개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 4개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 6개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 또는 10개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 수용성 중합체는 적어도 1개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 2개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 4개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 또는 6개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 수용성 중합체는 최대 2개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 4개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 6개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 또는 10개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 수용성 중합체는 4개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 수용성 중합체는 하기 화학식 (II)의 구조를 포함한다.
Figure pct00013
여기서 각각의 m은 독립적으로 4-30의 정수이다. 일부 실시양태에서, 제2 수용성 중합체의 적어도 하나의 폴리에틸렌 글리콜 사슬은 하기 화학식 (III)의 구조를 포함한다:
Figure pct00014
여기서 각각의 m은 독립적으로 4-30의 정수이고 각각의 n은 독립적으로 1-10의 정수이다. 일부 실시양태에서, 제2 수용성 중합체의 각각의 폴리에틸렌 글리콜 사슬은 화학식 (III)의 구조를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 변형된 IL-18 폴리펩티드는 변형된 IL-18 폴리펩티드에 공유 부착된 제3 중합체를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제3 중합체는 약 6,000 달톤 내지 약 50,000 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 제3 중합체는 약 6,000 달톤 내지 약 10,000 달톤, 약 6,000 달톤 내지 약 25,000 달톤, 약 6,000 달톤 내지 약 50,000 달톤, 약 10,000 달톤 내지 약 25,000 달톤, 약 10,000 달톤 내지 약 50,000 달톤, 또는 약 25,000 달톤 내지 약 50,000 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 제3 중합체는 약 6,000 달톤, 약 10,000 달톤, 약 25,000 달톤, 또는 약 50,000 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 제3 중합체는 적어도 약 6,000 달톤, 약 10,000 달톤, 또는 약 25,000 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 제3 중합체는 최대 약 10,000 달톤, 약 25,000 달톤, 또는 약 50,000 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는다.
일부 실시양태에서, 제3 중합체는 약 120 달톤 내지 약 1,000 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 제3 중합체는 약 120 달톤 내지 약 250 달톤, 약 120 달톤 내지 약 300 달톤, 약 120 달톤 내지 약 400 달톤, 약 120 달톤 내지 약 500 달톤, 약 120 달톤 내지 약 1,000 달톤, 약 250 달톤 내지 약 300 달톤, 약 250 달톤 내지 약 400 달톤, 약 250 달톤 내지 약 500 달톤, 약 250 달톤 내지 약 1,000 달톤, 약 300 달톤 내지 약 400 달톤, 약 300 달톤 내지 약 500 달톤, 약 300 달톤 내지 약 1,000 달톤, 약 400 달톤 내지 약 500 달톤, 약 400 달톤 내지 약 1,000 달톤, 또는 약 500 달톤 내지 약 1,000 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 제3 중합체는 약 120 달톤, 약 250 달톤, 약 300 달톤, 약 400 달톤, 약 500 달톤, 또는 약 1,000 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 제3 중합체는 적어도 약 120 달톤, 약 250 달톤, 약 300 달톤, 약 400 달톤, 또는 약 500 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 제3 중합체는 최대 약 250 달톤, 약 300 달톤, 약 400 달톤, 약 500 달톤, 또는 약 1,000 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 그에 공유 부착된 약 250 달톤 내지 약 50,000 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는 제3 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 그에 공유 부착된 약 500 달톤 내지 약 25,000 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는 제3 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 그에 공유 부착된 약 1000 달톤 내지 약 10,000 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는 제3 중합체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제3 중합체는 수용성 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 폴리(알킬렌 옥시드), 다당류, 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알코올), 폴리옥사졸린, 폴리(아크릴로일모르폴린), 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 폴리(알킬렌 옥시드)이다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜이다. 일부 실시양태에서, 제3 중합체는 클릭 화학을 통해 IL-18 폴리펩티드에 부착된다.
또 다른 측면에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함하는 변형된 IL-18 폴리펩티드가 본원에 기재되며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드는 (a) 제1 아미노산 잔기에 공유 부착된 약 6000 달톤 이하의 중량 평균 분자량을 갖는 제1 중합체; (b) 제2 아미노산 잔기에 공유 부착된 약 6000 달톤 이하의 중량 평균 분자량을 갖는 제2 중합체를 포함하며; 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 한 측면에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함하는 변형된 IL-18 폴리펩티드가 본원에 기재되며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드는 (a) 제1 아미노산 잔기에 공유 부착된 제1 중합체; 및 (b) 제2 아미노산 잔기에 공유 부착된 제2 중합체를 포함하며, 여기서 제1 중합체 및 제2 중합체 중 하나는 약 200 Da, 300 Da, 또는 400 Da 내지 약 600 Da, 1000 Da, 또는 6000 Da의 범위 내의 중량 평균 분자량을 갖고 제1 중합체 및 제2 중합체 중 나머지 중합체는 약 5000 Da, 10,000 Da, 또는 20,000 Da 내지 약 30,000 Da, 40,000 Da, 또는 50,000 Da의 범위 내의 중량 평균 분자량을 갖고, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 제1 중합체 및 제2 중합체 각각은 독립적으로 수용성 중합체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 각각의 중합체는 수용성 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 폴리(알킬렌 옥시드), 다당류, 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알코올), 폴리옥사졸린, 폴리(아크릴로일모르폴린), 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 수용성 중합체는 폴리(알킬렌 옥시드)이다. 일부 실시양태에서, 각각의 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜이다.
일부 실시양태에서, 제1 중합체 및 제2 중합체 각각은 독립적으로 1 내지 5개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 중합체 및 제2 중합체 각각은 독립적으로 단일 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 중합체 및 제2 중합체 각각은 독립적으로 3 내지 25개의 에틸렌 글리콜 단위를 갖는 하나의 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 중합체 및 제2 중합체 각각은 독립적으로 3개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 25개의 에틸렌 글리콜 단위를 갖는 하나의 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 중합체 및 제2 중합체 각각은 독립적으로 3개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 5개의 에틸렌 글리콜 단위, 3개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 7개의 에틸렌 글리콜 단위, 3개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 10개의 에틸렌 글리콜 단위, 3개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 15개의 에틸렌 글리콜 단위, 3개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 25개의 에틸렌 글리콜 단위, 5개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 7개의 에틸렌 글리콜 단위, 5개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 10개의 에틸렌 글리콜 단위, 5개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 15개의 에틸렌 글리콜 단위, 5개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 25개의 에틸렌 글리콜 단위, 7개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 10개의 에틸렌 글리콜 단위, 7개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 15개의 에틸렌 글리콜 단위, 7개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 25개의 에틸렌 글리콜 단위, 10개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 15개의 에틸렌 글리콜 단위, 10개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 25개의 에틸렌 글리콜 단위, 또는 15개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 25개의 에틸렌 글리콜 단위를 갖는 하나의 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 중합체 및 제2 중합체 각각은 독립적으로 3개의 에틸렌 글리콜 단위, 5개의 에틸렌 글리콜 단위, 7개의 에틸렌 글리콜 단위, 10개의 에틸렌 글리콜 단위, 15개의 에틸렌 글리콜 단위, 또는 25개의 에틸렌 글리콜 단위를 갖는 하나의 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 중합체 및 제2 중합체 각각은 독립적으로 적어도 3개의 에틸렌 글리콜 단위, 5개의 에틸렌 글리콜 단위, 7개의 에틸렌 글리콜 단위, 10개의 에틸렌 글리콜 단위, 또는 15개의 에틸렌 글리콜 단위를 갖는 하나의 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 중합체 및 제2 중합체 각각은 독립적으로 최대 5개의 에틸렌 글리콜 단위, 7개의 에틸렌 글리콜 단위, 10개의 에틸렌 글리콜 단위, 15개의 에틸렌 글리콜 단위, 또는 25개의 에틸렌 글리콜 단위를 갖는 하나의 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제3 수용성 중합체는 1 내지 10개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제3 수용성 중합체는 1개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬 내지 10개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제3 수용성 중합체는 1개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬 내지 2개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 1개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬 내지 4개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 1개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬 내지 6개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 1개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬 내지 10개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 2개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬 내지 4개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 2개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬 내지 6개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 2개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬 내지 10개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 4개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬 내지 6개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 4개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬 내지 10개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 또는 6개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬 내지 10개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제3 수용성 중합체는 1개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 2개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 4개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 6개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 또는 10개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제3 수용성 중합체는 적어도 1개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 2개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 4개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 또는 6개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제3 수용성 중합체는 최대 2개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 4개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 6개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 또는 10개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제3 수용성 중합체는 4개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제3 수용성 중합체는 하기 화학식 (II)의 구조를 포함한다:
Figure pct00015
여기서 각각의 m은 독립적으로 4-30의 정수이다. 일부 실시양태에서, 제3 수용성 중합체의 각각의 폴리에틸렌 글리콜 사슬은 하기 화학식 (III)의 구조를 포함한다:
Figure pct00016
여기서 각각의 m은 독립적으로 4-30의 정수이고 각각의 n은 독립적으로 1-10의 정수이다.
일부 실시양태에서, 각각의 폴리에틸렌 글리콜 사슬은 독립적으로 약 5 내지 약 300, 약 10 내지 약 200, 약 20 내지 약 100, 또는 약 25 내지 약 50개의 에틸렌 글리콜 단위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 폴리에틸렌 글리콜 사슬은 독립적으로 5개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 300개의 에틸렌 글리콜 단위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 폴리에틸렌 글리콜 사슬은 독립적으로 5개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 10개의 에틸렌 글리콜 단위, 5개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 20개의 에틸렌 글리콜 단위, 5개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 25개의 에틸렌 글리콜 단위, 5개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 50개의 에틸렌 글리콜 단위, 5개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 100개의 에틸렌 글리콜 단위, 5개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 200개의 에틸렌 글리콜 단위, 5개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 300개의 에틸렌 글리콜 단위, 10개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 20개의 에틸렌 글리콜 단위, 10개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 25개의 에틸렌 글리콜 단위, 10개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 50개의 에틸렌 글리콜 단위, 10개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 100개의 에틸렌 글리콜 단위, 10개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 200개의 에틸렌 글리콜 단위, 10개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 300개의 에틸렌 글리콜 단위, 20개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 25개의 에틸렌 글리콜 단위, 20개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 50개의 에틸렌 글리콜 단위, 20개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 100개의 에틸렌 글리콜 단위, 20개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 200개의 에틸렌 글리콜 단위, 20개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 300개의 에틸렌 글리콜 단위, 25개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 50개의 에틸렌 글리콜 단위, 25개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 100개의 에틸렌 글리콜 단위, 25개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 200개의 에틸렌 글리콜 단위, 25개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 300개의 에틸렌 글리콜 단위, 50개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 100개의 에틸렌 글리콜 단위, 50개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 200개의 에틸렌 글리콜 단위, 50개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 300개의 에틸렌 글리콜 단위, 100개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 200개의 에틸렌 글리콜 단위, 100개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 300개의 에틸렌 글리콜 단위, 또는 200개의 에틸렌 글리콜 단위 내지 300개의 에틸렌 글리콜 단위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 폴리에틸렌 글리콜 사슬은 독립적으로 5개의 에틸렌 글리콜 단위, 10개의 에틸렌 글리콜 단위, 20개의 에틸렌 글리콜 단위, 25개의 에틸렌 글리콜 단위, 50개의 에틸렌 글리콜 단위, 100개의 에틸렌 글리콜 단위, 200개의 에틸렌 글리콜 단위, 또는 300개의 에틸렌 글리콜 단위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 폴리에틸렌 글리콜 사슬은 독립적으로 적어도 5개의 에틸렌 글리콜 단위, 10개의 에틸렌 글리콜 단위, 20개의 에틸렌 글리콜 단위, 25개의 에틸렌 글리콜 단위, 50개의 에틸렌 글리콜 단위, 100개의 에틸렌 글리콜 단위, 또는 200개의 에틸렌 글리콜 단위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 폴리에틸렌 글리콜 사슬은 독립적으로 최대 10개의 에틸렌 글리콜 단위, 20개의 에틸렌 글리콜 단위, 25개의 에틸렌 글리콜 단위, 50개의 에틸렌 글리콜 단위, 100개의 에틸렌 글리콜 단위, 200개의 에틸렌 글리콜 단위, 또는 300개의 에틸렌 글리콜 단위를 포함한다.
일부 실시양태에서, 각각의 폴리에틸렌 글리콜 사슬은 독립적으로 선형 또는 분지형이다. 일부 실시양태에서, 각각의 폴리에틸렌 글리콜 사슬은 선형 폴리에틸렌 글리콜이다. 일부 실시양태에서, 각각의 폴리에틸렌 글리콜 사슬은 분지형 폴리에틸렌 글리콜이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 중합체 각각은 선형 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함한다.
일부 실시양태에서, 각각의 폴리에틸렌 글리콜 사슬은 독립적으로 히드록시, 알킬, 알콕시, 아미도, 또는 아미노 기로 말단 캡핑된다. 일부 실시양태에서, 각각의 폴리에틸렌 글리콜 사슬은 독립적으로 아미노 기로 말단 캡핑된다. 일부 실시양태에서, 각각의 폴리에틸렌 글리콜 사슬은 독립적으로 아미도 기로 말단 캡핑된다. 일부 실시양태에서, 각각의 폴리에틸렌 글리콜 사슬은 독립적으로 알콕시기로 말단 캡핑된다. 일부 실시양태에서, 각각의 폴리에틸렌 글리콜 사슬은 독립적으로 알킬기로 말단 캡핑된다. 일부 실시양태에서, 각각의 폴리에틸렌 글리콜 사슬은 독립적으로 히드록시기로 말단 캡핑된다. 일부 실시양태에서, 폴리에틸렌 글리콜 사슬 중 하나 이상은 독립적으로 구조
Figure pct00017
를 가지며, 여기서 n은 4-30의 정수이다. 일부 실시양태에서, 폴리에틸렌 글리콜 사슬 중 하나 이상은 독립적으로 구조
Figure pct00018
를 가지며, 여기서 m은 4-30의 정수이다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 1 내지 10개의 공유 부착된 수용성 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 1 내지 10개의 공유 부착된 수용성 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 1 또는 2개의 공유 부착된 수용성 중합체, 1 내지 3개의 공유 부착된 수용성 중합체, 1 내지 4개의 공유 부착된 수용성 중합체, 1 내지 6개의 공유 부착된 수용성 중합체, 1 내지 8개의 공유 부착된 수용성 중합체, 1 내지 10개의 공유 부착된 수용성 중합체, 2 또는 3개의 공유 부착된 수용성 중합체, 2 내지 4개의 공유 부착된 수용성 중합체, 2 내지 6개의 공유 부착된 수용성 중합체, 2 내지 8개의 공유 부착된 수용성 중합체, 2 내지 10개의 공유 부착된 수용성 중합체, 3 또는 4개의 공유 부착된 수용성 중합체, 3 내지 6개의 공유 부착된 수용성 중합체, 3 내지 8개의 공유 부착된 수용성 중합체, 3 내지 10개의 공유 부착된 수용성 중합체, 4 내지 6개의 공유 부착된 수용성 중합체, 4 내지 8개의 공유 부착된 수용성 중합체, 4 내지 10개의 공유 부착된 수용성 중합체, 6 내지 8개의 공유 부착된 수용성 중합체, 6 내지 10개의 공유 부착된 수용성 중합체, 또는 8 내지 10개의 공유 부착된 수용성 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 1개의 공유 부착된 수용성 중합체, 2개의 공유 부착된 수용성 중합체, 3개의 공유 부착된 수용성 중합체, 4개의 공유 부착된 수용성 중합체, 6개의 공유 부착된 수용성 중합체, 8개의 공유 부착된 수용성 중합체, 또는 10개의 공유 부착된 수용성 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 적어도 1개의 공유 부착된 수용성 중합체, 2개의 공유 부착된 수용성 중합체, 3개의 공유 부착된 수용성 중합체, 4개의 공유 부착된 수용성 중합체, 6개의 공유 부착된 수용성 중합체, 또는 8개의 공유 부착된 수용성 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 최대 2개의 공유 부착된 수용성 중합체, 3개의 공유 부착된 수용성 중합체, 4개의 공유 부착된 수용성 중합체, 6개의 공유 부착된 수용성 중합체, 8개의 공유 부착된 수용성 중합체, 또는 10개의 공유 부착된 수용성 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 2 내지 6개의 공유 부착된 수용성 중합체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 공유 부착되는 중합체 중 하나 이상은 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제3 중합체와 같은 공유 부착되는 중합체 중 하나 이상은 하나 이상의 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 하나 이상의 리신을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 스페이서를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 반응성 작용기 또는 작용기 예를 들어 아미드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 하기 화학식 (IV)의 구조를 갖는다:
Figure pct00019
여기서 A, B, C 및 D는 각각 독립적으로 중합체이다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 하기 화학식 (I)의 구조를 갖는 하나 이상의 PEG화 리신을 포함한다:
Figure pct00020
여기서 n은 4 내지 30으로부터 선택된 정수이다. 일부 실시양태에서, n은 4 내지 6, 4 내지 8, 4 내지 10, 4 내지 15, 4 내지 20, 4 내지 25, 4 내지 30, 6 내지 8, 6 내지 10, 6 내지 15, 6 내지 20, 6 내지 25, 6 내지 30, 8 내지 10, 8 내지 15, 8 내지 20, 8 내지 25, 8 내지 30, 10 내지 15, 10 내지 20, 10 내지 25, 10 내지 30, 15 내지 20, 15 내지 25, 15 내지 30, 20 내지 25, 20 내지 30, 또는 25 내지 30이다. 일부 실시양태에서, n은 4, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 또는 30이다. 일부 실시양태에서, n은 적어도 4, 6, 8, 10, 15, 20, 또는 25이다. 일부 실시양태에서, n은 최대 6, 8, 10, 15, 20, 25, 또는 30이다. 한 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 변형된 IL-18 폴리펩티드는 1 또는 2개의 아미노산 잔기에 공유 부착된 1개 또는 2개의 수용성 중합체를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 표 2에 나타낸 바와 같은 특징 및 부착 부위를 갖는 1 또는 2개의 수용성 중합체를 포함한다.
[표 2]
Figure pct00021
Figure pct00022
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드에 부착될 수 있는 수용성 중합체는 하기 화학식 (A)의 구조를 포함한다:
Figure pct00023
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드에 부착될 수 있는 수용성 중합체는 하기 화학식 (B)의 구조를 포함한다:
Figure pct00024
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드에 부착될 수 있는 수용성 중합체는 하기 화학식 (C)의 구조를 포함한다:
Figure pct00025
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드에 부착될 수 있는 수용성 중합체는 하기 화학식 (D)의 구조를 포함한다:
Figure pct00026
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드에 부착될 수 있는 수용성 중합체는 하기 화학식 (E)의 구조를 포함한다:
Figure pct00027
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 표 3에 나타낸 바와 같은 구조 및 부착 부위를 갖는 1개 또는 2개의 수용성 중합체를 포함한다.
[표 3]
Figure pct00028
일부 실시양태에서, 잔기 68 또는 70에서 부착된 수용성 중합체는 하나 이상의 링커 및/또는 스페이서를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 링커는 하나 이상의 아미드 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 링커는 하나 이상의 리신 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 잔기 68 또는 70에서 부착된 수용성 중합체는 화학식 (II), 화학식 (III), 화학식 (IV), 또는 이들의 조합의 구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, 잔기 68 또는 70에서 부착된 수용성 중합체는 화학식 (A), 화학식 (B), 화학식 (C), 화학식 (D), 또는 이들의 조합의 구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, 잔기 68 또는 70에서 부착된 수용성 중합체는
Figure pct00029
의 구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, 잔기 68 또는 70에서 부착된 수용성 중합체는 하나 이상의 링커 및/또는 스페이서를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 링커는 하나 이상의 아미드 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 링커는 하나 이상의 리신 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 잔기 68에서 부착된 수용성 중합체는 화학식 (II), 화학식 (III), 화학식 (IV), 또는 이들의 조합의 구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, 잔기 70에서 부착된 수용성 중합체는 화학식 (A), 화학식 (B), 화학식 (C), 화학식 (D), 또는 이들의 조합의 구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, 잔기 68 또는 70에서 부착된 수용성 중합체는
Figure pct00030
의 구조를 포함한다.
일부 실시양태에서, 잔기 68, 69, 또는 70에서 부착된 수용성 중합체는 하나 이상의 링커 및/또는 스페이서를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 링커는 하나 이상의 아미드 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 링커는 하나 이상의 리신 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 잔기 68, 69, 또는 70에서 부착된 수용성 중합체는 화학식 (II), 화학식 (III), 화학식 (IV), 또는 이들의 조합의 구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, 잔기 68, 69, 또는 70에서 부착된 수용성 중합체는 화학식 (A), 화학식 (B), 화학식 (C), 화학식 (D), 또는 이들의 조합의 구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, 잔기 68, 69, 또는 70에서 부착된 수용성 중합체는
Figure pct00031
의 구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, 잔기 68, 69, 또는 70에서 부착된 수용성 중합체는 하나 이상의 링커 및/또는 스페이서를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 링커는 하나 이상의 아미드 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 링커는 하나 이상의 리신 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 잔기 69에서 부착된 수용성 중합체는 화학식 (II), 화학식 (III), 화학식 (IV), 또는 이들의 조합의 구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, 잔기 69에서 부착된 수용성 중합체는 화학식 (A), 화학식 (B), 화학식 (C), 화학식 (D), 또는 이들의 조합의 구조를 포함한다.
일부 실시양태에서, 중합체는 적합한 전구체 물질로부터 합성된다. 일부 실시양태에서, 중합체는 구조 6, 구조 7, 구조 8, 또는 구조 9의 전구체 물질로부터 합성되며, 여기서 구조 6은
Figure pct00032
구조 7은
Figure pct00033
구조8은
Figure pct00034
구조 9는
Figure pct00035
이다.
또한, 복수의 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함하는 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단이 본원에 기재되며, 여기서 복수의 변형된 IL-18 폴리펩티드는 폴리펩티드의 잔기에서 부착된 복수의 수용성 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 잔기에서 부착된 복수의 수용성 중합체의 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%는 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 질량 분석법(MALDI-MS: matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectroscopy)에 의해 결정되는 바와 같이 부착된 복수의 수용성 중합체의 피크 분자량의 ±10% 이내인 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드에 부착된 복수의 수용성 중합체의 최대 50%, 최대 60%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%는 MALDI-MS에 의해 결정되는 바와 같이 폴리펩티드에 부착된 복수의 수용성 중합체의 피크 분자량의 ±10% 이내인 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드에 부착된 복수의 수용성 중합체의 수 평균 분자량에 대한 중량 평균 분자량의 비율은 겔 투과 크로마토그래피(GPC) 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)와 같은 크로마토그래피 또는 MALDI-MS와 같은 질량 분석법에 의해 측정되는 바와 같이 약 1.0 내지 약 1.5, 약 1.0 내지 약 1.1, 약 1.0 내지 약 1.2, 약 1.0 내지 약 1.3, 약 1.0 내지 약 1.25, 약 1.05 내지 약 1.1, 약 1.05 내지 약 1.2, 약 1.05 내지 약 1.5, 약 1.1 내지 약 1.2, 약 1.1 내지 약 1.5, 또는 약 1.2 내지 약 1.5, 또는 약 1.2 내지 약 1.5이다.
일부 실시양태에서, 집단은 적어도 1 ㎍, 적어도 10 ㎍, 또는 적어도 1 mg의 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 집단은 적어도 100개, 적어도 1000개, 또는 적어도 1000개의 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 수 평균 분자량에 대한 중량 평균 분자량의 비율은 최대 1.1이다.
일부 실시양태에서, 복수의 중합체 각각은 수용성 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 폴리(알킬렌 옥시드), 다당류, 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알코올), 폴리옥사졸린, 폴리(아크릴로일모르폴린), 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.
일부 실시양태에서, 복수의 중합체의 중량 평균 분자량은 약 200 Da 내지 약 50,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 복수의 중합체의 중량 평균 분자량은 약 10,000 Da 내지 약 30,000 Da이다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 서열 번호 2-58과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 서열 번호 2-83과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 서열은 서열 번호 2 또는 서열 번호 18과 적어도 약 80% 동일하다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 서열은 서열 번호 2와 적어도 약 80% 동일하다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 서열은 서열 번호 2와 적어도 약 90% 동일하다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 서열은 서열 번호 2와 적어도 약 95% 동일하다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 서열은 서열 번호 18과 적어도 약 80% 동일하다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 서열은 서열 번호 18과 적어도 약 90% 동일하다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 서열은 서열 번호 18과 적어도 약 95% 동일하다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드에 부착된 복수의 수용성 중합체의 수 평균 분자량에 대한 중량 평균 분자량의 비율은 GPC 및 HPLC와 같은 크로마토그래피 또는 질량 분석법에 의해 결정되는 바와 같이 적어도 1.1, 적어도 1.2, 적어도 1.3, 적어도 1.5, 적어도 1.6, 적어도 1.7, 적어도 1.8, 적어도 1.9, 적어도 2.0, 적어도 2.5, 또는 적어도 3.0이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드에 부착된 복수의 수용성 중합체의 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%는 MALDI-MS에 의해 결정되는 바와 같이 폴리펩티드에 부착된 복수의 수용성 중합체의 피크 분자량의 ±10% 이내인 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 일부 실시양태에서, 폴리펩티드에 부착된 복수의 수용성 중합체의 최대 50%, 최대 60%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%는 MALDI-MS에 의해 결정되는 바와 같이 폴리펩티드에 부착된 복수의 수용성 중합체의 피크 분자량의 ±10% 이내인 분자량을 갖는다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드에 부착된 복수의 수용성 중합체의 수 평균 분자량에 대한 중량 평균 분자량의 비율은 GPC 및 HPLC와 같은 크로마토그래피 또는 질량 분석법에 의해 결정되는 바와 같이 약 1.0 내지 약 1.5, 약 1.0 내지 약 1.1, 약 1.0 내지 약 1.2, 약 1.0 내지 약 1.3, 약 1.0 내지 약 1.25, 약 1.05 내지 약 1.1, 약 1.05 내지 약 1.2, 약 1.05 내지 약 1.5, 약 1.1 내지 약 1.2, 약 1.1 내지 약 1.5, 또는 약 1.2 내지 약 1.5이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드에 부착된 복수의 수용성 중합체의 수 평균 분자량에 대한 중량 평균 분자량의 비율은 GPC 및 HPLC와 같은 크로마토그래피 또는 질량 분석법에 의해 결정되는 바와 같이 적어도 1.1, 적어도 1.2, 적어도 1.3, 적어도 1.5, 적어도 1.6, 적어도 1.7, 적어도 1.8, 적어도 1.9, 적어도 2.0, 적어도 2.5, 또는 적어도 3.0이다.
IIIb . 단분산성
한 측면에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단이 본원에 기재된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 변형된 IL-18 폴리펩티드의 집단은 단분산된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단은 단분산 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단분산 중합체는 폴리펩티드의 N-말단 또는 잔기에 부착된다. 일부 실시양태에서, 단분산 중합체는 본 개시 내용의 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 위치에 부착된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단은 그에 공유 부착되는 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 변형된 IL-18 폴리펩티드는 그에 공유 부착되는 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합체는 단분산 중합체이다. 일부 실시양태에서, 중합체는 잔기 68 또는 70에 공유 부착되며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 중합체는 잔기 68, 69, 또는 70에 공유 부착되며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 중합체는 변형된 IL-18 폴리펩티드의 N-말단 영역에 공유 부착된다. 일부 실시양태에서, 중합체는 변형된 IL-18 폴리펩티드의 N-말단에 공유 부착된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 변형된 IL-18의 집단은 그에 공유 부착된 제2 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 중합체는 단분산 중합체이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단은 그에 공유 부착된 제3 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제3 중합체는 단분산 중합체이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 변형된 IL-18 폴리펩티드의 집단은 단분산된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 수 평균 분자량에 대한 중량 평균 분자량의 비율은 최대 1.5, 최대 1.2, 최대 1.1, 또는 최대 1.05이다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단을 포함하며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 집단의 수 평균 분자량에 대한 중량 평균 분자량의 비율은 1.05 내지 1.5이다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단을 포함하며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 집단의 수 평균 분자량에 대한 중량 평균 분자량의 비율은 약 1.0 내지 약 1.5, 약 1.0 내지 약 1.1, 약 1.0 내지 약 1.2, 약 1.0 내지 약 1.3, 약 1.0 내지 약 1.4, 약 1.05 내지 약 1.1, 약 1.05 내지 약 1.2, 약 1.05 내지 약 1.5, 약 1.1 내지 약 1.2, 약 1.1 내지 약 1.5, 또는 약 1.2 내지 약 1.5이다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단을 포함하며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 수 평균 분자량에 대한 중량 평균 분자량의 비율은 약 1.05, 1.1, 약 1.2 , 또는 약 1.5이다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단을 포함하며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 집단의 수 평균 분자량에 대한 중량 평균 분자량의 비율은 적어도 1.05, 1.1, 또는 1.2이다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단을 포함하며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 수 평균 분자량에 대한 중량 평균 분자량의 비율은 최대 1.1, 1.2, 또는 1.5이다. 일부 실시양태에서, 비율은 겔 투과 크로마토그래피(GPC) 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)와 같은 크로마토그래피에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, 비율은 MALDI-MS 및 ESI-HRMS와 같은 질량 스펙트럼에 의해 결정된다.
본원에 기재된 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 피크 분자량의 ±10% 이내인 분자량을 갖는다. 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 80%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 피크 분자량의 ±10% 이내인 분자량을 갖는다. 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 85%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 피크 분자량의 ±10% 이내인 분자량을 갖는다. 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 90%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 피크 분자량의 ±10% 이내인 분자량을 갖는다. 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 95%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 피크 분자량의 ±10% 이내인 분자량을 갖는다. 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 99%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 피크 분자량의 ±10% 이내인 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 질량 스펙트럼은 MALDI-질량 분석법이다. 일부 실시양태에서, 질량 스펙트럼은 고해상도 전자분무 이온화 질량 분석법(ESI-MS 또는 ESI-HRMS)이다.
본원에 기재된 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 피크 분자량의 ±5% 이내인 분자량을 갖는다. 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 80%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 피크 분자량의 ±5% 이내인 분자량을 갖는다. 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 85%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 피크 분자량의 ±5% 이내인 분자량을 갖는다. 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 90%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 피크 분자량의 ±5% 이내인 분자량을 갖는다. 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 95%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 피크 분자량의 ±5% 이내인 분자량을 갖는다. 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 99%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 피크 분자량의 ±5% 이내인 분자량을 갖는다.
본원에 기재된 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 피크 분자량의 ±2% 이내인 분자량을 갖는다. 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 80%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 피크 분자량의 ±2% 이내인 분자량을 갖는다. 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 85%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 피크 분자량의 ±2% 이내인 분자량을 갖는다. 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 90%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 피크 분자량의 ±2% 이내인 분자량을 갖는다. 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 95%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 피크 분자량의 ±2% 이내인 분자량을 갖는다. 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 99%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 피크 분자량의 ±2% 이내인 분자량을 갖는다.
본원에 기재된 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 피크 분자량의 ±1% 이내인 분자량을 갖는다. 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 80%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 피크 분자량의 ±1% 이내인 분자량을 갖는다. 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 85%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 피크 분자량의 ±1% 이내인 분자량을 갖는다. 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 90%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 피크 분자량의 ±1% 이내인 분자량을 갖는다. 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 95%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 피크 분자량의 ±1% 이내인 분자량을 갖는다. 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 99%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 피크 분자량의 ±1% 이내인 분자량을 갖는다.
본원에 기재된 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 피크 분자량의 ±1000 달톤 이내인 분자량을 갖는다. 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 80%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 피크 분자량의 ±1000 달톤 이내인 분자량을 갖는다. 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 85%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 피크 분자량의 ±1000 달톤 이내인 분자량을 갖는다. 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 90%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 피크 분자량의 ±1000 달톤 이내인 분자량을 갖는다. 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 95%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 피크 분자량의 ±1000 달톤 이내인 분자량을 갖는다. 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 99%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 피크 분자량의 ±1000 달톤 이내인 분자량을 갖는다.
본원에 기재된 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 피크 분자량의 ±500 달톤 이내인 분자량을 갖는다. 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 80%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 피크 분자량의 ±500 달톤 이내인 분자량을 갖는다. 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 85%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 피크 분자량의 ±500 달톤 이내인 분자량을 갖는다. 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 90%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 피크 분자량의 ±500 달톤 이내인 분자량을 갖는다. 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 95%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 피크 분자량의 ±500 달톤 이내인 분자량을 갖는다. 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 99%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 피크 분자량의 ±500 달톤 이내인 분자량을 갖는다.
본원에 기재된 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 피크 분자량의 ±100 달톤 이내인 분자량을 갖는다. 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 80%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 피크 분자량의 ±100 달톤 이내인 분자량을 갖는다. 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 85%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 피크 분자량의 ±100 달톤 이내인 분자량을 갖는다. 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 90%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 피크 분자량의 ±100 달톤 이내인 분자량을 갖는다. 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 95%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 피크 분자량의 ±100 달톤 이내인 분자량을 갖는다. 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 99%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 피크 분자량의 ±100 달톤 이내인 분자량을 갖는다.
변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 90%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 피크 분자량의 ±20 Da, ±10 Da, 또는 ±5 Da 이내인 분자량을 갖는다. 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 95%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 피크 분자량의 ±20 Da, ±10 Da, 또는 ±5 Da 이내인 분자량을 갖는다. 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 99%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 피크 분자량의 ±20 Da, ±10 Da, 또는 ±5 Da 이내인 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 질량 스펙트럼은 MALDI-질량 분석법이다. 일부 실시양태에서, 질량 스펙트럼은 ESI-HRMS이다.
본원에 기재된 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 동일한 분자량을 갖는다. 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 80%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 동일한 분자량을 갖는다. 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 85%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 동일한 분자량을 갖는다. 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 90%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 동일한 분자량을 갖는다. 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 95%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 동일한 분자량을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단은 예를 들어 크기 배제 크로마토그래피, 동적 광산란, ESI-MS, MALDI-MS, 또는 분석 초원심분리에 의해 평가될 때 실질적으로 하나의 겉보기 분자량 형태로 존재한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단은 예를 들어 크기 배제 크로마토그래피, 동적 광산란, ESI-MS, MALDI-MS 또는 분석 초원심분리에 의해 평가될 때 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 이상에서 하나의 겉보기 분자량 형태로 존재한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단은 크기 배제 크로마토그래피로 평가할 때 실질적으로 하나의 겉보기 분자량 형태로 존재한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단은 동적 광 산란에 의해 평가될 때 실질적으로 하나의 겉보기 분자량 형태로 존재한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단은 MALDI-MS 또는 ESI-MS에 의해 평가될 때 실질적으로 하나의 겉보기 분자량 형태로 존재한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단은 분석 초원심분리에 의해 평가될 때 실질적으로 하나의 겉보기 분자량 형태로 존재한다.
한 측면에서, 복수의 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함하는 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단이 본원에 기재되며, 여기서 복수의 변형된 IL-18 폴리펩티드는 복수의 중합체(즉, 복수의 제1 중합체)를 포함하고, 여기서 각각의 변형된 IL-18 폴리펩티드는 그에 공유 부착된 복수의 중합체 중 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 중합체 중 적어도 95%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 복수의 중합체의 피크 분자량의 ±10% 이내인 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 복수의 중합체의 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 복수의 중합체의 피크 분자량의 ±10% 이내인 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 복수의 중합체의 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%는 MALDI-MS에 의해 결정되는 바와 같이 복수의 중합체의 피크 분자량의 ±5% 이내인 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 복수의 중합체의 최대 50%, 최대 60%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 복수의 중합체의 피크 분자량의 ±10% 이내인 분자량을 갖고, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 피크 분자량의 ±10% 이내인 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 복수의 중합체의 최대 50%, 최대 60%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 복수의 중합체의 피크 분자량의 ±5% 이내인 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 피크 분자량의 ±1% 이내인 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 피크 분자량의 ±0.5% 이내인 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 피크 분자량의 ±0.1% 이내인 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 복수의 중합체의 수 평균 분자량에 대한 중량 평균 분자량의 비율은 GPC 및 HPLC와 같은 크로마토그래피 또는 MALDI-MS와 같은 질량 분석법에 의해 결정되는 바와 같이 약 1.0 내지 약 1.5, 약 1.0 내지 약 1.1, 약 1.0 내지 약 1.2, 약 1.0 내지 약 1.3, 약 1.0 내지 약 1.25, 약 1.05 내지 약 1.1, 약 1.05 내지 약 1.2, 약 1.05 내지 약 1.5, 약 1.1 내지 약 1.2, 약 1.1 내지 약 1.5, 또는 약 1.2 내지 약 1.5이다. 일부 실시양태에서, 복수의 중합체의 수 평균 분자량에 대한 중량 평균 분자량의 비율은 GPC 및 HPLC와 같은 크로마토그래피 또는 질량 분석법에 의해 결정되는 바와 같이 적어도 1.1, 적어도 1.2, 적어도 1.3, 적어도 1.5, 적어도 1.6, 적어도 1.7, 적어도 1.8, 적어도 1.9, 적어도 2.0, 적어도 2.5, 또는 적어도 3.0이다.
일부 실시양태에서, 중합체의 중량 평균 분자량은 적어도 약 1000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 중량 평균 분자량은 적어도 약 3000 Da, 적어도 약 6000 Da, 적어도 약 12,000 Da, 또는 적어도 약 24,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 중량 평균 분자량은 적어도 약 3000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 중량 평균 분자량은 적어도 약 6000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 중량 평균 분자량은 적어도 약 12,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 중합체의 중량 평균 분자량은 적어도 약 24,000 Da이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 복수의 변형된 IL-18 폴리펩티드는 복수의 제2 중합체를 포함하며, 여기서 각각의 변형된 IL-18 폴리펩티드는 그에 공유 부착된 복수의 제2 중합체 중 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 제2 중합체의 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%는 MALDI-MS 및 ESI-MS와 같은 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 복수의 제2 중합체의 피크 분자량의 ±10% 이내인 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 복수의 제2 중합체의 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 복수의 제2 중합체의 피크 분자량의 ±5% 이내인 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 복수의 제2 중합체의 최대 50%, 최대 60%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 복수의 제2 중합체의 피크 분자량의 ±10% 이내인 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 복수의 제2 중합체의 최대 50%, 최대 60%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%는 질량 스펙트럼에 의해 결정되는 바와 같이 복수의 제2 중합체의 피크 분자량의 ±5% 이내인 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 복수의 제2 중합체의 수 평균 분자량에 대한 중량 평균 분자량의 비율은 GPC 및 HPLC와 같은 크로마토그래피 또는 질량 스펙트럼과 같은 질량 분석법에 의해 결정되는 바와 같이 약 1.0 내지 약 1.5, 약 1.0 내지 약 1.1, 약 1.0 내지 약 1.2, 약 1.0 내지 약 1.3, 약 1.0 내지 약 1.25, 약 1.05 내지 약 1.1, 약 1.05 내지 약 1.2, 약 1.05 내지 약 1.5, 약 1.1 내지 약 1.2, 약 1.1 내지 약 1.5, 또는 약 1.2 내지 약 1.5이다. 일부 실시양태에서, 복수의 제2 중합체의 수 평균 분자량에 대한 중량 평균 분자량의 비율은 GPC 및 HPLC와 같은 크로마토그래피 또는 질량 분석법에 의해 결정되는 바와 같이 적어도 1.1, 적어도 1.2, 적어도 1.3, 적어도 1.5, 적어도 1.6, 적어도 1.7, 적어도 1.8, 적어도 1.9, 적어도 2.0, 적어도 2.5, 또는 적어도 3.0이다.
일부 실시양태에서, 제2 중합체의 중량 평균 분자량은 적어도 약 3000 Da, 적어도 약 6000 Da, 적어도 약 12,000 Da, 또는 적어도 약 24,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 제2 중합체의 중량 평균 분자량은 적어도 약 3000 Da이다. 일부 실시양태에서, 제2 중합체의 중량 평균 분자량은 적어도 약 6000 Da이다. 일부 실시양태에서, 제2 중합체의 중량 평균 분자량은 적어도 약 12,000 Da이다. 일부 실시양태에서, 제2 중합체의 중량 평균 분자량은 적어도 약 24,000 Da이다.
일부 실시양태에서, 복수는 적어도 100, 적어도 1000, 적어도 10000, 적어도 100000, 적어도 1000000, 적어도 10000000개의 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수는 적어도 100개의 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수는 적어도 1000개의 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수는 적어도 10000개의 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수는 적어도 100000개의 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수는 적어도 1000000개의 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수는 적어도 10000000개의 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수는 적어도 100000000개의 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 복수는 약 100, 약 1000, 약 10000, 약 100000, 약 1000000, 약 10000000개의 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수는 약 100개의 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수는 약 1000개의 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수는 약 10000개의 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수는 약 100000개의 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수는 약 1000000개의 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수는 약 10000000개의 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수는 약 100000000개의 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 복수는 적어도 1 ㎍, 적어도 10 ㎍, 적어도 100 ㎍, 적어도 1 mg, 적어도 10 mg, 또는 적어도 100 mg의 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수는 적어도 1 ㎍의 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수는 적어도 10 ㎍의 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수는 적어도 100 ㎍의 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수는 적어도 1 mg의 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수는 적어도 10 mg의 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 복수는 약 100 mg의 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수는 약 1 ㎍, 약 10 ㎍, 약 100 ㎍, 약 1 mg, 약 10 mg, 또는 약 100 mg의 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수는 약 1 ㎍의 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수는 약 10 ㎍의 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수는 약 100 ㎍의 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수는 약 1 mg의 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수는 약 10 mg의 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수는 약 100 mg의 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 변형된 IL-18 폴리펩티드는 선형 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 변형된 IL-18 폴리펩티드는 폴딩된다. 일부 실시양태에서, 변형된 폴리펩티드는 하나 이상의 이황화 결합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 변형된 IL-18 폴리펩티드는 반감기 연장을 위해 공유 부착되는 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시 내용의 변형된 IL-18 폴리펩티드는 혈장 또는 혈청 반감기 연장을 위해 공유 부착되는 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시 내용의 변형된 IL-18 폴리펩티드의 혈장 또는 혈청 반감기는 야생형 IL-18 폴리펩티드의 혈장 또는 혈청 반감기에 비해 적어도 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 또는 10배 더 길다. 일부 실시양태에서, 본 개시 내용의 변형된 IL-18 폴리펩티드의 혈장 또는 혈청 반감기는 야생형 IL-18 폴리펩티드의 혈장 또는 혈청 반감기에 비해 1.5배 내지 10배 더 길다. 일부 실시양태에서, 본 개시 내용의 변형된 IL-18 폴리펩티드의 혈장 또는 혈청 반감기는 야생형 IL-18 폴리펩티드의 혈장 또는 혈청 반감기에 비해 1.5배 내지 2배, 1.5배 내지 4배, 1.5배 내지 6배, 1.5배 내지 8배, 1.5배 내지 10배, 2배 내지 4배, 2배 내지 6배, 2배 내지 8배, 2배 내지 10배, 4배 내지 6배, 4배 내지 8배, 4배 내지 10배, 6배 내지 8배, 6배 내지 10배, 또는 8배 내지 10배 더 길다. 일부 실시양태에서, 본 개시 내용의 변형된 IL-18 폴리펩티드의 혈장 또는 혈청 반감기는 야생형 IL-18 폴리펩티드의 혈장 또는 혈청 반감기에 비해 1.5배, 2배, 4배, 6배, 8배, 또는 10배 더 길다. 일부 실시양태에서, 본 개시 내용의 변형된 IL-18 폴리펩티드의 혈장 또는 혈청 반감기는 적어도 1.5배, 2배, 4배, 6배, 또는 8배 더 길다. 일부 실시양태에서, 본 개시 내용의 변형된 IL-18 폴리펩티드의 혈장 또는 혈청 반감기는 야생형 IL-18 폴리펩티드의 혈장 또는 혈청 반감기에 비해 최대 2배, 4배, 6배, 8배, 또는 10배 더 길다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 변형된 IL-18 폴리펩티드의 혈장 또는 혈청 반감기는 반감기 연장 중합체가 없는 변형된 IL-18 폴리펩티드의 혈장 또는 혈청 반감기에 비해 적어도 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 또는 10배 더 길다. 일부 실시양태에서, 본 개시 내용의 변형된 IL-18 폴리펩티드의 혈장 또는 혈청 반감기는 반감기 연장 중합체가 없는 변형된 IL-18 폴리펩티드의 혈장 또는 혈청 반감기에 비해 1.5배 내지 10배 더 길다. 일부 실시양태에서, 본 개시 내용의 변형된 IL-18 폴리펩티드의 혈장 또는 혈청 반감기는 반감기 연장 중합체가 없는 변형된 IL-18 폴리펩티드의 혈장 또는 혈청 반감기에 비해 1.5배 내지 2배, 1.5배 내지 4배, 1.5배 내지 6배, 1.5배 내지 8배, 1.5배 내지 10배, 2배 내지 4배, 2배 내지 6배, 2배 내지 8배, 2배 내지 10배, 4배 내지 6배, 4배 내지 8배, 4배 내지 10배, 6배 내지 8배, 6배 내지 10배, 또는 8배 내지 10배 더 길다. 일부 실시양태에서, 본 개시 내용의 변형된 IL-18 폴리펩티드의 혈장 또는 혈청 반감기는 반감기 연장 중합체가 없는 변형된 IL-18 폴리펩티드의 혈장 또는 혈청 반감기에 비해 1.5배, 2배, 4배, 6배, 8배, 또는 10배 더 길다. 일부 실시양태에서, 본 개시 내용의 변형된 IL-18 폴리펩티드의 혈장 또는 혈청 반감기는 적어도 1.5배, 2배, 4배, 6배, 또는 8배이다. 일부 실시양태에서, 본 개시 내용의 변형된 IL-18 폴리펩티드의 혈장 또는 혈청 반감기는 반감기 연장 중합체가 없는 변형된 IL-18 폴리펩티드의 혈장 또는 혈청 반감기에 비해 최대 2배, 4배, 6배, 8배, 또는 10배 더 길다.
IV. 약학 조성물
한 측면에서, 본원에 기재된 변형된 IL-18 폴리펩티드; 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물이 본원에 기재된다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 복수의 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 탄수화물, 무기염, 항산화제, 계면활성제, 또는 완충제로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물은 탄수화물을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 탄수화물은 프룩토스, 말토스, 갈락토스, 글루코오스, D-만노스, 소르보스, 락토스, 수크로오스, 트레할로스, 셀로비오스, 라피노스, 멜레지토스, 말토덱스트린, 덱스트란, 전분, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 락티톨, 자일리톨, 소르비톨(글루시톨), 피라노실 소르비톨, 미오이노시톨, 시클로덱스트린, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물은 무기염을 포함한다. 특정 실시양태에서, 무기염은 염화나트륨, 염화칼륨, 염화마그네슘, 염화칼슘, 인산나트륨, 인산칼륨, 황산나트륨, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 약학 조성물은 항산화제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항산화제는 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔, 부틸화 히드록시톨루엔, 메타중아황산칼륨, 갈산프로필, 메타중아황산나트륨, 티오황산나트륨, 비타민 E, 3,4-디히드록시벤조산, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 약학 조성물은 계면활성제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 계면활성제는 폴리소르베이트, 소르비탄 에스테르, 지질, 인지질, 포스파티딜에탄올아민, 지방산, 지방산 에스테르, 스테로이드, EDTA, 아연, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 약학 조성물은 완충제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 완충제는 시트르산, 인산나트륨, 인산칼륨, 아세트산, 에탄올아민, 히스티딘, 아미노산, 타르타르산, 숙신산, 푸마르산, 락트산, 트리스, HEPES, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 완충제는 시트르산, 인산나트륨, 인산칼륨, 아세트산, 에탄올아민, 히스티딘, 아미노산, 타르타르산, 숙신산, 푸마르산, 락트산, 트리스, HEPES, CHAPS, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물은 비경구 또는 경장 투여용으로 제제화된다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 정맥 내 또는 피하 투여용으로 제제화된다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 동결건조된 형태이다.
한 측면에서, 기재된 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함하는 액체 또는 동결건조된 조성물이 본원에 기재된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 동결건조된 분말이다. 일부 실시양태에서, 동결건조된 분말은 완충 용액에 재현탁된다. 일부 실시양태에서, 완충 용액은 완충제, 당, 염, 계면활성제, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 완충 용액은 인산염을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인산염은 나트륨 Na2HPO4이다. 일부 실시양태에서, 염은 염화나트륨이다. 일부 실시양태에서, 완충 용액은 인산 완충 식염수를 포함한다. 일부 실시양태에서, 완충 용액은 만니톨을 포함한다. 일부 실시양태에서, 동결건조 분말은 50 mg/mL 만니톨과 함께 인산염 완충 식염수 용액(pH 7.4)을 포함하는 용액에 현탁된다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 대상체에게 투여되기 직전에 재구성되는 동결건조된 조성물이다.
본원에 기재된 변형된 IL-18 폴리펩티드는 다양한 제형일 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 동결건조 분말로 투여된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 현탁액으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 용액으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 주사 가능한 용액으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 IV 용액으로 투여된다.
V. 변형된 IL-18 폴리펩티드의 합성
본원에 기재된 변형된 IL-18 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드로서 발현되기보다는 화학적으로 합성될 수 있다. 변형된 IL-18 폴리펩티드는 전장의 변형된 IL-18 폴리펩티드의 하나 이상의 단편을 합성하는 단계, 단편을 함께 결찰하는 단계, 및 결찰된 전장 폴리펩티드를 폴딩하는 단계에 의해 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 아미노산 서열에서 적어도 하나의 돌연변이 및 폴리펩티드의 잔기 C68 또는 K70에 공유 부착된 PEG 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 아미노산 서열에서 적어도 하나의 돌연변이 및 폴리펩티드의 잔기 C68, E69, 또는 K70에 공유 부착된 PEG 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, PEG는 변형된 IL-18 폴리펩티드의 위치 68, 69, 또는 70에서 시스테인 잔기에 부착된다. 일부 실시양태에서, PEG 중합체는 적어도 약 1 kDa, 적어도 약 2 kDa, 적어도 약 5 kDa, 적어도 약 10 kDa, 적어도 약 15 kDa, 또는 적어도 약 20 kDa의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, PEG 중합체는 약 1 kDa, 약 2 kDa, 약 5 kDa, 약 10 kDa, 약 15 kDa, 약 20 kDa, 약 25 kDa, 또는 약 30 kDa의 분자량을 갖는다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 아미노산 서열에서 적어도 하나의 돌연변이 및 폴리펩티드의 잔기 C68 또는 K70에 공유 부착된 약 30 kDa의 PEG 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 아미노산 서열에서 적어도 하나의 돌연변이 및 폴리펩티드의 잔기 C68, E69, 또는 K70에 공유 부착된 약 30 kDa의 PEG 중합체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 대상체에게 투여될 때 IFNγ 유도를 향상시킨다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 대상체에게 투여될 때 IL-18BP 중화에 대해 내성이면서 IFNγ 유도를 향상시킨다.
VI. 숙주 세포
한 측면에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함하는 숙주 세포가 본원에 기재된다.
한 측면에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드의 생산 방법이 본원에 기재되며, 상기 방법은 변형된 IL-18 폴리펩티드를 숙주 세포에서 발현시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 포유동물 세포, 조류 세포 또는 곤충 세포이다. . 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 포유동물 세포, 조류 세포, 진균 세포, 또는 곤충 세포이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 CHO 세포, COS 세포 또는 효모 세포이다.
VII. 변형된 IL-18 폴리펩티드의 생물학적 활성
VIIa . 결합 친화도
한 측면에서, IL-18BP보다 IL-18Rα에 대해 더 큰 친화도를 나타내는 변형된 IL-18 폴리펩티드가 본원에 기재된다. 일부 실시양태에서, IL-18Rα, IL-18Rα/β 이종이량체, 또는 IL-18BP에 대한 친화도는 해리 상수(KD)에 의해 측정된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "변형된 IL-18 폴리펩티드/IL-18Rα의 KD"라는 어구는 변형된 IL-18 폴리펩티드와 IL-18Rα의 결합 상호작용의 해리 상수를 의미한다. "변형된 IL-18 폴리펩티드/IL-18Rα/β의 KD"라는 어구는 변형된 IL-18 폴리펩티드와 IL-18Rα/β 이종이량체의 결합 상호작용의 해리 상수를 의미한다. 유사하게, "변형된 IL-18 폴리펩티드/IL-18BP의 KD"라는 어구는 변형된 IL-18 폴리펩티드와 IL-18BP의 결합 상호작용의 해리 상수를 의미한다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 KD로 측정되는 바와 같이 IL-18 결합 단백질(IL-18BP)에 대해서보다 IL-18 수용체(IL-18R)에 더 큰 친화도를 나타내며, 여기서 [KD IL-18R] /[KD IL-18BP]는 1보다 낮다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 KD에 의해 측정되는 바와 같이 IL-18 결합 단백질(IL-18BP)에 대해보다 IL-18 수용체 알파 서브유닛(IL-18Rα)에 대해 10배 미만 더 낮은 친화도, 5배 미만 더 낮은 친화도, 또는 더 큰 친화도를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 KD에 의해 측정되는 바와 같이 IL-18 결합 단백질(IL-18BP)에 대해보다 IL-18 수용체 알파 서브유닛(IL-18Rα)에 대해 10배 미만 더 낮은 친화도를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 KD에 의해 측정되는 바와 같이 IL-18 결합 단백질(IL-18BP)에 대해보다 IL-18 수용체 알파 서브유닛(IL-18Rα)에 대해 5배 미만 더 낮은 친화도를 나타낸다. 일부 실시양태에서, KD는 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 결정된다(예를 들어, 실시예 8, 실시예 10 및 실시예 12 참조). 일부 실시양태에서, KD는 alphaLISA 분석에 의해 결정된다(예를 들어, 실시예 9 참조).
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 KD에 의해 측정되는 바와 같이 IL-18 결합 단백질(IL-18BP)에 대해보다 IL-18 수용체 알파 서브유닛(IL-18Rα)에 대해 10배 미만 더 낮은 친화도, 5배 미만 더 낮은 친화도, 또는 더 큰 친화도를 나타내며, 여기서 [KD IL-18Rα/[KD IL-18BP]는 0.1보다 크다. 일부 실시양태에서, [KD IL-18Rα/[KD IL-18BP]는 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 또는 1보다 크다. 일부 실시양태에서, KD는 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 결정된다(예를 들어, 실시예 8, 실시예 10 및 실시예 12 참조). 일부 실시양태에서, KD는 alphaLISA 분석에 의해 결정된다(예를 들어, 실시예 9 참조).
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 IL-18 수용체 알파(IL-18Rα)에 결합한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 약 200 nM 미만, 약 100 nM 미만, 또는 약 50 nM 미만의 KD로 IL-18Rα에 결합한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 약 200 nM 미만의 KD로 IL-18Rα에 결합한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 약 100 nM 미만의 KD로 IL-18Rα에 결합한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 약 50 nM 미만의 KD로 IL-18Rα에 결합한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 약 10 nM 미만의 KD로 IL-18Rα에 결합한다. 일부 실시양태에서, KD는 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 결정된다(예를 들어, 실시예 8 및 실시예 10 참조).
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 IL-18 수용체 알파/베타(IL-18Rα/β) 이종이량체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 약 100 nM 미만의 KD로 IL-18Rα/β 이종이량체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 약 500 nM 미만의 KD로 IL-18Rα/β 이종이량체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 약 20 nM 미만의 KD로 IL-18Rα/β 이종이량체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 약 10 nM 미만의 KD로 IL-18Rα/β 이종이량체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 약 5 nM 미만의 KD로 IL-18Rα/β 이종이량체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 약 2 nM 미만의 KD로 IL-18Rα/β 이종이량체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 서열 번호 1의 IL-18 폴리펩티드의 KD와 유사한 KD로 IL-18Rα/β에 결합한다. 일부 실시양태에서, KD는 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 결정된다(예를 들어, 실시예 8 및 실시예 11 참조).
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드/IL-18Rα의 KD는 1000 nM 미만, 750 nM 미만, 500 nM 미만, 450 nM 미만, 400 nM 미만, 350 nM 미만, 300 nM 미만 nM, 250 nM 미만, 200 nM 미만, 150 nM 미만, 140 nM 미만, 130 nM 미만, 125 nM 미만, 120 nM 미만, 100 nM 미만이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드/IL-18Rα의 KD는 150 nM 미만, 50 nM 미만, 25 nM 미만, 또는 10 nM 미만이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드/IL-18Rα의 KD는 50 nM 미만이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드/IL-18Rα의 KD는 10 nM 미만이다. 일부 실시양태에서, KD는 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 결정된다(예를 들어, 실시예 8 및 실시예 10 참조).
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드/IL-18Rα/β 이종이량체의 KD는 1000 nM 미만, 750 nM 미만, 500 nM 미만, 450 nM 미만, 400 nM 미만, 350 nM 미만, 300 nM 미만, 250 nM 미만, 200 nM 미만, 150 nM 미만, 140 nM 미만, 130 nM 미만, 125 nM 미만, 120 nM 미만, 100 nM 미만이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드/IL-18Rα/β 이종이량체의 KD는 150 nM 미만, 50 nM 미만, 25 nM 미만, 10 nM 미만, 5 nM 미만, 또는 2 nM 미만이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드/IL-18Rα/β 이종이량체의 KD는 50 nM 미만이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드/IL-18Rα/β 이종이량체의 KD는 10 nM 미만이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드/IL-18Rα/β 이종이량체의 KD는 5 nM 미만이다. 일부 실시양태에서, KD는 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 결정된다(예를 들어, 실시예 8 및 실시예 11 참조).
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드/IL-18BP의 KD는 1000 nM 미만, 750 nM 미만, 500 nM 미만, 450 nM 미만, 400 nM 미만, 350 nM 미만, 300 nM 미만 nM, 250 nM 미만, 200 nM 미만, 150 nM 미만, 140 nM 미만, 130 nM 미만, 125 nM 미만, 120 nM 미만, 100 nM 미만이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드/IL-18BP의 KD는 50 nM 미만, 25 nM 미만, 1 nM 미만, 또는 0.5 nM 미만이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드/IL-18BP의 KD는 약 10 nM이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드/IL-18BP의 KD는 약 2.5 nM이다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드/IL-18BP의 KD는 약 1 nM이다. 일부 실시양태에서, KD는 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 결정된다(예를 들어, 실시예 8 및 실시예 12 참조). 일부 실시양태에서, KD는 alphaLISA 분석에 의해 결정된다(예를 들어, 실시예 9 참조).
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드/IL-18Rα의 KD는 야생형 IL-18/IL-18Rα의 KD와 실질적으로 동일하다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드/IL-18Rα의 KD는 야생형 IL-18/IL-18Rα의 KD보다 더 크다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드/IL-18Rα의 KD는 야생형 IL-18/IL-18Rα의 KD보다 더 낮다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드/IL-18Rα의 KD는 야생형 IL-18/IL-18Rα의 KD보다 최대 10%, 최대 20%, 최대 30%, 최대 40%, 최대 50%, 최대 60%, 최대 70%, 최대 80%, 최대 85%, 또는 최대 90% 더 크다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드/IL-18Rα의 KD는 야생형 IL-18/IL-18Rα의 KD보다 적어도 20% 더 크다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드/IL-18Rα의 KD는 야생형 IL-18/IL-18Rα의 KD보다 적어도 25% 더 크다. 일부 실시양태에서, KD는 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 결정된다(예를 들어, 실시예 8 및 실시예 10 참조).
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드/IL-18Rα의 KD는 야생형 IL-18/IL-18Rα의 KD보다 최대 100%, 최대 200%, 최대 300%, 최대 400%, 최대 500%, 또는 최대 600% 더 크다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드/IL-18Rα의 KD는 야생형 IL-18/IL-18Rα의 KD보다 최대 500% 더 크다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드/IL-18Rα의 KD는 야생형 IL-18/IL-18Rα의 KD보다 약 500% 더 크다. 일부 실시양태에서, KD는 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 결정된다(예를 들어, 실시예 8 및 실시예 10 참조).
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드/IL-18Rα/β 이종이량체의 KD는 야생형 IL-18/IL-18Rα/β의 KD와 실질적으로 동일하다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드/IL-18Rα/β 이종이량체의 KD는 야생형 IL-18/IL-18Rα/β 이종이량체의 KD보다 더 크다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드/IL-18Rα/β 이종이량체의 KD는 야생형 IL-18/IL-18Rα/β 이종이량체의 KD보다 최대 10%, 최대 20%, 최대 30%, 최대 40%, 최대 50%, 최대 60%, 최대 70%, 최대 80%, 또는 최대 90% 더 크다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드/IL-18Rα/β 이종이량체의 KD는 야생형 IL-18/IL-18Rα/β 이종이량체의 KD보다 최대 25% 더 크다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드/IL-18Rα/β 이종이량체의 KD는 야생형 IL-18/IL-18Rα/β 이종이량체의 KD보다 약 25% 더 크다. 일부 실시양태에서, KD는 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 결정된다(예를 들어, 실시예 8 및 실시예 11 참조).
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드/IL-18Rα/β 이종이량체의 KD는 야생형 IL-18/IL-18Rα/β 이종이량체의 KD보다 최대 100%, 최대 200%, 최대 300%, 최대 400%, 최대 500% 더 크다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드/IL-18Rα/β 이종이량체의 KD는 야생형 IL-18/IL-18Rα/β 이종이량체의 KD보다 최대 350% 더 크다. 일부 실시양태에서, KD는 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 결정된다(예를 들어, 실시예 8 및 실시예 11 참조).
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드/IL-18BP의 KD는 야생형 IL-18/IL-18BP의 KD와 실질적으로 동일하다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드/IL-18BP의 KD는 야생형 IL-18/IL-18BP의 KD보다 더 크다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드/IL-18BP의 KD는 야생형 IL-18/IL-18BP의 KD보다 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 더 크다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드/IL-18BP의 KD는 야생형 IL-18/IL-18BP의 KD보다 적어도 25% 더 크다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드/IL-18BP의 KD는 야생형 IL-18/IL-18BP의 KD보다 약 25% 더 크다. 일부 실시양태에서, KD는 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 결정된다(예를 들어, 실시예 8 및 실시예 12 참조). 일부 실시양태에서, KD는 alphaLISA 분석에 의해 결정된다(예를 들어, 실시예 9 참조).
일부 실시양태에서, 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드/IL-18BP의 KD는 야생형 IL-18/IL-18BP의 KD보다 더 크다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드/IL-18BP의 KD는 야생형 IL-18/IL-18BP의 KD보다 적어도 2배, 3배, 5배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 또는 50배 더 크다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드/IL-18BP의 KD는 야생형 IL-18/IL-18BP의 KD보다 적어도 5배 더 크다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드/IL-18BP의 KD는 야생형 IL-18/IL-18BP의 KD보다 적어도 30배 더 크다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드/IL-18BP의 KD는 야생형 IL-18/IL-18BP의 KD보다 약 8배 더 크다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드/IL-18BP의 KD는 야생형 IL-18/IL-18BP의 KD보다 약 35배 더 크다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드/IL-18BP의 KD는 야생형 IL-18/IL-18BP의 KD보다 약 40배 더 크다. 일부 실시양태에서, KD는 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 결정된다(예를 들어, 실시예 8 및 실시예 12 참조). 일부 실시양태에서, KD는 alphaLISA 분석에 의해 결정된다(예를 들어, 실시예 9 참조).
VIIb . 절반 최대 유효 농도(EC 50 )
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 IFNγ 생성을 조절한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드의 IFNγ 유도 능력의 EC50(nM)은 서열 번호 1의 IL-18 폴리펩티드의 EC50(nM)보다 10배 미만 더 높거나, 5배 미만 더 높거나, 더 낮다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드의 IFNγ 유도 능력의 EC50은 서열 번호 1의 IL-18 폴리펩티드의 EC50(nM)보다 10배 미만 더 높다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드의 IFNγ 유도 능력의 EC50은 서열 번호 1의 IL-18 폴리펩티드의 EC50 (nM)보다 5배 미만 더 높다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드의 IFNγ 유도 능력의 EC50(nM)은 서열 번호 1의 IL-18 폴리펩티드의 EC50 (nM)보다 낮다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드의 IFNγ 유도 능력의 EC50은 서열 번호 1의 IL-18 폴리펩티드의 EC50(nM)보다 10배 미만, 8배 미만, 6배 미만, 5배 미만, 4배 미만, 3배 미만, 또는 2 배 미만 더 높다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드의 IFNγ 유도 능력의 EC50은 IFNγ 유도 세포 분석에 의해 측정된다(예를 들어, 실시예 13 참조).
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 IFNγ 생성을 조절하고, 여기서 IFNγ에 대한 변형된 IL-18 폴리펩티드의 EC50(nM)은 서열 번호 1의 IL-18 폴리펩티드의 EC50(nM)보다 더 낮다. 일부 실시양태에서, IFNγ에 대한 변형된 IL-18 폴리펩티드의 EC50(nM)은 서열 번호 1의 IL-18 폴리펩티드의 EC50(nM)보다 적어도 10배 더 낮다. 일부 실시양태에서, IFNγ에 대한 변형된 IL-18 폴리펩티드의 EC50(nM)은 서열 번호 1의 IL-18 폴리펩티드의 EC50(nM)보다 약 10배 더 낮다. 일부 실시양태에서, IFNγ에 대한 변형된 IL-18 폴리펩티드의 EC50(nM)은 서열 번호 1의 IL-18 폴리펩티드의 EC50(nM)보다 약 15배 더 낮다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드의 IFNγ 유도 능력의 EC50은 IFNγ 유도 세포 분석에 의해 측정된다(예를 들어, 실시예 13 참조).
VIII. 치료 방법
한 측면에서, 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 변형된 IL-18 폴리펩티드 또는 약학 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다.
또 다른 측면에서, 암 치료를 필요로 하는 대상체의 암 치료에 사용하기 위한 본원에 제공된 변형된 IL-18 폴리펩티드가 본원에 기재된다. 또 다른 측면에서, 암 치료를 필요로 하는 대상체의 암 치료용 의약의 제조를 위한 본원에 제공된 변형된 IL-18 폴리펩티드가 본원에 기재된다.
일부 실시양태에서, 암은 고형암이다. 일부 실시양태에서, 고형암은 신장암, 피부암, 방광암, 골암, 뇌암, 유방암, 결장직장암, 식도암, 안암, 두경부암, 폐암, 난소암, 췌장암, 또는 전립선 암이다. 일부 실시양태에서, 고형암은 전이성 신세포 암종(전이성 RCC) 또는 흑색종이다. 일부 실시양태에서, 암은 고형암이다. 일부 실시양태에서, 고형암은 암종 또는 육종이다.
일부 실시양태에서, 암은 액체 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 혈액암이다. 일부 실시양태에서, 액체 암은 골수종 또는 백혈병이다. 일부 실시양태에서, 액체 암은 백혈병, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 또는 다발성 골수종이다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 (i) 변형된 IL-18 폴리펩티드가 1일 1회 투여되거나; (ii) 변형된 IL-18 폴리펩티드가 하루의 기간에 걸쳐 대상체에게 여러 번 투여되는 추가의 실시양태를 포함하여, 단회 용량의 유효량의 변형된 IL-18 폴리펩티드로 투여된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 매일, 격일로, 주 3회, 주 1회, 2주마다, 3주마다, 4주마다, 5주마다, 3일마다, 4일마다, 5일마다, 6일마다, 격주, 주 3회, 주 4회, 주 5회, 주 6회, 1개월에 1회, 1개월에 2회, 1개월에 3회, 2개월마다 1회 , 3개월마다 1회, 4개월마다 1회, 5개월마다 1회, 또는 6개월마다 1회 투여된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 매일 투여된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 격일로 투여된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 격일로 투여된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 주 3회 투여된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 주 1회 투여된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 2주마다 투여된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 3주마다 투여된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 4주마다 투여된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 5주마다 투여된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 3일마다 투여된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 4일마다 투여된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 5일마다 투여된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 6일마다 투여된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 격주로 투여된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 주 3회 투여된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 주 4회 투여된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 주 5회 투여된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 주 6회 투여된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 1개월에 1회 투여된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 1개월에 2회 투여된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 1개월에 3회 투여된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 2개월마다 1회 투여된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 3개월마다 1회 투여된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 4개월마다 1회 투여된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 5개월마다 1회 투여된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 6개월마다 1회 투여된다.
일부 실시양태에서, 대상체는 5 내지 75세이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 5 내지 10, 5 내지 15, 5 내지 18, 5 내지 25, 5 내지 35, 5 내지 45, 5 내지 55, 5 내지 65, 5 내지 75, 10 내지 15, 10 내지 18, 10 내지 25, 10 내지 35, 10 내지 45, 10 내지 55, 10 내지 65, 10 내지 75, 15 내지 18, 15 내지 25, 15 내지 35, 15 내지 45, 15 내지 55, 15 내지 65, 15 내지 75, 18 내지 25, 18 내지 35, 18 내지 45, 18 내지 55, 18 내지 65, 18 내지 75, 25 내지 35, 25 내지 45, 25 내지 55, 25 내지 65, 25 내지 75, 35 내지 45, 35 내지 55, 35 내지 65, 35 내지 75, 45 내지 55, 45 내지 65, 45 내지 75, 55 내지 65, 55 내지 75, 또는 65 내지 75세이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 적어도 5, 10, 15, 18, 25, 35, 45, 55, 또는 65세이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 최대 10, 15, 18, 25, 35, 45, 55, 65, 또는 75세이다.
일부 실시양태에서, 방법은 변형된 IL-18 폴리펩티드 또는 약학 조성물의 동결건조된 형태를 재구성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 또는 약학 조성물은 투여 전에 재구성된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 투여 직전, 투여 최대 약 5분 전, 투여 최대 약 20분 전, 투여 최대 약 40분 전, 투여 최대 1시간 전, 또는 투여 최대 약 4시간 전에 재구성된다.
IX. 제조(합성) 방법
또한 변형된 IL-18 폴리펩티드의 합성 방법이 본원에 제공된다. 일부 경우에, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 재조합적으로 발현되기보다는 화학적으로 합성된다. 일부 경우에, 변형된 IL-18 폴리펩티드의 여러 단편 펩티드 전구체가 합성되고 이어서 적합한 결찰 방법론(예를 들어, 알파-케토산 히드록실아민(KAHA) 결찰)을 사용하여 함께 결찰된다. 일부 경우에, 결찰 후, 생성된 변형된 IL-18 폴리펩티드는 폴딩되어 재조합 또는 야생형 IL-18 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 2차 및 3차 구조를 갖는 변형된 IL-18 폴리펩티드를 생성한다.
일부 경우에, 변형된 IL-18 폴리펩티드의 메티오닌 잔기는 안정성 목적을 위해 그리고 최종 변형된 IL-18 폴리펩티드를 생성하기 위한 선형의 변형된 IL-18 폴리펩티드의 폴딩을 돕기 위해 치환된다. 메티오닌의 측쇄는 합성 과정(예를 들어, 펩티드 합성 및 단백질 폴딩) 동안 산화되기 쉬우므로, 일부 경우에, 균일성 결여로 인해 특정 용도에 대해 불충분한 품질의 최종 IL-18 폴리펩티드가 생성된다.
일부 경우에, 이러한 제한을 극복하기 위해, 변형된 IL-18 폴리펩티드의 모든 메티오닌 잔기가 노르류신 잔기로 교체되었다. 일부 경우에, 선형 펩티드의 합성은 성공적이었지만, 결과는 소수성 및 침전 경향의 증가와 같은 불안정성의 징후, 및 탈조정된 생물학적 활성을 나타냈으며, 이는 잠재적으로 미스폴딩이 야생형 또는 재조합 IL-18와 비교하여 변형된 IL-18 폴리펩티드의 변경된 2차/3차 구조를 초래하였기 때문이다.
일부 경우에, 부분 메티오닌 산화의 복합 혼합물 없이 균일한 선형 단백질을 생성하려는 시도에서 전구체 펩티드의 합성 동안 산화된 메티오닌을 직접 포함하도록 변형된 IL-18 폴리펩티드를 합성하였다. 일부 경우에, 변형된 선형 IL-18 폴리펩티드가 성공적으로 합성되었지만, 메티오닌을 다시 산화되지 않은 형태로 환원시키는 데 어려움이 있었다.
이러한 문제를 해결하기 위해, 메티오닌 잔기를 O-메틸-L-호모세린(Omh) 잔기로 대체한 새로운 변형된 IL-18 폴리펩티드 변이체가 설계되었다. Omh는 메티오닌의 황 원자가 산소로 대체된 천연 메티오닌의 구조적 유사체이다. 황 원자가 없기 때문에, Omh 잔기는 산화되는 경향이 낮으므로 변형된 IL-18 폴리펩티드에 더 큰 안정성과 합성/정제 용이성을 제공할 것으로 예상된다. 추가로, 천연 메티오닌 잔기와 Omh의 더 큰 구조적 상동성과 함께 노르류신 잔기에 비해 Omh 잔기의 증가된 친수성은 메티오닌 대신에 노르류신 잔기를 가진 변이체에 비해 변형된 IL-18 폴리펩티드의 적절한 폴딩 및 더 큰 안정성을 촉진할 것으로 예측된다. 따라서, 메티오닌 잔기를 Omh 잔기로 대체하는 화학적으로 합성된 변형된 IL-18 폴리펩티드가 다른 합성된 변형된 IL-18 폴리펩티드에 비해 몇 가지 이점을 제공할 것으로 예측된다.
한 측면에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드의 제조 방법이 본원에 기재된다. 또 다른 측면에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드의 제조 방법으로서, 변형된 IL-18 폴리펩티드의 2개 이상의 단편을 합성하는 단계 및 단편을 결찰하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다. 또 다른 측면에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드의 제조 방법으로서, a. 변형된 IL-18 폴리펩티드의 2개 이상의 단편을 합성하는 단계, b. 단편을 결찰하는 단계; 및 c. 결찰된 단편을 폴딩하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다. 또 다른 측면에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드의 제조 방법으로서, a. 변형된 IL-18 폴리펩티드의 2개 이상의 단편을 제공하는 단계; b. 단편을 결찰하는 단계; 및 c. 결찰된 단편을 폴딩하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다. 또 다른 측면에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드의 제조 방법으로서, 변형된 IL-18 폴리펩티드의 2개 이상의 단편을 결찰하는 단계로 변형된 IL-18 폴리펩티드의 2개 이상의 단편 중 적어도 하나는 합성되는 것인 단계, 및 결찰된 단편을 폴딩하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드의 2개 이상의 단편은 화학적으로 합성된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드의 2개 이상의 단편은 고상 펩티드 합성에 의해 합성된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드의 2개 이상의 단편은 자동 펩티드 합성기에서 합성된다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 펩티드 단편으로부터 결찰된다. 일부 실시양태에서, 변형된 펩티드는 2개의 펩티드 단편으로부터 결찰된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 3개의 펩티드 단편으로부터 결찰된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 4개의 펩티드 단편으로부터 결찰된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 2 내지 10개의 펩티드 단편으로부터 결찰된다.
일부 실시양태에서, 2개 이상의 단편은 N-말단 단편, C-말단 단편, 및 선택적으로 하나 이상의 내부 단편을 포함하며, 여기서 N-말단 단편은 변형된 IL-18 폴리펩티드의 N-말단을 포함하고 C-말단 단편은 변형된 IL-18 폴리펩티드의 C-말단을 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 N-말단 단편 및 하나 이상의 내부 단편은 각각의 단편의 C-말단 잔기로서 알파-케토 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 알파-케토 아미노산은 알파-케토-페닐알라닌, 알파-케토-티로신, 알파-케토-발린, 알파-케토-류신, 알파-케토-이소류신, 알파-케토-노르류신, 및 알파-케토-O-메틸호모세린으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 각각의 C-말단 단편 및 하나 이상의 내부 단편은 각각의 단편의 N-말단 잔기로서 히드록실아민 또는 시클릭 히드록실아민 작용성을 갖는 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 히드록실아민 또는 시클릭 히드록실아민 작용성을 갖는 각각의 잔기는 5-옥사프롤린 잔기이다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드의 2개 이상의 단편은 함께 결찰된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드의 3개 이상의 단편은 순차적 방식으로 결찰된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드의 3개 이상의 단편이 원-포트 반응으로 결찰된다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드의 2개 이상의 단편을 합성하는 단계는 4개의 단편을 합성하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드의 2개 이상의 단편을 제공하는 단계는 4개의 단편을 제공하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 4개의 단편은 각각이 표 13에 제공된 것들로부터 독립적으로 선택된 임의의 서열과 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 4개의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 4개의 단편은 표 13에 제공된 것들과 적어도 약 85%의 서열 동일성을 갖는 4개의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 4개의 단편은 표 13에 제공된 것들과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 4개의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 4개의 단편은 표 13에 제공된 것들과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 4개의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 4개의 단편은 표 13에 제공된 4개의 단편을 포함한다.
[표 13]
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
일부 실시양태에서, 4개의 단편은 N-말단 단편, 제1 내부 단편, 제2 내부 단편, 및 C-말단 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, N-말단 단편은 변형된 IL-18 폴리펩티드의 아미노산 1-30에 상응하는 잔기를 포함하며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, N-말단 단편은 서열 번호 1의 서열과 비교하여 N-말단 연장부를 포함한다. 일부 실시양태에서, N-말단 단편은 서열 번호 201에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, N-말단 단편은 서열 번호 201-209 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 내부 단편은 변형된 IL-18 폴리펩티드의 아미노산 31-62에 상응하는 잔기를 포함하며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 제1 내부 단편은 서열 210에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 내부 단편은 서열 번호 210-217 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 내부 단편은 변형된 IL-18 폴리펩티드의 아미노산 63-115에 상응하는 잔기를 포함하며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 제2 내부 단편은 서열 번호 227에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 내부 단편은 서열 번호 227-236 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 내부 단편은 변형된 IL-18 폴리펩티드의 아미노산 31-74에 상응하는 잔기를 포함하며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 제1 내부 단편은 서열 번호 218에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 내부 단편은 서열 번호 218-226 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 내부 단편은 변형된 IL-18 폴리펩티드의 아미노산 75-115에 상응하는 잔기를 포함하며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, 제2 내부 단편은 서열 번호 237에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 내부 단편은 서열 번호 237-242 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, C-말단 단편은 변형된 IL-18 폴리펩티드의 아미노산 116-157에 상응하는 잔기를 포함하며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 위치 번호는 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 한다. 일부 실시양태에서, C-말단 단편은 서열 번호 243에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, C-말단 단편은 서열 번호 243-248 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, N-말단 단편, 제1 내부 단편, 제2 내부 단편, 및 C-말단 단편은 변형된 IL-18 폴리펩티드에서 각각 N-말단에서 C-말단으로 배열된다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 결찰된 단편을 재배열하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 결찰된 단편을 재배열하는 단계는 선형 IL-18 폴리펩티드의 하나 이상의 뎁시펩티드 결합을 재배열하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 뎁시펩티드 결합은 재배열되어 하나 이상의 아미드 결합을 형성한다. 일부 실시양태에서, 뎁시펩티드 결합은 단편의 결찰 결과로서 형성된다. 일부 실시양태에서, 뎁시펩티드 결합은 호모세린 잔기의 히드록실 모이어티와 호모세린 잔기에 인접한 아미노산 사이에 있다. 일부 실시양태에서, 결찰된 단편을 재배열하는 단계는 각각의 단편이 결찰된 후에 발생한다.
일부 실시양태에서 결찰된 단편은 폴딩된다. 일부 실시양태에서, 폴딩은 은 변형된 IL-18 폴리펩티드 내에 하나 이상의 이황화 결합을 형성하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 결찰된 단편은 폴딩 과정을 거친다. 일부 실시양태에서, 결찰된 단편은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 폴딩된다. 일부 실시양태에서, 결찰된 폴리펩티드 또는 폴딩된 폴리펩티드는 그에 하나 이상의 중합체를 부착함으로써 추가로 변형된다. 일부 실시양태에서, 결찰된 폴리펩티드 또는 폴딩된 폴리펩티드는 PEG화에 의해 추가로 변형된다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 합성된다.
본원에 제공된 특정 변형된 IL-18 폴리펩티드의 예시적인 비제한적 합성 반응식이 [도 5] 및 [도 9-17]에 도시되어 있다. 일반적으로, 일부 실시양태에서, 서열 번호 1에 대해 설정된 아미노산 서열과 비교하여 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 번호 1-30에 상응하는 아미노산 또는 아미노산 전구체를 함유하는 제1 단편("세그먼트 1")이 제조된다(예를 들어, 고상 펩티드 합성(SPPS)에 의해). 이것은 일부 실시양태에서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 번호 31-74 또는 잔기 번호 31-62에 상응하는 아미노산 또는 아미노 전구체를 함유하는 제2 단편("세그먼트 2")에 커플링되어 단일 단편("세그먼트 12")을 생성한다. 이 제2 단편은 일부 실시양태에서 SPPS에 의해서도 제조된다. 유사하게, 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 번호 63-115 또는 75-115에 상응하는 아미노산 또는 아미노산 전구체를 갖는 제3 단편은, 일부 실시양태에서, SPPS에 의해 제조된다. 이 제3 단편은 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 번호 116-157에 상응하는 아미노산 또는 아미노산 전구체를 포함하는, 일부 실시양태에서 SPPS에 의해 제조된, 제4 단편("세그먼트 4")에 커플링되어 단일 단편("세그먼트 34")을 생성한다. 그런 다음 세그먼트 12와 세그먼트 34가 커플링되어 전장의 단편("세그먼트 1234")을 생성한다. 단편을 결찰하는 데 KAHA 결찰이 사용되는 실시양태에서, 그 후 부위 잔기가 재배열되어 결찰 지점에서 아미드 결합을 생성한다(예를 들어, 아미드 결합으로 뎁시펩티드 호모세린 재배열). 마지막으로, 그 후 전장의 선형 단편이 폴딩되어 합성 IL-18 폴리펩티드를 생성한다.
[도 5]는 서열 번호 26에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 변형된 IL-18 폴리펩티드의 합성을 위한 예시적인 합성 반응식을 보여준다. 이 변형된 IL-18 폴리펩티드는 단편 2의 합성에서 PEG 링커를 통해 잔기 K70에 부착된 아지드 작용성을 포함한다. 이 아지드 작용성은 나중에 더 큰 PEG 기를 부착하기 위한 접합 핸들로서 작용한다.
[도 9]는 변형된 IL-18 폴리펩티드의 합성을 위한 예시적인 합성 반응식을 보여준다. 이 도면에 도시된 합성은 또한 [도 5]와 유사하게 위치 70에 아지드 보유 PEG 리신 잔기를 포함한다.
[도 10]은 변형된 IL-18 폴리펩티드의 합성을 위한 추가적인 예시 합성 반응식을 보여준다. 변형된 IL-18 폴리펩티드는 서열 번호 25에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다. 도시된 IL-18 폴리펩티드는 시스테인 잔기를 함유하지 않으며 접합 핸들을 포함하도록 변형되지 않아서, 본원에 제공된 기술을 사용하여 부위 특이적 PEG화에 부적합하다.
[도 11]은 서열 번호 31에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 변형된 IL-18 폴리펩티드의 합성을 위한 예시적인 합성 반응식을 보여준다. [도 5, 9, 및 10]에서 제시된 합성과 비교하여, IL-18은 74/75가 아닌 62/63 위치에 결찰된다.
[도 12]는 서열 번호 32에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 변형된 IL-18 폴리펩티드의 합성을 위한 예시적인 합성 반응식을 보여준다. 변형된 IL-18 폴리펩티드는 아지드 작용성을 보유하는 변형된 리신 잔기를 포함한다.
[도 13]은 서열 번호 33에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 변형된 IL-18 폴리펩티드의 합성을 위한 예시적인 합성 반응식을 보여준다. 도시된 IL-18 폴리펩티드는 시스테인 잔기를 함유하지 않으며 접합 핸들을 포함하도록 변형되지 않아서, 본원에 제공된 기술을 사용하는 부위 특이적 PEG화에 부적합하다.
[도 14]는 서열 번호 34에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 변형된 IL-18 폴리펩티드의 합성을 위한 예시적인 합성 반응식을 보여준다. 변형된 IL-18 폴리펩티드는 아지드 작용성을 보유하는 변형된 리신 잔기를 포함한다.
[도 15]는 PEG 기를 통해 아지드 모이어티가 부착된 변형된 아스파르테이트 잔기를 포함하는 변형된 IL-18 폴리펩티드의 합성을 위한 예시적인 합성 반응식을 보여준다. 변형된 아스파르테이트 잔기는 임의의 원하는 위치(예를 들어, 잔기 68, 69, 또는 70)에 배치될 수 있다.
[도 16]는 PEG 기를 통해 아지드 모이어티가 부착된 변형된 글루타메이트 잔기를 포함하는 변형된 IL-18 폴리펩티드의 합성을 위한 예시적인 합성 반응식을 보여준다. 변형된 글루타메이트 잔기는 임의의 원하는 위치(예를 들어, 잔기 68, 69, 또는 70)에 배치될 수 있다.
[도 17]은 세그먼트 3 상의 아미노산 잔기(예를 들어, 잔기 68, 69, 또는 70)에 부착된 아지드기를 포함하는 변형된 IL-18 폴리펩티드의 제조에 사용되는 일반적인 합성 반응식을 보여준다. 표시된 R 기는 아지드 작용성이 시스테인, 리신, 아스파르테이트, 및 글루타메이트를 비롯한 다양한 변형된 잔기를 통해 부착될 수 있음을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드로 발현된다. 일부 실시양태에서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli)를 사용하여 발현된다.
본 개시 내용 및 그의 이점이 상세히 설명되었지만, 첨부된 청구범위에 정의된 개시 내용의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 변경, 대체 및 변형이 본원에서 이루어질 수 있음을 이해해야 한다.
X. 합성 IL-18
또한, 화학적으로 합성된 IL-18가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 합성된 IL-18은 서열 번호 1의 재조합 IL-18과 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 합성된 IL-18은 본원에 제공된 바와 같은 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 변형은 본원에 제공된 바와 같은 변형된 IL-18 폴리펩티드의 생물학적 활성을 조절한다.
화학적으로 합성된 IL-18은 재조합 IL-18에 비해 이점을 제공하는데, 그 이유는 이들이 임의의 원하는 변형을 부위 특이적 방식으로 쉽게 포함하도록 합성될 수 있어 생물학적 활성을 쉽게 조절할 수 있기 때문이다.
한 측면에서, 합성 IL-18 폴리펩티드로서, 잔기 21-41, 잔기 60-80, 및 잔기 106-126의 영역으로부터 선택된 위치에 호모세린(Hse) 잔기를 포함하는 합성 IL-18 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 하는 것인 합성 IL-18 폴리펩티드가 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 합성 IL-18 폴리펩티드는 잔기 21-41, 잔기 60-80, 및 잔기 106-126의 각각의 영역에 Hse 잔기를 포함한다.
일부 실시양태에서, 합성 IL-18 폴리펩티드는 위치 31에 Hse 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 합성 IL-18 폴리펩티드는 위치 63 또는 위치 75에서 Hse 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 합성 IL-18 폴리펩티드는 위치 63에서 Hse 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 합성 IL-18 폴리펩티드는 위치 75에서 Hse 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 합성 IL-18 폴리펩티드는 위치 116에서 Hse 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 합성 IL-18 폴리펩티드는 위치 63 및 75 중 적어도 하나, 위치 31, 및 위치 116에서 Hse 잔기를 포함한다.
일부 실시양태에서, 합성 IL-18 폴리펩티드는 서열 번호 1에서 적어도 하나의 메티오닌 잔기의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열 번호 1에서 적어도 하나의 메티오닌 잔기의 아미노산 치환은 M33, M51, M60, M86, M113, 또는 M150에서 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 합성 IL-18 폴리펩티드는 적어도 3개의 메티오닌 잔기의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 합성 IL-18 폴리펩티드는 적어도 5개의 메티오닌 잔기의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 합성 IL-18 폴리펩티드는 적어도 6개의 메티오닌 잔기의 치환을 포함한다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 메티오닌 잔기는 O-메틸-호모세린(Omh) 잔기로 치환된다. 일부 실시양태에서, 적어도 3개의 메티오닌 잔기는 Omh 잔기로 치환된다. 일부 실시양태에서, 적어도 5개의 메티오닌 잔기는 Omh 잔기로 치환된다. 일부 실시양태에서, 각각의 메티오닌 치환은 노르류신 또는 Omh 잔기로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 각각의 메티오닌 치환은 Omh 잔기로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 서열 번호 1의 각각의 메티오닌 잔기는 Omh 잔기로 치환된다.
일부 실시양태에서, 합성 IL-18 폴리펩티드는 서열 번호 1에 대한 추가 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 합성 IL-18 폴리펩티드는 서열 번호 1의 아미노산 서열과 적어도 약 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 합성 IL-18 폴리펩티드는 합성 IL-18 폴리펩티드의 잔기에 공유 부착되는 중합체를 포함한다.
본 개시 내용은 하기 실시예에서 추가로 예시되며, 이는 예시 목적으로만 제공되고 어떠한 방식으로든 본 개시 내용을 제한하려는 의도가 아니다.
실시예
실시예 1 - 변형된 IL-18 폴리펩티드의 합성
고상 펩티드 합성(SPPS)을 사용하여 합성된 개별 펩티드를 결찰함으로써 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는 변형된 IL-18 폴리펩티드를 제조하였다. 개별 펩티드는 하기 기재된 방법을 사용하여 자동 펩티드 합성기에서 합성하였다.
상업적으로 이용 가능한 시약은 Sigma-Aldrich, Acros, Merck 또는 TCI Europe에서 구입하여 추가 정제 없이 사용하였다. 고상 펩티드 합성에 적합한 측쇄 보호기를 갖는 플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc) 아미노산은 Novabiochem, Christof Senn Laboratories AG 또는 PeptART에서 구입하여 공급된 상태로 사용하였다. 펩티드 합성에 사용되는 폴리에틸렌 글리콜 유도체는 Polypure에서 구입하였다. 분석 및 분취용 HPLC 정제에 Sigma Aldrich의 HPLC 등급 CH3CN을 사용하였다.
펩티드 및 단백질은 4-히드록시-α-시아노신남산(HCCA)을 매트릭스로 사용하는 이중 ESI/MALDI-FTICR 소스가 장착된 Bruker solariX(9.4T magnet) 분광계를 사용하여 고분해능 푸리에 변환 질량 분석법(FTMS)으로 특성화하였다. CD 스펙트럼은 1.0 mm 경로 길이 셀을 이용한 Jasco J-715 분광기로 기록하였다. CD 스펙트럼은 표준 감도(100 mdeg), 0.5 nm 데이터 피치, 50 nm/분 스캐닝 속도 및 1 nm 대역폭으로 연속 스캐닝 모드로 25℃에서 수집하였다. CD 곡선은 5회 스캔을 평균하고 배경 신호를 차감하여 얻었다.
펩티드 세그먼트, 결찰된 펩티드, 및 선형 단백질을 분석하고 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)로 정제하였다. 펩티드 분석 및 반응 모니터링은 이중 펌프, 혼합기 및 인라인 탈기 장치, 자동 샘플러, 가변 파장 UV 검출기(220 nm 및 254 nm에서 용리액의 동시 모니터링), 및 100 μL 주입 루프가 장착된 주입기가 있는 분석 Jasco 기기에서 수행하였다. 펩티드 세그먼트의 정제는 10-20 mL 주입 루프가 있는 Gilson 분취용 기기 또는 Jasco 반분취용 기기에서 수행하였다. 모든 경우에 이동상은 0.1% TFA(v/v) 가 포함된 MilliQ-H2O(완충액 A) 및 0.1% TFA(v/v) 가 포함된 HPLC 등급 CH3CN(완충액 B)이었다. 분석용 HPLC는 실온에서 bioZen™ Intact C4 컬럼(3.6 ㎛, 150 x 4.6 mm) 또는 60℃에서 1 mL/분의 유속으로 Aeris WIDEPORE XB-C18 컬럼(3.6 ㎛, 150 x 4.6 mm)에서 수행하였다. 분취용 HPLC는 Gemini NX-C18 110 Å 컬럼(5 ㎛, 250 x 50 mm) 또는 Shiseido capcell Pak UG80 C18 컬럼(5 ㎛, 250 x 50 mm)에서 40℃ 또는 60℃에서 40 mL/분의 유속으로 수행하였다. 반분취용 HPLC는 Shiseido capcell Pak C18 컬럼(5 ㎛, 250 x 20 mm)에서 60℃에서 10 mL/분의 유속으로 수행하였다.
펩티드 세그먼트는 Fmoc-SPPS 화학을 사용하여 자동 펩티드 합성기에서 합성하였다. 측쇄 보호기를 갖는 하기 Fmoc-아미노산을 사용하였다: Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Asp(OBno)-OH, Fmoc-Asp(OAll)-OH, Fmoc-Cys(Acm)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Lys(alloc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Met(O)-OH, Fmoc-Hse(Me)-OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH. 필요한 경우 Fmoc-슈도프롤린 디펩티드를 합성에 포함시켰다. Fmoc 탈보호는 DMF 중 20% 피페리딘(2 x 8분) 또는 0.1 M Cl-HOBt 함유 DMF 중 25% 피페리딘(2 x 8분) 또는 0.1 M Cl-HOBt 함유 DMF 중 20% 피페리딘(2 x 8분)으로 수행하였으며, 완전한 Fmoc 제거를 보장하기 위해 피드백 루프를 이용하여 304 nm에서 UV로 모니터링하였다. 커플링은 Fmoc-아미노산(수지 치환에 대해 3.0 - 5.0 당량), 커플링 시약으로서 HCTU 또는 HATU(2.9 - 4.9 당량) 및 DMF 중 DIPEA 또는 NMM(6 - 10 당량)을 사용하여 실온 또는 50℃에서 수행하였다. 3분 동안 사전 활성화한 후, 용액을 수지에 첨가하고 아미노산에 따라 15분, 30분 또는 2시간 동안 반응시켰다. 일부 경우에, 이중 커플링이 필요하였다. 일부 경우에, 미반응 자유 아민을 캡핑하기 위해 수지를 DMF 중 20% 아세트산 무수물로 처리하였다. 필요한 경우 LiCl 세척을 수행하였다. 알릴옥시카르보닐(Alloc) 탈보호는 실온에서 30분 동안 질소 퍼징된 디클로로메탄 중 페닐실란(24 당량) 및 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0)(0.5 당량)을 사용하여 질소 하에서 수행하였다.
SPPS에 의한 펩티드 세그먼트의 합성은 다음 샘플 프로토콜을 사용하여 미세절단에 의해 모니터링하였다: 10 mg의 펩티딜 수지를 실온에서 1.5시간 동안 절단 칵테일(200 μL)로 처리하였다. 수지를 여과하고 여액을 농축하고 냉각 디에틸 에테르로 처리하고, 트리츄레이션(trituration)하고 원심분리하였다. 에테르 층을 조심스럽게 따라내고, 잔류물을 디에틸 에테르에 다시 현탁시키고, 트리츄레이션하고 원심분리하였다. 에테르 세척을 2회 반복하였다. 생성된 페이스트를 0.1% TFA(v/v)가 포함된 1:1 CH3CN/H2O에 재가용화하고 60℃에서 Aeris WIDEPORE XB-C18 컬럼(3.6 ㎛, 150 x 4.6 mm)을 사용하는 분석용 HPLC 및 MALDI- TOF로 분석하였다.
펩티드 합성이 완료되면, 실온에서 2시간 동안 절단 칵테일을 사용하여 펩티드를 수지로부터 절단하였다. 수지를 여과하고 여액을 농축하고 냉각 디에틸 에테르로 처리하고, 트리츄레이션하고 원심분리하였다. 에테르 층을 조심스럽게 따라내고, 잔류물을 디에틸 에테르에 다시 현탁시키고, 트리츄레이션하고 원심분리하였다. 에테르 세척을 2회 반복하였다. 생성된 미정제 펩티드를 진공 하에 건조시키고 -20℃에서 보관하였다.
본원에서 제공되는 변형된 IL-18 폴리펩티드를 생성하기 위해 사용되는 일반적인 합성 반응식은 [도 8]에 도시한다. 간략하게, SPPS를 사용하여 선형 펩티드 단편([도 8]에 나타낸 바와 같은 단편 1-4)을 제조하고, 야생형 IL-18의 아미노산 서열(서열 번호 1)에 대한 임의의 원하는 변형을 합성 동안 포함시켰다. 개별 세그먼트의 정제 후, 세그먼트 1과 2를 함께 결찰하고, 별도로 세그먼트 3과 4을 함께 결찰하였다. 그 후, 생성된 세그먼트 1-2 및 3-4를 함께 결찰하고 전체적으로 탈보호하여 미정제 합성 IL-18 폴리펩티드를 얻었다.
그 후 IL18-Seg1234-Acm의 Acm 기를 전체적으로 탈보호하고 정제하여 합성 IL18 선형 단백질을 제공하였다.
1.1 IL-18 단편의 합성을 위한 일반적인 절차
1.1.1. 세그먼트 1: IL18(1-29)-Leu-α- 케토산 .
Figure pct00040
치환 용량이 0.25 mmol/g인 보호된 Fmoc-α-Phe-케토산이 사전 로딩된 Rink Amide MBHA 수지에서 IL18(1-29)-Leu-α-케토산 세그먼트를 합성한다. 합성은 일반적인 방법 섹션에 기재된 절차를 사용하여 자동 Fmoc-SPPS에 의해 Tyr 1까지 수행한다.
세그먼트 1의 변이체: 일부 경우에, Glu 6을 Lys로 치환하였다.
일반적인 방법 섹션에 기재된 바와 같이 미세절단 분석을 수행함으로써 펩티드 합성의 진행을 모니터링한다. 절단 칵테일은 95:2.5:2.5 TFA/DODT/H2O의 혼합물로 구성된다.
합성이 완료되면, 일반적인 방법에 기재된 바와 같이, 95:2.5:2.5 TFA/DODT/H2O(10 mL/g 수지)의 혼합물에서 실온에서 2시간 동안 수지를 교반하여 펩티드를 수지로부터 절단한다. 미정제 IL18(1-29)-Leu-α-케토산 세그먼트의 정제는 25분 내에 0.1% TFA(v/v)가 포함된 10에서 60%까지의 CH3CN의 구배와 함께, 60℃에서 40 mL/분의 유속으로 Shiseido capcell Pak UG80 C18 컬럼(5 ㎛, 250 x 50 mm)을 사용하는 분취용 HPLC로 수행한다. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조하여 IL18(1-29)-Leu-α-케토산 세그먼트(IL18-Seg1)를 얻는다. 분석용 HPLC 및 ESI-HRMS를 사용하여 생성물의 순도 및 질량을 확인한다.
1.1.2 세그먼트 2: Opr -IL18(32-61)- 광보호 -Val-α- 케토산 및 Opr -IL18(32-73)-광보호-Leu-α-케토산
1.1.2.1 Opr -IL18(32-61)- 광보호 -Val-α- 케토산
Figure pct00041
치환 용량이 0.24 mmol/g인 보호된 Fmoc-Val-광보호-α-케토산이 사전 로딩된 Rink Amide MBHA 수지에서 Opr-IL18(32-61)-Val-광보호-α-케토산 세그먼트를 합성한다. 합성은 일반적인 방법 섹션에 기재된 절차를 사용하여 자동 Fmoc-SPPS에 의해 Asp 32까지 수행한다. 이 세그먼트의 합성에 슈도프롤린 디펩티드가 필요하며 이를 위치 54-55, 49-50 및 35-36에서 수동으로 커플링하였다. Boc-5-(S)-옥사프롤린을 서열의 끝에서 수동으로 커플링한다. 위치 32, 37 및 40에 비통상적인 측쇄 보호기가 있는 아스파르트산 잔기를 수동으로 추가한다. 일부 경우에, 이러한 보호기는 수지로부터 펩티드를 절단한 후 추가 탈보호 단계가 필요하였다.
세그먼트 2의 변이체: 일부 경우에, Lys 53을 Ala로 치환한다. 일부 경우에, Cys(Acm) 38을 Ser로 치환한다. 일부 경우에, Met 33, Met 51, 및 Met 60을 Nle 또는 O-메틸-L-호모세린으로 치환한다.
일반적인 방법 섹션에 기재된 미세절단을 수행함으로써 펩티드 합성의 진행을 모니터링한다. 절단 칵테일은 95:2.5:2.5 TFA/DODT/H2O의 혼합물로 구성된다. 합성이 완료되면, 95:2.5:2.5 TFA/DODT/H2O(15 mL/g 수지)의 혼합물을 사용하여 실온에서 2시간 동안 펩티드를 수지로부터 절단한다. 미정제 Opr-IL18(32-61)-광보호-Val-α-케토산 세그먼트는 30분 내에 0.1% TFA(v/v)가 포함된 10에서 60%까지의 CH3CN의 구배와 함께 40℃에서 40 mL/분의 유속으로 Gemini NX-C18 110 Å 컬럼(5 ㎛, 250 x 50 mm)을 사용하는 분취용 HPLC로 정제한다. 정제된 생성물을 포함하는 분획을 모으고 동결건조하여 Opr-IL18(32-61)-광보호-Val-α-케토산(IL18-Seg2)을 얻는다. 분석용 HPLC 및 ESI-HRMS를 사용하여 생성물의 순도 및 질량을 확인한다. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조하여 >98% 순도의 백색 고체로서 Opr-IL18(32-61)-광보호-Val-α-케토산(IL18-Seg2)을 얻는다.
1.1.2.1 Opr -IL18(32-73)- 광보호 -Leu-α- 케토산
세그먼트 2 길이의 변이: 일부 경우에, IL-18의 세그먼트 2의 서열은 몇 개의 아미노산만큼 더 길고 위치 31에서 74까지의 IL-18 서열을 포함할 것이다.
치환 용량이 0.21 mmol/g인 Fmoc-Phe-광보호-α-케토산이 사전 로딩된 Rink Amide MBHA 수지에서 세그먼트 Opr-IL18(32-73)-광보호-Phe-α-케토산 세그먼트를 제조한다. 합성은 일반적인 방법 섹션에 기재된 절차를 사용하여 자동 Fmoc-SPPS에 의해 Asp 32까지 수행한다. Boc-5-(S)-옥사프롤린을 서열에 수동으로 커플링한다.
Figure pct00042
세그먼트 2의 변이체: 일부 경우에, Lys 53을 Ala로 치환하고 Lys 70을 비표준 N-α-(9-플루오레닐메틸옥시카르보닐)-ε-아지도-L-리신(Fmoc-Lys(N3)-OH)로 치환하였다. 일부 경우에, Lys 70의 측쇄를 alloc 기로 보호한다. 그런 다음 alloc 기를 수지 상(on-resin) 탈보호 단계 동안 제거하고, 생성된 유리 아민을 글루타르산 무수물과 커플링한다. 그런 다음 생성된 유리 산을 상응하는 원하는 기, 예를 들어 PEG 기 또는 아지드 작용성을 보유하는 PEG 기에 커플링한다. 일부 경우에, Cys(Acm) 38 및 Cys(Acm) 68을 Ser으로 치환한다. 일부 경우에, Met 33, Met 51, 및 Met 60을 Nle 또는 O-메틸-L-호모세린으로 치환한다.
1.1.3 세그먼트 3: Fmoc - Opr -IL18(64-114)- Phe -α- 케토산 및 Fmoc - Opr -IL18(76-114)-Phe-α-케토산.
1.1.3.1 Fmoc - Opr -IL18(64-114)- Phe -α- 케토산
Figure pct00043
치환 용량이 0.47 mmol/g 인 Fmoc-Phe-보호-α-케토산이 사전 로딩된 Rink Amide ChemMatrixⓒ 수지에서 Fmoc-Opr-IL18(64-114)-Phe-α-케토산 세그먼트를 0.1 mmol 규모로 합성한다. 합성은 일반적인 방법 섹션에 기재된 절차를 사용하여 자동 Fmoc-SPPS에 의해 Ile 64까지 수행한다. 슈도프롤린 디펩티드가 이 세그먼트의 합성에 필요하며 이를 위치 81-82 및 71-72에서 수동으로 커플링한다. Fmoc-5-(S)-옥사프롤린을 서열의 끝에 수동으로 커플링한다.
일반적인 방법 섹션에 기재된 미세절단을 수행함으로써 펩티드 합성의 진행을 모니터링한다. 절단 칵테일은 95:2.5:2.5 TFA/DODT/H2O의 혼합물로 구성된다. 합성이 완료되면, 95:2.5:2.5 TFA/DODT/H2O(15 mL/g 수지)의 혼합물을 사용하여 2시간 동안 수지로부터 펩티드를 절단한다. 미정제 Fmoc-Opr-IL18(76-114)-Phe-α-케토산 세그먼트는 40분 내에 0.1% TFA(v/v)가 포함된 10에서 50%까지의 CH3CN의 구배와 함께, 40℃에서 40 mL/분의 유속으로 Gemini NX-C18 110 Å 컬럼(5 ㎛, 250 x 50 mm)을 사용하는 분취용 HPLC로 정제한다. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조하여 Fmoc-Opr-IL18(76-114)-Phe-α-케토산(IL18-Seg3)을 얻는다. 분석용 HPLC 및 ESI-HRMS를 사용하여 생성물의 순도 및 질량을 확인한다.
세그먼트 3의 변이체: 일부 경우에, Cys(Acm) 68 및 Cys(Acm) 76을 Ser으로 치환한다. 일부 경우에, Met86 및 Met113을 Nle 또는 O-메틸-L-호모세린으로 치환한다. 일부 경우에, Lys 70을 비표준 N-α-(9-플루오레닐메틸옥시카르보닐)-ε-아지도-L-리신(Fmoc-Lys(N3)-OH)로 치환한다. 일부 경우에, Lys 70의 측쇄를 alloc 기로 보호한다. 그런 다음 alloc 기를 수지 상 탈보호 단계 동안 제거하고, 생성된 유리 아민을 글루타르산 무수물과 커플링한다. 그런 다음 생성된 유리 산은 상응하는 원하는 기, 예를 들어 PEG 기 또는 아지드 작용성을 보유하는 PEG 기에 커플링한다.
1.1.3.2 Fmoc - Opr -IL18(76-114)- Phe -α-케토산.
세그먼트 3 길이의 변이: 일부 경우에, IL-18의 세그먼트 3의 서열은 몇 개의 아미노산만큼 더 짧고 위치 75에서 115까지의 IL-18 서열을 포함할 것이다. 치환 용량이 0.47 mmol/g인 Fmoc-Phe-보호-α-케토산이 사전 로딩된 Rink Amide ChemMatrix® 수지에서 세그먼트 Fmoc-Opr-IL18(74-114)-Phe-α-케토산을 합성한다. 자동 Fmoc-SPPS는 일반적인 방법 섹션에 기재된 절차를 사용하여 Cys(Acm) 76까지 수행한다. Fmoc-5-(S)-옥사프롤린을 서열에 수동으로 커플링한다.
Figure pct00044
세그먼트 3의 변이체: 일부 경우에, Cys(Acm) 76을 Ser으로 치환한다. 일부 경우에, Met86 및 Met113을 Nle 또는 O-메틸-L-호모세린으로 치환한다.
1.1.4 세그먼트 4: Opr -IL18(117-157).
Fmoc-Rink-Amide MBHA 수지에서 Fmoc-Asp(OtBu)-OH의 사전 로딩을 수행한다. 4 g의 수지(로딩량: 0.56 mmol/g, 2.24 mmol 규모)를 DMF에서 15분 동안 팽윤시킨다. 수지를 실온에서 20분 동안 DMF 중 20%(v/v)로 처리한다. DMF로 수지를 여러 번 세척한다. Fmoc-Asp(OtBu)-OH(691 mg, 1.68 mmol, 0.75 당량) 및 HATU(638 mg, 1.68 mmol, 0.75 당량)를 DMF(12 mL)에 용해한다. 실온에서 3분 동안 DIPEA(585 μL, 3.36 mmol, 1.5 당량)를 첨가하여 사전 활성화를 수행한다. 반응 혼합물을 팽윤된 수지에 첨가한다. 이를 부드러운 교반하에 실온에서 밤새 반응하도록 둔다. 수지를 DMF로 완전히 헹군다. DMF(12 mL) 중 아세트산 무수물(1.17 mL) 및 DIPEA(2.34 mL)의 용액을 첨가하여 수지에서 미반응 아민의 캡핑을 개시한다. 이를 부드러운 교반하에 실온에서 15분 동안 반응하도록 둔다. 수지를 DCM으로 완전히 헹구고 건조시킨다. 수지의 로딩량을 측정한다(0.34 mmol/g).
Figure pct00045
치환 용량이 0.34 mmol/g인 Fmoc-Asp(OtBu)-OH가 사전 로딩된 Rink Amide MBHA 수지에서 Opr-IL18(117-157) 세그먼트를 합성한다. 자동 Fmoc-SPPS는 일반적인 방법 섹션에 기재된 절차를 사용하여 Ser 117까지 수행한다. Boc-5-(S)-옥사프롤린을 서열에 커플링한다.
일반적인 방법 섹션에 기재된 미세절단을 수행하여 펩티드 합성의 진행을 모니터링한다. 절단 칵테일은 92.5:2.5:2.5:2.5 TFA/TIPS/DODT/H2O의 혼합물로 구성된다. 합성이 완료되면, 92.5:2.5:2.5:2.5 TFA/TIPS/DODT/H2O(10 mL/g 수지)의 혼합물을 사용하여 2시간 동안 수지로부터 펩티드를 절단한다. 미정제 Opr-IL18(117-157) 세그먼트는 45분 내에 0.1% TFA(v/v)가 포함된 10에서 55%까지의 CH3CN의 구배와 함께, 40℃에서 40 mL/분의 유속으로 Gemini NX-C18 110 Å 컬럼(5 ㎛, 250 x 50 mm)을 사용하는 분취용 HPLC로 정제한다. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조하여 Opr-IL18(117-157)(IL18-Seg4)을 얻는다. 분석용 HPLC 및 ESI-HRMS를 사용하여 생성물의 순도 및 질량을 확인한다.
세그먼트 4의 변이체: 일부 경우에, Cys(Acm) 127을 Ser로 치환한다. 일부 경우에, Met 150을 Nle 또는 O-메틸-L-호모세린으로 치환한다.
1.2 IL18 선형 단백질의 제조를 위한 KAHA 결찰 .
1.2.1. 세그먼트 12(IL18- Seg12 )의 합성을 위한 KAHA 결찰
Figure pct00046
결찰: IL18-Seg1(1.2 당량) 및 IL18-Seg2(1 당량)를 0.1M 옥살산을 함유하는 9:1 DMSO/H2O에 용해시키고(제한제의 경우 20 mM 펩티드 농도) 60℃에서 15시간 동안 반응시킨다. 결찰 바이알은 바이알을 알루미늄 호일로 감싸 차광한다. 7분 내에 20에서 95%까지의 CH3CN의 구배와 함께 60℃에서 1 mL/분의 유속으로 Aeris WIDEPORE XB-C18 컬럼(3.6 ㎛, 150 x 4.6 mm)을 사용하는 HPLC로 KAHA 결찰의 진행을 모니터링한다.
광탈보호: 결찰 완료 후, 혼합물을 0.1% TFA(v/v)가 포함된 1:1 CH3CN/H2O로 희석하고 365 nm의 파장에서 1.5시간 동안 조사한다. 광분해 반응의 완료는 HPLC 및 MALDI-TOF MS 분석으로 확인하였다.
정제: 25분 내에 0.1% TFA(v/v)가 포함된 10에서 60%까지의 CH3CN, 그 후 5분 동안 60% CH3CN을 유지하는 2단계 구배와 함께 40 mL/분의 흐름으로 60℃로 유지된 Shiseido capcell Pak UG80 C18 컬럼(5 ㎛, 250 x 50 mm)을 사용하는 분취용 HPLC로 광탈보호된 샘플을 정제한다. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조하여 IL18-Seg12를 얻는다. HPLC 및 ESI-HRMS 분석에 의해 세그먼트의 순도 및 동일성을 확인한다.
1.2.2 세그먼트 34(IL18- Seg34 )의 합성을 위한 KAHA 결찰
Figure pct00047
결찰: IL18-Seg3(1 당량) 및 IL18-Seg4(1.2 당량)를 0.1M 옥살산을 함유하는 97.5:2.5 DMSO/H2O에 용해시키고(제한제의 경우 20 mM 펩티드 농도) 60℃에서 16시간 동안 반응시킨다. 7분 내에 5에서 65%까지의 CH3CN의 구배와 함께 60℃에서 1 mL/분의 유속으로 Aeris WIDEPORE(3.6 ㎛, 150 x 4.6 mm) 컬럼을 사용하는 HPLC에 의해 KAHA 결찰의 진행을 모니터링한다.
Fmoc 탈보호: 결찰 완료 후, 반응 혼합물을 DMSO(6.7 mM 펩티드 농도)로 희석한다. 디에틸아민을 첨가하고(5%, v/v) 반응 혼합물을 실온에서 15분 동안 진탕한다. 반응 혼합물을 DMSO(3.3 mM 펩티드 농도)로 두 번째 희석한다. 디에틸아민을 첨가하고(2.5%, v/v) 반응 혼합물을 실온에서 추가로 15분 동안 진탕한다. 그런 다음 반응 혼합물을 0.1% TFA(v/v)가 포함된 1:1 CH3CN/H2O로 희석한다.
정제: 샘플은 40분 내에 0.1% TFA(v/v)가 포함된 10에서 50%까지의 CH3CN의 구배와 함께, 40℃에서 40 mL/분의 유속으로 Gemini NX-C18 110 Å 컬럼(5 ㎛, 250 x 50 mm)에서의 분취용 HPLC로 정제한다. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조하여 IL18-Seg34(Seg34)를 얻는다. 분석용 HPLC 및 ESI-HRMS를 사용하여 생성물의 순도 및 질량을 확인한다.
1.2.3 IL18 세그먼트 1234(IL18- Seg1234 - Acm )의 합성을 위한 KAHA 결찰 .
Figure pct00048
결찰: IL18-Seg12(1.2 당량) 및 IL18-Seg34(1.0 당량)를 0.1M 옥살산을 함유하는 9:1 DMSO/H2O에 용해시키고(15 mM 펩티드 농도), 반응물을 60℃에서 24시간 동안 교반한다. 7분 내에 20에서 95%까지의 CH3CN의 구배와 함께, 이동상으로 0.1% TFA(v/v)가 포함된 CH3CN/H2O를 사용하여 60℃에서 1 mL/분의 유속으로 Aeris WIDEPORE(3.6 ㎛, 150 x 4.6 mm) 컬럼을 사용하는 분석용 HPLC로 KAHA 결찰의 진행을 모니터링한다. 결찰 완료 후, 반응 혼합물을 DMSO로 희석한 다음 0.1% TFA(v/v)가 포함된 1:1 CH3CN/H2O의 혼합물로 추가 희석한다.
정제: 샘플은 30분 내에 0.1% TFA(v/v)가 포함된 10에서 60%까지의 CH3CN의 구배와 함께, 60℃에서 40 mL/분의 유속으로 Gemini NX-C18 110 Å 컬럼(5 ㎛, 250 x 50 mm)에서의 분취용 HPLC로 정제한다. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조하여 시스테인 잔기가 Acm 기로 보호된 IL18-Seg1234(IL18-Seg1234-Acm)를 얻는다. 분석용 HPLC 및 ESI-HRMS를 사용하여 생성물의 순도 및 질량을 확인한다.
1.2.4. IL18 선형 단백질 합성을 위한 재배열 및 Acm 탈보호
재배열: IL18-Seg1234-Acm을 0.1M Tris(pH 8.1)를 함유하는 6M Gu·HCl(1.5 mL, 0.13 mM 단백질 농도)에 용해시킨다. pH는 8.0으로 조정한다. 이를 50℃에서 2시간 동안 반응하도록 둔다. 반응 완료 후, 샘플을 0.1% TFA를 함유한 6M Gu·HCl(v/v, 10 mL)로 희석하고, 0.1% % TFA(v/v)가 포함된 20에서 40%까지(19분 내에) 및 40에서 50%까지(11분 내에)의 CH3CN의 구배와 함께, 이동상으로 0.1% TFA(v/v)가 포함된 CH3CN/H2O를 사용하여 60℃에서 10 mL/분의 유속으로 Proteonavi S5 컬럼(250 x 20 mm)을 사용하는 분취용 HPLC로 정제한다. 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조하여 Acm을 갖는 IL18 선형 단백질을 얻는다. 분석용 HPLC 및 ESI-HRMS를 사용하여 생성물의 순도 및 질량을 확인한다.
Acm 탈보호: Acm을 갖는 IL18 선형 단백질을 1:1 AcOH/H2O(0.25 mM 단백질 농도)에 용해시키고 아세트산은(1%, m/v)를 용액에 첨가한다. 혼합물을 차광시켜 50℃에서 2.5시간 동안 진탕한다. 7분 내에 20에서 95%까지의 CH3CN의 구배와 함께, 이동상으로 0.1% TFA(v/v)가 포함된 CH3CN/H2O를 사용하여 60℃에서 1 mL/분의 유속으로 Aeris WIDEPORE(3.6 ㎛, 150 x 4.6 mm) 컬럼을 사용하는 분석용 HPLC에 의해 Acm 탈보호 반응의 진행을 모니터링한다. 반응 완료 후, 샘플을 0.1% TFA(v/v)가 포함된 1:1 CH3CN/H2O로 희석한다.
정제: 샘플은 5분 내에 10에서 30%까지의 CH3CN 및 20분 내에 30에서 95%까지의 CH3CN의 2단계 구배와 함께, 이동상으로 0.1% TFA(v/v)가 포함된 CH3CN/H2O를 사용하여 실온에서 10 mL/분의 유속으로 Shiseido capcell Pak UG80 C18 컬럼(250 x 20 mm)에서의 분취용 HPLC로 정제한다. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조하여 원하는 IL18 선형 단백질을 얻는다. 분석용 HPLC 및 HRMS를 사용하여 생성물의 순도 및 질량을 확인한다.
실시예 2 - 변형된 IL-18 폴리펩티드의 폴딩
합성된 변형된 IL-18 폴리펩티드를 완충 용액에 용해시키고 특정 완충액 및 pH 조건에 적용시켜 폴리펩티드의 폴딩을 촉진한다. 폴딩된 단백질은 HPLC, ESI-MS 및/또는 MALDI-TOF와 같은 분석 기술을 사용하여 확인한다. 폴딩 완충액(완충액 A 및 B) 및 제제 완충액의 조성을 변화시켜 여러 조건을 스크리닝하고 테스트한다. 예시적인 폴딩 조건 및 완충액 조성은 하기 표 14에 제시한다. 변형된 IL-18 폴리펩티드의 원하는 분석적 및 생화학적 특성을 초래하는 하나 이상의 조건을 스케일 업 폴딩 프로토콜을 위해 선택한다.
1단계: 선형 단백질을 완충액 A에 용해시킨다(2 내지 4 mg/mL 단백질 농도). 단백질 용액을 20℃에서 최대 1시간 동안 부드럽게 진탕한다.
2단계: 단백질 용액을 완충액 B로 적가 방식으로 서서히 희석한다. 0.2 내지 0.4 mg/mL의 농도로 얻은 투명한 용액을 4℃, 10℃ 또는 20℃에서 18 내지 48시간 동안 인큐베이션한다.
3단계: 용액을 10℃에서 10,000 RPM으로 10분 동안 원심분리한다. 그런 다음 0.02% Tween 80 및 5-6% 수크로오스를 함유하는 PBS(pH 7.4)에 대해 실온에서 2시간 동안 투석한다. 이 단계는 두 번째로 반복한다. 그런 다음 동일한 완충액으로 실온에서 18시간 동안 세 번째로 투석한다.
분석용 HPLC 및 MALDI-TOF에 의해 순수 폴딩 단백질의 순도 및 동일성을 추가로 확인한다.
[표 14]
Figure pct00049
실시예 3 - 폴딩된 IL-18의 추가 변형
폴딩된 IL-18은 폴리에틸렌 글리콜 중합체와의 반응에 의해 추가로 변형시키고 적절한 완충액에 제제화한다.
실시예 4 - 서열 번호 24에 대해 변형된 IL-18 폴리펩티드의 합성.
서열 번호 24의 선형 펩티드를 하기 기재된 프로토콜에 따라 제조하였다.
Figure pct00050
세그먼트 1 (IL-18 (1-29)- Phe -α- 케토산 ): Fmoc-Rink-Amide MBHA 수지에서 Fmoc-Phe-보호-α-케토산 1의 사전 로딩을 수행하였다. 5 g의 수지(로딩량: 0.56 mmol/g, 1.8 mmol 규모)를 DMF에서 20분 동안 팽윤시켰다. 수지를 실온에서 10분 동안 DMF(v/v) 중 20% 피페리딘으로 2회 처리하고 DMF로 여러 번 세척하였다. 케토산 1 (1.46 g, 1.8 mmol, 1.0 당량) 및 HATU (650 mg, 1.71 mmol, 0.95 당량)를 DMF(20 mL)에 용해시켰다. NMM(396 μL, 3. 6 mmol, 2 당량)을 첨가하여 실온에서 3분 동안 사전 활성화를 수행하였다. 반응 혼합물을 팽윤된 수지에 첨가하고 실온에서 2.5시간 동안 부드럽게 교반하였다. 수지를 DMF로 완전히 헹구었다. DMF(20 mL) 중 아세트산 무수물(1.17 mL) 및 DIPEA(2.34 mL)의 용액을 첨가하고 반응물을 실온에서 15분 동안 부드럽게 교반하여 수지 상의 미반응 아민의 캡핑을 개시하였다. 수지를 DCM에 이어서 디에틸 에테르로 완전히 헹구고 건조하였다. 수지의 로딩량을 측정하였다(0.30 mmol/g).
Figure pct00051
IL18(1-29)-Phe-α-케토산 세그먼트는 ~0.30 mmol/g의 치환 용량을 갖는 Fmoc-Phe-보호-α-케토산(1.5 g)이 사전 로딩된 Rink Amide MBHA 수지에서 0.45 mmol 규모로 합성하였다.
IL18(1-29)-Phe-α-케토산의 자동화된 Fmoc-SPPS: DMF에 용해된 Fmoc-아미노산 용액(10.0 mL, 0.4 M, 4 당량), DMF 중 HCTU(10.0 mL, 0.38 M, 3.8 당량) 및 DMF 중 NMM(10.0 mL, 0.8 M, 8 당량)을 수지에 첨가하여 실온에서 30분 동안 커플링 반응을 수행하였다. 위치 14에서 1까지의 경우, 이중 커플링이 필요하였다. Fmoc 탈보호 반응 전에 5개의 아미노산마다 DMF 중 염화리튬 용액(0.8 M)으로 세척을 수행하였다. 필요한 경우 DMF 중 20%(v/v) 아세트산 무수물 용액(10.0 mL)과 DMF 중 NMM(0.8 M, 10.0 mL)을 첨가하여 실온에서 10분 동안 캡핑을 수행하였다. Cl-HOBt(0.1 M)를 함유하는 DMF 중 20%(v/v) 피페리딘을 사용하여 실온에서 8분 동안 Fmoc 탈보호 반응을 수행하였다.
수지를 DCM으로 세척하고 진공하에 건조하였다. 건조된 펩티딜 수지의 질량은 4.6 g이었다. 95:2.5:2.5 TFA/DODT/H2O(10 mL/g 수지)의 혼합물을 사용하여 실온에서 2.0시간 동안 수지로부터 펩티드를 절단하였다. 수지를 절단 칵테일로부터 여과하고 여액을 농축하고 냉각 디에틸 에테르(20℃)로 20배 희석하여 펩티드가 침전되도록 하였다. 원심분리 후, 에테르 층을 조심스럽게 따라내고, 펩티드 침전물을 디에틸 에테르에 재현탁하고, 트리츄레이션하고, 원심분리하였다. 에테르 세척을 2회 반복하고, 생성된 펩티드 침전물을 건조하였다. 미정제 펩티드의 질량은 1.8 g이었다. 미정제 IL18(1-29)-Leu-α-케토산 세그먼트의 정제는 25분 내에 0.1% TFA(v/v)가 포함된 10에서 60%까지의 CH3CN의 구배와 함께, 이동상으로 0.1% TFA(v/v)가 포함된 CH3CN/H2O를 사용하여 60℃에서 40 mL/분의 유속으로 Shiseido Capcell Pak UG80 C18 컬럼(5 ㎛, 250 x 50 mm)을 사용하는 분취용 HPLC로 수행하였다. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조하여 >98% 순도의 백색 고체로서 IL18(1-29)-Leu-α-케토산(IL18-Seg1)을 얻었다. 수지 로딩양을 기준으로 단리된 수득량은 472 mg(28%)이었다. MS(ESI): C233H348N58O69S; 평균 동위 이론치 3550.8936 Da [M]; 실측치: 3550.8948.
Figure pct00052
세그먼트 2( Opr -IL18(32-73)-Leu- 광보호 -α-케토산): Fmoc-Rink-Amide MBHA 수지에서 Fmoc-Leu-광보호-α-케토산 2의 사전 로딩을 수행하였다. 5 g의 수지(로딩량: 0.56 mmol/g, 2.25 mmol 규모)를 DMF에서 20분 동안 팽윤시켰다. 케토산 2(1.79 g, 2.25 mmol, 1 당량) 및 HATU(813 mg, 2.14 mmol, 0.95 당량)를 DMF(25 mL)에 용해시켰다. NMM(495 μL, 4.5 mmol, 2 당량)을 첨가하여 실온에서 2분 동안 사전 활성화를 수행하였다. 반응 혼합물을 팽윤된 수지에 첨가하고 실온에서 6시간 동안 부드럽게 교반하였다. 수지를 DMF로 완전히 헹구었다. DMF(20 mL) 중 아세트산 무수물(2.0 mL) 및 DIPEA(2.0 mL)의 용액을 첨가하고 혼합물을 실온에서 15분 동안 부드럽게 교반하여 수지 상의 미반응 아민의 캡핑을 개시하였다. 수지를 DCM 및 디에틸 에테르로 완전히 헹구고 건조하였다. 수지의 로딩량을 측정하였다(0.34 mmol/g).
Figure pct00053
Opr-IL18(32-73)-Phe-광보호-α-케토산 세그먼트는 ~0.34 mmol/g의 치환 용량을 갖는 Fmoc-Phe-Leu-광보호-α-케토산이 사전 로딩된 Rink Amide MBHA 수지에서 0.2 mmol 규모로 합성하였다.
위치 73에서 66까지 자동화된 Fmoc-SPPS: DMF에 용해된 Fmoc-아미노산(2.0 mL, 0.4 M, 4 당량), DMF 중 HCTU(2.0 mL, 0.38 M, 3.8 당량) 및 DMF 중 NMM(2.0 mL, 0.8 M, 8 당량)을 수지에 첨가하여 실온에서 30분 동안 커플링 반응을 수행하였다. Cl-HOBt(0.1 M)를 함유하는 DMF 중 20%(v/v) 피페리딘을 사용하여 실온에서 7분 동안 Fmoc 탈보호 반응을 각 커플링 주기에 대해 2회 수행하였다.
그런 다음 Fmoc-L-Ile-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH의 수동 커플링을 수행하였다. 3 mL의 DMF 중 Fmoc-L-Ile-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH(384 mg, 0.8 mmol, 4 당량), HATU 290 mg, 0.76 mmol, 3.8 당량) 및 NMM(176 μL, 1.6 mmol, 8 당량)의 용액을 제조하고(실온에서 3분의 사전 활성화) 수지에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 부드럽게 교반하였다.
위치 63에 대한 자동화된 Fmoc-SPPS: 위에서 설명한 조건을 사용하여 커플링 반응을 수행하였다. 위치 63에는 트리플 커플링이 필요하였다.
위치 64에서 56까지 자동화된 Fmoc-SPPS: 위에서 설명한 조건을 사용하여 커플링 반응을 수행하였다.
그런 다음 Fmoc-L-Asp(tBu)-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH의 수동 커플링을 수행하였다. 용액 3 mL의 DMF 중 Fmoc-L-Asp(tBu)-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH(430 mg, 0.8 mmol, 4 당량), HATU(290 mg, 0.76 mmol, 3.8 당량) 및 NMM(176 μL, 1.6 mmol, 8 당량)의 용액을 제조하고(실온에서 3분의 사전 활성화) 수지에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 부드럽게 교반하였다.
위치 53에서 51까지 자동화된 Fmoc-SPPS: 서열의 시작 부분에 대해 앞서 언급한 것과 동일한 조건을 사용하여 커플링 반응을 수행하였다.
그런 다음 Fmoc-L-Ile-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH의 수동 커플링을 수행하였다. 3 mL의 DMF 중 Fmoc-L-Ile-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH(384 mg, 0.8 mmol, 4 당량), HATU(290 mg, 0.76 mmol, 3.8 당량) 및 NMM(176 μL, 1.6 mmol, 8 당량)의 용액을 제조하고(실온에서 3분의 사전 활성화) 수지에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 부드럽게 교반하였다.
위치 48에서 37까지 자동화된 SPPS: 위에서 설명한 조건을 사용하여 커플링 반응을 수행하였다. 각 위치에 이중 커플링이 필요하였다.
그런 다음 Fmoc-L-Asp(tBu)-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH의 수동 커플링을 수행하였다. 3 mL의 DMF 중 Fmoc-L-Asp(tBu)-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH(430 mg, 0.8 mmol, 4 당량), HATU(290 mg, 0.76 mmol, 3.8 당량) 및 NMM(176 μL, 1.6 mmol, 8 당량)의 용액을 제조하고(실온에서 3분의 사전 활성화) 수지에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 부드럽게 교반하였다.
위치 34에서 32까지 자동화된 Fmoc-SPPS: 위에서 설명한 조건을 사용하여 커플링 반응을 수행하였다. 각 위치에 이중 커플링이 필요하였다. DMF 중 20%(v/v) 아세트산 무수물(2 mL) 및 DMF 중 NMM(0.8 M, 2 mL)을 첨가하여 각 위치에서 실온에서 10분 동안 캡핑을 수행하였다. Cl-HOBt(0.1M)를 포함하는 DMF 중 20%(v/v) 피페리딘을 사용하여 실온에서 7분 동안 Fmoc 탈보호를 수행하였다.
그런 다음 Boc-5-(S)-옥사프롤린의 수동 커플링을 수행하였다. 7 mL의 DMF 중 Boc-5-(S)-옥사프롤린(217 mg, 1.0 mmol, 5 당량), HATU(361 mg, 0.95 mmol, 4.8 당량) 및 NMM (220 μL, 2.0 mmol, 10 당량)의 용액을 제조하고(실온에서 3분의 사전 활성화) 수지에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2.5시간 동안 부드럽게 교반하였다. 수지를 DCM 및 디에틸 에테르로 세척하고 진공하에 건조하였다. 건조된 펩티딜 수지의 질량은 1.8 g이었다.
95:2.5:2.5 TFA/DODT/H2O(15 mL/g 수지)의 혼합물을 사용하고 혼합물을 실온에서 2.0시간 동안 부드럽게 교반하여 펩티드를 수지로부터 절단하였다. 수지를 절단 칵테일로부터 여과하고, 여액을 농축하고 냉각 디에틸 에테르(20℃)로 20배 희석하여 펩티드가 침전되도록 하였다. 원심분리 후, 에테르 층을 조심스럽게 따라내고, 펩티드 침전물을 디에틸 에테르에 재현탁하고, 트리츄레이션하고, 원심분리하였다. 에테르 세척을 2회 반복하고, 생성된 펩티드 침전물을 건조하였다. 미정제 펩티드의 질량은 1.2 g이었다. 미정제 Opr-IL18(32-73)-Phe-광보호-α-케토산 세그먼트의 정제는 30분 내에 0.1% TFA(v/v)가 포함된 10에서 60%까지의 CH3CN의 구배와 함께, 이동상으로 0.1% TFA(v/v)가 포함된 CH3CN/H2O를 사용하여 40℃에서 40 mL/분의 유속으로 Gemini NX-C18 110 Å 컬럼(5 ㎛, 250 x 50 mm)을 사용하는 분취용 HPLC로 정제하였다. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조하여 >98% 순도의 백색 고체로서 Opr-IL18(32-73)-Phe-광보호-α-케토산(IL18-Seg2)을 얻었다. 수지 로딩양을 기준으로 단리된 수득량은 148 mg(14%)이었다. LC-MS(ESI): 4.88분; C233H348N58O69S; m/z 이론치: 1315.4233Da [M+4H]; 실측치: 1315.4231Da [M+4H].
Figure pct00054
세그먼트 3(Fmoc-Opr-IL18(76-114) - Phe -α- 케토산 ): 222 mg의 수지(로딩량: 0.47 mmol/g, 0.1 mmol 규모)를 DMF에서 15분 동안 팽윤시켰다. 케토산 3(163 mg, 0.2 mmol, 2 당량) 및 HATU(76 mg, 0.2 mmol, 2 당량)를 DMF(2 mL)에 용해시켰다. DIPEA(100 μL, 0.6 mmol, 6 당량)를 첨가하여 실온에서 2분 동안 사전 활성화를 수행하였다. 반응 혼합물을 팽윤된 수지에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 밤새 부드럽게 교반하였다. 수지를 DMF로 완전히 헹구었다. DMF(2 mL) 중 아세트산 무수물(100 μL) 및 DIPEA(100 μL)의 용액을 첨가하여 수지 상의 미반응 아민의 캡핑을 개시하였다. 반응물을 실온에서 15분 동안 부드럽게 교반하였다. 수지를 DMF로 완전히 헹구었다. 수지의 최종 로딩량은 계산하지 않았으며 변경되지 않은 것으로 추정하였다(0.47 mmol/g).
Figure pct00055
The Fmoc-Opr-IL18(76-114)-Phe-α-케토산 세그먼트는 ~0.47 mmol/g의 치환 용량을 갖는 Fmoc-Phe-보호-α-케토산이 사전 로딩된 Rink Amide ChemMatrixⓒ 수지에서 0.1 mmol 규모로 합성하였다.
위치 96에서 114까지 자동화된 Fmoc-SPPS: DMF에 용해된 Fmoc-아미노산(1.0 mL, 0.5 M, 5 당량), DMF 중 HCTU(1.0 mL, 0.48 M , 4.8 당량), 및 NMP 중 DIPEA(0.4 mL, 0.2 M, 8 당량)를 수지에 첨가하여 실온에서 30분 동안 커플링 반응을 수행하였다. DMF 중 20%(v/v) 피페리딘을 사용하여 실온에서 15분 동안 Fmoc 탈보호를 수행하였다.
그런 다음 Fmoc-L-Asp(tBu)-L-Thr[Ψ(Me,Me)Pro]-OH의 수동 커플링을 수행하였다. 3 mL의 DMF 중 Fmoc-L-Asp(tBu)-L-Thr[Ψ(Me,Me)Pro]-OH(166 mg, 0.3 mmol, 3 당량), HATU(114 mg, 0.3 mmol, 3 당량) 및 DIPEA(100 μL, 0.6 mmol, 6 당량)의 용액을 제조하고(실온에서 3분의 사전 활성화) 수지에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 부드럽게 교반하였다.
위치 76에서 93까지 자동화된 Fmoc-SPPS: 위에서 설명한 조건을 사용하여 커플링 반응을 수행하였다. 각 위치에 이중 커플링이 필요하였다. DMF 중 20%(v/v) 아세트산 무수물(1 mL) 및 DMF 중 DIPEA(0.2 M, 1 mL)를 첨가하여 각 위치에서 실온에서 10분 동안 캡핑을 수행하였다. Cl-HOBt(0.1 M)를 함유하는 DMF 중 25%(v/v) 피페리딘을 사용하여 실온에서 15분 동안 Fmoc 탈보호 반응을 수행하였다.
그런 다음 Fmoc-5-(S)-옥사프롤린의 수동 커플링을 수행하였다. 3 mL의 DMF 중 Fmoc-5-(S)-옥사프롤린(102 mg, 0.3 mmol, 3 당량), HATU(114 mg, 0.3 mmol, 3 당량) 및 DIPEA(100 μL, 0.6 mmol, 6 당량)의 용액을 제조하고(실온에서 3분의 사전 활성화) 수지에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 부드럽게 교반하였다. 수지를 DCM으로 세척하고 진공하에 건조하였다. 건조된 펩티딜 수지의 질량은 1.0 g이었다.
수지를 95:2.5:2.5 TFA/DODT/H2O(15 mL/g 수지)의 혼합물에서 실온에서 2.0시간 동안 교반하여 펩티드를 수지로부터 절단하였다. 수지를 절단 칵테일로부터 여과하고, 여액을 농축하고 냉각 디에틸 에테르(20℃)로 20배 희석하여 펩티드가 침전되도록 하였다. 원심분리 후, 에테르 층을 조심스럽게 따라내고, 펩티드 침전물을 디에틸 에테르에 재현탁하고, 트리츄레이션하고, 원심분리하였다. 에테르 세척을 2회 반복하고, 생성된 펩티드 침전물을 건조하였다. 미정제 펩티드의 질량은 540 mg이었다. 미정제 Fmoc-Opr-IL18(76-114)-Phe-α-케토산 세그먼트의 정제는 40분 내에 0.1% TFA(v/v)가 포함된 10에서 50%까지의 CH3CN의 구배와 함께, 이동상으로 0.1% TFA(v/v)가 포함된 CH3CN/H2O를 사용하여 40℃에서 40 mL/분의 유속으로 Gemini NX-C18 110 Å 컬럼(5 ㎛, 250 x 250 mm)을 사용하는 분취용 HPLC로 수행하였다. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조하여 Fmoc-Opr-IL18(76-114)-Phe-α-케토산(IL18-Seg3)을 백색 고체로서 얻었다. 수지 로딩양을 기준으로 단리된 수득량은 128 mg(25%)이었다. MS(ESI): C233H348N58O69S; 평균 동위원소 이론치 5094.5226 Da [M]; 실측치: 5094.5224 Da.
세그먼트 4( Opr -IL18(117-157)): Fmoc-Rink-Amide MBHA 수지에서 Fmoc-Asp(OtBu)-OH의 사전 로딩을 수행하였다. 4 g의 수지(로딩량: 0.56 mmol/g, 2.24 mmol 규모)를 DMF에서 15분 동안 팽윤시켰다. 수지를 DMF 중 20%(v/v)로 실온에서 20분 동안 처리하였다. 수지를 DMF로 여러 번 세척하였다. Fmoc-Asp(OtBu)-OH(691 mg, 1.68 mmol, 0.75 당량) 및 HATU(638 mg, 1.68 mmol, 0.75 당량)을 DMF(12 mL)에 용해시켰다. DIPEA(585 μL, 4.48 mmol, 2 당량)를 첨가하여 실온에서 3분 동안 사전 활성화를 수행하였다. 반응 혼합물을 팽윤된 수지에 첨가하고 실온에서 밤새 부드럽게 교반하였다. 수지를 DMF로 완전히 헹구었다. DMF(12 mL) 중 아세트산 무수물(1.17 mL) 및 DIPEA(2.34 mL)의 용액을 첨가하고 혼합물을 실온에서 15분 동안 부드럽게 교반하여 수지 상의 미반응 아민의 캡핑을 개시하였다. 수지를 DCM으로 완전히 헹구고 건조하였다. 수지의 로딩량을 측정하였다(0.34 mmol/g).
Figure pct00056
Opr-IL18(117-157) 세그먼트는 ~0.34 mmol/g의 치환 용량을 갖는 Fmoc-Asp(OtBu)-OH가 사전 로딩된 Rink Amide MBHA 수지에서 0.1 mmol 규모로 합성하였다. 294 mg의 수지를 DMF에서 15분 동안 팽윤시켰다.
위치 147에서 157까지 자동화된 Fmoc-SPPS: DMF에 용해된 Fmoc-아미노산 (1.0 mL, 0.5 M, 5 당량), DMF 중 HCTU(1.0 mL, 0.48 M, 4.8 당량), 및 NMP 중 DIPEA(0.4 mL, 0.2 M, 8 당량)를 수지에 첨가하여 실온에서 30분 동안 커플링 반응을 수행하였다. DMF 중 20%(v/v) 피페리딘을 사용하여 실온에서 15분 동안 Fmoc 탈보호를 수행하였다. 위치 117에서 146까지 이중 커플링과 캡핑 단계가 필요하였다. DMF 중 20%(v/v) 아세트산 무수물(1 mL) 및 DMF 중 DIPEA(0.2 M, 1 mL)를 첨가하여 각 위치에서 실온에서 10분 동안 캡핑을 수행하였다.
그런 다음 Boc-5-(S)-옥사프롤린의 수동 커플링을 수행하였다. 3 mL의 DMF 중 Boc-5-(S)-옥사프롤린(65 mg, 0.3 mmol, 3 당량), HATU(114 mg, 0.3 mmol, 3 당량) 및 DIPEA (100 μL, 0.6 mmol, 6 당량)의 용액을 제조하고(실온에서 3분의 사전 활성화) 수지에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 반응시켰다.
수지를 DCM으로 세척하고 진공하에 건조하였다. 건조된 펩티딜 수지의 질량은 1.2 g이었다. 92.5:2.5:2.5:2.5 TFA/TIPS/DODT/H2O(10 mL/g 수지)의 혼합물을 사용하여 실온에서 2시간 동안 수지로부터 펩티드를 절단하였다. 수지를 절단 칵테일로부터 여과하고, 여액을 농축하고 냉각 디에틸 에테르(20℃)로 20배 희석하여 펩티드가 침전되도록 하였다. 원심분리 후, 에테르 층을 조심스럽게 따라내고, 펩티드 침전물을 디에틸 에테르에 재현탁하고, 트리츄레이션하고, 원심분리하였다. 에테르 세척을 2회 반복하고, 생성된 펩티드 침전물을 건조하였다. 미정제 펩티드의 질량은 770 mg이었다. 미정제 Opr-IL18(117-157) 세그먼트의 정제는 40분 내에 0.1% TFA(v/v)가 포함된 10에서 50%까지의 CH3CN의 구배와 함께, 이동상으로 0.1% TFA(v/v)가 포함된 CH3CN/H2O를 사용하여 40℃에서 40 mL/분의 유속으로 Gemini NX-C18 110 Å 컬럼(5 ㎛, 250 x 50 mm)을 사용하는 분취용 HPLC로 수행하였다. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조하여 Opr-IL18(117-157)(IL18-Seg4)을 백색 고체로 얻었다. 수지 로딩양을 기준으로 한 단리된 수득량은 106 mg(21%)이었다. MS(ESI): C222H346N56O73S; 평균 동위원소 이론치 1250.9051 Da [M+4H+]; 실측치: 1250.6293 Da.
Figure pct00057
펩티드 광보호 케토산 IL18-Seg12(28.4 mg; 7.98 μmol; 1.2 당량) 및 히드록실아민 펩티드 IL18-Seg2(25.9 mg; 6.65 μmol; 1.0 당량)를 0.1M 옥살산을 함유하는 9:1 DMSO/H2O(333 μL)에 용해시켰다. 균질한 액체 용액을 얻었다. 결찰 바이알을 알루미늄 호일로 싸서 차광하고, 반응물을 60℃에서 밤새 두었다. 결찰 완료 후 혼합물을 0.1% TFA(v/v) 가 포함된 1:1 CH3CN/H2O(1780 μL)로 희석하고 365 nm의 파장에서 1.5시간 동안 조사하여 C-말단 케토산의 광탈보호를 허용하였다. 반응 혼합물을 TFA(0.1%, v/v)가 포함된 1:1 CH3CN/H2O(10 mL가 되도록 하는 양)로 추가 희석하였다. 희석된 혼합물을 여과하고 분취용 HPLC에 주입하였다. 미정제 결찰 펩티드는 30분 내에 0.1% TFA(v/v)가 포함된 10에서 60%까지의 CH3CN의 구배와 함께 60℃에서 40 mL/분의 유속으로 Gemini NX-C18 110 Å 컬럼(5 ㎛, 250 x 250 mm)을 사용하는 분취용 HPLC로 정제하였다. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조하여 >98% 순도의 백색 고체로서 IL18-Seg12를 얻었다. 단리된 수득량은 23.9 mg(50%)이었다.
LC-MS (ESI): 4.63분; C322H515N89O96S; m/z 이론치: 7196.7874Da [M]; 실측치: 7196.7476Da [M].
Figure pct00058
IL18- Seg12 제조: 펩티드 광보호된 케토산 IL18-Seg1(18.1 mg; 5.09 μmol; 1.2 당량) 및 히드록실아민 펩티드 IL18-Seg2(22.3 mg; 4.24 μmol; 1.0 당량)를 0.1 M 옥살산을 함유하는 9:1 DMSO/H2O 용액(220 μL)에 용해시켰다. 매우 균질한 액체 용액을 얻었다. 결찰 바이알을 알루미늄 호일로 싸서 차광하고 60℃에서 밤새 부드럽게 교반하였다. 결찰 완료 후, 혼합물을 0.1% TFA(v/v) 가 포함된 1:1 CH3CN/H2O(1780 μL)로 희석하고 365 nm의 파장에서 1.5시간 동안 조사하여 C-말단 케토산의 광탈보호를 허용하였다. 혼합물을 TFA(0.1%, v/v)가 포함된 1:1 CH3CN/H2O(10 mL가 되도록 하는 양)로 추가 희석하였다. 희석된 혼합물을 여과하고 분취용 HPLC에 주입하였다. 미정제 결찰된 펩티드는 25분 내에 0.1% TFA(v/v)가 포함된 10에서 60%까지의 CH3CN의 구배와 함께 60℃에서 40 mL/분의 유속으로 Gemini NX-C18 110 Å 컬럼(5 ㎛, 250 x 250 mm)을 사용하는 분취용 HPLC로 정제하였다. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조하여 >98% 순도의 백색 고체로서 IL18-Seg12를 얻었다. 단리된 수득량은 16.9 mg(47%)이었다.
Figure pct00059
IL18- Seg34 제조: 펩티드 케토산 IL18-Seg3(54.6 mg; 10.9 μmol; 1.0 당량) 및 히드록실아민 펩티드 IL18-Seg4(66.8 mg; 13.1 μmol; 1.2 당량)를 0.1 M 옥살산을 함유하는 9:1 DMSO/H2O(546 μL)에 용해시켰다. 매우 균질한 액체 용액을 얻었고, 이를 60℃에서 밤새 부드럽게 교반하였다. 결찰 반응이 완료되면, 혼합물을 DMSO(1092 μL)로 희석하였다. 디에틸아민(82 μL, 5%, v/v)을 첨가하여 Fmoc 탈보호를 개시하고 실온에서 15분 동안 부드럽게 교반하였다. DMSO(1638 μL) 중 디에틸아민(82 μL)의 두 번째 용액을 반응 혼합물에 첨가하고 실온에서 추가 15분 동안 부드럽게 교반하였다. 겔 형성이 예상되었다. 트리플루오로아세트산(200 μL)을 첨가하여 반응 혼합물을 중화시켰다. 균질하고 무색인 액체 용액을 얻었고, 이를 TFA(0.1%, v/v)가 포함된 1:1 CH3CN/H2O(17 mL가 되도록 하는 양)로 추가 희석하였다. 희석된 혼합물을 분취용 HPLC에 바로 주입하였다. 미정제 결찰된 펩티드 용액은 여과하고 40분 내에 0.1% TFA(v/v)가 포함된 10에서 50%까지의 CH3CN의 구배와 함께, 이동상으로 0.1% TFA(v/v)가 포함된 CH3CN/H2O를 사용하여 40℃에서 40 mL/분의 유속으로 Gemini NX-C18 110 Å 컬럼(5 ㎛, 250 x 50 mm)을 사용하는 분취용 HPLC로 정제하였다. 희석된 혼합물을 분취용 HPLC에 바로 주입하였다. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조하여 백색 고체로서 IL18-Seg34를 얻었다. 단리된 수득량은 60.1 mg(56%)이었다. MS (ESI): C439H684N114O138S2; 평균 동위원소 이론치 9831.0810 Da [M]; 실측치: 9830.9439 Da.
Figure pct00060
Acm을 갖는 IL18- Seg1234 제조: 펩티드 케토산 IL18-Seg12(16.1 mg; 1.97 μmol; 1.2 당량) 및 히드록실아민 펩티드 IL18-Seg34(16.1 mg; 1.64 μmol; 1.0 당량)를 0.1 M 옥살산을 함유하는 9:1 DMSO/H2O(110 μL)에 용해시켰다. 균질한 액체 용액을 얻었고, 이를 60℃에서 밤새 반응시켰다. 결찰 반응 완료 후, 혼합물을 먼저 DMSO(1890 μL)로 희석하였다. 혼합물을 TFA(0.1%, v/v)를 함유하는 1:1 H2O/CH3CN(8 mL가 되도록 하는 양)으로 추가 희석하였다. 희석된 혼합물을 여과하고 분취용 HPLC에 주입하였다. 미정제 결찰된 펩티드는 30분 내에 0.1% TFA(v/v)가 포함된 10에서 60%까지의 CH3CN의 구배와 함께, 이동상으로 0.1% TFA(v/v)가 포함된 CH3CN/H2O를 사용하여 60℃에서 40 mL/분의 유속으로 Gemini NX-C18 110 Å 컬럼(5 ㎛, 250 x 50 mm)을 사용하는 분취용 HPLC로 정제하였다. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조하여 >98% 순도의 백색 고체로서 IL18-Seg12를 얻었다. 단리된 수득량은 10.0 mg(33%)이었다.
표 4는 본원에 제공된 방법에 따라 제조될 수 있는 변형된 IL-18 폴리펩티드를 나타낸다.
[표 4]
Figure pct00061
Figure pct00062
Figure pct00063
Figure pct00064
Figure pct00065
Figure pct00066
Figure pct00067
Figure pct00068
Figure pct00069
Figure pct00070
Figure pct00071
Figure pct00072
Figure pct00073
Figure pct00074
Figure pct00075
Figure pct00076
Figure pct00077
실시예 4A - 서열 번호 42의 변형된 IL-18 폴리펩티드의 합성.
서열 번호 42의 변형된 선형 IL-18 폴리펩티드는 하기 제공된 프로토콜에 따라 제조하였다.
Figure pct00078
세그먼트 1A(IL18 (1-29)- Phe -α- 케토산: Fmoc-Rink-Amide MBHA 수지에서 Fmoc-Phe-보호-α-케토산 1의 사전 로딩을 수행하였다. 5 g의 수지(로딩량: 0.56 mmol/g, 2.8 mmol 규모)를 DMF에서 20분 동안 팽윤시켰다. 수지를 실온에서 10분 동안 DMF 중 20% 4-메틸피페리딘(v/v)로 2회 처리하고 DMF로 여러 번 세척하였다. 케토산 1(1.7 g, 2.1 mmol, 0.75 당량) 및 HATU(800 mg, 2.1 mmol, 0.75 당량)를 DMF (15 mL)에 용해시켰다. DIPEA(730 μL, 4.2 mmol, 1.5 당량)를 첨가하여 실온에서 3분 동안 사전 활성화를 수행하였다. 반응 혼합물을 팽윤된 수지에 첨가하고 실온에서 3시간 동안 부드럽게 교반하였다. 수지를 DMF로 완전히 헹구었다. DMF(15 mL) 중 아세트산 무수물(2.1 mL) 및 DIPEA(3.9 mL)의 용액 첨가하고 반응물을 실온에서 15분 동안 부드럽게 교반하여 용액을 첨가함으로써 수지 상의 미반응 아민의 캡핑을 개시하였다. 수지를 DCM에 이어 디에틸 에테르로 완전히 헹구고 건조하였다. 수지의 로딩량을 측정하였다(0.27 mmol/g).
Figure pct00079
IL18(1-29)-Phe-α-케토산 세그먼트는 ~0.27 mmol/g의 치환 용량을 갖는 Fmoc-Phe-보호-α-케토산(741 mg)이 사전 로딩된 Rink Amide MBHA 수지에서 0.2 mmol 규모로 합성하였다.
IL18(1-29)-Phe-α-케토산의 자동화된 Fmoc-SPPS: DMF에 용해된 Fmoc-아미노산의 용액(2.0 mL, 0.4 M, 4 당량), DMF 중 OxymaPure(2 mL, 0.4 M, 4 당량) 및 DMF 중 DIC(2 mL, 0.4 M, 4 당량)을 수지에 첨가하여 실온에서 30분 동안 커플링 반응을 수행하였다. 위치 14에서 1까지의 경우, 이중 커플링이 필요하였다. DMF 중 20%(v/v) 아세트산 무수물 용액(2 mL) 및 DMF 중 NMM(0.8 M, 2.0 mL)을 첨가하여 실온에서 6분 동안 각 아미노산 뒤에 캡핑을 수행하였다. Cl-HOBt(0.1 M)를 함유하는 DMF 중 20%(v/v) 4-메틸피페리딘을 사용하여 실온에서 8분 동안 Fmoc 탈보호 반응을 수행하였다.
수지를 DCM으로 세척하고 진공하에 건조하였다. 건조된 펩티딜 수지의 질량은 3.4 g이었다. 95:2.5:2.5 TFA/DODT/H2O(10 mL/g 수지)의 혼합물을 사용하여 실온에서 2.0시간 동안 수지로부터 펩티드를 절단하였다. 수지를 절단 칵테일로부터 여과하고, 여액을 농축하고 냉각 디에틸 에테르(20℃)로 20배 희석하고, 펩티드가 침전되도록 하였다. 원심분리 후, 에테르 층을 조심스럽게 따라내고, 펩티드 침전물을 디에틸 에테르에 재현탁하고, 트리츄레이션하고, 원심분리하였다. 에테르 세척을 2회 반복하고, 생성된 펩티드 침전물을 건조하였다. 미정제 펩티드의 질량은 1.07 g이었다. 미정제 IL18(1-29)-Phe-α-케토산 세그먼트 1A의 정제는 40분 내에 0.1% TFA(v/v)가 포함된 10에서 60%까지의 CH3CN의 구배와 함께, 이동상으로 0.1% TFA(v/v)가 포함된 CH3CN/H2O를 사용하여 60℃에서 10 mL/분의 유속으로 Shiseido Capcell Pak C18 컬럼(5 ㎛, 250 x 50 mm)을 사용하는 분취용 HPLC로 수행하였다. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조하여 >90% 순도의 백색 고체로서 IL18(1-29)-Leu-α-케토산(IL18-Seg1)을 얻었다. 수지 로딩양을 기준으로 단리된 수득량은 348 mg(29%)이었다. MS (ESI): C164H260N44O44; 평균 동위원소 이론치3551.9517 Da [M]; 실측치: 3551.9644 Da [M].
Figure pct00080
세그먼트 2A( Opr -IL18(32-61)-Val- 광보호 -α-케토산): Fmoc-Rink-Amide MBHA 수지에서 Fmoc-Val-광보호-α-케토산 2의 사전 로딩을 수행하였다. 3.05 g의 수지(로딩량: 0.56 mmol/g, 1. 71 mmol 규모)를 DMF에서 20분 동안 팽윤시켰다. 케토산 2(1.0 g, 1.28 mmol, 0.75 당량) 및 HATU(487 mg, 1.28 mmol, 0.75 당량)를 DMF(10 mL)에 용해시켰다. NMM(280 μL, 2.56 mmol, 1.5 당량)을 첨가하여 실온에서 2분 동안 사전 활성화를 수행하였다. 반응 혼합물을 팽윤된 수지에 첨가하고 실온에서 15시간 동안 부드럽게 교반하였다. 수지를 DMF로 완전히 헹구었다. DMF(10 mL) 중 아세트산 무수물(1.29 mL) 및 DIPEA(2.38 mL)의 용액을 첨가하고 혼합물을 실온에서 15분 동안 부드럽게 교반하여 수지 상의 미반응 아민의 캡핑을 개시하였다. 수지를 DCM 및 디에틸 에테르로 완전히 헹구고 건조하였다. 수지의 로딩량을 측정하였다(0.307 mmol/g).
Figure pct00081
Opr-IL18(32-61)-Val-광보호-α-케토산 세그먼트는 ~0.307 mmol/g의 치환 용량을 갖는 Fmoc-Val-광보호-α-케토산이 사전 로딩된 Rink Amide MBHA 수지에서 0.2 mmol 규모로 합성하였다.
위치 61에서 56까지 자동화된 Fmoc-SPPS: DMF에 용해된 Fmoc-아미노산(2.0 mL, 0.4 M, 4 당량), DMF 중 OxymaPure(2 mL, 0.4 M, 4 당량), 및 DMF 중 DIC(2 mL, 0.4 M, 4 당량)를 수지에 첨가하여 실온에서 30분 동안 커플링 반응을 수행하였다. DMF 중 20%(v/v) 아세트산 무수물 용액(2 mL) 및 DMF 중 NMM(0.8 M, 2.0 mL)을 첨가하여 실온에서 6분 동안 각 아미노산 뒤에 캡핑을 수행하였다. DMF 중 20%(v/v) 4-메틸피페리딘을 사용하여 실온에서 8분 동안 Fmoc 탈보호 반응을 수행하였다.
그런 다음 Fmoc-L-Asp(tBu)-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH의 수동 커플링을 수행하였다. 6 mL의 DMF 중 Fmoc-L-Asp(tBu)-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH(322 mg, 0.6 mmol, 3 당량), HATU(228 mg, 0.6 mmol, 3 당량) 및 DIPEA(209 μL, 1.2 mmol, 6 당량)의 용액을 제조하고(실온에서 3분의 사전 활성화) 수지에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 부드럽게 교반하였다.
위치 53에서 51까지 자동화된 Fmoc-SPPS: 서열의 시작 부분에 대해 앞서 언급한 것과 동일한 조건을 사용하여 커플링 반응을 수행하였다.
그런 다음 Fmoc-L-Ile-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH의 수동 커플링을 수행하였다. 6 mL의 DMF 중 Fmoc-L-Ile-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH(288 mg, 0.6 mmol, 3 당량), HATU(228 mg, 0.6 mmol, 3 당량) 및 DIPEA(209 μL, 1.2 mmol, 6 당량)의 용액을 제조하고(실온에서 3분의 사전 활성화) 수지에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 부드럽게 교반하였다.
위치 48에서 37까지 자동화된 SPPS: 위에서 설명한 조건을 사용하여 커플링 반응을 수행하였다. 각 위치에 이중 커플링이 필요하였다.
그런 다음 Fmoc-L-Asp(tBu)-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH의 수동 커플링을 수행하였다. 6 mL의 DMF 중 Fmoc-L-Asp(tBu)-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH(322 mg, 0.6 mmol, 3 당량), HATU(228 mg, 0.6 mmol, 3 당량) 및 DIPEA(209 μL, 1.2 mmol, 6 당량)의 용액을 제조하고(실온에서 3분의 사전 활성화) 수지에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 부드럽게 교반하였다.
위치 34에서 32까지 자동화된 Fmoc-SPPS: 위에서 설명한 조건을 사용하여 커플링 반응을 수행하였다. 각 위치에 이중 커플링이 필요하였다.
그런 다음 Boc-5-(S)-옥사프롤린의 수동 커플링을 수행하였다. 6 mL의 DMF 중 Boc-5-(S)-옥사프롤린(130 mg, 0.6 mmol, 3 당량), HATU(228 mg, 0.6 mmol, 3 당량) 및 DIPEA(209 μL, 1.2 mmol, 6 당량)의 용액을 제조하고(실온에서 3분의 사전 활성화) 수지에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 부드럽게 교반하였다. 수지를 DCM 및 디에틸 에테르로 세척하고 진공하에 건조하였다. 건조된 펩티딜 수지의 질량은 1.2 g이었다.
95:2.5:2.5 TFA/DODT/H2O(10 mL/g 수지)의 혼합물을 사용하고 혼합물을 실온에서 2.0시간 동안 부드럽게 교반하면서 펩티드를 수지로부터 절단하였다. 수지를 절단 칵테일로부터 여과하고, 여액을 농축하고 냉각 디에틸 에테르(20℃)로 20배 희석하여 펩티드가 침전되도록 하였다. 원심분리 후, 에테르 층을 조심스럽게 따라내고, 펩티드 침전물을 디에틸 에테르에 재현탁하고, 트리츄레이션하고, 원심분리하였다. 에테르 세척을 2회 반복하고, 생성된 펩티드 침전물을 건조하였다. 미정제 펩티드의 질량은 520 mg이었다. 미정제 Opr-IL18(32-61)-Val-광보호-α-케토산 세그먼트 2A의 정제는 40분 내에 0.1% TFA(v/v)가 포함된 10에서 70%까지의 CH3CN의 구배와 함께, 이동상으로 0.1% TFA(v/v)가 포함된 CH3CN/H2O를 사용하여 60℃에서 10 mL/분의 유속으로 Shiseido Capcell Pak C18 컬럼(5 ㎛, 250 x 20 mm)을 사용하는 분취용 HPLC로 수행하였다. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조하여 >95% 순도의 백색 고체로서 Opr-IL18(32-61)-Val-광보호-α-케토산(IL18-Seg2)을 얻었다. 수지 로딩량을 기준으로 단리된 수득량은 200 mg(24%)이었다. C166H259N45O57S; 평균 동위원소 이론치: 3828.8527 Da [M]; 실측치: 3829.1116 Da [M].
세그먼트 3A( Fmoc - Opr -IL18(64-114)- Phe -α-케토산): 488 mg의 수지(로딩량: 0.40 mmol/g, 0.2 mmol 규모)를 DMF에서 15분 동안 팽윤시켰다. 케토산 1(326 mg, 0.4 mmol, 2 당량) 및 HATU(152 mg, 0.4 mmol, 2 당량)를 DMF(6 mL)에 용해시켰다. DIPEA(174 μL, 1 mmol, 5 당량)를 첨가하여 실온에서 2분 동안 사전 활성화를 수행하였다. 반응 혼합물을 팽윤된 수지에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 3시간 동안 부드럽게 교반하였다. 수지를 DMF로 완전히 헹구었다. DMF(5 mL) 중 아세트산 무수물(200 μL) 및 DIPEA(200 μL)의 용액을 첨가하여 수지 상의 미반응 아민의 캡핑을 개시하였다. 반응물을 실온에서 15분 동안 부드럽게 교반하였다. 수지를 DMF로 완전히 헹구었다. 수지의 최종 로딩량은 계산하지 않았으며 변경되지 않은 것으로 추정하였다(0.40 mmol/g).
Figure pct00082
The Fmoc-Opr-IL18(64-114)-Phe-α-케토산 세그먼트는 ~0.40 mmol/g의 치환 용량을 갖는 Fmoc-Phe-보호-α-케토산이 사전 로딩된 Rink Amide ChemMatrixⓒ 수지에서 0.2 mmol 규모로 합성하였다.
위치 96에서 114까지 자동화된 Fmoc-SPPS: DMF에 용해된 Fmoc-아미노산(2.0 mL, 0.4 M, 4 당량), DMF 중 OxymaPure(2 mL, 0.4 M, 4 당량) 및 DMF 중 DIC(2 mL, 0.4 M, 4 당량)를 수지에 첨가하여 실온에서 30분 동안 커플링 반응을 수행하였다. 각 위치에 이중 커플링이 필요하였다. DMF(2 mL) 중 20%(v/v) 아세트산 무수물 및 DMF 중 NMM(0.8 M, 2.0 mL)을 첨가하여 실온에서 6분 동안 각 아미노산 뒤에 캡핑을 수행하였다. DMF 중 20%(v/v) 4-메틸피페리딘을 사용하여 실온에서 8분 동안 Fmoc 탈보호 반응을 수행하였다.
그런 다음 Fmoc-L-Asp(tBu)-L-Thr[Ψ(Me,Me)Pro]-OH의 수동 커플링을 수행하였다. 6 mL의 DMF 중 Fmoc-L-Asp(tBu)-L-Thr[Ψ(Me,Me)Pro]-OH(332 mg, 0.6 mmol, 3 당량), HATU(228 mg, 0.6 mmol, 3 당량) 및 DIPEA (209 μL, 1.2 mmol, 6 당량)의 용액을 제조하고(실온에서 3분의 사전 활성화) 수지에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 부드럽게 교반하였다.
위치 73에서 93까지 자동화된 Fmoc-SPPS: 위에서 설명한 조건을 사용하여 커플링 반응을 수행하였다. 각 위치에 이중 커플링이 필요하였다. Cl-HOBt(0.1 M)를 함유하는 DMF 중 20%(v/v) 4-메틸피페리딘을 사용하여 실온에서 8분 동안 Fmoc 탈보호 반응을 수행하였다.
그런 다음 Fmoc-L-Ile-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH의 수동 커플링을 수행하였다. 6 mL의 DMF 중 Fmoc-L-Ile-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH(288 mg, 0.6 mmol, 3 당량), HATU(228 mg, 0.6 mmol, 3 당량) 및 DIPEA(209 μL, 1.2 mmol, 6 당량)의 용액을 제조하고(실온에서 3분의 사전 활성화) 수지에 첨가하였다. 실온에서 2시간 동안 반응하도록 두었다.
위치 64에서 70까지 자동화된 Fmoc-SPPS: 위치 73 내지 93까지에 사용된 동일한 조건을 사용하여 커플링 반응을 수행하였다.
그런 다음 Fmoc-5-(S)-옥사프롤린의 수동 커플링을 수행하였다. 6 mL의 DMF 중 Fmoc-5-(S)-옥사프롤린(204 mg, 0.6 mmol, 3 당량), HATU(228 mg, 0.6 mmol, 3 당량) 및 DIPEA(209 μL, 0.6 mmol, 6 당량)의 용액을 제조하고(실온에서 3분의 사전 활성화) 수지에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 부드럽게 교반하였다. 수지를 DCM으로 세척하고 진공하에 건조하였다. 건조된 펩티딜 수지의 질량은 2.0 g이었다.
수지를 95:2.5:2.5 TFA/DODT/H2O(10 mL/g 수지)의 혼합물에서 실온에서 2.0시간 동안 교반하여 펩티드를 수지로부터 절단하였다. 수지를 절단 칵테일로부터 여과하고, 여액을 농축하고 냉각 디에틸 에테르(20℃)로 20배 희석하여, 펩티드가 침전되도록 하였다. 원심분리 후, 에테르 층을 조심스럽게 따라내고, 펩티드 침전물을 디에틸 에테르에 재현탁하고, 트리츄레이션하고, 원심분리하였다. 에테르 세척을 2회 반복하고, 생성된 펩티드 침전물을 건조하였다. 미정제 펩티드의 질량은 1.05 g이었다. 미정제 Fmoc-Opr-IL18(64-114)-Phe-α-케토산 세그먼트 3A의 정제는 40분 내에 0.1% TFA(v/v)가 포함된 10에서 45%까지의 CH3CN의 구배와 함께, 이동상으로 0.1% TFA(v/v)가 포함된 CH3CN/H2O를 사용하여 60℃에서 10 mL/분의 유속으로 Shiseido Capcell Pak C18 컬럼(5 ㎛, 250 x 20 mm)을 사용하는 분취용 HPLC로 수행하였다. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조하여 >95% 순도의 백색 고체로서 Fmoc-Opr-IL18(64-114)-Phe-α-케토산(IL18-Seg3)을 얻었다. 단리된 수득량은 350 mg(27.1%)이었다. MS(MALDI-TOF): C292H453N73O88S2; 평균 동위원소 이론치: 6458.3790 Da [M]; 실측치: 6459.476 Da [M+H+].
세그먼트 4A( Opr -IL18(117-157)): Fmoc-Rink-Amide MBHA 수지에서 Fmoc-Asp(OtBu)-OH의 사전 로딩을 수행하였다. 4 g의 수지(로딩량: 0.56 mmol/g, 2.24 mmol 규모)를 DMF에서 15분 동안 팽윤시켰다. 수지를 DMF 중 20%(v/v)로 실온에서 20분 동안 처리하였다. 수지를 DMF로 여러 번 세척하였다. Fmoc-Asp(OtBu)-OH(691 mg, 1.68 mmol, 0.75 당량) 및 HATU(638 mg, 1.68 mmol, 0.75 당량)를 DMF(12 mL)에 용해시켰다. DIPEA(585 μL, 4.48 mmol, 2 당량)를 첨가하여 실온에서 3분 동안 사전 활성화를 수행하였다. 반응 혼합물을 팽윤된 수지에 첨가하고 실온에서 밤새 부드럽게 교반하였다. 수지를 DMF로 완전히 헹구었다. DMF(12 mL) 중 아세트산 무수물(1.17 mL) 및 DIPEA(2.34 mL)의 용액을 첨가하고 혼합물을 실온에서 15분 동안 부드럽게 교반하여 수지 상의 미반응 아민의 캡핑을 개시하였다. 수지를 DCM으로 완전히 헹구고 건조하였다. 수지의 로딩량을 측정하였다(0.34 mmol/g).
Figure pct00083
Opr-IL18(117-157) 세그먼트는 ~0.34 mmol/g의 치환 용량을 갖는 Fmoc-Asp(OtBu)-OH이 사전 로딩된 Rink Amide MBHA 수지에서 0.1 mmol 규모로 합성하였다. 294 mg의 수지를 DMF에서 15분 동안 팽윤시켰다.
위치 147에서 157까지 자동화된 Fmoc-SPPS: DMF(1.0 mL, 0.5 M, 5 당량)에 용해된 Fmoc-아미노산, DMF 중 HCTU(1.0 mL, 0.48 M, 4.8 당량), 및 NMP 중 DIPEA(0.4 mL, 0.2 M, 8 당량)를 수지에 첨가하여 실온에서 30분 동안 커플링 반응을 수행하였다. DMF 중 20%(v/v) 피페리딘을 사용하여 실온에서 15분 동안 Fmoc 탈보호를 수행하였다. 위치 117에서 146까지 이중 결합과 캡핑 단계가 필요하였다. DMF 중 20%(v/v) 아세트산 무수물(1 mL) 및 DMF 중 DIPEA(0.2 M, 1 mL)를 첨가하여 각 위치에서 10분 동안 실온에서 캡핑을 수행하였다.
그런 다음 Boc-5-(S)-옥사프롤린의 수동 커플링을 수행하였다. 3 mL의 DMF 중 Boc-5-(S)-옥사프롤린(65 mg, 0.3 mmol, 3 당량), HATU(114 mg, 0.3 mmol, 3 당량) 및 DIPEA(100 μL, 0.6 mmol, 6 당량)의 용액을 제조하고(실온에서 3분의 사전 활성화) 수지에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 반응시켰다.
수지를 DCM으로 세척하고 진공하에 건조하였다. 건조된 펩티딜 수지의 질량은 1.2 g이었다. 92.5:2.5:2.5:2.5 TFA/TIPS/DODT/H2O(10 mL/g 수지)의 혼합물을 사용하여 실온에서 2시간 동안 수지로부터 펩티드를 절단하였다. 수지를 절단 칵테일로부터 여과하고, 여액을 농축하고 냉각 디에틸 에테르(20℃)로 20배 희석하여 펩티드가 침전되도록 하였다. 원심분리 후, 에테르 층을 조심스럽게 따라내고, 펩티드 침전물을 디에틸 에테르에 재현탁하고, 트리츄레이션하고, 원심분리하였다. 에테르 세척을 2회 반복하고, 생성된 펩티드 침전물을 건조하였다. 미정제 펩티드의 질량은 770 mg이었다. 미정제 Opr-IL18(117-157) 세그먼트 4A의 정제는 40분 내에 0.1% TFA(v/v)가 포함된 10에서 50%까지의 CH3CN의 구배와 함께, 이동상으로 0.1% TFA(v/v)가 포함된 CH3CN/H2O를 사용하여 40℃에서 40 mL/분의 유속으로 Gemini NX-C18 110 Å 컬럼(5 ㎛, 250 x 50 mm)을 사용하는 분취용 HPLC로 정제하였다. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조하여 백색 고체로서 Opr-IL18(117-157)(IL18-Seg4)를 얻었다. 수지 로딩량을 기준으로 한 단리된 수득량은 106 mg(21%)이었다. MS (ESI): C222H346N56O73S; 평균 동위원소 이론치4998.4861 Da [M]; 실측치: 4999.5126 Da [M].
Figure pct00084
IL18- Seg12A 제조: 펩티드 케토산 IL18-Seg1(80.8 mg; 22.8 μmol; 1.2 당량) 및 히드록실아민 펩티드 IL18-Seg2(72.6 mg; 19 μmol; 1.0 당량)를 0.1 M 옥살산을 함유하는 9.75:0.25 DMSO/H2O 용액(950 μL)에 용해시켰다. 매우 균질한 용액을 얻었다. 결찰 바이알을 알루미늄 호일로 싸서 차광하고 60℃에서 밤새 부드럽게 교반하였다. 결찰 완료 후, 혼합물을 DMSO(3550 μL)로 희석하고 365 nm의 파장에서 3시간 동안 조사하여 C-말단 케토산의 광탈보호를 허용하였다. 혼합물을 TFA(0.1%, v/v)가 포함된 1:1 CH3CN/H2O(10 mL가 되도록 하는 양)로 추가 희석하였다. 희석된 혼합물을 여과하고 분취용 HPLC에 주입하였다. 미정제 결찰된 펩티드는 30분 내에 0.1% TFA(v/v)가 포함된 20%에서 50%까지의 CH3CN의 구배와 함께, 60℃에서 40 mL/분의 유속으로 Shiseido Capcell Pak UG80 C18 컬럼(5 ㎛, 250 x 50 mm)을 사용하는 분취용 HPLC로 정제하였다. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조하여 >98% 순도의 백색 고체로서 IL18-Seg12A를 얻었다. 단리된 수득량은 66.1 mg(48%)이었다. MS (ESI): C321H506N88O96S; m/z 이론치: 7129.7248 Da [M]; 실측치 7129.7177 Da [M].
Figure pct00085
IL18- Seg34A 제조: 펩티드 케토산 IL18-Seg3(28 mg; 4.4 μmol; 1.1 당량) 및 히드록실아민 펩티드 IL18-Seg4(20 mg; 4 μmol; 1 당량)를 0.1 M 옥살산을 함유하는 97.5:2.5 DMSO/H2O(200 μL)에 용해시켰다. 매우 균질한 액체 용액을 얻었고, 이를 60℃에서 밤새 부드럽게 교반하였다. 결찰 반응이 완료되면, 혼합물을 DMSO(400 μL)로 희석하였다. 디에틸아민(30 μL, 5%, v/v)을 첨가하여 Fmoc 탈보호를 개시하고 실온에서 15분 동안 부드럽게 교반하였다. DMSO(600 μL) 중 디에틸아민(30 μL)의 두 번째 용액을 반응 혼합물에 첨가하고 실온에서 추가 15분 동안 부드럽게 교반하였다. 겔 형성이 예상되었다. 트리플루오로아세트산(100 μL)을 첨가하여 반응 혼합물을 중화시켰다. 균질하고 무색인 액체 용액을 얻었고, 이를 TFA(0.1%, v/v)가 포함된 1:2 CH3CN/H2O(10 mL가 되도록 하는 양)로 추가 희석하였다. 희석된 혼합물을 분취용 HPLC에 바로 주입하였다. 미정제 결찰된 펩티드 용액은 여과하고 40분 내에 0.1% TFA(v/v)가 포함된 10에서 45%까지의 CH3CN의 구배와 함께, 이동상으로 0.1% TFA(v/v)가 포함된 CH3CN/H2O를 사용하여 60℃에서 10 mL/분의 유속으로 Shiseido Capcell Pak C18 컬럼(5 ㎛, 250 x 20 mm)을 사용하는 분취용 HPLC로 정제하였다. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조하여 >97% 순도의 백색 고체로서 IL18-Seg34A를 얻었다. 단리된 수득량은 20 mg(45%)이었다. MS (ESI): C498H789N129O157S3; 평균 동위원소 이론치11190.7044 Da [M]; 실측치: 11190.7341 Da [M].
Figure pct00086
IL18- Seg1234A - Acm 제조: 펩티드 케토산 IL18-Seg12(7.5 mg; 1.1 μmol; 1.0 당량) 및 히드록실아민 펩티드 IL18-Seg34(13 mg; 1.2 μmol; 1.1 당량)를 0.1 M 옥살산을 함유하는 97.5:2.5 DMSO/H2O(69 μL)에 용해시켰다. 균질한 액체 용액을 얻었고, 이를 60℃에서 밤새 반응시켰다. 결찰 반응 완료 후, 혼합물을 먼저 DMSO(140 μL)로 희석하였다. 혼합물을 TFA(0.1%, v/v)를 함유하는 1:1 H2O/CH3CN(10 mL이 되도록 하는 양)으로 추가 희석하였다. 희석된 혼합물을 여과하고 분취용 HPLC에 주입하였다. 미정제 결찰된 펩티드는 40분 내에 0.1% TFA(v/v)가 포함된 10에서 45%까지의 CH3CN의 구배와 함께, 이동상으로 0.1% TFA(v/v)가 포함된 CH3CN/H2O를 사용하여 60℃에서 10 mL/분의 유속으로 Shiseido Capcell Pak C18 컬럼(5 ㎛, 250 x 20 mm)을 사용하는 분취용 HPLC로 정제하였다. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조하여 >92% 순도의 백색 고체로서 IL18-Seg1234A-Acm을 얻었다. 단리된 수득량은 5.45 mg(26%)이었다. (26%). MS (ESI): C815H789N129O157S3; 평균 동위원소 이론치: 18277.4418 Da [M]; 실측치: 18278.5394 Da.
Figure pct00087
IL18- Seg1234A 선형 단백질 제조:
선형 단백질의 재배열: IL18-Seg1234A-Acm(3.61 mg, 0.198 μmol)을 0.1M Tris를 함유하는 6M Gu·HCl에 용해시키고(1.4 mL, 15 μM 단백질 농도) 혼합물을 50℃에서 2.5시간 동안 부드럽게 진탕하였다. 재배열 반응 완료 후, 혼합물을 TFA(0.1%, v/v)를 함유하는 6M Gu·HCl(10 mL가 되도록 하는 양)로 희석하였다. 희석된 혼합물을 여과하고 분취용 HPLC에 주입하였다. 미정제 재배열된 펩티드는 40분 내에 0.1% TFA(v/v)가 포함된 10에서 45%까지의 CH3CN의 구배와 함께, 이동상으로 0.1% TFA(v/v)가 포함된 CH3CN/H2O를 사용하여 60℃에서 10 mL/분의 유속으로 Shiseido Capcell Pak C18 컬럼(5 ㎛, 250 x 20 mm)을 사용하는 분취용 HPLC로 정제하였다. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조하여 >97% 순도의 백색 고체로서 IL18-Seg1234A-Acm-재배열을 얻었다. 단리된 수득량은 1.41 mg(38%)이었고 이 물질은 추가 특성화 없이 Acm 탈보호 단계에서 바로 사용하였다.
Acm 탈보호: IL18-Seg1234A-Acm-재배열(1.41 mg; 0.077 μmol)을 0.25 mM AcOH/H2O(1:1) (310 μL, 단백질 농도)에 용해시키고 아세트산은(3.1 mg, 1%, m/ v)을 용액에 추가하였다. 혼합물을 차광시켜 50℃에서 2.5시간 동안 진탕하였다. 반응 완료 후, 샘플을 0.1% TFA(v/v)가 포함된 1:2 CH3CN/H2O 6 mL로 희석하였다. 샘플은 40분 내에 0.1% TFA(v/v)가 포함된 10에서 45%까지의 CH3CN의 구배와 함께, 이동상으로 0.1% TFA(v/v)가 포함된 CH3CN/H2O를 사용하여 60℃에서 10 mL/분의 유속으로 Shiseido Capcell Pak UG80 C18 컬럼(5 ㎛, 250 x 20 mm)을 사용하는 분취용 HPLC로 정제하였다. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조하여 백색 분말로서 97% 순도(50% 수율)로 0.7 mg의 IL18-Seg1234A 선형 단백질을 얻었다. MS (ESI): C803H1275N213O247S4; 평균 동위원소 이론치: 17992.2908 Da [M]; 실측치: 17993.3349 Da [M].
실시예 4B - 서열 번호 28의 변형된 IL-18 폴리펩티드의 합성
이 변이체의 경우, 세그먼트 3을 제외하고 다른 모든 세그먼트는 실시예 4A에 사용된 것과 동일하다.
Figure pct00088
세그먼트 3B( Fmoc - Opr -IL18(64-114)- Phe -α-케토산): Fmoc-Opr-IL18(64-114)-Phe-α-케토산 세그먼트는 ~0.40 mmol/g의 치환 용량을 갖는 Fmoc-Phe-보호-α-케토산이 사전 로딩된 Rink Amide ChemMatrixⓒ 수지에서 0.2 mmol 규모로 합성하였다.
위치 96에서 114까지 자동화된 Fmoc-SPPS: DMF(2.0 mL, 0.4 M, 4 당량)에 용해된 Fmoc-아미노산, DMF 중 OxymaPure(2 mL, 0.4 M, 4 당량) 및 DMF 중 DIC(2 mL, 0.4 M, 4 당량)를 수지에 첨가하여 실온에서 30분 동안 커플링 반응을 수행하였다. 각 위치에 이중 커플링이 필요하였다. DMF 중 20%(v/v) 아세트산 무수물 용액(2 mL) 및 DMF 중 NMM(0.8 M, 2.0 mL)을 첨가하여 실온에서 6분 동안 각 아미노산 뒤에 캡핑을 수행하였다. DMF 중 20%(v/v) 4-메틸피페리딘을 사용하여 실온에서 8분 동안 Fmoc 탈보호 반응을 수행하였다.
그런 다음 Fmoc-L-Asp(tBu)-L-Thr[Ψ(Me,Me)Pro]-OH의 수동 커플링을 수행하였다. 6 mL의 DMF 중 Fmoc-L-Asp(tBu)-L-Thr[Ψ(Me,Me)Pro]-OH(332 mg, 0.6 mmol, 3 당량), HATU(228 mg, 0.6 mmol, 3 당량) 및 DIPEA(209 μL, 1.2 mmol, 6 당량)의 용액을 제조하고(실온에서 3분의 사전 활성화) 수지에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 부드럽게 교반하였다.
위치 73에서 93까지 자동화된 Fmoc-SPPS: 위에서 설명한 조건을 사용하여 커플링 반응을 수행하였다. 각 위치에 이중 커플링이 필요하였다. Cl-HOBt(0.1 M)를 함유하는 DMF 중 20%(v/v) 4-메틸피페리딘을 사용하여 실온에서 8분 동안 Fmoc 탈보호 반응을 수행하였다.
그런 다음 Fmoc-L-Ile-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH의 수동 커플링을 수행하였다. 6 mL의 DMF 중 Fmoc-L-Ile-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH(288 mg, 0.6 mmol, 3 당량), HATU(228 mg, 0.6 mmol, 3 당량) 및 DIPEA(209 μL, 1.2 mmol, 6 당량)의 용액을 제조하고(실온에서 3분의 사전 활성화) 수지에 첨가하였다. 이를 실온에서 2시간 동안 반응하도록 두었다. DMF 중 20%(v/v) 아세트산 무수물 용액(2 mL) 및 DMF 중 NMM(0.8 M, 2.0 mL)을 첨가하여 실온에서 10분 동안 캡핑을 수행하였다. 실온에서 10분 동안 Cl-HOBt(0.1 M)를 함유하는 DMF 중 20%(v/v) 4-메틸피페리딘을 사용하여 Fmoc 탈보호 반응을 수행하였다.
그런 다음 Fmoc-Lys(alloc)-OH의 수동 커플링을 수행하였다. 6 mL의 DMF 중 Fmoc-Lys(alloc)-OH(272 mg, 0.6 mmol, 3 당량), HATU(228 mg, 0.6 mmol, 3 당량) 및 DIPEA(209 μL, 1.2 mmol, 6 당량)의 용액을 제조하고(실온에서 3분의 사전 활성화) 수지에 첨가하였다. 이를 실온에서 2시간 동안 반응하도록 두었다.
위치 64에서 69까지 자동화된 Fmoc-SPPS: 위치 73에서 93까지에 사용된 동일한 조건을 사용하여 커플링 반응을 수행하였다.
그런 다음 Fmoc-5-(S)-옥사프롤린의 수동 커플링을 수행하였다. 6 mL의 DMF 중 Fmoc-5-(S)-옥사프롤린(204 mg, 0.6 mmol, 3 당량), HATU(228 mg, 0.6 mmol, 3 당량) 및 DIPEA(209 μL, 0.6 mmol, 6 당량)의 용액을 제조하고(실온에서 3분의 사전 활성화) 수지에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다.
Alloc 탈보호: 수지를 건조 DCM에서 15분 동안 팽윤시켰다. N2로 퍼징된 3 mL의 건조 DCM 중 페닐 실란(595 μL, 4.80 mmol, 24 당량)의 용액에 이어 N2로 퍼징된 3 ml의 건조 DCM 중 팔라듐-테트라키스(트리페닐포스핀)(116 mg, 100 μmol, 0.5 당량)의 용액을 수지에 첨가하고 이를 실온에서 30분 동안 교반하도록 두었다. 수지를 DCM 및 DMF로 여러 번 세척하였다.
그런 다음 글루타르산 무수물의 수동 커플링을 수행하였다. 6 mL의 DMF 중 글루타르산 무수물(172 μL, 2 mmol, 10 당량) 및 NMM(220 μL, 2 mmol, 10 당량)을 수지에 첨가하고 이를 실온에서 30분 동안 교반하도록 두었다. 수지를 DCM 및 DMF로 여러 번 세척하였다.
그런 다음 O-(2-아미노에틸)-O'-(2-아지도에틸) 노나에틸렌 글리콜의 수동 커플링을 수행하였다. 3 mL의 DMF 중HATU(228 mg, 0.6 mmol, 3 당량)의 용액을 첨가한 후, 2 mL의 DMF 중의 시판 중인 O-(2-아미노에틸)-O'-(2-아지도에틸) 노나에틸렌 글리콜(338 mg, 0.6 mmol, 3 당량)의 용액 및 1 mL의 DMF 중 DIPEA (209 μL, 0.6 mmol, 6 당량)를 첨가하였다. 그런 다음 수지를 실온에서 2시간 동안 교반하였다.
수지를 DCM으로 세척하고 진공하에 건조하였다. 건조된 펩티딜 수지의 질량은 1.81 g이었다. 수지를 95:2.5:2.5 TFA/DODT/H2O(10 mL/g 수지)의 혼합물에서 실온에서 2시간 동안 교반하여 펩티드를 수지로부터 절단하였다. 수지를 절단 칵테일로부터 여과하고, 여액을 농축하고 냉각 디에틸 에테르(20℃)로 20배 희석하여 펩티드가 침전하도록 하였다. 원심분리 후, 에테르 층을 조심스럽게 따라내고, 펩티드 침전물을 디에틸 에테르에 재현탁하고, 트리츄레이션하고, 원심분리하였다. 에테르 세척을 2회 반복하고, 생성된 펩티드 침전물을 건조하였다. 미정제 펩티드의 질량은 1.08 g이었다. 미정제 Fmoc-Opr-IL18(64-114)-Phe-α-케토산 세그먼트 3B의 정제는 40분 내에 0.1% TFA(v/v)가 포함된 10에서 45%까지의 CH3CN의 구배와 함께, 이동상으로 0.1% TFA(v/v)가 포함된 CH3CN/H2O를 사용하여 60℃에서 10 mL/분의 유속으로 Shiseido Capcell Pak C18 컬럼(5 ㎛, 250 x 20 mm)을 사용하는 분취용 HPLC로 수행하였다. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조하여 >98% 순도의 백색 고체로서 Fmoc-Opr-IL18(64-114)-Phe-α-케토산(IL18-Seg3B)를 얻었다. 수지 로딩량을 기준으로 단리된 수득량은 120 mg(8.5%)이었다.MS (ESI): C319H503N77O100S2; [실측치: 7081.0 Da [M].
IL18- Seg34B 제조: 펩티드 케토산 IL18-Seg3B(31 mg; 4.4 μmol; 1.1 당량) 및 히드록실아민 펩티드 IL18-Seg4A(20 mg; 4 μmol; 1 당량)를 0.1 M 옥살산을 함유하는 97.5:2.5 DMSO/H2O(200 μL)에 용해시켰다. 매우 균질한 액체 용액을 얻었고, 이를 60℃에서 밤새 부드럽게 교반하였다. 결찰 반응이 완료되면, 혼합물을 DMSO(200 μL)로 희석하고 TFA(0.1%, v/v)가 포함된 1:1 CH3CN/H2O(10 mL가 되도록 하는 양)로 추가 희석하였다. 희석된 혼합물을 분취용 HPLC에 바로 주입하였다. 미정제 결찰된 펩티드 용액을 여과하고 40분 내에 0.1% TFA(v/v)가 포함된 10에서 45%까지의 CH3CN의 구배와 함께, 이동상으로 0.1% TFA(v/v)가 포함된 CH3CN/H2O를 사용하여 60℃에서 10 mL/분의 유속으로 Shiseido Capcell Pak C18 컬럼(5 ㎛, 250 x 20 mm)을 사용하는 분취용 HPLC로 정제하였다. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조하여 >98% 순도의 백색 고체로서 30.3 mg의 Fmoc 보호된 IL18-Seg34B를 얻었다.
Fmoc 보호된 IL18-Seg34B를 300 μL의 DMSO에 용해시켰다. 디에틸아민(15 μL, 5%, v/v)을 첨가하여 Fmoc 탈보호를 개시하고 실온에서 15분 동안 부드럽게 교반하였다. DMSO(300 μL) 중 디에틸아민(15 μL)의 두 번째 용액을 반응 혼합물에 첨가하고 실온에서 추가 15분 동안 부드럽게 교반하였다. 겔 형성이 예상되었다. 트리플루오로아세트산(50 μL)을 첨가하여 반응 혼합물을 중화시켰다. 균질하고 무색인 액체 용액을 얻었고, 이를 TFA(0.1%, v/v)가 포함된 1:1 CH3CN/H2O(10 mL가 되도록 하는 양)로 추가 희석하였다. 희석된 혼합물을 분취용 HPLC에 바로 주입하였다. 미정제 결찰된 펩티드 용액을 여과하고 40분 내에 0.1% TFA(v/v)가 포함된 10에서 45%까지의 CH3CN의 구배와 함께, 이동상으로 0.1% TFA(v/v)가 포함된 CH3CN/H2O를 사용하여 60℃에서 10 mL/분의 유속으로 Shiseido Capcell Pak C18 컬럼(5 ㎛, 250 x 20 mm)을 사용하는 분취용 HPLC로 정제하였다. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조하여 >94% 순도의 백색 고체로서 IL18-Seg34B를 얻었다. 단리된 수득량은 12.5 mg(26%)이었다. MS (ESI): C525H839N133O169S3; 실측치: 11815.0 Da [M].
IL18- Seg1234B - Acm 제조: 펩티드 케토산 IL18-Seg12A(7.2 mg; 1.01 μmol; 1.0 당량) 및 히드록실아민 펩티드 IL18-Seg34B(12.5 mg; 1.06 μmol; 1.05 당량)를 0.1 M 옥살산을 함유하는 97.5:2.5 DMSO/H2O(68 μL)에 용해시켰다. 균질한 액체 용액을 얻었고, 이를 60℃에서 밤새 반응시켰다. 결찰 반응 완료 후, 혼합물을 먼저 DMSO(150 μL)로 희석하였다. 혼합물을 TFA(0.1%, v/v)를 함유하는 2:1 H2O/CH3CN(10 mL가 되도록 하는 양)으로 추가 희석하였다. 희석된 혼합물을 여과하고 분취용 HPLC에 주입하였다. 미정제 결찰된 펩티드는 40분 내에 0.1% TFA(v/v)가 포함된 10에서 45%까지의 CH3CN의 구배와 함께, 이동상으로 0.1% TFA(v/v)가 포함된 CH3CN/H2O를 사용하여 60℃에서 10 mL/분의 유속으로 Shiseido Capcell Pak C18 컬럼(5 ㎛, 250 x 20 mm)을 사용하는 분취용 HPLC로 정제하였다. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조하여 >98% 순도의 백색 고체로서 IL18-Seg1234B-Acm을 얻었다. 단리된 수득량은 5.8 mg(30.4%)이었다. 이 물질은 추가 특성화 없이 재배열 단계에서 바로 사용하였다.
IL18- Seg1234B 선형 단백질 제조:
선형 단백질의 재배열: IL18-Seg1234B-Acm(5.81 mg, 0.307 μmol)을 0.1 M Tris를 함유하는 수성 6 M Gu·HCl에 용해시키고(2.2 mL, 15 μM 단백질 농도) 혼합물을 50℃에서 2.5 시간 동안 부드럽게 진탕하였다. 재배열 반응 완료 후, 혼합물을 TFA(0.1%, v/v)를 함유하는 6M Gu·HCl(10 mL가 되도록 하는 양)로 희석하였다. 희석된 혼합물을 여과하고 분취용 HPLC에 주입하였다. 미정제 재배열된 펩티드는 40분 내에 0.1% TFA(v/v)가 포함된 10에서 45%까지의 CH3CN의 구배와 함께, 이동상으로 0.1% TFA(v/v)가 포함된 CH3CN/H2O를 사용하여 60℃에서 10 mL/분의 유속으로 Shiseido Capcell Pak C18 컬럼(5 ㎛, 250 x 20 mm)을 사용하는 분취용 HPLC로 정제하였다. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조하여 >90% 순도의 백색 고체로서 IL18-Seg1234B-Acm-재배열을 얻었다. 단리된 수득량은 1.2 mg(21%)이었다. 이 물질은 추가 특성화 없이 Acm 탈보호 단계에서 바로 사용하였다.
Acm 탈보호: IL18-Seg1234B-Acm 재배열(1.2 mg; 0.063 μmol)을 0.20 mM AcOH/H2O(1:1)(320 μL, 단백질 농도)에 용해시키고 아세트산은(3.2 mg, 1%, m/v)을 용액에 첨가하였다. 혼합물을 차광시켜 50℃에서 2.5시간 동안 진탕하였다. 반응 완료 후, 샘플을 0.1% TFA(v/v)가 포함된 1:2 CH3CN/H2O 6 mL로 희석하였다. 샘플은 40분 내에 0.1% TFA(v/v)가 포함된 10에서 45%까지의 CH3CN의 구배와 함께, 이동상으로 0.1% TFA(v/v)가 포함된 CH3CN/H2O를 사용하여 60℃에서 10 mL/분의 유속으로 Shiseido Capcell Pak UG80 C18 컬럼(5 ㎛, 250 x 20 mm)을 사용하는 분취용 HPLC로 정제하였다. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조하여 86% 순도의 백색 분말로서 0.2 mg의 IL18-Seg1234B 선형 단백질(20% 수율)을 얻었다. MS (ESI): C830H1325N217O259S4; 질량 실측치: 18617.00 Da [M+H+].
실시예 4C - 서열 번호 63의 변형된 IL-18 폴리펩티드의 합성
다음 프로토콜을 사용하여 서열 번호 63의 변형된 IL-18 폴리펩티드를 제조하였으며, 여기서 잔기 68은 아지드 작용성을 포함하도록 변형된 아스파르테이트 잔기를 포함한다.
이 변이체의 경우, 세그먼트 1A는 실시예 4A에 사용된 것과 동일하다.
세그먼트 2B( Opr -IL18(32-61)-Val- 광보호 -α-케토산): Opr-IL18(32-61)-Val-광보호-α-케토산 세그먼트 B는 ~0.3074 mmol/g의 치환 용량을 갖는 Fmoc-Val-광보호-α-케토산이 사전 로딩된 Rink Amide MBHA 수지에서 0.2 mmol 규모로 합성하였다.
위치 61에 대한 자동화된 Fmoc-SPPS: DMF(2.0 mL, 0.4 M, 4 당량)에 용해된 Fmoc-아미노산, DMF 중 OxymaPure(2 mL, 0.4 M, 4 당량) 및 DMF 중의 DIC(2 mL, 0.4 M, 4 당량)를 수지에 첨가하여 실온에서 30분 동안 커플링 반응을 수행하였다. DMF 중 20%(v/v) 아세트산 무수물 용액(2 mL) 및 DMF 중 NMM(0.8 M, 2.0 mL)을 첨가하여 실온에서 6분 동안 캡핑을 수행하였다. DMF 중 20%(v/v) 4-메틸피페리딘을 사용하여 실온에서 8분 동안 Fmoc 탈보호 반응을 수행하였다.
그런 다음 Fmoc-O-메틸-L-호모세린의 수동 커플링을 수행하였다. 6 mL의 DMF 중 Fmoc-O-메틸-L-호모세린(177 mg, 0.5 mmol, 2.5 당량), HATU(190 mg, 0.5 mmol, 2.5 당량) 및 DIPEA(174 μL, 1.0 mmol, 5 당량)의 용액을 제조하고(실온에서 3분의 사전 활성화) 수지에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 부드럽게 교반하였다. 실온에서 10분 동안 DMF(4 mL) 중 아세트산 무수물(150 μL, 1.6 mmol, 8 당량) 및 DIPEA(278 μL, 1.6 mmol, 8 당량)을 첨가하여 실온에서 캡핑을 수행하였다. DMF 중 20%(v/v) 4-메틸피페리딘을 사용하여 실온에서 10분 동안 Fmoc 탈보호 반응을 수행하였다.
위치 59에서 56까지 자동화된 Fmoc-SPPS: DMF(2.0 mL, 0.4 M, 4 당량)에 용해된 Fmoc-아미노산, DMF 중 OxymaPure(2 mL, 0.4 M, 4 당량) 및 DMF 중 DIC(2 mL, 0.4 M, 4 당량)를 수지에 첨가하여 실온에서 30분 동안 커플링 반응을 수행하였다. DMF 중 20%(v/v) 아세트산 무수물 용액(2 mL) 및 DMF 중 NMM(0.8 M, 2.0 mL)을 첨가하여 실온에서 6분 동안 각 아미노산 뒤에 캡핑을 수행하였다. DMF 중 20%(v/v) 4-메틸피페리딘을 사용하여 실온에서 8분 동안 Fmoc 탈보호 반응을 수행하였다.
그런 다음 Fmoc-L-Asp(tBu)-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH의 수동 커플링을 수행하였다. 6 mL의 DMF 중 Fmoc-L-Asp(tBu)-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH(322 mg, 0.6 mmol, 3 당량), HATU(228 mg, 0.6 mmol, 3 당량) 및 DIPEA(209 μL, 1.2 mmol, 6 당량)의 용액을 제조하고(실온에서 3분의 사전 활성화) 수지에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 부드럽게 교반하였다.
위치 53에서 52까지 자동화된 Fmoc-SPPS: 서열의 시작 부분에 대해 앞서 언급한 것과 동일한 조건을 사용하여 커플링 반응을 수행하였다.
그런 다음 Fmoc-O-메틸-L-호모세린의 수동 커플링을 수행하였다. Fmoc-O-메틸-L-호모세린 수동 커플링 반응은 앞에서 언급한 것과 동일한 조건을 사용하여 수행하였다.
그런 다음 Fmoc-L-Ile-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH의 수동 커플링을 수행하였다. 6 mL의 DMF 중 Fmoc-L-Ile-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH(288 mg, 0.6 mmol, 3 당량), HATU(228 mg, 0.6 mmol, 3 당량) 및 DIPEA(209 μL, 1.2 mmol, 6 당량)의 용액을 제조하고(실온에서 3분의 사전 활성화) 수지에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 부드럽게 교반하였다.
위치 48에서 37까지 자동화된 SPPS: 위에서 설명한 조건을 사용하여 커플링 반응을 수행하였다. 각 위치에 이중 커플링이 필요하였다.
그런 다음 Fmoc-L-Asp(tBu)-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH의 수동 커플링을 수행하였다. 6 mL의 DMF 중 Fmoc-L-Asp(tBu)-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH(322 mg, 0.6 mmol, 3 당량), HATU(228 mg, 0.6 mmol, 3 당량) 및 DIPEA(209 μL, 1.2 mmol, 6 당량)의 용액을 제조하고(실온에서 3분의 사전 활성화) 수지에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 부드럽게 교반하였다.
위치 34에 대한 자동화된 Fmoc-SPPS: 위에서 설명한 조건을 사용하여 커플링 반응을 수행하였다. 이중 커플링이 필요하였다.
그런 다음 Fmoc-O-메틸-L-호모세린의 수동 커플링을 수행하였다. Fmoc-O-메틸-L-호모세린 수동 커플링 반응은 이전에 언급한 것과 동일한 조건을 사용하여 수행하였다.
위치 32에 대한 자동화된 Fmoc-SPPS: 위에서 설명한 조건을 사용하여 커플링 반응을 수행하였다. 이중 커플링이 필요하였다.
그런 다음 Boc-5-(S)-옥사프롤린의 수동 커플링을 수행하였다. 6 mL의 DMF 중 Boc-5-(S)-옥사프롤린(130 mg, 0.6 mmol, 3 당량), HATU(228 mg, 0.6 mmol, 3 당량) 및 DIPEA(209 μL, 1.2 mmol, 6 당량)의 용액을 제조하고(실온에서 3분의 사전 활성화) 수지에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 부드럽게 교반하였다. 수지를 DCM 및 디에틸 에테르로 세척하고 진공하에 건조하였다. 건조된 펩티딜 수지의 질량은 1.4 g이었다.
95:2.5:2.5 TFA/DODT/H2O(10 mL/g 수지)의 혼합물을 사용하고 혼합물을 실온에서 2.0시간 동안 부드럽게 교반하여 펩티드를 수지로부터 절단하였다. 수지를 절단 칵테일로부터 여과하고, 여액을 농축하고 냉각 디에틸 에테르(20℃)로 20배 희석하여 펩티드가 침전되도록 하였다. 원심분리 후, 에테르 층을 조심스럽게 따라내고, 펩티드 침전물을 디에틸 에테르에 재현탁하고, 트리츄레이션하고, 원심분리하였다. 에테르 세척을 2회 반복하고, 생성된 펩티드 침전물을 건조하였다. 미정제 펩티드의 질량은 940 mg이었다. 미정제 Opr-IL18(32-61)-Val-광보호-α-케토산 세그먼트 2C의 정제는 40분 내에 0.1% TFA(v/v)가 포함된 10에서 70%까지의 CH3CN의 구배와 함께, 이동상으로 0.1% TFA(v/v)가 포함된 CH3CN/H2O를 사용하여 60℃에서 10 mL/분의 유속으로 Shiseido Capcell Pak C18 컬럼(5 ㎛, 250 x 20 mm)을 사용하는 분취용 HPLC로 수행하였다. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조하여 >90% 순도의 백색 고체로서 Opr-IL18(32-61)-Val-광보호-α-케토산(IL18-Seg2)을 얻었다. 수지 로딩량을 기준으로 단리된 수득량은 340 mg(40%)이었다. C163H253N45O60S; 평균 동위원소 이론치: 1278.6023 Da [M+3H+]; 실측치: 1278.6020 Da [M+3H+].
Figure pct00089
세그먼트 3C( Fmoc - Opr -IL18(64-114)- Phe -α-케토산): Fmoc-Opr-IL18(64-114)-Phe-α-케토산 세그먼트는 ~0.40 mmol/g의 치환 용량을 갖는 Fmoc-Phe-보호-α-케토산이 사전 로딩된 Rink Amide ChemMatrixⓒ 수지에서 0.2 mmol 규모로 합성하였다.
위치 114에서 자동화된 Fmoc-SPPS: DMF(2.0 mL, 0.4 M, 4 당량)에 용해된 Fmoc-아미노산, DMF 중 OxymaPure(2 mL, 0.4 M, 4 당량) 및 DMF 중의 DIC(2 mL, 0.4 M, 4 당량)를 수지에 첨가하여 실온에서 30분 동안 커플링 반응을 수행하였다. 이중 커플링이 필요하였다. DMF 중 20%(v/v) 아세트산 무수물 용액(2 mL) 및 DMF 중 NMM(0.8 M, 2.0 mL)을 첨가하여 실온에서 6분 동안 캡핑을 수행하였다. DMF 중 20%(v/v) 4-메틸피페리딘을 사용하여 실온에서 8분 동안 Fmoc 탈보호 반응을 수행하였다.
그런 다음 Fmoc-O-메틸-L-호모세린의 수동 커플링을 수행하였다. 6 mL의 DMF 중 Fmoc-O-메틸-L-호모세린(177 mg, 0.5 mmol, 2.5 당량), HATU(190 mg, 0.5 mmol, 2.5 당량) 및 DIPEA(174 μL, 1.0 mmol, 5 당량)의 용액을 제조하고 (실온에서 3분의 사전 활성화) 수지에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 부드럽게 교반하였다. 실온에서 10분 동안 DMF(4 mL) 중 아세트산 무수물(150 μL, 1.6 mmol, 8 당량) 및 DIPEA(278 μL, 1.6 mmol, 8 당량)를 첨가하여 실온에서 캡핑을 수행하였다. DMF 중 20%(v/v) 4-메틸피페리딘을 사용하여 실온에서 10분 동안 Fmoc 탈보호 반응을 수행하였다.
위치 96에서 112까지 자동화된 Fmoc-SPPS: DMF에 용해된 Fmoc-아미노산(2.0 mL, 0.4 M, 4 당량), DMF 중 OxymaPure(2 mL, 0.4 M, 4 당량) 및 DMF 중 DIC(2 mL, 0.4 M, 4 당량)를 수지에 첨가하여 실온에서 30분 동안 커플링 반응을 수행하였다. 각 위치에 이중 커플링이 필요하였다. DMF 중 20%(v/v) 아세트산 무수물 용액(2 mL) 및 DMF 중 NMM(0.8 M, 2.0 mL)을 첨가하여 실온에서 6분 동안 각 아미노산 뒤에 캡핑을 수행하였다. DMF 중 20%(v/v) 4-메틸피페리딘을 사용하여 실온에서 8분 동안 Fmoc 탈보호 반응을 수행하였다.
그런 다음 Fmoc-L-Asp(tBu)-L-Thr[Ψ(Me,Me)Pro]-OH의 수동 커플링을 수행하였다. 6 mL의 DMF 중 Fmoc-L-Asp(tBu)-L-Thr[Ψ(Me,Me)Pro]-OH(332 mg, 0.6 mmol, 3 당량), HATU(228 mg, 0.6 mmol, 3 당량) 및 DIPEA(209 μL, 1.2 mmol, 6 당량)의 용액을 제조하고(실온에서 3분의 사전 활성화) 수지에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 부드럽게 교반하였다.
위치 87에서 93까지 자동화된 Fmoc-SPPS: 위에서 설명한 조건을 사용하여 커플링 반응을 수행하였다. 각 위치에 이중 커플링이 필요하였다. Cl-HOBt(0.1 M)를 함유하는 DMF 중 20%(v/v) 4-메틸피페리딘을 사용하여 실온에서 8분 동안 Fmoc 탈보호 반응을 수행하였다.
그런 다음 Fmoc-O-메틸-L-호모세린의 수동 커플링을 수행하였다. Fmoc-O-메틸-L-호모세린 수동 커플링 반응은 이전에 언급한 것과 동일한 조건을 사용하여 수행하였다.
위치 73에서 85까지 자동화된 Fmoc-SPPS: 위치 87에서 93까지에 사용된 동일한 조건을 사용하여 커플링 반응을 수행하였다.
그런 다음 Fmoc-L-Ile-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH의 수동 커플링을 수행하였다. 6 mL의 DMF 중 Fmoc-L-Ile-L-Ser[Ψ(Me,Me)Pro]-OH(288 mg, 0.6 mmol, 3 당량), HATU(228 mg, 0.6 mmol, 3 당량) 및 DIPEA(209 μL, 1.2 mmol, 6 당량)의 용액을 제조하고(실온에서 3분의 사전 활성화) 수지에 첨가하였다. 이를 실온에서 2시간 동안 반응하도록 두었다.
위치 69에서 70까지 자동화된 Fmoc-SPPS: 위치 73에서 85까지에 사용된 동일한 조건을 사용하여 커플링 반응을 수행하였다.
그런 다음 Fmoc-Asp(alloc)-OH의 수동 커플링을 수행하였다. 6 mL의 DMF 중 Fmoc-Asp(alloc)-OH(237 mg, 0.6 mmol, 3 당량), HATU(228 mg, 0.6 mmol, 3 당량) 및 DIPEA(209 μL, 1.2 mmol, 6 당량)의 용액을 제조하고(실온에서 사전 활성화 3분) 수지에 첨가하였다. 실온에서 2시간 동안 반응하도록 두었다.
위치 64에서 67까지 자동화된 Fmoc-SPPS: 위치 69에서 70까지에 사용된 동일한 조건을 사용하여 커플링 반응 수행하였다.
그런 다음 Fmoc-5-(S)-옥사프롤린의 수동 커플링을 수행하였다. 6 mL의 DMF 중 Fmoc-5-(S)-옥사프롤린(204 mg, 0.6 mmol, 3 당량), HATU(228 mg, 0.6 mmol, 3 당량) 및 DIPEA(209 μL, 0.6 mmol, 6 당량)의 용액을 제조하고(실온에서 3분의 사전 활성화) 수지에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 부드럽게 교반하였다.
Alloc 탈보호: 수지를 건조 DCM에서 15분 동안 팽윤시켰다. N2로 퍼징된 3 mL의 건조 DCM 중 페닐 실란(595 μL, 4.80 mmol, 24 당량)의 용액에 이어 N2로 퍼징된 3 ml의 건조 DCM 중 팔라듐-테트라키스(트리페닐포스핀)(116 mg, 100 μmol, 0.5 당량)의 용액을 수지에 첨가하고 이를 실온에서 30분 동안 교반하도록 두었다. 수지를 DCM 및 DMF로 여러 번 세척하였다.
그런 다음 O-(2-아미노에틸)-O'-(2-아지도에틸) 노나에틸렌 글리콜의 수동 커플링을 수행하였다. 3 mL의 DMF 중HATU(228 mg, 0.6 mmol, 3 당량)의 용액을 수지에 첨가한 후, 2 mL의 DMF 중의 시판 중인 O-(2-아미노에틸)-O'-(2-아지도에틸) 노나에틸렌 글리콜(338 mg, 0.6 mmol, 3 당량)의 용액 및 1 mL의 DMF 중 DIPEA (209 μL, 0.6 mmol, 6 당량)를 첨가하였다. 그런 다음 수지를 실온에서 2시간 동안 교반하였다.
수지를 DCM으로 세척하고 진공하에 건조하였다. 건조된 펩티딜 수지의 질량은 2 g이었다. 수지를 95:2.5:2.5 TFA/DODT/H2O(10 mL/g 수지)의 혼합물에서 실온에서 2.0시간 동안 교반하여 펩티드를 수지로부터 절단하였다. 수지를 절단 칵테일로부터 여과하고, 여액을 농축하고 냉각 디에틸 에테르(20℃)로 20배 희석하여 펩티드가 침전하도록 하였다. 원심분리 후, 에테르 층을 조심스럽게 따라내고, 펩티드 침전물을 디에틸 에테르에 재현탁하고, 트리츄레이션하고, 원심분리하였다. 에테르 세척을 2회 반복하고, 생성된 펩티드 침전물을 건조하였다. 미정제 펩티드의 질량은 1.5 g이었다. 미정제 Fmoc-Opr-IL18(64-114)-Phe-α-케토산 세그먼트 3C의 정제는 40분 내에 0.1% TFA(v/v)가 포함된 10에서 50%까지의 CH3CN의 구배와 함께, 이동상으로 0.1% TFA(v/v)가 포함된 CH3CN/H2O를 사용하여 60℃에서 10 mL/분의 유속으로 Shiseido Capcell Pak C18 컬럼(5 ㎛, 250 x 20 mm)을 사용하는 분취용 HPLC로 수행하였다. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조하여 >80% 순도의 백색 고체로서 Fmoc-Opr-IL18(64-114)-Phe-α-케토산(IL18-Seg3C)을 얻었다. 수지 로딩량을 기준으로 단리된 수득량은 104 mg(6%)이었다. MS (MALDI-TOF): C310H488N76O100S; 이론치 6907.5157 Da [M]; 실측치: 6902.4980 Da.
Figure pct00090
세그먼트 4C( Opr -IL18(117-157)): 서열 번호 63-Seg4의 Opr-IL18(117-157)의 합성은 ~0.35 mmol/g(1.43 g)의 치환 용량을 갖는 Fmoc-Asp(OtBu)-OH이 사전 로딩된 Rink Amide MBHA 수지를 사용하여 0.5 mmol 규모로 출발하였다.
위치 153에서 156까지의 수동 Fmoc-SPPS: Fmoc 보호된 아미노산(5.0 당량, 2.5 mmol) 및 HCTU(4.8 당량, 2.4 mmol)를 NMP(6.0 mL)에 용해하였다. DIPEA(0.5 mL, 2.2 mmol)를 첨가하여 사전 활성화를 2분 동안 수행하였다. 반응 혼합물을 수지에 붓고 부드러운 수동 교반 하에 45분 동안 반응하도록 하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 완전히 헹구었다. DMF(6 mL) 중 아세트산 무수물(0.5 mL) 및 DIPEA(0.5 mL)를 첨가하여 실온에서 6분 동안 각 위치에서 캡핑을 수행하였다. Fmoc 탈보호를 위해, 수지를 DMF 중 20% 4-메틸피페리딘으로 한 번 헹구었다. 수지를 부드러운 수동 교반 하에 15분 동안 동일한 용액으로 처리하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 완전히 헹구었다.
Fmoc-Phe-Thr[Ψ(Me,Me)Pro]-OH의 수동 커플링: 6 mL의 NMP 중 Fmoc-Phe-Thr[Ψ(Me,Me)Pro]-OH(793 mg, 1.5 mmol, 3.0 당량), HATU (570 mg, 1.5 mmol, 3.0 당량) 및 DIPEA(500 μL, 2.9 mmol, 5.8 당량.)의 용액을 제조하고(실온에서 3분의 사전 활성화) 수지에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 부드럽게 교반하였다. DMF(6 mL) 중 아세트산 무수물(0.5 mL) 및 DIPEA(0.5 mL)를 첨가하여 각 위치에서 실온에서 6분 동안 캡핑을 수행하였다. Fmoc 탈보호를 위해, 수지를 DMF 중 20%(v/v) 4-메틸피페리딘으로 한 번 헹구었다. 수지를 부드러운 수동 교반 하에 15분 동안 동일한 용액으로 처리하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 완전히 헹구었다.
Fmoc-O-메틸호모세린의 수동 커플링: 6 mL의 NMP 중 Fmoc-Hse(Me)-OH(533 mg, 1.5 mmol, 3.0 당량), HATU(570 mg, 1.5 mmol, 3.0 당량) 및 DIPEA(500 μL, 2.9 mmol, 5.8 당량)의 용액을 제조하고(실온에서 3분의 사전 활성화) 수지에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 부드럽게 교반하였다. DMF(6 mL) 중 아세트산 무수물(0.5 mL) 및 DIPEA(0.5 mL)를 첨가하여 실온에서 6분 동안 각 위치에서 캡핑을 수행하였다. Fmoc 탈보호를 위해, 수지를 DMF 중 20%(v/v) 4-메틸피페리딘으로 한 번 헹구었다. 수지를 부드러운 수동 교반 하에 15분 동안 동일한 용액으로 처리하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 완전히 헹구었다.
위치 146에서 149까지 수동 Fmoc-SPPS: 위치 151에서 156까지에 사용된 동일한 조건을 사용하여 커플링, 아세틸화 및 탈보호 반응을 수행하였다.
Fmoc-Leu-(Dmb)Gly-OH의 수동 커플링: 6 mL의 NMP 중 Fmoc-Leu-(Dmb)Gly-OH(842 mg, 1.5 mmol, 3.0 당량), HATU(570 mg, 1.5 mmol, 3.0 당량) 및 DIPEA(500 μL, 2.9 mmol, 5.8 당량)의 용액을 제조하고(실온에서 3분의 사전 활성화) 수지에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 부드럽게 교반하였다. DMF(6 mL) 중 아세트산 무수물(0.5 mL) 및 DIPEA(0.5 mL)를 첨가하여 실온에서 6분 동안 각 위치에서 캡핑을 수행하였다. Fmoc 탈보호를 위해, 수지를 DMF 중 20%(v/v) 4-메틸피페리딘으로 한 번 헹구었다. 수지를 부드러운 수동 교반 하에 15분 동안 동일한 용액으로 처리하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 완전히 헹구었다.
서열 번호 63 Seg4의 합성은 0.15 mmol 규모로 계속하였다.
위치 128에서 143까지 자동화된 Fmoc-SPPS: DMF에 용해된 Fmoc-아미노산의 용액(2.0 mL, 0.4 M, 5.3 당량), HCTU(2 mL, 0.4 M, 5.3 당량) 및 DMF 중 NMM(2 mL, 0.8 M, 10.7 당량)을 수지에 첨가하여 실온에서 30분 동안 커플링 반응을 수행하였다. 모든 위치에 이중 커플링을 수행하였다. DMF 중 20%(v/v) 아세트산 무수물 용액(2 mL) 및 DMF 중 NMM(0.8 M, 2.0 mL)을 첨가하여 실온에서 6분 동안 각 아미노산 뒤에 캡핑을 수행하였다. DMF 중 20%(v/v) 4-메틸피페리딘을 사용하여 실온에서 10분 동안 Fmoc 탈보호 반응을 수행하였다.
Figure pct00091
Fmoc-Cys(Acm-NHalloc)-OH 3의 수동 커플링: 4 mL의 NMP 중 Fmoc-Cys(Acm-NHalloc)-OH(308 mg, 0.75 mmol, 5.0 당량), HATU(285 mg, 0.75 mmol, 5.0 당량) 및 DIPEA(210 μL, 1.2 mmol, 8 당량)의 용액을 제조하고(실온에서 3분의 사전 활성화) 수지에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 부드럽게 교반하였다. DMF(4 mL) 중 아세트산 무수물(0.2 mL) 및 DIPEA(0.2 mL)를 첨가하여 실온에서 6분 동안 각 위치에서 캡핑을 수행하였다. Fmoc 탈보호를 위해, 수지를 DMF 중 20%(v/v) 4-메틸피페리딘으로 한 번 헹구었다. 수지를 부드러운 수동 교반 하에 15분 동안 동일한 용액으로 처리하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 완전히 헹구었다.
위치 123에서 126까지 자동화된 Fmoc-SPPS: 위치 123에서 143까지에 사용된 동일한 조건을 사용하여 커플링, 아세틸화 및 탈보호 반응을 수행하였다.
Fmoc-Glu(OtBu)-(Dmb)Gly-OH의 수동 커플링: 4 mL의 NMP 중 Fmoc-Glu(OtBu)-(Dmb)Gly-OH(475 mg, 0.75 mmol, 5.0 당량), HATU(342 mg, 0.75 mmol, 5.0 당량) 및 DIPEA(210 μL, 1.2 mmol, 8 당량)의 용액을 제조하고(실온에서 3분의 사전 활성화) 수지에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 부드럽게 교반하였다. DMF(4 mL) 중 아세트산 무수물(0.2 mL) 및 DIPEA(0.2 mL)를 첨가하여 실온에서 6분 동안 각 위치에서 캡핑을 수행하였다. Fmoc 탈보호를 위해, 수지를 DMF 중 20%(v/v) 4-메틸피페리딘으로 한 번 헹구었다. 수지를 부드러운 수동 교반 하에 15분 동안 동일한 용액으로 처리하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 완전히 헹구었다.
위치 117에서 120까지 자동화된 Fmoc-SPPS: 위치 123에서 143까지에 사용된 동일한 조건을 사용하여 커플링, 아세틸화 및 탈보호 반응을 수행하였다.
Boc-Opr-OH의 수동 커플링: 4 mL의 NMP 중 Boc-Opr-OH(163 mg, 0.75 mmol, 5.0 당량), HATU(342 mg, 0.75 mmol, 5.0 당량) 및 DIPEA(210 μL, 1.2 mmol, 8 당량)의 용액을 제조하고(실온에서 3분의 사전 활성화) 수지에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2시간 동안 부드럽게 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 완전히 헹구었다.
잔기 127의 Alloc 탈보호의 경우: 수지를 질소 퍼징된 DCM에서 팽윤시켰다. 질소로 퍼징된 DCM(3 mL) 중의 페닐실란(444 μL, 3.6 mmol, 24 당량)의 용액을 수지에 첨가하였다. 질소로 퍼징된 DCM(2 mL) 중 Pd(PPh3)4(58 mg, 0.075 mmol, 0.5 당량)의 용액을 첨가하여 Alloc 탈보호를 수행하였다. 수동 교반하면서 실온에서 30분 동안 반응하도록 하였다. 그런 다음 측쇄를 3개의 아르기닌 잔기로 구성된 가용화 태그로 작용화하였다. 위치 123에서 143까지에 사용된 동일한 조건을 사용하여 자동화된 방식으로 이들을 커플링하였다.
92.5:2.5:2.5:2.5 TFA/TIPS/DODT/H2O(10 mL/g 수지)의 혼합물을 사용하여 실온에서 2시간 동안 수지로부터 펩티드를 절단하였다. 절단 칵테일로부터 수지를 여과하고, 여액을 농축하고 냉각 디에틸 에테르(-20℃)로 20배 희석하여 펩티드가 침전되도록 하였다. 원심분리 후, 에테르 층을 조심스럽게 따라내고, 펩티드 침전물을 디에틸 에테르에 재현탁하고, 트리츄레이션하고, 원심분리하였다. 에테르 세척을 2회 반복하고, 생성된 펩티드 침전물을 건조하였다. 미정제 세그먼트 4C의 정제는 45분 내에 0.1% TFA(v/v)가 포함된 5에서 50%까지의 CH3CN의 구배와 함께, 이동상으로 0.1% TFA(v/v)가 포함된 CH3CN/H2O를 사용하여 60℃에서 40 mL/분의 유속으로 Shiseido Proteonavi 컬럼(5 ㎛, 250 x 50 mm)을 사용하는 분취용 HPLC로 수행하였다. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조하여 백색 고체로서 세그먼트 4C를 얻었다. 수지 로딩량을 기준으로 단리된 수득량은 116 mg(14%)이었다. MS (MALDI-TOF): C239H381N69O77S; 평균 동위원소 이론치 5485.14 Da [M]; 실측치: 5481.28
IL18- Seg12C 제조: 펩티드 케토산 IL18-Seg1A(56.2 mg; 15.8 μmol; 1.2 당량) 및 히드록실아민 펩티드 IL18-Seg2C(50.6 mg; 13.2 μmol; 1.0 당량)를 0.1M 옥살산을 함유하는 9.75:0.25 DMSO/H2O 용액(660 μL)에 용해시켰다. 매우 균질한 액체 용액을 얻었다. 결찰 바이알을 알루미늄 호일로 싸서 차광하고 60℃에서 밤새 부드럽게 교반하였다. 결찰 완료 후, 혼합물을 DMSO(1920 μL)로 희석하고 365 nm의 파장에서 2시간 동안 조사하여 C-말단 케토산의 광탈보호를 허용하였다. 혼합물을 TFA(0.1%, v/v)를 포함하는 1:1 CH3CN/H2O(20 mL가 되도록 하는 양)로 추가로 희석하였다. 희석된 혼합물을 여과하고 분취용 HPLC에 주입하였다. 결찰된 미정제 펩티드는 40분 내에 0.1% TFA(v/v)가 포함된 10%에서 70%까지의 CH3CN의 구배와 함께, 60℃에서 40 mL/분의 유속으로 Shiseido capcell Pak C18 컬럼(5 ㎛, 250 x 50 mm)을 사용하는 분취용 HPLC로 정제하였다. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조하여 >98% 순도의 백색 고체로서 IL18-Seg12C를 얻었다. 단리된 수득량은 40 mg(42%)이었다. MS(MALDI-TOF): C321H506N88O96S; 평균 이론치 7131.6516 Da [M]; 실측치: 7125.8340.
IL18- Seg34C 제조: 펩티드 케토산 IL18-Seg3C(25 mg; 3.6 μmol; 1.0 당량) 및 히드록실아민 펩티드 IL18-Seg4C(22 mg; 4 μmol; 1.1 당량)를 0.1 M 옥살산을 함유하는 97.5:2.5 DMSO/H2O(180 μL)에 용해시켰다. 매우 균질한 액체 용액을 얻었고 60℃에서 밤새 부드럽게 교반하였다. 결찰 반응이 완료되면 혼합물을 DMSO(320 μL)로 희석하고 TFA(0.1%, v/v)를 포함하는 1:2 CH3CN/H2O(10 mL가 되도록 하는 양)로 추가 희석하였다. 희석된 혼합물을 분취용 HPLC에 바로 주입하였다. 미정제 결찰된 펩티드 용액을 여과하고 40분 내에 0.1% TFA(v/v)가 포함된 10에서 45%까지의 CH3CN의 구배와 함께, 이동상으로 0.1% TFA(v/v)가 포함된 CH3CN/H2O를 사용하여 60℃에서 10 mL/분의 유속으로 Shiseido Capcell Pak C18 컬럼(5 ㎛, 250 x 20 mm)을 사용하는 분취용 HPLC로 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조하여 백색 고체로서 8 mg의 Fmoc 보호된 IL18-Seg34C를 얻었다.
Fmoc 보호된 IL18-Seg34C를 DMSO(200 μL)에 용해시켰다. 디에틸아민(10 μL, 5%, v/v)을 첨가하여 Fmoc 탈보호를 개시하고 실온에서 15분 동안 부드럽게 교반하였다. DMSO(200 μL) 중 디에틸아민(10 μL)의 두 번째 용액을 반응 혼합물에 첨가하고 실온에서 추가 15분 동안 부드럽게 교반하였다. 겔 형성이 예상되었다. 트리플루오로아세트산(40 μL)을 첨가하여 반응 혼합물을 중화시켰다. 균질하고 무색인 액체 용액을 얻었고, 이를 TFA(0.1%, v/v)를 포함하는 1:2 CH3CN/H2O(10 mL가 되도록 하는 양)로 추가 희석하였다. 희석된 혼합물을 분취용 HPLC에 바로 주입하였다. 미정제 결찰된 펩티드 용액을 여과하고 40분 내에 0.1% TFA(v/v)가 포함된 10에서 45%까지의 CH3CN의 구배와 함께, 이동상으로 0.1% TFA(v/v)가 포함된 CH3CN/H2O를 사용하여 60℃에서 10 mL/분의 유속으로 Shiseido Capcell Pak C18 컬럼(5 ㎛, 250 x 20 mm)을 사용하는 분취용 HPLC로 정제하였다. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조하여 IL18-Seg34C를 >97% 순도의 백색 고체로서 얻었다. 단리된 수득량은 5.5 mg(26%)이었다. MS(MALDI-TOF): C530H854N144O172S2; 평균 이론치 12059.62 Da [M]; 실측치: 12119.56 [M + 부가물].
IL18- Seg1234C 선형 단백질 제조:
최종 펩티드 결찰 : 펩티드 케토산 IL18-Seg12C(3.6 mg; 0.5 μmol; 1.1 당량) 및 히드록실아민 펩티드 IL18-Seg34C(5.5 mg; 0.46 μmol; 1.0 당량)를 0.1 M 옥살산을 함유하는 97.5:2.5 DMSO/H2O(23 μL)에 용해시켰다. 균질한 액체 용액을 얻었고, 이를 65℃에서 밤새 반응시켰다. 결찰 반응 완료 후, 혼합물을 먼저 DMSO(0.95 mL)로 희석하였다.
재배열: 혼합물을 0.1 M Tris(1.0 mL)를 함유하는 6M Gu·HCl로 추가 희석하고 혼합물을 50℃에서 2시간 동안 부드럽게 진탕하였다. 재배열 반응 완료 후, 혼합물을 TFA(0.1%, v/v)를 함유하는 6 M Gu·HCl(10.0 mL이 되도록 하는 양)로 희석하였다. 희석된 혼합물을 여과하고 분취용 HPLC에 주입하였다. 미정제 재배열된 펩티드는 40분 내에 0.1% TFA(v/v)가 포함된 10에서 45%까지의 CH3CN의 구배와 함께, 이동상으로 0.1% TFA(v/v)가 포함된 CH3CN/H2O를 사용하여 60℃에서 10 mL/분의 유속으로 Shiseido Capcell Pak C18 컬럼(5 ㎛, 250 x 20 mm)을 사용하는 분취용 HPLC로 정제하였다. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조하여 >97% 순도의 백색 고체로서 IL18-Seg1234C-Acm-재배열을 얻었다. 단리된 수득량은 1.9 mg(22%)이었다. 이 물질은 추가 특성화 없이 Acm 탈보호 단계에서 바로 사용하였다.
Acm 탈보호 : IL18-Seg1234C-Acm-재배열(1.9 mg; 0.099 μmol)을 0.20 mM AcOH/H2O(1:1)(500 μL)에 용해시키고 아세트산은(5.0 mg, 1%, m/v)을 용액에 첨가하였다. 혼합물을 차광시켜 50℃에서 3시간 동안 진탕하였다. 반응 완료 후, 샘플을 0.1% TFA(v/v)가 포함된 9.5 mL의 1:2 CH3CN/H2O로 희석하였다. 샘플은 40분 내에 0.1% TFA(v/v)가 포함된 10에서 45%까지의 CH3CN의 구배와 함께, 이동상으로 CH3CN/H2O을 사용하여 60℃에서 10 mL/분의 유속으로 Shiseido Capcell Pak UG80 C18 컬럼(5 ㎛, 250 x 20 mm)에서의 HPLC로 정제하였다. 정제된 생성물을 함유하는 분획을 모으고 동결건조하여 97% 순도의 백색 분말로서 0.5 mg의 IL18-Seg1234C 선형 단백질(30% 수율)을 얻었다. MS(MALDI-TOF): C819H1305N217O264S3; 평균 이론치 18511.88; 측정치: 18513.3270.
IL18- Seg1234C 선형 단백질의 폴딩 및 제제화:
단백질 분말(0.22 mg, TFA 염으로 동결건조됨)을 8 M 요소, 2 mM DTT 및 0.02%(m/v) Tween 80을 함유하는 110 μL의 완충액 A Tris 완충액(50 mm, pH 8.0)에 용해시킨다. 2 mg/mL 투명한 용액을 얻는다. 이를 실온에서 30분 동안 인큐베이션한다. 단백질 용액을 2 mM EDTA, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 400 mM 아르기닌·HCl, 2mM DTT 및 0.02%(m/v) Tween 80을 함유하는 Tris 완충액(50 mM, pH 7.8)(완충액 B)로 적가 방식으로 20℃에서 서서히 희석한다. 혼합물을 부드럽게 진탕하여(400 RPM) 효율적인 확산을 허용한다. 0.2 mg/mL의 투명한 용액을 얻는다. 이를 20℃에서 20시간 동안 인큐베이션한다. 그런 다음 10,000 RPM으로 실온에서 5분 동안 원심분리한다. 단백질 용액을 6% 수크로오스 및 0.02% Tween 80을 함유하는 650 mL의 PBS(pH 7.4)에 대해 실온에서 2시간 동안 투석한다. 이 단계가 두 번째로 반복된다. 단백질 용액을 6% 수크로오스 및 0.02% Tween 80을 함유하는 650 mL의 PBS(pH 7.4)에 대해 실온에서 2시간 동안 세 번째로 투석한다. 마지막으로, 10,000 RPM으로 실온에서 5분 동안 원심분리하고 -80℃에서 보관한다.
상기 폴딩 프로토콜은 선형 Seg1234 폴리펩티드 전구체로부터 적절하게 폴딩된 IL-18 폴리펩티드를 제조하기 위해 테스트할 수 있는 예시적인 프로토콜을 기재한다. 일부 실시양태에서, 실시예 2에 개략적으로 기술한 바와 같이 대안적인 완충액 A 및 B를 사용하여 전술한 폴딩 프로토콜을 수정한다(표 14 참조). 이러한 폴딩 프로토콜은 원하는 폴딩 결과가 결정될 때까지 테스트할 수 있다.
실시예 5 - 조성물 A 및 조성물 B의 구조
[도 4]는 변형된 IL-18 폴리펩티드인 조성물 A의 합성을 보여준다. 조성물 A는 짧은 PEG 중합체의 말단에서 잔기 C68에 부착된 30 kDa PEG 작용성을 포함한다. 선택적으로, 이 30 kDa PEG 작용성은 구리가 없는 클릭 화학 반응에 의해 짧은 PEG 중합체에 공유 부착된다.
변형된 IL-18 폴리펩티드 조성물 B가 본원에 추가로 제공된다. 조성물 B는 짧은 PEG 중합체의 말단에서 잔기 K70에 부착된 30 kDa PEG 작용성을 포함한다. 선택적으로, 이 30 kDa PEG 작용성은 구리가 없는 클릭 화학 반응에 의해 짧은 PEG 중합체에 공유 부착된다.
변형된 IL-18 폴리펩티드 조성물 C가 본원에서 추가로 제공된다. 조성물 C는 짧은 PEG 중합체의 말단에서 잔기 E69에 부착된 30 kDa PEG 작용성을 포함한다. 선택적으로, 이 30 kDa PEG 작용성은 구리가 없는 클릭 화학 반응을 통해 짧은 PEG 중합체에 공유 부착된다.
실시예 6 - 조성물 A 및 조성물 B의 특성화
조성물 A 및 조성물 B는 조성물을 특성화하기 위해 일련의 분석 실험을 거친다. 변형된 IL-18 폴리펩티드를 HPLC로 분석하여 조성물의 균일성 정도를 결정한다. 변형된 IL-18 폴리펩티드 조성물은 또한 MALDI-MS로 분석하여 조성물의 MW 및 분자량 분포를 결정한다. 야생형 IL-18과 비교하여 변형된 IL-18 폴리펩티드 조성물의 폴딩을 비교하기 위해 변형된 IL-18 폴리펩티드 조성물을 원 이색법에 의해 추가로 분석한다.
실시예 7 - 변형된 IL-18 폴리펩티드의 제제화
동결건조된 변형된 IL-18 폴리펩티드를 50 mg/mL 만니톨이 포함된 PBS 완충액(pH 7.4)을 포함하는 용액에 현탁시켰다.
실시예 8 - IL-18 SPR 측정
야생형 및 변형된 IL-18 폴리펩티드의 인간 IL-18 수용체 서브유닛와의 상호작용을 표면 플라스몬 공명(SPR: Surface Plasmon Resonance) 기술로 측정하였다. 6 ㎍/mL의 Fc 융합 인간 IL-18Rα, 6 ㎍/mL의 Fc 융합 인간 IL-18Rβ, 또는 2 ㎍/mL의 Fc 융합 인간 IL-18BP 아이소형 a(IL-18BPa)를 포획하기 위해 포획 전 30분 동안 항-인간 IgG 항체를 CM5 칩에 아민 커플링에 의해 결합시켰다. 다른 설정에서, 알파/베타 이종이량체 IL-18 수용체를 포획하기 전에 6 ㎍/mL의 알파 및 베타 IL-18 수용체를 혼합하고 30분 동안 사전 인큐베이션하였다.
IL-18 분석물의 동역학적 결합은 Biacore 8K 기기를 사용하여 1 μM에서 시작하여 0.98 nM까지의 2배 연속물에서 측정하였다. 분석물의 매 농도 후에 아민 커플링된 항 IgG 항체로의 표면 재생을 수행하였다. 수용체에 대한 단백질 회합을 측정하기 위해, 샘플을 50 μL/분의 유속으로 60초 동안 주입한 다음 300초 완충액만 주입한 후 해리를 검출하였다. 사용된 실행 완충액은 0.05% Tween20이 포함된 1xPBS였다. 상대 반응 단위(RU, Y축)는 시간(s, X축)에 대해 플롯하고 단량체 수용체 결합 및 IL-18BP에 대한 결합에 대한 동역학적 1:1 결합 모델로 분석한다. 알파/베타 이종이량체 결합에 동역학적 이종 리간드 맞춤 모델을 적용하였다.
실시예 9 - IL- 18BP 결합 alphaLISA 분석
인간 IL-18BP AlphaLISA 분석 키트를 사용하여 IL-18BP에 대한 각 IL-18 변이체의 결합 친화도를 결정하였으며, 이는 유리 형태 IL-18BP의 존재를 검출하였다.
5 ng/mL의 His-태그된 인간 IL-18BP의 존재 하에 20% FCS, Glutamax, 및 25 μM β-메르캅토에탄올이 보충된 aMEM 배지에서 IL-18 분석물의 16개의 3배 연속 희석물을 제조하였다. 최종 IL-18 분석물 농도 범위는 2778 nM 내지 0.2 pM이었다.
실온에서 1시간 인큐베이션 후, 인간 IFNγ AlphaLISA 분석 키트를 사용하여 유리 IL-18BP 수준을 측정하였다. 384웰 OPTI플레이트에서, 5 μL의 5X 항-IL-18BP 수용 비드를 7.5 μL의 IL-18/IL-18BP 혼합물에 첨가하였다. 진탕하면서 실온에서 30분 인큐베이션 후, 5 μL의 비오티닐화 항-IL-18BP 항체를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 추가로 인큐베이션하였다. 은은한 빛 아래에서, 12.5 μL의 2X 스트렙타비딘(SA) 공여 비드를 각 웰에 피펫팅하고, 웰을 실온에서 추가 30분 동안 진탕하면서 인큐베이션하였다. 여기 및 방출 파장이 각각 680 및 615 nm로 Enspire 플레이트 판독기에서 AlphaLisa 신호를 측정하였다. GraphPad PRISM 소프트웨어를 사용하는 가변 기울기, 4개 매개변수 분석을 기초로 하여 해리 상수(KD)를 계산하였다.
실시예 10 - IL- 18Rα 단량체에 대한 IL-18 변이체의 결합
표 5는 실시예 8에 제시된 바와 같은 프로토콜을 사용하여 IL-18Rα와 기재된 IL-18 변이체에 대해 관찰된 해리 상수(KD)의 결과를 보여준다. 결과는 서열 번호 6, 7, 8, 및 20의 변형된 IL-18 폴리펩티드가 서열 번호 1의 야생형 IL-18의 KD와 유사하거나 그보다 낮은 KD 값을 가졌음을 보여준다. 서열 변형 E06K, K53A, S55A, 및 T63A를 갖는 변형된 IL-18 폴리펩티드는 IL-18Rα에 대한 결합 친화도를 유지하였다.
[표 5]
Figure pct00092
Figure pct00093
실시예 11 - IL- 18Rα /β 이종이량체에 대한 IL-18 변이체의 결합
표 6은 실시예 8에 기재된 바와 같은 실험을 사용하여 IL-18Rα/β 이종이량체와 기재된 IL-18 변이체에 대해 관찰된 해리 상수(KD)의 결과를 보여준다. 결과는 서열 번호 6, 7, 8, 18, 19, 및 20의 변형된 IL-18 폴리펩티드가 서열 번호 1의 야생형 IL-18과 유사한 KD 값을 가졌음을 보여준다. 일부 경우에, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 야생형 IL-18보다 더 낮은 KD 값을 나타냈다. 서열 변형 E06K, K53A, S55A, 및 T63A를 보유하는 변형된 IL-18 폴리펩티드는 IL-18Rα/β 이종이량체에 대한 결합 친화도를 유지하였다. 데이터는 본 개시 내용의 일부 IL-18 변이체가 감소된 해리 상수를 가졌음을 나타내며, 이는 IL-18/IL-18R 복합체의 안정화를 반영하였다.
[표 6]
Figure pct00094
실시예 12 - IL- 18BP 단량체에 대한 결합 분석
표 7은 실시예 8에 기재된 것과 유사한 프로토콜을 사용하여 IL-18BP와 기재된 IL-18 변이체에 대해 관찰된 해리 상수(KD)의 결과를 보여준다. 결과는 서열 번호 4, 5, 6, 7, 8, 15, 16, 19, 20, 및 21의 변형된 IL-18 폴리펩티드가 서열 번호 1의 야생형 IL-18과 유사하거나 더 높은 KD 값을 가졌음을 보여준다. 서열 변형 K53A, S55A, E06K, C38S, C68S, C76S, C127S, 및/또는 K70C를 보유하는 변형된 IL-18 폴리펩티드는 IL-18BP에 대한 결합 친화도를 유지하였다.
변형된 IL-18 변이체 중 다수는 IL-18BP에 대한 회합(Kon)을 실질적으로 변형시키지 않고 단지 본 개시 내용의 일부 변형된 IL-18 변이체에 의해 관찰된 10배 더 높은 해리 상수에 의해 나타난 바와 같이 복합체를 불안정화시켰다. 이러한 변형된 IL-18 변이체의 경우, IL-18/IL-18R 복합체의 안정화 및 IL-18/IL-18BP 복합체의 불안정화는 IL-18에 대한 IL-18R 및 IL-18BP의 경쟁에서 균형이 이동되는 결과를 낳았다. 많은 변이체의 경우, IL-18BP에 대한 결합이 제거되지 않았지만 IL-18BP와 비교하여 IL18R에 대한 결합이 유사하거나 약간 개선된 것으로 나타났다.
[표 7]
Figure pct00095
Figure pct00096
표 8은 실시예 9에 기재된 프로토콜을 사용하여 측정된 바와 같이 IL-18BP와 기재된 IL-18 변이체에 대해 관찰된 해리 상수(KD)의 결과를 보여준다. 결과는 서열 번호 5, 6, 8, 15, 및 16의 변형된 IL-18 폴리펩티드가 서열 번호 1의 야생형 IL-18과 유사하거나 더 높은 KD 값을 가졌음을 보여준다.
[표 8]
Figure pct00097
Figure pct00098
실시예 13 - IFNγ 유도 세포 분석
본원에 제공된 IL-18 폴리펩티드의 능력을 하기 프로토콜에 따른 세포 분석에서 IFN γ를 유도하는 능력에 대해 평가하였다.
림프종 환자로부터 유래된 NK 세포주 NK-92(ATCC® CRL-2407™)를 20% FCS, Glutamax, 25 μM B-머캅토에탄올, 및 100 IU/mL의 재조합 인간 IL-2가 보충된 aMEM 배지에서 배양하였다.
실험 당일, 세포를 수거하고 IL-2가 포함되지 않고 1 ng/mL의 재조합 인간 IL-12를 함유하는 aMEM 배지로 세척하였다. 계수 후, 세포를 384웰 역가 플레이트에 100,000개 세포/웰로 접종하고 37℃/5% CO2에서 인큐베이션하였다. IL-18 분석물의 16개의 4배 연속 희석물을 aMEM 배지에서 제조하고, 1 ng/mL의 IL-12를 NK-92 세포에 첨가하였다. 최종 IL-18 분석물 농도는 56 nM 내지 5x10-5 pM 범위였다.
세포를 37℃/5% CO2에서 16-20시간 동안 인큐베이션한 후, 5 μL의 상청액을 조심스럽게 384 마이크로웰 OptiPlate로 옮겼다. IFNγ 수준은 인간 IFNγ AlphaLISA 분석 키트를 사용하여 측정하였다. 간략하게, 10 μL의 2.5X AlphaLISA 항-IFNγ 수용 비드 및 비오티닐화된 항체 항-IFNγ 혼합물을 5 μL의 NK-92 상청액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 진탕하면서 인큐베이션하였다. 은은한 빛 아래에서, 2.5 μL의 2X 스트렙타비딘(SA) 공여 비드를 각 웰에 피펫팅하고, 웰을 실온에서 30분 동안 진탕하면서 인큐베이션하였다. 여기 및 방출 파장으로 각각 680 nm 및 615 nm를 사용하여 EnSpire™ 플레이트 판독기에서 AlphaLISA 신호를 측정하였다. GraphPad PRISM 소프트웨어를 사용하는 가변 기울기 및 4가지 매개변수 분석을 기초로 하여 반수 최대 유효 농도(EC50)를 계산하였다.
다양한 IL-18 폴리펩티드에 대한 이 실험의 결과는 하기 표 9(EC50 데이터)에 제시한다.
실시예 14 - IL-18 결합 단백질 억제 세포 분석
림프종 환자로부터 유래된 NK 세포주 NK-92(ATCC® CRL-2407™)를 20% FCS- Glutamax, 25 μM B-머캅토에탄올, 및 100 IU/mL의 재조합 인간 IL-2가 보충된 aMEM 배지에서 배양하였다.
실험 당일, 세포를 수거하고 IL-2가 포함되지 않고 1 ng/mL의 재조합 인간 IL-12를 함유하는 aMEM 배지로 세척하였다. 계수 후, 세포를 384웰 역가 플레이트에 100,000개 세포/웰로 접종하고 37℃/5% CO2에서 인큐베이션하였다. Fc-융합 인간 IL-18 결합 단백질 아이소형 a(IL-18BPa)의 16개의 2배 연속 희석물을 aMEM 배지에서 제조하였다. 2 nM의 각각의 변형된 IL-18 폴리펩티드 변이체를 함유하는 1 ng/mL의 IL-12를 NK-92 세포에 첨가하였다. 최종 IL-18 분석물 농도는 1 nM이었고, 최종 IL-18BPa 농도는 566 nM 내지 17 pM 범위였다.
세포를 37℃/5% CO2에서 16-20시간 동안 인큐베이션한 후, 5 μL의 상청액을 조심스럽게 384 마이크로웰 OptiPlate로 옮겼다. 인간 IFNγ AlphaLISA 분석 키트를 사용하여 IFNγ 수준을 측정하였다. 간략하게, 10 μL의 2.5X AlphaLISA 항-IFNγ 수용 비드 및 비오티닐화된 항체 항-IFNγ 믹스를 5 μL의 NK-92 상청액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 진탕하면서 인큐베이션하였다. 은은한 빛 아래에서, 2.5 μL의 2X SA 공여 비드를 각 웰에 피펫팅하고 실온에서 30분 동안 진탕하면서 인큐베이션하였다. 여기 및 방출 파장으로 각각 680 nm 및 615 nm를 사용하여 EnSpire™ 플레이트 판독기에서 AlphaLISA 신호를 측정하였다. GraphPad PRISM 소프트웨어를 사용하는 가변 기울기 및 4가지 매개변수 분석을 기초로 하여 반수 최대 억제 농도(IC50)를 계산하였다.
본 개시 내용의 변형된 IL-18 변이체는 활성적이고 시험관 내에서 IFNγ 분비를 유도할 수 있다. 표 9는 테스트된 IL-18 변이체 중 다수가 IFNγ 생성을 유도할 수 있는 한편, 일부 IL-18 변이체는 각각 EC50 및 IC50으로 측정되는 바와 같이 IL-18BP에 의한 억제에 대해 상당히 덜 민감하다는 것을 보여준다.
[표 9]
Figure pct00099
Figure pct00100
실시예 15 - HEK -Blue IL18R 리포터 분석
IL-18R 양성 HEK-Blue 리포터 세포주를 사용하여 IL-18R에 대한 IL-18 변이체의 결합 및 후속 다운스트림 신호 전달을 결정하였다. 일반적인 프로토콜은 아래에 개략적으로 설명한다.
5Х104개 세포 HEK-Blue IL18R 리포터 세포(InvivoGen, #hkb-hmil18)를 96웰 플레이트의 각 웰에 접종하고 37℃ 및 5% CO2에서 0-100 nM의 IL-18 폴리펩티드 변이체로 자극하였다. 20시간 인큐베이션 후, 각 웰에서 20 μL의 세포 배양 상청액을 취하여 96웰 플레이트에서 180 μL QUANTI-Blue 배지와 혼합하고, 37℃ 및 5% CO2에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 620 nm에서의 흡광도 신호를 여기 및 방출 파장으로서 각각 680 및 615 nm로 Enspire 플레이트 판독기에서 측정하였다. GraphPad PRISM 소프트웨어를 사용하는 가변 기울기, 4개의 매개변수 분석을 기초로 하여 반수 최대 유효 용량(EC50)을 계산하였다.
선택된 변이체에 대한 이 실험의 결과는 하기 표 12에 제시한다.
[표 12]
Figure pct00101
실시예 16A - 변형된 IL-18 폴리펩티드 변이체의 약동학적 및 약력학적 특성
선별된 IL-18 폴리펩티드 변이체의 약동학(PK) 및 약력학(PD) 특성을 측정하였다. 세 마리의 C57BL/6 마우스를 군별 및 시점별로 테스트하였다. IL-18 변이체는 단회 정맥 주사를 통해 적용하였다. 마우스를 4개의 용량 군: 0.5 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.02 mg/kg, 0.004 mg/kg; 및 4개의 시점 군: 5분, 6시간, 24시간, 48시간으로 나누었다.
면역 관련 PD 효과는 혈장의 사이토카인 수준을 분석하여 결정하였다. 다음 혈장 사이토카인을 측정하였다: IFNγ, CXCL9, CXCL10, GM-CSF, IL-1a, FasL, 및 IL-18BP. 백혈구의 활성화 상태는 ICOS, PD-1, CD25, CD69, 및 Fas와 같은 표면 마커를 모니터링하여 결정하였다. IL-18 변이체(유리 및 IL-18BP-복합체, [도 7] 참조)의 총량을 검출하여 생체분석을 수행하였다. Corning 고결합 하프-에어리어 플레이트(Fisher Scientific, 스위스 라이나흐 소재)를 PBS 중 2 ㎍/ml의 항-IL18 단클론 항체(MBL, 카탈로그 번호 D043-3, 클론 25-2G) 25 μl로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 그런 다음 플레이트를 100 μl의 PBS-0.02% Tween20으로 4회 세척하였다. 플레이트 표면을 25 μl의 PBS-0.02% Tween20-1% BSA 로 37℃에서 1시간 동안 차단하였다. 그런 다음 플레이트를 100 μl의 PBS-0.02% Tween20으로 4회 세척하였다. 25 마이크로리터의 IL-18 변이체(또는 마우스 혈장)를 PBS-0.02% Tween20-0.1% BSA에 50 nM에서 시작하여 0.02 nM까지 낮춘 8배 연속 희석물에 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 플레이트를 100 μl의 PBS-0.02% Tween20 및 PBS 중 2 ㎍/ml의 비오티닐화 항-IL18 단클론 항체(MBL, 카탈로그 번호, 클론 159-12B) 25 μl 로 4회 세척하였다. 플레이트를 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 다음 100 μl의 PBS-0.02% Tween20으로 4회 세척하였다. PBS-0.02% Tween20-0.1% BSA에 1:500으로 희석된 스트렙타비딘-양고추냉이 퍼옥시다제(#RABHRP3, Merck, 스위스 부흐스 소재) 25 마이크로리터를 각 웰에 첨가하고 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 플레이트를 100 μl의 PBS-0.02% Tween20으로 4회 세척하였다. 50 마이크로리터의 TMB 기질 시약(#CL07, Merck, 스위스 부흐스 소재)을 각 웰에 첨가하고 37℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 37℃에서 5분 후, 50 μl/웰의 0.5 M H2SO4 정지 용액을 첨가하여 양고추냉이 퍼옥시다제 반응을 정지시켰다. 그런 다음 ELISA 신호를 Perkin Elmer(스위스 슈베르첸바흐 소재)의 EnSpire 플레이트 판독기에서 450 nm에서 측정하였다.
[도 7]은 하기 군의 ELISA 결과를 나타낸다: 대조군; 대조군 + IL-18BP; 야생형 IL-18; 야생형 IL-18 + IL-18BP; 서열 번호 2의 변형된 IL-18 폴리펩티드; 서열 번호 2의 변형된 IL-18 폴리펩티드 + IL-18BP.
실시예 16B - E6K 및 K53A 아미노산 치환을 보유하는 변형된 IL-18의 PK/PD
별도의 실험에서, 3마리의 C57BL/6 마우스를 군별 및 시점별로 테스트하였다. 야생형 IL-18(서열 번호 1)을 0.3 mg/kg의 단회 정맥 주사를 통해 적용하였다. E6K, K53A 변이체 IL-18(서열 번호 7)을 t=0시간 및 t=24시간에 0.3 mg/kg의 2회 정맥 내 주사를 통해 적용하였다. 마우스를 5분, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 24시간, 및 48시간의 7개 시점 군으로 나누었다.
면역 관련 PD 효과는 혈장의 사이토카인 수준을 분석하여 결정하였다. 다음 혈장 사이토카인을 측정하였다: GM-CSF, IFNγ, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, TNFa, IL-22, MCP-1, MCP-3, MIP-1a, MIP-1b 및 CXCL1. 백혈구의 활성화 상태는 표면 마커인 PD-1 및 CD25를 모니터링하여 결정하였다. IL-18 변이체(유리 및 IL-18BP-복합체)의 총량을 검출하여 생체분석을 수행하였다.
인간 IL-18 폴리펩티드 변이체(서열 번호 7)는 야생형 인간 IL-18에 비해 생체 내 사이토카인 생성을 증가시켰다. [도 20]은 IFNγ의 혈장 농도를 나타내고, [도 21]은 야생형 또는 변이체 IL-18의 I.v. 주사 후 다양한 시점에서 CXCL10의 혈장 농도를 나타낸다. IFNγ, MCP-1, MCP-3, MIP-1a, MIP-1b, CXCL10 케모카인으로 가장 강력한 반응이 발견되었으며, 주사 후 2시간에서 8시간 사이에 상당한 증가가 관찰되었다(MCP-1, MCP-3, MIP-1a 및 MIO-1b에 대한 데이터는 표시되지 않음). 인간 IL-18 폴리펩티드 변이체(서열 번호 7)의 반복된 i.v. 주사는 혈장 사이토카인 수준이 주사 후 1시간 내지 8시간 사이에 증가하면서 더 강하고 더 빠른 반응을 일으켰다.
실시예 17 - rIL18 발현 및 정제
하기 제공된 프로토콜에 따라 본원에 제공된 재조합 IL-18 변이체를 제조할 수 있다.
가용성 His-SUMO-IL18 변이체
N-His-SUMO 태그된 IL-18 변이체 융합체를 코딩하는 플라스미드를 보유하는 이. 콜라이 BL21(DE3)을 3L LB 배양 배지에 접종하고 30℃에서 6시간 동안 0.4 mM IPTG로 유도한다. 세포를 펠릿화하고 용해 완충액 PBS, pH 7.4에서 초음파 처리하여 세포 용해를 수행한다. Ni-NTA 비드 6FF를 통해 가용성 단백질을 정제한다(PBS, 20 mM 이미다졸, pH 7.4를 이용한 세척 1; PBS, 50 mM 이미다졸, pH7.4를 이용한 세척 2; PBS, 500 mM 이미다졸, pH7.4를 이용한 용리).
단백질을 함유하는 분획을 모으고, PBS pH 7.4로 투석한 다음 SUMO 분해한다. 그런 다음 Ni-NTA 비드(샘플을 통한 흐름으로 계속) 및 겔 여과로 단백질을 2단계 정제한다. 단백질을 함유하는 분획을 모으고 SDS-PAGE 및 분석 SEC와 같은 분석 기술을 사용하여 QC를 수행한다.
불용성 His-SUMO-IL18 변이체
N-His-SUMO 태그된 IL-18 변이체 융합체를 코딩하는 플라스미드를 보유하는 이. 콜라이 BL21(DE3)을 10L LB 배양 배지에 접종하고 30℃에서 6시간 동안 0.4 mM IPTG로 유도한다. 세포를 펠릿화하고 용해 완충액 PBS, 8M 요소, pH 7.4에서 초음파 처리하여 세포 용해를 수행한다. Ni-NTA 비드 6FF를 통해 단백질을 정제한다(PBS, 8M 요소, 20 mM 이미다졸, pH7.4를 이용한 세척 1; PBS, 8 M 요소, 50 mM 이미다졸, pH7.4를 이용한 세척 2; PBS, 8 M 요소, 500 mM 이미다졸, pH7.4를 이용한 용리).
단백질을 함유하는 분획을 모으고, PBS pH 7.4로 투석한 다음 SUMO 분해한다. 그런 다음 Ni-NTA 비드로 단백질을 정제한다(PBS, 8M 요소, pH 7.4로 컬럼을 평형화, PBS, 8M 요소, pH 7.4로 세척, PBS, 8 M 요소, pH 7.4로 용리). 단백질을 함유하는 분획을 모으고, PBS pH 7.4로 투석하고 SDS-PAGE 및 분석 SEC와 같은 분석 기술을 사용하여 QC를 수행한다.
불용성 태그 없는 IL18 변이체
mIL-18을 코딩하는 플라스미드를 보유하는 이. 콜라이 BL21(DE3)을 2L LB 배양 배지에 접종하고 0.4 mM IPTG로 30℃에서 6시간 동안 유도한다. 세포를 펠릿화하고 용해 완충액 110 mM Tris, 1.1 M 구아니딘 HCl, 5 mM DTT, pH 8.9에서 초음파 처리에 의해 세포 용해를 수행한다. Q Sepharose FF를 통해 단백질을 정제한다(평형 완충액 20 mM MES, pH 7.0, 0에서 1M NaCl까지 증가 구배로 용리).
이중시스트론 ( bicistronic ) 시스템
플라스미드(예를 들어, 서열 번호 71)를 함유하는 이. 콜라이 BL21의 단일 콜로니를 25 ㎍/mL 카나마이신 설페이트를 함유하는 10 mL LB의 접종원으로 사용하고 37℃ 및 200 rpm에서 밤새 인큐베이션 한다. 예비 배양액 1 mL를 사용하여 100 ㎍/mL 카나마이신 설페이트를 함유하는 1L 자가유도 terrific broth에 접종한다. 배양물을 37℃ 및 110 rpm에서 4시간 동안 인큐베이션한 다음 추가 15시간 동안 15℃로 옮긴다. 세포를 10-15 mL 용해 완충액(100 mM Hepes, 1 mM EDTA, 5 mM DTT, 20 ㎍/mL 리소자임, 0.1 mg/mL DNase I, 1 mM PMSF, pH 7.5)에 재현탁하고 4℃에서 1시간 동안 부드럽게 진탕한다. 그런 다음 세포를 초음파 처리로 용해하고 원심분리(16,000 x g, 30분, 4℃) 및 여과(0.2 ㎛ 막)에 의해 가용성 단백질 분획을 얻는다.
상청액은 약 pH 7으로 조정하고 50 mL 슈퍼루프를 사용한 직렬 컬럼 시스템(2Х SP CIEX + 1Х HiPrep DEAE FF 16/10, 모두 cytiva 제품)에 로딩하였다(실행당 30 mL 미만의 용해액 로딩). 세척 완충액(25 mM Hepes, 1 mM EDTA, 5 mM DTT, pH 7.0)으로 시스템을 실행하고 단백질을 함유하는 분획(두 번째 주요 피크)을 수집하고 모은다.
직렬 컬럼은 각각의 유형으로 구분된다. DEAE 컬럼을 완충액 E1 및 E2(각각 25 mM Bis-Tris 프로판 HCl, pH 9.5 및 2 5 mM Bis-Tris 프로판 HCl, 1 M NaCl, pH 9.5)로 단계적 구배로 용리하였다. 먼저, 8 CV 동안 100% E1을 실행한 다음 5 CV에 걸쳐 0%에서 12%까지의 E2의 구배를 적용한 다음 추가 10 CV 동안 12%로 유지하였다. 그 후 5 CV에 걸쳐 12%에서 40%까지의 E2 구배를 실행하고 추가 5 CV 동안 40%로 유지하였다. 단백질을 함유하는 분획(두 번째 주요 피크)을 수집하고 이전 분획과 함께 모은다. SP 컬럼을 동일한 방법으로 세척하고 폐기한다. 이 용리에서 단백질이 발견되지 않아야 하기 때문이다.
샘플을 모아 pH 9.5로 조정하고 Mono Q(소규모) 또는 Hitrap Q(대규모) 컬럼에 로딩한다. 사용되는 완충액은 E2 및 E3(25 mM Bis-Tris 프로판 HCl, 1.5 M 황산암모늄, pH 9.5)이다. 단계적 용리 구배는 15 CV 동안 8% E3에서 시작하여 5 CV에 걸쳐 16% E3로 증가시키고 3 CV에 걸쳐 50% E3으로 증가시킨다. 단백질을 함유하는 분획은 두 번째 주요 피크에서 발견된다.
목표 단백질을 함유하는 분획을 모으고 정용여과(10 kDa MWCO, 3500 xg 미만, 4℃)에 의해 농축한다. 농축된 샘플을 완충액(20 mM 인산칼륨, 150 mM KCl, 1 mM DTT, pH 6.0)로 평형화된 Superdex 75에 로딩한다. 목표 단백질을 함유하는 분획을 수집하고, 모아 농축한다.
실시예 18 - 변형된 IL-18 폴리펩티드의 접합
일부 경우에, 본원에 제공된 바와 같은 변형된 IL-18 폴리펩티드를 PEG 작용성에 접합시킨다. 일부 경우에, 먼저, 변형된 IL-18 폴리펩티드의 원하는 잔기(예를 들어, C68 또는 다른 적합한 자연 발생 시스테인 또는 원하는 부위에 혼입된 시스테인 잔기, 예를 들어 잔기 69 또는 70)에 부착하는 이작용성 링커를 통해 PEG를 부착시킨다. IL-18 폴리펩티드에 부착되면, 이작용성 링커의 두 번째 작용성을 사용하여 PEG 모이어티를 부착시킨다. 그러한 공정의 예시적인 개략도는 [도 18]에 도시한다. 본원에 제공된 재조합 IL-18 변이체에 대한 예시적인 프로토콜은 아래에 설명한다.
접합 - 재조합 IL-18은 50 mM KCl 및 1 mM DTT를 함유하는 인산칼륨 완충액(pH 7.0)에 2.4 mg/mL의 농도로 -80℃에서 보관하였다. 샘플을 얼음 위에서 해동하여 투명한 용액을 얻었다. 단백질 용액을 PBS, pH 7.4로 희석하였다. ~ 0.4 mg/mL의 농도에서 투명한 용액을 얻었다.
단백질 용액을 PBS, pH 7.4에 대해 투석하였다(2시간 동안 600 mL에 대해 2회 및 18시간 동안 800 mL에 대해 1회). 투석 후, 침전의 징후가 없는 투명한 용액을 얻었다. 280 nm에서의 UV 흡광도와 BCA 단백질 분석법을 사용하여 단백질 농도를 얻었다.
20 mM의 농도로 물에 용해된 이작용성 프로브(브로모아세트아미도-PEG5-아지드, CAS: 1415800-37-1)의 저장 용액을 준비하였다. 500 μL의 단백질 용액을 25 μL의 프로브 용액과 혼합하였다. pH를 7.5로 조절하고 20℃에서 3시간 동안 반응하도록 두었다.
Aeris WIDEPORE C18 200 Å 컬럼(3.6 ㎛, 150 x 4.6 mm)에서 40℃에서 1 mL/분의 유속으로 0.1% TFA(v/v)가 포함된 5에서 30%까지(2.5분) 및 30에서 75%까지(7.5분)의 CH3CN의 구배를 사용한 역상 HPLC 및 MALDI-TOF MS에 의해 합성 진행을 모니터링하였다.
정제 - 일부 경우에, 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 접합 단백질을 정제하였다. 과량의 프로브를 제거하기 위해, 반응 혼합물(부피는 약 500 μL)을 완충액으로 25 mM Tris(pH 7.4)를 사용하여 Hi-Trap-G-FF-1 mL 컬럼을 통해 흘렸다. 동일한 완충액 중 0-0.35M NaCl의 선형 구배로 컬럼을 용리시켰다. 표적 단백질을 함유하는 분획을 수집하고, 완충액을 교환하고(25 m M Tris, pH 7.4, 75 mM NaCl, 5% 글리세롤) 0.4 mg/mL로 농축하였다. 280 nm에서의 UV 흡광도 및 BCA 단백질 분석에 의해 정제된 단백질의 농도를 결정하였다. 단백질 용액을 -80℃에서 보관하였다.
특성화 - 상용 공급원의 재조합 단백질 및 접합 단백질의 순도 및 정체성을 aSEC, HPLC 및 MALDI-TOF MS로 확인하였다.
실시예 19 - 변형된 IL-18 폴리펩티드의 PEG화
실시예 19에 기재되고 [도 18]에 도시된 바와 같이 이작용성 링커의 접합 후. 변형된 IL-18 폴리펩티드를 PEG 기와 공유 결합시킬 수 있다. 이 공정의 예시적인 개략도는 [도 19]에 도시한다. PEG와 적절하게 활성화된 IL-18 폴리펩티드 사이의 접합 반응의 예시적인 프로토콜은 아래에 제공한다. 추가로, 아래의 프로토콜을 사용하여 변형된 IL-18 폴리펩티드의 제조 동안(예를 들어, 합성 IL-18 폴리펩티드의 합성 동안) 접합 핸들을 직접 포함하는 변형된 IL-18 폴리펩티드에 원하는 PEG 기를 공유적으로 연결할 수 있다. 그러한 공정의 예시적인 개략도는 [도 3]에 도시한다.
접합 - 서열 번호 71의 재조합 변형된 IL-18 폴리펩티드를 75 mM NaCl 및 5%(v/v) 글리세롤을 함유하는 PBS(pH 7.4)에 -80℃에서 보관하였다. PEG화 반응 전에, 샘플을 얼음 위에서 해동하여 투명한 용액을 얻었다. 200 μL의 단백질 용액(0.4 mg/mL)을 2.0 mg의 30 kDa DBCO-폴리에틸렌 글리콜 중합체와 혼합하였다. 이를 20℃에서 밤새 반응하도록 두었다.
Aeris WIDEPORE C4 200 Å 컬럼(3.6 ㎛, 150 x 4.6 mm)에서 40℃에서 1 mL/분의 유속으로 0.1% TFA(v/v)가 포함된 5에서 30%까지(2.5분) 및 30에서 75%까지(7.5분)의 CH3CN의 구배를 사용한 역상 HPLC 및 MALDI-TOF MS에 의해 합성의 진행을 모니터링하였다.
정제 - 과량의 PEG를 제거하기 위해 반응 혼합물을 Tris 완충액(25 mM, pH 7.4)으로 희석하고 완충액으로 25 mM Tris(pH 7.4)를 사용하여 Hi-Trap-Q-FF 컬럼을 통해 흘렸다. 동일한 완충액 중 0-0.35M NaCl의 선형 구배로 컬럼을 용리시켰다. 표적 단백질을 함유하는 분획을 수집하고, 완충액을 교환하고(25 mM Tris, pH 7.4, 75 mM NaCl, 5% 글리세롤) 0.04 mg/mL로 농축하였다. BCA 단백질 분석으로 정제된 단백질의 농도를 결정하였다. 단백질 용액을 -80℃에서 보관하였다.
특성화 - 접합 단백질의 순도 및 정체성을 HPLC 및 MALDI-TOF MS로 확인하였다.
실시예 20 - PBMC 자극 분석
하기 프로토콜에 따라 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 자극하는 IL-18 변이체의 능력을 평가하였다.
림프구 단리: 건강한 지원자의 버피 코트로부터의 혈액을 동일한 부피의 PBS로 희석하고 15 mL Histopaque-1077로 미리 채워진 SepMate 튜브 위에 천천히 부었다. 튜브를 1200 g에서 10분 동안 원심분리하고, 최상층을 수집하고 2% 우태 혈청을 함유하는 PBS로 3회 세척하였다. PBMC를 계수하고 20 x 106 세포의 분취액으로 동결보존하였다.
동결보존된 PBMC를 해동하고 10% 우태 혈청을 함유하는 RPMI 중 0.2 pM 내지 1 μM의 범위의 인간 IL-18 변이체의 구배로 자극하였다.
24시간 자극 후 사이토카인 생성을 다색 유세포 분석기에서 Legendplex(Biolegend #740930)로 측정한다. GraphPad PRISM 소프트웨어를 사용하는 가변 기울기 및 4가지 매개변수 분석을 기초로 하여 배양 상청액에서 방출된 IFNγ의 절반 최대 유효 농도(EC50)를 계산한다.
72시간 자극 후 유동 세포측정법(마우스 IgG1 클론 3G8)에 의해 NK 세포 상의 FcγRIII의 표면 발현을 측정한다.
[도 22]는 야생형 IL-18(서열 번호 1) 및 서열 번호 7 및 서열 번호 10의 변형된 IL-18 폴리펩티드의 투여 시 인간 IFNγ, IL-1β, IL-6, IL-12p70, IL-10 및 TNFα의 유도(좌측 상단부터 시계 방향)를 보여준다. 각각의 개별 그래프에서, x축은 표시된 IL-18 폴리펩티드의 농도(nM)를 표시하고 y축은 표시된 바이오마커의 평균 형광 강도(MFI)을 표시한다. 그래프에서, 야생형 IL-18은 원으로 표시하고, 서열 번호 7의 변형된 IL-18 폴리펩티드는 사각형으로 표시하며, 서열 번호 10의 변형된 IL-18 폴리펩티드는 삼각형으로 표시한다. 각각의 바이오마커에 대해, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 야생형보다 낮은 농도에서 표시된 사이토카인의 생성을 유도하였다. 서열 번호 7과 서열 번호 10의 변형된 IL-18 폴리펩티드 사이에서 서열 번호 10은 각 사이토카인에 대해 더 낮은 농도에서 사이토카인 생성을 유도하였다.
[도 23]은 변형된 IL-18 폴리펩티드로 자극된 PBMC의 NK 세포 집단에서 CD16+ 세포의 백분율을 보여준다(y축, 전체 집단의 %로 표현). x축은 관련 IL-18 폴리펩티드의 농도(nM)를 표시한다. 야생형 IL-18은 채워진 원으로 표시하고, 서열 번호 7은 채워진 정사각형으로 표시하며, 서열 번호 10은 채워진 삼각형으로 표시하고, 서열 번호 71은 빈 원으로 표시하며, 잔기 C68에서 부착된 30 kDa PEG가 있는 서열 번호 71은 채워진 마름모로 표시한다. 서열 번호 7 및 10은 야생형에 비해 더 낮은 농도에서 활성을 나타냈던 반면, 서열 번호 71 및 PEG가 있는 서열 번호 71은 야생형보다 유사하지만 약간 더 높은 농도에서 활성을 나타냈다.
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MOD_RES <222> (1)..(1) <223> 5-oxa-proline <220> <221> MOD_RES <222> (35)..(35) <223> Norleucine <400> 246 Xaa Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Ser Glu Lys Glu Arg 1 5 10 15 Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu Gly Asp Arg 20 25 30 Ser Ile Xaa Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp 35 40 <210> 247 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> 5-oxa-proline <220> <221> MOD_RES <222> (35)..(35) <223> O-methyl-L-homoserine <400> 247 Xaa Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu Lys Glu Arg 1 5 10 15 Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu Gly Asp Arg 20 25 30 Ser Ile Xaa Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp 35 40 <210> 248 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> 5-oxa-proline <220> <221> MOD_RES <222> (35)..(35) <223> O-methyl-L-homoserine <400> 248 Xaa Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Ser Glu Lys Glu Arg 1 5 10 15 Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu Gly Asp Arg 20 25 30 Ser Ile Xaa Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp 35 40

Claims (151)

  1. 변형된 인터류킨-18(IL-18) 폴리펩티드로서,
    E06K 및 K53A를 포함하는 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 하는 것인 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, T63A를 추가로 포함하는 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 Y01X, S55X, F02X, D54X, C38X, C68X, E69X, C76X, C127X, 또는 K70X 중 적어도 하나를 추가로 포함하며, 여기서 X는 아미노산 또는 아미노산 유도체인, 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  4. 제3항에 있어서, Y01G, S55A, F02A, D54A, C38S, C38A, C68S, C68A, E69C, C76S, C76A, C127S, C127A, 또는 K70C 중 적어도 하나를 포함하는 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 잔기 65, 잔기 66, 잔기 67, 잔기 68, 잔기 69, 잔기 70, 잔기 71, 잔기 72, 잔기 73, 잔기 74 또는 잔기 75에서 공유 부착되는 중합체를 포함하는 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 잔기 C68에서 공유 부착되는 중합체를 포함하는 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 잔기 E69 또는 E69C에서 공유 부착되는 중합체를 포함하는 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 잔기 K70 또는 잔기 K70C에서 공유 부착되는 중합체를 포함하는 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체는 최대 약 50,000 달톤, 최대 약 25,000 달톤, 최대 약 10,000 달톤, 최대 약 6,000 달톤, 또는 최대 약 2,000 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는 것인 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  10. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체는 적어도 약 120 달톤, 적어도 약 250 달톤, 적어도 약 300 달톤, 적어도 약 400 달톤, 또는 적어도 약 500 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는 것인 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  11. 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체는 접합 핸들 또는 접합 핸들과 상보적인 접합 핸들의 반응 생성물을 포함하는 것인 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  12. 제5항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체는 아지드 모이어티, 알킨 모이어티, 또는 아지드-알킨 고리첨가 반응의 반응 생성물을 포함하는 것인 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  13. 제5항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체는 수용성 중합체인 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  14. 제13항에 있어서, 수용성 중합체는 폴리(알킬렌 옥시드), 다당류, 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알코올), 폴리옥사졸린, 폴리(아크릴로일모르폴린), 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  15. 제13항에 있어서, 수용성 중합체는 폴리(알킬렌 옥시드)를 포함하는 것인 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 폴리(알킬렌옥시드)는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)인 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  17. 제16항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜은 약 10 kDa 내지 약 50 kDa의 중량 평균 분자량을 갖는 것인 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  18. 제16항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜은 약 10 kDa, 약 20 kDa, 또는 약 30 kDa의 중량 평균 분자량을 갖는 것인 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  19. 제16항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜은 약 30 kDa의 중량 평균 분자량을 갖는 것인 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  20. 제5항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 IL-18 폴리펩티드의 반감기는 상응하는 야생형 IL-18 폴리펩티드의 반감기보다 적어도 10% 더 긴 것인 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  21. 제20항에 있어서, 변형된 IL-18 폴리펩티드의 반감기는 상응하는 야생형 IL-18 폴리펩티드의 반감기보다 적어도 30% 더 긴 것인 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, N-말단 연장부를 포함하는 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  23. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, N-말단 절두(truncation)를 포함하는 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 2-83 중 어느 하나와 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  25. 제24항에 있어서, 폴리펩티드 서열은 서열 번호 2 또는 서열 번호 18과 적어도 약 80% 동일한 것인 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  26. 제25항에 있어서, 폴리펩티드 서열은 서열 번호 2와 적어도 약 80% 동일한 것인 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  27. 제25항에 있어서, 폴리펩티드 서열은 서열 번호 2와 적어도 약 90% 동일한 것인 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  28. 제25항에 있어서, 폴리펩티드 서열은 서열 번호 2와 적어도 약 95% 동일한 것인 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  29. 제25항에 있어서, 폴리펩티드 서열은 서열 번호 18과 적어도 약 80% 동일한 것인 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  30. 제25항에 있어서, 폴리펩티드 서열은 서열 번호 18과 적어도 약 90% 동일한 것인 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  31. 제25항에 있어서, 폴리펩티드 서열은 서열 번호 18과 적어도 약 95% 동일한 것인 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합체인 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  33. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 잔기 26-36 중 어느 하나에 위치한 호모세린 잔기;
    (b) 잔기 60-80 중 어느 하나에 위치한 호모세린 잔기;
    (c) 잔기 110-120 중 어느 하나에 위치한 호모세린 잔기;
    (d) 잔기 28-38 중 어느 하나에 위치한 노르류신 또는 O-메틸-호모세린 잔기;
    (d) 잔기 46-56 중 어느 하나에 위치한 노르류신 또는 O-메틸-호모세린 잔기;
    (e) 잔기 54-64 중 어느 하나에 위치한 노르류신 또는 O-메틸-호모세린 잔기;
    (f) 잔기 80-90 중 어느 하나에 위치한 노르류신 또는 O-메틸-호모세린 잔기;
    (g) 잔기 108-118 중 어느 하나에 위치한 노르류신 또는 O-메틸-호모세린 잔기; 및
    (h) 잔기 145-155 중 어느 하나에 위치한 노르류신 또는 O-메틸-호모세린 잔기
    로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하며,
    여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 하는 것인, 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  34. 제33항에 있어서, 호모세린(Hse) 31, 노르류신(Nle) 33, O-메틸-호모세린(Omh) 33, Nle51, Omh51, Nle60, Omh60, Hse75, Nle86, Omh86, Hse106, Nle113, Omh113, Nle150, 및 Omh150으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, IFNγ 생성을 조절하고, 변형된 IL-18 폴리펩티드의 IFNγ 유도 능력의 EC50(nM)은 서열 번호 1의 IL-18 폴리펩티드의 EC50(nM)보다 10배 미만 더 높거나, 5배 미만 더 높거나, 더 낮은 것인 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  36. 제35항에 있어서, 변형된 IL-18 폴리펩티드의 IFNγ 유도 능력의 EC50(nM)은 서열 번호 1의 EC50(nM)보다 5배 미만 더 큰 것인 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  37. 제35항에 있어서, 변형된 IL-18 폴리펩티드의 IFNγ 유도 능력의 EC50(nM)은 서열 번호 1의 IL-18 폴리펩티드의 EC50(nM)보다 더 작은 것인 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  38. 제35항에 있어서, 변형된 IL-18 폴리펩티드의 IFNγ 유도 능력의 EC50(nM)은 서열 번호 1의 EC50(nM)보다 적어도 약 10배 더 작은 것인 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  39. 서열 번호 2-83 중 어느 하나와 적어도 약 80% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  40. 제39항에 있어서, 폴리펩티드 서열은 서열 번호 2 또는 서열 번호 18과 적어도 약 80% 동일한 것인 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  41. 제39항에 있어서, 폴리펩티드 서열은 서열 번호 2와 적어도 약 80% 동일한 것인 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  42. 제39항에 있어서, 폴리펩티드 서열은 서열 번호 2와 적어도 약 90% 동일한 것인 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  43. 제39항에 있어서, 폴리펩티드 서열은 서열 번호 2와 적어도 약 95% 동일한 것인 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  44. 제39항에 있어서, 폴리펩티드 서열은 서열 번호 18과 적어도 약 80% 동일한 것인 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  45. 제39항에 있어서, 폴리펩티드 서열은 서열 번호 18과 적어도 약 90% 동일한 것인 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  46. 제39항에 있어서, 폴리펩티드 서열은 서열 번호 18과 적어도 약 95% 동일한 것인 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 KD에 의해 측정되는 바와 같이 IL-18 결합 단백질(IL-18BP)에 대해보다 IL-18 수용체 알파 서브유닛(IL-18Rα)에 대해 10배 미만 더 낮은 친화도, 5배 미만 더 낮은 친화도, 또는 더 큰 친화도를 나타내고, 여기서 [KD IL-18Rα]/[KD IL-18BP]는 0.1보다 큰 것인 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  48. 제47항에 있어서, IL-18 수용체 알파(IL-18Rα)에 결합하는 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  49. 제47항에 있어서, 약 200 nM 미만, 약 100 nM 미만, 약 80 nM 미만, 약 70 nM 미만, 약 60 nM 미만, 또는 약 50 nM 미만의 KD로 IL-18Rα에 결합하는 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  50. 제47항에 있어서, 약 50 nM 미만의 KD로 IL-18Rα에 결합하는 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  51. 제47항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, IL-18 수용체 알파/베타(IL-18Rα/β) 이종이량체에 결합하는 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  52. 제51항에 있어서, 약 25 nM 미만의 KD로 IL-18Rα/β 이종이량체에 결합하는 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  53. 제51항에 있어서, 약 10 nM 미만의 KD로 IL-18Rα/β 이종이량체에 결합하는 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 추가 펩티드에 접합되는 변형된 IL-18 폴리펩티드.
  55. 변형된 인터류킨-18(IL-18) 폴리펩티드 집단으로서,
    a) 복수의 변형된 IL-18 폴리펩티드; 및
    b) 적어도 하나의 중합체 모이어티로서 적어도 하나의 중합체 모이어티는 변형된 IL-18 폴리펩티드에 공유 결합되고 잔기 65, 잔기 66, 잔기 67, 잔기 68, 잔기 69, 잔기 70, 잔기 71, 잔기 72, 잔기 73, 잔기 74 또는 잔기 75 에서 부착되며, 여기서 아미노산 잔기 위치는 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 하는 것인 적어도 하나의 중합체 모이어티
    를 포함하며,
    변형된 IL-18 폴리펩티드의 적어도 90%는 고해상도 전자분무 이온화 질량 분석법(ESI-HRMS: high resolution electrospray ionization mass spectrometry)에 의해 결정되는 바와 같이 복수의 변형된 IL-18 폴리펩티드의 피크 분자량의 ±500 Da 이내인 분자량을 갖는 것인, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단.
  56. 변형된 인터류킨-18(IL-18) 폴리펩티드 집단으로서,
    a) 복수의 변형된 IL-18 폴리펩티드; 및
    b) 복수의 중합체 모이어티로서 복수의 중합체 모이어티는 변형된 IL-18 폴리펩티드에 공유 결합되고 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 65, 잔기 66, 잔기 67, 잔기 68, 잔기 69, 잔기 70, 잔기 71, 잔기 72, 잔기 73, 잔기 74 또는 잔기 75에서 부착되며, 여기서 아미노산 잔기 위치는 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 하는 것인 복수의 중합체 모이어티
    를 포함하며;
    복수의 중합체 모이어티의 적어도 90%는 고해상도 전자분무 이온화 질량 분석법(ESI-HRMS)에 의해 결정되는 바와 같이 복수의 중합체 모이어티의 피크 분자량의 ±500 Da 이내인 분자량을 갖는 것인, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단.
  57. 제55항 또는 제56항에 있어서, 적어도 하나의 중합체 모이어티 또는 복수의 중합체 모이어티는 아미노산 잔기 68에서 변형된 IL-18 폴리펩티드에 공유 결합되며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 아미노산 잔기 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 하는 것인 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단.
  58. 제55항 또는 제56항에 있어서, 적어도 하나의 중합체 모이어티 또는 복수의 중합체 모이어티는 아미노산 잔기 69에서 변형된 IL-18 폴리펩티드에 공유 결합되며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 아미노산 잔기 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 하는 것인 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단.
  59. 제55항 또는 제56항에 있어서, 적어도 하나의 중합체 모이어티 또는 복수의 중합체 모이어티는 아미노산 잔기 70에서 변형된 IL-18 폴리펩티드에 공유 결합되며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 아미노산 잔기 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 하는 것인 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단.
  60. 제55항 또는 제56항에 있어서, 적어도 하나의 중합체 모이어티 또는 복수의 중합체 모이어티는 C68에서 변형된 IL-18 폴리펩티드에 공유 결합되며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 아미노산 잔기 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 하는 것인 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단.
  61. 제55항 또는 제56항에 있어서, 적어도 하나의 중합체 모이어티 또는 복수의 중합체 모이어티는 E69 또는 E69C에서 변형된 IL-18 폴리펩티드에 공유 결합되며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 아미노산 잔기 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 하는 것인 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단.
  62. 제55항 또는 제56항에 있어서, 적어도 하나의 중합체 모이어티 또는 복수의 중합체 모이어티는 K70 또는 K70C에서 변형된 IL-18 폴리펩티드에 공유 결합되며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 아미노산 잔기 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 하는 것인 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단.
  63. 제55항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 변형된 IL-18 폴리펩티드의 각각의 변형된 IL-18 폴리펩티드는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 것인 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단.
  64. 제63항에 있어서, 하나 이상의 돌연변이는 E06, K53, Y01, S55, F02, D54, C38, T63, C68, E69, C76, C127, 및 K70으로부터 선택된 잔기 위치에 위치하며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 하는 것인 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단.
  65. 제64항에 있어서, 하나 이상의 돌연변이는 E06K, K53A, Y01G, S55A, F02A, D54A, C38S, C38A, T63A, C68S, C68A, E69C, C76S, C76A, C127S, C127A, 및 K70C로부터 선택되는 것인 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단.
  66. 제65항에 있어서, 하나 이상의 돌연변이는 E06K 및 K53A를 포함하는 것인 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단.
  67. 제65항에 있어서, 하나 이상의 돌연변이는 E06K, K53A, 및 T63A를 포함하는 것인 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단.
  68. 제55항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1 ㎍, 적어도 10 ㎍, 또는 적어도 1 mg의 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함하는 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단.
  69. 제55항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 100개, 적어도 1000개, 또는 적어도 10000개의 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함하는 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단.
  70. 제55항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단의 수 평균 분자량에 대한 중량 평균 분자량의 비율은 최대 1.1인 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단.
  71. 제55항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 중합체 각각은 수용성 중합체를 포함하는 것인 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단.
  72. 제71항에 있어서, 수용성 중합체는 폴리(알킬렌 옥시드), 다당류, 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알코올), 폴리옥사졸린, 폴리(아크릴로일모르폴린), 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단.
  73. 제71항에 있어서, 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 것인 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단.
  74. 제55항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 중합체의 중량 평균 분자량은 약 200 Da 내지 약 50,000 Da인 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단.
  75. 제55항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 중합체의 중량 평균 분자량은 약 10,000 Da 내지 약 30,000 Da인 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단.
  76. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항의 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함하는 숙주 세포.
  77. 변형된 IL-18 폴리펩티드를 숙주 세포에서 발현시키는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항의 변형된 IL-18 폴리펩티드의 생산 방법.
  78. 제76항 또는 제77항에 있어서, 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포인 숙주 세포.
  79. 제76항 또는 제77항에 있어서, 숙주 세포는 포유동물 세포, 조류 세포, 진균 세포, 또는 곤충 세포인 숙주 세포.
  80. 제79항에 있어서, 숙주 세포는 CHO 세포, COS 세포, 또는 효모 세포인 숙주 세포.
  81. a) 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항의 변형된 IL-18 폴리펩티드 또는 제55항 내지 제75항 중 어느 한 항의 변형된 IL-18 폴리펩티드 집단; 및
    b) 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제
    를 포함하는 약학 조성물.
  82. 제81항에 있어서, 동결건조된 형태인 약학 조성물.
  83. 약학적 유효량의 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항의 변형된 IL-18 폴리펩티드 또는 제81항 또는 제82항의 약학 조성물을 암 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  84. 제83항에 있어서, 암은 고형암인 방법.
  85. 제84항에 있어서, 고형암은 신장암, 피부암, 방광암, 골암, 뇌암, 유방암, 결장직장암, 식도암, 안암, 두경부암, 폐암, 난소암, 췌장암, 또는 전립선 암인 방법.
  86. 제84항에 있어서, 고형암은 전이성 신세포 암종 또는 흑색종인 방법.
  87. 제84항에 있어서, 고형암은 암종 또는 육종인 방법.
  88. 제83항에 있어서, 암은 혈액암인 방법.
  89. 제88항에 있어서, 혈액암은 백혈병, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 또는 다발성 골수종인 방법.
  90. 제83항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 IL-18 폴리펩티드 또는 약학 조성물의 동결건조된 형태를 재구성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  91. 합성 IL-18 폴리펩티드로서,
    잔기 21-41, 잔기 60-80, 및 잔기 106-126의 영역으로부터 선택된 위치에서 호모세린(Hse) 잔기를 포함하며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 하는 것인 합성 IL-18 폴리펩티드.
  92. 제91항에 있어서, 잔기 21-41, 잔기 60-80, 및 잔기 106-126의 각각의 영역에 Hse 잔기를 포함하는 합성 IL-18 폴리펩티드.
  93. 제91항 또는 제92항에 있어서, 위치 31에서 Hse 잔기를 포함하는 합성 IL-18 폴리펩티드.
  94. 제91항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 63 또는 위치 75에서 Hse 잔기를 포함하는 합성 IL-18 폴리펩티드.
  95. 제94항에 있어서, 위치 63에서 Hse 잔기를 포함하는 합성 IL-18 폴리펩티드.
  96. 제94항에 있어서, 위치 75에서 Hse 잔기를 포함하는 합성 IL-18 폴리펩티드.
  97. 제91항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 116에서 Hse 잔기를 포함하는 합성 IL-18 폴리펩티드.
  98. 제91항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 63 및 75 중 적어도 하나, 위치 31, 및 위치 116에서 Hse 잔기를 포함하는 합성 IL-18 폴리펩티드.
  99. 제91항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1에서 적어도 하나의 메티오닌 잔기의 아미노산 치환을 포함하는 합성 IL-18 폴리펩티드.
  100. 제99항에 있어서, 서열 번호 1에서 적어도 하나의 메티오닌 잔기의 아미노산 치환은 M33, M51, M60, M86, M113, 또는 M150에서 치환을 포함하는 것인 합성 IL-18 폴리펩티드.
  101. 제99항 또는 제100항에 있어서, 적어도 3개의 메티오닌 잔기의 치환을 포함하는 합성 IL-18 폴리펩티드.
  102. 제99항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 5개의 메티오닌 잔기의 치환을 포함하는 합성 IL-18 폴리펩티드.
  103. 제99항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 6개의 메티오닌 잔기의 치환을 포함하는 합성 IL-18 폴리펩티드.
  104. 제99항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 메티오닌 잔기는 O-메틸-호모세린(Omh) 잔기로 치환되는 것인 합성 IL-18 폴리펩티드.
  105. 제99항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 3개의 메티오닌 잔기는 Omh 잔기로 치환되는 것인 합성 IL-18 폴리펩티드.
  106. 제99항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 5개의 메티오닌 잔기는 Omh 잔기로 치환되는 것인 합성 IL-18 폴리펩티드.
  107. 제99항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 메티오닌 치환은 노르류신 또는 Omh 잔기로의 치환인 합성 IL-18 폴리펩티드.
  108. 제99항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 메티오닌 치환은 Omh 잔기로의 치환인 합성 IL-18 폴리펩티드.
  109. 제99항 또는 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1의 각각의 메티오닌 잔기는 Omh 잔기로 치환되는 것인 합성 IL-18 폴리펩티드.
  110. 제99항 또는 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1에 대해 추가 돌연변이를 포함하는 합성 IL-18 폴리펩티드.
  111. 제99항 또는 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1의 아미노산 서열과 적어도 약 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 합성 IL-18 폴리펩티드.
  112. 제99항 또는 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 합성 IL-18 폴리펩티드의 잔기에 공유 부착되는 중합체를 포함하는 합성 IL-18 폴리펩티드.
  113. a) 변형된 IL-18 폴리펩티드의 2개 이상의 단편을 합성하는 단계;
    b) 단편을 결찰하는 단계; 및
    c) 결찰된 단편을 폴딩하는 단계
    를 포함하는, 변형된 IL-18 폴리펩티드의 제조 방법.
  114. 제113항에 있어서, 2개 이상의 단편은 N-말단 단편, C-말단 단편, 및 선택적으로 하나 이상의 내부 단편을 포함하며, 여기서 N-말단 단편은 변형된 IL-18 폴리펩티드의 N-말단을 포함하고 C-말단 단편은 변형된 IL-18 폴리펩티드의 C-말단을 포함하는 것인 방법.
  115. 제114항에 있어서, 각각의 N-말단 단편 및 하나 이상의 내부 단편은 각각의 단편의 C-말단 잔기로서 알파-케토 아미노산을 포함하는 것인 방법.
  116. 제115항에 있어서, 각각의 알파-케토 아미노산은 알파-케토-페닐알라닌, 알파-케토-티로신, 알파-케토-발린, 알파-케토-류신, 알파-케토-이소류신, 알파-케토-노르류신, 및 알파-케토-O-메틸호모세린으로부터 선택되는 것인 방법.
  117. 제114항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 C-말단 단편 및 하나 이상의 내부 단편은 각각의 단편의 N-말단 잔기로서 히드록실아민 또는 시클릭 히드록실아민 작용성을 갖는 잔기를 포함하는 것인 방법.
  118. 제117항에 있어서, 히드록실아민 또는 시클릭 히드록실아민 작용성을 갖는 각각의 잔기는 5-옥사프롤린 잔기인 방법.
  119. 제113항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 IL-18 폴리펩티드의 2개 이상의 단편을 합성하는 단계는 4개의 단편을 합성하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  120. 제119항에 있어서, 4개의 단편은 N-말단 단편, 제1 내부 단편, 제2 내부 단편, 및 C-말단 단편을 포함하는 것인 방법.
  121. 제120항에 있어서, N-말단 단편은 변형된 IL-18 폴리펩티드의 아미노산 1-30에 상응하는 잔기를 포함하며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 하는 것인 방법.
  122. 제120항 또는 제121항에 있어서, N-말단 단편은 서열 번호 1의 서열과 비교하여 N-말단 연장부를 포함하는 것인 방법.
  123. 제120항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, N-말단 단편은 서열 번호 201에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  124. 제120항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, N-말단 단편은 서열 번호 201-209 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  125. 제120항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 내부 단편은 변형된 IL-18 폴리펩티드의 아미노산 31-62에 상응하는 잔기를 포함하며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 하는 것인 방법.
  126. 제120항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 내부 단편은 서열 번호 210에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  127. 제120항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 내부 단편은 서열 번호 210-217 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  128. 제120항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 내부 단편은 변형된 IL-18 폴리펩티드의 아미노산 63-115에 상응하는 잔기를 포함하며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 하는 것인 방법.
  129. 제120항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 내부 단편은 서열 번호 227에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  130. 제120항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 내부 단편은 서열 번호 227-236 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  131. 제120항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 내부 단편은 변형된 IL-18 폴리펩티드의 아미노산 31-74에 상응하는 잔기를 포함하며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 하는 것인 방법.
  132. 제120항 내지 제124항 및 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 내부 단편은 서열 번호 218에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  133. 제120항 내지 제124항, 제131항 및 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 내부 단편은 서열 번호 218-226 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  134. 제120항 내지 제124항 및 제131항 내지 제133항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 내부 단편은 변형된 IL-18 폴리펩티드의 아미노산 75-115에 상응하는 잔기를 포함하며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 하는 것인 방법.
  135. 제120항 내지 제124항 및 제131항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 내부 단편은 서열 번호 237에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  136. 제120항 내지 제124항 및 제131항 내지 제135 중 어느 한 항에 있어서, 제2 내부 단편은 서열 번호 237-242 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  137. 제120항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, C-말단 단편은 변형된 IL-18 폴리펩티드의 아미노산 116-157에 상응하는 잔기를 포함하며, 여기서 변형된 IL-18 폴리펩티드의 잔기 위치 넘버링은 참조 서열로서 서열 번호 1을 기준으로 하는 것인 방법.
  138. 제120항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, C-말단 단편은 서열 번호 243에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  139. 제120항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, C-말단 단편은 서열 번호 243-248 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  140. 제120항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, N-말단 단편, 제1 내부 단편, 제2 내부 단편, 및 C-말단 단편은 변형된 IL-18 폴리펩티드에서 각각 N-말단에서 C-말단으로 배열되는 것인 방법.
  141. 제113항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 결찰된 단편을 재배열하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  142. 제113항 내지 제141항 중 어느 한 항에 있어서, IL-18 폴리펩티드의 단편 중 적어도 하나는 접합 핸들을 포함하는 것인 방법.
  143. 제131항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 수용성 중합체를 폴딩된 결찰된 단편에 부착시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  144. 변형된 IL-18 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질로서, 변형된 IL-18 폴리펩티드는 서열 번호 2-83 중 어느 하나와 적어도 약 80% 동일한 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  145. 제144항에 있어서, 서열은 서열 번호 2와 적어도 약 85% 동일한 것인 융합 단백질.
  146. 제144항에 있어서, 서열은 서열 번호 2와 적어도 약 90% 동일한 것인 융합 단백질.
  147. 제144항에 있어서, 서열은 서열 번호 2와 적어도 약 95% 동일한 것인 융합 단백질.
  148. 제144항에 있어서, 서열은 서열 번호 18과 적어도 약 85% 동일한 것인 융합 단백질.
  149. 제144항에 있어서, 서열은 서열 번호 18과 적어도 약 90% 동일한 것인 융합 단백질.
  150. 제144항에 있어서, 서열은 서열 번호 18과 적어도 약 95% 동일한 것인 융합 단백질.
  151. 제144항에 있어서, 서열은 서열 번호 18과 동일한 것인 융합 단백질.
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